JPWO2015121924A1 - ｍＲＮＡ送達用組成物 - Google Patents

Abstract

［課題］本発明は、ｍＲＮＡ送達用組成物および医薬組成物を提供する。［解決手段］ポリカチオン性ポリマーとメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とを含んでなる、ポリイオンコンプレックス。

Description

本発明は、ｍＲＮＡとポリカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスおよびｍＲＮＡ送達用組成物並びに医薬組成物に関する。

体内の好適な箇所に薬剤を送り届けるドラッグデリバリーシステムは、副作用の少ない新しい医薬を提供するものとして研究開発が行われている。その中で、ポリイオンコンプレックス（以下、「PIC」ともいう）を用いたドラックデリバリーシステムは、ナノミセルに薬物を包接させて疾患部位特異的に薬物を送達することが可能な技術として注目を集めている。「ポリイオンコンプレックス」とは、一般的に、ＰＥＧとアニオン性ブロックとの共重合体と、ＰＥＧとカチオン性ブロックとの共重合体とを溶液中で混合することにより得られる、両ブロック共重合体のカチオン性ブロックとアニオン性ブロックとの間で形成されるイオン層を意味する。ＰＥＧと上記の荷電性連鎖とを結合させることにより、ポリイオンコンプレックスが凝集して沈殿することが抑制されるとともに、粒径数十ｎｍの単分散なコア−シェル構造を有するナノ微粒子の形成が促進される。この際、ＰＥＧはナノ微粒子の外殻（シェル）を覆うため、生体適合性が高く、血中滞留時間を向上させる点で都合がよいことが知られている。

ＰＩＣを応用した技術として、特に核酸を副作用少なく体内に送達できるシステムが開発されてきた（特許文献１および２）。特許文献１および２では、ＤＮＡと新しいカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスが提案されている。

特許第４５３５２２９号公報 特許第５０６１３４９号公報

本発明は、ｍＲＮＡ送達用組成物および医薬組成物ならびにこれらに有用なｍＲＮＡとポリカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスを提供する。

本発明者らは、ｍＲＮＡとポリカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスが、炎症をほとんど誘発させずにｍＲＮＡを対象の体内の細胞内に送達できることを見出した。本発明者らはまた、上記ポリイオンコンプレックスが、ｍＲＮＡを対象の体内の細胞に一様に発現させることができることを見出した。本発明者らはさらに、上記ポリイオンコンプレックスが、ｍＲＮＡを対象の体内の細胞内で迅速に発現させることを見出した。本発明者らはさらにまた、上記ポリイオンコンプレックスが、ｍＲＮＡを対象の体内の細胞内で持続的に発現させることを見出した。本発明は上記知見に基づいてなされたものである。

すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）カチオン性ポリマーとメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とを含んでなる、ポリイオンコンプレックス。
（２）カチオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールブロックとのブロック共重合体を形成している、上記（１）に記載のポリイオンコンプレックス。
（３）カチオン性ポリマーが、
カチオン性天然アミノ酸、
カチオン性非天然アミノ酸、または
カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸
を含むモノマー単位の重合体である、上記（１）または（２）に記載のポリイオンコンプレックス。
（４）カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である｝を有するアミノ酸である、上記（３）に記載のポリイオンコンプレックス。
（５）カチオン性ポリマーが、下記一般式（Ｉ）：
｛式中、
Ｒ^１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
Ｒ^４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
Ｒ^２は、メチレンまたはエチレンであり、
Ｒ^３は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基であり、
Ｘは、カチオン性天然アミノ酸から選択されるいずれか１のアミノ酸であり、
ｐは、１〜５のいずれかの整数であり、好ましくは、ｐは、２、３または４であり、
ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ_１は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ_３は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ−ｎ_１−ｎ_３は、０以上の整数であり、式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい。｝
で表されるポリカチオンブロックであり、
但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ^１またはＲ^４は結合を表し、ポリエチレングリコールは、結合であるＲ^１またはＲ^４を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している、
上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（６）ポリカチオンブロックが、下記一般式（ＩＩ）：
｛式中、
Ｒ^１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
Ｒ^４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
Ｒ^２は、メチレンまたはエチレンであり、
Ｒ^３は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基であり、
ｐは、１〜５のいずれかの整数であり、
ｑは、１〜５のいずれかの整数であり、
ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ_１は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ_２は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
ｎ−ｎ_１−ｎ_２は、０以上の整数であり、
式中の各繰り返し単位は特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい。｝
で表されるポリカチオンブロックであり、
但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ^１またはＲ^４は結合を表し、ポリエチレングリコールは、結合であるＲ^１またはＲ^４を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している、
上記（５）に記載のポリイオンコンプレックス。
（７）ｍＲＮＡが、成長因子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、細胞死促進因子、細胞死抑制因子、癌抑制遺伝子産物または転写因子をコードするｍＲＮＡである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（８）細胞増殖因子が、造血因子または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である、上記（７）に記載のポリイオンコンプレックス。
（９）細胞死抑制因子が、Ｂｃｌ−２である、上記（７）に記載のポリイオンコンプレックス。
（１０）ｍＲＮＡが、修飾されたシチジンおよびウリジンを含んでなる、上記（１）〜（９）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。

（１１）ｍＲＮＡを対象の体内細胞の細胞質に送達する方法であって、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる、方法。
（１２）対象において、対象の組織またはその一部に均一にタンパク質を発現させるための上記（１１）に記載の方法であって、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる、方法。
（１３）組織が肝臓または粘膜組織である、上記（１２）に記載の方法。

（１４）急性疾患を有する対象において、該疾患の病変部における細胞死を抑制する方法であって、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞死抑制因子をコードするものである、方法。
（１５）造血を促進させる必要のある対象において造血を促進させる方法であって、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが造血因子をコードするものである、方法。
（１６）嗅覚障害を有する対象において嗅覚障害を処置する方法であって、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードするものである、方法。
（１７）癌を有する対象において癌を処置する方法であって、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞増殖抑制因子、癌抑制遺伝子産物または細胞死促進因子をコードするものである、方法。

（１８）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを含んでなる、ｍＲＮＡを体内の細胞内に送達することに用いるための組成物。
（１９）対象において、対象の組織またはその一部に均一にタンパク質を発現させることに用いるための、上記（１８）に記載の組成物。
（２０）組織が肝臓または粘膜組織である、上記（１９）に記載の組成物。

（２１）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを含んでなる、医薬組成物。
（２２）急性疾患をその必要のある対象において処置することに用いるための、上記（２１）に記載の医薬組成物。
（２３）疾患が、劇症肝炎または急性期の脊髄損傷である、上記（２２）に記載の医薬組成物。
（２４）疾患がアポトーシスの亢進を伴う疾患である、上記（２２）または（２３）に記載の医薬組成物。
（２５）嗅覚障害をその必要のある対象において処置することに用いるための、上記（２１）に記載の医薬組成物。
（２６）対象における造血を促進させることに用いるための、上記（２１）に記載の医薬組成物であって、ｍＲＮＡが造血因子をコードする、医薬組成物。

本発明によれば、ｍＲＮＡの細胞内（特に細胞質）に送達することができるが、炎症の誘発が抑制され、かつ、早期にかつ組織全体に均一にタンパク質を発現させることができる点で有利である。

図１Ａは、アニオン性ポリマーとしてｍＲＮＡを用い、カチオン性ポリマーとしてＰＥＧとポリカチオンとのブロックコポリマーを用いたポリイオンコンプレックス（ｍＲＮＡ内包ミセル）の形成スキームを示す。図１Ｂは、頚部クモ膜下腔にｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスの髄液中でのタンパク質発現を示す。 図２Ａは、ハイドロダイナミクス法によりｍＲＮＡ内包ミセルを尾静脈から投与したマウスのタンパク質発現をルシフェラーゼによりモニターした写真である。図２Ｂは、タンパク質発現の経時的変化を示す図である。 図３Ａは、ハイドロダイナミクス法によりｍＲＮＡ内包ミセルを尾静脈から投与したマウスの肝臓の切片におけるタンパク質発現を示す図であり、図３Ｂは、その画像解析結果を示す図である。図３Ｃは、ｍＲＮＡ内包ミセルにより送達されたｍＲＮＡの肝臓での分解の低減を示す図である。 図４Ａは、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスにおいて誘発された炎症の低減を示す図である。図４Ｂは、修飾ＲＮＡでタンパク質発現の持続時間を延長させることができることを示す図である。 図５は、ｍＲＮＡとしてエリスロポエチンをコードするｍＲＮＡを内包した、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスでの造血回復を示す図である。 図６は、嗅覚障害モデルマウスにおける、ｍＲＮＡ内包ミセルを用いた脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現の効果を示す図である。図６Ａは、鼻の粘膜上皮細胞でのｍＲＮＡの発現とその持続を示す図である。図６Ｂは、鼻の粘膜上皮組織全体にｍＲＮＡが均一に発現することを示す図である。図６Ｃは、嗅覚障害に対するｍＲＮＡ内包ミセルの治療促進効果を示すグラフである。図６Ｄは、嗅覚障害に対するｍＲＮＡミセルの治療促進効果を示す鼻の粘膜上皮組織の切片写真である。図６Ｅは、ｍＲＮＡ内包ミセルでの処置２８日後の鼻の粘膜上皮組織における嗅覚マーカータンパク質（ＯＭＰ）の発現を示す図である。 図７は、劇症肝炎モデルマウスにおける、ｍＲＮＡ内包ミセルを用いたＢｃｌ−２の発現の効果を示す図である。

発明の具体的な説明

本発明のポリイオンコンプレックスは、（ｉ）カチオン性ポリマーを含んでなるブロック共重合体と、（ｉｉ）ｍＲＮＡとがポリイオンコンプレックスとを少なくとも含んでなるものである。カチオン性ポリマーは、ポリエチレングリコールブロックとブロック共重合体を形成したものであってもよい。（ｉ）の共重合体と（ｉｉ）のｍＲＮＡは溶液中でポリイオンコンプレックスを形成している。本発明のポリイオンコンプレックスは、溶液中、好ましくは水溶液中に提供され得る。

本明細書では、ｍＲＮＡとは、メッセンジャーＲＮＡを意味する。

本発明のポリイオンコンプレックスでは、ｍＲＮＡ中のシチジンおよびウリジンは修飾されていてもよい。修飾されたシチジンとしては、例えば、５−メチル−シチジンが挙げられ、修飾したウリジンとしては、シュードウリジンおよび２−チオ−シチジンが挙げられる。修飾シチジンおよびウリジンは、全シチジンおよびウリジンの１０モル％以上、２０モル％以上、または３０モル％以上含まれていればよい。

本発明のポリイオンコンプレックスは、後記実施例に示されるようにｍＲＮＡに起因する炎症反応が少ないことから、ｍＲＮＡをその内部に内包するミセルの形態を取ると考えられる。従って、本明細書では、本発明のポリイオンコンプレックスを「ｍＲＮＡ内包ミセル」とも呼ぶ。また、本明細書では、上記ｍＲＮＡ内包ミセルにおいて、ｍＲＮＡの代わりにプラスミドＤＮＡを内包したミセルを「プラスミドＤＮＡ内包ミセル」と呼ぶ。

本明細書では、「ミセル」とは、１層の分子膜により形成される小胞を意味する。ミセルとしては、界面活性剤などの両親媒性分子により形成されるミセル、および、ポリイオンコンプレックスにより形成されるミセル（ＰＩＣミセル）が挙げられる。ミセルは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいことが知られている。

本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。

本発明では、ポリカチオンブロックとしては、例えば、カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸、例えば、ヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンなどのカチオン性天然アミノ酸、および／または、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝を側鎖として有するポリマーブロック、例えば、上記カチオン性の側鎖を有するカチオン性非天然アミノ酸のポリマーブロック、例えば、上記カチオン性の側鎖を有するアスパラギン酸またはグルタミン酸などのカチオン性非天然アミノ酸のポリマーブロックが挙げられる。本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝を側鎖として有するポリマーブロックである。ここで、カチオン性天然アミノ酸としては、好ましくはヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンが挙げられ、より好ましくはアルギニン、オルニチンおよびリジンが挙げられ、さらに好ましくはオルニチンおよびリジンが挙げられ、さらにより好ましくはリジンが挙げられる。

本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、下記一般式（Ｉ）：
｛式中、
Ｒ^１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
Ｒ^４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
Ｒ^２は、メチレンまたはエチレンであり、
Ｒ^３は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基であり、
Ｘは、カチオン性天然アミノ酸から選択されるいずれか１のアミノ酸であり、
ｐは、１〜５のいずれかの整数であり、好ましくは、ｐは、２、３または４であり、
ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、２〜５００のいずれかの整数であり、
ｎ_１は、０〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、０〜５００のいずれかの整数であり、
ｎ_３は、０〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、０〜５００のいずれかの整数であり、
ｎ−ｎ_１−ｎ_３は、０以上の整数であり、
式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく、
但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ^１またはＲ^４が結合を表し、ポリエチレングリコールは、該結合を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している。｝
で表されるポリカチオンブロックが用いられる。なお、上記一般式（Ｉ）のポリマーでは、各繰り返し単位がペプチド結合により結合している。

−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基は、エンドソームからのポリイオンコンプレックスの脱出を誘発することが知られており、また、ｎに応じてその特性が変化することが知られている。そのため、本発明では、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝を側鎖として有するポリマーブロックが好ましく用いられ得る。本発明では、例えば、上記カチオン性の側鎖は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは２または４である。｝とすることができ、このようにすると、早期に（例えば、２４時間以内または１２時間以内に）細胞内でタンパク質発現を誘導することができる。また、本発明では、上記カチオン性の側鎖は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは３である。｝とすることができ、このようにすると、ポリイオンコンプレックスからのｍＲＮＡの放出が穏やかであり、長期的（例えば、１日〜５日）にタンパク質発現を高発現させることができる。

本発明のある態様では、アミノ酸のポリマーでは、アミノ酸が、そのカルボキシル基とアミノ基との間でペプチド結合を形成している。

ポリカチオンブロックには、カチオン性アミノ酸およびカチオン性の側鎖を有するアミノ酸が混在していてもよい。すなわち、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、カチオン性天然アミノ酸、カチオン性非天然アミノ酸、または、カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸を含むモノマー単位の重合体である。本発明のある態様では、ポリカチオンブロック中のモノマー単位間の結合はペプチド結合である。本発明の好ましい態様では、カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｎは１〜５の整数である｝を有するアミノ酸である。また、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、カチオン性天然アミノ酸並びに−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝で修飾されたアスパラギン酸およびグルタミン酸が任意の順番で重合してなるポリカチオンブロックとすることができる。本発明のある態様では、ポリマー中のモノマー単位の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％が側鎖として−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝を有する。

また、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、主鎖として、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される１以上のアミノ酸のポリマーを含んでなる。本発明のある態様では、ポリカチオンブロックの主鎖中では、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される１以上のアミノ酸がポリマー中のモノマー単位の８０％、９０％、９５％または９８％を占める。本発明のある態様では、ポリカチオンブロックの主鎖は、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される１以上のアミノ酸のポリマーからなる。本発明のある態様では、実質的にすべてのアスパラギン酸およびグルタミン酸が側鎖として−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝を有する。本発明のある態様では、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基は、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボン酸基とペプチド結合により結合している。

また、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックとしては、下記一般式（ＩＩ）：
｛式中、
Ｒ^１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
Ｒ^４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
Ｒ^２は、メチレンまたはエチレンであり、
Ｒ^３は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基であり、
ｐは、１〜５のいずれかの整数であり、好ましくは、ｐは、２、３または４であり、
ｑは、１〜５のいずれかの整数であり、好ましくは、ｑは、２、３または４であり、
ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、２〜５００のいずれかの整数であり、
ｎ_１は、０〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、０〜５００のいずれかの整数であり、
ｎ_２は、０〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、０〜５００のいずれかの整数であり、
ｎ−ｎ_１−ｎ_２は、０以上の整数であり、
式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく、
但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ^１またはＲ^４が結合を表し、ポリエチレングリコールは、該結合を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している。｝
で表されるポリカチオンブロックが用いられる。なお、上記一般式（ＩＩ）のポリマーでは、各繰り返し単位がペプチド結合により結合している。

本発明のある態様では、ポリカチオンブロックとしては、ポリ（Ａｓｐ（ジエチルトリアミン））（以下「ポリ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））」という）が用いられる。ポリＡｓｐ（ＤＥＴ）の構造はそれぞれ、下記一般式（ＩＩＩ）で表される。なお、カチオン性ポリマーが下記一般式（ＩＩＩ）で表されるポリカチオンブロックからなる場合には、Ｒ^１およびＲ^４はいずれも結合であってはならない。

ポリＡｓｐ（ＤＥＴ）
｛式中、
Ｒ^１は、水酸基、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
Ｒ^４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
Ｒ^３は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_２−ＮＨ_２で表される基であり、
ｎは、０〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、０〜５００のいずれかの整数であり、
ｍは、０〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、０〜５００のいずれかの整数であり、
ｍ＋ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、２〜５００のいずれかの整数であり、
ｎ−ｍは、０以上の整数であり、
式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示しているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく、
但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ^１またはＲ^４が結合を表し、ポリエチレングリコールは、該結合を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している。｝なお、上記一般式（ＩＩＩ）のポリマーでは、各繰り返し単位がペプチド結合により結合している。

上記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において、保護基としては、Ｃ_１−６アルキルカルボニル基が挙げられ、好ましくはアセチル基であり、疎水性基としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレンおよびこれらの誘導体またはＣ_１−６アルキル基が挙げられ、重合性基としては、メタクリロイル基およびアクリロイル基が挙げられる。これらの保護基、疎水性基および重合性基をブロックコポリマーに導入する方法は当業者に周知である。

本発明では、カチオン性ポリマーは、ポリカチオンブロックは、ＰＥＧと連結していてもよい。例えば、上記式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物は、結合であるＲ^１とＲ^４のいずれかを介してポリエチレングリコールとブロックコポリマーを形成することができる。ＰＥＧは、平均重合度５〜２００００、好ましくは１０〜５０００、より好ましくは４０〜５００であるが、ブロックコポリマーとｍＲＮＡとのポリイオンコンプレックス形成が阻害されない限り特に限定されない。

結合であるＲ^１とＲ^４のいずれかとＰＥＧとは、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーは、例えば、−（ＣＨ_２）_ｒ−ＮＨ−｛ここでｒは、１〜５のいずれかの整数である。｝または−（ＣＨ_２）_ｓ−ＣＯ−｛ここでｓは、１〜５のいずれかの整数である。｝とすることができ、好ましくはペプチド結合により式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のポリカチオンブロックと結合する。また、リンカーは、好ましくは、メチレン側でＰＥＧとＰＥＧのＯ原子を介して結合する。ＰＥＧの別の末端の炭素原子は、水酸基、メトキシ基または保護基で置換されていてもよい。

すなわち、本発明のある態様では、ＰＥＧ−リンカー−ポリカチオンブロックのブロック共重合体をカチオン性ポリマー｛ここで、ＰＥＧ、リンカーおよびポリカチオンブロックは、上記で定義される通りである。｝として用いる。

本発明者らは、以前、プラスミドＤＮＡを内包するミセルを報告している（ＷＯ２００６／０８５６６４）。ＷＯ２００６／０８５６６４では、免疫原性の低いＤＮＡをミセルに内包させる技術が開示されている。具体的には、ＷＯ２００６／０８５６６４は、カチオン性ポリマーとして、ポリＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いるか、またはＰＥＧとポリＡｓｐ（ＤＥＴ）とのブロック共重合体を用い、上記カチオン性ポリマーとプラスミドＤＮＡにより形成されたｐＤＮＡ内包ミセルは、インビボで毒性が低くプラスミドＤＮＡ中の遺伝子を効率的に発現させることを開示する。ＷＯ２００６／０８５６６４では、細胞に取り込まれる過程において、上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）においてＲ^３が−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_２−ＮＨ_２で表される基であるときに、エンドソームから細胞質にミセルが極めて効率的に脱出することを開示する。

一方、免疫原性の低いＤＮＡとは異なり、ｍＲＮＡは免疫原性が極めて高いことで知られ、ｍＲＮＡを炎症無く細胞質内に送達するためには、細胞質に送達するまでの全過程でｍＲＮＡを完全にミセル内に封じ込め続けておく必要があると考えられた。そのため、ｍＲＮＡの体内への導入はミセルに内包させた場合でも困難であると予想された。しかし、本発明者らによれば、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、意外にも体内でほとんど炎症反応を引き起こさなかった。このことは、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、細胞質内に特異的にｍＲＮＡを送達できることを示唆する。

また、ｐＤＮＡ内包ミセルでは、ＤＮＡは一部の細胞でしか発現を示さなかったが、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、インビボで肝臓においてほぼ１００％の細胞に均一にタンパク質を発現させた（図３Ａ）。このことは、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、組織全体で均一にｍＲＮＡを発現させたい場合に極めて有利に用いられ得ることを示す。また、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、インビボで非常に素早くｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を発現させた。従って、本願発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、急速なタンパク質発現が要求される場合に有利に用いられ得る。

従って、本発明では、カチオン性ポリマーとｍＲＮＡとのポリイオンコンプレックスを含んでなる、ｍＲＮＡを対象の体内の細胞質に送達するための組成物が提供される。すなわち、本発明の組成物は、ｍＲＮＡを対象の体内の細胞質に送達するためのｍＲＮＡ送達剤である。

このように本発明のポリイオンコンプレックスは、広範な細胞で均一にｍＲＮＡを発現させることができ、投与後迅速にｍＲＮＡを発現させることができ、および／または、体内で炎症反応を引き起こし難い。従って、本発明のポリイオンコンプレックスは、広範な細胞でｍＲＮＡを発現させることが必要であり、かつ、迅速なｍＲＮＡ発現が必要である疾患、例えば、病状の進行の早い疾患や急性疾患の処置に好ましく用いられ得る。

従って、本発明では、本発明のポリイオンコンプレックスを含んでなる、病状の進行の早い疾患や急性疾患を有する対象の体内にｍＲＮＡを送達することに用いるための組成物が提供される。本発明では、本発明のポリイオンコンプレックスを含んでなる、病状の進行の早い疾患や急性疾患を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。

細胞の急速な細胞死を伴う疾患では、細胞死抑制処理により、症状の進行または悪化を抑制ことができる。本発明のポリイオンコンプレックスは、ｍＲＮＡを細胞死抑制因子とすれば、このような疾患の処置に有利に用いることができる。細胞の急速なアポトーシスを伴う疾患では、アポトーシス抑制処理により、症状の進行または悪化を抑制ことができる。本発明のポリイオンコンプレックスは、ｍＲＮＡを抗アポトーシス因子とすれば、このような疾患の処置に有利に用いることができる。細胞の急速な細胞死またはアポトーシスを伴う疾患としては、例えば、急性期脊髄損傷または劇症肝炎が挙げられる。

急性期脊髄損傷および劇症肝炎では、病変部の広範な細胞において細胞死（アポトーシス）が発生する。具体的には、急性期脊髄損傷では、損傷部位で多くの神経細胞が細胞死を起こす。また、劇症肝炎では、肝臓において広範な肝細胞死が発生し、その結果、肝不全が引き起こされる。そして、急性期脊髄損傷および劇症肝炎では、組織全体で均一に細胞死を抑制する処置をすることで、症状の悪化が抑制されるか、症状が改善される。そのため、組織全体で均一にタンパク質を発現させることのできる本発明の医薬組成物は、これらの疾患の処置に好ましく用いられ得る。

従って、本発明の医薬組成物は、ある態様では、細胞死を抑制するものであり、例えば、細胞死抑制因子をコードするｍＲＮＡを含んでなる。本発明の医薬組成物は、ある態様では、アポトーシスを抑制するものであり、例えば、抗アポトーシス因子をコードするｍＲＮＡを含んでなる。

抗アポトーシス因子としては、特に限定されないが、例えば、ＦＬＩＰ、Ｍｃｌ−１、Ｘｉａｐ、ｃｒｍＡ、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬなどが挙げられ、Ｂｃｌ−２が好ましく用いられ得る。このように、急性疾患が、細胞のアポトーシスの亢進を伴う疾患、特に急性疾患である場合には、ｍＲＮＡは抗アポトーシス因子をコードするｍＲＮＡである。

また、本発明のポリイオンコンプレックスは、効率良くｍＲＮＡを細胞に送達することができるため、その他の様々な疾患の処置に適用することができる。本発明で用いられるｍＲＮＡとしては、成長因子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、細胞死促進因子、細胞死抑制因子、癌抑制遺伝子産物および転写因子をコードするｍＲＮＡなどが挙げられ、当業者であれば目的に応じて適宜選択することができる。例えば、特定の細胞を増殖させることが必要な対象に対して該特定の細胞の増殖因子をコードするｍＲＮＡをポリイオンコンプレックスとして投与することで、該対象における疾患や状態を処置することができる。

成長因子とは、特定の細胞の増殖や分化を促進する内因性タンパク質を意味し、特に限定されないが、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。細胞増殖抑制因子としては、特に限定されないが、例えば、ｐ２１、ｐ１７、ｐ１６およびｐ５３が挙げられる。細胞死促進因子としては、特に限定されないが、例えば、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、ＨｔｒＡ２、Ｂａｄ、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、ｐ５３、カスパーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０（例えば、カスパーゼ２、３、６、７、８、９および１０、好ましくはカスパーゼ３、６および７）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）並びにＦｏｘＯ１が挙げられる。細胞死抑制因子としては、上記のような抗アポトーシス因子が挙げられる。癌抑制遺伝子産物としては、特に限定されないが、例えば、ｐ５３、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ）、大腸腺腫症遺伝子（ＡＰＣ）、神経線維腫症１型遺伝子（ＮＦ１）、神経線維腫症２型遺伝子（ＮＦ２）、ＷＴ１、ＶＨＬ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、マスピン、ｐ７３、Ｓｍａｄ４、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＤＣＣ、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＤＨＤ、ｐ１６、ｐ５７^Ｋｉｐ２、ＰＴＣ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＥＸＴ１およびＥＸＴ２が挙げられる。転写因子としては、特に限定されないが、例えば、Ｒｕｎｔ関連転写因子１（Ｒｕｎｘ１）、ｐ５３、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、Ｃ／ＥＢＰ、ＭｙｏＤ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｂ、Ｏｃｔ３／４、ＮＦ−κＢ、ＮＦ−ＡＴ、Ｍｅｆ−２および細胞外シグナル応答因子（ＳＲＦ）などが挙げられる。

本発明によれば、例えば、造血を促進させる必要のある対象（例えば、貧血患者など）において造血を促進させるために用いるための医薬組成物であって、ｍＲＮＡが造血因子（例えば、コロニー刺激因子またはエリスロポエチン）をコードする、本発明のポリイオンコンプレックスを含んでなる医薬組成物を提供する。

本発明によれば、例えば、嗅覚組織（例えば、粘膜上皮細胞または嗅覚神経）の破壊を伴う嗅覚障害を有する対象において、嗅覚障害を処置することに用いるための医薬組成物であって、ｍＲＮＡが脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードする、本発明のポリイオンコンプレックスを含んでなる医薬組成物が提供される。

本発明のさらに別の側面では、癌を有する対象において癌を処置することに用いるための医薬組成物であって、本発明のポリイオンコンプレックスを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞増殖抑制因子、癌抑制遺伝子産物または細胞死促進因子をコードするものである、医薬組成物が提供される。癌組織では、すべての癌細胞の増殖を抑制することが望まれ、増殖抑制因子を癌組織全体に均一に発現させることができる本発明の医薬組成物は特に好適に用いることができる。癌を処置することに用いるための医薬組成物では、本発明のポリイオンコンプレックスは、２０〜１００ｎｍの粒径を有することが好ましい。このようにすることで、本発明のポリイオンコンプレックスは、癌組織近傍の毛細血管から組織に侵入しやすくなる。

本発明の医薬組成物は、賦形剤をさらに含んでいてもよい。

本発明のある側面では、ｍＲＮＡを対象の体内細胞の細胞質に送達する方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる方法が提供される。

本発明のある側面では、対象において組織またはその一部に均一にタンパク質を発現させるために用いられる、ｍＲＮＡを対象の体内細胞の細胞質に送達する方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが発現させたいタンパク質をコードするものである、方法が提供される。組織は、ある態様では、肝臓または粘膜組織（例えば、嗅覚上皮組織）である。

臓器（例えば、肝臓）には、静脈注射で本発明のポリイオンコンプレックスを送達することができるが、ハイドロダイナミクス法により、臓器、特に肝臓へのポリイオンコンプレックスの送達効率を著しく向上させることができる。ハイドロダイナミクス法とは、血液量と同量程度の薬液を静脈から短時間の間に投与する方法であり、投与の際の圧力により臓器の内部に薬液を浸透させるものである。ハイドロダイナミクス法には、部位を限定したものが知られており、例えば、標的部位周辺の血流を一時的に止めた上で、標的部位にその部位に含まれる血液量と同量程度の薬液を投与して薬液を標的組織に浸透させるものも知られており、本発明で用いることができる。

粘膜組織には、本発明のポリイオンコンプレックスを塗布することで送達することができる。本発明のＰＩＣは、塗布により粘膜組織の深部に浸透し、組織またはその一部に取り込まれる。

当業者であれば適切な投与方法を選択して、様々な組織にポリイオンコンプレックスを送達することができる。本発明で用いられる投与方法としては、例えば、皮下注射、筋肉注射、関節内注射およびくも膜下腔注射などが挙げられる。ポリイオンコンプレックスを徐放させるために、コラーゲンスポンジなどの担体にポリイオンコンプレックスを浸潤させて皮下または筋層下に留置する方法も知られ、本発明で用いることができる。

本発明の別の側面では、急性疾患を有する対象において、該疾患の病変部における細胞死を抑制する方法であって、ｍＲＮＡが細胞死抑制因子をコードする本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる方法が提供される。本発明のある態様では、細胞死はアポトーシスであり、細胞死抑制因子は抗アポトーシス因子である。

本発明の別の側面では、細胞死の亢進を伴う疾患を有する対象において該細胞死を抑制する方法であって、ｍＲＮＡが細胞死抑制因子をコードする本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる方法が提供される。本発明のある態様では、細胞死はアポトーシスであり、細胞死抑制因子は抗アポトーシス因子である。

本発明の別の側面では、劇症肝炎または急性期の脊髄損傷を処置する方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞死抑制因子をコードするものである、方法が提供される。本発明のある態様では、細胞死抑制因子は抗アポトーシス因子である。

本発明の別の側面では、造血を促進させる必要のある対象（例えば、貧血患者など）において造血を促進させる方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが造血因子（例えば、コロニー刺激因子またはエリスロポエチン）をコードするものである、方法が提供される。

本発明の別の側面では、嗅覚組織（例えば、粘膜上皮細胞または嗅覚神経）の破壊を伴う嗅覚障害を有する対象において、嗅覚障害を処置する方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードするものである、方法が提供される。

本発明のさらに別の側面では、癌を有する対象において癌を処置する方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞増殖抑制因子、癌抑制遺伝子産物または細胞死促進因子をコードするものである、方法が提供される。

実施例１：ポリイオンコンプレックスの作製
まず、ｍＲＮＡを含有するポリイオンコンプレックスを作製した。

負電荷を有するｍＲＮＡとポリイオンコンプレックスを形成し得るブロック共重合体として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリカチオンとのブロック共重合体を用いた（図１Ａ）。

ＰＥＧ−ポリカチオンブロック共重合体としては、ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体を用いた。

１−１．ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体の合成
まず、ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体を合成した。具体的には、一方の末端がメトキシ基であり、他方の末端がアミノプロピル基である、数平均分子量１２，０００のポリエチレングリコール（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ_２）を塩化メチレンに溶解した。β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）（中央化製品社に製造委託して得た）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と上記塩化メチレン溶液の混合液に添加して溶解させ、反応溶液を得た。次いで、反応溶液を４０℃で２日間反応させて、ポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得た。

ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡのアミノ末端を無水酢酸と反応させてアセチル化し、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃを得た。^１Ｈ−ＮＭＲによる解析から、ＰＢＬＡ部分の数平均分子量は１４，０００であり、重合度は７０であることが分かった。

次に、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃにジエチレントリアミンを反応させて、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体を得た。具体的には、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃをベンゼンに溶解し凍結乾燥させた。凍結乾燥したＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−ＡｃをＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解させた。その後、得られた溶液をジエチレントリアミンのＮＭＰ溶液中に滴下し、５〜１０℃で１時間攪拌した。さらに氷冷下で塩酸で中和し、透析および凍結乾燥を行い、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体を得た。透析は、透析外液を０．０１Ｎ塩酸水溶液とし、最終的には純水として４℃で行った。^１Ｈ−ＮＭＲによる解析から、得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体のｐＡｓｐ（ＤＥＴ）部分の重合度は６３であることが分かった。

１−２．ｍＲＮＡの調製
ｍＲＮＡは、プラスミドＤＮＡを鋳型としてmMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いてインビトロ転写を行うことで作製した。まず、プラスミドＤＮＡは、Ｔ７プロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、エリスロポエチン遺伝子またはＢｃｌ−２遺伝子を導入し、遺伝子の下流に１２０塩基のポリＡ配列を組み込んだ。修飾ｍＲＮＡは、インビトロ転写の際に、塩基として５−メチル−ＣＴＰ、シュード−ＵＴＰおよび２−チオ−ＵＴＰ(TriLink BioTechnologies, San Diego, CA, USA)を添加することにより得た。具体的には、インビトロ転写の際に、全ＣＴＰに対して５−メチル−ＣＴＰを２０モル％、全ＵＴＰに対してシュード−ＵＴＰおよび２−チオ−ＵＴＰを各１０％ずつ加えた。転写された非修飾ｍＲＮＡおよび修飾ＲＮＡは、RNeasy Mini Preparation Kit (Qiagen, Hilden, Germany)で精製した。mRNA濃度は260 nmの吸光度を用いて測定した。

１−３．ポリイオンコンプレックスの調製
ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３））と、ｍＲＮＡ溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３））またはプラスミドＤＮＡ溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３））とを混合して、ポリイオンコンプレックス（それぞれ、ｍＲＮＡ内包ミセルまたはプラスミドＤＮＡ内包ミセルという）を得た。ＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）中のアミノ酸残基のアミノ基（Ｎ）と核酸中のリン酸基と混合比（Ｎ／Ｐ）は、３となるようにした。また、核酸最終濃度が３３．３ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。動的光散乱法（ＤＬＳ）により得られたミセルの粒径を測定した。得られたｍＲＮＡ内包ミセルの粒径は約５０ｎｍであり、得られたプラスミドＤＮＡ内包ミセルの粒径は約９０ｎｍであった。

実施例２：ｍＲＮＡ内包ミセルの投与試験
本実施例では、実施例１で得られたミセルを実験動物に投与してｍＲＮＡからのタンパク質の発現を調べた。

実験動物としては日本チャールズリバーから購入したＢａｌｂ／ｃ（♀、７週齢）を用いた。ｍＲＮＡ内包ミセルはハイドロダイナミクス法によりマウスに投与した。すなわち、それぞれ５μｇのｍＲＮＡ内包ミセルまたはプラスミドＤＮＡ内包ミセルを生理食塩水１．８ｍＬで希釈し、マウス尾静脈より５秒間かけて全量を投与した。ハイドロダイナミクス法により投与された薬剤は肝細胞に効率的に取り込まれることが知られている。

分泌性タンパク質としては、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を用いた。頚部クモ膜下腔にｍＲＮＡ内包ミセルまたはＧＬｕｃタンパク質を投与して、投与後の髄液中でのタンパク質量を５日にわたりモニターした。

すると、図１Ｂに示されるように、ｍＲＮＡ内包ミセルによりｍＲＮＡを投与すると、ＧＬｕｃの持続的な発現が観察された。

実施例３：肝臓へのｍＲＮＡの送達
実施例２と同じ方法でｍＲＮＡ内包ミセルをマウスに投与し、肝臓へのｍＲＮＡの蓄積およびその発現をモニターした。

３−１．肝臓でのタンパク質発現
肝臓でのタンパク質の発現は、ルシフェラーゼの発光により定量した。具体的には、ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを内包させたミセルまたは裸のｍＲＮＡを投与したマウスに、投与４時間後にＤルシフェリン（住友ファーマ）を１５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し、IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA, USA)を用いてその発光を観察、定量した。

その結果、図２ＡおよびＢに示されるように、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスでは、ルシフェラーゼの強い発光が観察されたが、裸のｍＲＮＡを投与したマウスでは、弱い蛍光が観察されるに過ぎなかった。また、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスではルシフェラーゼの発光が長期間持続した（図２Ｂ）。

３−２．肝臓でのタンパク質発現の免疫組織学的解析
さらに、免疫組織学により肝臓でのタンパク質発現を詳細にモニターした。この目的のために、ＧＦＰを発現するｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡを内包させたミセルを投与したマウスから投与２４時間後に肝臓を採取した。得られた肝臓を４％パラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝溶液(和光純薬)で一晩固定し、次いで、１０％、１５％および２０％のスクロースを含有するＰＢＳ溶液中で常温にてそれぞれ４時間、４時間および一晩静置したのち、optimal cutting temperature (OCT) compound (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)中で凍結させた。その後、厚さ１０μｍの組織切片を作成した。ＧＦＰの免疫染色は１次抗体として５００倍希釈の抗ＧＦＰウサギＩｇＧ（インビトロジェン社）と室温で一晩反応させ、その後２次抗体として２００倍希釈Alexa 488ヤギ抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン社）と室温で１時間反応させた。抗体染色した切片は、画像解析機能を搭載した蛍光顕微鏡であるIn Cell Analyzer 1000 (GE ヘルスケア社, Buckinghamshire, UK)を用いて観察した。

その結果、図３Ａに示されるように、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスの肝臓では、すべての細胞が一様にＧＦＰタンパク質を発現したが、プラスミドＤＮＡ内包ミセルでは、一部の細胞がＧＦＰタンパク質の強い発現を示した一方で、多くの細胞ではＧＦＰタンパク質の発現は見られなかった。このことは、蛍光強度分布からも支持された（図３Ｂ）。

３−３．投与されたｍＲＮＡ量の肝臓での分解
ｍＲＮＡの肝臓での分解の有無を確認するため、投与されたｍＲＮＡ量を蛍光標識核酸を用いた方法および定量ＰＣＲ法の両方により定量した。定量ＰＣＲでは、配列の全長が保たれているｍＲＮＡの量が定量され、蛍光標識核酸を用いた方法では、分解されたｍＲＮＡも含むすべてのｍＲＮＡが定量される。実施例２の方法により、マウスにｍＲＮＡ内包ミセルまたは裸のｍＲＮＡを投与し、１０分後に肝臓を採取してｍＲＮＡを定量した。

蛍光標識核酸を用いた方法は以下のように行なった。Label IT（商標） Nucleic Acid Labeling Kit, Cy5 (Mirus, Madison, WI, USA)によりＣｙ５標識されたｍＲＮＡをミセルに内包させてまたはさせないで導入した後、肝臓を採取しホモジナイズした。その後、ホモジナイズ液中の蛍光量を蛍光プレートリーダー (TECAN, Mannedorf, Switzerland)にて測定した。

定量ＰＣＲ法は以下のように行なった。ルシフェラーゼ発現ｍＲＮＡをミセルに内包させてまたはさせないで導入した後、採取した肝臓よりRNA easy mini preparation kit (Qiagen)を用いてｍＲＮＡを抽出した。定量ＰＣＲでは、ＴＧＣＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＧＴＧおよびＡＡＴＧＧＧＡＡＧＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧのプライマーセットを用い、検出はABI Prism 7500 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いた。いずれの方法でも、投与したｍＲＮＡ量のうちの肝臓に導入されたｍＲＮＡ量の割合（％）により肝臓に導入されたｍＲＮＡ量を求めた。

その結果、裸のｍＲＮＡを投与したマウスでは、ｍＲＮＡが肝臓で急速に分解を受けているのに対して、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスでは、ｍＲＮＡの分解はほとんど確認されなかった（図３Ｃ）。

実施例４：ｍＲＮＡ内包ミセルによる炎症反応
本実施例では、ｍＲＮＡ内包ミセルを導入することにより生じる炎症反応を調べた。

ｍＲＮＡ導入による炎症の誘発を評価した。具体的には、実施例２の通りマウスにｍＲＮＡ内包ミセルを投与した。実施例３−３の方法に従って投与４時間後に抽出したｍＲＮＡを用い、ABI Prism 7500 Sequence Detector (Applied Biosystems)とTaqman Gene Expression Assays (Applied Biosystem, IL-6: Mm00446190_m1, TNF-α: Mm00443258, IFN-β: Mm00439552_s1)により炎症性サイトカインのｍＲＮＡの量を定量ＰＣＲにより定量した。ｍＲＮＡ量はβ−アクチン量(Mm00607939)のｍＲＮＡ量で標準化した。対照としては、生理食塩水を投与したマウスを用いた。

すると、非修飾ｍＲＮＡ（天然型）内包ミセルでは、裸のｍＲＭＡを導入する場合と比較して炎症性サイトカインＩＬ−６の産生量は極めて低かった（図４Ａ）。修飾ｍＲＮＡでは、非修飾ｍＲＮＡを導入する場合と比較して炎症性サイトカインＩＬ−６の産生量は低かったが、ミセルに内包させることにより炎症性サイトカインＩＬ−６の産生量を低減させることができた（図４Ａ）。ｍＲＮＡは強い免疫原性で知られるため、炎症性サイトカインの産生が対照と同等程度であったことは驚くべきことであった。

ｍＲＮＡ内包ミセルは細胞にエンドサイトーシスにより取り込まれると考えられる。そして、エンドソーム内はｐＨが低いため、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは側鎖のアミン構造が変化してその膜融合性を増加させ、これによりミセルはエンドソームから細胞内に移行すると考えられる（Miyata et al., J. Am. Chem. Soc., 130 (48): 16287-16294 (2008)）。エンドソームの内表面にはトル様受容体（ＴＬＲ）が発現しており、ｍＲＮＡを認識すると自然免疫を惹起する。そのため、エンドソーム内でｍＲＮＡが放出された場合には、それが例え少ない量であったとしても強い自然免疫応答が惹起される。しかしながら、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、驚くべきことに炎症反応をほとんど惹起しなかった。

このことから、本発明のミセルは、ｍＲＮＡを内包したミセルであること、および、エンドソーム内では放出させずにｍＲＮＡを細胞質内に送達できる高い選択性を有することが理解できる。また、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルのこの驚くべき性質がｍＲＮＡの細胞への効率的な送達を可能にしたと考えられる。

また、タンパク質発現の持続時間を非修飾ｍＲＮＡ内包ミセルと修飾ＲＮＡ内包ミセルとで比較した。ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼのｍＲＮＡを用い、ルシフェラーゼの発現量を実施例３に記載の方法により測定した。

すると、修飾ｍＲＮＡ内包ミセルでは、より長く持続する発現を示した（図４Ｂ）。

実施例５：造血回復実験
本実施例では、エリスロポエチンのｍＲＮＡを内包したミセルを投与したマウスでの造血回復を確認した。

実施例２に記載の方法によりエリスロポエチン遺伝子のｍＲＮＡを内包させたミセルを投与したマウスから投与２８日後または５６日後に血液を採取し、ヘマトクリットおよびヘモグロビン値をpocH-100i (Sysmex社、兵庫)により測定した。

その結果、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスでは、ヘマトクリットおよびヘモグロビンのいずれにもいても有意に増加を示し、効果的かつ持続的な造血効果を示すことが分かった（図５）。

実施例６：点鼻投与による嗅覚障害モデル動物の治療
本実施例では、ｍＲＮＡ内包ミセルの点鼻投与による嗅覚障害モデル動物の治療を試みた。

６−１．ルシフェラーゼタンパク質の発現定量
まず、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを内包するミセルは、核酸最終濃度を２００μｇ／ｍＬとする以外は実施例１に記載の方法により調製した。４匹のマウスを麻酔下で仰臥位に保持し、ｍＲＮＡ内包ミセル溶液５０μＬ（ｍＲＮＡは１０μｇ含有）を鼻孔上に点下した。対照としてミセルに内包させていない裸のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）およびｍＲＮＡのそれぞれ１０μｇを鼻孔に点下した。投与４時間後、２４時間後または４８時間後に１５ｍｇ／ｍＬのＤルシフェリン（住友ファーマ社製）を２００μＬ点鼻投与した。１０分後、IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA, USA)を用いて，ルシフェラーゼ発光を観察、定量した。

その結果、図６Ａに示されるように、ｍＲＮＡ内包ミセルでは、ルシフェラーゼの高発現が認められた。発現は、ミセル投与４時間後から観察され、４８時間後まで発現が持続した。

培養細胞にｍＲＮＡをトランスフェクションすると、通常は、数時間後から長くても４８時間程度しか発現が持続しないため、本発明で４８時間後でも発現が持続していることは、とても意外なことであった。

なお、ｍＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ発現プラスミドＤＮＡを内包するミセルでも同様の実験を行なったが、タンパク質の発現は観察されなかった（データ掲載省略）。また、ルシフェラーゼをコードする裸のｍＲＮＡまたはＤＮＡの投与でも、タンパク質の発現は観察されなかった（データ省略）。

６−２．ＧＦＰタンパク質の発現定量（免疫組織化学）
また、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡを内包するミセルは、本実施例のルシフェラーゼｍＲＮＡ内包ミセルの調製方法と同じ方法により調製した。ｍＲＮＡ内包ミセル溶液５０μＬ（ｍＲＮＡは１０μｇ含有）を鼻孔上に点下した。投与２４時間後、マウスを安楽死させ、鼻部を切除し、嗅球前縁から５μｍ厚の凍結切片を作製した。

発現したＧＦＰタンパク質の免疫組織化学染色は常法に従い行なった。１次抗体としては、５００倍希釈の抗ＧＦＰウサギＩｇＧ（インビトロジェン社製）を用い、室温で一晩切片と反応させた。２次抗体としては、２００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン社製）を用い、室温で１時間切片と反応させた。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含有するブロッキング液（同人堂、熊本、日本）により染色した。得られた切片は、顕微鏡として蛍光顕微鏡（Axiovert 200 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)） を用い、対物レンズとして20×EC Plan Neofuar objective (Carl Zeiss）を用いて観察した。

その結果、図６Ｂに示されるように、粘膜皮下組織全体において均一にＧＦＰが発現していることが明らかであった。

６−３．嗅覚障害行動試験による治療効果の評価
嗅覚障害行動試験は、マウスがチーズ片を発見するまでの時間を評価することにより行なった。具体的には、嗅覚障害モデルとして、メチマゾールにより嗅覚障害を誘発させたマウスを用いた。まず、１５０ｍｇ／ｋｇ体重のメチマゾールをマウスに腹腔内投与し、マウスに嗅覚障害を誘発させた。メチマゾール投与２４時間後、嗅覚障害モデルマウス（７匹）を１匹ずつケージに入れ、２４時間絶食させた。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードするｍＲＮＡを内包するミセルを実施例１と同じ方法により調製し、得られたミセル溶液５０μＬ（ｍＲＮＡを１０μｇ含有する）をマウスの鼻孔に点鼻投与した。対照のマウスには、バッファーのみを投与した。ミセル投与１日後、３日後、５日後、７日後または１０日後に行動試験を行なった。この試験では、行動試験の２４時間前からマウスを絶食させた。４ｃｍ厚に敷いた床敷きのケージ隅にチーズ小片を置き、マウスがチーズを発見して把持または摂食開始するまでの時間を計測した。試験は１０分の間隔を置いて４回繰り返して行った。所要時間のカットオフ値を５分に設定し、それまでにマウスがチーズを発見できないときは、所要時間５分と記録した。

その結果、図６Ｃに示されるように、ＢＤＮＦ発現ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスでは、チーズ片を発見するまでの時間が対照マウスと比べて有意に短く、回復速度も改善していた。

６−４．組織学による治療効果の評価
ｍＲＮＡ内包ミセルによる嗅覚障害の治療効果を組織学的に検証した。ｍＲＮＡ内包ミセル投与１日後、７日後、１４日後または２８日後に、マウスを安楽死させ、頭部を切除した。脱灰後、頭部組織をパラフィン法包埋し、５μｍ厚の組織切片を作製した。その後、切片をヘマトキシリンエオジン染色した。嗅覚マーカータンパク質（ＯＭＰ）の発現を可視化するため免役組織化学染色を行なった。１次抗体としては、５０００倍希釈のヤギ抗ＯＭＰ抗体を含むブロッキング液（Wako Chemical USA, Richmond, VA）を用いて切片と室温で一晩反応させ、２次抗体としては４００倍希釈したAlexa546-conjugated secondary antibodyを含むブロッキング液（インビトロジェン社製）を用いて切片と室温で１時間反応させた。核は、roLong Gold Antifade Reagent with DAPI（インビトロジェン社製）により染色した。

結果、ＢＤＮＦをコードするｍＲＮＡ内包ミセルを投与した群では、７日後、１４日後および２８日後において明らかな嗅覚上皮組織および嗅覚神経の回復が見られた（図６Ｄ）。また、再生した組織は、ＯＭＰを発現していた（図６Ｅ）。これにより、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルにより神経細胞が効率よく回復することが示された。

このように、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、点鼻投与により嗅覚障害モデルを治療することができた。

実施例７：劇症肝炎に対する治療効果
本実施例では、アポトーシスを抑制する因子をコードするｍＲＮＡ内包ミセルを投与することにより、急速な細胞死が広範に引き起こされることで知られる劇症肝炎に対する治療を試みた。

まず、Fasリガンド（ＦａｓＬ）であるＪｏ−２(BD Bioscience)を５μｇを腹腔内投与することで、劇症肝炎モデルを作製した。作製１５分後に劇症肝炎マウスにＢｃｌ−２遺伝子のｍＲＮＡを内包するミセル、Ｂｃｌ−２遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドＤＮＡまたは生理食塩水を上述の通りに投与し、投与４時間後にマウスから肝臓を採取した。上記の方法で肝臓の切片を作製し、in situ cell death detection kit, TMR red (Roche, Basel, Switzerland)を用いて、ＴＵＮＥＬ染色処理を行った。In Cell Analyzer 1000にて観察した後、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を、In Cell Analyzer 1000のソフトウェアにて定量した。１視野当りの細胞数は平均２，０００個であり、マウス１匹あたり５視野以上を解析に用いた。

その結果、生理食塩水を投与した群およびプラスミドＤＮＡを投与した群では、未処理の群と比べてＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合が増加し、却って病態が悪化したが、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与した群では、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合が減少し、病態が改善した（図７）。

すべての細胞に均一、急速かつ持続的にタンパク質を発現させられるｍＲＮＡ内包ミセルの性質が、急速な細胞死が広範に引き起こされることで知られる劇症肝炎の治療上有効であったことを示唆するものである。

このように、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、広範な細胞が急速に変容し、病態が急速に悪化する疾患に対して有効な治療法を提供するものと評価される。

ｍＲＮＡは、その強い免疫原性と高い不安定性のために導入薬剤の候補としては適していないと考えられてきた。しかし、本発明によれば、ｍＲＮＡ内包ミセルは、意外にも、免疫原性がほとんど無く、かつ、インビボですべての細胞に均一、迅速かつ持続的にタンパク質を発現する方法を提供するものであった。ｍＲＮＡは、ゲノムへのインテグレーションを起こさない点で安全な遺伝子治療法を提供するものとして期待される。

Claims (26)

1. カチオン性ポリマーとメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とを含んでなる、ポリイオンコンプレックス。
2. カチオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールブロックとのブロック共重合体を形成している、請求項１に記載のポリイオンコンプレックス。
3. カチオン性ポリマーが、
   カチオン性天然アミノ酸、
   カチオン性非天然アミノ酸、または、
   カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸
   を含むモノマー単位の重合体である、請求項１または２に記載のポリイオンコンプレックス。
4. カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である｝を有するアミノ酸である、請求項３に記載のポリイオンコンプレックス。
5. カチオン性ポリマーが、下記一般式（Ｉ）：
   ｛式中、
   Ｒ^１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
   Ｒ^４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
   Ｒ^２は、メチレンまたはエチレンであり、
   Ｒ^３は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基であり、
   Ｘは、カチオン性天然アミノ酸から選択されるいずれか１のアミノ酸であり、
   ｐは、１〜５のいずれかの整数であり、好ましくは、ｐは、２、３または４であり、
   ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、
   ｎ_１は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
   ｎ_３は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
   ｎ−ｎ_１−ｎ_３は、０以上の整数であり、式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい。｝
   で表されるポリカチオンブロックであり、
   但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ^１またはＲ^４は結合を表し、ポリエチレングリコールは、結合であるＲ^１またはＲ^４を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している、
   請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス。
6. ポリカチオンブロックが、下記一般式（ＩＩ）：
   ｛式中、
   Ｒ^１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
   Ｒ^４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
   Ｒ^２は、メチレンまたはエチレンであり、
   Ｒ^３は、−（ＮＨ−（ＣＨ_２）_２）_ｐ−ＮＨ_２で表される基であり、
   ｐは１〜５のいずれかの整数であり、
   ｑは、１〜５のいずれかの整数であり、
   ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、
   ｎ_１は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
   ｎ_２は、０〜５０００のいずれかの整数であり、
   ｎ−ｎ_１−ｎ_２は、０以上の整数であり、
   式中の各繰り返し単位は特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい。｝
   で表されるポリカチオンブロックであり、
   但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ^１またはＲ^４は結合を表し、ポリエチレングリコールは、結合であるＲ^１またはＲ^４を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している、
   請求項５に記載のポリイオンコンプレックス。
7. ｍＲＮＡが、成長因子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、細胞死促進因子、細胞死抑制因子、癌抑制遺伝子産物または転写因子をコードするｍＲＮＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス。
8. 細胞増殖因子が、造血因子または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である、請求項７に記載のポリイオンコンプレックス。
9. 細胞死抑制因子が、Ｂｃｌ−２である、請求項７に記載のポリイオンコンプレックス。
10. ｍＲＮＡが、修飾されたシチジンおよびウリジンを含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス。
11. ｍＲＮＡを対象の体内細胞の細胞質に送達する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる、方法。
12. 対象において、対象の組織またはその一部に均一にタンパク質を発現させるための請求項１１に記載の方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる、方法。
13. 組織が肝臓または粘膜組織である、請求項１２に記載の方法。
14. 急性疾患を有する対象において、該疾患の病変部における細胞死を抑制する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞死抑制因子をコードするものである、方法。
15. 造血を促進させる必要のある対象において造血を促進させる方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが造血因子をコードするものである、方法。
16. 嗅覚障害を有する対象において嗅覚障害を処置する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードするものである、方法。
17. 癌を有する対象において癌を処置する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞増殖抑制因子、癌抑制遺伝子産物または細胞死促進因子をコードするものである、方法。
18. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを含んでなる、ｍＲＮＡを体内の細胞内に送達することに用いるための組成物。
19. 対象において、対象の組織またはその一部に均一にタンパク質を発現させることに用いるための、請求項１８に記載の組成物。
20. 組織が肝臓または粘膜組織である、請求項１９に記載の組成物。
21. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを含んでなる、医薬組成物。
22. 急性疾患をその必要のある対象において処置することに用いるための、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 疾患が、劇症肝炎または急性期の脊髄損傷である、請求項２２に記載の医薬組成物。
24. 疾患がアポトーシスの亢進を伴う疾患である、請求項２２または請求項２３に記載の医薬組成物。
25. 嗅覚障害をその必要のある対象において処置することに用いるための、請求項２１に記載の医薬組成物。
26. 対象における造血を促進させることに用いるための、請求項２１に記載の医薬組成物であって、ｍＲＮＡが造血因子をコードする、医薬組成物。