JP2001161372A - アポトーシス抑制ポリペプチド、それをコードする遺伝子およびポリヌクレオチド、並びにそれらを含む組成物 - Google Patents
アポトーシス抑制ポリペプチド、それをコードする遺伝子およびポリヌクレオチド、並びにそれらを含む組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 野生型Ｂｃｌ−２タンパク質のアポトーシス
抑制活性を増強する目的でそのアミノ酸配列の一部に変
異を導入する。 【解決手段】 野生型Ｂｃｌ−２タンパク質のアミノ酸
配列内の少なくとも一つセリンをアラニンまたはアスパ
ラギン酸で置換する。
抑制活性を増強する目的でそのアミノ酸配列の一部に変
異を導入する。 【解決手段】 野生型Ｂｃｌ−２タンパク質のアミノ酸
配列内の少なくとも一つセリンをアラニンまたはアスパ
ラギン酸で置換する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞のアポトーシ
スを調節する遺伝子に関する。さらに詳しくは、本発明
は、ヒト瀘胞性Ｂ細胞リンパ腫由来の癌遺伝子Ｂｃｌ−
２の変異体およびそれらがコードするアポトーシス抑制
Ｂｃｌ−２変異体タンパク質に関する．
スを調節する遺伝子に関する。さらに詳しくは、本発明
は、ヒト瀘胞性Ｂ細胞リンパ腫由来の癌遺伝子Ｂｃｌ−
２の変異体およびそれらがコードするアポトーシス抑制
Ｂｃｌ−２変異体タンパク質に関する．
【０００２】
【従来の技術】１．細胞死とアポトーシス 従来、細胞死とは、火傷などにより一群の細胞が死ぬ、
病理的細胞死である“ネクローシス”（ｎｅｃｒｏｓｉ
ｓ）のみが知られていた。アポトーシス（ａｐｏｐｔｏ
ｓｉｓ）は、１９７２年、Ｋｅｒｒ，Ｗｙｌｌｉｅ、お
よびＣｕｒｒｉｅの３人の病理学者達によって、ネクロ
ーシスとは形態学的に異なる細胞死として発見され、定
義された細胞死である（Ｋｅｒｒ等：Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ２６，２３９（１９７２））。アポトーシスは、
その形態のみならず、機能においてもネクローシスとは
異なり、組織の細胞動態に広範な意義を有するものとし
て提起された。その特徴から、遺伝子にプログラムされ
た能動的過程（プログラム細胞死）と考えられている。
病理的細胞死である“ネクローシス”（ｎｅｃｒｏｓｉ
ｓ）のみが知られていた。アポトーシス（ａｐｏｐｔｏ
ｓｉｓ）は、１９７２年、Ｋｅｒｒ，Ｗｙｌｌｉｅ、お
よびＣｕｒｒｉｅの３人の病理学者達によって、ネクロ
ーシスとは形態学的に異なる細胞死として発見され、定
義された細胞死である（Ｋｅｒｒ等：Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ２６，２３９（１９７２））。アポトーシスは、
その形態のみならず、機能においてもネクローシスとは
異なり、組織の細胞動態に広範な意義を有するものとし
て提起された。その特徴から、遺伝子にプログラムされ
た能動的過程（プログラム細胞死）と考えられている。
【０００３】アポトーシスは、複雑な真核生物において
発育および自己維持のために多くの細胞が死滅するプロ
セスである。アポトーシスによる細胞死は、外因性また
は内因性シグナルにより、細胞が、内部にコードされた
自殺プログラムを活性化するときに起こる。アポトーシ
スは、細胞質膜小気胞化（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、細胞容
積損失、核凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）、および
ＤＮＡがヌクレオソーム間隔で分解されることにより特
徴づけられる（Ｗｙｌｌｉｅ等：Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙ
ｔｏｌ． ６８，２５１（１９８０））。
発育および自己維持のために多くの細胞が死滅するプロ
セスである。アポトーシスによる細胞死は、外因性また
は内因性シグナルにより、細胞が、内部にコードされた
自殺プログラムを活性化するときに起こる。アポトーシ
スは、細胞質膜小気胞化（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、細胞容
積損失、核凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）、および
ＤＮＡがヌクレオソーム間隔で分解されることにより特
徴づけられる（Ｗｙｌｌｉｅ等：Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙ
ｔｏｌ． ６８，２５１（１９８０））。
【０００４】アポトーシスは、１個の受精卵から始まる
生命の誕生の初期から、死に至るまで、正常な身体の働
きの維持に必須の役割を果たし、その異常は癌を含む多
くの疾病に関係する。こうした細胞死の機構には共通す
る遺伝子が関与していることも明らかになった。そし
て、癌遺伝子や癌抑制遺伝子の多くがアポトーシスと関
連した遺伝子であることがわかってきた。アポトーシス
は、免疫、ホルモン作用など生理的現象の発現の際にも
みられ、これら生命現象に必須な“生理的細胞死”とし
ても重要な役割を果たしている。最近、プログラムされ
た細胞死を調節するメカニズムの研究は驚くべき勢いで
進展している（Ｗｉｌｌｉａｍｓ：Ｃｅｌｌ ６５，１
０９７（１９９１））。
生命の誕生の初期から、死に至るまで、正常な身体の働
きの維持に必須の役割を果たし、その異常は癌を含む多
くの疾病に関係する。こうした細胞死の機構には共通す
る遺伝子が関与していることも明らかになった。そし
て、癌遺伝子や癌抑制遺伝子の多くがアポトーシスと関
連した遺伝子であることがわかってきた。アポトーシス
は、免疫、ホルモン作用など生理的現象の発現の際にも
みられ、これら生命現象に必須な“生理的細胞死”とし
ても重要な役割を果たしている。最近、プログラムされ
た細胞死を調節するメカニズムの研究は驚くべき勢いで
進展している（Ｗｉｌｌｉａｍｓ：Ｃｅｌｌ ６５，１
０９７（１９９１））。
【０００５】２．アポトーシスの異常と疾病、治療 生体防御機構の中心である免疫系は、アポトーシスとも
っとも関連の深い領域である。胸腺を中心とした免疫系
の成立においても、アポトーシス関連遺伝子の異常は自
己免疫疾患の原因となる。また、ＨＩＶなどウイルス感
染では、リンパ球の急激な減少がアポトーシスによって
誘発されることがある。神経系の形成においてもアポト
ーシスは重要な役割を演じている。また、アルツハイマ
ー病、パーキンソン病、再灌流傷害による記憶障害など
神経細胞死を伴う疾患においてもアポトーシスが重要視
されている。発癌の病理においてもアポトーシスの関連
が大きくクローズアップされている。大腸で発癌頻度が
高いのに比べて、小腸で発癌頻度が極端に低いのは、小
腸上皮幹細胞でのアポトーシス発現がきわめて高いゆえ
であると説明されている。このように、アポトーシスは
発癌の病理に、直接関わっている可能性が考えられる。
っとも関連の深い領域である。胸腺を中心とした免疫系
の成立においても、アポトーシス関連遺伝子の異常は自
己免疫疾患の原因となる。また、ＨＩＶなどウイルス感
染では、リンパ球の急激な減少がアポトーシスによって
誘発されることがある。神経系の形成においてもアポト
ーシスは重要な役割を演じている。また、アルツハイマ
ー病、パーキンソン病、再灌流傷害による記憶障害など
神経細胞死を伴う疾患においてもアポトーシスが重要視
されている。発癌の病理においてもアポトーシスの関連
が大きくクローズアップされている。大腸で発癌頻度が
高いのに比べて、小腸で発癌頻度が極端に低いのは、小
腸上皮幹細胞でのアポトーシス発現がきわめて高いゆえ
であると説明されている。このように、アポトーシスは
発癌の病理に、直接関わっている可能性が考えられる。
【０００６】以上のような病因研究のみならず、治療の
分野でも新しい考えが生まれようとしている。癌治療で
いえば、これまでは、癌細胞の増殖阻害のみが治療の目
標であったが、癌細胞に積極的にアポトーシスを誘導し
治療効果を上げようとするアプローチが生まれている。
分野でも新しい考えが生まれようとしている。癌治療で
いえば、これまでは、癌細胞の増殖阻害のみが治療の目
標であったが、癌細胞に積極的にアポトーシスを誘導し
治療効果を上げようとするアプローチが生まれている。
【０００７】このように細胞死の過剰や過小が、多くの
疾病と関連していることから、アポトーシスの制御によ
る治療への期待が高まっている。従って、アポトーシス
を促進あるいは抑制する因子、薬剤を開発することによ
り、アポトーシスに関連する疾病の治療に応用できる可
能性も開けるであろう。
疾病と関連していることから、アポトーシスの制御によ
る治療への期待が高まっている。従って、アポトーシス
を促進あるいは抑制する因子、薬剤を開発することによ
り、アポトーシスに関連する疾病の治療に応用できる可
能性も開けるであろう。
【０００８】３．アポトーシス関連遺伝子（Ｂｃｌ−２
遺伝子） Ｂｃｌ−２遺伝子は、ヒト瀘胞性Ｂ細胞リンパ腫に高頻
度でみられるｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）転座
点近傍に位置する癌遺伝子として、１９８５年辻本らに
より発見された（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ Ｙ．等：Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２２８，１４４０（１９８５））。８８年、
ＶａｕｘらによりＢｃｌ−２のアポトーシス抑制作用が
報告されて以来、多くのアポトーシスを誘導する系にお
いてＢｃｌ−２の保護効果が示されてきた。９３年来、
Ｂｃｌ−２とホモロジーを示す遺伝子、およびＢｃｌ−
２蛋白に結合する因子の遺伝子探索が勢力的に行われ、
多数のファミリー遺伝子が同定されてきた。
遺伝子） Ｂｃｌ−２遺伝子は、ヒト瀘胞性Ｂ細胞リンパ腫に高頻
度でみられるｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）転座
点近傍に位置する癌遺伝子として、１９８５年辻本らに
より発見された（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ Ｙ．等：Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２２８，１４４０（１９８５））。８８年、
ＶａｕｘらによりＢｃｌ−２のアポトーシス抑制作用が
報告されて以来、多くのアポトーシスを誘導する系にお
いてＢｃｌ−２の保護効果が示されてきた。９３年来、
Ｂｃｌ−２とホモロジーを示す遺伝子、およびＢｃｌ−
２蛋白に結合する因子の遺伝子探索が勢力的に行われ、
多数のファミリー遺伝子が同定されてきた。
【０００９】Ｂｃｌ−２遺伝子は３つのエキソンからな
る。Ｂｃｌ−２遺伝子はスプライシングの有無により複
数のｍＲＮＡを作りだし、２種類の蛋白（２６ｋＤのＢ
ｃｌ−２αと２２ｋＤのＢｃｌ−２β）の産生が予想さ
れるが、生体内ではＢｃｌ−２αのみが検出されてい
る。Ｂｃｌ−２蛋白はＣ末端の疎水性アミノ酸領域を膜
局在シグナルとし、核外膜、小胞体膜、ミトコンドリア
膜に存在する。
る。Ｂｃｌ−２遺伝子はスプライシングの有無により複
数のｍＲＮＡを作りだし、２種類の蛋白（２６ｋＤのＢ
ｃｌ−２αと２２ｋＤのＢｃｌ−２β）の産生が予想さ
れるが、生体内ではＢｃｌ−２αのみが検出されてい
る。Ｂｃｌ−２蛋白はＣ末端の疎水性アミノ酸領域を膜
局在シグナルとし、核外膜、小胞体膜、ミトコンドリア
膜に存在する。
【００１０】Ｂｃｌ−２は、ほとんどすべての刺激で誘
導されるアポトーシスを効率よく抑制しうることが示さ
れており、Ｂｃｌ−ＸＬとともにアポトーシスの共通経
路で機能すると考えられている。一方、Ｂｃｌ−２ファ
ミリーの他のメンバーであるＢａｘ，Ｂａｋ，Ｂａｄ，
Ｂｉｋ，Ｂｃｌ−ＸＳは、Ｂｃｌ−２，Ｂｃｌ−ＸＬの
アポトーシス抑制作用を抑える。Ｂａｘなどのこの機能
は、Ｂｃｌ−２やＢｃｌ−ＸＬとヘテロダイマーを形成
することで達成されると考えられている。Ｂｃｌ−２
は、上記のファミリーメンバー以外に、Ｒ−Ｒａｓ，Ｂ
ａｇ−１，Ｒａｆ−１などとも結合しうることが報告さ
れている。Ｂｃｌ−２とＢｃｌ−ＸＬは、一部のネクロ
ーシス（ミトコンドリア呼吸鎖阻害による）を阻害する
ことができる。
導されるアポトーシスを効率よく抑制しうることが示さ
れており、Ｂｃｌ−ＸＬとともにアポトーシスの共通経
路で機能すると考えられている。一方、Ｂｃｌ−２ファ
ミリーの他のメンバーであるＢａｘ，Ｂａｋ，Ｂａｄ，
Ｂｉｋ，Ｂｃｌ−ＸＳは、Ｂｃｌ−２，Ｂｃｌ−ＸＬの
アポトーシス抑制作用を抑える。Ｂａｘなどのこの機能
は、Ｂｃｌ−２やＢｃｌ−ＸＬとヘテロダイマーを形成
することで達成されると考えられている。Ｂｃｌ−２
は、上記のファミリーメンバー以外に、Ｒ−Ｒａｓ，Ｂ
ａｇ−１，Ｒａｆ−１などとも結合しうることが報告さ
れている。Ｂｃｌ−２とＢｃｌ−ＸＬは、一部のネクロ
ーシス（ミトコンドリア呼吸鎖阻害による）を阻害する
ことができる。
【００１１】Ｂ細胞系でＢｃｌ−２を過剰発現するトラ
ンスジェニックマウスは、良性のリンフアデノパチーを
呈し、その後一定頻度で悪性のリンパ腫を形成する。ま
たＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）に似た自己免疫疾
患の発症もみられる。Ｔ細胞でＢｃｌ−２を過剰発現す
るトランスジェニックマウスは、過剰のＴ細胞蓄積を示
さない。胸腺で起こるＴ細胞の自己抗原認識Ｔ細胞の除
去も、ほぼ正常に進行することが示されている。
ンスジェニックマウスは、良性のリンフアデノパチーを
呈し、その後一定頻度で悪性のリンパ腫を形成する。ま
たＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）に似た自己免疫疾
患の発症もみられる。Ｔ細胞でＢｃｌ−２を過剰発現す
るトランスジェニックマウスは、過剰のＴ細胞蓄積を示
さない。胸腺で起こるＴ細胞の自己抗原認識Ｔ細胞の除
去も、ほぼ正常に進行することが示されている。
【００１２】神経細胞にＢｃｌ−２を高発現させたトラ
ンスジェニックマウスでは、正常な個体発生途上で作り
出される過剰な神経細胞の除去が抑制される。また、こ
のマウスは神経切断や虚血による細胞死に対して耐性を
示す。肝細胞にＢｃｌ−２を高発現させたトランスジェ
ニックマウスでは、抗Ｆａｓ抗体による劇症肝炎の誘発
が有位に抑制される。
ンスジェニックマウスでは、正常な個体発生途上で作り
出される過剰な神経細胞の除去が抑制される。また、こ
のマウスは神経切断や虚血による細胞死に対して耐性を
示す。肝細胞にＢｃｌ−２を高発現させたトランスジェ
ニックマウスでは、抗Ｆａｓ抗体による劇症肝炎の誘発
が有位に抑制される。
【００１３】Ｂｃｌ−２欠損マウスは一見正常に生まれ
るが、発育不良や小外耳介、白毛、多嚢胞腎といった異
常のほかに、リンパ球や腸上皮細胞の短命による異常を
伴う。胸腺Ｔ細胞においては、Ｂｃｌ−２は成熟Ｔ細胞
（ＣＤ４＋ＣＤ８−およびＣＤ４−ＣＤ８＋）に発現が
みられ、未熟Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８）での発現は低
い。Ｂｃｌ−２は成熟胸腺細胞の維持に重要な働きをし
ていることが示されている。
るが、発育不良や小外耳介、白毛、多嚢胞腎といった異
常のほかに、リンパ球や腸上皮細胞の短命による異常を
伴う。胸腺Ｔ細胞においては、Ｂｃｌ−２は成熟Ｔ細胞
（ＣＤ４＋ＣＤ８−およびＣＤ４−ＣＤ８＋）に発現が
みられ、未熟Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８）での発現は低
い。Ｂｃｌ−２は成熟胸腺細胞の維持に重要な働きをし
ていることが示されている。
【００１４】４．Ｂｃｌ−２遺伝子のリン酸化 １９９５年、ＨａｌｄａｒらはＢｃｌ−２リン酸化によ
ってそのアポトーシス抑制作用が喪失する可能性を指摘
した（Ｈａｌｄａｒ Ｓ等：ＰＮＡＳ ９２４５０７
（１９９５））。彼らはＢｃｌ−２中のセリン残基の一
部がリンパ球中でリン酸化されることを見いだし、リン
酸の加水分解酵素阻害剤であるオカダ酸、タキソールを
加えた系でＢｃｌ−２の抗アポトーシス能が阻害される
ことを示した。
ってそのアポトーシス抑制作用が喪失する可能性を指摘
した（Ｈａｌｄａｒ Ｓ等：ＰＮＡＳ ９２４５０７
（１９９５））。彼らはＢｃｌ−２中のセリン残基の一
部がリンパ球中でリン酸化されることを見いだし、リン
酸の加水分解酵素阻害剤であるオカダ酸、タキソールを
加えた系でＢｃｌ−２の抗アポトーシス能が阻害される
ことを示した。
【００１５】また芝崎らは、ＢＨ−４領域にセリン／ス
レオニンの脱リン酸化酵素であるカリシニューリンが結
合することを見いだした（Ｓｈｉｂａｓａｋｉ Ｆ等：
Ｎａｔｕｒｅ ３８６ ７２８−７３１（１９９
７））。彼らはセリン／スレオニンの脱リン酸化酵素で
あるカルシュニューリンがＢｃｌ−２のＢＨ４ドメイン
に直接結合し、リン酸化・脱リン酸化を調節することで
Ｂｃｌ−２の機能を制御していることを示した。
レオニンの脱リン酸化酵素であるカリシニューリンが結
合することを見いだした（Ｓｈｉｂａｓａｋｉ Ｆ等：
Ｎａｔｕｒｅ ３８６ ７２８−７３１（１９９
７））。彼らはセリン／スレオニンの脱リン酸化酵素で
あるカルシュニューリンがＢｃｌ−２のＢＨ４ドメイン
に直接結合し、リン酸化・脱リン酸化を調節することで
Ｂｃｌ−２の機能を制御していることを示した。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、野生型Ｂｃ
ｌ−２よりさらに強力なアポトーシス抑制活性を有する
Ｂｃｌ−２変異体タンパク質、および該タンパク質をコ
ードするＢｃｌ−２変異体遺伝子を提供することを目的
とする。
ｌ−２よりさらに強力なアポトーシス抑制活性を有する
Ｂｃｌ−２変異体タンパク質、および該タンパク質をコ
ードするＢｃｌ−２変異体遺伝子を提供することを目的
とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】上述のとおり、Ｂｃｌ−
２分子中のセリン残基のリン酸化／脱リン酸化がそのア
ポトーシス抑制活性に影響を与えるであろうと予想され
ている。従って、本発明者らは、これらセリン残基の重
要性に着目して、野生型Ｂｃｌ−２のアポトーシス抑制
活性を向上させるべく鋭意検討を行った結果、そのＢＨ
−４領域内に存在する２４番目のセリンをアラニンまた
はアスパラギン酸で置換した変異体が野生型Ｂｃｌ−２
に比べて有意に増強されたアポトーシス抑制活性を示す
ことを見いだした。
２分子中のセリン残基のリン酸化／脱リン酸化がそのア
ポトーシス抑制活性に影響を与えるであろうと予想され
ている。従って、本発明者らは、これらセリン残基の重
要性に着目して、野生型Ｂｃｌ−２のアポトーシス抑制
活性を向上させるべく鋭意検討を行った結果、そのＢＨ
−４領域内に存在する２４番目のセリンをアラニンまた
はアスパラギン酸で置換した変異体が野生型Ｂｃｌ−２
に比べて有意に増強されたアポトーシス抑制活性を示す
ことを見いだした。
【００１８】また、本発明者らは、Ｂｃｌ−２のＢＨ−
４領域以外に存在する特定の部位のセリン残基をアラニ
ンまたはアスパラギン酸で置換した変異体も同様に、野
生型Ｂｃｌ−２に比べて有意に増強されたアポトーシス
抑制活性を示すことを見いだし、本発明を完成した。
４領域以外に存在する特定の部位のセリン残基をアラニ
ンまたはアスパラギン酸で置換した変異体も同様に、野
生型Ｂｃｌ−２に比べて有意に増強されたアポトーシス
抑制活性を示すことを見いだし、本発明を完成した。
【００１９】すなわち、本発明は、野生型Ｂｃｌ−２タ
ンパク質を構成するアミノ酸のうちセリンをアラニンま
たはアスパラギン酸で置換することにより、そのアポト
ーシス抑制活性を増強し、得られた変異体タンパク質或
いはそれをコードする変異体遺伝子をアポトーシスが関
与する様々な疾病の治療に適用し、増強されたアポトー
シス抑制作用にもとづいて治療効果をあげることを要旨
とする。
ンパク質を構成するアミノ酸のうちセリンをアラニンま
たはアスパラギン酸で置換することにより、そのアポト
ーシス抑制活性を増強し、得られた変異体タンパク質或
いはそれをコードする変異体遺伝子をアポトーシスが関
与する様々な疾病の治療に適用し、増強されたアポトー
シス抑制作用にもとづいて治療効果をあげることを要旨
とする。
【００２０】従って、本発明は、配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列において少なくとも一つのセリンを
アラニンまたはアスパラギン酸で置換してなるアミノ酸
配列からなり、且つアポトーシス抑制活性を有するポリ
ペプチドを提供する。
記載のアミノ酸配列において少なくとも一つのセリンを
アラニンまたはアスパラギン酸で置換してなるアミノ酸
配列からなり、且つアポトーシス抑制活性を有するポリ
ペプチドを提供する。
【００２１】好ましくは、本発明は、配列表の配列番号
１に記載のアミノ酸配列において少なくとも一つのセリ
ンをアラニンまたはアスパラギン酸で置換してなるアミ
ノ酸配列からなり、且つ該配列番号１に記載のアミノ酸
配列によって定義される野生型Ｂｃｌ−２タンパク質よ
りも実質的に高いアポトーシス抑制活性を有するポリペ
プチドを提供する。
１に記載のアミノ酸配列において少なくとも一つのセリ
ンをアラニンまたはアスパラギン酸で置換してなるアミ
ノ酸配列からなり、且つ該配列番号１に記載のアミノ酸
配列によって定義される野生型Ｂｃｌ−２タンパク質よ
りも実質的に高いアポトーシス抑制活性を有するポリペ
プチドを提供する。
【００２２】好ましくは、上記のポリペプチドにおいて
セリンがアミノ酸配列の２４番目、１１６番目、１１７
番目、または１６１番目の残基から選ばれる少なくとも
一つである。
セリンがアミノ酸配列の２４番目、１１６番目、１１７
番目、または１６１番目の残基から選ばれる少なくとも
一つである。
【００２３】さらに好ましくは、上記のポリペプチドに
おいて前記２４番目、１１６番目、および／または１１
７番目のセリンをアラニンで、および／または１６１番
目のセリンをアラニン若しくはアスパラギン酸で置換し
たことを特徴とする。
おいて前記２４番目、１１６番目、および／または１１
７番目のセリンをアラニンで、および／または１６１番
目のセリンをアラニン若しくはアスパラギン酸で置換し
たことを特徴とする。
【００２４】特定的には、本発明は、以下１〜４に記載
のポリペプチドを提供する。 １．配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる
ポリペプチド。 ２．配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる
ポリペプチド。 ３．配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる
ポリペプチド。 ４．配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる
ポリペプチド。
のポリペプチドを提供する。 １．配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる
ポリペプチド。 ２．配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる
ポリペプチド。 ３．配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる
ポリペプチド。 ４．配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる
ポリペプチド。
【００２５】上記１〜４に記載のポリペプチドは、いず
れも野生型Ｂｃｌ−２タンパク質の変異体であり、該タ
ンパク質よりも実質的に高いアポトーシス抑制活性を有
する。
れも野生型Ｂｃｌ−２タンパク質の変異体であり、該タ
ンパク質よりも実質的に高いアポトーシス抑制活性を有
する。
【００２６】さらに、本発明は、上記いずれか一つのア
ポトーシス抑制活性を有するポリペプチド、それらの組
み合わせ、またはその部分ペプチド、さらに薬学的に許
容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物を提供す
る。
ポトーシス抑制活性を有するポリペプチド、それらの組
み合わせ、またはその部分ペプチド、さらに薬学的に許
容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物を提供す
る。
【００２７】また、本発明は、上記いずれか一つのアポ
トーシス抑制活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子またはそれに対応するポリヌクレオチドを提供す
る。
トーシス抑制活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子またはそれに対応するポリヌクレオチドを提供す
る。
【００２８】より特定的には、本発明は、以下５〜８に
記載のポリヌクレオチドを提供する。 ５．配列表の配列番号７に記載のヌクレオチド配列から
なるポリヌクレオチド。 ６．配列表の配列番号８に記載のヌクレオチド配列から
なるポリヌクレオチド。 ７．配列表の配列番号９に記載のヌクレオチド配列から
なるポリヌクレオチド。 ８．配列表の配列番号１０に記載のヌクレオチド配列か
らなるポリヌクレオチド。
記載のポリヌクレオチドを提供する。 ５．配列表の配列番号７に記載のヌクレオチド配列から
なるポリヌクレオチド。 ６．配列表の配列番号８に記載のヌクレオチド配列から
なるポリヌクレオチド。 ７．配列表の配列番号９に記載のヌクレオチド配列から
なるポリヌクレオチド。 ８．配列表の配列番号１０に記載のヌクレオチド配列か
らなるポリヌクレオチド。
【００２９】上記５〜８のいずれか一つに記載のポリヌ
クレオチドは、いずれも野生型Ｂｃｌ−２遺伝子の変異
体を表すポリヌクレオチドであり、該遺伝子は上記野生
型Ｂｃｌ−２変異体タンパク質をコードする。
クレオチドは、いずれも野生型Ｂｃｌ−２遺伝子の変異
体を表すポリヌクレオチドであり、該遺伝子は上記野生
型Ｂｃｌ−２変異体タンパク質をコードする。
【００３０】また、本発明は、前記遺伝子が発現可能な
状態で組み込まれたウィルスベクターを提供する。
状態で組み込まれたウィルスベクターを提供する。
【００３１】さらに、本発明は、上記いずれか一つのポ
リヌクレオチドと、治療的に許容される担体または希釈
剤を含む遺伝子治療用組成物を提供する。
リヌクレオチドと、治療的に許容される担体または希釈
剤を含む遺伝子治療用組成物を提供する。
【００３２】なお、本明細書中、「Ｂｃｌ−２」或いは
「Ｂｃｌ−２タンパク質」は、適宜交換的に用いられ
る。また、「Ｂｃｌ−２」は、特記のない場合「野生型
Ｂｃｌ−２タンパク質」を意味する。
「Ｂｃｌ−２タンパク質」は、適宜交換的に用いられ
る。また、「Ｂｃｌ−２」は、特記のない場合「野生型
Ｂｃｌ−２タンパク質」を意味する。
【００３３】
【発明の実施の形態】以下、本発明について好適な実施
の形態を参照して、詳細に説明する。
の形態を参照して、詳細に説明する。
【００３４】Ｂｃｌ−２変異体タンパク質およびＢｃｌ
−２変異体遺伝子 Ｂｃｌ−２の全アミノ酸配列および対応するＢｃｌ−２
遺伝子の全ヌクレオチド配列は公知であり、それぞれを
配列表の配列番号１および配列番号６に示す。本発明の
ポリペプチドは、Ｂｃｌ−２変異体タンパク質であり、
Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列（配列番号１）において少な
くとも一つのセリンをアラニンまたはアスパラギン酸で
置換してなるアミノ酸配列からなる。好ましくは、本発
明のポリペプチドはＢｃｌ−２タンパク質よりも実質的
に高いアポトーシス抑制活性を有する。
−２変異体遺伝子 Ｂｃｌ−２の全アミノ酸配列および対応するＢｃｌ−２
遺伝子の全ヌクレオチド配列は公知であり、それぞれを
配列表の配列番号１および配列番号６に示す。本発明の
ポリペプチドは、Ｂｃｌ−２変異体タンパク質であり、
Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列（配列番号１）において少な
くとも一つのセリンをアラニンまたはアスパラギン酸で
置換してなるアミノ酸配列からなる。好ましくは、本発
明のポリペプチドはＢｃｌ−２タンパク質よりも実質的
に高いアポトーシス抑制活性を有する。
【００３５】特に好ましい個別の変異体タンパク質は、
下記の１〜４に記載のものである。 １．Ｓｅｒ２４Ａｌａ変異体 Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列の２４番目のセリンをアラニ
ンで置換した変異体であり、そのアミノ酸配列が配列番
号２に記載のポリペプチドである。この変異体をコード
する遺伝子は、配列番号７に記載のヌクレオチド配列か
らなるポリヌクレオチドで表わされる。 ２．Ｓｅｒ１１６Ａｌａ／Ｓｅｒ１１７Ａｌａ変異体 Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列の１１６番目のセリンをアラ
ニンで、かつ１１７番目のセリンをアラニンで置換した
変異体であり、そのアミノ酸配列が配列番号３に記載さ
れるポリペプチドである。この変異体をコードする遺伝
子は、配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなるポ
リヌクレオチドで表わされる。 ３．Ｓｅｒ１６１Ａｌａ変異体 Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列の１６１番目のセリンをアラ
ニンに置換した変異体であり、そのアミノ酸配列が配列
番号４に記載されるポリペプチドである。この変異体を
コードする遺伝子は、配列番号９に記載のヌクレオチド
配列からなるポリヌクレオチドで表わされる。 ４．Ｓｅｒ１６１Ａｓｐ変異体 Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列の１６１番目のセリンをアス
パラギン酸で置換した変異体であり、そのアミノ酸配列
が配列番号５に記載されるポリペプチドである。この変
異体をコードする遺伝子は、配列番号１０に記載のヌク
レオチド配列からなるポリヌクレオチドで表わされる。
下記の１〜４に記載のものである。 １．Ｓｅｒ２４Ａｌａ変異体 Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列の２４番目のセリンをアラニ
ンで置換した変異体であり、そのアミノ酸配列が配列番
号２に記載のポリペプチドである。この変異体をコード
する遺伝子は、配列番号７に記載のヌクレオチド配列か
らなるポリヌクレオチドで表わされる。 ２．Ｓｅｒ１１６Ａｌａ／Ｓｅｒ１１７Ａｌａ変異体 Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列の１１６番目のセリンをアラ
ニンで、かつ１１７番目のセリンをアラニンで置換した
変異体であり、そのアミノ酸配列が配列番号３に記載さ
れるポリペプチドである。この変異体をコードする遺伝
子は、配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなるポ
リヌクレオチドで表わされる。 ３．Ｓｅｒ１６１Ａｌａ変異体 Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列の１６１番目のセリンをアラ
ニンに置換した変異体であり、そのアミノ酸配列が配列
番号４に記載されるポリペプチドである。この変異体を
コードする遺伝子は、配列番号９に記載のヌクレオチド
配列からなるポリヌクレオチドで表わされる。 ４．Ｓｅｒ１６１Ａｓｐ変異体 Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列の１６１番目のセリンをアス
パラギン酸で置換した変異体であり、そのアミノ酸配列
が配列番号５に記載されるポリペプチドである。この変
異体をコードする遺伝子は、配列番号１０に記載のヌク
レオチド配列からなるポリヌクレオチドで表わされる。
【００３６】前記１〜４以外のＢｃｌ−２の変異体およ
びそれをコードする変異体遺伝子も本発明に包含され
る。これは、本明細書の開示に従って、Ｂｃｌ−２変異
体を調製し、そのアポトーシス抑制活性を、例えば実施
例に記載したスクリーニングパネルに基づき決定する。
もし決定されたアポトーシス抑制活性が野生型Ｂｃｌ−
２の活性より高い場合、該Ｂｃｌ−２変異体は、本発明
のポリペプチドの範囲内である。これら一連の手順は、
前記開示さらに当業者に公知の手法等に従って、当業者
が過剰な実験を試みることなくなしうる。
びそれをコードする変異体遺伝子も本発明に包含され
る。これは、本明細書の開示に従って、Ｂｃｌ−２変異
体を調製し、そのアポトーシス抑制活性を、例えば実施
例に記載したスクリーニングパネルに基づき決定する。
もし決定されたアポトーシス抑制活性が野生型Ｂｃｌ−
２の活性より高い場合、該Ｂｃｌ−２変異体は、本発明
のポリペプチドの範囲内である。これら一連の手順は、
前記開示さらに当業者に公知の手法等に従って、当業者
が過剰な実験を試みることなくなしうる。
【００３７】本発明のポリペプチドは、「実質的に純
粋」であり、これはタンパク質の分野で当業者に認識さ
れているように、それが遺伝子操作によって製造される
場合、宿主生物に由来するタンパク質、核酸、およびそ
の他の生体物質に汚染されていないことを意味する。ま
た、固相ペプチド合成法によって化学的に合成される場
合、合成に使用した試薬等の不純物に汚染されていない
ことを意味する。さらに、本発明のポリペプチドは、上
記で定義されたＢｃｌ−２変異体の断片（例えば、１〜
４のいずれかに記載のポリペプチドの一部分）を包含す
る。このような断片を用いて容易に本発明のポリペプチ
ドに特異的に結合する抗体を製造することができる。抗
体は、特にアフィニティークロマトグラフィーを用いる
本発明のポリペプチドの精製に有用である。
粋」であり、これはタンパク質の分野で当業者に認識さ
れているように、それが遺伝子操作によって製造される
場合、宿主生物に由来するタンパク質、核酸、およびそ
の他の生体物質に汚染されていないことを意味する。ま
た、固相ペプチド合成法によって化学的に合成される場
合、合成に使用した試薬等の不純物に汚染されていない
ことを意味する。さらに、本発明のポリペプチドは、上
記で定義されたＢｃｌ−２変異体の断片（例えば、１〜
４のいずれかに記載のポリペプチドの一部分）を包含す
る。このような断片を用いて容易に本発明のポリペプチ
ドに特異的に結合する抗体を製造することができる。抗
体は、特にアフィニティークロマトグラフィーを用いる
本発明のポリペプチドの精製に有用である。
【００３８】製造方法 本発明のポリペプチドは、Ｂｃｌ−２のアミノ酸配列に
おいて少なくとも一つのセリンをアラニンまたはアスパ
ラギン酸で置換してなるアミノ酸配列からなる。置換さ
れるべきセリンの位置が特定されれば、Ｂｃｌ−２変異
体遺伝子から本発明のポリペプチドを製造することがで
きる。このような目的で、遺伝子のヌクレオチド配列の
変異法として最もよく行われているのは部位特異的突然
変異誘発（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ）である。例えば、Ｍ１３プライマー突然変
異、ＰＣＲ法、その他の改良法が知られている。一般的
総説としてＳａｍｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄ）Ｖｏｌ ２，１９８９を
参照。所望の変異を導入した合成オリゴヌクレオチド
（遺伝子）が入手可能であれば、その変異がコードする
アミノ酸で変異させたい野生型タンパク質の所定のアミ
ノ酸を置き換えることができる。
おいて少なくとも一つのセリンをアラニンまたはアスパ
ラギン酸で置換してなるアミノ酸配列からなる。置換さ
れるべきセリンの位置が特定されれば、Ｂｃｌ−２変異
体遺伝子から本発明のポリペプチドを製造することがで
きる。このような目的で、遺伝子のヌクレオチド配列の
変異法として最もよく行われているのは部位特異的突然
変異誘発（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ）である。例えば、Ｍ１３プライマー突然変
異、ＰＣＲ法、その他の改良法が知られている。一般的
総説としてＳａｍｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄ）Ｖｏｌ ２，１９８９を
参照。所望の変異を導入した合成オリゴヌクレオチド
（遺伝子）が入手可能であれば、その変異がコードする
アミノ酸で変異させたい野生型タンパク質の所定のアミ
ノ酸を置き換えることができる。
【００３９】本発明の実施の形態で採用された、変異に
よって置換される特定のセリン残基の位置は、Ｂｃｌ−
２のアミノ酸配列において２４番目、７０番目、１１６
番目、１１７番目、または１６１番目から選ばれる少な
くとも一つの位置である。特に、好ましくは、２４番
目、１１６番目、１１７番目、または１６１番目から選
ばれる少なくとも一つの位置である。これらの好適な位
置を考慮して、好ましい変異のパターンは、２４番目、
１１６番目、および／または１１７番目のセリンをアラ
ニンで、および／または１６１番目のセリンをアラニン
若しくはアスパラギン酸で置換する変異である。これら
の置換（変異）位置とＢｃｌ−２の各ドメインとの相対
的な位置関係を示したものが図１である。これらの位置
をアラニンまたはアスパラギン酸で置換すべく下記に例
示する合成オリゴヌクレオチドを作製した。 Ｏｌｉｇｏ−１：Ｓ２４Ａ変異導入用オリゴヌクレオチ
ド（配列番号１１） ５’−ｇｔａｇｃｃｇｇｔｃｔｇｃｇｃｃａｇｃｔｔａ
ｔａａｔｇ−３’ Ｏｌｉｇｏ−２：Ｓ２４Ｄ変異導入用オリゴヌクレオチ
ド（配列番号１２） ５’−ｇｔａｇｃｃｇｇｔｃｔｇｇｔｃｃａｇｃｔｔａ
ｔａａｔｇ−３’ Ｏｌｉｇｏ−３：Ｓ７０Ａ変異導入用オリゴヌクレオチ
ド（配列番号１３） ５’−ｇｇｔｃｔｇｃａｇｃｇｇｃｇｃｇｇｔｃｃｔｇ
ｇｃｇａｃ−３’ Ｏｌｉｇｏ−４：Ｓ７０Ｄ変異導入用オリゴヌクレオチ
ド（配列番号１４） ５’−ｇｇｔｃｔｇｃａｇｃｇｇｇｔｃｇｇｔｃｃｔｇ
ｇｃｇａｃ−３’ Ｏｌｉｇｏ−５：Ｓ１１６Ａ変異導入用オリゴヌクレオ
チド（配列番号１５） ５’−ｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｔｃｔｃｇ
ｇｃｇａａ−３’ Ｏｌｉｇｏ−６：Ｓ１１６Ｄ変異導入用オリゴヌクレオ
チド（配列番号１６） ５’−ｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｃｔｇａｃｃａｔｃｔｃｇ
ｇｃｇａａ−３’ Ｏｌｉｇｏ−７：Ｓ１１６Ａ／Ｓ１１７Ａ変異導入用オ
リゴヌクレオチド（配列番号１７） ５’−ｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｇｃｇｇｃｃａｔｃｔｃｇ
ｇｃｇａａ−３’Ｏｌｉｇｏ−８：Ｓ１６１Ａ変異導入
用オリゴヌクレオチド（配列番号１８） ５’−ｃｔｃｃｃｇｇｔｔｇａｃｇｇｃｃｔｃｃａｃａ
ｃａｃａｔ−３’Ｏｌｉｇｏ−９：Ｓ１６１Ｄ変異導入
用オリゴヌクレオチド（配列番号１９） ５’−ｃｔｃｃｃｇｇｔｔｇａｃｇａｃｃｔｃｃａｃａ
ｃａｃａｔ−３’ 上記で、アミノ酸の一文字表記に従い、「Ｓ」はセリン
を、「Ａ」はアラニンを、「Ｄ」はアスパラギン酸を指
す。
よって置換される特定のセリン残基の位置は、Ｂｃｌ−
２のアミノ酸配列において２４番目、７０番目、１１６
番目、１１７番目、または１６１番目から選ばれる少な
くとも一つの位置である。特に、好ましくは、２４番
目、１１６番目、１１７番目、または１６１番目から選
ばれる少なくとも一つの位置である。これらの好適な位
置を考慮して、好ましい変異のパターンは、２４番目、
１１６番目、および／または１１７番目のセリンをアラ
ニンで、および／または１６１番目のセリンをアラニン
若しくはアスパラギン酸で置換する変異である。これら
の置換（変異）位置とＢｃｌ−２の各ドメインとの相対
的な位置関係を示したものが図１である。これらの位置
をアラニンまたはアスパラギン酸で置換すべく下記に例
示する合成オリゴヌクレオチドを作製した。 Ｏｌｉｇｏ−１：Ｓ２４Ａ変異導入用オリゴヌクレオチ
ド（配列番号１１） ５’−ｇｔａｇｃｃｇｇｔｃｔｇｃｇｃｃａｇｃｔｔａ
ｔａａｔｇ−３’ Ｏｌｉｇｏ−２：Ｓ２４Ｄ変異導入用オリゴヌクレオチ
ド（配列番号１２） ５’−ｇｔａｇｃｃｇｇｔｃｔｇｇｔｃｃａｇｃｔｔａ
ｔａａｔｇ−３’ Ｏｌｉｇｏ−３：Ｓ７０Ａ変異導入用オリゴヌクレオチ
ド（配列番号１３） ５’−ｇｇｔｃｔｇｃａｇｃｇｇｃｇｃｇｇｔｃｃｔｇ
ｇｃｇａｃ−３’ Ｏｌｉｇｏ−４：Ｓ７０Ｄ変異導入用オリゴヌクレオチ
ド（配列番号１４） ５’−ｇｇｔｃｔｇｃａｇｃｇｇｇｔｃｇｇｔｃｃｔｇ
ｇｃｇａｃ−３’ Ｏｌｉｇｏ−５：Ｓ１１６Ａ変異導入用オリゴヌクレオ
チド（配列番号１５） ５’−ｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｃｔｇｇｃｃａｔｃｔｃｇ
ｇｃｇａａ−３’ Ｏｌｉｇｏ−６：Ｓ１１６Ｄ変異導入用オリゴヌクレオ
チド（配列番号１６） ５’−ｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｃｔｇａｃｃａｔｃｔｃｇ
ｇｃｇａａ−３’ Ｏｌｉｇｏ−７：Ｓ１１６Ａ／Ｓ１１７Ａ変異導入用オ
リゴヌクレオチド（配列番号１７） ５’−ｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｇｃｇｇｃｃａｔｃｔｃｇ
ｇｃｇａａ−３’Ｏｌｉｇｏ−８：Ｓ１６１Ａ変異導入
用オリゴヌクレオチド（配列番号１８） ５’−ｃｔｃｃｃｇｇｔｔｇａｃｇｇｃｃｔｃｃａｃａ
ｃａｃａｔ−３’Ｏｌｉｇｏ−９：Ｓ１６１Ｄ変異導入
用オリゴヌクレオチド（配列番号１９） ５’−ｃｔｃｃｃｇｇｔｔｇａｃｇａｃｃｔｃｃａｃａ
ｃａｃａｔ−３’ 上記で、アミノ酸の一文字表記に従い、「Ｓ」はセリン
を、「Ａ」はアラニンを、「Ｄ」はアスパラギン酸を指
す。
【００４０】合成オリゴヌクレオチドの長さについて、
変異される所定部位において野生型遺伝子にハイブリダ
イズするのに充分の長さであれば、前記の特定の開示例
で採用された長さに限定されない。
変異される所定部位において野生型遺伝子にハイブリダ
イズするのに充分の長さであれば、前記の特定の開示例
で採用された長さに限定されない。
【００４１】具体的な部位特異的突然変異法について
は、実施例に詳述されるが、次のような手順で行う。上
記合成オリゴヌクレオチドをＢｃｌ−２遺伝子が組み込
まれた適当なプラスミドととも部位特異的変異用キット
で処理すると、アニーリング条件下該オリゴヌクレオチ
ドが鋳型ＤＮＡとして、前記遺伝子の所定部位にハイブ
リダイズする。これにＴ４リガーゼの存在下、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを作用させると所望の変異を含む遺伝子
を有するプラスミドが得られる。該プラスミドから変異
された遺伝子を制限酵素で切り出す。
は、実施例に詳述されるが、次のような手順で行う。上
記合成オリゴヌクレオチドをＢｃｌ−２遺伝子が組み込
まれた適当なプラスミドととも部位特異的変異用キット
で処理すると、アニーリング条件下該オリゴヌクレオチ
ドが鋳型ＤＮＡとして、前記遺伝子の所定部位にハイブ
リダイズする。これにＴ４リガーゼの存在下、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを作用させると所望の変異を含む遺伝子
を有するプラスミドが得られる。該プラスミドから変異
された遺伝子を制限酵素で切り出す。
【００４２】このようにして得られたＢｃｌ−２変異体
遺伝子を適当なベクター・プロモーターに連結し、宿主
細胞系に遺伝子導入し、それがコードするタンパク質を
産生させ、抽出、精製することで本発明のポリペプチド
を入手することができる。これらの操作は当業者に公知
である。そこで使用されるベクター・プロモーター系は
関して、特に限定はされないが、例えば、MoMLVベクタ
ー、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、AAVベクター、HIVベクター、S1Vベクター、センダ
イウイルスベクタ一等のウイルスベクターが挙げられ
る。また昆虫細胞に遺伝子導入可能なバキュロウイルス
ベクター、植物細胞に遺伝子導入可能なタバコモザイク
ウイルス由来のベクター等も使用可能である。
遺伝子を適当なベクター・プロモーターに連結し、宿主
細胞系に遺伝子導入し、それがコードするタンパク質を
産生させ、抽出、精製することで本発明のポリペプチド
を入手することができる。これらの操作は当業者に公知
である。そこで使用されるベクター・プロモーター系は
関して、特に限定はされないが、例えば、MoMLVベクタ
ー、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、AAVベクター、HIVベクター、S1Vベクター、センダ
イウイルスベクタ一等のウイルスベクターが挙げられ
る。また昆虫細胞に遺伝子導入可能なバキュロウイルス
ベクター、植物細胞に遺伝子導入可能なタバコモザイク
ウイルス由来のベクター等も使用可能である。
【００４３】ウイルス以外のベクターとしてはリン醸カ
ルシウムと核酸の複合体、リボソーム、カチオン脂質複
合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主
鎖とする高分子キャリアー等も使用可能である。さら
に、エレクトロポレーション、遺伝子銃等の方法も遺伝
子導入に用いることができる。
ルシウムと核酸の複合体、リボソーム、カチオン脂質複
合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主
鎖とする高分子キャリアー等も使用可能である。さら
に、エレクトロポレーション、遺伝子銃等の方法も遺伝
子導入に用いることができる。
【００４４】プロモーターは、宿主細胞内で遺伝子を発
現させることができるものであれば、特に制限されな
い。例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス40、ラウス肉
腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイ
ルス、シンビスウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウ
イルス、C型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒト
丁細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本
脳炎ウイルス、JCウイルス、パルボウイルスB19、ポリ
オウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミ
ン、SRα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の
哺乳類由来のプロモーター、CAGプロモーター等のキメ
ラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等に
よって発現が誘導されるプロモーターが挙げられる。ま
た、Ｌａｃプロモーターなど大腸菌宿主内で発現可能な
プロモーターも使用できる。
現させることができるものであれば、特に制限されな
い。例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス40、ラウス肉
腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイ
ルス、シンビスウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウ
イルス、C型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒト
丁細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本
脳炎ウイルス、JCウイルス、パルボウイルスB19、ポリ
オウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミ
ン、SRα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の
哺乳類由来のプロモーター、CAGプロモーター等のキメ
ラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等に
よって発現が誘導されるプロモーターが挙げられる。ま
た、Ｌａｃプロモーターなど大腸菌宿主内で発現可能な
プロモーターも使用できる。
【００４５】宿主細胞系としては、例えば、動物細胞、
昆虫細胞、植物細胞、大腸菌、発育鶏卵などが挙げられ
る。
昆虫細胞、植物細胞、大腸菌、発育鶏卵などが挙げられ
る。
【００４６】さらに、遺伝子導入した宿主細胞系から産
生されたタンパク質を抽出する方法としては、例えば、
細胞をホモジュナイズする方法、ＳＤＳ等の界面活性剤
や酵素を用いて細胞膜を溶解させる方法、超音波処理、
凍結・融解を繰り返す方法等がある。また、本発明のポ
リペプチドは、比較的アミノ酸鎖長が短いので上記の遺
伝子組換え手法以外に、市販のペプチド合成機を用いた
化学的合成等により製造することも可能である。いずれ
の方法で得られた本発明のポリペプチドも、常法により
精製できる。例えば、超遠心や密度勾配遠心を利用した
遠心分離、イオン交換カラムやアフィニティーカラム
（例えば、前述の特異的な抗体を用いる）、逆相カラム
等を利用したカラム分離、ポリアクリルアミドゲル等を
用いたゲル分離等、一般的な生化学的手法が精製に利用
できる。
生されたタンパク質を抽出する方法としては、例えば、
細胞をホモジュナイズする方法、ＳＤＳ等の界面活性剤
や酵素を用いて細胞膜を溶解させる方法、超音波処理、
凍結・融解を繰り返す方法等がある。また、本発明のポ
リペプチドは、比較的アミノ酸鎖長が短いので上記の遺
伝子組換え手法以外に、市販のペプチド合成機を用いた
化学的合成等により製造することも可能である。いずれ
の方法で得られた本発明のポリペプチドも、常法により
精製できる。例えば、超遠心や密度勾配遠心を利用した
遠心分離、イオン交換カラムやアフィニティーカラム
（例えば、前述の特異的な抗体を用いる）、逆相カラム
等を利用したカラム分離、ポリアクリルアミドゲル等を
用いたゲル分離等、一般的な生化学的手法が精製に利用
できる。
【００４７】薬学的組成物 上記のようにして製造、精製されたポリペプチドは，公
知の方法に従って、薬学的に許容される担体或いは希釈
剤と混合され、薬学的に有用な組成物に製剤化すること
ができる。本発明で用いられる薬学的組成物は、一また
は複数の治療的に有効な量の上記ポリペプチドを含んで
なる。適当な担体および希釈剤、並びにヒトタンパク質
を含む製剤については、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に
記載されている。
知の方法に従って、薬学的に許容される担体或いは希釈
剤と混合され、薬学的に有用な組成物に製剤化すること
ができる。本発明で用いられる薬学的組成物は、一また
は複数の治療的に有効な量の上記ポリペプチドを含んで
なる。適当な担体および希釈剤、並びにヒトタンパク質
を含む製剤については、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に
記載されている。
【００４８】本発明のポリペプチドに関して、投与に適
した剤型は特に限定はされないが、既に医薬として使用
されている多くのヒトタンパク質を含む薬学的組成物と
同様に注射剤として調製されることが好ましい。より具
体的に言えば、ポリペプチドを、水、生理食塩水、等張
化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤と
する。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、
各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護材とし
て添加して調製可能である。また，リボソーム等の封入
体にポリペプチドを包埋させて投与することも可能であ
る。
した剤型は特に限定はされないが、既に医薬として使用
されている多くのヒトタンパク質を含む薬学的組成物と
同様に注射剤として調製されることが好ましい。より具
体的に言えば、ポリペプチドを、水、生理食塩水、等張
化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤と
する。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、
各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護材とし
て添加して調製可能である。また，リボソーム等の封入
体にポリペプチドを包埋させて投与することも可能であ
る。
【００４９】本発明のポリペプチドを下記の様々な疾病
の治療に用いるとき、その用量は、対象の年齢、体重、
病状、および投与経路、その他の要素により異なるが、
投薬する医師が容易に適宜決定することができる。例え
ば、注射剤として非経口投与される場合には、1日量約
０．１μｇ／ｋｇ−１０００ｍｇ／ｋｇを投与するのが
好ましく、より好ましくは、1日量約１μｇ／ｋｇ−１
００ｍｇ／ｋｇである。
の治療に用いるとき、その用量は、対象の年齢、体重、
病状、および投与経路、その他の要素により異なるが、
投薬する医師が容易に適宜決定することができる。例え
ば、注射剤として非経口投与される場合には、1日量約
０．１μｇ／ｋｇ−１０００ｍｇ／ｋｇを投与するのが
好ましく、より好ましくは、1日量約１μｇ／ｋｇ−１
００ｍｇ／ｋｇである。
【００５０】遺伝子治療 本発明のポリヌクレオチドは、治療遺伝子（薬物遺伝
子）として、遺伝子治療に用いることができる。すなわ
ち、本発明のポリヌクレオチドを組換えベクター（ｇｅ
ｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ ）に挿入し、標
的細胞にまでデリバリーして、そこでＢｃｌ−２変異体
遺伝子を発現させる。すると、本発明のポリペプチド
（すなわち特定のＢｃｌ−２変異体）が前記標的細胞内
で産生し、該細胞のアポトーシスを抑制する。
子）として、遺伝子治療に用いることができる。すなわ
ち、本発明のポリヌクレオチドを組換えベクター（ｇｅ
ｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ ）に挿入し、標
的細胞にまでデリバリーして、そこでＢｃｌ−２変異体
遺伝子を発現させる。すると、本発明のポリペプチド
（すなわち特定のＢｃｌ−２変異体）が前記標的細胞内
で産生し、該細胞のアポトーシスを抑制する。
【００５１】この目的で用いる適当な 組換えベクター
は、既に上記のベクター・プロモーターに関して、列挙
したもののうち哺乳類、特にヒト細胞に遺伝子導入可能
なベクターと重複する。上で開示されていないベクター
には、例えば、シュードタイプのウィルスベクターがあ
る。その一例は、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖ
タンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕ
ｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）
の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換し
たシュードタイプウイルスベクターである（Ｎａｌｄｉ
ｎｉ Ｌ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２ ２６３（１９９
６））。
は、既に上記のベクター・プロモーターに関して、列挙
したもののうち哺乳類、特にヒト細胞に遺伝子導入可能
なベクターと重複する。上で開示されていないベクター
には、例えば、シュードタイプのウィルスベクターがあ
る。その一例は、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖ
タンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕ
ｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）
の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換し
たシュードタイプウイルスベクターである（Ｎａｌｄｉ
ｎｉ Ｌ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２ ２６３（１９９
６））。
【００５２】同様に、使用可能なプロモータも列挙した
もののうち、哺乳類、特にヒト細胞で遺伝子発現が可能
なプロモータと重複する。
もののうち、哺乳類、特にヒト細胞で遺伝子発現が可能
なプロモータと重複する。
【００５３】遺伝子治療用組成物 本発明のポリヌクレオチドを遺伝子治療に用いる場合、
好ましくは、治療用にデザインされた治療遺伝子を含む
組換えウイルスベクターとして調製される。より具体的
に言えば、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えウイ
ルスベクターを、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等
の適当な溶媒に溶解することで遺伝子治療用組成物とし
て調製される。
好ましくは、治療用にデザインされた治療遺伝子を含む
組換えウイルスベクターとして調製される。より具体的
に言えば、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えウイ
ルスベクターを、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等
の適当な溶媒に溶解することで遺伝子治療用組成物とし
て調製される。
【００５４】用途 Ａ 治療 様々な疾患においてアポトーシスが関与しており、それ
らの疾患はアポトーシスによる細胞死（変性）を抑制す
ることで治療効果が期待できる。従って、本発明のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチド（以下、Ｂｃｌ−２変
異体およびＢｃｌ−２変異体遺伝子ともいう）は、それ
らのアポトーシス抑制活性のためこれらの疾患の治療に
用いることができる。以下に、個別の代表的な疾患を挙
げる。
らの疾患はアポトーシスによる細胞死（変性）を抑制す
ることで治療効果が期待できる。従って、本発明のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチド（以下、Ｂｃｌ−２変
異体およびＢｃｌ−２変異体遺伝子ともいう）は、それ
らのアポトーシス抑制活性のためこれらの疾患の治療に
用いることができる。以下に、個別の代表的な疾患を挙
げる。
【００５５】１．アルツハイマー病 アルツハイマー病は進行性の記憶障害と知能低下を主症
状とする脳変性疾患であり、ニューロンの変性死により
発症することが知られている。この細胞死はアポトーシ
スにより誘導されることが最近分かってきた。従って、
ニューロンにＢｃｌ-２変異体またはＢｃｌ-２変異体遺
伝子を導入することで、アルツハイマー病の治療に効果
が期待できる。
状とする脳変性疾患であり、ニューロンの変性死により
発症することが知られている。この細胞死はアポトーシ
スにより誘導されることが最近分かってきた。従って、
ニューロンにＢｃｌ-２変異体またはＢｃｌ-２変異体遺
伝子を導入することで、アルツハイマー病の治療に効果
が期待できる。
【００５６】２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ） 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は四肢遠位部の筋力低
下、筋萎縮、嚥下傷害を主症状とする脳変性疾患であ
り、主に下位運動ニューロンが進行性かつ選択的に傷害
をうける。発症の分子生物学的メカニズムの詳細は不明
であるが、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）、神経成長栄養因子（ＢＤＮＦ）などの遺伝子異常
によりニューロンにアポトーシスが誘導されることが明
らかになりつつある。従って、ニューロンにＢｃｌ-２
変異体またはＢｃｌ-２変異体遺伝子を導入すること
で、筋萎縮性側索硬化症の治療に効果が期待できる。
下、筋萎縮、嚥下傷害を主症状とする脳変性疾患であ
り、主に下位運動ニューロンが進行性かつ選択的に傷害
をうける。発症の分子生物学的メカニズムの詳細は不明
であるが、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）、神経成長栄養因子（ＢＤＮＦ）などの遺伝子異常
によりニューロンにアポトーシスが誘導されることが明
らかになりつつある。従って、ニューロンにＢｃｌ-２
変異体またはＢｃｌ-２変異体遺伝子を導入すること
で、筋萎縮性側索硬化症の治療に効果が期待できる。
【００５７】３．脳虚血後の神経細胞死 脳虚血や脳梗塞後に海馬ＣＡ１領域に神経細胞死が起こ
り、記憶障害、神経変性症の原因となる。この細胞死は
アポトーシスにより誘導されることが最近分かってき
た。従って、ニューロンにＢｃｌ-２変異体またはＢｃ
ｌ-２変異体遺伝子を導入することで、脳虚血後の神経
細胞死の治療に効果が期待できる。
り、記憶障害、神経変性症の原因となる。この細胞死は
アポトーシスにより誘導されることが最近分かってき
た。従って、ニューロンにＢｃｌ-２変異体またはＢｃ
ｌ-２変異体遺伝子を導入することで、脳虚血後の神経
細胞死の治療に効果が期待できる。
【００５８】４．網膜変性症 網膜変性症は１０代後半から２０代後半にかけて夜盲を
発症した後、求心性視野狭窄が進行し４０−６０代にか
けて失明に至ることが多い。これらの症状はアポトーシ
スによる網膜視細胞の細胞変性に起因することが知られ
ている。従って、網膜視細胞にＢｃｌ-２変異体または
Ｂｃｌ-２変異体遺伝子を導入することで、網膜変性症
の治療に効果が期待できる。
発症した後、求心性視野狭窄が進行し４０−６０代にか
けて失明に至ることが多い。これらの症状はアポトーシ
スによる網膜視細胞の細胞変性に起因することが知られ
ている。従って、網膜視細胞にＢｃｌ-２変異体または
Ｂｃｌ-２変異体遺伝子を導入することで、網膜変性症
の治療に効果が期待できる。
【００５９】５．肝疾患 肝炎、肝不全などの肝疾患は肝細胞の細胞死により発症
するが、この細胞死がアポトーシスであることが知られ
ている。従って、肝細胞にＢｃｌ-２変異体またはＢｃ
ｌ-２変異体遺伝子を導入することで、肝疾患の治療に
効果が期待できる。
するが、この細胞死がアポトーシスであることが知られ
ている。従って、肝細胞にＢｃｌ-２変異体またはＢｃ
ｌ-２変異体遺伝子を導入することで、肝疾患の治療に
効果が期待できる。
【００６０】６．心疾患 心筋虚血モデル実験としてラット心筋細胞を低酸素状態
で培養すると、ＤＮＡｌａｄｄｅｒｉｎｇやＦａｓ抗原
の増加などが観察されアポトーシスによる細胞死が起こ
る。心筋梗塞、心不全、肥大心などの心疾患ではこのよ
うな心筋細胞のアポトーシスが関与している可能性が示
唆されている。心筋細胞にＢｃｌ-２変異体またはＢｃ
ｌ-２変異体遺伝子を導入することで、心疾患の治療に
効果が期待できる。
で培養すると、ＤＮＡｌａｄｄｅｒｉｎｇやＦａｓ抗原
の増加などが観察されアポトーシスによる細胞死が起こ
る。心筋梗塞、心不全、肥大心などの心疾患ではこのよ
うな心筋細胞のアポトーシスが関与している可能性が示
唆されている。心筋細胞にＢｃｌ-２変異体またはＢｃ
ｌ-２変異体遺伝子を導入することで、心疾患の治療に
効果が期待できる。
【００６１】Ｂ その他の用途 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、疾病
の治療以外にもアポトーシスによる細胞死を抑制する目
的で使用できる。
の治療以外にもアポトーシスによる細胞死を抑制する目
的で使用できる。
【００６２】１．生産細胞株 抗体産生細胞株（ハイブリドーマ）やウイルスベクター
産生細胞株などの有用タンパク質を生産する細胞株は、
長期間培養している間に生産される蛋白質の細胞障害性
などにより細胞死を引き起こす場合がある。また、これ
らの細胞株では培養液中の血清を取り除くことでタンパ
ク質の生産をより効率的に行う事が可能であるが、同時
に血清非存在下では細胞死を誘導してしまう問題があ
る。この細胞死の多くはアポトーシスによるものである
ことが知られている。あらかじめ野生型Ｂｃｌ−２を組
み込んだ細胞株において、タンパク質の生産効率が上昇
する知見が得られている（ＷＰＩ９７−３８０１６７／
１９９７３５）。Ｂｃｌ−２変異体遺伝子導入すること
で、よりタンパク質の生産効率が上昇する事が期待され
る。
産生細胞株などの有用タンパク質を生産する細胞株は、
長期間培養している間に生産される蛋白質の細胞障害性
などにより細胞死を引き起こす場合がある。また、これ
らの細胞株では培養液中の血清を取り除くことでタンパ
ク質の生産をより効率的に行う事が可能であるが、同時
に血清非存在下では細胞死を誘導してしまう問題があ
る。この細胞死の多くはアポトーシスによるものである
ことが知られている。あらかじめ野生型Ｂｃｌ−２を組
み込んだ細胞株において、タンパク質の生産効率が上昇
する知見が得られている（ＷＰＩ９７−３８０１６７／
１９９７３５）。Ｂｃｌ−２変異体遺伝子導入すること
で、よりタンパク質の生産効率が上昇する事が期待され
る。
【００６３】２．移植細胞、移植臓器 パーキンソン病の治療の際に亡くなった胎児の神経細胞
やドーパミン生産細胞を患者の脳内に移植する手法が用
いられている。また輸血や骨髄移植、遺伝子治療におけ
るｅｘ ｖｉｖｏ法など自家、若しくは他者の細胞を患
者に導入する細胞移植療法が数多く行われるようになっ
た。移植細胞は、一般的にアポトーシスなどによる細胞
死を起こし、長期維持が困難である。移植細胞にＢｃｌ
−２変異体またはＢｃｌ−２変異体遺伝子を導入するこ
とで、臓器移植、細胞移植療法で効果が期待できる。
やドーパミン生産細胞を患者の脳内に移植する手法が用
いられている。また輸血や骨髄移植、遺伝子治療におけ
るｅｘ ｖｉｖｏ法など自家、若しくは他者の細胞を患
者に導入する細胞移植療法が数多く行われるようになっ
た。移植細胞は、一般的にアポトーシスなどによる細胞
死を起こし、長期維持が困難である。移植細胞にＢｃｌ
−２変異体またはＢｃｌ−２変異体遺伝子を導入するこ
とで、臓器移植、細胞移植療法で効果が期待できる。
【００６４】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限され
るものではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限され
るものではない。
【００６５】（実施例１）Ｂｃｌ−２変異体遺伝子の構
築 ヒト野生型Ｂｃｌ−２遺伝子はワシントン大学のＳ．Ｋ
ｏｒｓｍｅｙｅｒより供与された。ヒト野生型Ｂｃｌ−
２遺伝子の転写開始コドンの直前に制限酵素であるＸｈ
ｏＩサイトを持つプライマー（Ｏｌｉｇｏ−１０：配列
番号２０）と転写終止コドンの直後にＸｂａＩサイトを
持つプライマー（Ｏｌｉｇｏ−１１：配列番号２１）を
それぞれ合成し、以下の手順でＰＣＲを行った。
築 ヒト野生型Ｂｃｌ−２遺伝子はワシントン大学のＳ．Ｋ
ｏｒｓｍｅｙｅｒより供与された。ヒト野生型Ｂｃｌ−
２遺伝子の転写開始コドンの直前に制限酵素であるＸｈ
ｏＩサイトを持つプライマー（Ｏｌｉｇｏ−１０：配列
番号２０）と転写終止コドンの直後にＸｂａＩサイトを
持つプライマー（Ｏｌｉｇｏ−１１：配列番号２１）を
それぞれ合成し、以下の手順でＰＣＲを行った。
【００６６】１μｌ ヒトＢｃｌ−２遺伝子、５μｌ ｄ
ＮＴＰ（２ｎＭ：プロメガ社）、１μｌ Ｏｌｉｇｏ−
１０（５０μＭ）、１μｌ Ｏｌｉｇｏ−１１（５０μ
Ｍ）、１μｌ ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２−３
ｕｎｉｔ：プロメガ社）、３１μｌ ｄＨ2Ｏを混合し、
全体で５０μｌとした。この混合液を９５℃で５分間放
置した後、（９４℃、３０秒）−（５５℃、３０秒）−
（７２℃、６０秒）を１サイクルとして２サイクル反応
させ、さらに（９４℃、３０秒）−（５８℃、３０秒）
−（７２℃、６０秒）を１サイクルとして２０サイクル
繰り返した。得られたＰＣＲ産物をｐＢＳ−ＳＫ（＋）
（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＸｈｏＩ−ＸｂａＩサ
イトに組み込みｐＢＳ−ｂｃｌ２を作製した。
ＮＴＰ（２ｎＭ：プロメガ社）、１μｌ Ｏｌｉｇｏ−
１０（５０μＭ）、１μｌ Ｏｌｉｇｏ−１１（５０μ
Ｍ）、１μｌ ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２−３
ｕｎｉｔ：プロメガ社）、３１μｌ ｄＨ2Ｏを混合し、
全体で５０μｌとした。この混合液を９５℃で５分間放
置した後、（９４℃、３０秒）−（５５℃、３０秒）−
（７２℃、６０秒）を１サイクルとして２サイクル反応
させ、さらに（９４℃、３０秒）−（５８℃、３０秒）
−（７２℃、６０秒）を１サイクルとして２０サイクル
繰り返した。得られたＰＣＲ産物をｐＢＳ−ＳＫ（＋）
（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＸｈｏＩ−ＸｂａＩサ
イトに組み込みｐＢＳ−ｂｃｌ２を作製した。
【００６７】ｐＢＳ−ｂｃｌ２と、別途化学合成した様
々な変異導入用アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｏｌ
ｉｇｏ−１〜９：配列番号１１〜１９を含む）のうち１
種類若しくは２種類を用いて、Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔ
ｅｓ ＩＩ−Ｅｘ１ ｉｎｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）を用い以下
の手順でＢｃｌ−２遺伝子に１ヶ所若しくは２ヶ所の変
異を導入した。
々な変異導入用アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｏｌ
ｉｇｏ−１〜９：配列番号１１〜１９を含む）のうち１
種類若しくは２種類を用いて、Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔ
ｅｓ ＩＩ−Ｅｘ１ ｉｎｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）を用い以下
の手順でＢｃｌ−２遺伝子に１ヶ所若しくは２ヶ所の変
異を導入した。
【００６８】２μｌ ｐＢＳ-ｂｃｌ２（２００ｎｇ）、
１μｌ Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｐａｉｒ Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（０．２５μＭ：キット付属
品、プロメガ社製）、１μｌ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｌｉ
ｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ（０．２５μＭ：キット付属品、プロメガ社製）、１
μｌ 変異導入用Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
（１．２５μＭ）、２μｌＡｎｎｅａｌｉｎｇ １０Ｘ
ｂｕｆｆｅｒ（キット付属品、プロメガ社製）、１３μ
ｌ ｄＨ2Ｏを混合し、全体で２０μｌとした。この混合
液を９５℃で５分、７５℃で６分間放置した後、１秒に
つき１℃づつ４５℃になるまで温度を下げた。その後３
７℃で反応を止めた。この反応液に３μｌ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ １０Ｘｂｕｆｆｅｒ（キット付属品、プロメ
ガ社製）、１ｌＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（５−１０ｕｎｉｔ：キット付属品、プロメガ社製）、
Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（１−３ｕｎｉｔ：キット
付属品、プロメガ社製）、５μｌｄＨ2Ｏを混合し全体
で３０μｌとした。この混合液をさらに３７℃で９０分
間反応し、前記変異型アンチセンスオリゴヌクレオチド
（例えば、Ｏｌｉｇｏ−１〜９）の１種類若しくは２種
類に対応する合計１２種類のＢｃｌ−２変異体ＤＮＡを
得た。
１μｌ Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｐａｉｒ Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（０．２５μＭ：キット付属
品、プロメガ社製）、１μｌ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｌｉ
ｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ（０．２５μＭ：キット付属品、プロメガ社製）、１
μｌ 変異導入用Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
（１．２５μＭ）、２μｌＡｎｎｅａｌｉｎｇ １０Ｘ
ｂｕｆｆｅｒ（キット付属品、プロメガ社製）、１３μ
ｌ ｄＨ2Ｏを混合し、全体で２０μｌとした。この混合
液を９５℃で５分、７５℃で６分間放置した後、１秒に
つき１℃づつ４５℃になるまで温度を下げた。その後３
７℃で反応を止めた。この反応液に３μｌ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ １０Ｘｂｕｆｆｅｒ（キット付属品、プロメ
ガ社製）、１ｌＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（５−１０ｕｎｉｔ：キット付属品、プロメガ社製）、
Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（１−３ｕｎｉｔ：キット
付属品、プロメガ社製）、５μｌｄＨ2Ｏを混合し全体
で３０μｌとした。この混合液をさらに３７℃で９０分
間反応し、前記変異型アンチセンスオリゴヌクレオチド
（例えば、Ｏｌｉｇｏ−１〜９）の１種類若しくは２種
類に対応する合計１２種類のＢｃｌ−２変異体ＤＮＡを
得た。
【００６９】Ｂｃｌ−２変異体ＤＮＡを動物細胞中で転
写可能なサイトメガロウイルスのプロモーターを有する
ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込
み、最終的に１２種類のＢｃｌ−２変異体遺伝子が組み
込まれたウィルス発現ベクターを構築した。図２参照。
写可能なサイトメガロウイルスのプロモーターを有する
ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込
み、最終的に１２種類のＢｃｌ−２変異体遺伝子が組み
込まれたウィルス発現ベクターを構築した。図２参照。
【００７０】（実施例２）変異体遺伝子の細胞への導入 実施例１で構築した１２種類のＢｃｌ−２変異体遺伝
子、陽性対照である野生型Ｂｃｌ−２遺伝子、および陰
性対照であるｐｃＤＮＡ３？ＧＦＰをＢＨＫ細胞（シリ
アンハムスター腎臓由来）にリン酸カルシウム法を用い
て以下のような手順で遺伝子導入した。
子、陽性対照である野生型Ｂｃｌ−２遺伝子、および陰
性対照であるｐｃＤＮＡ３？ＧＦＰをＢＨＫ細胞（シリ
アンハムスター腎臓由来）にリン酸カルシウム法を用い
て以下のような手順で遺伝子導入した。
【００７１】ＢＨＫ細胞を０．８−１．６ｘ１０4にな
るようにカバースリップ（１８ｍｍ：松波ガラス社製）
に蒔いた。３７℃、５％ＣＯ2条件下で１晩培養した。
培養後、１度培地を交換し３７℃、５％ＣＯ2条件下で
さらに２−４時間培養した。
るようにカバースリップ（１８ｍｍ：松波ガラス社製）
に蒔いた。３７℃、５％ＣＯ2条件下で１晩培養した。
培養後、１度培地を交換し３７℃、５％ＣＯ2条件下で
さらに２−４時間培養した。
【００７２】遺伝子／リン酸カルシウム溶液は以下の方
法により調製した。４μｌ 野生型Ｂｃｌ−２、ｐｃＤ
ＮＡ３？ＧＦＰ、および１２種類のＢｃｌ−２変異体遺
伝子（各２μｇ）を３０μｌ 塩化カルシウム溶液
（０．２Ｍ ＣａＣｌ2、５０ｍＭＨｅｐｅｓ）に加え
る。さらに、３０μｌ ２ｘＨＢＳ（５０ｍＭ Ｈｅｐ
ｅｓ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．
５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、１２ｍＭ Ｇｌｕ
ｃｏｓｅ、０．１ｘＰＢＳ）を振盪しながら一滴ずつ加
えた。室温で１５分放置し、最後に３５０μｌの培地を
加え、遺伝子／リン酸カルシウム溶液を調製した。
法により調製した。４μｌ 野生型Ｂｃｌ−２、ｐｃＤ
ＮＡ３？ＧＦＰ、および１２種類のＢｃｌ−２変異体遺
伝子（各２μｇ）を３０μｌ 塩化カルシウム溶液
（０．２Ｍ ＣａＣｌ2、５０ｍＭＨｅｐｅｓ）に加え
る。さらに、３０μｌ ２ｘＨＢＳ（５０ｍＭ Ｈｅｐ
ｅｓ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．
５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、１２ｍＭ Ｇｌｕ
ｃｏｓｅ、０．１ｘＰＢＳ）を振盪しながら一滴ずつ加
えた。室温で１５分放置し、最後に３５０μｌの培地を
加え、遺伝子／リン酸カルシウム溶液を調製した。
【００７３】調製した遺伝子／リン酸カルシウム溶液を
細胞に加え、４時間培養した後、細胞を洗浄し培地を交
換した。さらに１６時間培養した後、４ｍＭのＤｅｘａ
ｍｅｔｈａｚｏｎｅ（シグマ社製）を添加し細胞にアポ
トーシスを誘導した。さらに８時間培養した後、細胞を
３％のホルムアルデヒドで固定し、以下の実験に使用し
た。
細胞に加え、４時間培養した後、細胞を洗浄し培地を交
換した。さらに１６時間培養した後、４ｍＭのＤｅｘａ
ｍｅｔｈａｚｏｎｅ（シグマ社製）を添加し細胞にアポ
トーシスを誘導した。さらに８時間培養した後、細胞を
３％のホルムアルデヒドで固定し、以下の実験に使用し
た。
【００７４】（実施例３）核染色によるアポトーシス抑
制効果の比較 実施例２で得られたアポトーシスが誘導され、３％のホ
ルムアルデヒドで固定された細胞を１０ｍｇ／ｍｌのＨ
ｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（モレキュラープローブ社
製）で１分間染色し、細胞を顕微鏡下に観察した。
制効果の比較 実施例２で得られたアポトーシスが誘導され、３％のホ
ルムアルデヒドで固定された細胞を１０ｍｇ／ｍｌのＨ
ｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（モレキュラープローブ社
製）で１分間染色し、細胞を顕微鏡下に観察した。
【００７５】アポトーシスの判定には、（１）細胞骨格
の著明な収縮、（２）核の濃縮及び染色性の増強、
（３）細胞のｒｏｕｎｄ ｕｐとｂｌｅｂｉｎｇ、
（４）核の断片化を観察し（Ｗｙｌｌｉｅ等：Ｉｎｔ．
Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ． ６８，２５１-（１９８０））
を指標として用いた。（１）〜（４）の１つにでも当て
はまれば細胞をアポトーシス陽性とし、その数を１５０
０細胞中の％で示した。得られた結果を図３に示す。最
終的に変異を導入した１２種類のＢｃｌ−２変異体のう
ちＳｅｒ２４Ａｌａ変異体、Ｓｅｒ１１６Ａｌａ／Ｓｅ
ｒ１１７Ａｌａ変異体、Ｓｅｒ１６１Ａｌａ変異体、お
よびＳｅｒ１６１Ａｓｐ変異体は、陽性対照である野生
型Ｂｃｌ−２に比べ有意にアポトーシス抑制活性が増強
されていた。
の著明な収縮、（２）核の濃縮及び染色性の増強、
（３）細胞のｒｏｕｎｄ ｕｐとｂｌｅｂｉｎｇ、
（４）核の断片化を観察し（Ｗｙｌｌｉｅ等：Ｉｎｔ．
Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ． ６８，２５１-（１９８０））
を指標として用いた。（１）〜（４）の１つにでも当て
はまれば細胞をアポトーシス陽性とし、その数を１５０
０細胞中の％で示した。得られた結果を図３に示す。最
終的に変異を導入した１２種類のＢｃｌ−２変異体のう
ちＳｅｒ２４Ａｌａ変異体、Ｓｅｒ１１６Ａｌａ／Ｓｅ
ｒ１１７Ａｌａ変異体、Ｓｅｒ１６１Ａｌａ変異体、お
よびＳｅｒ１６１Ａｓｐ変異体は、陽性対照である野生
型Ｂｃｌ−２に比べ有意にアポトーシス抑制活性が増強
されていた。
【００７６】特に、ＢＨ４ドメインに存在する２４番目
のセリンをアラニンで置換して得られるＳｅｒ２４Ａｌ
ａ変異体がアポトーシスを強く抑制する結果は、その部
位がカルシュニューリンによる脱リン酸化を受けやすい
事実に一致する。
のセリンをアラニンで置換して得られるＳｅｒ２４Ａｌ
ａ変異体がアポトーシスを強く抑制する結果は、その部
位がカルシュニューリンによる脱リン酸化を受けやすい
事実に一致する。
【００７７】
【発明の効果】以上説明したように、本発明のポリヌク
レオチドおよび本発明のポリペプチドは、それぞれプロ
トオンコジーンであるＢｃｌ−２遺伝子の変異体および
アポトーシス抑制活性を有するＢｃｌ−２変異体タンパ
ク質であり、該タンパク質は野生型Ｂｃｌ−２タンパク
質に比べ有意に増強されたアポトーシス抑制活性を有す
る。
レオチドおよび本発明のポリペプチドは、それぞれプロ
トオンコジーンであるＢｃｌ−２遺伝子の変異体および
アポトーシス抑制活性を有するＢｃｌ−２変異体タンパ
ク質であり、該タンパク質は野生型Ｂｃｌ−２タンパク
質に比べ有意に増強されたアポトーシス抑制活性を有す
る。
【００７８】従って、 本発明のポリペプチドは、細胞
のアポトーシスが原因である様々な疾患の治療に有用で
ある。
のアポトーシスが原因である様々な疾患の治療に有用で
ある。
【００７９】さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ア
ポトーシス抑制活性を有する前記ポリペプチドをコード
する遺伝子たりえるので、遺伝子治療に応用されて、細
胞のアポトーシスが原因である様々な疾患の治療に有用
となる。
ポトーシス抑制活性を有する前記ポリペプチドをコード
する遺伝子たりえるので、遺伝子治療に応用されて、細
胞のアポトーシスが原因である様々な疾患の治療に有用
となる。
【００８０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hisamitsu Pharmaceuticals Co., Inc. <120> Apoptosis-inhibiting Polypeptides, Genes and Polynucleotides Encoding Same, and Compositions Containing Them <130> P99HM-024 <140> <141> <160> 21 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 239 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 50 55 60 Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Ala 85 90 95 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Gly Asp Phe 100 105 110 Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 130 135 140 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 145 150 155 160 Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 165 170 175 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro 195 200 205 Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala 210 215 220 Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys 225 230 235 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ala Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 50 55 60 Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Ala 85 90 95 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Gly Asp Phe 100 105 110 Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 130 135 140 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 145 150 155 160 Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 165 170 175 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro 195 200 205 Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala 210 215 220 Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys 225 230 235 <210> 3 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 50 55 60 Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Ala 85 90 95 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Gly Asp Phe 100 105 110 Ala Glu Met Ala Ala Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 130 135 140 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 145 150 155 160 Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 165 170 175 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro 195 200 205 Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala 210 215 220 Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys 225 230 235 <210> 4 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 50 55 60 Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Ala 85 90 95 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Gly Asp Phe 100 105 110 Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 130 135 140 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 145 150 155 160 Ala Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 165 170 175 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro 195 200 205 Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala 210 215 220 Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys 225 230 235 <210> 5 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 5 Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 50 55 60 Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Ala 85 90 95 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Gly Asp Phe 100 105 110 Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 130 135 140 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 145 150 155 160 Asp Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 165 170 175 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro 195 200 205 Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala 210 215 220 Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys 225 230 235 <210> 6 <211> 720 <212> DNA <213> Human <400> 6 atggcgcacg ctgggagaac ggggtacgac aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60 tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120 ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180 gcatcccgcg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240 gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctggccct ccgccaagcc 300 ggcgacgact tctcccgccg ctaccgcggc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360 ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420 ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480 agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540 ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggatgc ctttgtggaa 600 ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660 ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctgag ccacaagtga 720 <210> 7 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 atggcgcacg ctgggagaac ggggtacgac aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60 tataagctgg cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120 ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180 gcatcccgcg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240 gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctggccct ccgccaagcc 300 ggcgacgact tctcccgccg ctaccgcggc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360 ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420 ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480 agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540 ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggatgc ctttgtggaa 600 ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660 ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctgag ccacaagtga 720 <210> 8 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 atggcgcacg ctgggagaac ggggtacgac aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60 tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120 ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180 gcatcccgcg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240 gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctggccct ccgccaagcc 300 ggcgacgact tctcccgccg ctaccgcggc gacttcgccg agatggccgc ccagctgcac 360 ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420 ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480 agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540 ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggatgc ctttgtggaa 600 ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660 ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctgag ccacaagtga 720 <210> 9 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 atggcgcacg ctgggagaac ggggtacgac aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60 tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120 ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180 gcatcccgcg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240 gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctggccct ccgccaagcc 300 ggcgacgact tctcccgccg ctaccgcggc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360 ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420 ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480 gccgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540 ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggatgc ctttgtggaa 600 ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660 ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctgag ccacaagtga 720 <210> 10 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 atggcgcacg ctgggagaac ggggtacgac aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60 tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120 ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180 gcatcccgcg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240 gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctggccct ccgccaagcc 300 ggcgacgact tctcccgccg ctaccgcggc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360 ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420 ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480 gacgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540 ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggatgc ctttgtggaa 600 ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660 ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctgag ccacaagtga 720 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 gtagccggtc tgcgccagct tataatg 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 gtagccggtc tggtccagct tataatg 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ggtctgcagc ggcgcggtcc tggcgac 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 ggtctgcagc gggtcggtcc tggcgac 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 gtgcagctgg ctggccatct cggcgaa 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 gtgcagctgg ctgaccatct cggcgaa 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gtgcagctgg gcggccatct cggcgaa 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 ctcccggttg acggcctcca cacacat 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 ctcccggttg acgacctcca cacacat 27 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 ccgctcgaga tggcgcacgc tgggagaacg gggtac 36 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 gctctagatc acttgtggct cagataggca cc 32
【図１】図１は、野生型Ｂｃｌ−２タンパク質の各ドメ
インと変異を導入され、置換されるセリン残基との相対
的な位置関係を示す前記Ｂｃｌ−２の構造模式図であ
る。
インと変異を導入され、置換されるセリン残基との相対
的な位置関係を示す前記Ｂｃｌ−２の構造模式図であ
る。
【図２】図２は、本発明に従い、Ｂｃｌ−２変異体遺伝
子を含むプラスミドをＰＣＲ、制限酵素切断、部位特異
的突然変異等の手法によって構築するスキームを表わす
模式図である。
子を含むプラスミドをＰＣＲ、制限酵素切断、部位特異
的突然変異等の手法によって構築するスキームを表わす
模式図である。
【図３】図３は、野生型Ｂｃｌ−２タンパク質と、本発
明に従い、前記タンパク質に単一または複数の変異を導
入した各種Ｂｃｌ−２変異体のアポトーシス抑制活性を
比較する棒グラフである。
明に従い、前記タンパク質に単一または複数の変異を導
入した各種Ｂｃｌ−２変異体のアポトーシス抑制活性を
比較する棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 27/02 25/28 43/00 １０５ 27/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 EA02 EA04 GA11 HA01 HA17 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA07 AA13 BA01 BA22 CA53 MA66 ZA022 ZA162 ZA332 ZA362 ZA752 ZB212 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 ZA02 ZA16 ZA33 ZA36 ZA75 ZB21 ZB26 4H045 AA10 AA30 BA10 CA41 EA20 FA72 FA74 HA05
Claims (16)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列において少なくとも一つのセリンをアラニンまたはア
スパラギン酸で置換してなるアミノ酸配列からなり、且
つアポトーシス抑制活性を有するポリペプチド。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列において少なくとも一つのセリンをアラニンまたはア
スパラギン酸で置換してなるアミノ酸配列からなり、且
つ該配列番号１に記載のアミノ酸配列によって定義され
る野生型Ｂｃｌ−２タンパク質よりも実質的に高いアポ
トーシス抑制活性を有するポリペプチド。 - 【請求項３】 前記セリンが前記アミノ酸配列の２４番
目、１１６番目、１１７番目、または１６１番目の残基
から選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請
求項２に記載のポリペプチド。 - 【請求項４】 前記２４番目、１１６番目、および／ま
たは１１７番目のセリンをアラニンで、および／または
１６１番目のセリンをアラニン若しくはアスパラギン酸
で置換したことを特徴とする請求項３に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項５】 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列からなるポリペプチド。 - 【請求項６】 配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配
列からなるポリペプチド。 - 【請求項７】 配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配
列からなるポリペプチド。 - 【請求項８】 配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配
列からなるポリペプチド。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポ
リペプチドをコードする遺伝子。 - 【請求項１０】 配列表の配列番号７に記載のヌクレオ
チド配列からなるポリヌクレオチド。 - 【請求項１１】 配列表の配列番号８に記載のヌクレオ
チド配列からなるポリヌクレオチド。 - 【請求項１２】 配列表の配列番号９に記載のヌクレオ
チド配列からなるポリヌクレオチド。 - 【請求項１３】 配列表の配列番号１０に記載のヌクレ
オチド配列からなるポリヌクレオチド。 - 【請求項１４】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の
ポリペプチド、それらの組み合わせ、またはその部分ペ
プチドと、さらに薬学的に許容される担体または希釈剤
を含む薬学的組成物。 - 【請求項１５】 請求項９に記載の遺伝子が発現可能な
状態で組み込まれたウィルスベクター。 - 【請求項１６】 請求項１０〜１３のいずれか１項に記
載のポリヌクレオチドと、治療的に許容される担体また
は希釈剤を含む遺伝子治療用組成物。
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| JP35042799A JP2001161372A (ja) | 1999-12-09 | 1999-12-09 | アポトーシス抑制ポリペプチド、それをコードする遺伝子およびポリヌクレオチド、並びにそれらを含む組成物 |
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