CN1372569A - 角质形成细胞生长因子－2 - Google Patents

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P·金米尼兹
D·R·杜安
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D·门德里克
J·张
J·倪
P·A·摩尔
T·A·克里曼
J·R·格鲁伯
P·J·迪伦
R·L·简茨
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Abstract

本发明涉及多种新鉴定的多核苷酸,由这类多核苷酸编码的多肽,这类多核苷酸和多肽的用途,以及这类多核苷酸和多肽的生产。更具体地,本发明的多肽是角质形成细胞生长因子,下文中有时也称之为“KGF－2”,以前也称之为成纤维细胞生长因子12(FGF－12)。本发明另外还涉及KGF－2促进或加快创伤愈合的治疗用途。本发明也涉及KGF－2的新的突变体形式,所述突变体形式显示出活性增强,稳定性增加,产量较高或溶解性较好。

Description

角质形成细胞生长因子-2
                       发明领域
本发明涉及新鉴定的多核苷酸，由这种多核苷酸编码的多肽，这种多核苷酸和多肽的用途，以及这种多核苷酸和多肽的生产。更具体地，本发明的多肽是一种角质形成细胞生长因子，下文中有时也称之为“KGF-2”，以前也称之为成纤维细胞生长因子12(FGF-12)。本发明也涉及抑制这种多肽的作用。本发明另外还涉及KGF-2促进或加快创伤愈合的治疗用途。本发明也涉及KGF-2的新的突变体形式，所述突变体形式显示出活性增强，稳定性增加，产量更高或溶解性更好。另外，本发明涉及纯化KGF-2多肽的方法。
                       发明背景
成纤维细胞生长因子家族为涉及软组织生长和再生的生长因子大家族。目前，它包括几个在蛋白质水平上同源性程度不同的成员，除其中的一个外，似乎都具有类似的宽的促细胞分裂谱，即它们能够促进多种来自中胚层和神经外胚层之细胞的增殖和/或促进血管生成。
从发育一些阶段极端受限的表达，到与之相反的多个组织和器官中的遍在表达，该家族不同成员的表达模式非常不同。所有的成员似乎都与肝素和硫酸肝素蛋白聚糖和糖胺聚糖结合，并高度集中于胞外基质内。起初，通过序列同源性或因子纯化和克隆，将KGF鉴定为FGF家族的成员。角质形成细胞生长因子(KGF)作为经培养的鼠角质形成细胞系的促分裂原被分离(Rubin，J.S.等，美国国家科学院院报，86：802-806(1989))。与FGF家族的其它成员不同的是：它对间充质衍生的细胞没什么活性，但可刺激上皮细胞的生长。角质形成细胞生长因子基因编码一种具194个氨基酸的多肽(Finch，P.W.等，科学，245：752-755(1989))。N-末端的64个氨基酸是独特的，但该蛋白质的其余部分与bFGF约有30％的同源性。KGF是FGF家族中最与众不同的成员。该分子具有疏水性的信号序列并能有效地分泌。翻译后修饰包括信号序列的切割和在一个位点的N-连接的糖基化，产生了一种28KDa的蛋白质。角质形成细胞生长因子由来源于皮肤和胎儿肺的成纤维细胞产生(Rubin等，(1989))。已发现角质形成细胞生长因子的mRNA可在成人肾脏，结肠和髂骨中表达，但不能在脑或肺中表达(Finch，P.W.等，科学，245：752-755(1989))。KGF在FGF蛋白质家族内呈现出保守区域，KGF以高亲和力与FGF-2受体结合。
创伤愈合受损是重要的发病源，可导致如裂开，吻合崩溃和创伤久治不愈的并发症。在正常的个体中，不难达到愈合创伤的目的。与之形成对照的是，愈合受损与如糖尿病，感染，免疫抑制，肥胖和营养不良的几种疾病有关(Cruse，P.J.和Foord，R.，外科文献(Arch.Surg)，107：206(1973)；Schrock，T.R等，外科纪事(Ann.Surg)，177：513(1973)；Poole，G.U.，Jr.，外科学，97：631(1985)；Irvin，G.L等，美国外科学，51：418(1985))。
创伤修复是复杂的相互作用和生物学过程的结果。已描述了正常创伤愈合的3个阶段：急性炎症期，胞外基质与胶原的合成，和重建(Peacock，E.E.，Jr.，创伤修复，第2版，WB Saunders，Philadelphia(1984))。所述过程涉及角质形成细胞，成纤维细胞和炎性细胞在受伤位点的相互作用。
组织再生似乎受特异性肽因子的控制，所述肽因子调节与修复过程有关的细胞的迁移和增殖(Barrett，T.B等，美国国家科学院院报，81：6772-6774(1985)；Collins，T.等，自然，316：748-750(1985))，因此，生长因子在治疗创伤，烧伤和其它皮肤病中是有希望的治疗剂(Rifkin，D.B.和Moscatelli，细胞生物学杂志，109：1-6(1989)；Sporn，M.B.等，细胞生物学杂志，105：1039-1045(1987)；Pierce，G.F.等，细胞生物化学杂志，45：319-326(1991))。在急性炎症过程中，临时组织的沉积启动了愈合过程的顺序，紧接其后的是上皮重新形成，胶原合成并沉积，成纤维细胞增殖和新血管形成，它们最终确定了模型重建阶段(Clark，R.A.F，J.Am.Acad.Dermatol，13：701(1985))。这些事件受生长因子和炎性细胞或位于创伤边缘的细胞所分泌的细胞因子影响(Assoian，R.K等，自然(Lond.)309：804(1984)；Nemeth，G.G等，“生长因子及其对创伤和骨折愈合的作用”，生长因子和创伤愈合的其它方面在生物学和临床上的意义，纽约(1988)，p1-17)。
已鉴定出几个与创伤愈合有关的多肽生长因子，包括角质形成细胞生长因子(KGF)(Antioniades，H等，美国国家科学院院报，88：565(1991))，衍生于血小板的生长因子(PDGF)(Antioniades，H等，美国国家科学院院报，88：565(1991)；Staiano-Coico，L等，实验医学杂志，178：865-878(1993))，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Golden，M.A等，临床研究杂志，87：406(1991))，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)(Mellin，T.N等，临床皮肤病学杂志(J.Invest.Dermatol)，104：850-855(1995))，表皮生长因子(EGF)(Whitby，D.J和Ferguson，W.J.，发育生物学，147：207(1991))，转化生长因子-α(TGF-α)(Gartner，M.H等，Surg.Forum，42：643(1991)；Todd，R等，美国病理学杂志，138：1307(1991))，转化生长因子-β(TGF-β)(Wong，D.T.W等，临床研究杂志，143：622(1987))，neu分化因子(rNDF)(Danilenko，D.M等，临床研究杂志，95：842-851(1995))，胰岛素样生长因子I(IGF-I)和胰岛素样生长因子II(IGF-II)(Cromack，D.T等，外科研究杂志，42：622(1987))。
已报道说皮肤中的rKGF-1会刺激表皮角质形成细胞，毛囊和皮脂腺内的角质形成细胞(Pierce，G.F等，实验医学杂志，179：831-840(1994))。
                          发明概述
本发明提供了分离的核酸分子，所述核酸分子含有编码角质形成细胞生长因子(KGF-2)的多核苷酸，该生长因子具有图1所示的氨基酸序列[SEQ ID NO：2]或由1994年12月16日保藏的保藏号为ATCC 75977的细菌宿主中保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列。通过测定经保藏的KGF-2克隆的序列确定的核苷酸序列示于图1[SEQ ID NO：1]，该序列含有编码208个氨基酸残基的多肽的一个开放阅读框，其中包括第1-3位的起始密码子，预测前导序列约为35或36个氨基酸残基，推定其分子量约为23.4 kDa。成熟的KGF-2氨基酸序列示于图1，为约36或37至208位[SEQ ID NO：2]的氨基酸残基。
本发明的多肽被推测鉴定为FGF家族的成员，更具体地，由于其氨基酸序列与FGF家族其它成员的同源性，将所述多肽推测鉴定为KGF-2。
根据本发明的一个方面，提供了新的成熟的多肽KGF-2，及其具有生物活性的、在诊断或治疗上有用的片段，类似物和衍生物。本发明的多肽来源于人。
根据本发明的另一方面，提供了编码人KGF-2的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA及其反义类似物，以及具有生物活性的、在诊断或治疗上有用的片段。
根据本发明的另一方面，提供了通过重组技术生产这种多肽的方法，所述重组技术为使用重组载体，如在重组生产KGF-2蛋白中可用作试剂的克隆和表达质粒，以及含有人KGF-2核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。
根据本发明的另一方面，提供了将这种多肽，或编码这种多肽的多核苷酸用作治疗目的的方法，例如用于刺激上皮细胞增殖和基底的角质形成细胞以使创伤愈合，刺激毛囊产生和皮伤愈合。KGF-2可临床用于刺激创伤愈合，所述创伤包括外科伤口，切除术的伤口，涉及真皮和表皮损伤的深层创伤，眼组织创伤，牙组织创伤，口腔创伤，糖尿病溃疡，皮肤溃疡，肘溃疡，动脉溃疡，静脉停滞溃疡，因热暴露或化合物引起的灼伤，和其它不正常的创伤愈合疾病，如尿毒症，营养不良，维生素缺乏症和与用类固醇，放射疗法和抗肿瘤药物和抗代谢物全身性治疗相关的并发症。KGF-2可被用来促进皮损失后的皮重建。
KGF-2可被用来增加皮肤移植物与创伤床的粘附性，并刺激创伤床处重新形成上皮。下文列出了可使用KGF-2增加其与创伤床的粘附性的移植物类型：自体移植物，人工皮肤，同种移植物，自体真皮移植物，自体表皮移植物，无血管移植物，Blair-Brown移植物，骨移植物，胚胎期形成的移植物，皮肤移植物，延迟的移植物，真皮移植物，表皮移植物，筋膜移植物，全层皮(full thickness)移植片，异源移植物，异种移植物，同种移植物，增生性移植物，角膜薄层移植物，网眼移植物，粘膜移植物，Ollier-Thiersch移植物，网膜移植物，补片移植物，蒂移植物，全层角膜移植物，分层皮移植片，厚分层皮移植片。可使用KGF-2促进皮肤强度并改善老化皮肤的外观。
据信KGF-2也可使肝细胞的增殖，和肺、乳房、胰腺、胃、小肠和大肠中的上皮细胞的增殖产生变化。KGF-2可促进如皮脂细胞(sebocyte)，毛囊，肝细胞，II型肺细胞，产生粘蛋白的杯状细胞的上皮细胞，和其它上皮细胞以及皮肤，肺，肝脏和胃肠道中所含的它们的祖细胞的增殖。KGF-2可促进内皮细胞，角质形成细胞和基底的角质形成细胞的增殖。
也可使用KGF-2降低由放射，化学疗法治疗或病毒感染引起的肠毒性副作用。KGF-2对小肠粘膜具有细胞保护性作用。KGF-2也可刺激由化学疗法和病毒感染引起的粘膜炎(口腔溃疡)的愈合。
KGF-2也可用于对包括烧伤(即毛囊，汗腺和皮脂腺的重新分群)的全部和部分厚度的皮肤缺陷的完全再生，和对如牛皮癣的其它皮肤缺陷的治疗。KGF-2通过加速损害部位重新形成上皮也可用于治疗大疱性表皮松解，该病是上皮与其下面的真皮的粘附性缺陷，可导致经常性的、破溃的和疼痛的水疱。KGF-2也可用于治疗胃和十二指肠溃疡，并通过在粘膜衬里处形成疤痕和使腺粘膜和十二指肠粘膜衬里更快速地再生而帮助溃疡处愈合。如Crohn’s病和溃疡性结肠炎的炎性肠疾病分别是导致小肠或大肠粘膜表面被破坏的疾病。因此，KGF-2也可用于促进粘膜表面重新形成表面，从而有助于更快速地愈合并阻止炎性肠疾病的进程。预期KGF-2治疗对整个胃肠道的粘膜产生具有显著的作用，可用来保护肠粘膜使之远离被摄入的或外科手术后的有害物质。KGF-2也可用于治疗与KGF-2的表达不足有关的疾病。
另外，KGF-2也可用于预防和治愈因多种病理学状态引起的对肺的损伤。如KGF-2这样的生长因子可刺激增殖和分化，并促进肺泡和细支气管上皮的修复以预防或治疗急性或慢性肺损伤。例如，KGF-2可有效地治疗导致肺泡渐进损失的肺气肿，和由吸烟和烧伤引起的可导致细支气管上皮和肺泡坏死的吸入剂损伤。KGF-2也可用于刺激II型肺细胞的增殖和分化，这有助于治疗或预防如透明膜疾病之类的疾病，所述透明膜疾病如婴儿呼吸窘迫综合征和不成熟幼儿的支气管肺发育不良。
KGF-2也可刺激肝细胞的增殖和分化，因此，KGF-2可用来缓解或治疗肝脏疾病和如由肝硬变引起的暴发性肝脏疾病，由病毒性肝炎和毒性物质(即扑热息痛，四氯化碳和现有技术中已知的肝毒素)引起的肝损害的病理学。
另外，KGF-2也可用于治疗或预防糖尿病的发作。在最近被诊断为I型和II型糖尿病，仍维持有一些胰岛细胞功能的病人中，可使用KGF-2维持胰岛功能以缓解，延迟或防止疾病的永久现象。KGF-2也可被用作胰岛细胞移植过程中的辅助物以改善或促进胰岛细胞的功能。
根据本发明的另一方面，提供了抗这种多肽的抗体。
根据本发明的另一方面，提供了核酸探针，所述探针含有足够长以与人KGF-2序列特异性杂交的核酸分子。
根据本发明的另一方面，提供了可用作治疗肽的KGF-2模拟肽，模拟的KGF-2肽是一些通过结合和激活KGF-2的同源受体从而模拟KGF-2蛋白生物活性的短肽。模拟的KGF-2肽也可结合并抑制KGF-2的同源受体。
根据本发明的另一方面，提供了这种多肽的拮抗剂，使用所述拮抗剂可抑制这种多肽的作用，例如减少创伤愈合过程中的疤痕和预防和/或治疗肿瘤增殖，糖尿病性视网膜病，类风湿性关节炎，骨关节炎和肿瘤生长。也可使用KGF-2拮抗剂治疗与KGF-2过量表达有关的疾病。
根据本发明的另一方面，提供了用于检测与KGF-2核酸序列中的突变或由这种序列编码的多肽的过量表达相关的疾病或对所述疾病的易感性的诊断试验。
根据本发明的另一方面，提供了将这种多肽，或编码这种多肽的多核苷酸用于与科学研究，DNA合成和DNA载体的制备相关的体外目的的方法。
因此，本发明一方面提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子含有具有选自下列的一种核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码具有图1完整的氨基酸序列[SEQ ID NO：2]的KGF-2多肽的核苷酸序列；(b)编码具有图1第36或37至208位的氨基酸序列[SEQ ID NO：2]的成熟KGF-2多肽的核苷酸序列；(c)编码具有由ATCC保藏号75977中所含cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的KGF-2多肽的核苷酸序列；(d)编码具有由ATCC保藏号75977中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟KGF-2多肽的核苷酸序列；和(e)与上述(a)，(b)，(c)或(d)中任一个核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明的其它实施方案包括分离的核酸分子，所述核酸分子含有具有与上述(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中任一个核苷酸序列至少90％相同，更优选至少95％，97％，98％或99％相同的核苷酸序列的多核苷酸，或在严谨杂交条件下能与上述(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中的多核苷酸杂交的多核苷酸。杂交的此多核苷酸在严谨杂交条件下不与具有仅由A残基或仅由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。本发明其它的核酸实施方案涉及分离的核酸分子，所述核酸分子含有编码具有上述(a)，(b)，(c)或(d)中一种氨基酸序列的KGF-2的携有表位的部分的氨基酸序列的多核苷酸。
本发明另外提供了分离的KGF-2多肽，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列：(a)具有图1所示的完整的208个氨基酸的序列，包括前导序列的KGF-2多肽的氨基酸序列[SEQ ID NO：2]；(b)具有图1第36或37至208位氨基酸序列的成熟KGF-2多肽的氨基酸序列[SEQ IDNO：2](不具有前导序列)；(c)具有由ATCC保藏号75977中所含cDNA克隆编码的完整氨基酸序列，包括前导序列的KGF-2多肽的氨基酸序列；和(d)具有由ATCC保藏号75977中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟KGF-2多肽的氨基酸序列。本发明的多肽也包括具有与上述(a)，(b)，(c)或(d)中所述氨基酸序列至少90％相似，更优选至少95％相似的氨基酸序列的多肽，以及具有与上述氨基酸序列至少80％相同，更优选至少90％相同，还要更优选95％，97％，98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。
本发明的另一发明涉及具有KGF-2多肽的携有表位的部分的氨基酸序列的肽或多肽，所述KGF-2多肽具有上述(a)，(b)，(c)或(d)中的氨基酸序列。尽管本发明中也包括长度直至和包含上述本发明多肽的整个氨基酸序列的任何长度的携有表位的多肽，但具有本发明KGF-2多肽的携有表位的部分的氨基酸序列的肽或多肽包括具有至少6或7个，优选至少9个，更优选至少约30个氨基酸至约50个氨基酸的这类多肽的部分。在另一个实施方案中，本发明提供了与具有上述(a)，(b)，(c)或(d)中的氨基酸序列的KGF-2多肽特异性结合的分离的抗体。
根据本发明的另一方面，描述了KGF-2的新的变体。通过缺失或替换KGF-2的一个或多个氨基酸可产生这些变体。天然的突变被称为等位基因变异。等位基因变异可以是沉默的(经编码的多肽没有变化)，或可具有经改变的氨基酸序列。为了尝试改善或改变天然KGF-2的特征，可利用蛋白质工程。可使用本领域中已知的重组DNA技术产生新的多肽，突变蛋白和缺失突变体可显示例如增强的活性或增加的稳定性。另外，可以较高的得率纯化它们，至少在某些纯化和储存条件下，它们显示出较好的溶解性。
鉴于本文的教导，本发明的这些和其它方面对本领域的技术人员而言将是显而易见的。
                          图的简述
下述诸图阐明了本发明的实施方案，但并不意味着限制 中所包含的本发明的范围。
图1A-1C阐明了本发明多肽的cDNA和相应的推定的氨基酸序列。起初的35或36个氨基酸残基表示推定的前导序列(下划线的)。使用了针对氨基酸的标准的单字母缩写。当尝试测定多核苷酸序列时，测序的不准确性是常见的难题。使用373型自动化DNA测序仪(AppliedBiosystems公司)进行测序，预测测序的准确性大于97％准确度[SEQID NO：1]。
图2A-2D阐明了本发明多肽和其它成纤维细胞生长因子的氨基酸序列的比较[SEQ ID NO：13-22]。
图3A-3D显示了KGF-2基因的全长mRNA和氨基酸序列[SEQ IDNO：23和24]。
图4A-4E显示了KGF-2氨基酸序列的分析，显示出α，β，转角和卷曲区；亲水性和疏水性；两亲性区域；柔性区域；抗原性指数和表面概率。在“抗原性指数-Jameson-Wolf”图中，图1中的氨基酸残基41-109对应于KGF-2蛋白显示出高度抗原性的区域。疏水性区域(Hopp-Woods作图)落在中位值线的下方(负值)，而发现亲水性区域(Kyte-Doolittle作图)位于中位值线的上方(正值，如氨基酸残基41-109)。作图针对的是全部208个氨基酸的ORF。
图5显示出有关KGF-2对糖尿病小鼠伤口闭合之作用的评价。受伤后立即测量创伤，并在连续5天中的每一天和第8天也测量创伤，使用下列公式来计算伤口闭合的百分比：[第1天的面积]-[第8天的面积]/[第1天的面积]。使用非成对t检验进行统计学分析(平均值+/-SEM，n＝5)。
图6显示出有关KGF-2对非糖尿病小鼠伤口闭合之作用的评价。受伤后立即测量创伤，并在连续5天中的每一天和第8天也测量创伤，使用下列公式计算伤口闭合的百分比：[第1天的面积]-[第8天的面积]/[第1天的面积]。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM，n＝5)。
图7显示出糖尿病小鼠伤口闭合的时间进程。受伤后立即测量创伤，并在连续5天中的每一天和第8天测量创伤，数值表示为总面积(mm2)。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM，n＝5)。
图8显示出非糖尿病小鼠伤口闭合的时间进程。受伤后立即测量创伤，并在连续5天中的每一天和第8天也测量创伤，数值表示为总面积(mm2)。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM，n＝5)。
图9显示出有关KGF-2对糖尿病小鼠的组织病理学评价。评分由盲观测者给出，使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM，n＝5)。
图10显示出有关KGF-2对非糖尿病小鼠的组织病理学评价，评分由盲观测者给出，使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM，n＝5)。
图11显示出角质形成细胞生长对糖尿病小鼠的作用。评分由盲观测者给出。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM，n＝5)。
图12显示出角质形成细胞生长对非糖尿病小鼠的作用。评分由盲观测者给出。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM，n＝5)。
图13显示出皮肤增殖对糖尿病小鼠的作用。评分由盲观测者给出，使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM，n＝5)。
图14显示出皮肤增殖对非糖尿病小鼠的作用。评分由盲观测者给出。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM，n＝5)。
图15显示出DNA序列和由pQE60-Cys37构建体表达的蛋白质(SEQ ID No：29和30)。表达的KGF-2蛋白含有从第37位的半胱氨酸至第208位丝氨酸的序列，所述蛋白质的N末端结合有6X(His)标记物。
图16显示出甲基氢化泼尼松对大鼠伤口愈合的作用。在受伤的当天用5mg甲基氢化泼尼松注射雄性SD成年大鼠(n＝5)。动物接受皮穿孔创伤(8mm)，连续5天每天用缓冲溶液或溶于50微升缓冲溶液中的KGF-2溶液治疗上述大鼠。在第1-5天的每天和第8天用经校准的Jameson测径器测量伤口，数值表示为第8天测量的结果(平均值+/-SEM)。
图17显示出KGF-2对伤口闭合的作用。雄性SD成年大鼠(n＝5)接受皮穿孔创伤(8mm)，并在受伤的当天接受5mg甲基氢化泼尼松注射。从受伤当天开始，连续5天每天用缓冲溶液或溶于50微升缓冲溶液中的KGF-2溶液治疗上述动物。在第1-5天的每天和第8天测量伤口，使用下列公式来计算伤口闭合：[第8天的面积]-[第1天的面积]/[第1天的面积]。第1天的面积测定为64mm2，此面积由皮穿孔造成。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM)。
图18显示出创伤愈合的糖皮质激素损伤模型中创伤愈合的时间进程。雄性SD成年大鼠(n＝5)在第1天接受皮穿孔创伤(8mm)，并连续5天每天用缓冲溶液或溶于50微升缓冲溶液中的KGF-2溶液治疗上述动物。动物在受伤当天接受了5mg甲基氢化泼尼松注射。从受伤当天开始，在第1-5天的每天和第8天用经校准的Jameson测径器测量伤口。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM)。
图19(A)显示出受伤后第5天未用甲基氢化泼尼松注射的创伤愈合大鼠模型中KGF-2对伤口面积的作用。雄性SD成年大鼠(n＝5)在第1天接受了皮穿孔创伤(8mm)，并在受伤当天和其后连续5天每天用缓冲溶液或溶于50微升缓冲溶液中的KGF-2溶液治疗上述动物。每天用经校准的Jameson测径器测量伤口，使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM)。(B)PDGF-BB和KGF-2在雄性SD大鼠(n＝6)中的评分。所有大鼠接受了8mm的背部伤口和甲基氢化泼尼松(MP)(17mg/kg)来损害创伤愈合。每天用缓冲液或多种浓度的PDGF-BB和KGF-2治疗伤口。在第2，4，6，8和10天使用经校准的Jameson测径器测量伤口。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM)。*与缓冲液比较。**1微克PDGF-BB对1微克KGF-2/E3。
图20显示出在经糖皮质激素损伤的创伤愈合模型中KGF-2对伤口距离的作用。雄性SD成年大鼠(n＝5)接受了皮穿孔创伤(8mm)，并在受伤当天接受了17mg/kg甲基氢化泼尼松。在其后连续5天的每天和第8天用缓冲溶液或溶于50微升缓冲溶液中的KGF-2溶液治疗上述动物。在光学显微镜下用经校准的测微计测量伤口距离。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SEM)。
图21(A)显示了KGF-2对正常的原发性表皮角质形成细胞增殖的刺激。(B)显示了KGF-2Δ33对正常的原发性表皮角质形成细胞增殖的刺激。(C)显示了KGF-2Δ28对正常的原发性表皮角质形成细胞增殖的刺激。将正常的人原发性表皮角质形成细胞与多种浓度的KGF-2，KGF-2Δ33或KGF-2Δ28一起保温3天，然后对所有3个实验加入alamarBlue 16小时，通过O.D.570nm和O.D.600nm之间的差异测定细胞由alamarBlue转变成的红色的强度。对于每种KGF-2蛋白而言，在相同的检测板中包括含有完全的角质形成细胞生长培养基(KGM)的阳性对照，和含有角质形成细胞基础培养基(KBM)的阴性对照。
图22(A)显示了被FGFR1b和FGFR2转染的Baf3细胞中KGF-2和FGF7对胸苷掺入的刺激作用。测定了KGF-2(右边的组)和FGF7(左边的组)对被FGFR1iiib(空心圆圈)或FGFR2iiib/KGFR(实心圆圈)转染的Baf3细胞增殖的作用。Y轴表示掺入Baf3细胞DNA中的[3H]胸苷的量(cpm)，X轴表示在组织培养基中加入的KGF-2或FGF7的终浓度。(B)显示了被FGFR2iiib转染的Baf3细胞中KGF-2Δ33对胸苷掺入的刺激作用。(C)显示了被FGFR2iiib转染的Baf3细胞中KGF-2(白线)，KGF-2Δ33(黑线)和KGF-2Δ28(灰线)对胸苷掺入的刺激作用。
图23显示了大肠杆菌优化的全长KGF-2的DNA和蛋白质序列[SEQ ID NOS：38和39]。
图24A和B显示了大肠杆菌优化的成熟KGF-2的DNA和蛋白质序列[SEQ ID NOS：42、43、54和55]。
图25显示了含有KGF-2氨基酸36至208位的KGF-2缺失构建体的DNA和被编码的蛋白质序列[SEQ ID NOS：65和66]。
图26显示了含有KGF-2氨基酸63至208位的KGF-2缺失构建体的DNA和被编码的蛋白质序列[SEQ ID NOS：67和68]。
图27显示了含有KGF-2氨基酸77至208位的KGF-2缺失构建体的DNA和被编码的蛋白质序列[SEQ ID NOS：69和70]。
图28显示了含有KGF-2氨基酸93至208位的KGF-2缺失构建体的DNA和被编码的蛋白质序列[SEQ ID NOS：71和72]。
图29显示了含有KGF-2氨基酸104至208位的KGF-2缺失构建体的DNA和被编码的蛋白质序列[SEQ ID NOS：73和74]。
图30显示了含有KGF-2氨基酸123至208位的KGF-2缺失构建体的DNA和被编码的蛋白质序列[SEQ ID NOS：75和76]。
图31显示了含有KGF-2氨基酸138至208位的KGF-2缺失构建体的DNA和被编码的蛋白质序列[SEQ ID NOS：77和78]。
图32显示了含有KGF-2氨基酸36至153位的KGF-2缺失构建体的DNA和被编码的蛋白质序列[SEQ ID NOS：79和80]。
图33显示了含有KGF-2氨基酸63至153位的KGF-2缺失构建体的DNA和被编码的蛋白质序列[SEQ ID NOS：81和82]。
图34显示了KGF-2半胱氨酸-37至丝氨酸的突变体构建体的DNA序列[SEQ ID NOS：83]。
图35显示了KGF-2半胱氨酸-37/半胱氨酸-106至丝氨酸的突变体构建体的DNA序列[SEQ ID NOS：84]。
图36显示了雄性SD大鼠(n＝5)中KGF-2Δ33对创伤愈合之作用的评价。动物接受了6mm的背部创伤，并连续4天用多种浓度的缓冲液，或KGF-2Δ33治疗上述动物。每天使用经校准的Jameson测径器测量伤口。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SE)。*与缓冲液比较。
图37显示了正常大鼠中KGF-2Δ33对创伤愈合之作用的评价。雄性，SD，250-300g，大鼠(n＝5)接受了6mm的全层皮(full-thickness)背部创伤。用测径器测量伤口，并从手术当天开始连续4天用多种浓度的KGF-2Δ33和缓冲液处理伤口，最后一天收获伤口。使用非成对t试验进行统计学分析。*将测量值与未治疗的对照比较。#将测量值与缓冲液对照比较。
图38显示了KGF-2Δ33对切口创伤破裂强度的作用。雄性成年SD大鼠(n＝10)在第1天接受了2.5cm的全层皮切口创伤，受伤后用缓冲液或KGF-2(Δ33)(1，4和10微克)之一处理切口内部。在第5天处死动物，切下0.5cm的伤口样品以进行常规的组织学和破裂强度分析。横跨伤口施加外力，使用Instron皮肤张力计进行生物力学试验，破裂强度(breaking strength)被定义为破裂前受每个伤口抑制的最大外力。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SE)。
图39显示了KGF-2(Δ33)对切口创伤表皮厚度的影响。雄性成年SD大鼠(n＝10)在第1天接受了2.5cm的全层皮切口创伤，受伤后用缓冲液或KGF-2(Δ33)(1，4和10微克)之一处理切口内部。在第5天处死动物，切下0.5cm的伤口样品以进行常规的组织学和破裂强度分析。通过取受伤位点周围的6次测量结果的平均值确定表皮厚度，诸测量结果是由盲观测者在使用经校准的透镜测微器的光学显微镜下观测经Masson Trichrome染色的切片得到的。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SE)。
图40显示了单次皮内注射后KGF-2(Δ33)对表皮厚度的影响。雄性成年SD大鼠(n＝18)在第0天接受了用缓冲液或溶于50微升的缓冲液中的1和4微克KGF-2的6次皮内注射。注射后24和48小时处死动物，测量由颗粒状层至基层底部的表皮厚度。沿着注射位点测量大约20次，计算出平均厚度。诸测量结果是使用经校准的透镜测径器在光学显微镜下观测经Masson Trichrome染色的切片得到的。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SE)。
图41显示了KGF-2(Δ33)对BrdU评分的影响。雄性成年SD大鼠(n＝18)在第0天接受了安慰剂或溶于50微升的浓度为1和4微克KGF-2的6次皮内注射。注射后24和48小时处死动物。处死前2小时用5-2’-溴脱氧尿苷(100mg/kg腹膜内)注射动物。盲观测者在光学显微镜下使用下列评分系统作出评分：0-3没有标记或被BrdU标记很少的细胞；4-6中度标记的细胞；7-10强标记的细胞。使用非成对t试验进行统计学分析(平均值+/-SE)。
图42显示了KGF-2对PAF-诱导的足水肿的抗炎症作用。
图43显示了Lewis大鼠中KGF-2Δ33对PAF-诱导的足水肿的抗炎症作用。
图44显示了KGF-2Δ33对全身被辐照的Balb/c小鼠存活的影响。用519 RADS辐照Balb/c雄性小鼠(n＝5)，22.1g。在照射前的2天里和照射后连续7天中的每一天用缓冲液或KGF-2(1和5mg/kg，皮下)治疗动物。
图45显示了KGF-2Δ33对被辐照小鼠的体重的影响。在用519Rad/min照射前的2天里用缓冲液或KGF-2Δ33(1和5mg/kg)注射体重为22.1g的Balb/c雄性小鼠(n＝5)，每天给动物称重，并在辐照后连续注射7天。
图46显示了KGF-2Δ33对全身被辐照的Balb/c小鼠存活率的影响。用519 RADS照射Balb/c雄性小鼠(n＝7)，22.1g。在照射前的2天里和照射后连续7天中的每一天用缓冲液或KGF-2(1和5mg/kg，皮下)治疗动物。
图47显示了在糖皮质激素损伤的大鼠模型中KGF-2Δ33对创伤愈合的效果。
图48显示了使用BrdU标记测定时KGF-2Δ33对细胞增殖的影响。
图49显示了KGF-2Δ33对位于大鼠结肠的吻合外科手术位点处的胶原含量的影响。
图50显示了pHE4-5表达载体[SEQ ID NO：147]和亚克隆的KGF-2cDNA编码序列的示意图。卡那霉素抗性标记基因、KGF-2编码序列、oriC序列和lacIq编码序列的位置均显示。
图51显示了pHE载体启动子(SEQ ID NO：148)的调节元件的核苷酸序列。两个lac操纵子序列、Shine-delgarno序列(S/D)、和末端HindIII及NdeI限制性位点(斜体)均显示。
图52显示在ip或sc施用KGF-2Δ33后膀胱上皮的增殖。
图53显示在系统性施用KGF-2Δ33后前列腺上皮细胞的增殖。
图54显示在大鼠的环磷酰胺诱导之出血性膀胱炎模型中KGF-2Δ33对膀胱壁溃疡形成的影响。
图55显示在大鼠的环磷酰胺诱导之出血性膀胱炎模型中KGF-2Δ33对膀胱壁厚度的影响。
图56提供了设计的用于确定当利用SC和IP途径系统性施用时KGF-2Δ33是否诱导正常大鼠上皮细胞增殖之研究的纵览。
图57正常Sprague Dawley大鼠每日注射KGF-2Δ33(5mg/kg；HG03411-E2)或缓冲液，于最后一次注射后一日处死。盲观察者在10倍放大倍数下计数每只动物随机选择的10个视野中增生细胞的数目。SC施用KGF-2Δ33后一天引发明显增殖，然后经过2天恢复为正常。IP施用的KGF-2Δ33从1-3天刺激增殖，但是仅在第1和第3天的结果有统计学显著性。
图58正常Sprague Dawley大鼠每日注射KGF-2Δ33(5mg/kg；HG03411-E2)或缓冲液，于最后一次注射后一日处死。盲观察者在10倍放大倍数下计数每只动物随机选择的10个视野中增生细胞的数目。IP施用的KGF-2Δ33在整个研究期间刺激增殖，而SC施用KGF-2Δ33在任何时间点均未引起增殖。
图59正常Sprague dawley大鼠每日注射KGF-2Δ33(5mg/kg；HG03411-E2)或缓冲液，于最后一次注射后一日处死。盲观察者在10倍放大倍数下计数每只动物一个截面中增生细胞的数目。SC施用的KGF-2Δ33在每日施用后1、2和3天引发明显增殖。当IP施用的KGF-2Δ33时，仅在第2和第3天后可见增殖。
图60证明KGF-2Δ33在正常大鼠肺部诱导增殖。
                         发明详述
根据本发明的一方面，提供了分离的核酸(多核苷酸)，所述核酸编码具有图1推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的多肽，或由1994年12月16日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209的ATCC保藏号为75977的克隆的cDNA编码的多肽，或由1994年9月29日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209的ATCC保藏号为75901的克隆的cDNA编码的多肽。核酸分子
除非另有说明，使用自动化DNA测序仪(如373型，可得自AppliedBiosystems公司)定通过测定本文DNA分子的序列确定的所有核苷酸序列，通过翻译如上测定的DNA序列推测由本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列。因此，正如本领域技术人员对由这种自动化方法测定的任何DNA序列已知的那样，本文测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。由自动化方法测定的核苷酸序列与被测序DNA分子的实际核苷酸序列至少约90％相同，更通常为至少约95％至至少约99.9％相同。通过其它方法，包括本领域中众所周知的人工DNA测序法，可更准确地测定实际的序列。现有技术中已知：与实际序列相比，被测定的核苷酸序列中的单个插入或缺失会导致该核苷酸序列翻译过程中的移码现象，从而使从所述插入或缺失点开始，由被测定的核苷酸序列编码的推测的氨基酸序列会与被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列完全不同。
除非另有说明，本文列出的每个“核苷酸序列”以脱氧核糖核苷酸(缩写为A，G，C和T)的序列表示。然而，核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”对于DNA分子或多核苷酸而言为脱氧核糖核苷酸的序列，对于RNA分子或多核苷酸而言为相应的核糖核苷酸(A，G，C和U)序列，其中特定的脱氧核糖核苷酸序列中的每个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)被尿嘧啶核糖核苷酸(U)所代替。例如，关于具有使用脱氧核糖核苷酸缩写列出的SEQ ID NO：1之序列的RNA分子，想表示的是其序列中SEQ ID NO：1的每个脱氧核糖核苷酸A，G或C已被相应的核糖核苷酸A，G或C代替，而每个脱氧核糖核苷酸T已被核糖核苷酸U所代替的RNA分子。
“分离的”核酸分子指的是从其天然环境中得到的核酸分子，DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，载体中所含的重组DNA分子被认为是分离的。分离的DNA分子的其它例子包括异源宿主细胞中所含的重组DNA分子或溶液中纯化的(部分纯化或基本上纯化)DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子的体内或体外RNA转录本。本发明的分离的核酸分子另外还包括合成产生的这种分子。
本发明的分离的核酸分子包括含有具有图1所示核苷酸序列(SEQID NO：1)第1-3位起始密码子的开放阅读框(ORF)的DNA分子；含有图1所示的成熟KGF-2蛋白(最后的172或173个氨基酸)(SEQ IDNO：2)之编码序列的DNA分子；和含有实质上与上述不同的序列但因遗传密码的简并性仍编码KGF-2蛋白的DNA分子。当然，遗传密码是本领域中众所周知的，因此，本领域技术人员可常规制备上述简并变体。
编码本发明多肽的多核苷酸可以得自人前列腺和胎儿肺。编码多肽的cDNA片段最初分离自得自人正常前列腺的文库，随后，从随机引发的人胎儿肺cDNA文库中分离编码全长蛋白质的开放阅读框。所述阅读框在结构上与FGF家族相关，它含有编码208个氨基酸残基之蛋白质的开放阅读框，其中大约前35或36个氨基酸残基是推定的前导序列以使成熟的蛋白质含有173或172个氨基酸。该蛋白质表现出与人角质形成细胞生长因子最高程度的同源性，在206个氨基酸的一段序列中具有45％的同一性和82％的相似性。已发现在FGF整个家族中保守的序列在本发明的蛋白质中也是保守的，这一点也很重要。
另外，得自文库的KGF-2 cDNA的嵌套式PCR结果表明KGF-2也存在潜在的其它剪接形式。具体地说，使用侧翼于KGF-2开放阅读框之N末端的引物，由多个cDNA文库得到0.2kb和0.4kb的PCR产物。0.2kb大小是预期的KGF-2产物，而0.4kb大小可能是KGF-2的其它剪接形式。在得自胃癌，成人睾丸，十二指肠和胰腺的文库中观察到了这一0.4kb产物。
本发明的多核苷酸可以是RNA的形式，也可以是DNA的形式，所述DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。该DNA可以是双链或单链，而若是单链，则可以是编码链，也可以是非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与图1所示的编码序列(SEQ ID NO：1)或经保藏的克隆中的编码序列相同；或者也可以是不同的编码序列，这一编码序列因遗传密码的丰余性或简并性而编码与图1之DNA(SEQ IDNO：1)或经保藏的cDNA所编码的相同的成熟多肽。
编码图1推测的成熟多肽(SEQ ID NO：2)或由经保藏的cDNA所编码的推测的成熟多肽的多核苷酸可包括：仅有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和其它编码序列如前导序列或分泌序列或原蛋白质序列；成熟多肽的编码序列(和任选的其它编码序列)和非编码序列如内含子或推测的成熟多肽之编码序列的5’和/或3’非编码序列。另外，已得到全长的mRNA，它含有该基因的5’和3’非翻译区(图3(SEQ IDNO：23))。
由于上文讨论的测序错误概率以及针对不同的已知蛋白质中前导序列的切割位点的可变异性，本领域技术人员会期望由经保藏的cDNA所编码的真正的KGF-2多肽含有约208个氨基酸，但可以是200-220个氨基酸范围内的任何一种情况；此蛋白质的实际前导序列约为35或36个氨基酸，但可以是30-40个氨基酸范围内的任何一种情况。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅包含多肽编码序列的多核苷酸以及包含另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明另外涉及上文所述多核苷酸的变体，所述多核苷酸变体编码具有图1推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)之多肽或由经保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。所述多核苷酸的变体可以是该多核苷酸天然产生的等位基因变体或该多核苷酸非天然产生的变体。
因此，本发明包括编码与图1(SEQ ID NO：2)所示相同的推测成熟多肽或与经保藏克隆的cDNA所编码的相同的推测成熟多肽的多核苷酸，以及这种多核苷酸的变体，所述变体编码图1(SEQ ID NO：2)所示多肽或由经保藏克隆的cDNA所编码多肽的片段、衍生物或类似物。这种核苷酸变体包括缺失变体、替换变体和添加或插入变体。
本发明包括编码可用作治疗肽的KGF-2模拟肽的多核苷酸。模拟的KGF-2肽是一些短肽，它们能够通过结合和激活KGF-2的相关受体来模拟KGF-2蛋白的生物活性。模拟的KGF-2肽也可以结合并抑制KGF-2的相关受体。KGF-2受体包括但不限于FGFR2iiib和FGFR1iiib。这种模拟肽可得自诸如，但不限于噬菌体展示或组合化学的方法。例如，Wrighton等，科学，273：458-463(1996)所述的产生模拟的KGF-2肽的方法。
如上所述，多核苷酸具有的编码序列可以是图1所示编码序列(SEQID NO：1)或经保藏克隆之编码序列的天然产生的等位基因变体。正如本领域中所熟知，等位基因变体是多核苷酸序列的一种可替换形式，它可具有一个或多个核苷酸的替换，缺失或添加，但基本上不会改变编码多肽的功能。
本发明也包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在相同的阅读框中与有助于宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸序列(例如作为分泌序列行使功能以控制从细胞中转运出多肽的前导序列)融合。具有前导序列的多肽是前蛋白，它可能具有可被宿主细胞切割从而形成多肽的成熟形式的前导序列。该多核苷酸也可以编码蛋白原，所述蛋白原是成熟的蛋白质加上额外的5’氨基酸残基。具有原序列的成熟蛋白质是蛋白原，它是蛋白质的无活性形式。一旦原序列被切割掉，剩下的就是有活性的成熟蛋白质。
因此，例如，本发明的多核苷酸可以编码成熟的蛋白质，或具有原序列的蛋白质，或既具有原序列也具有前序列(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸也可以具有符合读框地与一种标记序列融合的编码序列，所述标记序列可用于纯化本发明的多肽。在宿主为细菌的情况下，该标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记物以纯化与标记序列融合的成熟多肽，或例如，当使用哺乳动物宿主，如COS-7细胞时，标记序列也可以是血凝素(HA)标记物。HA标记物相当于得自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson，I等，细胞，37：767(1984))。
术语“基因”指的是参与产生多肽链的DNA区段；它包括编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
本发明全长基因的片段可被用作cDNA文库的杂交探针以分离全长的cDNA和分离与该基因具有高度序列相似性或相似的生物活性的其它cDNA。这种类型的探针优选具有至少30个碱基，并可含有例如50个或更多个碱基。所述探针可被用于鉴定对应于全长转录本的cDNA克隆和含有包括调节和启动子区域、外显子和内含子的完整基因的基因组克隆。筛选的例子包括通过使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探针以分离该基因的编码区。使用具有与本发明基因互补的序列的经标记的寡核苷酸筛选人cDNA、基因组DNA或cDNA文库以确定该探针与文库的哪个成员杂交。
本发明的其它实施方案包括分离的核酸分子，所述核酸分子含有的多核苷酸具有与：(a)编码具有图1(SEQ ID NO：2)完整的氨基酸序列(包括推测的前导序列)的全长KGF-2多肽的一个核苷酸序列；(b)编码具有图1(SEQ ID NO：2)中约第36或37至208位氨基酸序列的成熟KGF-2多肽(除去前导序列的全长多肽)的一个核苷酸序列；(c)编码具有由ATCC保藏号75977中所含cDNA克隆编码的完整氨基酸序列(包括前导序列)的全长KGF-2多肽的一个核苷酸序列；(d)编码具有由ATCC保藏号75977中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟KGF-2多肽的一个核苷酸序列；(e)编码上述任一种KGF-2类似物或缺失突变体的一个核苷酸序列；或(f)与(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中任一个核苷酸序列互补的一个核苷酸序列至少80％相同，更优选至少85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同的核苷酸序列。
具有与参照的编码KGF-2多肽的核苷酸序列至少，例如95％“相同”的核苷酸序列的多核苷酸指的是除了该多核苷酸序列在参照的编码KGF-2多肽的核苷酸序列的每100个核苷酸中可包括多至5个点突变外，多核苷酸的核苷酸序列与参照序列是相同的。换句话说，为了得到具有与参照的核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中多至5％的核苷酸可缺失或被另一种核苷酸替换，或者多至参照序列之总核苷酸的5％的大量核苷酸可插入参照序列中。参照序列的这些突变可在参照核苷酸序列的5’或3’末端位置发生，也可以在这些末端位置之间的任何地方发生，它们各自散布在参照序列的核苷酸中，或以一个或多个邻接组的形式散布在参照序列内。
实际操作过程中，使用已知的计算机程序，如Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包，Unix第8版，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)可常规确定是否任何特定的核酸分子与例如，图1所示的核苷酸序列(SEQ IDNO：1)或经保藏的cDNA克隆的核苷酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％，98％或99％相同。Bestfit使用Smith和Waterson，应用数学进展(Advances in AppliedMathematics)，2：482-489(1981)的局部同源性算法规则来找出两个序列之间同源性最好的区段。当使用Bestfit或任何其它序列排列程序来确定特定的序列是否与，例如根据本发明的参照序列95％相同时，参数的设置当然应使得是对参照核苷酸序列的全长计算同一性百分比，并且允许存在达参照序列总核苷酸数目5％的同源性缺口。
确定待查序列(本发明序列)和指示序列间最佳总体匹配的优选方法，也称综合序列对比，可用基于Brutlag等，Comp.Appl.Biosci.6：237-245(1990)运算法则的FASTDB计算机软件确定。在序列对比中，待查和指示序列均为DNA序列。可通过将U转变为T来比较RNA序列。所说综合序列对比的结果以相同性百分比表示。在DNA序列的FASTDB对比中，用于计算相同性百分比的优选参数为：矩阵(Matrix)＝Unitary，k-tuple＝4，错配罚分(Mismatch Penalty)＝1，连接罚分(Joining Penalty)＝30，随机化分组长度(Randomization Group Length)＝0，截断分(Cutoffscore)＝1，缺口罚分(Gap Penalty)＝5，缺口大小罚分(Gap SizePenalty)＝0.05，窗口大小(Window Size)＝500或指示核苷酸序列长度(选择较短者)。
若指示序列(subject sequence)由于5’或3’缺失(不是由于内部缺失)而比待查序列(query sequence)短，必须对结果进行人工矫正。这是因为在计算相同性百分比时，FASTDB软件不考虑指示序列的5’和3’截短。对于相对待查序列而言5’或3’端截短的指示序列，通过计算位于指示序列5’和3’的不相配/匹配的待查序列碱基数作为待查序列总碱基的百分比，矫正相同性百分比。核苷酸是否相配/匹配由FASTDB序列对比的结果决定。然后从用指定参数通过以上FASTDB软件计算的相同性百分比中减去此百分率，以得到最终的相同性百分比值。此修正值即本发明中涉及的值。正如FASTDB序列对比所展示的，人工调整相同性百分比值时，只计算与待查序列不相配/匹配的、位于指示序列5’和3’碱基外的碱基。
例如，一90个碱基长的指示序列与100个碱基长的待查序列排列以确定相同性百分比。缺失发生于指示序列5’端，因此FASTDB序列对比显示5’端头10个碱基不相配/匹配。这10个未配对碱基代表了序列的10％(不匹配的5’和3’端碱基数/待查序列的总碱基数)，因此从FASTDB软件计算的相同性百分比中减去10％。若余下90个碱基完全匹配，则最终的相同性百分比为90％。在另一例子中，90个碱基长的指示序列与100个碱基长的待查序列相比较。这次缺失在内部，以致在指示序列的5’和3’端无与待查序列不相配/匹配的碱基。这种情况下，对用FASTDB计算的相同性百分比不作人为的修正。再者，只对与待查序列不相配/匹配的指示序列的5’和3’碱基人为修正。为了本发明的目的，不进行其它的人工修正。
本申请涉及与图1[SEQ ID NO：1]所示核酸序列或经保藏cDNA的核酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％相同的核酸分子，而不论它们是否编码具有KGF-2活性的多肽。这是因为甚至当一种特定的核酸分子不编码具有KGF-2活性的多肽时，本领域技术人员仍知道如何将该核酸分子用作例如杂交探针或聚合酶链反应(PCR)的引物。不编码具有KGF-2活性的多肽的本发明核酸分子的用途特别地包括：(1)分离cDNA文库中的KGF-2基因或其等位基因变体；(2)与中期染色体的伸展物原位杂交(如“FISH”)以提供KGF-2基因精确的染色体定位，例见Verma等，人类染色体：基础技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)；和Northern印迹分析以检测特定组织中的KGF-2mRNA表达。
然而，优选的是具有与图1[SEQ ID NO：1]所示核酸序列或经保藏cDNA的核酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％相同的序列的核酸分子，所述核酸分子实际上可编码具有KGF-2蛋白活性的多肽。“具有KGF-2活性的多肽”指的是经特殊的生物学试验测定，表现出与本发明野生型KGF-2蛋白的活性相似，但不必相同的活性，或与野生型KGF-2蛋白(全长蛋白质或，优选为成熟的蛋白质)相比有所增强的活性的多肽。
例如，下文实施例10和11中公开了KGF-2活性的检测方法。使用这些检测方法可测定部分纯化的或纯化的天然或重组蛋白质的KGF-2活性。
KGF-2刺激表皮角质形成细胞而不是如成纤维细胞之类的间充质细胞的增殖。因此，“具有KGF-2蛋白活性的多肽”包括在实施例10所述的角质形成细胞增殖试验中表现出KGF-2活性，并能与FGF受体同工型1-iiib和2-iiib结合(实施例11)的多肽。尽管活性水平不必与KGF-2蛋白的相同，但优选“具有KGF-2蛋白活性的多肽”表现出与KGF-2蛋白基本相似的活性(即候选多肽相对于参照的KGF-2蛋白而言表现出较高的活性，或不高于10倍，优选不高于2倍的活性)。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域技术人员可立即认识到具有与经保藏的cDNA的核酸序列或图1[SEQ ID NO：1]所示核酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％相同的序列的大量核酸分子可编码“具有KGF-2蛋白活性”的多肽。实际上，由于这些核苷酸序列的简并性变体都编码相同的多肽，因此本领域技术人员甚至无需进行上述的比较试验即可明了这一点。本领域技术人员还会意识到，对于这种不是简并变体的核酸分子而言，相当数目也编码具有KGF-2蛋白活性的多肽。这是因为熟练的技术人员完全能掌握不大可能或不可能显著影响蛋白质功能的氨基酸替换(如一个脂肪族氨基酸被另一个脂肪族氨基酸替换)。
例如，有关如何进行表型沉默的氨基酸替换的指导例见：Bowie，J.U等，“译解蛋白质序列中的信息：对氨基酸替换的耐受”，科学，247：1306-1310(1990)，其中作者指出了研究氨基酸序列对变化的耐受性有两种主要的方法。第一种方法依靠的是进化过程，其中突变被自然选择接受或排斥。第二种方法使用基因工程在克隆基因的特定位置导入氨基酸变化，并选择或筛选以鉴定出保持功能性的序列。如作者所指出的，这些研究已揭示蛋白质对氨基酸替换具有令人惊奇的耐受性。作者进一步指出在蛋白质的某些位置哪些氨基酸的变化可能是允许的。例如，大多数隐蔽的氨基酸残基需要非极性的侧链，而表面侧链的特征一般很少是保守的。其它这种表型沉默替换描述于Bowie，J.U等(文献同上)和本文提及的参考文献。
本发明另外涉及一类多核苷酸，当它们的序列与上文所述序列之间有至少70％，优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％同一性时，能够与上文所述序列杂交上。本发明具体地涉及在严谨条件下能够与上文所述多核苷酸杂交的多核苷酸。本文所用术语“严谨条件”是指仅当序列之间有至少95％和优选至少97％同一性时才会发生杂交。在一个优选实施方案中，能够与上文所述多核苷酸杂交上的多核苷酸所编码的多肽能基本上维持与由图1(SEQ ID NO：1)之cDNA或经保藏的cDNA编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。
“严谨杂交条件”的例子包括42℃下，在含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml变性的经剪切的鲑精DNA的溶液中保温过夜，接着于约65℃用0.1×SSC洗涤滤膜。或者，多核苷酸可至少具有20个碱基，优选30个碱基，更优选至少具有50个碱基，如上所述它能与本发明的多核苷酸杂交并与本发明的多核苷酸具有同一性，它有可能保持或不能保持活性。例如，可将这种多核苷酸用作SEQ ID NO：1之多核苷酸的探针，例如用以回收多核苷酸或用作诊断探针或用作PCR引物。
在中度的高严谨条件下与KGF-2多核苷酸可杂交的核酸分子也是所预期的。主要通过控制甲酰胺浓度(较低百分率的甲酰胺导致较低的严谨度)、盐浓度或温度完成杂交严谨度和信号检测的改变。例如，适度的高严谨条件包括在含以下成分的溶液中37℃温育过夜：6×SSPE(20×SSPE＝3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑精封闭DNA；随后在1×SSPE、0.1％SDS中50℃洗涤。此外，为了达到较低的严谨度，可在严谨杂交后在较高的盐浓度下(如5×SSC)进行洗涤。
应注意，以上条件的变化可通过包含和/或替代杂交实验中用于抑制背景的封闭剂而完成。典型的封闭剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑精DNA及可购得的配方。由于相容性的问题，具体封闭试剂的加入可能需要对上述严谨条件进行改良。
当然，能够与参照多核苷酸(如经保藏的cDNA克隆)的较大部分，如长度为50-750nt的部分，或甚至与全长的参照多核苷酸杂交的多核苷酸也可用作本发明的探针，对应于经保藏的cDNA的核苷酸序列或图1[SEQ ID NO：1]所示的核苷酸序列的大部分(如果不是全部的话)的多核苷酸也一样能用作探针。例如，“长度至少为20nt”的多核苷酸部分是指参照多核苷酸的核苷酸序列(如经保藏的cDNA或图1[SEQ IDNO：1]所示的核苷酸序列)中的20个或更多个邻接的核苷酸。如上所述，所述部分在诊断上可用作根据常规DNA杂交技术的探针或用作引物从而通过聚合酶链反应(PCR)扩增靶序列，例见分子克隆，实验室手册，第2版，Sambrook，J.，Fritsch，E.F和Maniatis，T(1989)编，冷泉港实验室出版社，该文献全文列入本文作为参考。
由于KGF-2 cDNA克隆已被保藏，其确定的核苷酸序列示于图1[SEQ ID NO：1]，产生能与KGF-2 cDNA分子的一部分杂交的多核苷酸对于本领域技术人员而言应是常规技术。例如，可简单地使用限制性内切核酸酶切割或通过超声处理KGF-2 cDNA克隆进行剪切以产生不同大小的DNA部分，这些DNA部分就是能与KGF-2 cDNA分子的一部分杂交的多核苷酸。或者，可根据已知技术合成产生本发明的杂交多核苷酸。当然，仅能与polyA序列(如图1[SEQ ID NO：1]所示KGF-2cDNA之3’末端poly(A)序列)，或T(或U)残基的互补序列杂交的多核苷酸不包括在用于与本发明的核酸部分杂交的本发明的多核苷酸中，因为这种多核苷酸可与含有poly(A)序列或其互补物的任何核酸分子(如实际上任何一种双链cDNA克隆)杂交上。
本发明另外还提供了含有编码KGF-2蛋白之携有表位的部分的多核苷酸的分离的核酸分子。具体地说，所提供的分离的核酸分子编码含有图1(SEQ ID NO：2)中的下列氨基酸残基的多肽，本发明人已测定出它们是KGF-2蛋白的抗原性区域：1.Gly41-Asn71：GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN[SEQID NO：25]；2.Lys91-Ser109：KIEKNGKVSGTKKENCPYS[SEQ ID NO：26]；3.Asn135-Tyr164：NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTY[SEQ ID NO：27]；和4.Asn181-Ala199：NGKGAPRRGQKTRRKNTSA[SEQ ID NO：28]。还有另外两个较短的推测抗原性区域，Gln74-Arg78和Gln170-Gln175。下文将详细描述产生KGF-2之携有表位的部分的方法。
可根据有关用于专利程序的微生物保藏国际承认的布达佩斯条约中的款项维持本文所述的保藏物。这些保藏物仅为方便本领域技术人员而提供，而不是认定根据35U.S.C.ξ112的规定需要保藏。经保藏材料中所含的多核苷酸序列及其所编码多肽的氨基酸序列均引入本文作为参考，当这些序列与本文所述序列有冲突时，以前者为准。制备，使用或销售经保藏的材料需经许可，本申请未授予这种许可。KGF-2多肽和片段
本发明另外涉及具有图1(SEQ ID NO：2)的推定氨基酸序列或具有由经保藏的cDNA编码的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽的片段，类似物和衍生物。
本领域技术人员能理解，由于上文讨论的测序错误概率以及针对不同的已知蛋白质中前导序列的裂解位点的可变异性，由经保藏的cDNA所编码的实际的KGF-2多肽含有约208个氨基酸，但可以是200-220个氨基酸范围内的任何数目；此蛋白质的实际前导序列约为35或36个氨基酸，但可以是30-40个氨基酸范围内的任何数目。
涉及图1(SEQ ID NO：2)的多肽或经保藏的cDNA所编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”指的是保留了与这种多肽基本上相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括蛋白原，通过裂解该蛋白原部分以产生有活性的成熟多肽而能激活该蛋白原。
本发明的多肽可以是重组的多肽，天然的多肽或合成的多肽，优选为重组的多肽。
图1(SEQ ID NO：2)的多肽或经保藏的cDNA所编码的多肽的片段，衍生物或类似物可以是下列各种多肽：(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)替换，这种被替换的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括替换基，或(iii)其中成熟的多肽与另一种化合物，如提高多肽半寿期的化合物(如聚乙二醇)融合，或(iv)其中另外的氨基酸与成熟多肽融合，如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或蛋白原序列。鉴于本文的教导，本领域技术人员不难掌握这种片段，衍生物和类似物。
术语“肽”和“寡肽”被认为是同义词(如普遍认为)，当上下文中需要指明由肽键偶联的至少2个氨基酸的链时，这两个术语可以互换使用。本文中对含有10个氨基酸残基以上的链使用“多肽”一词。本文所有寡肽和多肽式或序列从左至右为氨基末端至羧基末端。
本领域技术人员应当认识到，KGF-2多肽的一些氨基酸序列可以改变，而不会显著影响蛋白质的结构或功能。如果分析序列中的这种差异，应能记得蛋白质中存在决定活性的至关重要的区域。一般而言，可以替换形成四级结构的残基，只要使用行使类似功能的残基即可。在其它场合下，如果变化发生在蛋白质的非重要区域，那么残基的类型有可能完全不重要。
因此，本发明另外包括基本上表现出KGF-2多肽活性或包括诸如下文所讨论的蛋白质部分的KGF-2蛋白区域的KGF-2多肽的各种变异。这种突变体包括缺失，插入，倒位，重复和类型替换(如原则是用一种亲水的残基替换另一种亲水的残基，而不是用强亲水的残基替换强疏水的残基)。小的变化或这种“中性的”氨基酸替换一般对活性影响很小。
通常视为保守的替换是脂肪族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile中相互之间的替换；羟基残基Ser和Thr的互换，酸性残基Asp和Glu的互换，酰胺残基Asn和Gln之间的替换，碱性残基Lys和Arg的互换以及芳香族残基Phe，Tyr的相互替换。
如上文详述，有关何种氨基酸变化很可能是表型沉默的(即不会对功能有显著不利的影响)的其它指南例见Bowie，J.U.等人的“译解蛋白质序列中的信息：对氨基酸替换的耐受”，科学，247：1306-1310(1990)。
本发明包括编码可用作治疗肽的KGF-2模拟肽。模拟的KGF-2肽是一些短肽，它们通过结合和激活KGF-2的相关受体来模拟KGF-2蛋白的生物活性。模拟的KGF-2肽也可以结合并抑制KGF-2的相关受体。KGF-2受体包括但不限于FGFR2iiib和FGFR1iiib。这种模拟肽可得自例如，但不限于噬菌体展示或组合化学的方法。例如，Wrighton等，科学，273：458-463(1996)所述的方法可用于产生模拟的KGF-2肽。
优选以分离的形式提供本发明的多肽和多核苷酸，并优选己被纯化为均质。
本发明的多肽优选为分离的形式，“分离的多肽”是指从其天然环境中取出的多肽，因此，为了本发明的目的，重组宿主细胞产生和/或含有的多肽被认为是分离的，“分离的多肽”还指从重组宿主细胞中或天然来源部分或基本上纯化好的多肽。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽(尤其是成熟的多肽)以及与SEQ ID NO：2的多肽至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％相似(更优选至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％相同)的多肽，还包括这种多肽的部分，多肽的所述部分(如下文所述的缺失突变体)一般含有至少30个氨基酸，更优选至少50个氨基酸。
众所周知，通过将一种多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸替换与第二种多肽的序列比较即可确定两种多肽之间的“相似性”。
两个多肽的“相似性百分比”指的是通过使用Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包，Unix第8版，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)和用于确定相似性的缺失设置比较两个多肽的氨基酸序列而产生的相似性评分。Bestfit使用Smith和Waterson(应用数学进展，2：482-489，1981)的局部同源性算法规则来找出两个序列之间相似性最好的区段。
具有与参照的KGF-2多肽的氨基酸序列至少，例如至少95％“相同”的氨基酸序列的多肽指的是除了该多肽序列在参照的KGF-2多肽的氨基酸序列的每100个氨基酸中可包括多至5个氨基酸的改变外，该多肽的氨基酸序列与参照序列是相同的。换句话说，为了得到具有与参照的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参照序列中多至5％的氨基酸残基可缺失或被另一种氨基酸替换，或者多至参照序列之总氨基酸残基的5％的大量氨基酸可插入参照序列中。参照序列的这些变化可在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置发生，也可以在所述末端位置之间的任何位置发生，或者各自散布在参照序列的残基中，或者散布在参照序列内的一个或多个邻接的组中。
实际操作过程中，使用已知的计算机程序，如Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包，Unix第8版，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)可常规确定是否任何特定的多肽与例如，图1[SEQ ID NO：2]所示的氨基酸序列或经保藏的cDNA克隆所编码的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％相同。当使用Bestfit或任何其它序列排列程序以确定特定的序列是否，例如与根据本发明的参照序列95％相同时，当然应设置参数以便是在参照氨基酸序列的全长基础上计算同一性百分比，并且达参照序列总氨基酸残基数目5％的同源性缺口是可以允许的。
确定待查序列(本发明序列)和指示序列间最佳总体匹配的优选方法，也称综合序列对比，可用基于Brutlag等，Comp.Appl.Biosci.6：237-245(1990)运算法则的FASTDB计算机软件确定。在序列对比中，待查和指示序列均为DNA序列。可通过将U转变为T来比较RNA序列。所说综合序列对比的结果以相同性百分比表示。在DNA序列的FASTDB对比中，用于计算相同性百分比的优选参数为：矩阵＝PAM，k-tuple＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机化分组长度＝0，截断分＝1，窗口大小＝序列长度，缺口罚分＝5，缺口大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或指示核苷酸序列长度(选择较短者)。
若指示序列由于5’或3’缺失，不是由于内部缺失而比待查序列短，必须对结果进行人工矫正。这是因为在计算相同性百分比时，FASTDB软件不考虑指示序列的N’和C’截短。对于相对待查序列而言N’或C’端截短的指示序列，通过计算位于指示序列N’和C’的不相配/匹配的待查序列碱基数作为待查序列总碱基的百分比，矫正相同性百分比。残基是否相配/匹配由FASTDB序列对比的结果决定。然后从用指定参数通过以上FASTDB软件计算的相同性百分比中减去此百分率，以得到最终的相同性百分比值。此最终百分比相同得分即本发明中所用的值。只有不与待查序列相配/匹配的处于指示序列N-端侧或C-端侧的残基被认为用于手工调整百分同一性得分的目的。即，只有待查序列位于指示序列最N-端或最C-端残基之外。
例如，一90个碱基长的指示序列与100个碱基长的待查序列排列以确定相同性百分比。缺失发生于指示序列N’端，因此FASTDB序列对比显示N’端头10个碱基不相配/匹配。这10个未配对碱基代表了序列的10％(不匹配的N’和C’端碱基数/待查序列的总碱基数)，因此从FASTDB软件计算的相同性百分比中减去10％。若余下90个碱基完全匹配，则最终的相同性百分比为90％。在另一例子中，90个碱基长的指示序列与100个碱基长的待查序列相比较。这次缺失在内部，以致在指示序列的N’和C’端无与待查序列不相配/匹配的碱基。这种情况下，对用FASTDB计算的相同性百分比不作人为的修正。再者，只对与待查序列不相配/匹配的指示序列的N’和C’碱基人为修正。为了本发明的目的，不进行其它的人工修正。
如下文详述，本发明的多肽可被用于产生多克隆和单克隆抗体，所述抗体可用于下文所述的检测KGF-2蛋白表达的诊断试验中，或用作能增强或抑制KGF-2蛋白功能的激动剂和拮抗剂。另外，这种多肽可被用于酵母双杂交系统以“捕获”也是本发明的候选激动剂和拮抗剂的KGF-2蛋白结合蛋白。酵母双杂交系统描述于Fields和Song，自然，340：245-246(1989)。
另一方面，本发明提供了含有本发明多肽之携有表位的部分的肽或多肽。此多肽部分的所述表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”被定义为当整个蛋白质为免疫原时蛋白质中能引发抗体应答的部分。据信这些免疫原性表位仅限于分子上的几个位置。另一方面，蛋白质分子中可与抗体结合的区域被定义为“抗原性表位”。蛋白质的免疫原性表位的数目一般少于抗原性表位的数目，例见Geysen等，美国国家科学院院报，81：3998-4002(1993)。
至于携有抗原性表位(即含有蛋白质分子中可与抗体结合的区域)的肽或多肽的选择，本领域技术人员熟知模拟蛋白质序列一部分的相对短的合成肽一般能刺激产生可与部分模拟的蛋白质发生反应的抗血清。例见Sutcliffe，J.G，Shinnick，T.M，Green，N和Learner，R.A(1983)，与蛋白质上预定位点反应的抗体，科学，219：660-666。经常以蛋白质的一级序列描述能引发产生蛋白质反应性血清的肽，通过一套简单的化学规则可鉴定这种肽，它们既不限于完整蛋白质的免疫决定簇区域(即免疫原性表位)，也不限于氨基或羧基末端。极端疏水的肽和含6个或更少残基的肽一般不能诱导可与模拟蛋白质结合的抗体；较长的、可溶性的肽，尤其是含有脯氨酸残基的肽通常是有效的。Sutcliffe等，文献同上，p661。例如，根据这些指南设计的，含有覆盖流感病毒血凝素HA1多肽链序列75％的8-39个残基的20个肽中有18个可诱导产生能与HA1蛋白或整个病毒反应的抗体；对于MuIV聚合酶而言，12个肽中的12个，对于狂犬病糖蛋白而言，18个肽中的18个可诱导产生能沉淀各自蛋白质的抗体。
因此，本发明携有抗原性表位的肽和多肽可用于产生能特异性地与本发明多肽结合的抗体，包括单克隆抗体。因此，通过融合来自经携有抗原表位的肽免疫的供体的脾细胞而得到的大多数杂交瘤通常可分泌能与天然蛋白反应的抗体，Sutcliffe等，文献同上，p663。由携有抗原性表位的肽或多肽产生的抗体可用于检测模拟的蛋白质，针对不同肽的抗体可用于追踪进行翻译后加工的蛋白质前体多个区域的去向。在模拟蛋白质的多种定量或定性测定，如竞争测定中可使用肽和抗肽抗体，因为已经证明甚至短肽(如约9个氨基酸)都可在免疫沉淀试验中结合和替代较大的肽，例见Wilson等，细胞，37：767-778(1984)，p777。本发明的抗肽抗体也可用于纯化模拟的蛋白质，例如通过使用本领域所熟知的方法进行吸附层析。
根据上述指南设计的本发明携有抗原性表位的肽和多肽优选含有本发明多肽的氨基酸序列中所含的至少7个，更优选至少9个，最优选约15-约30个氨基酸的序列。然而，包括本发明多肽氨基酸序列的较大部分，含有约30，40，50，60，70，80，90，100或150个，或直至和包括本发明多肽全部氨基酸序列的任何长度的氨基酸的肽或多肽也被认为是本发明携有表位的肽或多肽，也可用于诱导产生与模拟蛋白质反应的抗体。优选携有表位的肽的氨基酸序列被选择为在含水溶剂中具有良好的溶解性(即该序列包括相对亲水的残基，而优选避免高度疏水的残基)；特别优选含有脯氨酸残基的序列。
可用于产生KGF-2特异性抗体的抗原性多肽或肽的非限制性例子包括下列：1.Gly41-Asn71：GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN[SEQID NO：25]；2.Lys91-Ser109：KIEKNGKVSGTKKENCPYS[SEQ ID NO：26]；3.Asn135-Tyr164：NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTY[SEQ ID NO：27]；和4.Asn181-Ala199：NGKGAPRRGQKTRRKNTSA[SEQ ID NO：28]。
还有另外两个较短的推测抗原性区域，图1的Gln74-Arg78(SEQID NO：2)和Gln170-Gln175(SEQ ID NO：2)。
通过制备肽或多肽的任何常规方法，包括使用本发明核酸分子的重组方法，可产生本发明携有表位的肽和多肽。例如，可将携有短的表位的氨基酸序列与较大的多肽融合，该多肽可在重组生产和纯化的过程中用作载体，在免疫过程中可用来产生抗肽抗体。也可以使用已知的化学合成方法合成携有表位的肽。例如，Houghten描述了合成大数目肽的一种简单方法，如在4周之内制备和鉴定(通过ELISA-型结合研究)代表HA1多肽一个区段的单个氨基酸变体的10-20mg 248个不同的13残基的肽，Houghten，R.A(1985)，快速固相合成大数目肽的一般方法：各个氨基酸水平上的抗原-抗体相互作用的特异性，美国国家科学院院报，82：5131-5135。这种“同时合成多个肽(SMPS)”的方法进一步描述于Houghten等人的美国专利4,631,211(1986)中。在此方法中，将用于固相合成多个肽的各个树脂包含在各个单独的可渗透溶剂的袋中，以最佳利用固相方法中所包括的多个相同的重复步骤。完全人工的方法可同时进行500-1000或更多个肽的合成，Houghten等人，文献同上，p5134。
本发明包括包含，或者由如下表位组成的多肽：具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽之表位，或由包含在ATCC保藏号75977的多核苷酸序列编码的表位，或者在如前所述严谨杂交条件或较低严谨条件下可与SEQ ID NO：1的序列的互补物或可与包含于ATCC保藏号75977的序列的互补物杂交的多核苷酸编码的表位。本发明还包括编码本发明的多肽序列之表位的多核苷酸序列(诸如，例如公开于SEQ ID NO：1的序列)，编码本发明的多肽序列之表位的多核苷酸序列的互补链的多核苷酸序列，和在如前所述严谨杂交条件或较低严谨条件下可与互补链杂交的多核苷酸序列。
术语“表位”如此处所用是指具有在动物(优选哺乳动物，最优选人)中的抗原性或免疫原性活性的多肽的部分。在一个优选实施方案中，本发明包括包含一种表位的多肽，以及编码此多肽的多核苷酸。一种“免疫原性表位”如此处所用是指如本领域已知的任一种方法所测定的在动物中引发抗体反应的蛋白质的部分，所述方法例如下面所述的用于产生抗体的方法(见例如Geysen等，美国国家科学院院报，81：3998-4002(1983))。术语“抗原性表位”如此处所用是指抗体可免疫特异性结合其抗原的蛋白质上的一部分，如本领域已知任何方法所测的，例如通过此处所述的免疫检测。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除与其他抗原的交叉反应性。抗原性表位不一定是免疫原性的。
其功能作为表位的片段可利用任何常规方法制备(见如，Houghten，R.A.，美国国家科学院院报，82：5131-5135(1985)，进一步描述于美国专利4631211)。
本发明中，抗原性表位优选含有至少4，至少5，至少6，至少7，更优选至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30，至少40，至少50，且最优选在约15-约30氨基酸之间的序列。优选的包含免疫原性或抗原性表位的多肽的长度至少为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。其他优选的抗原性表位包括，或者由如下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：2的M-1至H-15；W-2至L-16；K-3至P-17；W-4至G-18；I-5至C-19；L-6至C-20；T-7至C-21；H-8至C-22；C-9至C-23；A-10至F-24；S-11至L-25；A-12至L-26；F-13至L-27；P-14至F-28；H-15至L-29；L-16至V-30；P-17至S-31；G-18至S-32；C-19至V-33；C-20至P-34；C-2 1至V-35；C-22至T-36；C-23至C-37；F-24至Q-38；L-25至A-39；L-26至L-40；L-27至G-41；F-28至Q-42；L-29至D-43；V-30至M-44；S-31至V-45；S-32至S-46；V-33至P-47；P-34至E-48；V-35至A-49；T-36至T-50；C-37至N-51；Q-38to S-52；A-39至S-53；L-40至S-54；G-41至S-55；Q-42至S-56；D-43至F-57；M-44至S-58；V-45至S-59；S-46至P-60；P-47至S-61；E-48至S-62；A-49to A-63；T-50至G-64；N-51至R-65；S-52至H-66；S-53至V-67；S-54至R-68；S-55至S-69；S-56至Y-70；F-57至N-71；S-58至H-72；S-59至L-73；P-60至Q-74；S-61至G-75；S-62至D-76；A-63至V-77；G-64至R-78；R-65至W-79；H-66至R-80；V-67至K-81；R-68至L-82；S-69至F-83；Y-70至S-84；N-71至F-85；H-72至T-86；L-73至K-87；Q-74至Y-88；G-75至F-89；D-76至L-90；V-77至K-91；R-78至I-92；W-79至E-93；R-80至K-94；K-81至N-95；L-82至G-96；F-83至K-97；S-84至V-98；F-85至S-99；T-86至G-100；K-87至T-101；Y-88至K-102；F-89至K-103；L-90至E-104；K-91至N-105；I-92至C-106；E-93至P-107；K-94至Y-108；N-95至S-109；G-96至I-110；K-97至L-111；V-98至E-112；S-99至I-113；G-100至T-114；T-101至S-115；K-102至V-116；K-103至E-117；E-104至I-118；N-105至G-119；C-106至V-120；P-107至V-121；Y-108至A-122；S-109至V-123；I-110至K-124；L-111至A-125；E-112至I-126；I-113至N-127；T-114至S-128；S-115至N-129；V-116至Y-130；E-117至Y-131；I-118至L-132；G-119至A-133；V-120至M-134；V-121至N-135；A-122至K-136；V-123至K-137；K-124至G-138；A-125至K-139；I-126至L-140；N-127至Y-141；S-128至G-142；N-129至S-143；Y-130至K-144；Y-131至E-145；L-132至F-146；A-133至N-147；M-134至N-148；N-135至D-149；K-136至C-150；K-137至K-151；G-138至L-152；K-139至K-153；L-140至E-154；Y-141至R-155；G-142至I-156；S-143至E-157；K-144至E-158；E-145至N-159；F-146至G-160；N-147至Y-161；N-148至N-162；D-149至T-163；C-150至Y-164；K-151至A-165；L-152至S-166；K-153至F-167；E-154至N-168；R-155至W-169；I-156至Q-170；E-157至H-171；E-158至N-172；N-159至G-173；G-160至R-174；Y-161至Q-175；N-162至M-176；T-163至Y-177；Y-164至V-178；A-165至A-179；S-166至L-180；F-167至N-181；N-168至G-182；W-169至K-183；Q-170至G-184；H-171至A-185；N-172至P-186；G-173至R-187；R-174至R-188；Q-175至G-189；M-176至Q-190；Y-177至K-191；V-178至T-192；A-179至R-193；L-180至R-194；N-181至K-195；G-182至N-196；K-183至T-197；G-184至S-198；A-185至A-199；P-186至H-200；R-187至F-201；R-188至L-202；G-189至P-203；Q-190至M-204；K-191至V-205；T-192至V-206；R-193至H-207；和/或R-194至S-208。编码这些多肽片段的多核苷酸也包括在本发明中。
其他非排他性优选抗原性表位包括此处公开的抗原性表位，以及其部分。抗原性表位可用于例如产生抗体，包括单克隆抗体，其特异性结合表位。优选的抗原性表位包括此处公开的抗原性表位以及两个、三个、四个、五个或更多这些抗原性表位的任意组合。抗原性表位可用做免疫检测中的靶分子。(见如，Wilson等，细胞37：767-778(1984)；Sutcliffe等，科学219：660-666(1983))。
类似地，免疫原性表位可用于例如根据本领域已知的方法诱导抗体(见如，Sutcliffe等，出处同前；Wilson等，出处同前；Chow等，美国国家科学院院报，82：910-914；和Bittle等，普通病毒学杂志，66：2347-2354(1985))。优选的免疫原性表位包括处公开的免疫原性表位以及两个、三个、四个、五个或更多这些免疫原性表位的任意组合。包含一个或多个免疫原性表位的多肽可被呈递用于和载体蛋白(如白蛋白)一起引发动物体系(如兔或鼠)抗体应答，或者，如果多肽是足够长(至少约25个氨基酸)，多肽可被呈递而无须载体。但是，包含少至8-10个氨基酸的免疫原性表位已显示足以引发能结合至至少在变性多肽的线性表位上的抗体(例如，在Western印迹)。
可根据本领域众所周知的方法，使用本发明携有表位的肽和多肽诱导抗体，例见Sutcliffe等人，文献同上；Wilson等人，文献同上；Chow，M等人，美国国家科学院院报，82：910-914；和Bittle，F.J等人，普通病毒学杂志，66：2347-2354(1985)。通常，可用游离的肽免疫动物；然而，通过将肽与大分子载体，如匙孔血蓝蛋白(KLH)或破伤风类毒素偶联，可提高抗肽抗体的滴度。例如，使用如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)的接头，可将含有半胱氨酸的肽与载体偶联，而使用更一般的连接剂如戊二醛可将其它肽与载体偶联。通过例如腹膜内和/或皮内注射含有约100微克肽或载体蛋白和弗氏佐剂的乳剂，可用游离的或与载体偶联的肽免疫动物，如兔，大鼠和小鼠。需要例如以约2周为间隔进行几次加强注射以提供有用的抗肽抗体滴度，通过例如使用吸附于固体表面的游离肽的ELISA试验可检测所述滴度。通过例如将肽吸附于固相支持物上并根据本领域技术人员熟知的方法洗脱选定的抗体，从而选择抗肽抗体，可提高得自经免疫动物的血清中的抗肽抗体滴度。
可根据本领域技术人员熟知的方法鉴定本发明携有免疫原性表位的肽，即当整个蛋白质是免疫原时可引发抗体应答的所述蛋白质的诸部分。例如，Geysen等人(文献同上)公开了在固相支持物上快速地同时合成纯度足以在酶联免疫吸附试验中反应的上百个肽的方法。然后，不用将它们与支持物分开即可轻易地检测合成的肽与抗体的相互作用。按此方法，本领域技术人员可常规地鉴定携有所需蛋白质的免疫原性表位的肽。例如，Geysen等人通过合成一套重叠的覆盖口蹄疫病毒外被蛋白全部213个氨基酸的序列的所有208种可能的六肽，以7个氨基酸的分辨率定位出该蛋白质内免疫学重要的表位。然后，合成完整一套替换肽，其中在表位内每一个位置依次用所有20个氨基酸替换，测定赋予与抗体反应的特异性的特殊氨基酸。因此，通过此方法可常规制备本发明携有表位的肽的肽类似物。Geysen(1987)的美国专利4,708,781中进一步描述了鉴定携有所需蛋白质的免疫原性表位的肽的方法。
Geysen(1990)的美国专利5,194,392中描述了检测或确定单体(氨基酸或其它化合物)序列的一般方法，所述单体是与目标抗体的特定互补位(抗原结合位点)互补之表位的拓扑等价物(即“mimotope”)。更一般地，Geysen(1989)的美国专利4,433,092中描述了检测或确定单体序列的方法，所述单体是与所需特定受体的配体结合位点互补之配体的拓扑等价物。类似地，Houghten，R.A等人(1996)的有关预先烷基化的寡肽混合物的美国专利5,480,971公开了线性的C1-C7-烷基预先烷基化的寡肽和这种肽的系列和文库，以及使用这种寡肽系列和文库测定优先与所需受体分子结合的预先烷基化寡肽之序列的方法。因此，通过这些方法可常规制备本发明携有表位的肽的非肽类似物。
正如本领域技术人员所期望的，本发明的KGF-2多肽及其上述携有表位的片段可与免疫球蛋白(IgG)的恒定区部分联合形成嵌合的多肽。这些融合蛋白便于纯化并显示出体内半寿期增加。例如，由人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的各个区域组成的嵌合蛋白已显示出这一现象(EPA 394,827；Traunecker等人，自然，331：84-86(1988))。因IgG部分而具有由二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白在结合和中和其它分子方面比单体的KGF-2蛋白或单独的蛋白质片段更加有效(Fountoulakis等人，生物化学杂志，270：3958-3964(1995))。
根据本发明，也描述了KGF-2新的变体。通过缺失或替换KGF-2的一个或多个氨基酸可产生这些变体。天然的突变被称为等位基因变异，  等位基因变异可以是沉默的(所编码的多肽没有变化)，也可以具有改变了的氨基酸序列。
为了尝试改善或改变天然KGF-2的特征，可利用蛋白质工程。也可使用本领域技术人员已知的重组DNA技术产生新的多肽。突变蛋白和缺失可显示出例如增强的活性或增加的稳定性。另外，它们可以较高的得率被纯化，并至少在某些纯化和储存条件下显示出较好的溶解性。下文所示的是所构建的突变的例子。
本发明的KGF-2多肽可为单体或多聚体(即：二聚体，三聚体，四聚体和高级多聚体)。因此，本发明涉及本发明KGF-2多肽的单聚体和多聚体，及其制备和含有其的组合物(优选为药物组合物)。在一个特定实施方案中，本发明的多肽为单体，二聚体，三聚体，四聚体。在其他实施方案中，本发明的多聚体至少为二聚体，三聚体，四聚体。
本发明的多聚体可为同聚体或异聚体。如此处所用，术语同聚体是指仅含有相应于SEQ ID NO：2或由保藏的克隆中所含cDNA编码的(包括片段，变体，剪接变体，和融合蛋白，如此处所述)的多聚体。这些同聚体可含有具有相同或不同氨基酸序列的本发明KGF-2多肽。在一个特定实施方案中，本发明的同聚体是仅含有相同氨基酸序列的KGF-2多肽的多聚体。在另一个实施方案中，本发明的同聚体是含有具有不同氨基酸序列的KGF-2多肽的多聚体。在一个特定实施方案中，本发明的多聚体是同聚二体，(如含有相同或不同氨基酸序列的KGF-2多肽)。在另一个实施方案中，本发明的同聚体至少是同聚二体，同聚三体或至少是同聚四体。
如此处所用，术语异聚体是指含有除了本发明的KGF-2多肽之外的一个或多个异源多肽(即：不同蛋白质的肽)的多聚体。在一个实施方案中，本发明的多聚体是异聚二体，异聚三体或是异聚四体。在另一个实施方案中，本发明的同聚体至少是同聚二体，同聚三体或至少是同聚四体。
本发明的多聚体可以是疏水性、亲水性、离子性和/或共价结合的结果，和/或可间接通过例如脂质体形成而连接。由此，在一个实施方案中，本发明的多聚体(如例如同聚二体或同聚三体)在当本发明的多肽与溶液中的另一个接触时形成。在本发明的另一个实施方案中，本发明的异多聚体(如例如异聚三体或异聚四体)在当本发明的多肽与溶液中本发明多肽的抗体接触(包括针对本发明融合抗体中异源多肽序列的抗体)时形成。在另一实施方案中，本发明的多聚体通过与和/或位于本发明KGF-2多肽之间的共价结合形成。这种共价结合可包括一种或多种多肽序列中所包含的氨基酸残基(例如，示于SEQ ID NO：2中，或包含于由克隆HPRCC57或保藏于ATCC，保藏号75977或75901所编码的多肽中)。在一种情况中，共价结合为位于多肽序列中的半胱氨酸之间(其在天然(即天然存在)多肽中相互作用)的交联。在另一种情况中，共价结合为化学或重组处理后的结果。或者，这种共价结合可包括一种或多种含于KGF-2融合蛋白中的异源多肽序列内的氨基酸残基。在一个实施例中，共价结合在含于本发明融合蛋白质中异源序列之间(见如美国专利5478925)。在一个特定实施例中，共价结合在含于本发明融合蛋白质KGF-2-Fc中异源序列之间。在另一个实施例中，本发明的融合蛋白质的共价结合在来自另一个成纤维生长因子家族成员的异源多肽序列之间，所述纤维生长因子家族成员的异源多肽能形成共价结合多聚体，如例如，oseteoprotegerin(见如，国际公开文本WO98/49305，其内容在此引入作为参考。)在另一实施方案中，两个或多个本发明的多肽通过肽连接子结合。实例包括在美国专利5073627中描述的那些肽连接子(在此引入作为参考)。包含由肽连接子分隔的本发明多重肽的蛋白质可利用常规重组DNA技术制备。
制备本发明的多聚体多肽的另一种方法包括利用与亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列融合的本发明的多肽。亮氨酸拉链和异亮氨酸拉链结构域是促进其中所含的蛋白质多聚化的多肽。最初亮氨酸拉链是在数种DNA-结合蛋白质中发现(Landschulz等，科学，240：1759(1988))，由此从多种不同蛋白质发现。在已知的亮氨酸拉链中由天然存在的肽和二聚或三聚的其衍生物。适于制备本发明的可溶性多聚蛋白质之亮氨酸拉链的例子见PCT申请WO94/10308中所述，此处引入作为参考。包含与在溶液中二聚或三聚的多肽融合的本发明多肽的之重组融合蛋白质在适当的宿主细胞中表达，其所得可溶性多聚融合蛋白质利用本领域已知方法从培养物上清液中回收。
本发明的三聚多肽可提供改进的生物活性的益处。优选的亮氨酸拉链基团和异亮氨酸基团是优势形成三聚体的那些。一个例子是来自肺表面活性剂蛋白质D(SPD)的亮氨酸拉链，见Hoppe等，FEBS Letters，344：191，(1994))和美国专利申请08/446922所述，此处引入作为参考。来自天然存在的三聚体蛋白质的其他肽也可在制备本发明的三聚体多肽中采用。
在另一例子中，本发明的蛋白质通过FLAG多肽序列之间的相互作用而结合，所述FLAG多肽序列存在于包含FLAG多肽序列的本发明融合蛋白质中。在一个实施方案中，本发明的蛋白质结合是通过本发明的FLAG融合蛋白质所含异源多肽序列与抗FLAG抗体的相互作用结合的。
本发明多聚体可利用本领域已知的化学技术产生。例如，期望包含于本发明的多聚体中的多肽可利用连接子分子和本领域已知的连接子分子长度优化技术被化学交联(见如美国专利5478925，在此引入作为参考)。此外，本发明的多聚体可利用本领域已知的方法形成一个或多个半胱氨酸残基间的分子内交联产生，所述半胱氨酸位于期待包含于多聚体中的多肽序列中(见如，美国专利5478925，在此引入作为参考)。此外，本发明的多肽可被常规修饰，方法是向多肽的C-或N-末端添加半胱氨酸或生物素，可利用本领域已知的方法产生含有一个或多个如此修饰的多肽(见如，美国专利5478925，在此引入作为参考)。另外，本领域已知的技术可用来产生含有期望被包含于本发明多聚体中的多肽成分之脂质体(见如，美国专利5478925，在此引入作为参考)。
或者，本发明的多聚体可利用本领域已知的遗传工程技术产生。在一个实施方案中，包含于本发明多聚体的多肽利用此处所述或本领域已知的融合蛋白质技术重组产生(见如美国专利5478925，在此引入作为参考)。在一个特定实施方案中，编码本发明同聚二体的多核苷酸这样制备：将编码本发明多肽的多核苷酸序列于编码一种连接子多肽的序列连接，然后进一步与合成的多核苷酸连接，所述多核苷酸编码反方向(由C-末端到N-末端)的肽的翻译产物(缺乏前导序列)(见如，美国专利5478925，在此引入作为参考)。在另一实施方案中，此处所述或本领域已知的重组技术应用于制备本发明的重组多肽，其含有跨膜结构域(或疏水或信号肽)且能利用膜重构技术被掺入脂质体中(见如美国专利5478925，在此引入作为参考)。多核苷酸和多肽片段
本发明进一步涉及此处所述的分离的核酸分子的片段。一个分离的核酸分子的片段具有例如保藏的cDNA(克隆HPRCC57)的核苷酸序列，编码有保藏的cDNA编码的多肽序列之核苷酸序列，编码示于图1(SEQID NO：2)的多肽序列的核苷酸序列，示于图1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列，或其互补链，是指具有长度至少约15nt，更优选至少约20nt，还更优选至少约30nt，更优选至少约40，50，100，150，200，250，300，325，350，375，400，450，500，550或600nt的长度。这些核苷酸片段可用作包括但不限于，诊断探针和引物。当然，更大的片段是优选的，例如，501-1500nt的片段根据本发明也是有用的，作为片段其相应于大多数，如果不是全部的话，保藏的cDNA(克隆HPRCC57)的核苷酸序列，或如图1(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列。例如，长度至少为20nt的片段是指包括20或更多个来自例如保藏的cDNA的核苷酸序列，或如图1(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列中的连续碱基。
此外，KGF-2多核苷酸片段的代表性例子包括，例如，具SEQ ID NO：1中核苷酸数约第1-50、51-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500、501-550、551-600、651-700、701-750、751-800、800-850、851-900、901-950、951-1000、1001-1050、1051-1100、1101-1150、1151-1200、1201-1250、1251-1300、1301-1350、1351-1400、1401-1450、1451-1500、1501-1550、1551-1600、1601-1650、1651-1700、1701-1750、1751-1800、1801-1850、1851-1900、1901-1950、1951-2000或2001-结尾的序列，或其互补链，或者保藏克隆中所含cDNA之序列的片段。在此上下文中“大约”包括了在任一端或两端更多或更少几个核苷酸(5、4、3、2或1)的特别列举范围。
优选的，本发明的多核苷酸片段编码显示KGF-2功能性活性的多肽。一多肽显示KGF-2功能性活性是指能够显示一种或多种与全长(完整)KGF-2蛋白质相关的已知功能性活性的多肽。这类功能性活性包括但不限于，生物活性、抗原性(能够结合(或与KGF-2多肽竞争结合)到抗KGF-2抗体的能力)、免疫原性(能够产生结合KGF-2多肽之抗体的能力)、与本发明KGF-2多肽形成多聚体的能力以及结合KGF-2多肽受体或配体的能力。
KGF-2多肽及其片段、变体衍生物和类似物的功能性活性可由多种方法检验。
例如，在一种鉴别与或与KGF-2多肽竞争结合到抗KGF-2抗体的能力之实施方案中，可采用本领域已知的多种方法，包括但不限于利用放射免疫检测、ELISA(酶联免疫检测)、夹心免疫检测、免疫放射测量检验、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散检测、原位免疫检验(例如，利用胶体金、酶或放射性同位素)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集反应检验(例如，凝胶凝集检验、血细胞凝集检验)、补体固定检验、免疫荧光检验、蛋白A检验和免疫电泳检验等。在一个实施方案中，抗体结合通过检测初级抗体上的标记来检验。在另一实施方案中，初级抗体通过检测次级抗体或试剂与初级抗体的结合而检验。在又一实施方案中，次级抗体被标记。本领域已知多种检测免疫检验中的结合之方法，且包括在本发明中。
在另一实施方案中，当KGF-2配体被鉴别，或本发明多肽片段、变体或衍生物之多聚化的能力被评价后，可鉴别结合，方法是例如本领域已知分方法，诸如还原会和非还原性凝胶电泳，蛋白质亲和层析以及亲和印迹。见Phizicky，E.等，Microbiol.Rev.，59：94-123(1995)。在另一实施方案中，可鉴定结合到其底物上的KGF-2生理性关联(信号转导)。
此外，如此处所述的检验(见实施例)和其他本领域已知的方法可被常规地用于测量KGF-2多肽及其片段、变体衍生物和类似物引发KGF-2相关生物活性(无论体外或体内)的能力。其他方法为本领域技术人员已知，且包括在本发明中。
本发明还涉及此处所述KGF-2多肽的片段。分离的KGF-2多肽，例如由保藏的cDNA(克隆HPRCC57)编码的，由保藏的cDNA编码的多肽序列，如图1(SEQ ID NO：2)所示的多肽序列之片段意在包括包含于SEQ ID NO：2中的多肽片段或有包含于保藏的克隆中的cDNA编码的多肽片段。蛋白质片段可以是“独立的”或包含于较大多肽内形成其中一部分或一个区域，最优选作为单个连续区存在于其中。本发明多肽片段的典型例子包括，例如，来自编码区约第1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、102-120、121-140、141-160、161-180、181-200、201-220、221-240、241-260、261-280或281-结尾氨基酸的片段。此外，多肽片段可为至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸长。在此上下文中“大约”包括了特别列举范围，在其任一端或两端值更多或更少几个氨基酸(5、4、3、2或1)的范围。
即使从蛋白质的N端缺失一个或多个氨基酸导致蛋白质一种或多种生物功能丧失的修饰，其他功能性活性(例如，生物活性、多聚化能力、结合KGF-2配体的能力)可仍旧保留。例如当从N端移去不超过完整或成熟多肽残基之主要部分时，截短的KGF-2突变蛋白诱导和/或结合于识别多肽的完整或成熟形式之抗体的能力一般会保留。特定的缺乏完整多肽N末端残基之多肽是否保留了这样的免疫活性可容易地通过此处所述的常规方法和本领域已知的其他方法确定。具有较大数目的N-末端氨基酸残基缺失之KGF-2突变蛋白仍保留某些生物学或免疫学活性并非不太可能。事实上，有时少至6个KGF-2氨基酸残基组成的肽经常可引发免疫反应。
因此，多肽片段包括分泌的KGF-2蛋白质以及成熟形式。此外，优选的多肽片段包括分泌的KGF-2蛋白质或成熟形式，其中具有连续的从氨基端或羧基端(或两端)残基的缺失。例如，可以从分泌的KGF-2或其成熟形式的氨基端删除范围从1-60个的任一数目的氨基酸。类似地，可以从分泌的KGF-2或其成熟形式的羧基端删除范围从1-30个的任一数目的氨基酸。此外，上述氨基端和羧基端缺失的任意组合也是优选的。类似地，编码这些KGF-2多肽片段的多核苷酸片段也是优选的。
特别是，KGF-2多肽的N-端缺失体可用通式m-208描述，其中m是2-207的整数，其中m相应于SEQ ID NO：2中所定的氨基酸残基位置。具体地，本发明提供了编码包含或由如下氨基酸残基序列组成的多肽之多核苷酸：SEQ ID NO：2的W-2至S-208；K-3至S-208；W-4至S-208；I-5至S-208；L-6至S-208；T-7至S-208；H-8至S-208；C-9至S-208；A-10至S-208；S-11至S-208；A-12至S-208；F-13至S-208；P-14至S-208；H-15至S-208；L-16至S-208；P-17至S-208；G-18至S-208；C-19至S-208；C-20至S-208；C-21至S-208；C-22至S-208；C-23至S-208；F-24至S-208；L-25至S-208；L-26至S-208；L-27至S-208；F-28至S-208；L-29至S-208；V-30至S-208；S-31至S-208；S-32至S-208；V-33至S-208；P-34至S-208；V-35至S-208；T-36至S-208；C-37至S-208；Q-38至S-208；A-39至S-208；L-40至S-208；G-41至S-208；Q-42至S-208；D-43至S-208；M-44至S-208；V-45至S-208；S-46至S-208；P-47至S-208；E-48至S-208；A-49至S-208；T-50至S-208；N-51至S-208；S-52至S-208；S-53至S-208；S-54至S-208；S-55至S-208；S-56至S-208；F-57至S-208；S-58至S-208；S-59至S-208；P-60至S-208；S-61至S-208；S-62至S-208；A-63至S-208；G-64至S-208；R-65至S-208；H-66至S-208；V-67至S-208；R-68至S-208；S-69至S-208；Y-70至S-208；N-71至S-208；H-72至S-208；L-73至S-208；Q-74至S-208；G-75至S-208；D-76至S-208；V-77至S-208；R-78至S-208；W-79至S-208；R-80至S-208；K-81至S-208；L-82至S-208；F-83至S-208；S-84至S-208；F-85至S-208；T-86至S-208；K-87至S-208；Y-88至S-208；F-89至S-208；L-90至S-208；K-91至S-208；I-92至S-208；E-93至S-208；K-94至S-208；N-95至S-208；G-96至S-208；K-97至S-208；V-98至S-208；S-99至S-208；G-100至S-208；T-101至S-208；K-102至S-208；K-103至S-208；E-104至S-208；N-105至S-208；C-106至S-208；P-107至S-208；Y-108至S-208；S-109至S-208；I-110至S-208；L-111至S-208；E-112至S-208；I-113至S-208；T-114至S-208；S-115至S-208；V-116至S-208；E-117至S-208；I-118至S-208；G-119至S-208；V-120至S-208；V-121至S-208；A-122至S-208；V-123至S-208；K-124至S-208；A-125至S-208；I-126至S-208；N-127至S-208；S-128至S-208；N-129至S-208；Y-130至S-208；Y-131至S-208；L-132至S-208；A-133至S-208；M-134至S-208；N-135至S-208；K-136至S-208；K-137至S-208；G-138至S-208；K-139至S-208；L-140至S-208；Y-141至S-208；G-142至S-208；S-143至S-208；K-144至S-208；E-145至S-208；F-146至S-208；N-147至S-208；N-148至S-208；D-149至S-208；C-150至S-208；K-151至S-208；L-152至S-208；K-153至S-208；E-154至S-208；R-155至S-208；I-156至S-208；E-157至S-208；E-158至S-208；N-159至S-208；G-160至S-208；Y-161至S-208；N-162至S-208；T-163至S-208；Y-164至S-208；A-165至S-208；S-166至S-208；F-167至S-208；N-168至S-208；W-169至S-208；Q-170至S-208；H-171至S-208；N-172至S-208；G-173至S-208；R-174至S-208；Q-175至S-208；M-176至S-208；Y-177至S-208；V-178至S-208；A-179至S-208；L-180至S-208；N-181至S-208；G-182至S-208；K-183至S-208；G-184至S-208；A-185至S-208；P-186至S-208；R-187至S-208；R-188至S-208；G-189至S-208；Q-190至S-208；K-191至S-208；T-192至S-208；R-193至S-208；R-194至S-208；K-195至S-208；N-196至S-208；T-197至S-208；S-198至S-208；A-199至S-208；H-200至S-208；F-201至S-208；L-202至S-208；P-203至S-208。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明。
特别优选的是含有或由如下组成的片段：S69-S208；A63-S208；Y70-S208；V77-S208；E93-S208；E104-S208；V123-S208；G138-S208；R80-S208；A39-S208；S69-V178；S69-G173；S69-R188；S69-S198；S84-S208；V98-S208；A63-N162；S69-N162；和M35-N162。
如上述，即使从蛋白质的C端缺失一个或多个氨基酸导致蛋白质一种或多种生物功能丧失的修饰，其他功能性活性(例如，生物活性、多聚化能力、结合KGF-2配体的能力)可仍旧保留。例如当从C端移去不超过完整或成熟多肽残基之主要部分时，截短的KGF-2突变蛋白诱导和/或结合于识别多肽的完整或成熟形式之抗体的能力一般会保留。特定的缺乏完整多肽C末端残基之多肽是否保留了这样的免疫活性可容易地通过此处所述的常规方法和本领域已知的其他方法确定。具有较大数目的C-末端氨基酸残基缺失之KGF-2突变蛋白仍保留某些生物学或免疫学活性并非不太可能。事实上，有时少至6个KGF-2氨基酸残基组成的肽经常可引发免疫反应。
因此，本发明进一步提供具有从示于图1(SEQ ID NO：2)中的KGF-2多肽之氨基酸序列的羧基末端缺失一个或多个残基的多肽，如通式1-n描述，其中n是2-207的整数，其中n相应于SEQ ID NO：2中所定的氨基酸残基位置。具体地，本发明提供了编码包含，或由如下氨基酸残基序列组成的多肽之多核苷酸：SEQ ID NO：2的M-1至H-207；M-1至V-206；M-1至V-205；M-1至M-204；M-1至P-203；M-1至L-202；M-1至F-201；M-1至H-200；M-1至A-199；M-1至S-198；M-1至T-197；M-1至N-196；M-1至K-195；M-1至R-194；M-1至R-193；M-1至T-192；M-1至K-191；M-1至Q-190；M-1至G-189；M-1至R-188；M-1至R-187；M-1至P-186；M-1至A-185；M-1至G-184；M-1至K-183；M-1至G-182；M-1至N-181；M-1至L-180；M-1至A-179；M-1至V-178；M-1至Y-177；M-1至M-176；M-1至Q-175；M-1至R-174；M-1至G-173；M-1至N-172；M-1至H-171；M-1至Q-170；M-1至W-169；M-1至N-168；M-1至F-167；M-1至S-166；M-1至A-165；M-1至Y-164；M-1至T-163；M-1至N-162；M-1至Y-161；M-1至G-160；M-1至N-159；M-1至E-158；M-1至E-157；M-1至I-156；M-1至R-155；M-1至E-154；M-1至K-153；M-1至L-152；M-1至K-151；M-1至C-150；M-1至D-149；M-1至N-148；M-1至N-147；M-1至F-146；M-1至E-145；M-1至K-144；M-1至S-143；M-1至G-142；M-1至Y-141；M-1至L-140；M-1至K-139；M-1至G-138；M-1至K-137；M-1至K-136；M-1至N-135；M-1至M-134；M-1至A-133；M-1至L-132；M-1至Y-131；M-1至Y-130；M-1至N-129；M-1至S-128；M-1至N-127；M-1至I-126；M-1至A-125；M-1至K-124；M-1至V-123；M-1至A-122；M-1至V-121；M-1至V-120；M-1至G-119；M-1至I-118；M-1至E-117；M-1至V-116；M-1至S-115；M-1至T-114；M-1至I-113；M-1至E-112；M-1至L-111；M-1至I-110；M-1至S-109；M-1至Y-108；M-1至P-107；M-1至C-106；M-1至N-105；M-1至E-104；M-1至K-103；M-1至K-102；M-1至T-101；M-1至G-100；M-1至S-99；M-1至V-98；M-1至K-97；M-1至G-96；M-1至N-95；M-1至K-94；M-1至E-93；M-1至I-92；M-1至K-91；M-1至L-90；M-1至F-89；M-1至Y-88；M-1至K-87；M-1至T-86；M-1至F-85；M-1至S-84；M-1至F-83；M-1至L-82；M-1至K-81；M-1至R-80；M-1至W-79；M-1至R-78；M-1至V-77；M-1至D-76；M-1至G-75；M-1至Q-74；M-1至L-73；M-1至H-72；M-1至N-71；M-1至Y-70；M-1至S-69；M-1至R-68；M-1至V-67；M-1至H-66；M-1至R-65；M-1至G-64；M-1至A-63；M-1至S-62；M-1至S-61；M-1至P-60；M-1至S-59；M-1至S-58；M-1至F-57；M-1至S-56；M-1至S-55；M-1至S-54；M-1至S-53；M-1至S-52；M-1至N-51；M-1至T-50；M-1至A-49；M-1至E-48；M-1至P-47；M-1至S-46；M-1至V-45；M-1至M-44；M-1至D-43；M-1至Q-42；M-1至G-41；M-1至L-40；M-1至A-39；M-1至Q-38；M-1至C-37；M-1至T-36；M-1至V-35；M-1至P-34；M-1至V-33；M-1至S-32；M-1至S-31；M-1至V-30；M-1至L-29；M-1至F-28；M-1至L-27；M-1至L-26；M-1至L-25；M-1至F-24；M-1至C-23；M-1至C-22；M-1至C-21；M-1至C-20；M-1至C-19；M-1至G-18；M-1至P-17；M-1至L-16；M-1至H-15；M-1至P-14；M-1至F-13；M-1至A-12；M-1至S-11；M-1至A-10；M-1至C-9；M-1至H-8；M-1至T-7。编码这些多肽的多核苷酸也包含于本发明。
类似地，如SEQ ID NO：2所示的本发明KGF-2多肽之C末端缺失包括含有如下氨基酸序列残基的多肽：SEQ ID NO：2的S-69至H-207；S-69至V-206；S-69至V-205；S-69至M-204；S-69至P-203；S-69至L-202；S-69至F-201；S-69至H-200；S-69至A-199；S-69至S-198；S-69至T-197；S-69至N-196；S-69至K-195；S-69至R-194；S-69至R-193；S-69至T-192；S-69至K-191；S-69至Q-190；S-69至G-189；S-69至R-188；S-69至R-187；S-69至P-186；S-69至A-185；S-69至G-184；S-69至K-183；S-69至G-182；S-69至N-181；S-69至L-180；S-69至A-179；S-69至V-178；S-69至Y-177；S-69至M-176；S-69至Q-175；S-69至R-174；S-69至G-173；S-69至N-172；S-69至H-171；S-69至Q-170；S-69至W-169；S-69至N-168；S-69至F-167；S-69至S-166；S-69至A-165；S-69至Y-164；S-69至T-163；S-69至N-162；S-69至Y-161；S-69至G-160；S-69至N-159；S-69至E-158；S-69至E-157；S-69至I-156；S-69至R-155；S-69至E-154；S-69至K-153；S-69至L-152；S-69至K-151；S-69至C-150；S-69至D-149；S-69至N-148；S-69至N-147；S-69至F-146；S-69至E-145；S-69至K-144；S-69至S-143；S-69至G-142；S-69至Y-141；S-69至L-140；S-69至K-139；S-69至G-138；S-69至K-137；S-69至K-136；S-69至N-135；S-69至M-134；S-69至A-133；S-69至L-132；S-69至Y-131；S-69至Y-130；S-69至N-129；S-69至S-128；S-69至N-127；S-69至I-126；S-69至A-125；S-69至K-124；S-69至V-123；S-69至A-122；S-69至V-121；S-69至V-120；S-69至G-119；S-69至I-118；S-69至E-117；S-69至V-116；S-69至S-115；S-69至T-114；S-69至I-113；S-69至E-112；S-69至L-11 1；S-69至I-110；S-69至S-109；S-69至Y-108；S-69至P-107；S-69至C-106；S-69至N-105；S-69至E-104；S-69至K-103；S-69至K-102；S-69至T-101；S-69至G-100；S-69至S-99；S-69至V-98；S-69至K-97；S-69至G-96；S-69至N-95；S-69至K-94；S-69至E-93；S-69至I-92；S-69至K-91；S-69至L-90；S-69至F-89；S-69至Y-88；S-69至K-87；S-69至T-86；S-69至F-85；S-69至S-84；S-69至F-83；S-69至L-82；S-69至K-81；S-69至R-80；S-69至W-79；S-69至R-78；S-69至V-77；S-69至D-76；S-69至G-75。
此外，任一上述N-或C-末端缺失可组合以产生N-和C-末端缺失的KGF-2多肽。本发明还提供了具有从氨基端和羧基端缺失一个或多个氨基酸的多肽，其可一般性的描述为具有SEQ ID NO：2的m-n残基，其中n和m均为上述整数。此外，N-或C-末端缺失突变体也可含有位点特异性氨基酸替换。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明中。
还包括编码由完整KGF-2氨基酸序列的部分组成的多肽之核苷酸序列，其中所述完整KGF-2氨基酸序列由包含于ATCC保藏号75977中的cDNA克隆所编码，其中所述部分不包括完整氨基酸之氨基端第1至约198个氨基酸的氨基酸残基之任一整数，或羧基端第1-约198个氨基酸的氨基酸残基的任一整数，所述完整氨基酸由包含于ATCC保藏号75977中的cDNA克隆所编码；或由包含于ATCC保藏号75977中的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列的上述氨基端和羧基端缺失的任一组合。编码上述所有缺失突变体多肽形式的多核苷酸也在此提供。
本发明海涉及含有与此处所示m-n的KGF-2多肽序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％相同的多肽。在一个优选实施方案中，本申请涉及含有与特定KGF-2和此处所述C末端缺失的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％相同的多肽之蛋白质。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明。
在本发明特别优选的片段中，是特征为KGF-2结构或功能性质的那些片段。这些片段包括含有如下特征的氨基酸残基：含有完整(即：全长)KGF-2(SEQ ID NO：2)的α-螺旋和α-螺旋形成区(α-区)，β-片层和β-形成区(β-区)，转角和转角形成区(转角区)，卷曲和卷曲形成区(卷曲区)，亲水区，疏水区，α-两亲区，β-两亲区，表面形成区和高抗原系数区(即：含有4个或多个连续的氨基酸，其具有高于或等于1.5的抗原系数，如利用Jameson-Wolf程序的默认的所鉴别的)。某些优选的区域如示于图4中的那些，包括但不限于，通过分析示于图1(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列鉴别的前面提到的类型重点区域，这样的优选区域包括：Garnier-Robson预期的α-区，β-区，转角区和卷曲区；Chou-Fasman预期的α-区，β-区，转角区和卷曲区；Kyte-Doolittle预期的亲水区和疏水区；Eisenbergα-两亲区，β-两亲区；Emini表面形成区；和Jameson-Wolf高抗原系数区，如利用这些计算机程序的默认参数预期的。编码这些多肽的多核苷酸业包括在本发明中。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸编码KGF-2的功能性特征。在这方面优选的本发明实施方案包括包含KGF-2的α-螺旋和α-螺旋形成区(α-区)，β-片层和β片层-形成区(β-区)，转角和转角形成区(转角区)，卷曲和卷曲形成区(卷曲区)，亲水区，疏水区，α-两亲区，β-两亲区，柔性区，表面形成区和高抗原系数区的片段。
代表KGF-2的结构或功能特征的数据示于图1和/或表1，如上述，其是利用多种模式和算法由设定为默认参数的DNA*STAT产生的。在一个优选实施方案中，在表1的VIII、IX、XIII和XIV栏中出现的数据可用于确定显示抗原性的可能性高度的KGF-2区域。高抗原性区域可从VIII、IX、XIII和/或IV栏重点数据中确定，方法是挑选那些代表可能在环境中暴露在多肽表面的区域的数值，其中所述环境中抗原识别可在免疫反应起始的过程中发生。
在这方面某些优选的区域示于图4，但也如表1所示，通过利用图4中的数据之表格表示或鉴别。用于产生图4的DNA*STAR计算机算法(设定为原初默认参数)用来以表的形式呈现图4中的数据(见表I)。图4中的数据之表的形式可用于方便地确定优选区域的特定边界。
上述图4和表I所示的优选区域包括但不限于，由示于图1的氨基酸序列分析所鉴别的前述类型的区域。如图4和表I所示，这类优选的区域包括Garnier-Robsonα-区，β-区，转角区和卷曲区；Chou-Fasmanα-区，α-区，β-区和卷曲区；Kyte-Doolittle亲水区和疏水区；Eisenbergα-两亲区，β-两亲区；Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区；和Jameson-Wolf高抗原系数区。各栏用题头“Res”、“Position”和罗马数字I-XIV标记。各栏题头是指示于图3和表I的氨基酸序列的下列特征：“Res”：SEQ ID NO：2和图1A及1B的氨基酸残基；“Position”：SEQ ID NO：2和图1A及1B内的相应残基位置；I：α-区-Garnier-Robson；II：Alpha，-Chou-Fasman；III：β，区-Garnier-Robson；IV：β，区-Chou-Fasman；V：转角，区-Garnier-Robson；VI：转角，区-Chou-Fasman；VII：卷曲，区-Garnier-Robson；VIII：亲水性图-Kyte-Doolittle；IX：疏水性图-Hopp-Woods；X：α，两亲性区-Eisenberg；XI：β，两亲性区-Eisenberg；XII：柔性区-Karplus-Schulz；XIII：抗原系数-Jameson-Wolf；和XIV：表面可能性图-Emini。
表IRes      位置      I   II  III   IV    V    VI    VII   VIII    IX     X    XI    XII   XIII    XIVMet      1         A   A    .     .    .     .     .    -0.08   0.73   *     .     .    -0.60   0.82Trp      2         A   A    .     .    .     .     .    -0.50   0.99   *     .     .    -0.60   0.45Lys      3         A   A    .     .    .     .     .    -0.42   1.24   *     .     .    -0.60   0.29Trp      4         A   A    .     .    .     .     .    -0.07   1.30   *     .     .    -0.60   0.42Ile      5         A   A    .     .    .     .     .    -0.34   1.19   *     .     .    -0.60   0.55Leu      6         A   A    .     .    .     .     .    -0.33   0.84   *     .     .    -0.60   0.15Thr      7         .   A    B     .    .     .     .    -0.34   1.34   *     .     .    -0.60   0.14His      8         .   A    .     .    T     .     .    -0.98   0.81   *     .     .    -0.20   0.27Cys      9         .   A    .     .    T     .     .    -1.39   0.63   .     .     .    -0.20   0.33Ala      10        .   A    .     .    T     .     .    -0.71   0.73   *     .     .    -0.20   0.20Ser      11        .   A    .     .    T     .     .    0.07    0.67   *     .     .    -0.20   0.23Ala      12        .   A    .     .    T     .     .    -0.43   0.67   *     .     .    -0.20   0.57Phe      13        .   A    B     .    .     .     .    -0.61   0.79   .     .     .    -0.60   0.47Pro      14        .   .    .     .    T     .     .    -0.29   0.71   .     .     .    0.00    0.54His      15        .   .    .     .    T     .     .    -0.37   0.76   .     .     .    0.00    0.53Leu      16        .   .    .     .    T     T     .    -0.73   0.83   .     .     .    0.20    0.33Pro      17        .   .    .     .    T     T     .    -0.81   0.61   .     .     .    0.20    0.11Gly      18        .   .    .     .    T     T     .    -0.78   0.76   .     .     .    0.20    0.04Cys      19        .   .    .     .    T     T     .    -1.23   0.83   .     .     .    0.20    0.03
表I(续)Res     位置       I    II   III   IV   V   VI   VII   VIII   IX    X    XI   XII   XIII   XIVCys     20         .     .    .     .   T   T     .    -1.90  0.71  .     .    .    0.20   0.01Cys     21         .     .    B     .   .   T     .    -1.90  1.07  .     .    .    -0.20  0.01Cys     22         .     .    B     .   .   T     .    -2.50  1.33  .     .    .    -0.20  0.01Cys     23         .     .    B     .   .   T     .    -2.97  1.44  .     .    .    -0.20  0.02Phe     24         .     .    B     B   .   .     .    -3.00  1.56  .     .    .    -0.60  0.03Leu     25         .     .    B     B   .   .     .    -3.14  1.77  .     .    .    -0.60  0.05Leu     26         .     .    B     B   .   .     .    -3.33  1.89  .     .    .    -0.60  0.08Leu     27         .     .    B     B   .   .     .    -2.97  1.96  .     .    .    -0.60  0.07Phe     28         .     .    B     B   .   .     .    -2.60  1.56  .     .    .    -0.60  0.11Leu     29         .     .    B     B   .   .     .    -2.76  1.26  .     .    .    -0.60  0.18Val     30         .     .    B     B   .   .     .    -2.16  1.21  .     .    .    -0.60  0.16Ser     31         .     .    B     T   .   .     .    -2.20  0.96  .     .    .    -0.20  0.29Ser     32         .     .    .     B   .   .     C    -1.70  0.81  .     .    .    -0.40  0.26Val     33         .     .    B     B   .   .     .    -1.67  0.61  .     .    .    -0.60  0.51Pro     34         .     .    B     B   .   .     .    -0.86  0.54  .     *    .    -0.60  0.20Val     35         .     ,    B     B   .   .     .    -0.59  0.56  .     .    .    -0.60  0.26Thr     36         .     .    B     B   .   .     .    -1.10  0.67  .     *    .    -0.60  0.36Cys     37         .     .    B     B   .   .     .    -1.14  0.71  .     *    .    -0.60  0.19Gln     38         .     .    B     B   .   .     .    -0.29  0.71  .     *    .    -0.60  0.25Ala     39         .     .    B     B   .   .     .    -0.08  0.47  .     .    .    -0.60  0.30Leu     40         .     .    B     B   .   .     .     0.18 -0.01  .     .    .     0.30  0.95Gly     41         .     .    B     .   .   T     .    -0.37  0.03  .     .    F     0.25  0.54Gln     42         .     .    B     .   .   T     .     0.00  0.27  *     .    F     0.25  0.40
表I(续)Res    位置  I    II  III  IV  V     VI    VII     VIII     IX     X    XI   XII     XIII  XIVAsp    43    .    .    B    .  .     T     .       -0.21    0.16   .    .    F       0.25  0.65Met    44    .    .    B    .  .     T     .        0.38   -0.10   .    .    F       1.00  1.01Val    45    .    .    B    .  .     .     .        0.60   -0.53   .    .    .       0.95  1.01Ser    46    .    .    B    .  .     T     .        0.63   -0.43   .    .    F       0.85  0.61Pro    47    .    .    B    .  .     T     .        0.63    0.06   .    .    F       0.49  0.89Glu    48    A    .    B    .  .     T     .        0.33   -0.16   .    .    F       1.48  1.93Ala    49    A    .    .    .  .     T     .        0.63   -0.41   .    .    F       1.72  1.93Thr    50    A    .    .    .  .     .     .        1.19   -0.41   .    .    F       1.76  1.67Asn    51    .    .    .    .  .     T     C        1.19   -0.46   .    .    F       2.40  1.29Ser    52    .    .    .    .  .     T     C        1.10   -0.07   .    .    F       2.16  1.72Ser    53    .    .    .    .  .     T     C        0.40   -0.19   .    .    F       1.92  1.59Ser    54    .    .    .    .  T     T     .        0.69    0.11   .    .    F       1.13  0.86Ser    55    .    .    .    .  .     T     C        0.70    0.10   .    .    F       0.69  0.86Ser    56    .    .    .    .  T     T     .        0.49    0.10   .    .    F       0.65  0.86Phe    57    .    .    .    .  T     T     .        0.49    0.14   .    .    F       0.65  0.99Ser    58    .    .    .    .  .     T     C        0.49    0.14   .    .    F       0.69  0.99Ser    59    .    .    .    .  .     T     C        0.20    0.14   .    .    F       0.93  0.99Pro    60    .    .    .    .  .     T     C        0.16    0.26   *    .    F       1.32  1.15Ser    61    .    .    .    .  .     T     C        0.57   -0.10   *    .    F       2.01  0.85Ser    62    .    .    .    .  .     T     C        1.23   -0.49   *    .    F       2.40  1.25Ala    63    .    .    .    .  .     .     C        0.68   -0.37   *    .    F       1.96  1.10Gly    64    .    .    B    .  .     .     .        1.09   -0.16   *    .    F       1.37  0.61Arg    65    .    .    B    .   .    .     .        1.00   -0.54   *    .    F       1.43  0.89
表I(续)Res    位置  I    II  III    IV   V  VI  VII   VIII     IX    X   XI  XII     XIII   XIVHis     66   .    .    B     .    .   .   .    1.06   -0.54   *   .    .      1.19   1.18Val     67   .    .    B     .    .   .   .    1.36   -0.29   *   .    .      0.65   1.86Arg     68   .    .    B     .    .   T   .    1.91   -0.31   *   .    .      0.85   1.53Ser     69   .    .    B     .    .   T   .    1.44    0.19   *   *    .      0.25   1.53Tyr     70   .    .    B     .    .   T   .    1.33    0.37   *   *    .      0.25   1.70Asn     71   .    .    .     .    T   T   .    1.02    0.13   *   *    .      0.65   1.50His     72   .    .    .     .    .   .   C    1.88    0.56   *   *    .     -0.05   1.11Leu     73   .    .    .     .    .   T   C    0.91    0.17   *   *    .      0.45   1.18Gln     74   .    .    B     .    .   T   .    1.32    0.06   *   *    F      0.25   0.55Gly     75   .    .    B     .    .   T   .    1.28   -0.34   .   *    F      0.85   0.79Asp     76   .    .    B     .    .   T   .    1.39    0.07   .   *    F      0.40   1.00Val     77   .    .    B     B    .   .   .    1.47   -0.61   .   *    F      0.90   1.13Arg     78   .    .    B     B    .   .   .    1.47   -1.01   *   *    .      0.75   2.29Trp     79   .    .    B     B    .   .   .    0.77   -0.76   *   *    .      0.75   1.13Arg     80   .    .    B     B    .   .   .    0.81    0.03   *   *    .     -0.15   1.32Lys     81   .    .    B     B    .   .   .    0.11   -0.23   .   *    .      0.30   0.90Leu     82   .    .    B     B    .   .   .    0.66    0.56   *   *    .     -0.60   0.74Phe     83   .    .    B     B    .   .   .    0.59    0.13   *   *    .     -0.30   0.55Ser     84   .    .    B     B    .   .   .    0.63    0.13   *   .    .     -0.30   0.55Phe     85   A    .    .     B    .   .   .   -0.18    0.89   *   .    .     -0.45   1.04Thr     86   A    .    .     B    .   .   .   -1.03    0.99   *   .    .     -0.45   1.04Lys     87   A    A    .     B    .   .   .   -0.18    0.89   *   *    .     -0.60   0.64Tyr     88   A    A    .     B    .   .   .   -0.37    0.50   *   *    .     -0.45   1.48
表I(续)Res    位置     I   II   III  IV V    VI   VII    VIII    IX     X   XI  XII    XIII    XIVPhe     89      A   A     .   B  .    .     .    -0.07    0.40   *   .    .     -0.30   0.72Leu     90      A   A     .   B  .    .     .     0.68   -0.09   *   *    .      0.30   0.62Lys     91      A   A     .   B  .    .     .     0.99   -0.09   *   *    F      0.45   0.79Ile     92      A   A     .   .  .    .     .     0.60   -0.44   *   *    F      0.60   1.48Glu     93      A   .     .   .  .    T     .     0.89   -0.80   *   *    F      1.30   1.77Lys     94      A   .     .   .  .    T     .     0.73   -1.49   *   *    F      1.30   1.77Asn     95      A   .     .   .  .    T     .     1.24   -0.84   .   *    F      1.30   1.88Gly     96      A   .     .   .  .    T     .     0.86   -1.14   *   *    F      1.64   1.45Lys     97      A   .     .   .  .    .     .     1.43   -0.71   *   *    F      1.63   0.72Val     98      A   .     .   .  .    .     .     1.48   -0.23   .   *    F      1.67   0.64Ser     99      .   .     .   .  .    .     C     1.48   -0.63   .   .    F      2.66   1.30Gly     100     .   .     .   .  T    T     .     1.48   -1.06   .   *    F      3.40   1.30Thr     101     .   .     B   .  .    T     .     1.82   -1.06   .   *    F      2.66   3.04Lys     102     .   .     B   .  .    T     .     1.11   -1.30   .   *    F      2.49   3.65Lys     103     .   .     .   .  T    T     .     1.76   -1.11   .   .    F      2.72   1.98Glu     104     .   .     .   .  T    .     .     1.81   -1.11   .   .    F      2.35   2.12Asn     105     .   .     .   .  T    .     .     1.86   -0.84   .   .    F      2.18   1.66Cys     106     .   .     B   .  .    T     .     1.28   -0.46   .   .    .      1.70   1.11Pro     107     .   .     .   .  T    T     .     0.42    0.23   .   .    .      1.18   0.45Tyr     108     .   .     .   .  T    T     .     0.38    0.91   .   .    .      0.71   0.23Ser     109     .   .     B   .  .    T     .    -0.51    0.51   *   .    .      0.14   0.75Ile     110     .   .     B   B  .    .     .    -0.82    0.63   *   .    .     -0.43   0.34Leu     111     .   .     B   B  .    .     .    -0.46    0.69   .   .    .     -0.60   0.31
表I(续)Res     位置  I    II  III  IV  V  VI  VII      VIII     IX    X  XI   XII  XIII    XIVGlu     112   .    .    B   B   .   .   .       -1.10   0.31   .   .    .   -0.30  0.31Ile     113   .    .    B   B   .   .   .       -0.86   0.57   .   .    .   -0.60  0.33Thr     114   .    .    B   B   .   .   .       -1.44  -0.11   .   .    F    0.45  0.69Ser     115   .    .    B   B   .   .   .       -0.90  -0.11   .   .    F    0.45  0.28Val     116   A    .    .   B   .   .   .       -0.94   0.31   .   .    .   -0.30  0.40Glu     117   A    .    .   B   .   .   .       -1.80   0.27   .   .    .   -0.30  0.20Ile     118   A    .    .   B   .   .   .       -1.50   0.43   .   .    .   -0.60  0.11Gly     119   A    .    .   B   .   .   .       -2.04   0.54   .   *    .   -0.60  0.15Val     120   A    .    .   B   .   .   .       -1.70   0.54   .   *    .   -0.60  0.07Val     121   A    .    .   B   .   .   .       -1.43   0.54   *   .    .   -0.60  0.19Ala     122   A    .    .   B   .   .   .       -2.32   0.36   *   .    .   -0.30  0.19Val     123   .    .    B   B   .   .   .       -1.43   0.61   *   .    .   -0.60  0.18Lys     124   .    .    B   B   .   .   .       -1.39   0.37   .   .    .   -0.30  0.39Ala     125   .    .    B   .   .   .   .       -0.53   0.11   .   .    .   -0.10  0.52Ile     126   .    .    B   .   .   .   .        0.08   0.01   *   .    .    0.05  1.13Asn     127   .    .    B   .   .   T   .        0.42   0.13   *   .    F    0.25  0.88Ser     128   .    .    B   .   .   T   .        0.47   0.89   *   .    F    0.10  1.37Asn     129   .    .    B   .   .   T   .       -0.17   1.07   *   .    .   -0.05  1.61Tyr     130   .    .    B   .   .   T   .       -0.18   0.89   .   *    .   -0.05  1.01Tyr     131   A    A    .   .   .   .   .        0.71   1.10   .   *    .   -0.60  0.75Leu     132   A    A    .   .   .   .   .        0.76   1.11   .   .    .   -0.60  0.75Ala     133   A    A    .   .   .   .   .        1.10   0.71   .   .    .   -0.60  0.95Met     134   A    A    .   .   .   .   .        0.76  -0.04   .   *    .    0.45  1.22
表I(续)Res    位置   I    II  III  IV   V      VI  VII    VIII    IX    X  XI  XII XIII   XIVAsn     135   A     .   .    .   .       T   .     1.04  -0.37   .   *   .  0.85   1.46Lys     136   A     .   .    .   .       T   .     0.48  -1.06   .   *   F  1.30   2.89Lys     137   A     .   .    .   .       T   .     1.04  -0.87   .   *   F  1.30   2.41Gly     138   A     .   .    .   .       T   .     1.29  -0.73   .   *   F  1.30   2.34Lys     139   A     .   .    .   .       .   .     1.59  -0.70   *   *   F  1.10   1.16Leu     140   .     .   B    .   .       .   .     1.63  -0.31   .   *   F  0.65   0.78Tyr     141   .     .   B    .   .       T   .     1.59  -0.31   .   *   F  1.00   1.57Gly     142   .     .   B    .   .       T   .     0.84  -0.74   .   *   F  1.30   1.36Ser     143   .     .   B    .   .       T   .     1.19   0.04   .   *   F  0.40   1.43Lys     144   .     .   B    .   .       T   .     1.14  -0.24   .   *   F  1.00   1.47Glu     145   A     .   .    .   .       .   .     1.96  -0.60   *   .   F  1.10   2.38Phe     146   A     .   .    .   .       .   .     1.53  -1.03   *   *   F  1.10   2.97Asn     147   A     .   .    .   .       T   .     1.92  -0.84   *   *   F  1.15   0.80Asn     148   A     .   .    .   .       T   .     1.41  -0.84   .   *   F  1.15   0.92Asp     149   A     .   .    .   .       T   .     1.41  -0.16   .   *   F  0.85   0.88Cys     150   A     .   .    .   .       T   .     1.41  -0.94   *   *   F  1.30   1.09Lys     151   A     A   .    .   .       .   .     2.22  -1.34   *   *   F  0.90   1.17Leu     152   A     A   .    .   .       .   .     1.33  -1.74   *   *   F  0.90   1.37Lys     153   A     A   .    .   .       .   .     1.33  -1.06   *   *   F  0.90   1.80Glu     154   A     A   .    .   .       .   .     1.33  -1.63   *   *   F  0.90   1.56Arg     155   A     A   .    .   .       .   .     2.00  -1.63   *   *   F  0.90   3.27Ile     156   A     A   .    .   .       .   .     1.61  -1.91   *   *   F  1.24   2.63Glu     157   A     A   .    .   .       .   .     2.18  -1.49   *   *   F  1.58   1.50
表I(续)Res     位置   I   II   III  IV   V   VI   VII   VIII     IX    X    XI  XII    XIII   XIVGlu     158    A   A     .    .   .   .     .    2.13   -0.73   *    *    F     1.92   1.20Asn     159    .   .     .    .   T   T     .    1.82   -0.33   *    *    F     2.76   2.76Gly     160    .   .     .    .   T   T     .    1.47   -0.53   *    *    F     3.40   2.30Tyr     161    .   .     .    .   T   T     .    1.77    0.23   .    .    F     2.16   2.08Asn     162    .   .     .    .   .   T     C    1.47    0.73   .    .    F     1.32   1.31Thr     163    .   .     .    .   .   .     C    0.77    0.71   .    .    .     0.63   1.77Tyr     164    .   .     B    .   .   .     .    0.77    1.07   .    *    .    -0.06   0.98Ala     165    .   .     B    .   .   .     .    0.82    0.71   .    *    .    -0.40   0.98Ser     166    .   .     B    .   .   T     .    1.07    1.23   .    *    .    -0.20   0.71Phe     167    .   .     B    .   .   T     .    1.03    1.14   .    *    .    -0.20   0.79Asn     168    .   .     .    .   T   T     .    1.34    0.89   .    *    .     0.35   1.06Trp     169    .   .     .    .   T   T     .    1.24    0.79   .    *    .     0.35   1.27Gln     170    .   .     .    .   .   .     C    1.94    0.83   *    *    .     0.11   1.45His     171    .   .     .    .   .   T     C    2.24    0.04   *    *    .     0.77   1.77Asn     172    .   .     .    .   .   T     C    2.34    0.04   *    *    F     1.08   2.92Gly     173    .   .     .    .   T   T     .    2.10   -0.26   *    *    F     2.04   1.67Arg     174    .   .     .    .   T   T     .    1.53    0.10   *    *    F     1.60   1.92Gln     175    .   .     B    B   .   .     .    0.94    0.24   *    .    .     0.34   0.89Met    -176    .   .     B    B   .   .     .    0.17    0.34   *    .    .     0.18   0.90Tyr     177    .   .     B    B   .   .     .    0.17    0.60   *    *    .    -0.28   0.38Val     178    .   .     B    B   .   .     .    0.17    1.00   .    *    .    -0.44   0.35Ala     179    .   .     B    B   .   .     .    0.10    1.03   .    *    .    -0.60   0.35Leu     180    .   .     B    B   .   .     .   -0.24    0.41   .    *    .    -0.30   0.45
表I(续)Res     位置  I    II    III  IV     V   VI  VII    VIII    IX    X    XI   XII   XIII   XIVAsn     181   .     .     .    .     T   T    .    -0.23    0.09  .    *    F     1.25   0.60Gly     182   .     .     .    .     T   T    .    -0.20   -0.06  *    *    F     2.15   0.60Lys     183   .     .     .    .     T   T    .     0.77   -0.13  *    *    F     2.60   1.13Gly     184   .     .     .    .     .   T    C     1.47   -0.81  *    *    F     3.00   1.37Ala     185   .     .     .    .     .   .    C     1.93   -1.21  *    *    F     2.50   2.72Pro     186   .     .     B    .     .   T    .     1.93   -1.21  *    .    F     2.20   1.35Arg     187   .     .     B    .     .   T    .     2.32   -0.81  *    .    F     1.90   2.35Arg     188   .     .     B    .     .   T    .     1.97   -1.24  *    .    F     1.60   4.66Gly     189   .     .     B    .     .   T    .     2.42   -1.26  *    .    F     1.30   4.35Gln     190   .     .     B    .     .   .    .     3.12   -1.69  *    .    F     1.10   4.35Lys     191   .     .     B    .     .   .    .     3.38   -1.69  *    .    F     1.10   4.35Thr     192   .     .     B    .     .   .    .     3.27   -1.69  *    .    F     1.44   8.79Arg     193   .     .     B    .     .   .    .     2.84   -1.71  .    .    F     1.78   8.16Arg     194   .     .     .    .     T   .    .     2.89   -1.63  *    .    F     2.52   5.89Lys     195   .     .     .    .     T   .    .     2.30   -1.24  *    .    F     2.86   5.47Asn     196   .     .     .    .     T   T    .     2.22   -1.23  .    *    F     3.40   2.82Thr     197   .     .     .    .     .   T    C     1.83   -0.73  .    .    F     2.86   1.96Ser     198   .     .     .    .     .   T    C     0.91    0.06  .    .    F     1.47   0.85Ala     199   .     .     B    .     .   T    .     0.59    0.74  .    .    .     0.48   0.44His     200   .     .     B    .     .   .    .    -0.06    0.77  .    .    .    -0.06   0.47Phe     201   .     .     B    B     .   .    .    -0.91    0.90  *    .    .    -0.60   0.34Leu     202   .     .     B    B     .   .    .    -1.46    1.16  .    .    .    -0.60   0.25Pro     203   .     .     B    B     .   .    .    -1.19    1.30  .    .    .    -0.60   0.14Met     204   .     .     B    B     .   .    .    -0.90    1.30  *    .    .    -0.60   0.22Val     205   A     .     .    B     .   .    .    -1.26    0.90  *    .    .    -0.60   0.35Val     206   A     .     .    B     .   .    .    -0.94    0.64  .    .    .    -0.60   0.29His     207   A     .     .    B     .   .    .    -0.52    0.64  .    .    .    -0.60   0.38Ser     208   A     .     .    B     .   .    .    -0.70    0.46  .    .    .    -0.60   0.65
在这方面优选的片段是那些含有组合数种结构特征，诸如上述特征的数种之KGF-2的区域。
此外，可用基因改构(shuffling)、基元改构、外显子改构和/或密码子改构(一并称为“DNA改构”)技术来调节KGF-2的活性，由此有效地产生KGF-2的激动剂和拮抗剂。见美国专利5605793；5811238；5830721；5834252和5837458，以及Patten等，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33(1997)；Harayama，Trends biotechnol.16(2)：76-82(1998)；Hansson等，分子生物学杂志，287：265-76(1999)；以及Lorenzo和Blasco，生物技术，24(2)：308-13(1998)(在此各个全文引入作为参考)。
在一个实施方案中，相应于SEQ ID NO：1或3的多肽以及由这些多核苷酸编码的多肽之改变可通过DNA改构实现。DNA改构包括通过同源或定点重组组装两个或多个DNA区段以产生多核苷酸序列中的变化。在另一个实施方案中，KGF-2多核苷酸或编码的多肽可通过由差错倾向的PCR经历随机突变而被改变。在另一个实施方案中，编码KGF-2的多核苷酸之一个或多个元件、基元、区段、部分、结构域、片段等可与一个或多个异源分子的元件、基元、区段、部分、结构域、片段等重组。在优选实施方案中，异源分子是KGF-2家族成员。在优选实施方案中，异源分子是生长因子，诸如，例如血小板衍生的生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGI-I)，转化生长因子(TGF)-α，表皮生长因子(EGF)，成纤维生长因子(FGF)，TGF-β，骨形态生成蛋白(BMP)-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP7，活化素A和B，decapentaplegic(dpp)，60A，OP-2，dorsalin，生长分化因子(GDF)，节(nodal)，MIS，抑制素α，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β5，和神经胶质衍生的嗜中性因子(GDNF)。其他优选的片段为KGF-2生物活性片段。生物活性片段是那些显示与KGF-2多肽活性相似，但不一定相同的片段。片段的生物活性可包括一种改善的期望活性，或降低的不期望的活性。
此外，本发明提供了一种筛选化合物以从中鉴定那些调节本发明多肽的作用化合物之方法。这种检测的一个例子包括在成纤维细胞可正常增殖的细胞培养条件下，结合哺乳动物细胞、本发明多肽、待筛选的化合物以及3[H]胸腺嘧啶。在不存在待筛选化合物的条件下进行对照检测，并与在存在化合物时成纤维细胞增殖的数量，以通过测定每一例中3[H]胸腺嘧啶的摄入确定该化合物是否刺激增殖。利用测量3[H]胸腺嘧啶的掺入之液体闪烁色谱测量成纤维细胞增殖的量。用此方法可鉴别激动剂和拮抗剂化合物。
在另一个方法中，用标记的本发明多肽在存在化合物的条件下，温育表达本发明多肽的受体之哺乳动物细胞或膜制剂。化合物增加或阻断此相互作用的能力由此可测。或者，在待筛选化合物与KGF-2受体相互作用测量后，可测量KGF-2抑制第二信号系统的反应，和测量化合物结合到受体并引发第二信号反应的能力，以鉴定是否该化合物是潜在的激动剂或拮抗剂。这类第二信号系统包括但不限于，cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道或磷酸肌醇水解。所有以上试验均可用作诊断或预后标记。用这些试验发现的分子可用于通过活化或抑制KGF-2分子而治疗疾病或在患者中产生特殊的效果(如血管生长)。此外，这些试验能发现可抑制或增强适当处理细胞或组织中KGF-2产生的物质。
因此，本发明包括鉴定与KGF-2可结合的化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)温育候选结合化合物与KGF-2；和(b)测定结合是否发生。另外，本发明包括鉴定激动剂/拮抗物的方法，该方法含以下步骤：(a)温育候选化合物与KGF-2；(b)检测生物学活性，和(c)测定KGF-2的生物学活性是否已改变。
此外，可以利用在图4以及表1中公开的β-片层区实验性鉴定结合KGF-2的分子。因此，本发明的特定实施方案涉及编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括或者由在图3/表1中公开的每一个β-片层区之氨基酸序列组成。
本发明的额外的实施方案涉及编码KGF-2多肽的多核苷酸，所述多肽包括或者由在图4/表1中公开的β-片层区之氨基酸序列的任一组合以及其全部组成。本发明额外优选的实施方案涉及这样的多肽，所述多肽包括或者由在图4/表1中公开的β-片层区之KGF-2氨基酸序列组成。本发明额外的实施方案涉及KGF-2多肽，所述多肽包括或者由在图4/表1中公开的β-片层区的任一组合或全部组成。
本发明其他优选的实施方案为结合KGF-2受体的KGF-2片段。结合KGF-2受体的KGF-2片段可用作KGF-2的激动剂或拮抗剂。例如，结合受体的KGF-2片段可阻止与KGF-2结合并活化其部分。其他片段可结合受体并特异性失活受体，和受体活化，或可特异性结合可识别受体配体复合物的抗体，且优选不特异性识别未结合的受体或未结合的配体。类似地，本发明包括了活化受体的片段。这些片段可作为受体激动剂，即：增效或活化配体介导的受体活化之生物活性的全部或部分，例如通过诱导受体的二聚化。片段可明晰为生物活性的激动剂、拮抗剂或反向激动剂，所述生物活性包括此处公开的本发明的肽之特定的生物活性。
结合KGF-2受体的KGF-2片段的非限定性例子包括SEQ ID NO：2的氨基酸147-155，95-105，78-94，119-146，70-94，78-105，114-146，70-105，86-124，100-139，106-146，160-209，和/或156-209。还优选编码这些多肽的多核苷酸。
其他优选的片段是生物活性的KGF-2片段。生物活性片段是那些显示与KGF-2多肽活性相似，但不一定相同的片段。片段的生物活性可包括一种改善的期望活性，或降低的不期望的活性。
但是，如EST序列之类的许多多核苷酸序列可公开地从序列数据库获得。其中一些与SEQ ID NO：1有关，并可能在本发明构思前已可公开地获得。优选地，这种相关多核苷酸被特地排除在本发明范围之外。将每个相关序列一一列举是繁琐的。因此，优选从本发明中排除的是含通式a-b所描述之核苷酸序列的一个或多个多核苷酸，其中a是SEQ ID NO：1第1-613位的任何整数，b是第15-627位整数，其中a和b都相应于SEQ IDNO：1中所示的核苷酸残基位置，且b大于或等于a+14。氨基末端和羧基末端缺失
使用重组DNA技术已修饰了FGF家族的多个成员。在aFGF和bFGF中，对肝素结合至关重要的带正电的分子已被替换或缺失。经修饰的分子导致肝素结合活性的降低，因此，患者体内被肝素结合的经修饰分子的量会有所降低，由于更多的FGF会到达适当的受体，从而增加了效力(EP 0298723)。
含水状态的天然KGF-2相对不稳定，它会遭遇化学和物理降解，从而导致加工和储存过程中生物活性的损失。天然KGF-2在水溶液中，由于温度升高会倾向于聚集，在酸性条件下会失活。
为了改善或改变天然KGF-2的一个或更多个特性，可使用蛋白质工程。Ron等人，生物化学杂志，268(4)：2984-2988(1993)报道了即使丧失氨基末端3、8或27个氨基酸残基仍具有肝素结合活性的经修饰KGF蛋白。缺失3和8个氨基酸具有全部的活性。KGF更多个氨基酸的缺失描述于PCT/IB95/00971。羧基末端氨基酸的缺失可增强蛋白质的活性。一个例子是γ干扰素，通过缺失该蛋白质羧基末端的10个氨基酸残基可使活性提高达10倍(Dobeli等人，生物技术杂志，7：199-216(1988))。因此，本发明的一方面是提供KGF-2的多肽类似物和编码这种类似物的核苷酸序列，所述类似物相对于天然KGF-2多肽而言，表现出增强的稳定性(如当暴露于典型的pH，热条件或其它储存条件下)。
下文所示的是特别优选的KGF-2多肽(计数始于蛋白质中的第一个氨基酸(Met))(图1，SEQ ID No：2)：Thr(残基36)-Ser(残基208)       Arg(65)-Ser(208)Cys(37)-Ser(208)               Val(67)-Ser(208)Gln(38)-Ser(208)               Ser(69)-Ser(208)Ala(39)-Ser(208)               Val(77)-Ser(208)Leu(40)-Ser(208)               Arg(80)-Ser(208)Gly(41)-Ser(208)               Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-His(207)Gln(42)-Ser(208)               Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Val(206)Asp(43)-Ser(208)               Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Val(205)Met(44)-Ser(208)               Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Met(204)Val(45)-Ser(208)               Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Pro(203)Ser(46)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Leu(202)Pro(47)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Phe(201)Glu(48)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-His(200)Ala(49)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Ala(199)Thr(50)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Ser(198)Asn(51)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Thr(197)Ser(52)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Asn(196)Ser(53)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Lys(195)Ser(54)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Arg(194)Ser(55)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Arg(193)Ser(56)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Thr(192)Phe(57)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Lys(191)Ser(59)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Arg(188)Ser(62)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Arg(187)Ala(63)-Ser(208)    Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Lys(183)Gly(64)-Ser(208)
优选的实施方案包括N-末端缺失Ala(63)-Ser(208)(KGF-2Δ28)(SEQ ID NO：68)和Ser(69)-Ser(208)(KGF-2Δ33)(SEQ ID NO：96)。其它优选的N-末端和C-末端缺失突变体描述于说明书实施例13和16(c)，并包括Ala(39)-Ser(208)(SEQ ID NO：116)；图1的Pro(47)-Ser(208)(SEQ ID NO：2)；Val(77)-Ser(208)(SEQ ID NO：70)；Glu(93)-Ser(208)(SEQ ID NO：72)；Glu(104)-Ser(208)(SEQ IDNO：74)；Val(123)-Ser(208)(SEQ ID NO：76)；和Gly(138)-Ser(208)(SEQ ID NO：78)。其它优选的C-末端缺失突变体包括：图1(SEQ IDNO：2)的Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)-Lys(153)。
本发明中也包括N-末端和C-末端氨基酸都有缺失的缺失突变体。这种突变体包括上述N-末端缺失突变体和C-末端缺失突变体的所有联合，例如图1(SEQ ID NO：2)的Ala(39)-His(200)，图1(SEQ ID NO：2)的Met(44)-Arg(193)，图1(SEQ ID NO：2)的Ala(63)-Lys(153)，图1(SEQ ID NO：2)的Ser(69)-Lys(153)等等。使用本领域技术人员熟知的重组技术可进行这种组合。
因此，一方面，本发明提供了N-末端的缺失突变体，这种突变体包括那些除图1(SEQ ID NO：2)中至少前38个N-末端氨基酸残基(即至少Met(1)-Gln(38))但不超过前147个N-末端氨基酸残基缺失外，含有图1(SEQ ID NO：2)所示其余氨基酸序列的突变体。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少前38个N-末端氨基酸残基(即至少缺失Met(1)-Gln(38))但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少前46个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少前62个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少前68个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少前76个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少前92个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ IDNO：2)中至少前103个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少前122个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基。
除了上述N-末端缺失突变体的范围以外，本发明也涉及上述范围的所有联合，如图1(SEQ ID NO：2)中至少前62个N-末端氨基酸残基但不超过前68个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少前62个N-末端氨基酸残基但不超过前76个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少前62个N-末端氨基酸残基但不超过前92个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少前62个N-末端氨基酸残基但不超过前103个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQID NO：2)中至少前68个N-末端氨基酸残基但不超过前76个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少前68个N-末端氨基酸残基但不超过前92个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少前68个N-末端氨基酸残基但不超过前103个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少前46个N-末端氨基酸残基但不超过前62个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少前46个N-末端氨基酸残基但不超过前68个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少前46个N-末端氨基酸残基但不超过前76个N-末端氨基酸残基的缺失；等等。
另一方面，本发明提供了C-末端缺失突变体。优选所述C-末端缺失突变体的N-末端氨基酸残基是图1(SEQ ID NO：2)的氨基酸残基1(Met)，36(Thr)或37(Cys)。这种突变体包括那些除图1(SEQ ID NO：2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基(Ser(208))但不超过最后55个C-末端氨基酸残基缺失(即缺失氨基酸残基Glu(154)-Ser(208))外，含有图1(SEQ ID NO：2)所示其余氨基酸序列的突变体。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后65个C-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少最后10个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少最后20个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少最后30个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少最后40个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基。或者，缺失包括图1(SEQ ID NO：2)中至少最后50个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基。
除了上述C-末端缺失突变体的范围以外，本发明也涉及上述范围的所有联合，如图1(SEQ ID NO：2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后10个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后20个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后30个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后40个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少最后10个C-末端氨基酸残基但不超过最后20个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少最后10个C-末端氨基酸残基但不超过最后30个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少最后10个C-末端氨基酸残基但不超过最后40个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：2)中至少最后20个C-末端氨基酸残基但不超过最后30个C-末端氨基酸残基的缺失；等等。
另一方面，本发明也包括N-末端和C-末端残基都缺失了氨基酸的缺失突变体。这种突变体包括上述N-末端缺失突变体和C-末端缺失突变体的所有联合。这种突变体包括除图1(SEQ ID NO：2)中至少前46个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基缺失，图1(SEQID NO：2)中至少最后一个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基缺失外，含有图1(SEQ ID NO：2)所示其余氨基酸序列的突变体。或者，缺失可包括图1(SEQ ID NO：2)中至少前62，68，76，92，103或122个N-末端氨基酸残基但不超过前137个N-末端氨基酸残基的缺失，和图1中至少最后10，20，30，40或50个C-末端氨基酸残基但不超过最后55个C-末端氨基酸残基的缺失。另外还包括上述范围的所有联合。氨基酸替换
本发明的另一方面也包括氨基酸的替换。天然的成熟KGF-2含有44个带电的残基，其中的32个带正电。根据这种残基在蛋白质三维结构中的位置，用带负电或不带电的氨基酸替换一个或多个这些成簇的残基可改变相邻残基的静电相互作用，对于增加蛋白质稳定性和减少蛋白质聚集是有用的。蛋白质的聚集不仅会导致活性的丧失，也会给药物制剂的制备带来问题，因为它们可能会是免疫原性的(Pinckard等人，临床实验免疫学，2：331-340(1967)，Robbins等人，糖尿病，36：838-845(1987)，Cleland等人，Crit.ReV.Therapeutic Drug CarrierSystems，10：307-377(1993))。任何修饰都应考虑到使蛋白质分子四级结构中的电荷排斥最小化。因此，特别令人感兴趣的是用另一种带电的氨基酸和用中性的或带负电的氨基酸替换带电的氨基酸，后者会导致蛋白质所带的正电荷减少，从而改善KGF-2的特性。这种改善包括与天然的KGF-2蛋白相比，类似物的稳定性有所增加和聚集作用有所降低。
氨基酸的替换也可以改变与细胞表面受体结合的选择性，Ostade等人，自然，361：266-268(1993)中描述了某些TNFα突变导致TNFα仅选择性地与两种已知TNF受体之一结合。
本发明的又一个实施方案涉及包含KGF-2多肽的氨基酸序列的多肽，所述KGF-2多肽具有这样的氨基酸序列，其含有至少一个氨基酸替换，但是不超过50个氨基酸替换，甚至更优选不超过40个氨基酸替换，甚至更优选不超过30个氨基酸替换，甚至更优选不超过20个氨基酸替换。当然，以偏好增加的顺序，最优选具有这样的氨基酸序列的肽或多肽，其包含KGF-2多肽的氨基酸序列，其中含有至少一个，但是不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸替换。在特定实施方案中，在图1的氨基酸序列或其片段(例如，成熟形式和/或此处所述的其他片段)中添加、替换和/或缺失的数目是1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150，优选保守性氨基酸替换。
KGF-2分子可包括一个或多个氨基酸替换、缺失或添加，无论是天然突变或人工操作。突变可在全长KGF-2、成熟KGF-2、任一其他的KGF-2合适片段，例如A63-S208，S69-S208，V77-S208，R80-S208或E93-S208。这些优选的突变的例子是：Ala(49)Gln，Asn(51)Ala，Ser(54)Val，Ala(63)Pro，Gly(64)Glu，Val(67)Thr，Trp(79)Val，Arg(80)Lys，Lys(87)Arg，Tyr(88)Trp，Phe(89)Tyr，Lys(91)Arg，Ser(99)Lys，Lys(102)Gln，Lys 103(Glu)，Glu(104)Met，Asn(105)Lys，Pro(107)Asn，Ser(109)Asn，Leu(111)Met，Thr(114)Arg，Glu(117)Ala，Val(120)Ile，Val(123)Ile，Ala(125)Gly，Ile(126)Val，Asn(127)Glu，Asn(127)Gln，Tyr(130)Phe，Met(134)Thr，Lys(136)Glu，Lys(137)Glu，Gly(142)Ala，Ser(143)Lys，Phe(146)Ser，Asn(148)Glu，Lys(151)Asn，Leu(152)Phe，Glu(154)Gly，Glu(154)Asp，Arg(155)Leu，Glu(157)Leu，Gly(160)His，Phe(167)Ala，Asn(168)Lys，Gln(170)Thr，Arg(174)Gly，Tyr(177)Phe，Gly(182)Gln，Ala(185)Val，Ala(185)Leu，Ala(185)Ile，Arg(187)Gln(190)Lys，Lys(195)Glu，Thr(197)Lys，Ser(198)Thr，Arg(194)Glu，Arg(194)Gln，Lys(191)Glu，Lys(191)Gln，Arg(188)Glu，Arg(188)Gln，Lys(183)Glu，Arg(187)Ala，Arg(188)Ala，Arg 174(Ala)，Lys(183)Ala，Lys(144)Ala，Lys(151)Ala，Lys(153)Ala，Lys(136)Ala，Lys(137)Ala，和Lys(139)Ala。
命名例如，Ala(49)Gln是指图1(SEQ ID NO：2)的位置49处Ala被Gln替换。
此外，特别优选如下突变：S69-S208具有在这个位置的点突变：R188E；S69-S208具有在这个位置的点突变：K191E；S69-S208，具有在这个位置的点突变：K149E；S69-S208具有在这个位置的点突变：K183Q；S69-S208具有在这个位置的点突变：K183E；A63-S208具有在这个位置的点突变：R68G；A63-S208具有在这个位置的点突变：R68S；A63-S208具有在这个位置的点突变：R68A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R78A，R80A和K81A；A63-S208具有在这些位置的点突变：K81A，K87A和K91A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R78A，R80A，K81A，K87A和K91A；A63-S208具有在这些位置的点突变：K136A，K137A，K139A和K144A；A63-S208具有在这些位置的点突变：K151A，K153A和K155A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68G，R78A，R80A，和K81A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68G，K81A，K87A和K91A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68G，R78A，R80A，K81A，K87A和K91A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68G，K136A，K137A，K139A，和K144A；A63-208具有在这些位置的点突变：R68G，K151A，K153A，和R155A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68S，R78A，R80A，和K81A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68S，K81A，R87A和K91A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68S，R78A，R80A，K81A，K87A和K91A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68S，K136A，K137A，K139A，和K144A；A63-208具有在这些位置的点突变：R68S，K151A，K153A，和R155A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68A，R78A，R80A和K81A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68A，K81A，K87A，和K91A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68A，R78A，R80A，K81A，K87A，和K91A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R68A，K136A，K137A，K139A和K144A；和A63-S208具有在这些位置的点突变：R68A，K151A，K153A和R155A.还优选的是：A63-S208具有在R68至K91(包括)之间带正电的残基被丙氨酸替换[A63-S208(R68-K91A)]；全长KGF-2具有在R68至K91(包括)之间带正电的残基被丙氨酸替换[KGF-2(R68-K91A)]；A63-S208具有在R68至K91(包括)之间带正电的残基被中性残基替换，诸如G，S和/或A；全长KGF-2具有在R68至K91(包括)之间带正电的残基被中性残基替换，诸如G，S和/或A；A63-S208具有在R68至K91(包括)之间带正电的残基被带负电的酸性残基替换，诸如D和/或E；全长KGF-2具有在R68至K91(包括)之间带正电的残基被带负电的酸性残基替换，诸如D和/或E；全长KGF-2具有在这些位置的点突变：R78A，R80A，和K81A；全长KGF-2具有在这些位置的点突变：K81A，K87A和K91A；全长KGF-2具有在这个位置的点突变：R68G；全长KGF-2具有在这个位置的点突变：R68S；全长KGF-2具有在这个位置的点突变：R68A；A63-S208具有在这些位置的点突变：R174A和K183A；和A63-S208具有在这些位置的点突变：R187A和R188A。
还优选的是A63-S208，具有在这个位置的点突变：R188E，K191E，K149E，K183Q，或K183E；S69-S208具有在这些位置的点突变：R78A，R80A和K81A；S69-S208具有在这些位置的点突变：K81A，K87A和K91A；S69-S208具有在这些位置的点突变：R174A和K183A；S69-S208具有在这些位置的点突变：R187A和R188A；V77-S208具有在这个位置的点突变：R188E，K191E，K149E，K183Q，或K183E；V77-S208具有在这些位置的点突变：R78A，R80A和K81A；V77-S208具有在这些位置的点突变：K81A，K87A和K91A；V77-S208具有在这些位置的点突变：R174A和K183A；V77-S208具有在这些位置的点突变：R187A和R188A；R80-S208具有在这个位置的点突变：R188E，K191E，K149E，K183Q，或K183E；R80-S208具有在这些位置的点突变：R174A和K183A；R80-S208具有在这些位置的点突变：R187A和R188A；E93-S208具有在这个位置的点突变：R188E，K191E，K149E，K183Q，或K183E；E93-S208具有在这些位置的点突变：R174A和K183A；或E93-S208具有在这些位置的点突变：R187A和R188A。
所有上述点突变也可在全长KGF-2，成熟KGF-2，或此处所述KGF-2的任一其他片段中进行。命名例如R188E，是指位置188处的精氨酸被谷氨酸替换。
可在每一KGF-2的氨基酸处进行定点突变，优选在氨基酸A63至E93之间。每一氨基酸可被其他19种另外的氨基酸替换。例如，优选的突变包括：A63替换为C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；G64替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；R65替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，或Y；H66替换为A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；V67替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，或Y；R68替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，或Y；S69替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，或Y；Y70替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W；N71替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；H72替换为A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；L73替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；Q74替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W，或Y；G75替换为A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；D76替换为A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；V77替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W，或Y；R78替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，或Y；W79替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或Y；R80替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W，或Y；K81替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；L82替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；F83替换为A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；S84替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W，或Y；F85替换为A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；T86替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，V，W，或Y；K87替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；Y88替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，或W；F89替换为A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；L90替换为A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；K91替换为A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；I92替换为A，C，D，E，F，G，H，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y；和/或E93替换为A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y。
这些突变可在前述N末端缺失构建体中进行，特别是以氨基酸M1、T36、C37或A63开始的构建体。此外可在此区域(A63至E93)中进行一个以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9和10)的氨基酸替换。所得构建体可经过筛选是否丧失肝素结合、丧失KGF-2活性、和/或丧失氨基酸R68和S69之间的酶促切割。
优选的突变位于N末端缺失构建体M1、T36、C37和A63中的氨基酸位置R68和S69处，以及在所有上述N末端突变体的肝素结合位点，特别是T36、C37、A63、S69、V77、R80或E93。肝素结合位点位于Arg174和Lys183之间。优选的Arg68突变体用Gly、Ser或Ala替换精氨酸；优选Arg187突变体用丙氨酸替换精氨酸。
制备突变的两种方法，是定点突变法或是加速突变法(Kuchner和Arnold，Tibtech 5：523-530(1997)；Crameri等，自然(1998)；和Christians等，自然杂志生物工程分册17：259264(1999))。这些方法为本领域周知。
优选变化为微不足道的，如不会显著影响蛋白质的折叠或活性的保守氨基酸替换。下文所示的是本领域技术人员熟知的保守氨基酸替换的例子：
芳香族：苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸
疏水的：亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸
极性的：谷氨酰胺，天冬酰胺
碱性的：精氨酸，赖氨酸，组氨酸
酸性的：天冬氨酸，谷氨酸
小的：丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸
当然，熟练的技术人员可根据包括上述那些在内的很多因素决定氨基酸替换的数目。一般而言，根据目的，任何给定KGF-2多肽的替换数目不超过50，40，30，20，10，5或3个。例如，在KGF-2C-末端一些可改善稳定性的替换描述于上文和实施例22中。
特别优选的是具有保守性氨基酸替换的KGF-2分子，包括：M1替换为A，G，I，L，S，T，或V；W2替换为F，或Y；K3替换为H，或R；W4替换为F，或Y；I5替换为A，G，L，S，T，M，或V；L6替换为A，G，I，S，T，M，或V；T7替换为A，G，I，L，S，M，或V；H8替换为K，或R；A10替换为G，I，L，S，T，M，或V；S11替换为A，G，I，L，T，M，或V；A12替换为G，I，L，S，T，M，或V；F13替换为W，或Y；H15替换为K，或R；L16替换为A，G，I，S，T，M，或V；G18替换为A，I，L，S，T，M，或V；F24替换为W，或Y；L25替换为A，G，I，S，T，M，或V；L26替换为A，G，I，S，T，M，或V；L27替换为A，G，I，S，T，M，或V；F28替换为W，或Y；L29替换为A，G，I，S，T，M，或V；V30替换为A，G，I，L，S，T，或M；S31替换为A，G，I，L，T，M，或V；S32替换为A，G，I，L，T，M，或V；V33替换为A，G，I，L，S，T，或M；V35替换为A，G，I，L，S，T，或M；T36替换为A，G，I，L，S，M，或V；Q38替换为N；A39替换为G，I，L，S，T，M，或V；L40替换为A，G，I，S，T，M，或V；G41替换为A，I，L，S，T，M，或V；Q42替换为N；D43替换为E；M44替换为A，G，I，L，S，T，或V；V45替换为A，G，I，L，S，T，或M；S46替换为A，G，I，L，T，M，或V；E48替换为D；A49替换为G，I，L，S，T，M，或V；T50替换为A，G，I，L，S，M，或V；N51替换为Q；S52替换为A，G，I，L，T，M，或V；S53替换为A，G，I，L，T，M，或V；S54替换为A，G，I，L，T，M，或V；S55替换为A，G，I，L，T，M，或V；S56替换为A，G，I，L，T，M，或V；F57替换为W，或Y；S58替换为A，G，I，L，T，M，或V；S59替换为A，G，I，L，T，M，或V；S61替换为A，G，I，L，T，M，或V；S62替换为A，G，I，L，T，M，或V；A63替换为G，I，L，S，T，M，或V；G64替换为A，I，L，S，T，M，或V；R65替换为H，或K；H66替换为K，或R；V67替换为A，G，I，L，S，T，或M；R68替换为H，或K；S69替换为A，G，I，L，T，M，或V；Y70替换为F，或W；N71替换为Q；H72替换为K，或R；L73替换为A，G，I，S，T，M，或V；Q74替换为N；G75替换为A，I，L，S，T，M，或V；D76替换为E；V77替换为A，G，I，L，S，T，或M；R78替换为H，或K；W79替换为F，或Y；R80替换为H，或K；K81替换为H，或R；L82替换为A，G，I，S，T，M，或V；F83替换为W，或Y；S84替换为A，G，I，L，T，M，或V；F85替换为W，或Y；T86替换为A，G，I，L，S，M，或V；K87替换为H，或R；Y88替换为F，或W；F89替换为W，或Y；L90替换为A，G，I，S，T，M，或V；K91替换为H，或R；I92替换为A，G，L，S，T，M，或V；E93替换为D；K94替换为H，或R；N95替换为Q；G96替换为A，I，L，S，T，M，或V；K97替换为H，或R；V98替换为A，G，I，L，S，T，或M；S99替换为A，G，I，L，T，M，或V；G100替换为A，I，L，S，T，M，或V；T101替换为A，G，I，L，S，M，或V；K102替换为H，或R；K103替换为H，或R；E104替换为D；N105替换为Q；Y108替换为F，或W；S109替换为A，G，I，L，T，M，或V；I110替换为A，G，L，S，T，M，或V；L111替换为A，G，I，S，T，M，或V；E112替换为D；I113替换为A，G，L，S，T，M，或V；T114替换为A，G，I，L，S，M，或V；S115替换为A，G，I，L，T，M，或V；V116替换为A，G，I，L，S，T，或M；E117替换为D；I118替换为A，G，L，S，T，M，或V；G119替换为A，I，L，S，T，M，或V；V120替换为A，G，I，L，S，T，或M；V121替换为A，G，I，L，S，T，或M；A122替换为G，I，L，S，T，M，或V；V123替换为A，G，I，L，S，T，或M；K124替换为H，或R；A125替换为G，I，L，S，T，M，或V；I126替换为A，G，L，S，T，M，或V；N127替换为Q；S128替换为A，G，I，L，T，M，或V；N129替换为Q；Y130替换为F，或W；Y131替换为F，或W；L132替换为A，G，I，S，T，M，或V；A133替换为G，I，L，S，T，M，或V；M134替换为A，G，I，L，S，T，或V；N135替换为Q；K136替换为H，或R；K137替换为H，或R；G138替换为A，I，L，S，T，M，或V；K139替换为H，或R；L140替换为A，G，I，S，T，M，或V；Y141替换为F，或W；G142替换为A，I，L，S，T，M，或V；S143替换为A，G，I，L，T，M，或V；K144替换为H，或R；E145替换为D；F146替换为W，或Y；N147替换为Q；N148替换为Q；D149替换为E；K151替换为H，或R；L152替换为A，G，I，S，T，M，或V；K153替换为H，或R；E154替换为D；R155替换为H，或K；I156替换为A，G，L，S，T，M，或V；E157替换为D；E158替换为D；N159替换为Q；G160替换为A，I，L，S，T，M，或V；Y161替换为F，或W；N162替换为Q；T163替换为A，G，I，L，S，M，或V；Y164替换为F，或W；A165替换为G，I，L，S，T，M，或V；S166替换为A，G，I，L，T，M，或V；F167替换为W，或Y；N168替换为Q；W169替换为F，或Y；Q170替换为N；H171替换为K，或R；N172替换为Q；G173替换为A，I，L，S，T，M，或V；R174替换为H，或K；Q175替换为N；M176替换为A，G，I，L，S，T，或V；Y177替换为F，或W；V178替换为A，G，I，L，S，T，或M；A179替换为G，I，L，S，T，M，或V；L180替换为A，G，I，S，T，M，或V；N181替换为Q；G182替换为A，I，L，S，T，M，或V；K183替换为H，或R；G184替换为A，I，L，S，T，M，或V；A185替换为G，I，L，S，T，M，或V；R187替换为H，或K；R188替换为H，或K；G189替换为A，I，L，S，T，M，或V；Q190替换为N；K191替换为H，或R；T192替换为A，G，I，L，S，M，或V；R193替换为H，或K；R194替换为H，或K；K195替换为H，或R；N196替换为Q；T197替换为A，G，I，L，S，M，或V；S198替换为A，G，I，L，T，M，或V；A199替换为G，I，L，S，T，M，或V；H200替换为K，或R；F201替换为W，或Y；L202替换为A，G，I，S，T，M，或V；M204替换为A，G，I，L，S，T，或V；V205替换为A，G，I，L，S，T，或M；V206替换为A，G，I，L，S，T，或M；H207替换为K，或R；或S208替换为A，G，I，L，T，M，或V。
但是，还优选具有非保守性氨基酸替换的KGF-2分子，包括：M1替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；W2替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；K3替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；W4替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；I5替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L6替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T7替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H8替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C9替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；A10替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S11替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A12替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F13替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；P14替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；H15替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L16替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P17替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；G18替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C19替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；C20替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；C21替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；C22替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；C23替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；F24替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L25替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L26替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L27替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F28替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L29替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V30替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S31替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S32替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V33替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P34替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；V35替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T36替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；C37替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；Q38替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；A39替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L40替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G41替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q42替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；D43替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；M44替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V45替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S46替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P47替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；E48替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A49替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T50替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N51替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；S52替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S53替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S54替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S55替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S56替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F57替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S58替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S59替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P60替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；S61替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S62替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A63替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G64替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R65替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；H66替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V67替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R68替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；S69替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y70替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；N71替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；H72替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L73替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q74替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G75替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；D76替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V77替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R78替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；W79替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；R80替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K81替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L82替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F83替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S84替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F85替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；T86替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K87替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y88替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；F89替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L90替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K91替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I92替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E93替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K94替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N95替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G96替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K97替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；V98替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S99替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G100替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T101替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K102替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K103替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E104替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N105替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；C106替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；P107替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；Y108替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；S109替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I110替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L111替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E112替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I113替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；T114替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S115替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V116替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E117替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I118替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；G119替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V120替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V121替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A122替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V123替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K124替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；A125替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；I126替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N127替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；S128替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N129替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；Y130替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Y131替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L132替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A133替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；M134替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N135替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K136替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K137替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G138替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K139替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L140替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y141替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；G142替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S143替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K144替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E145替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F146替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；N147替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；N148替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；D149替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；C150替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P；K151替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；L152替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K153替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E154替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R155替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；I156替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；E157替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；E158替换为H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N159替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G160替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y161替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；N162替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T163替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y164替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；A165替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S166替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；F167替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；N168替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；W169替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；Q170替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；H171替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N172替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G173替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R174替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q175替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；M176替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Y177替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；V178替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A179替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；L180替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；N181替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；G182替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；K183替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G184替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A185替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P186替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；R187替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R188替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；G189替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；Q190替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；K191替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；T192替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；R193替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；R194替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；K195替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；N196替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C；T197替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；S198替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；A199替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H200替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；F201替换为D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C；L202替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；P203替换为D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C；M204替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V205替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；V206替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C；H207替换为D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C；或S208替换为D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C。
替换突变可在此处所述任一检验中检测。特别优选具有保守性替换的KGF-2分子，其保持了野生型蛋白质的活性和性质；具有与野生型蛋白质相比增强的活性或性质，而其他活性或性质仍保持；或具有与野生型蛋白质相比一种以上的增强的活性或性质。相反，具有非保守性替换的KGF-2分子，优选地缺乏野生型蛋白质的活性和性质，而其他活性或性质仍保持；或缺乏野生型蛋白质的一种以上的活性或性质。
例如，在具有保守性或非保守性替换的KGF-2分子中可以被改变的KGF-2的活性或性质包括但不限于，角质形成细胞、上皮细胞、头发毛囊、肝细胞、肾细胞、乳腺组织、膀胱细胞、前列腺细胞胰腺细胞生长的刺激；肌肉细胞、神经组织、前列腺细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、乳腺组织分化的刺激；创伤愈合的促进；血管生成的刺激；炎症的缓解；细胞保护；肝素结合；配体结合；稳定性；溶解性；和/或影响纯化的性质。
通过本领域技术人员熟知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学，244：1081-1085(1989))可鉴定KGF-2中对功能至关重要的氨基酸。后一种方法在分子中的每个残基处导入单个丙氨酸突变，然后检测所得突变体分子的生物活性，如受体结合或体外和体内增殖活性(例见实施例10和11)。通过结构分析，如结晶作用，核磁共振或光亲和标记也可确定对配体-受体结合至关重要的位点(例见Smith等人，分子生物学杂志，224：899-904(1992)；和de Vos等人，科学，255：306-312(1992))。
本发明的另一方面是用丝氨酸替换氨基酸第37和106和150位的半胱氨酸。半胱氨酸的奇数数目意味着至少一个半胱氨酸残基可用于分子间交联或成键，所述交联或成键可导致蛋白质采取不符合需要的四级结构。一个或多个半胱氨酸被丝氨酸或例如丙氨酸所替换的新的KGF-2蛋白一般以较高得率的可溶的、正确折叠的蛋白质形式被纯化。尽管未被证实，但据信第106位的半胱氨酸残基对于功能是至关重要的，此半胱氨酸在所有其它FGF家族成员中是高度保守的。
本发明的另一方面是KGF-2与其它蛋白质或其片段的融合蛋白，如与其它FGF蛋白，如KGF(FGF-7)，bFGF，aFGF，FGF-5，FGF-6等的融合蛋白或杂合体。已报道了KGF(FGF-7)的这种杂合体。在公开的PCT申请号90/08771中，产生了由KGF的前40个氨基酸残基和aFGF的C-末端部分组成的嵌合蛋白。据报道该嵌合体象KGF一样靶向角质形成细胞，但缺乏对肝素的敏感性，后者是aFGF而不是KGF的特征。与免疫球蛋白(IgG)恒定区的部分融合而成的融合蛋白经常显示出增加的体内半寿期。由人CD4多肽前2个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的各个区域组成的嵌合蛋白已显示出这一点(欧洲专利申请，公开号为394827，Traunecker等人，自然，331，84-86(1988))。具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白也能更有效地结合单独的单体分子(Fountoulakis等人，生物化学杂志，270：3958-3964(1995))。
本发明的其他融合蛋白质可用基因改构、基元改构、外显子改构和/或密码子改构(一并称为“DNA改构”)技术来产生。DNA改构可用来调节本发明多肽的活性，这种方法可用于产生具有改变的活性之多肽，以及多肽的激动剂和拮抗剂。见美国专利5605793；5811238；5830721；5834252和5837458，以及Patten等，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33(1997)；Harayama，Trends biotechnol.16(2)：76-82(1998)；Hansson等，分子生物学杂志，287：265-76(1999)；以及Lorenzo和Blasco，生物技术，24(2)：308-13(1998)(在此各个全文引入作为参考)。在一个实施方案中，相应于SEQ ID NO：1的多肽以及由这些多核苷酸编码的多肽之改变可通过DNA改构实现。DNA改构包括通过同源或定点重组组装两个或多个DNA区段以产生多核苷酸序列中的变化。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸或编码的多肽可通过由差错倾向的PCR经历随机突变而被改变。在另一个实施方案中，编码本发明多肽的多核苷酸之一个或多个元件、基元、区段、部分、结构域、片段等可与一个或多个异源分子的元件、基元、区段、部分、结构域、片段等重组。KGF-2的抗原性/亲水部分
如图4A-4E所述，KGF-2蛋白中有4个主要的高度亲水性区域。即氨基酸残基Gly41-Asn71，Lys91-Ser109，Asn135-Tyr164和Asn181-Ala199[SEQ ID NO：25-28]。还有另外两个较短的推测抗原性区域，Gln74-Arg78和Gln170-Gln175。已知亲水性部分主要位于蛋白质的外部(表面)，因此，便于抗体识别这些区域。所述区域似乎也与KGF-2和其受体的结合相关。得自这些区域的合成肽可干扰KGF-2与其受体的结合，因此阻断了蛋白质的功能。得自该蛋白质亲水性部分的合成肽也可以是激动剂，即模拟KGF-2的功能。
因此，本发明进一步涉及含有KGF-2亲水性区域的分离的多肽，其中所述多肽的长度不超过150个氨基酸，优选不超过100，75或50个氨基酸，该多肽含有一个或多个上述KGF-2亲水性区域。带有表位的KGF-2部分
另一方面，本发明提供含本发明多肽之带表位部分的肽或多肽。此多肽的表位部分是本文所述多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”定义为当整个蛋白质作为免疫原时会引起体内抗体应答的蛋白质部分。另一方面，抗体可结合的蛋白质分子区定义为“抗原性表位”。蛋白质体内免疫原性表位数通常少于抗原性表位数。参阅，例如，Geysen等，美国国家科学院院报81：3998-4002(1983)。但是，抗体可制备成针对任一抗原性表位，无论其是否是免疫原性表位，方法是利用诸如噬菌体展示。见如Petersen G等，Mol.Gen.Genet.249：425-431(1995)。因此，本发明同时包括免疫原性表位和抗原性表位。
包含免疫原性表位的示范性氨基酸序列的清单示于表1。要指出表1仅列出了包含预期具有最高抗原产生活性的表位之氨基酸，这是利用Jameson和Wolf，(1988)Comp.Appl.Biosci.，4：181-186的算法得出的(此处引入作为参考)。Jameson-Wolf抗原分析是利用计算机程序使用默认参数进行的(Power MacIntosh，DNASTAR，Inc.，1228 South ParkStreet Madison，WI，版本3.11)。表1及未列在表1中的多肽的部分不认为是非免疫原性的。表1的免疫原性表位为示范性的清单，而不是排他性的清单，因为其他免疫原性表位仅仅因为所用的特定算法而未被识别。包含其他免疫原性表位的氨基酸残基可被利用类似于Jameson和Wolf分析的算法或利用本领域已知的用于抗原发生应答的方法体内检测而常规测定。见如Geysen等，出处同前；美国专利4708781；5194392；4433092和5480971(此处全文引入作为参考)。
在本发明中，带有抗原性表位的肽或多肽优选包括至少7个，更优选至少9个，最优选包含于本发明的多肽之氨基酸序列中的约15-30个氨基酸的序列。可用作KGF-2特异性抗体的抗原性肽或多肽的非限定性例子包括：含有SEQ ID NO：2中从约Gly41-Asn71；Lys91-Ser109；Asn135-Tyr164；Asn181-Ala199；Glin74-Arg78；和Glin170-Gln175。这些多肽片段已经证实含有KGF-2蛋白质的抗原性表位，方法是分析如上述图4中的Jameson-Wolf抗原性系数。
特别指出的是表1的氨基酸序列包含免疫原性表位。表1仅列举了由Jameson和Wolf分析所确定的免疫原性表位的关键残基。因此，在N-末端或C-末端或者N-和C-末端二者的其他侧翼残基可添加到表1中的序列产生带有表位的本发明的多肽。因此，表1的免疫原性表位可包括额外的N-末端或C-末端氨基酸残基。额外的侧翼氨基酸残基可为连续的侧翼N-末端和/或C-末端序列，包括来自本发明多肽的，异源多肽序列的，或可包括来自本发明多肽和异源多肽序列二者的连续侧翼序列。本发明的多肽包含长度至少为7个氨基酸残基的免疫原性或抗原性表位。“至少”表示本发明的多肽包含长度可为7个氨基酸残基的免疫原性或抗原性表位，或任何在7个氨基酸和本发明多肽之全长氨基酸残基数目之间的任何整数个氨基酸的长度。优选的多肽包含长度为至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100个氨基酸残基的多肽。但是，需指出每一个长度在7和全长氨基酸残基数目之间的多肽均包括在本发明中。
带有免疫原性和抗原性表位的片段可利用连续氨基酸残基明确化(如上述)，或进一步通过这些片段的N-末端和C-末端在SEQ ID NO：2上的位置来表示。能够占据SEQ ID NO：2的氨基酸序列之长度为例如至少7个或至少15个连续氨基酸残基的片段的每一N-末端或C-末端位置均包括在本发明中。再次，“长度为至少7个连续氨基酸残基”表示长度为7个氨基酸残基或任何在7个氨基酸和本发明多肽之全长多肽的氨基酸残基数目之间的任何整数。具体的，每一个在7和全长多肽的氨基酸残基数目之间的整数均包括在本发明中。
本发明的带有免疫原性和抗原性表位的多肽可用于例如制备特异性地与本发明多肽结合的抗体，和用于免疫检测中以检测本发明的多肽。抗体可例如用于本发明多肽的亲和纯化。抗体也可常规地用于多种定量或定性免疫检测，特别是利用本领域已知的方法用于本发明多肽的检测。见如Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，第2版，1988)。
本发明的带有表位的多肽可利用任何制备多肽的常规方法制备，包括本领域已知的合成和重组方法。例如，带有表位的肽可利用化学合成的已知方法合成。例如，Houghten已描述了一种合成大量肽的简单方法，诸如10-20mg的248个单独和独特的13残基肽，其代表HA1多肽的单一氨基酸变体的一个区段，所有这些残基肽均在不到4周内被制备和表征(利用ELISA型结合研究)(Houghten，R.A.，美国国家科学院院报，82：5131-5135(1985))。此“同时多重肽合成法(SMPS)”进一步在美国专利4631211(Houghten和同事)中描述。在此方法中，在分隔的溶剂可渗透型口袋中含有用于固相合成多种肽的单独的树脂，使得许多在固相方法中相同的重复步骤优化使用。一个完整的操作步骤允许同时进行500-1000或更多的合成(Houghten，R.A.，美国国家科学院院报，82：5131-5135(1985))。
本发明的带有表位的多肽可根据本领域周知的方法用于诱导抗体，包括但不限于体内免疫、体外免疫和噬菌体展示方法。见如Sutcliffe等，出处同前；Wilson等，出处同前；和Bittle等，普通病毒学杂志，66：2347-2354(1985)。如果使用体内免疫，动物可用游离肽免疫；但是，抗肽抗体的效价可利用将肽偶联于大分子载体(如匙孔槭血蓝蛋白(KLH)或破伤风类毒素)的方法加强免疫。例如，含有半胱氨酸残基的肽可利用如间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)的连接子偶联到载体上，而其他肽可利用更一般的连接剂(如戊二醛)偶联到载体。利用游离或载体偶联的肽免疫接种动物，如兔、大鼠和小鼠，方法是例如利用含有于100μg肽或载体蛋白以及福氏佐剂(或任何已知用于刺激免疫反应的其他佐剂)的乳液腹膜内和/或皮内注射。可需要数次加强免疫注射，例如以约两周间隔，以提供可被利用吸附到固相表面的游离肽例如ELISA检测的抗肽抗体的有用的效价。来自免疫动物血清中抗肽抗体的效价可通过抗肽抗体是筛选而增加，方法是例如利用肽对固体支持物的吸附以及根据本领域已知方法的所选抗体的洗脱。
本领域技术人员知晓，且如上所述，包含免疫原性或抗原性表位的本发明的多肽可被融合到其他多肽序列上。例如，本发明的多肽可与免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgM)的恒定区或其部分(CH1，CH2，CH3，或其任意组合和其部分)融合，得到嵌合多肽。这种融合蛋白质可促进纯化且可增加体内的半寿期。这已经由这样的蛋白质所证实：由人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链之恒定区的多个结构域组成的嵌合蛋白质。见，如EP394827；Traunecker等，自然，331：84-86(1988)。对于偶联于FcRn结合配偶体(partner，如IgG或Fc片段)的抗原已证实了具有增强的抗原跨表皮屏障向免疫系统的递送(见，如PCT公开文本WO 96/22024和WO 99/04813)。由于IgG部分二硫键而具有二硫键连接的二聚结构IgG融合蛋白质也发现在结合及中和其他分子方面比仅仅是单体多肽或其片段更有效。见，如，Fountoulakis等，生物化学杂志，270：3958-3964(1995)。编码上述表位的核酸也可作为表位标签(tag)与目标基因重组(例如血凝素(HA)标签或flag标签)以帮助表达的多肽之检测和纯化。例如，由Janknecht等描述的系统允许对在人类细胞系中表达的非变性融合蛋白质的方便的纯化(Janknecht等，1991，美国国家科学院院报，88：8972-897)。在该系统中，将目标基因亚克隆入牛痘重组质粒，使得基因的开放阅读框架翻译性融合到由6组氨酸残基组成的氨基末端标签。标签用做一种用于融合蛋白质的基质结合结构域。用重组痘苗病毒感染的细胞之提取物上样于Ni2+次氮基乙酸-琼脂糖柱且组氨酸标记的蛋白质可被选择性的用含咪唑的缓冲液洗脱。化学修饰
可进一步修饰KGF野生型和类似物以使其含有非蛋白质的正常部分的其它化学组成成分。那些衍生化的组成成分可改善该蛋白质的溶解性、生物半寿期或吸附作用。所述组成成分也可以减少或消除该蛋白质任何不必要的副作用等等。有关这些组成成分的综述例见REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Mack出版公司，Easton，PA(1990)。聚乙二醇(PEG)是一种已用于制备治疗用蛋白质的这类化学组成成分。PEG与蛋白质的结合已显示出可保护蛋白质使之免受蛋白酶水解，Sada等人，发酵生物工程杂志，71：137-139(1991)。可使用多种方法来结合某些PEG组成成分，例见Abuchowski等人，《用作药物的酶》(Holcerberg和Roberts编)，p367-383(1981)。很多公开的专利描述了PEG衍生物和如何制备它们的方法，例见Ono等人，美国专利5,342,940；Nitecki等人，美国专利5,089,261；Delgado等人，美国专利5,349,052。通常，PEG分子通过蛋白质上的反应性基团与该蛋白质连接。相对而言，氨基基团，如赖氨酸上的氨基基团或蛋白质的氨基末端便于这种结合。
有关“多肽和肽”这一章中提及的每篇文献，其全文列入本文作为参考。
此外，本发明的多肽可以利用本领域已知的方法化学合成(例如，见Creighton，1983，蛋白质：结构和分子原理，W.H.Freeman & Co.，N.Y.，和Hunkapiller，M.等，1984，自然，310：105-111)。例如，相应于本发明KGF-2多肽的片段之肽可利用肽合成仪合成。此外，如需要，可将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物作为替代或添加导入KGF-2多肽序列。非经典氨基酸包括但不限于，常见氨基酸的D-异构体，2，4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正戊氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，同型瓜氨酸，胱氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己丙氨酸，β-丙氨酸，氟氨基酸，设计物氨基酸，如β-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，和通常的氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)。
本发明还构思了在翻译过程中或翻译后被不同地修饰的KGF-2多肽，例如，被糖基化，酰化，磷酸化，酰胺化，有已知的保护/封闭基团衍生化，蛋白切割，与抗体分子或其他细胞配体连接，等。可利用已知技术进行多种化学修饰的任何一种，包括但不限于，利用溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特异性化学裂解；乙酰化，甲酰化，氧化，还原；在衣霉素存在下代谢性合成；等。
本发明构思的其他翻译后修饰包括，例如，N-联或O-联糖链，N-末端或C-末端的加工)，化学基团向氨基酸骨架的附着，N-联或O-联糖链的化学修饰，以及N-末端甲硫氨酸残基作为原核宿主细胞表达结果的添加或缺失。多肽也可用可检测的标记修饰，诸如酶、荧光素、同位素或亲和标记，用于蛋白质的检测和分离。
本发明还提供了KGF-2的化学修饰的衍生物，其可提供额外的优点，例如多肽之增加的溶解度、稳定性和循环时间，或降低的免疫原性(见如美国专利4179337)。用于衍生化的化学基团可选自水溶性聚合物，诸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等。多肽也可被在分子内的随机位置上修饰，或在分子内预定的位置上修饰，且可包括一个、两个、三个或多个附着的化学基团。
聚合物可以是任何分子量，且可以是分支或不分支的。对于聚乙二醇，优选的分子量为约1kDa-100kDa之间(术语“约”表明在聚乙二醇制备中，有些分子会比标准分子量高些或低些。)以便于处理和操作。其他大小也可采用，取决于期望的治疗曲线(例如，期望的缓释持续时间，对生物活性的效果(如果有的话)，处理的容易程度，抗原性的程度和有无，以及其他聚乙二醇对治疗蛋白质或类似物的已知作用)。
聚乙二醇分子(或其他化学基团)应当与蛋白质结合，同时考虑对蛋白质的功能或抗原结构域的作用。本领域已有多种用于连接的方法，例如，EP0401384，在此引入作为参考(偶联PEG至G-CSF)，也参见Malik等，Exp.Hematol.，20：1028-1035(1992)(报道了利用三氟乙磺酰氯对GM-CSF的PEG化)。例如，聚乙二醇可通过反应基团，如自由的氨基或羧基通过氨基酸残基共价连接。反应基团是那些活化的聚乙二醇分子可连接的那些。具有自由氨基的氨基酸残基可包括赖氨酸残基和N-末端氨基酸残基；具有自由羧基的那些可包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C-末端残基。巯基基团也可用做反应基团用于结合聚乙二醇分子。优选用于治疗目的是在氨基的连接，如在N-末端或赖氨酸基团的连接。
人们可能特别期望在N-端化学修饰的蛋白质。利用聚乙二醇作为本发明组合物的例子，可以选择多种聚乙二醇分子(通过分子量，分支等)，聚乙二醇分子与蛋白质(或多肽)分子在反应混合物中的比例，待进行的聚乙二醇化类型，和获得所选N-末端聚乙二醇化蛋白质的方法。获得N-末端聚乙二醇化制备的方法(即：将此基团与其他单聚乙二醇化基团分离，如需要)可以是通过从多种聚乙二醇化蛋白质分子中纯化N-末端聚乙二醇材料在N-末端修饰之选择性化学修饰蛋白质可利用还原烷基化进行，方法中利用了在特定蛋白质衍生化中可用的不同类型的伯氨基团(赖氨酸对N-末端)的不同反应性。在适当的反应条件下，可基本上实现在N-末端的蛋白质用羧基基团的选择性衍生化。抗体
本发明进一步的多肽涉及与本发明的SEQ ID NO：2的多肽、多肽片段或变体和/或与表位免疫特异性结合的抗体和T细胞抗原受体(TCR)如本领域已知的针对特异性抗体-抗原结合的分析之免疫检测测定)。本发明的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、多重特异性、人、人源化或嵌合的抗体，单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、由Fab片段表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗本发明的抗体之抗Id抗体)和任意上述带有表位的片段。术语“抗体”如此处所用，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，即：含有免疫特异性结合一种抗原的抗原结合位点之分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任意类型的(例如，IgG，IgA，IgD，IgE，或IgM和IgY)、分型(如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)和免疫球蛋白分子的亚型。
最优选的抗体是本发明的人抗原结合抗体片段，包括但不限于Fab，Fab’，F(ab’)2，Fd，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗原结合抗体的片段(包括单链抗体)可包括单独的可变区，或与完整或部分的如下分子相组合：铰链区，CH1，CH2和CH3结构域。本发明还包括可变区与铰链区，CH1，CH2和CH3结构域的任意组合。抗体可为任何动物来源的，包括鸟类和哺乳动物类。优选的，抗体是人，鼠(包括大鼠和小鼠)，驴、ship兔，山羊，豚鼠，骆驼，马或鸡。此处所用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白文库中分离的抗体或从动物中分离，所述动物利用一种或多种人免疫球蛋白转基因且不表达内源免疫球蛋白(如下所述)，例如美国专利5939598(Kucherlapati等)所述。
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或者更高的多重特异性。多重特异性抗体可对本发明的多肽之不同的表位具有特异性，或可对本发明的多肽以及对异源组分(如异源多肽或固体支持物材料)均具有特异性。见如WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt，A，等，(1991)免疫学杂志，147：60-69；美国专利5573920，4474893，5601819，4714681，4925648；Kostelny，S.A.等，(1992)免疫学杂志，148：1547-1553。
本发明的抗体可用本发明的多肽之表位或部分来描述或明晰，所述表位或部分可被抗体识别或特异性结合。表位或多肽部分可如此处所述明晰，例如，通过N-末端和C-末端位置，通过相邻氨基酸残基的大小，或如表和图中所罗列的方法。优选的本发明的表位包括：SEQ ID NO：2的氨基酸41-71，91-109，135-164，181-199，74-78和170-175，以及编码这些表位的多核苷酸。特异性结合任意本发明表位或多肽的抗体也可被排除。因此本发明包括特异性结合本发明多肽的抗体，且允许这些抗体被排除。
本发明的抗体也可被用其交叉反应性来描述或明晰。包括了不与本发明的多肽之任何其他类似物、定向进化同源物或同源物结合的抗体。不与同本发明的多肽低于如下同一性的多肽相结合的抗体也包括在本发明中：低于95％，低于90％，低于85％，低于80％，低于75％，低于70％，低于65％，低于60％，低于55％，低于50％(如利用此处所述的方法或本领域已知的方法计算)。在一个特定实施方案中，本发明的抗体与人类蛋白质和其相应的表位之小鼠、大鼠和/或兔同源物交叉反应。不与同本发明的多肽低于如下同一性的多肽相结合的抗体也包括在本发明中：低于95％，低于90％，低于85％，低于80％，低于75％，低于70％，低于65％，低于60％，低于55％，低于50％(如利用此处所述的方法或本领域已知的方法计算)。在一个特定实施方案中，上述交叉反应性是任一单一抗原性或免疫原性多肽，或是此处公开的2，3，4，5或更多特定抗原性和/或免疫原性多肽的组合。还包括在本发明中的是仅于由这样的多核苷酸编码的多肽结合的抗体，其中所述多核苷酸在严谨条件下(如此处所述)可与本发明的多核苷酸杂交。本发明的抗体也可用其结合亲和性描述或明晰。优选的结合亲和性包括那些具有低于如下所述值的解离常数或Kd的那些：5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，或10-15M。
本发明还提供了竞争性抑制一种抗体与本发明的表位结合的抗体，所述抑制利用本领域周知的用于确定竞争性结合的任一方法测定，例如此处所述的免疫检测。在优选的实施方案中，抗体竞争性抑制与表位的至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，至少50％的结合。
本发明的抗体具有如下用途，包括但不限于，本领域已知的纯化、检测和靶定本发明的多肽的方法，包括体外和体内的诊断和治疗方法。例如，抗体具有在免疫检测中的用途用于定性和定量测定本发明多肽在生物学样品中的水平。见如，Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，2版，1988)(此处引入作为参考)。
本发明的抗体也可单独或与其他组分结合使用。抗体可进一步与异源多肽在N-或C-末端融合，或与多肽或其他组分化学偶联(包括共价的和非共价的偶联)。例如，本发明的抗体可与用做检测分析中的标记之分子和效应物分子(如异源多肽、药物或毒素)重组融合或偶联。见如WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利5314995和EP0396387。
本发明的多肽可利用本领域已知的任何适当的方法制备。例如，本发明的多肽或其抗原性片段可被施用于动物，以诱导含有多克隆抗体的血清的产生。术语“单克隆抗体”是指来自单一克隆的抗体，包括真核、原核或噬菌体克隆，而不是由产生该克隆的方法制备。单克隆抗体可利用多种本领域已知的方法制备，包括利用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。
杂交瘤技术包括本领域周知的技术，如Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，2版，1988；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤，563-681(Elsevier，N.Y.，1981)中教导(此处全文引入作为参考)。Fab和F(ab’)2片段可使用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胰蛋白酶(产生F(ab’)2片段)利用蛋白质切割制备。
或者，本发明的抗体可通过应用重组DNA技术和噬菌体展示技术或通过利用本领域已知的合成方法制备。例如，本发明的抗体可利用多种本领域已知的噬菌体展示技术制备。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在带有编码本发明抗体的多核苷酸序列之噬菌体颗粒的表面。具有期望的结合性质的噬菌体从文库或组合抗体库中筛选(例如人或鼠)，方法是用抗原直接筛选，一般是抗原结合或被捕获到固体表面或珠上。用在这些方法中的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括带有与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组地融合的Fab，Fv或二硫键稳定化的Fv抗体结构域。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括在如下中公开的那些：Brinkman等，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等，Gene 187：9-18(1997)；Burton等，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT公开文本PCT/GB91/01134；PCT公开文本WO 90/02809；WO 91/10737；WO92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；以及美国专利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；(此处全文引入作为参考)。
如上述文献所述，在噬菌体筛选后，来自噬菌体的抗体编码区可被分离，且用于产生完整抗体，包括人类抗体，或任何其他期望的抗原结合片段，并在任何期望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，酵母和细菌。例如，用于重组产生Fab，Fab’和F(ab’)2片段的技术可利用本领域已知的那些方法，见如WO 92/22324；Mullinax，R.L.等(1992)生物技术，12(6)：864-869；和Sawai，H等(1995)，AJRI34：26-34；和Better，M.等，(1988)科学，240：1041-1043(此处引入作为参考)。
可用于制备单链Fv和抗体的技术的例子包括那些公开在美国专利4,946,778和5258498；Huston等，酶学方法，203：46-88(1991)；shu等，PNAS，90：7995-7999(1993)；和Skerra等，科学，240：1038-1040(1988)。对于一些用途，包括抗体在人体内的应用和体外检测分析，优选地使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是这样一种分子，其中抗体的不同部分来源于不同的动物种类，诸如抗体具有来自鼠单克隆抗体的可变区，以及人免疫球蛋白恒定区。用于产生嵌合抗体的方法为本领域已知，例如见Morrison等，科学229：1202(1985)；Oi等，生物技术，4：214(1986)；Gillies等，(1989)免疫方法杂志，125：191-202；美国专利5807715；4816567和4816397，在此引入作为参考。人源化抗体是来自非人种类的抗体分子：其具有来自非人种类的一种或多种互补决定区(CDR)的期望的抗原，以及一个来源于人免疫球蛋白分子的框架区。通常，人框架区中的框架分子可用来自CDR供体的相应残基替代，以改变，优选地改善抗原结合。这些框架替换可通过本领域已知的方法鉴定，例如CDR与框架残基的相互作用建模，以鉴定对于抗原结合重要的框架残基，和序列比较以鉴定在特定位置的非常用框架残基(见，如Queen等，美国专利5585089；Riechmann等，自然，332：323(1988)，在此引入作为参考)。可利用多种本领域知晓的方法人源化抗体，包括例如CDR-移植(EP239400；PCT公开文本WO91/09967；美国专利5225539；5530101和5585089)，修饰(veneering)或表面重建(resurfacing)(EP592106；EP 519596；Padlan，分子免疫学，28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，蛋白质工程，7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS91：969-973(1994))和链改构(shuffling)(美国专利5565332)。人抗体可用本领域已知的多种方法制备，包括如上述的噬菌体展示技术。参见，如美国专利4444887；和4716111；和PCT公开文本WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO96/33735和WO 91/10741；在此引入作为参考。
本发明的抗体还可作为本发明多肽的拮抗剂或激动剂。例如，本发明包括部分或全部破坏受体/配体与本发明的多肽相互作用的抗体。优选地，本发明的抗体结合此处公开的抗原性表位，或其部分。本发明包括了受体特异性抗体和配体特异性抗体。本发明还包括了不阻止配体结合但阻止受体活化的受体特异性抗体。受体活化(即：信号传递)可利用此处所述的技术或本领域周知的技术测定。例如，受体活化可利用免疫沉淀检测受体或其底物的磷酸化(例如酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸)随后是Western印迹分析(例如，出处同前)来确定。在一个特定的实施方案中，提供了可抑制在缺乏抗体时配体活性或受体活性之至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，至少50％的抗体。
本发明还包括受体特异性抗体(其既阻止配体结合和受体活化)，以及识别受体配体复合物的抗体，且优选不特异性识别未结合的受体或未结合的配体。类似地，本发明包括了中和抗体，其结合配体，并阻止配体与受体的结合，以及结合配体由此阻止受体活化(但不阻止配体结合受体)的抗体。这些抗体可作为受体激动剂，即：增效或活化配体介导的受体活化之生物活性的全部或部分，例如通过诱导受体的二聚化。抗体可明晰为生物活性的激动剂、拮抗剂或反向激动剂，所述生物活性包括此处公开的本发明的肽之特定的生物活性。上述抗体激动剂可利用本领域周知的方法制备。见PCT公开文本WO96/40281；美国专利5811097；Deng等，Blood 92(6)：1981-1988(1998)；Chen等，Cancer Res.58(16)：3668-3678(1998)；Harrop等，J.Immunol.161(4)：1786-1794(1998)；Zhu等，Cancer Res.58(15)：3209-3214(1998)；Yoon等，J.Immunol.160(7)：3170-3179(1998)；Prat等，J.Cell.Sci.111(Pt2)：237-247(1998)；Pitard等，J.Immunol.Methods 205(2)：177-190(1997)；Liautard等，Cytokine 9(4)：233-241(1997)；Carlson等，J.Biol.Chem.272(17)：11295-11301(1997)；Taryman等，Neuron 14(4)：755-762(1995)；Muller等，Structure 6(9)：1153-1167(1998)；Bartunek等，Cytokine8(1)：14-20(1996)。此处引入作为参考。
本发明的抗体具有如下用途，包括但不限于，例如本领域已知的纯化、检测和靶定本发明的多肽的方法，包括体外和体内的诊断和治疗方法。例如，抗体具有在免疫检测中的用途用于定性和定量测定本发明多肽在生物学样品中的水平。见如，Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，2版，1988)(此处引入作为参考)。在一个优选实施方案中，KGF-2的水平在一个纯化的样品中利用山羊和鸡抗体(见下面实施例50)检测。
本发明的抗体也可单独或与其他组分结合使用。抗体可进一步与异源多肽在N-或C-末端融合，或与多肽或其他组分化学偶联(包括共价的和非共价的偶联)。例如，本发明的抗体可与用做检测分析中的标记之分子和效应物分子(如异源多肽、药物或毒素)重组融合或偶联。见如WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利5314995和EP0396387。
本发明的抗体包括如下修饰的衍生物，即通过共价结合任一类型的分子到抗体，使得共价结合不阻止抗体产生抗独特型反应。例如，但不是限制性的，抗体衍生物包括具有如下修饰的抗体，包括糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保护基团/封闭基团的衍生化、蛋白质切割、连接到细胞配体或其他蛋白质等。可利用本领域抑制的技术进行任一多种化学修饰，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢性合成等。另外，衍生可含有一个或多个非经典氨基酸。
本发明的抗体可利用本领域已知的适当方法制备。针对目标抗原的多克隆抗体可利用本领域已知的多种方法制备。例如，本发明的多肽可施用于多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等以诱发含有对该抗原特异的多克隆抗体之血清的产生。可利用多种佐剂增加免疫反应，取决于宿主种类，包括但不限于，弗氏(完全和不完全)佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔槭血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人类佐剂，如BCG(bacillecalmette-Guerin)和Corynebacterium parvum。这类佐剂为本领域周知。
本发明的单克隆抗体可利用本领域已知的任何适当的方法制备。包括利用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合。例如可利用杂交瘤技术包括那些本领域已知的方法和教导制备单克隆抗体，例如在Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版社，2版，1988)；Hammerling等，单克隆抗体和T-细胞杂交瘤563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述文献此处引入作为参考)。术语“单克隆抗体”在此处所用不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指一种来源于一种单一克隆，例如任一原核的、真核的或噬菌体克隆，且不是其所产生的方法。
利用杂交瘤技术制备和筛选特异性抗体的方法为本领域已知的常规方法，且在实施例中详细描述。在非限定性实施例中，小鼠用本发明的多肽或表达该多肽的细胞免疫。一旦检测到免疫反应，例如在小鼠血清中检测到特异于抗原的抗体，则收获小鼠脾脏，分离脾细胞。然后利用已知的技术将脾细胞与适当的杂交瘤细胞融合，例如与来自ATCC的细胞系SP20融合。利用有限稀释法筛选并克隆杂交瘤。然后利用本领域已知技术分析杂交瘤克隆中分泌能结合本发明多肽的抗体之细胞。可利用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠以产生通常含有高水平抗体的腹水。
因此，本发明提供了产生单克隆抗体的方法，以及由如下方法产生抗体的方法，包括：培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选地杂交瘤由从用本发明的抗原免疫之小鼠分离的脾细胞同骨髓瘤细胞融合而产生，然后筛选由融合得到的杂交瘤之分泌能结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆。
识别特异性表位的抗体片段可利用已知技术产生。例如，本发明的Fab和F(ab’)2片段可使用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胰蛋白酶(产生F(ab’)2片段)利用蛋白质切割免疫球蛋白分子制备。F(ab’)2含有可变区，轻链恒定区和重链的CH1结构域。
例如，本发明的抗体可利用多种本领域已知的噬菌体展示技术产生。在噬菌体展示方法中，在带有编码功能性抗体结构域的多核苷酸序列之噬菌体颗粒表面上展示了该功能性抗体结构域。在一个特定实施方案中，这种噬菌体可用于展示从“药库”或组合抗体文库(例如，人和鼠)中表达的抗原结合结构域。表达与目标抗原结合的抗原结合结构域之噬菌体可利用抗原筛选或鉴定，例如使用标记的抗原或结合(或俘获)到固相表面或珠上的抗原。用于这些方法中的噬菌体一般为丝状噬菌体，包括fd和M13结合结构域，其从这样的噬菌体中表达：带有Fab、Fv或二硫键稳定化的Fv抗体结构域(与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组性融合)之噬菌体。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括那些公开在如下文献中的：Brinkman U.等，(1995)J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames，R.S.等，(1995)J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough，C.A.等，(1994)Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic，L.等，(1997)Gene187：9-18；Burton，D.R.等，(1994)Advances in Immunology 57：191-280；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利5,698,426，5,223,409，5,403,484，5,580,717，5,427,908，5,750,753，5,821,047，5,571,698，5,427,908，5,516,637，5,780,225，5,658,727及5,733,743；此处全文引入作为参考
如上述文献所述，噬菌体筛选后，来自噬菌体的抗体编码区可被分离并用于产生完整抗体，包括人类抗体，或任何其他期望的抗体结合片段，并表达在任一期望的宿主，包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌等，如下面详述。例如，重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术可以利用本领域已知的方法采用，例如那些公开在PCT公开文本WO92/22324；Mullinax等，生物技术，12(6)864-869；和Sawai等，AJRI，34：26-34(1995)；和Better等，科学，240：1041-1043(1998)(此处全文引入作为参考)。
可用于制备单链Fv和抗体的技术的例子包括那些公开在美国专利4946778和5258498；Huston等，酶学方法，203：46-88(1991)；shu等，PNAS，90：7995-7999(1993)；和Skerra等，科学，240：1038-1040(1988)。对于一些用途，包括抗体在人体内的应用和体外检测分析，优选地使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是这样一种分子，其中抗体的不同部分来源于不同的动物种类，诸如抗体具有来自鼠单克隆抗体的可变区，以及人免疫球蛋白恒定区。用于产生嵌合抗体的方法为本领域已知，例如见Morrison等，科学229：1202(1985)；Oi等，生物技术，4：214(1986)；Gillies等，(1989)免疫方法杂志，125：191-202；美国专利5807715；4816567和4816397，在此引入作为参考。人源化抗体是来自非人种类的抗体分子：其具有来自非人种类的一种或多种互补决定区(CDR)的期望的抗原，以及一个来源于人免疫球蛋白分子的框架区。通常，人框架区中的框架分子可用来自CDR供体的相应残基替代，以改变，优选地改善抗原结合。这些框架替换可通过本领域已知的方法鉴定，例如CDR与框架残基的相互作用建模，以鉴定对于抗原结合重要的框架残基，和序列比较以鉴定在特定位置的非常用框架残基(见，如Queen等，美国专利5585089；Riechmann等，自然，332：323(1988)，在此引入作为参考)。可利用多种本领域知晓的方法人源化抗体，包括例如CDR-移植(EP239400；PCT公开文本WO91/09967；美国专利5225539；5530101和5585089)，修饰(veneering)或表面重建(resurfacing)(EP592106；EP 519596；Padlan，分子免疫学，28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，蛋白质工程，7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS91：969-973(1994))和链改构(shuffling)(美国专利5565332)。
完整的人抗体特别期望用于人类患者的治疗性处理。人抗体可利用多种本领域已知方法制备，包括上面描述的利用来自人免疫球蛋白分子的抗体文库之噬菌体展示方法。见，如美国专利4444887；和4716111；和PCT公开文本WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741；在此引入作为参考。
人类抗体也可利用转基因小鼠制备，所述小鼠不能表达有功能的内源性免疫球蛋白，但是能表达人免疫球蛋白基因。例如，可随机引入或通过同源重组方法将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物导入小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因之外，将人可变区、恒定区和多变区导入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可为非功能性的分别引入，或用同源重组方法与人免疫球蛋白基因座引入。特别地，JH区的纯合性缺失防止了内源性抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射入胚泡中产生嵌合小鼠。然后培育嵌合小鼠产生表达人抗体的纯合后代。用所选抗原(例如，所有或部分本发明的多肽)用常规方法免疫转基因小鼠。可利用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化中重新排列(rearrange)，随后经历了类型转换合体细胞突变。因此，利用这类技术，可能制备治疗上有用的IgG，IgA，IgM和IgE抗体。关于制备人类抗体的技术综述，参见Lonberg和Huszar，国际免疫学综述，13：65-93(1995)。对于制备人抗体和人单克隆抗体的技术以及制备这类抗体的方案的详细讨论见例如，PCT公开文本WO 98/24893；WO92/01047；WO 96/33735；欧洲专利0598877；美国专利5413923；5625126；5633425；5569825；5661016；5545806；5814318；5885793；5916771和5939598，在此引入作为参考。此外，诸如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和GenPharm(San Jose，CA)可用类似于上述的方法来提供针对所选抗原的人抗体。
可利用称为“指导性选择”的技术产生识别所选表位的完整人抗体。在此方法中，所选的非人单克隆抗体例如鼠抗体可用于指导识别相同表位的完整人抗体的选择(Jespers等，生物/技术，12：899-903)。
此外，针对本发明多肽的抗体可反过来用于产生“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体，方法是利用本领域已知的技术(见，如Greenspan & Bona，FASEB J.7(5)：437-444(1989)和Nissinoff，免疫学杂志，147：(8)2429-2438(1991))。例如，可利用结合且竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明多肽与配体结合之抗体来产生这样的抗独特型，其“模拟”多肽聚合化和/或结合结构域(以及作为结果)结合并中和多肽和/或其配体。这类中和抗独特型或这类抗独特型的Fab片段可用于治疗方案中以中和多肽配体。例如，这类抗独特型抗体可被用于结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，由此阻断其生物学活性。
本发明还涉及作为本发明多肽之激动剂或拮抗剂的抗体。作为本发明多肽之激动剂或拮抗剂的抗体包括例如，部分或全部破坏本发明的多肽与受体/配体相互作用的抗体。例如，本发明包括破坏本发明蛋白质多聚化能力的抗体。在另一例中，本发明包括允许本发明蛋白质多聚化但是破坏本发明蛋白质与一种或多种KGF-2受体/配体结合的能力的抗体。在另一例中，本发明包括允许本发明蛋白质多聚化且与一种或多种KGF-2受体/配体结合，但是阻断与KGF-2受体/配体复合物相关的生物活性的能力的抗体。
作为本发明多肽之激动剂或拮抗剂的抗体还包括受体特异性抗体和配体特异性抗体。包括不阻断配体结合但是阻断受体活化的受体特异性抗体。受体活化(即信号传递)可利用此处所述的技术测定或用本领域已知的技术完成。还包括既阻断配体结合又阻断受体活化的受体特异性抗体。类似地，包括结合配体并阻止配体与受体结合的中和抗体，以及结合配体，由此阻止受体活化但是不阻止配体结合受体的抗体。也包括活化受体的抗体。这些抗体可作为由配体介导的受体活化所实现的全部或不足全部的生物活性之激动剂。这些抗体可表示为生物活性(包括此处所述的特定活性)之激动剂或拮抗剂。上述抗体激动剂可利用本领域已知方法制备，见如PCT公开文本WO 96/40281；美国专利5,811,097；Deng等，Blood92(6)：1981-1988(1998)；Chen等，Cancer Res.58(16)：3668-3678(1998)；Harrop等，J.Immunol.161(4)：1786-1794(1998)；Zhu等，Cancer Res.58(15)：3209-3214(1998)；Yoon等，J.Immunol.160(7)：3170-3179(1998)；Prat等，J.Cell.Sci.111(Pt2)：237-247(1998)；Pitard等，J.Immunol.Methods 205(2)：177-190(1997)；Liautard等，Cytokine9(4)：233-241(1997)；Carlson等，J.Biol.Chem.272(17)：11295-11301(1997)；Taryman等，Neuron 14(4)：755-762(1995)；Muller等，Structure 6(9)：1153-1167(1998)；Bartunek等，Cytokine 8(1)：14-20(1996)，此处引入作为参考。
如上述，针对本发明KGF-2蛋白质的抗体可反过来利用本领域已知的技术用于产生“模拟”KGF-2的抗独特型抗体。(见如Greenspan & Bona，FASEB J.，7(5)：437-444；(1989)和Nissionff，免疫学杂志，147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合KGF-2且竞争性抑制KGF-2多聚化和/或结合至配体的抗体可用于产生“模拟”KGF-2多聚化和/或结合结构域的抗独特型抗体，且作为结果，结合并中和KGF-2和/或其配体。这类抗独特型抗体或其Fab片段可用在治疗方案中以中和KGF-2配体。例如这类抗独特型抗体可用于结合KGF-2，或结合KGF-2配体/受体，由此阻断KGF-2的生物学活性。编码抗体的多核苷酸
本发明还包括包含编码本发明抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也包括在严谨或低度严谨杂交条件下(例如，如前述)可与编码抗体(优选地特异性结合于本发明多肽的抗体，优选地，结合于具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列之多肽的抗体)杂交的多核苷酸。
可获得多核苷酸并利用本领域知晓的任一方法确定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果知晓抗体的核苷酸序列，编码抗体的多核苷酸可由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier等，生物技术，17：242(1994)中所述)，其，简言之，包括含有编码抗体之序列部分的重叠寡核苷酸的合成，将这些寡核苷酸退火并连接，然后利用PCR扩增所连接的寡核苷酸。
或者，可从适当来源的核苷酸中产生编码抗体的多核苷酸。如果含有编码特定抗体的核苷酸之克隆不可得，但是抗体分子的序列已知，可化学合成或从适当的来源获得编码免疫球蛋白的核苷酸(例如，从抗体CDNA文库，或从核酸(优选poly A+RNA)产生的cDNA文库中，所述核酸从表达该抗体的任何组织或细胞(如筛选用来表达本发明抗体的杂交瘤)中分离。)，方法是利用可与序列的3’和5’末端杂交的合成引物进行PCR扩增，或利用特异于特定基因序列的寡核苷酸探针克隆，以鉴定例如来自cDNA文库的编码该抗体的cDNA克隆。由PCR产生的扩增核苷酸可利用本领域周知的任一方法被克隆到可复制克隆载体中。
一旦抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列测定，抗体的核苷酸序列可利用本领域周知的核苷酸序列操作方法加以操作，例如重组DNA技术，定点突变，PCR等(见，例如，Sambrook等，1990，分子克隆：实验室手册，2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY和Ausubel等编，1998，分子生物学现代方法，John Wiley & Sons，NY，均在此引入作为参考)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸替换、缺失和/或插入。
在特定实施方案中，重链和/或轻链可变区结构域的氨基酸序列可利用本领域周知的方法(例如，与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较以确定高可变区序列的区域)被研究，以鉴定互补性决定区(CDR)。利用常规的重组DNA技术，可在框架区中插入一个或多个CDR，例如，插入人框架区以人源化非人类抗体，如前述。框架区可为天然存在的或共有序列的框架区，且优选为人框架区(见如，Chothia等，分子生物学杂志，278：457-479(1998)给出了人框架区的列表)。优选的，由框架区与CDR之组合产生编码特异性结合本发明多肽之抗体。优选的，如上述，可在框架区内进行一个或多个氨基酸替换，且优选地，氨基酸替换改善了抗体与其抗原的结合。此外，这种方法可用于进行一个或多个参与链间二硫键的可变区半胱氨酸的替换或删除，以产生缺乏一个或多个链间二硫键的抗体分子。其他多核苷酸的改变也包括在本发明的范围中且为本领域技术人员知识范围内。
此外，可使用制备“嵌合抗体”的技术(Morrison等，美国国家科学院院报，81：851-855(1984)；Neuberger等，自然，312：604-608(1984)；Takeda等，自然，314：452-454(1985))，方法是将合适的抗原特异性之来自鼠抗体分子的基因与具有适当的生物学活性的人抗体分子基因一起剪接。如前述，嵌合抗体是一种不同部分来自与不同动物种类的分子，如那些具有来自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子，例如人源化抗体。
或者，可采用制备单链抗体的技术(美国专利，4946778；Bird，科学，242：423-42(1988)；Houston等，美国国家科学院院报，85：5879-5883(1988)；和Ward等，自然，334：544-54(1989))制备单链抗体。单链抗体可通过将Fv区的重链和轻链片段用氨基酸桥连接来形成，得到单链多肽。用于在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术也可采用(Skerra等，科学，242：1038-1041(1988))。制备抗体的方法
本发明的抗体可利用本领域已知的用于合成抗体(特别是用化学合成或优选的重组表达技术)任何方法制备。
本发明抗体或其片段、衍生物或其类似物(例如本发明抗体的重链或轻链或本发明的单链抗体)的重组表达需要含有编码该抗体的多核苷酸之表达载体的构建。一旦获得编码本发明抗体分子或抗体的重链/轻链或其部分(优选含有重链或轻链可变区结构域)的多核苷酸，可通过重组DNA技术利用本领域已知的方法制备产生本发明抗体分子的载体。由此，在此描述了制备蛋白质的方法，其是通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸。本领域已知的方法均可用于构建含有抗体编码序列、合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术，合成技术和体内遗传重组。本发明因此提供了含有与启动子有效连接的编码本发明抗体分子(或其重链/轻链，或其重链/轻链可变区)之核苷酸序列的可复制载体。这类载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见如，PCT公开文本WO86/05807；PCT公开文本WO89/01036；和美国专利5122464)，且抗体的可变区结构域可被克隆到用于表达完整重链或轻链的载体中。
表达载体可利用常规方法转化到宿主细胞中，转化的细胞然后通过常规方法培养以产生本发明的抗体。由此，本发明包括含有与异源启动子有效连接的编码本发明抗体、或其重链/轻链、本发明单链抗体的多核苷酸之宿主细胞。在表达双链抗体的一个优选实施方案中，编码重链及轻链的载体可在用于表达完整免疫球蛋白分子的宿主细胞中共表达，如下详述。
多种宿主表达载体系统可用于表达本发明的抗体分子。这类宿主表达系统代表了可产生目标编码序列且随后被纯化的载体，以及当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些包括但不限于如下微生物，如用含有本发明抗体编码序列之重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母、毕赤酵母)；用含有抗体编码分子的重组病毒表达载体感染的昆虫细胞系统(例如，杆状病毒)；用含有抗体编码分子之病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；马铃薯花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)感染的植物细胞系统；或者带有含来自哺乳动物细胞的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子，痘苗病毒7.5K启动子)的启动子之重组表达构建体之哺乳动物细胞系统。优选地，诸如大肠杆菌的细菌细胞，和更优选地，真核细胞可用于表达重组抗体分子，特别是对于完整重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，与诸如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子的载体结合，是一个用于抗体的有效表达系统(Foecking，等，Gene，45：101(1986)；Cockett等，Bio/technology 8：2(1990))。
在细菌系统中，可根据待表达的抗体分子的用途有利地选择多种表达载体。例如，当大量这类蛋白需要产生时，用于抗体分子药物组合物的产生，希望直到易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达之载体。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.，2：1791(1983))，其中抗体编码序列可单独地与lacZ编码序列符合读框地连接到载体中，使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nuclei Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；等。pGEX载体可用于表达带有谷胱甘肽-S转移酶(GST)。通常，这类融合蛋白质可溶，可利用吸附并结合到谷胱甘肽琼脂糖珠基质中，随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱，从裂解的细胞中容易地纯化。设计pGEX载体以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可从GST部分释放。
在昆虫系统中，Autographa californica核多角体蛋白病毒(AcNPV)用作载体表达异源基因。病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可被单独克隆入病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)，且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用多种基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体时，目标抗体编码分子可被连接到腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三个拷贝的前导序列中。此嵌合基因可然后通过体外或体内重组被插入腺病毒基因组中。在病毒基因组非必需区的插入(例如，E1或E3区域)将得到有生命的且能在感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(见，如Logan & Shenk，美国国家科学院院报，81：355-359(1984))。可能需要特定起始信号用来有效翻译插入的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。此外，起始密码子必需于期望的编码序列同相，以确保完整的插入序列的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可为多种来源，天然或合成的。表达的效率可通过包含适当的转录增强子元件，转录终止子等而提高。(见，如Bittneret al，酶学方法，153：51-544(1987))。
此外，宿主细胞菌株可选择以特定的希望的方式调节插入序列表达，或修饰和加工基因产物的那些。蛋白质产物的这类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)可能对于蛋白质的功能非常重要。不同宿主细胞具有特征性和特异性的蛋白质与基因产物之翻译后加工及修饰的机理。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为达到此目的，可使用具有正确加工初级转录子、蛋白质的糖基化和磷酸化的细胞机构之真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERA、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38和特别是乳腺癌细胞系，例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，以及正常乳腺细胞系，例如CRL7030和Hs578Bst。
为了长期、高产制备重组蛋白质，优选稳定表达。例如，可构建稳定表达抗体分子的细胞系。不是利用含有病毒复制起点的表达载体，而是利用由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA转化。外源DNA导入后，可允许构建的细胞在加富培养基中生长1-2天，然后转换为选择性培养基。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，允许细胞稳定地将质粒整合入其染色体并生长，形成可被克隆的噬斑，并扩展到细胞系。此方法可有利地用于构建表达抗体分子的细胞系。这类构建的细胞系可特别用于筛选和评估直接或间接与抗体分子相互作用的化合物。
可使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler et al，细胞，11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，美国国家科学院院报，48：202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al，细胞，22：817(1980))基因可分别用于tk-，hgprt-或aprt-细胞。同样，抗代谢物抗性可用于筛选如下基因的基础：dhfr，其赋予氨甲喋呤抗性(Wigler et al，美国国家科学院院报，77：357(1980)；O’Hare et al，美国国家科学院院报，78：1527(1981))；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，美国国家科学院院报，78：2072(1981))；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Goldspiel等，Clinical Pharmacy，12：488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science，260：926-932(1993)；Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，1993，TIBTECH 11(5)：155-215)；以及hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre等，基因，30：147(1984))。本领域已知的重组DNA方法可常规用于选择期望的重组克隆，并且所述方法可见例如Ausubel等人，(eds.)，当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley &Sons，NY(1993)；Kriegler，基因转移和表达(Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual)，Stockton Press，NY(1990)；和第12及13章，Dracopoli et al.(eds)，人类遗传学现代方法(Current Protocolsin Human Genetics)，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.，150：1(1981)，此处引入作为参考。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增而增加(综述见Bebbington和Hentschel，基于基因扩增的载体用于在DNA克隆中于哺乳动物细胞中表达克隆的基因之用途(The use of vectors based on gene amplification forthe expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning)，Vol.3.(Academic Press，New York，1987))。当表达抗体的载体系统之中的标记可扩增，在宿主细胞培养物中的抑制物水平增加将增加标志基因拷贝数的数目。由于扩增的基因于抗体基因相关，抗体的产生将增加(Crouse等，Mol.Cell.Biol.，3：257(1983))。
宿主细胞可用两个本发明的表达载体共转染，第一个载体编码重链来源的多肽，第二个载体编码轻链来源的多肽。两个载体可含有相同的选择标记，其允许重链和轻链多肽的等量表达。或者，可利用单一载体，其编码且能表达重链以及轻链多肽。在这种情况中，轻链可被置于重链前，以避免有毒的游离重链的过量(Proudfoot，自然，322：52(1986)；Kohler，美国国家科学院院报，77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列包括cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的抗体分子由动物产生、化学合成或重组表达，其可用本领域已知的用于免疫球蛋白纯化的任何方法纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和、特别是针对蛋白A的特异性抗原的亲和，以及体积排阻色谱)、离心、溶解度差异或利用任何其他用于蛋白质纯化的标准方法。此外，本发明的抗体或其片段可被融合到在此所述的或其他本领域已知的异源多肽序列，以便于纯化。
本发明构思了重组地融合或化学偶联到(包括共价和非共价)本发明的多肽(或其部分，优选至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个氨基酸的多肽)，以产生融合蛋白。融合不一定被导向，也可通过连接头序列发生。抗体可特异于本发明多肽(或其部分，优选至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个氨基酸的多肽)之外的抗原。例如，抗体可用于将本发明的多肽靶向到特定的细胞类型，无论体外或体内，方法是将本发明的多肽与特异于特定细胞表面受体之抗体偶联或融合。融合或偶联于本发明多肽的抗体也可用于体外免疫检测和本领域已知的纯化方法中。见，如Harbor等，出处同前，和PCT公开文本WO93/231232；EP 439,095；Naramura，等，Immunol.Lett.39：91-99(1994)；美国专利5474981；Gillies等，PNAS 89：1428-1432(1992)；Fell等，J.Immunol.，146：2446-2452(1991)，在此引入作为参考。
本发明还包括与可变区以外的抗体结构域融合或偶联的本发明多肽之组合物。例如，本发明的多肽可融合或偶联于抗体Fc区域，或其部分。融合于本发明多肽的抗体可包含恒定区，铰链区，CH1结构域，CH2结构域和CH3结构域，或完整结构域或其部分的任一组合。多肽也可融合或偶联于上述多肽部分以形成多聚体。例如，融合于本发明多肽的Fc部分可通过Fc部分间的二硫键形成二聚体。较高的多聚体形式可通过将多肽与IgA和IgM的部分融合制备。融合或偶联本发明多肽至抗体部分的方法为本领域已知。见，如美国专利5336603，5622929，5359046，5349053，5447851，5112946；EP307434；EP367166；PCT公开文本WO96/04388；WO91/06570；Ashkenazi等，美国国家科学院院报，88：10535-10539(1991)；Zheng等，J.Immunol.154：5590-5600(1995)；和Vil et at，美国国家科学院院报89：11337-11341(1992)(此处引入作为参考)。
如上述，相应于SEQ ID NO：2的多肽、多肽片段或变体之多肽可与上述抗体部分融合或偶联，以增加多肽的体内半寿期，或用于利用本领域周知的方法之免疫检测中。此外，相应于SEQ ID NO：2的多肽可与上述抗体部分融合或偶联，以促进纯化。一个报道的例子描述了由人CD4多肽的前两个结构域与哺乳动物免疫球蛋白之重链或轻链恒定区组成的嵌合蛋白质。(EP 394827；Traunecker等，自然，331：84-86(1988)。与具有二硫键连接的二聚体结构之抗体融合或偶联的本发明的多肽可在结合和中和其他分子时比单体性分泌蛋白质或其片段自身的效率更高。(Fountoulakis等，J.Biochem.270：3958-3964(1995))。在许多情况中，融合蛋白质中的Fc部分在治疗和诊断中有益，因此可得到例如改善的药代动力学性质(EP A 232262)。或者，在融合蛋白质表达、检测并纯化后删去Fc部分是期望的。例如，Fc部分可能阻碍治疗和诊断，如果融合蛋白质用作免疫接种的抗原的话。在药物筛选中，例如人蛋白质，诸如hIL-5受体，已经与Fc部分融合，用于高通量筛选检测以鉴定hIL-5的拮抗剂。(见，Bennett等，J.Molecular Recoginition 8：52-58(1995)；Johanson et at.，J.Biol.Chem.270：9459-9471(1995))。
此外，本发明的抗体或其片段可与标记序列融合，诸如一种促进纯化的肽。在一个优选的实施方案中，标记氨基酸是六组氨酸肽，如在pQE载体中提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，尤其是，有许多可为市售的。如Gentz等人所述，美国国家科学院院报86：821-824(1989)，例如，六组氨酸提供用于融合蛋白质的方便的纯化。其他用于纯化的肽标记包括但不限于“HA”标记，其相应于来自流感血凝素蛋白质的表位(Wilson等，细胞，37：767(1984))和“flag”标记。
本发明还包含与诊断或治疗剂偶联的抗体或其片段。抗体可被诊断性地用于例如检测肿瘤发育或进程，作为临床实验程序的一个部分，以确定例如实施的治疗方案的功效。可通过将抗体偶联于可检测的物质帮助检测。可检测物质的例子包括但不限于多种酶，修复基团，荧光材料，萤光材料，生物发光材料，放射活性材料，利用多种正电子发射断层扫描法的正电子发射材料，和非放射活性顺磁性金属离子。可检测物质可被直接或间接偶联或结合到抗体(或其片段)上，方法是利用本领域已知的技术通过一种中间体(诸如，本领域已知的接头)进行。见，例如，美国专利4741900关于一种金属离子，其可被偶联于抗体用来作为根据本发明的诊断。适合的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的修补基团符合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素，和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三丫嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；萤光素材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；适当的放射活性材料的例子包括125I、131I、111In或99Tc。
此外，抗体或其片段可与治疗性单元如细胞毒素，例如，细胞增殖抑制剂或细胞自杀剂偶联，治疗剂偶联，或与放射活性金属离子，例如α-发射体，如213Bi偶联。细胞毒素或细胞毒剂包括任何对细胞有害的药剂。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊甙、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、萘心安和嘌罗霉素及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如，氨甲喋呤，6-巯基嘌呤)、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazene)，烷化剂(例如，氮芥、thioepa chlorambucil、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU))、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂、蒽环霉素(例如，柔红霉素(以前称道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素、博来霉素、普卡霉素、安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
本发明的偶联物可用于改善特定的生物应答，所述治疗剂或药物不应被解释成仅限于传统的化学治疗剂。例如，药物可以是具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可包括例如，毒素，诸如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活剂、细胞凋亡剂、例如，TNF-α、TNF-β、AIMI(见，国际公开文本WO97/33899)，AIM II(见，国际公开文本WO97/34911)，Fas配体(Takahashi等，INt.Immunol.，6：1567-1574(1994))，VEGI(见，国际公开文本WO997/23105)，溶栓剂或抗血管生成剂，例如，血管他丁或内皮他丁；或者生物反应调节剂，诸如，淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其他生长因子。
抗体也可被结合到固体支持物上，其特别用于免疫检测或靶抗原的纯化。这样的固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚丙烯、聚氯乙烯或聚苯乙烯。
将这些治疗性抗体分子偶联的技术为本领域周知，见例如Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″AntibodiesFor Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等，(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，inMonoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical  Applications，Pinchera等，(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy，Baldwin等，(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
或者，抗体可被偶联到次级抗体上形成如Segal在美国专利4676980中所述的抗体异偶联物，此处引入作为参考。
抗体，无论是否带有与之偶联的治疗性分子，是单独施用还是与细胞毒性因子和/或细胞因子一起施用，均可用作治疗物。免疫分型
本发明抗体可用于细胞系和生物样品的免疫分型。本发明基因的翻译物可用作细胞标记或更具体地，作为在特定细胞类型中分化和/或成熟的不同阶段差异性表达的细胞标记。针对特异性表位或表位组合的的单克隆抗体允许筛选表达该标记的细胞群。利用单克隆抗体有多种方法可用于筛选表达该标记的细胞群，包括利用抗体包被的磁珠之磁力分选，用结合与固体基质(即：平板)的抗体之“淘选”，和流式细胞仪(见，美国专利5985660；和Morrison等，Cell，96：737-49(1999))。
这些技术允许筛选特定的细胞群，诸如见于恶性血液病中的(即，急性白血病患者中的最小存活疾病(MRD))和移植中的“非己”细胞，以防止移植物对抗宿主疾病(GVHD)。或者，这些技术允许筛选造血干细胞和能够经历增殖和/或分化的先祖细胞，如见于人类脐带血中的那些。抗体结合的检测
本发明的抗体可利用本领域已知的方法检测免疫特异性结合。可采用的免疫检测包括但不限于竞争性和非竞争性检测系统，利用诸如蛋白质印迹、放射免疫检测、ELISA(酶联免疫检测)、夹心免疫检测、免疫沉淀检测、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散检测、聚集反应检测、补体固定检测、免疫放射计量检测、荧光免疫检测、蛋白A免疫检测，等等。这类检测为常规且本领域周知。(见，如，Ausubel等，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，此处引入作为参考)。示范性免疫检测的例子在下面简述(但不意味仅限于此)
免疫沉淀方法一般包括如下步骤：在裂解缓冲液(诸如，RIPA缓冲液，(1％，NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15NaCl，0.01 M磷酸钠，pH7.2，1％Trasylol)，其中补加了蛋白磷酸化酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA，PMSF，抑肽酶、钒酸钠))中裂解细胞群，将目标抗体加入细胞裂解物中，4摄氏度下温育一段时间，例如1-4小时，将蛋白质A和/或蛋白质G琼脂糖珠加入细胞裂解物中，4摄氏度下温育约1小时左右，在裂解缓冲液中洗涤珠，并在SDS/样品缓冲液中重新悬浮珠。目标抗体免疫沉淀特定抗原的能力可通过例如蛋白质印迹分析来评估。本领域技术人员能理解可修改参数以增加抗体同抗原的结合并降低背景(例如，用琼脂糖珠预清洗细胞裂解物)。关于进一步的免疫沉淀方法的论述见，如，Ausubel等，编，1994，Current Protocolsin Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，10。16。1部分。
蛋白质印迹分析一般包括制备蛋白质样品，蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳(例如，8％-20％SDS-PAGE，根据抗原的分子量)，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶中转移到膜(诸如硝酸纤维素，PVDF或尼龙)上，在封闭液(例如，含3％BSA或脱脂牛奶的PBS)中封闭膜，用洗涤缓冲液(例如，PBS-土温20)洗涤膜，用在封闭缓冲液中稀释的初级抗体(目标抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，用与一种酶促底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联或与放射活性分子(例如，32P或125I)偶联的在封闭缓冲液中稀释的次级抗体(其失败初级抗体，例如，一种抗人抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，检测抗原存在与否。本领域技术人员知晓，可改变参数以增加检测的信号并降低背景噪音。关于进一步的蛋白质印迹方法的论述见，如，Ausubel等，编，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，10.8.1部分。
ELISA包括制备抗原，用抗原包被96孔微孔板的孔，将与可检测化合物诸如酶促底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联的目标抗体加入孔中，温育一段时间，检测抗原存在与否。在ELISA中，目标抗体不必偶联于可检测化合物，相反，可将偶联到可检测化合物的次级抗体(其可识别目标抗体)加入到孔中。此外，不是用抗原包被孔，抗体可包被到孔上。在这种情况下，在目标抗原加入到包被的孔中后，偶联与可检测化合物的次级抗体可被加入。本领域技术人员知晓，可改变参数以增加检测的信号以及其他本领域已知的ELISA变化。关于进一步的ELISA方法的论述见，如，Ausubel等，编，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，11.2.1部分。
抗体与抗原的结合亲和力以及抗体-抗原相互作用的解离速率可利用竞争性结合检测确定。竞争性结合检测的一个例子是放射免疫检测，包括在存在增加量的未标记抗原的情况下，温育标记的抗原(例如，3H或125I)与目标抗体，检测结合到标记抗原上的抗体。目标抗体对于特定抗原的亲和力以及结合-解离速率可从所得数据中利用Scatchard曲线分析确定。与次级抗体竞争也可利用放射免疫检测确定。在这种情况下，，在存在数量增加的未标记次级抗体的情况下，抗原与偶联于标记化合物(例如，3H或125I)之目标抗体一起温育。载体和宿主细胞
本发明也涉及包括本发明分离的DNA分子的载体，用重组载体进行基因工程改造的宿主细胞，和通过重组技术生产KGF-2多肽或其片段的方法。
可使用本发明多肽的片段或部分通过肽合成来生产相应的全长多肽；因此，这些片段可用作生产全长多肽的中间体。可使用本发明多核苷酸的片段或部分来合成本发明全长的多核苷酸。本发明也涉及包括本发明多核苷酸的载体，用本发明的载体进行基因工程改造的宿主细胞，和通过重组技术生产本发明多肽的方法。
用本发明的载体对宿主细胞进行基因工程改造(转导或转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体的形式可以是例如质粒，病毒颗粒，噬菌体等等。可在适当加以改进以激活启动子，选择转化子或扩增KGF-2基因的常规营养培养基中培养经改造的宿主细胞。如温度，pH等的培养条件是选用来表达的宿主细胞以前所用的那些条件，这对于本领域技术人员而言应是显而易见的。
通过重组技术可将本发明的多核苷酸用于生产多肽，因此，例如，所述多核苷酸可包含在多种表达载体中的任一种中以表达多肽。这种载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA、病毒DNA(如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒和假狂犬病病毒)之联合的载体。然而，只要能在宿主中复制和存活，任何其它的载体都可使用。
可通过多种方法将适当的DNA序列插入载体。通常，通过本领域已知的方法将DNA序列插入适当的限制性内切核酸酶位点。这种方法和其它方法应是本领域技术人员所熟知的。
表达载体中的DNA序列与适当的表达控制序列(启动子)有效地相连以介导cDNA合成。至于这种启动子的代表性例子，应提及的有：LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp，噬菌体λPL启动子和已知能控制原核细胞或真核细胞或它们的病毒中的基因表达的其它启动子。表达载体也含有用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体也包括用于增强表达的适当序列。
另外，表达载体优选含有一个或多个选择性标记基因以提供可用于选择已转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性。
可使用含有上文所述适当的DNA序列以及适当的启动子或控制序列的载体来转化适当的宿主以使宿主表达蛋白质。
正如已表明的，表达载体将优选包括至少一个选择标记。所说的标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418，或新霉素抗性和用于大肠杆菌及其它细菌培养的四环素卡那霉素，或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的典型例子包括，但不局限于，细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏杆菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)(ATCC保藏号201178))；昆虫细胞，如果蝇S2和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS，293和Bowes黑素瘤细胞；及植物细胞。上述宿主细胞的合适培养基和培养条件是本领域所已知的。
除了表达载体在本发明实践中的应用外，本发明进一步包括含与编码目的蛋白之核苷酸序列有效连接的操纵基因和启动子元件的新表达载体。这种载体的一个例子是下文详述的pHE4-5。
如图50和51中所概述的，pHE4-5载体(SEQ ID NO：12)的组成包括：1)作为选择标记的新霉素磷酸转移酶基因，2)大肠杆菌的复制起点，3)T5噬菌体启动子序列，4)两个lac操纵基因序列，5)SD序列，6)乳糖操纵子阻抑蛋白基因(lacIq)。复制起点(oriC)来自pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。启动子序列和操纵基因序列通过合成制备。核苷酸序列的合成产生在本领域是众所周知的。CLONTECH 95/96 Catalog，第215-216页，CLONTECH，1020 East Meadow Circle，Palo Alto，CA94303。通过将核苷酸序列插入pHE4-5载体中NdeI和Asp718位点之间，编码KGF-2(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列即与启动子和操纵基因有效连接。
如上所提及，pHE4-5载体含lacIq基因。LacIq是严密调控lac操纵基因的lacI基因的等位基因。Amann，E.等，基因69：301-315(1988)；Stark，M.，基因51：255-267(1987)。LacIq基因编码可与lac操纵基因序列结合并封闭下游(即3’)序列的转录的阻遏蛋白。然而，存在乳糖或某些乳糖类似物，如异丙基B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)时，lacIq基因产物与lac操纵基因解离。因此在含pHE4-5载体的未诱导宿主细胞中不产生大量KGF-2。可是，加入IPTG之类的物质诱导这些宿主细胞，可导致KGF-2编码序列的表达。
pHE4-5载体的启动子/操纵基因序列(SEQ ID NO：148)包括T5噬菌体启动子和两个lac操纵基因序列。一操纵基因位于转录起始位点的5’而另一个位于其3’。这些操纵基因与lacIq基因产物一起存在时，在缺少lac操纵子诱导剂如IPTG情况下，它们紧密抑制下游序列。通过加入lac操纵子诱导剂，如IPTG，可诱导位于lac操纵基因下游的有效连接序列的表达。lac诱导剂与lacIq蛋白质的结合导致其脱离lac操纵基因序列，以及有效连接序列的转录起始。基因表达的lac操纵子调节综述于Devlin，T.，生化与临床相互关系(TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRYWITH CLINICAL CORRELATIONS)，第4版(1997)，第802-807页中。
pHE4系列载体包含pHE4-5载体中除KGF-2编码序列外的所有组分。pHE4载体的特征包括优化过的合成T5噬菌体启动子、lac操纵基因和SD序列。此外，这些序列还被最佳地间隔开，以便可严密调控插入基因的表达并在诱导时产生高水平的表达。
适用于本发明蛋白质产生的已知细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子及trp启动子等。合适的真核启动子包括CMV即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早、晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR启动子如劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，和金属硫蛋白启动子如金属硫蛋白-1启动子。
pHE4-5载体还包含位于AUG起始密码子5’的SD序列。SD序列是通常位于AUG起始密码子上游(即5’)约10个核苷酸处的短序列。这些序列本质上是指导原核核糖体至AUG起始密码子处。
因此，本发明也涉及用于本发明蛋白质产生的表达载体。本发明这方面的例子是pHE4-5载体(SEQ ID NO：147)。包含一个编码KGF-2Δ33之cDNA插入片段的pHE4-5载体于1998年1月9日保藏在ATCC，保藏号209575。
更具体地，本发明也包括含有一个或多个上文广泛描述的序列的重组构建体。这些构建体含有载体，如质粒或病毒载体，其中以正向或反向插入了本发明的序列。在此实施方案优选的方面，该构建体进一步包含与该序列有效相连的调控序列，如启动子。大量的适当的载体和启动子是本领域技术人员熟知的，并可商购。列出下列载体是为了举例：细菌：pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pDIO，phagescript，psiX174，pBluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)；真核细胞：pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，只要能在宿主中复制和存活，任何其它的质粒或载体都可使用。
载体中优选用于细菌中的包括pQE70、pQE60和pQE-9，可购自Qiagen公司；pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可购自Stratagene克隆系统公司；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可购自Pharmacia Biotech，Inc。优选的真核载体包括来自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；及来自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。优选的为用于酵母体系中的表达载体，包括但不限于pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZα、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K和PAO815(均可获自Invitrogen，Carlbad，CA)。其它的合适载体对本领域技术熟练人员来说将是显然的。
可使用具有选择性标记的CAT(氯霉素转移酶)载体或其它载体从任何合乎需要的基因中选择启动子区域。两个适当的载体是pKK232-8和pCM7。特别命名的细菌启动子包括lacI启动子，lacZ启动子，T3启动子，T7启动子，gpt启动子，λPR、PL启动子和trp启动子。真核启动子包括CMV即早期启动子，HSV胸苷激酶启动子，早期和晚期SV40启动子，逆转录病毒的LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子。适当载体和启动子的选择是本领域技术人员熟知的。
可用磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导转染、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法将构建体引入宿主细胞。这样的方法可见于许多标准实验室手册中，如Davis等，分子生物学基本方法(BasicMethods In Molecular Biology)(1986)。特别构思了KGF-2多肽可实际上由缺乏重组载体的宿主细胞表达。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞，或低等真核细胞如酵母细胞；或者宿主细胞也可以是原核细胞如细菌细胞。可通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis，L等人，分子生物学基础方法(1986))将构建体导入宿主细胞中。
可以常规方式使用宿主细胞中的构建体以产生由重组序列编码的基因产物。或者，也可通过常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。
在适当启动子的控制下，成熟的蛋白质可在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达。使用衍生自本发明DNA构建体的RNA，也可利用无细胞的翻译系统来产生这种蛋白质。可在原核和真核宿主中使用的适当的克隆和表达载体描述于Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约(1989)，该文献已列入本文作为参考。
通过在载体中插入增强子序列可增加高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是对启动子起作用以增加其转录的顺式作用的DNA元件，通常约为10至300bp。例子包括复制起点晚期侧的第100-270bp的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。
为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔、外周质空间或胞外环境中，可将适当的分泌信号掺入被表达的多肽中。所述信号对于该多肽而言可以是内源的，也可以是外源的。
多肽可以经修饰的形式，如融合蛋白的形式被表达，多肽不仅可包括分泌信号，也可包括其它的异源功能区域。例如，可在多肽的N-末端加上另外的氨基酸区域，尤其是带电的氨基酸以改善多肽在宿主细胞中、纯化过程中或随后的处理和储存过程中的稳定性和持久性。也可以在多肽中加入肽组成成分以便于纯化，最终制备多肽之前可除去这类区域。本领域技术人员熟知在多肽中加入肽组成成分以引发分泌或外泌，改善稳定性和便于纯化等等，这是本领域内的常规技术。优选的融合蛋白含有得自免疫球蛋白的异源区域，该区域可用于增溶受体。例如，EP-A-0 464 533(加拿大同族2045869)中公开了含有免疫球蛋白分子恒定区各个部分和另一种人蛋白质或其部分的融合蛋白。在很多情况下，融合蛋白中的Fc部分对于治疗和诊断用途十分有利，因此，导致例如药物动力学特性有所改善(EP-A0 232 262)。另一方面，对于一些应用而言，需要在融合蛋白以所述有利的方式被表达、检测和纯化之后缺失掉Fc部分。如当Fc部分成为治疗和诊断用途的障碍时，如当融合蛋白被用作免疫接种用的免疫原时即是如此。例如在筛选药物时，将如shIL-5之类的人蛋白质与Fc部分融合以进行高生产率筛选试验来鉴定hIL-5的拮抗剂，例见D.Bennett等人，分子识别杂志，第8卷，52-58(1995)和K.Johanson等人，生物化学杂志，Vol.270，No.16，p9459-9471(1995)。
通常，重组的表达载体包括复制起点和允许转化宿主细胞的抗性标记，如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母的TRP1基因，和得自高表达基因的启动子以介导下游结构序列的转录。这种启动子可得自编码如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)之类的糖酵解酶，α-因子，酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子。异源结构序列与翻译起始和终止序列，优选与能介导被翻译的蛋白质分泌至外周间隙或胞外基质中的前导序列以适当的方式装配在一起。任选地，异源序列可编码包括赋予所需特征的N-末端鉴定肽的融合蛋白，所述特征例如所表达重组蛋白的稳定化或纯化过程的简化。
通过将与功能性的启动子处于有效的阅读相中的编码所需蛋白质的结构DNA序列以及适当的翻译起始和终止信号一起插入可构建用于细菌的有用的表达载体。载体可含有一个或多个表型选择性标记和一个复制起点以确保载体的维持并在必要时提供宿主内的扩增。尽管也可利用其它的选择，但用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的多个种。
作为代表性的而非局限性的例子，用于细菌的有用的表达载体可含有选择性标记和得自含有已知克隆载体pBR322(ATCC37017)之遗传元件的商购质粒的细菌复制起点。这种可商购载体包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与适当的启动子和欲表达的结构序列联合在一起。
转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至适当的细胞密度之后，通过适当的方式(如温度变化或化学诱导)诱导选定的启动子，并将细胞再培养一段时间。
一般通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破碎细胞，保留所得的粗提取物以进一步纯化。
通过包括冷冻-融化循环，超声处理，机械破碎，或使用细胞裂解剂等在内的任何便利方法可破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，这些方法是本领域技术人员所熟知的。
可使用多种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白，哺乳动物表达系统的例子包括Gluzman，细胞，23：175(1981)所述的猴肾成纤维细胞COS-7系，以及能表达可容性载体的其它细胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可含有复制起点，合适的启动子和增强子，和任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’侧翼的非转录序列。可使用得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列提供所需的非转录的遗传元件。
通过包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阳离子或阴离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和凝集素层析等的方法从重组细胞培养物中回收和纯化KGF-2多肽。必要时，可进行蛋白质的重折叠步骤来完成成熟蛋白质的构型。最后，可使用高效液相层析(HPLC)完成最终的纯化步骤。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，或由原核或真核宿主(如培养中的细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)通过重组技术产生。取决于重组生产方法中所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
KGF-2多肽(优选分泌型式)也可从如下获得：由如下天然来源纯化的产品，包括体液、组织和细胞(无论直接分离或是培养的)；化学合成方法的产物；和由重组技术从原核或真核宿主中产生的产物，包括例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。依据在重组生产方法中所用的宿主，KGF-2多肽可以是糖基化或非糖基化的。此外，KGF-2多肽也可以包括起始修饰的甲硫氨酸残基，在某些情况中作为宿主介导的方法之结果。因此，本领域周知由翻译起始密码编码的N-末端甲硫氨酸在所有真核细胞中一般在任意蛋白质翻译后被从蛋白质上高效移去。当多数蛋白质上的N-末端甲硫氨酸在多数原核细胞中从某些蛋白质上被有效移去时，此原核移去方法是低效的，取决于N-末端甲硫氨酸与之共价连接的氨基酸的性质。
在一个实施方案中，酵母巴氏毕赤酵母是一种甲基营养型酵母，其能代谢甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢途径中的主要步骤是甲醇利用氧气被氧化至甲醛。此反应由醇氧化酶催化。为了代谢甲醇作为其唯一碳源，巴氏毕赤酵母必须产生高水平的醇氧化酶，这部分是由于醇氧化酶对氧气相对较低的亲和性。因此，在依赖甲醇作为主要碳源的生长培养基中，两种醇氧化酶基因之一(AOX1)的启动子区域十分活跃。在甲醇存在下，由AOX1基因产生的两个醇氧化酶占高达约30％的巴氏毕赤酵母总可溶性蛋白。见Ellis，S.B.，等，分子细胞生物学，5：1111-21(1985)；Koutz，P.J.等，酵母，5：167-77(1989)；Tschopp，J.F.，等，核酸研究，15：3859-76(1987)。因此，异源编码序列，如本发明KGF-2多肽(在全部或部分AOX1调控序列之转录调节之下)，在甲醇存在下于巴氏毕赤酵母中以异常高的水平表达。
在一个例子中，利用质粒载体pPIC9K在毕赤酵母体系中表达编码本发明KGF-2多肽DNA，如此处所述，基本依照“毕赤酵母方法：分子生物学”D.R.Higgins和J.Cregg编，The Humana Press，Totowa，NJ，1998中所述。该表达载体允许本发明KGF-2蛋白质的表达和分泌，其利用了位于多克隆位点上游与巴氏毕赤酵母碱性磷酸酶(PHO)分泌信号肽(即，前导序列)的强AOX1启动子。
也可用许多其他酵母载体替代pPIC9K，例如，pYES2，pYD1，pTEF1/Zeo，pYES2/GS，pPICZ，pGAPZ，pGAPZα，pPIC9，pPIC3.5，pHIL-D2，pHIL-S1，pPIC3.5K和PAO815，如本领域人员容易知晓，只要目标表达构建体提供合适定位的用于转录、翻译、分泌(如需要)等的信号，包括需要时的符合读框的AUG。
在另一实施方案中，异源编码序列(如本发明的KGF-2多核苷酸)的高水平表达可通过将本发明的异源多核苷酸克隆到一种表达载体，如pGAPZ或pGAPZα中，并在没有甲醇的酵母培养基中生长来实现。
除了使宿主细胞包含在此讨论的载体构建体之外，本发明还构思了脊椎动物来源的原代、次代和永生宿主细胞，特别是哺乳动物来源的，其经基因工程构建缺失或替换了内源遗传材料(如KGF-2编码序列)，和/或包含了与本发明的KGF-2多核苷酸有效连接的遗传材料(如，异源多核苷酸序列)，并且其活化、改变和/或扩增内源KGF-2多核苷酸。例如，本领域已知的技术可用于通过同源重组使异源控制区(例如，启动子和/或增强子)与内源KGF-2多核苷酸序列有效连接，从而形成新转录单位(见如美国专利5641670，1997年6月24日授权；美国专利5733761，1998年3月授权；国际公开文本WO96/29411，1996年9月26日出版；国际公开文本WO94/12650，1994年8月4日出版；Koller等，美国国家科学院院报，86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然，342：435-438(1989)，所述公开均在此引入作为参考)。KGF-2的诊断和治疗应用
下文章节中所用的“KGF-2”是指本文所述的全长和成熟形式的KGF-2，以及本文所述的KGF-2类似物，衍生物和突变体。本发明也涉及将KGF-2基因用作诊断试验的一部分以检测与KGF-2核酸序列中存在突变有关的疾病或对所述疾病的易感性。
可通过多种技术在DNA水平上检测KGF-2基因内携有突变的个体。用于诊断的核酸可得自病人的细胞，如血液，尿，唾液，组织活检和尸检材料。可直接将基因组DNA用于检测，或在分析前，通过使用PCR(Saiki等，自然，324：163-166(1986))酶促扩增基因组DNA。也可将RNA或cDNA用于相同目的。例如，可使用与编码KGF-2的核酸互补的PCR引物来鉴定和分析KGF-2突变。例如，通过比较扩增产物与正常基因型在大小上的变化可检测出缺失和插入。通过将已扩增的DNA与经放射性标记的KGF-2 RNA，或者经放射性标记的KGF-2反义DNA序列杂交可鉴定出点突变。通过RNA酶A消化或通过解链温度的差异可将完全匹配的序列与错配的双螺旋区分开。
通过在含或不含变性剂的凝胶上检测DNA片段电泳迁移率的变化可进行基于DNA序列差异的基因试验。通过高分辨率的凝胶电泳肉眼可见小序列缺失和插入。在变性的甲酰胺梯度凝胶上可区分不同序列的DNA片段，在所述凝胶中，根据不同DNA片段特殊的解链或部分解链温度，其迁移率被阻滞在凝胶的不同位置(例见Myers等，科学，230：1242(1985))。
通过如RNA酶和S1保护作用的核酶保护试验或化学裂解方法(如Cotton等，PNAS，USA，85：4397-4401(1985))也可揭示特定位置处的序列变化。
因此，通过诸如杂交，RNA酶保护作用，化学裂解，直接DNA测序或使用限制性酶(如限制性片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹之类的方法可检测特定的DNA序列。
除了更常规的凝胶电泳和DNA测序外，也可通过原位分析来检测突变。
本发明也涉及用于检测各种组织中KGF-2蛋白水平之变化的诊断测定，因为相对于正常的对照组织样品而言，该蛋白质的过量表达可检测疾病或对疾病的易感性的存在，所述疾病如肿瘤。用于检测得自宿主的样品中KGF-2蛋白水平的试验是本领域技术人员熟知的，这些方法包括放射性免疫测定，竞争结合测定，Western印迹分析，ELISA测定和“夹心”测定。ELISA测定(Coligan等，免疫学最新方法，1(2)，第6章，(1991))起初包括制备特异于KGF-2抗原的抗体，优选为单克隆抗体。另外还制备抗该单克隆抗体的报道抗体。报道抗体上结合有可检测的试剂，如放射活性，荧光标记或，在此例中为辣根过氧化物酶。从宿主体内取样，将样品置于能与样品中蛋白质结合的固相支持物，如聚苯乙烯盘上保温。然后通过与非特异性蛋白质如牛血清白蛋白一起保温以覆盖盘上任何游离的蛋白质结合位点，接着，使单克隆抗体与聚苯乙烯盘上结合的任何KGF-2蛋白结合。用缓冲液洗去所有未结合的单克隆抗体。此时将与辣根过氧化物酶连接的报道抗体置于盘中，使报道抗体与结合于KGF-2的任何单克隆抗体结合，然后洗去未结合的报道抗体。在盘中加入过氧化物酶底物，当与标准曲线相比时，在给定时间内显色的量即为给定体积的病人样品中存在的KGF-2蛋白的量的测量结果。
也可使用竞争性测定，其中特异于KGF-2的抗体与固相支持物结合，将经标记的KGF-2和得自宿主的样品在固相支持物上穿过，通过例如液体闪烁层析检测到的标记物的量与样品中KGF-2的量相关。
“夹心”试验类似于ELISA测定，在“夹心”测定中，KGF-2穿过固相支持物，并与固相支持物上结合的抗体相结合。然后使第二抗体与KGF-2结合。然后使特异于第二抗体的经标记的第三抗体穿过固相支持物并与第二抗体结合，再确定量的大小。
可将所述多肽，其片段或其它衍生物，或它们的类似物，或表达它们的细胞用作免疫原以产生其抗体。这些抗体可以是例如多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合的、单链的、人源化的抗体以及Fab片段或Fab表达文库的产物。可使用本领域中已知的多种方法产生这种抗体和片段。
通过将所述多肽直接注射至动物体内或通过给动物，优选为非人类动物施用所述多肽可得到针对对应于本发明序列的多肽而产生的抗体。然后，如此得到的抗体会结合多肽自身。按此方法，甚至仅编码多肽一个片段的序列也可用于产生能结合整个天然多肽的抗体。然后可将这种抗体用于从表达所述多肽的组织中分离该多肽。
为了制备单克隆抗体，可使用能提供通过连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。例如杂交瘤技术(Kohler & Milstein，自然，256：495-497(1975))，三瘤(trioma)技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，今日免疫学，4：72(1983))和用于产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，单克隆抗体和癌症疗法，Alan R.Liss，Inc，p77-96(1985))。
描述用于产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)也适于产生针对本发明免疫原性多肽产物的单链抗体。也可使用转基因小鼠表达针对本发明免疫原性多肽产物的人源化抗体。
本发明多肽已显示刺激上皮组织的生长。因此，本发明的多肽可用于刺激上皮组织生长。“上皮组织”是指肌体内部和外部表面的覆盖物(包括器官和其他小腔的衬里)。其由通过少量胶黏物质连接的细胞组成。上皮组织依照层数、深度、表面细胞的形状分为数种类型。上皮细胞包括anterius corneae、Barrett′s上皮、肾小囊上皮、纤毛上皮、柱状上皮、角膜上皮、立方(cubical)上皮、epithelium ductus semicircularis、釉质上皮、伪上皮、胚上皮、齿龈上皮、腺性上皮、肾小球上皮、薄层上皮、lend上皮、间质上皮、嗅觉上皮、扁平上皮、色素上皮、保护性上皮、假分层上皮、锥体上皮、呼吸上皮、柱上皮、生精上皮、感觉上皮、简单上皮、鳞状上皮、分层上皮、包膜上皮、sulcular上皮、镶嵌状上皮、过渡上皮、以及眼、舌、腺体、口腔粘膜、十二指肠、回肠、空肠、盲肠、鼻通道、食管、结肠、乳腺以及雌性和雄性生殖系统的上皮细胞。
“腺体”是指细胞的集合，其特化以分泌或产生与其正常代谢需要无关的物质。腺体的例子可包括上皮细胞，包括：吸收间质、附属腺、泡状腺、酸腺、admaxillary腺、肾上腺、聚合腺、Albarran′s腺、肛门腺、泡状腺、尿道球腺、主动脉腺、舌的顶腺、顶质分泌腺、乳晕腺、动脉腺、arteriococcygeal腺、杓状腺、Aselli′s腺、Avicenna′s腺、atribiliary gland、腋腺、Bartholin腺、Bauhin′s腺、Baumgarten′s腺，胆粘膜的腺体、Blandin腺、血管腺、Boerhaave′s腺、嗅腺、臂腺、支气管腺、Bruch′s腺、Brunner′s腺、口腔腺、球海绵体肌腺、贲门腺、颈动脉腺、腹腔腺、耵聍腺、子宫的宫颈腺、脉络膜腺、Ciaccio′s腺、结膜的睫毛腺、肛周腺、Cloquet′s腺、Cobelli′s腺、尾臀骨腺、盘管腺、复合腺、球状腺、结膜腺、Cowper′s腺、皮腺、细胞遗传腺、无管腺、十二指肠腺、Duverney′s腺、Ebner′s腺、外分泌腺、Eglis′腺、内分泌腺、内上皮腺、食管腺、排泄功能腺、外分泌腺、输卵管的卵泡腺、基底腺、胃腺、胃网膜腺、同性爱者腺、生殖腺、齿龈腺、Gley′s腺、球状腺、成球状腺、舌腭腺、Guerin′s腺、咽喉腺、Haller腺、Harder′s腺、haversian腺、快乐腺、血管腺、血液淋巴腺、造血腺、血淋巴腺、Henle′s腺、肝脏腺、哈氏腺、蛰伏腺、全质分泌腺和内分泌腺。
腺体的进一步例子包括颈动脉间腺、间中腺、肩胛间腺、间质腺、肠腺、上皮内腺、舌的肌肉内腺、颈静脉腺、Krause′s腺、醉的唇腺、泪腺、附属泪腺、乳腺腺、大肠腺、大汗腺、喉头腺、胃和舌的扁豆状腺、Lieberkuhn的腺、舌腺、前部舌腺、Littre′s腺、Luschka′s腺、淋巴腺、腮腺外淋巴腺、颊腺、乳腺腺、附属乳腺、上颚腺、Manz′腺、Mehlis′腺、睑板腺、局部分泌腺、肠系膜腺、结肠系膜腺、混合腺、磨牙腺、Moll′s腺、monoptyphic腺、蒙格马利腺、Morgagni′s腺、嘴部腺、黏液腺、分泌粘液腺、粘液腺、舌粘液腺、咽鼓管粘液腺、十二指肠粘液腺、咽鼓管粘液腺、多细胞腺、子宫肌层腺、Naboth′s腺、子宫颈腺、鼻腺、颈部腺、包皮气味腺、油腺、嗅觉腺、壁细胞腺、蛛网膜腺、上腭腺、胰脾腺、系带旁腺、甲状旁腺、par urethral腺、耳下腺、附属耳下腺、胸腺、消化腺、汗腺、Peyre′s腺、咽头腺、Philip′s腺、松果腺、和垂体腺。
其他腺体的例子包括Poirier′s腺、polyptychich腺、尾羽腺、妊娠腺、prehyoid腺、包皮腺、前列腺、青春期腺、幽门腺、总状花序腺、逆舌腺、磨牙后腺、Rivinus腺、Rosenmuller腺、囊形腺、唾液腺、腹部唾液腺、外部唾液腺、内部唾液腺、Sandstrom′s腺、Schuller′s腺、脂肪腺、结膜的皮脂腺、护卫腺、浆液粘液性腺、浆液腺、Serres′腺、Sigmunds腺、Skene′s腺、单纯腺、小肠的腺体、大肠的孤立腺、splenoid腺、Stahr′s腺、staplyline腺、subauricular腺、舌下腺、下颌下腺、suboriferous腺、副肾腺、附属副肾腺、Suzanne′s腺、汗腺、滑液腺、跗骨腺、Theile′s腺、胸腺、甲状腺、附属甲状腺、舌的腺体、气管腺、tachoma腺、管状腺、管泡状腺、鼓膜腺、Tyson的腺、单细胞腺、尿道腺、女性尿道的尿道腺、尾臀腺、子宫腺、小囊腺、阴道腺、导管腺、(大和小)前庭腺、Virchow′s腺、蛋黄腺、bulbovaginal腺、Waldeyer′s腺、Weber′s腺、Wolfring的腺体、Zeis的腺体和Zuckerkandl′s腺体。
因此，KGF-2可用于刺激这些腺体内诸多细胞中的任一种的生长。
可使用本发明多肽刺激新血管的生长或血管生成。尤其是，本发明的多肽可刺激角质形成细胞的细胞生长和增殖。因此，本发明提供了将这种多肽，或编码这种多肽的多核苷酸用于治疗目的的方法，所述治疗目的如刺激上皮细胞增殖和基底的角质形成细胞以使创伤愈合，以及刺激毛囊产生和治愈皮创伤。
如上所述，本发明的多肽可用来通过刺激上皮细胞增殖而治愈皮创伤。这些创伤可以是浅表的，也可以是很深并涉及皮肤之真皮和表皮的损害。因此，本发明提供了促进创伤愈合的方法，所述方法包括给个体施用有效量的KGF-2。
施用KGF-2的个体可以是能以正常的速率治愈创伤，也可以是愈合受损。当给愈合未受损的个体施用时，施用KGF-2可加快正常的愈合过程。当给愈合受损的个体施用时，施用KGF-2便于创伤的愈合，否则的话，创伤愈合将很缓慢或根本不愈合。如下文所述，很多痛苦和疾病可导致愈合受损。这些痛苦和疾病包括糖尿病(如II型糖尿病)，同时用类固醇和其它药剂治疗，和局部缺血障碍或受伤。已表现出损害创伤愈合的类固醇包括可的松，氢化可的松，地塞米松和甲基氢化泼尼松。
非类固醇类化合物，如奥曲肽乙酸盐已表现出会损害创伤愈合。Waddell，B.等，美国外科手术，63：446-49(1997)。据信本发明可促进受这种非类固醇药剂治疗的个体的创伤愈合。
多种生长因子已显示出可促进愈合受损之个体的创伤愈合，例见Steed，D等，J.Am.Coll.Surg，183：61-64(1996)；Richard，J等，糖尿病养护(Diabetes Care)，18：64-69(1995)；Steed，D.，J.Vasc.Surg，21：71-78(1995)；Kelley，S等，Proc.Soc.Exp.Biol.，194：320-326(1990)。这些生长因子包括生长激素释放因子，血小板衍生的生长因子，和碱性的成纤维细胞生长因子。因此，本发明也包括联合施用KGF-2和一种或多种可促进创伤愈合的其它生长因子或其它药剂。
本发明也提供了促进以正常速率愈合创伤和愈合受损的两种个体中吻合愈合和由外科手术导致的其它创伤的愈合的方法。所述方法包括在吻合术或其它外科手术之前，之后和/或过程中给个体施用有效量的KGF-2。吻合是两个管状结构的连接，例如，当中间一段肠被除去，剩下的部分相互连接以重新构成肠道时即会发生吻合。与皮肤愈合不同，吻合伤口的愈合过程一般看不清楚。另外，至少胃肠道中的创伤愈合在无并发症的情况下可快速发生；然而，并发症经常需要由额外的外科手术来纠正，Thornton，F和Barbul，A，北美外科手术及临床(Surg.Clin.North Am.)，77：549-573(1997)。如实施例21和28所示，结肠吻合术后用KGF-2治疗可导致腹膜泄漏和吻合收缩现象显著减少。据信KGF-2是通过加快愈合进程从而降低因这种进程引发的并发症发生概率，而导致这些结果的。
因此，本发明也提供了在以正常速率愈合创伤或愈合受损的个体中于吻合术或其它外科手术后加快创伤愈合的方法，所述方法包括施用有效量的KGF-2。
也可使用本发明的多肽刺激细胞的分化，所述细胞如肌肉细胞，组成神经组织的细胞，前列腺细胞和肺细胞。
KGF-2可在临床上用于在正常个体和患有会诱导不正常的创伤愈合之疾病的个体中刺激创伤的伤口愈合，所述创伤包括外科伤口，切除术的伤口，涉及真皮和表皮损伤的深层创伤，眼组织创伤，牙组织创伤，口腔创伤，糖尿病患者的溃疡，皮肤溃疡，肘溃疡，动脉溃疡，静脉停滞溃疡，因暴露于热或化合物引起的灼伤，所述疾病如尿毒症，营养不良，维生素缺乏症，肥胖症，感染，免疫抑制和与用类固醇，放射疗法，抗肿瘤药物和抗代谢物全身性治疗相关的并发症。KGF-2可被用于促进与局部缺血和局部缺血损伤相关之创伤的愈合，所述创伤如由静脉循环系统回流受损和/或不足导致的慢性静脉腿溃疡。
也可使用KGF-2来促进皮损伤后的皮重建。另外，也可使用KGF-2来增加表皮的抗张强度和表皮厚度。
也可使用KGF-2来增加皮肤移植物与创伤床的粘附性，并刺激创伤床处重新形成上皮。下文列出了可使用KGF-2增加其与创伤床的粘附性的移植物类型：自体移植物，人工皮肤，同种移植物，自体真皮移植物，自体表皮移植物，无血管移植物，Blair-Brown移植物，骨移植物，胚胎期形成的移植物，皮肤移植物，延迟的移植物，真皮移植物，表皮移植物，筋膜移植物，全层皮移植片，异源移植物，异种移植物，同种移植物，增生性移植物，角膜薄层移植物，网眼移植物，粘膜移植物，Ollier-Thiersch移植物，网膜移植物，补片移植物，蒂移植物，全层角膜移植物，分层皮移植片，厚分层皮移植片。可使用KGF-2促进皮肤强度并改善老化皮肤的外观。
据信KGF-2也可使肝细胞的增殖，和肺，乳房，胰腺，胃，小肠和大肠中的上皮细胞的增殖产生变化。KGF-2可促进如皮脂细胞，毛囊，肝细胞，II型肺细胞，产生粘蛋白的杯状细胞之类的上皮细胞，和其它上皮细胞以及皮肤，肺，肝脏，肾脏和胃肠道中所含的它们的祖细胞的增殖。如实施例31所示，KGF-2刺激肝细胞的增殖，故KGF-2可被用来缓解或治疗肝脏疾病和如由肝硬变引起的暴发性肝脏疾病，由病毒性肝炎和毒性物质(即扑热息痛，四氯化碳和现有技术中已知的其它肝毒素)引起的肝损害的病理状态、自身免疫性慢性活动性肝炎、肝脏移植和部分肝脏切除术(Cotran等，Pathologic basis of disease第5版，Philadelphia，W.B.saunders Company，1994)。也可使用KGF-2来刺激或促进肝脏的再生比用于酒精性肝脏疾病的患者。KGF-2可用于治疗肝脏纤维化。
大约80％的胰腺疾病与胆道疾病和酒精中毒相关(Rattner D.W.，Scand J gastroenterol 31：6-9(1996)；Cotran等，Pathologic basis ofdisease第5版，Philadelphia，W.B.saunders Company，1994)。急性胰腺炎是伴随较高的发病率和死亡率的临床问题(Banerjee等，BritishJournal of surgery，81：1096-1103(1994))。这些疾病的病理仍旧未能明晰，但是普遍认为在胰脏内释放的胰腺酶导致蛋白水解，间质炎症、脂肪坏死和出血。急性胰腺炎可导致扩散性血管内凝集、成人呼吸窘迫综合征、中风和急性肾小管坏死(Cotran等，Pathologic basis of disease，第5版，Philadelphia，W.B.saunders Company，1994)。除了姑息疗法之外，大约有5％的这类患者死于临床病程第一周内的中风。在存活的患者中，后遗症包括胰腺脓肿、假性囊肿和十二指肠梗阻(Cotran等，Pathologic basis of disease第5版，Philadelphia，W.B.saundersCompany，1994)。慢性胰腺炎常常是对胰腺的渐进性破坏，其由急性胰腺炎的反复发作引起。慢性胰腺炎似乎引起中等程度的胰腺肿瘤的风险(Cotran等，Pathologic basis of disease第5版，Philadelphia，W.B.saunders Company，1994)。
如上述，和实施例31中所述，KGF-2还促进胰腺细胞的增殖。因此，又一方面，KGF-2可预防性或治疗性使用，以防止或缓解急性或慢性胰腺炎。
也可使用KGF-2来降低由病毒感染的治疗，放射疗法，化学疗法或其它治疗引起的肠毒性副作用。KGF-2对小肠粘膜具有细胞保护性作用。KGF-2也可预防性地或治疗性地用于预防或减少因化学疗法，其它药剂和病毒感染引起的粘膜炎并刺激粘膜炎(如口腔，食管，肠，结肠，直肠和肛门溃疡)的愈合。因此，本发明也提供了预防或治疗粘膜疾病或病理学事件的方法，所述疾病或病理学事件包括溃疡性结肠炎，Crohn’s疾病和粘膜被损害的其它疾病，所述方法包括施用有效量的KGF-2。类似地，本发明也提供了预防或治疗口腔(包括与咽和咽下部粘膜损伤相关的吞咽疼)，食管，胃，肠，结肠和直肠粘膜炎的方法，而不论导致所述损害的药剂或用药方式如何。
此外，KGF-2可用于治疗和或预防：由于化学品造成的水泡和灼伤；卵巢损伤，例如，由于化疗或用环磷酰胺治疗引起的；放疗或化疗引起的膀胱炎；或高计量化疗引起的肠损伤。KGF-2可用于促进肠愈合、供体位点愈合、肠手术创伤愈合或在美容手术过程中的切割伤愈合。
KGF-2也可促进内皮细胞，角质形成细胞和基底角质形成细胞的增殖，因此，本发明也提供了刺激所述细胞类型增殖的方法，所述方法包括使细胞与有效量的KGF-2接触。也可给个体施用有效量的KGF-2以体内刺激细胞增殖，或使KGF-2在体外与这种细胞接触。
本发明也提供了促进泌尿道上皮愈合的方法，所述方法包括给个体施用有效量的KGF-2，因此，本发明提供了加速泌尿道上皮愈合或治疗多种涉及泌尿道上皮细胞(即沿着尿道排列的细胞)的病理学的方法。包括导管插入术，外科手术，或细菌感染(如被可导致性传播疾病，如淋病的致病因子感染)的多种机制均可能损害到含有这种细胞的组织层。
本发明也包括促进女性生殖道组织愈合的方法，所述方法包括施用有效量的KGF-2。包括念珠菌感染，滴虫病，加德纳属菌感染，淋病，衣原体，支原体感染和其它性传播疾病的多种疾病可导致女性生殖道的组织损伤。
如实施例10，18和19所示，KGF-2可刺激表皮角质形成细胞增殖和增加表皮厚度。因此，在完整皮肤的再生；全层皮和部分厚度皮肤的缺陷，包括烧伤(即毛囊，汗腺和皮脂腺的重新分群)；和对如牛皮癣之类的其它皮肤缺陷的治疗时可使用KGF-2。
KGF-2也可通过加速损害部位重新形成上皮而用于治疗大疱性表皮松懈，该病是上皮与其下面的真皮的粘附性缺陷，可导致经常性的破溃和疼痛的水疱。KGF-2也可用于治疗胃和十二指肠溃疡，并可协助更快速地在粘膜衬里处愈合和使腺粘膜和十二指肠粘膜衬里再生而帮助溃疡处愈合。如Crohn’s病和溃疡性结肠炎等炎性肠疾病分别是导致小肠或大肠粘膜表面被破坏的疾病。因此，KGF-2也可用于促进粘膜表面重新形成表面，目的是更快速地愈合并阻止炎性肠疾病的进程。预期KGF-2治疗对整个胃肠道的粘膜产生具有显著的作用，可被用来保护肠粘膜使之免受被摄入的或外科手术后的有害物质的影响。如上所述，也可使用KGF-2来促进肠或结肠吻合术的愈合。KGF-2也可用于治疗与KGF-2的表达不足有关的疾病。
如下述实施例32所示，KGF-2刺激肺上皮细胞增殖。因此，KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于防止和治疗由于多种病理状态造成对肺的损伤。生长因子，诸如KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可刺激增生和分化，并促进肺泡和细支气管上皮的修复，以防止或治疗急性或慢性肺损伤。例如，肺气肿，其造成肺泡的进行性损失，和吸入性损伤(即由于烟雾吸入造成的)，和烧伤(其引起细支气管上皮和肺泡的坏死)均可由KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂有效的治疗。另外，KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于刺激II型肺泡细胞的增生和分化，其可帮助早产婴儿中疾病(诸如透明膜病、诸如婴儿呼吸窘迫综合征和支气管肺displasia)的治疗或预防。
导致急性肾衰竭的三个原因是肾前的(如心衰竭)，内源性的(由化学治疗剂诱导的肾中毒性)和肾后的(如尿道阻塞)，这些原因可导致肾小管细胞死亡，小管腔阻塞，和滤液回流至肾小球中(参见Thadhani等，新英格兰医学杂志，334：1448-1460(1996))。如胰岛素类生长因子I，成骨蛋白-1，肝细胞生长因子和表皮生长因子等的生长因子已显示出具有改善动物模型中肾疾病的潜力。Taub等，细胞因子，5：175-179(1993)；Vukicevic等，J.Am.Soc.Nephrol，7：1867(1996)。KGF-2也可刺激肾细胞的增殖和分化，因此可用于缓解或治疗如急性和慢性肾衰竭和晚期肾疾病之类的肾疾病和病理学。
KGF-2也可刺激乳腺组织的增殖和分化，因此可用于促进因外科手术，外伤或癌症所致的乳腺组织损伤的愈合。
另外，也可使用KGF-2治疗或预防糖尿病的发作。在刚被诊断为I型和II型糖尿病，但仍维持有一些胰岛细胞功能的病人中，可使用KGF-2来维持胰岛功能从而缓解，延迟或防止疾病的永久表现。KGF-2也可被用作胰岛细胞移植过程中的辅助物以改善或促进胰岛细胞的功能。
另外，KGF-2的抗炎症特性对于治疗其中炎症是主要致病原因的急性和慢性疾病是有利的，所述疾病包括但不限于牛皮癣，湿疹，皮炎和/或关节炎。因此，本发明提供了预防或减轻个体中炎症和涉及炎症之疾病的方法，所述方法包括施用有效量的KGF-2。
也可使用KGF-2促进因外伤，外科手术或化学药品所致损伤导致的脑组织损伤的愈合并缓解所述脑组织损伤。
另外，由于KGF-2可增加表皮的厚度，因此可使用该蛋白质改善老化的皮肤，减少皮肤皱纹，减少外科手术后的疤痕。创伤组织的疤痕经常涉及真皮成纤维细胞的过度增殖。如实施例10所示，KGF-2不刺激成纤维细胞的增殖，因此，KGF-2似乎是特异于表皮角质形成细胞的有丝分裂原，并可诱导创伤愈合，同时形成最少量的疤痕。因此，本发明提供了促进创伤愈合，同时形成最少疤痕的方法，所述方法包括给个体施用有效量的KGF-2。可在产生创伤的过程(如美容外科手术，偶发的或由利器导致的蓄意的组织外伤)之前，之中和/或之后施用KGF-2。
如上所述，KGF-2也可刺激角质形成细胞和毛囊的增殖，因此，可使用KGF-2促进秃头和毛发移植病人中毛发的生长。因此，本发明进一步提供了促进毛发生长的方法，所述方法包括施用足以刺激毛囊产生的量的KGF-2。
本发明也提供了保护个体免受电离辐射，化学疗法或抗病毒剂治疗之影响的方法，所述方法包括施用有效量的KGF-2。本发明另外还提供了治疗因暴露于电离辐射，化学治疗剂或抗病毒剂所致的组织损害的方法，所述方法包括施用有效量的KGF-2。个体可能因很多原因而暴露于电离辐射，这些原因包括治疗目的(如治疗过度增殖性疾病)，放射性同位素偶然地释放至环境中的结果，或非介入性医学诊断方法(如X射线)过程中所致。另外，相当一部分个体在其工作地点和家中暴露于放射性氡中。长期连续的环境暴露已被用于计算估计寿命下降的估计值，Johnson，W和Kearfott，K，健康物理学，73：312-319(1997)。如实施例23所示，本发明的蛋白质可增强暴露于辐射之动物的存活，因此，可使用KGF-2增强遭受辐射诱导之损伤的个体的存活率，保护个体使之免受亚致死剂量辐射的影响，在治疗如过度增殖疾病的病痛时增加辐射的治疗率。
也可使用KGF-2保护个体使之耐受正常情况下不能耐受的辐射，化学治疗药物或抗病毒剂的剂量。当以此方式使用时，或要不然的话按本文所述使用时，可在辐射治疗/暴露，化学疗法或用抗病毒剂治疗之前，之后和/或之中施用KGF-2。当治疗患有如过度增殖性疾病的晚期病痛的个体时，大剂量的辐射和化学治疗剂特别有用。
另一方面，本发明提供了预防或治疗如辐射诱导的口腔和胃肠道损伤，粘膜炎，肠纤维变性，直肠炎，辐射诱导的肺纤维变性，辐射诱导的肺炎，辐射诱导的胸膜后缩，辐射诱导的造血综合征，辐射诱导的骨髓中毒性之疾病的方法，所述方法包括给个体施用有效量的KGF-2。
KGF-2可单独使用，也可与一种或多种能赋予抗辐射之保护作用的其它药剂或其它药剂联合使用。多种细胞因子(如IL-1，TNF，IL-6，IL-12)已显示出可赋予这种保护作用，例见Neta，R.等，实验医学杂志，173：1177(1991)。另外，IL-11显示出可保护经辐射和化学疗法联合处理后的小肠粘膜细胞(Du，X.X.等，血液，83：33(1994))和辐射诱导的胸损伤(Redlich，C.A.等，免疫学杂志，157：1705-1710(1996))。几种生长因子已显示出可赋予针对辐射暴露的保护作用，如成纤维细胞生长因子和转化生长因子β-3，Ding，I.等，肿瘤学报，36：337-340(1997)；Potten，C等，英国癌症杂志，75：1454-1459(1997)。
出血性膀胱炎是与某些疾病状态以及接触毒品、病毒和毒素有关的综合症。其表现为膀胱内皮衬里的弥散性出血。已知治疗包括使用血管内、全身用药及非药物疗法(West，N.J.，Pharmacotherapy 17：696-706(1997))。临床上使用的某些细胞毒性剂具有副作用，包括导致膀胱正常上皮增殖的抑制、潜在的上皮层致命性溃疡和破坏。例如，环磷酰胺是一种主要在肝脏中发生生物转化，受混合的功能性微粒体氧化酶系统的作用产生活性烷基化代谢产物的细胞毒性剂。这些代谢产物干扰敏感的快速增殖恶性细胞的生长。据信作用机制涉及与肿瘤细胞DNA的交联(Physcian′s Desk reference，1997)。
环磷酰胺作为一种细胞毒性剂，其引起某些病人的出血性膀胱炎-一种严重的并且有时是致命性的并发症。有或没有膀胱炎时也可发生膀胱的纤维变性。这种损伤被认为是由于尿中排出的环磷酰胺代谢产物引起的。环磷酰胺引起的血尿一般可持续几天，也可能长期存在。有些严重病例需要进行药物或外科手术治疗。严重的出血性膀胱炎需中断环磷酰胺治疗。另外，在环磷酰胺治疗的两年内和以前已有过出血性膀胱炎的病人可发生膀胱癌(CYTOXAN(环磷酰胺)包装内插页)。环磷酰胺对前列腺和雄性生殖系统有毒性作用。环磷酰胺治疗可导致不孕的发展，并导致一定程度的睾丸萎缩。
如图52和53中所示，给病人全身使用KGF-2可刺激膀胱和前列腺上皮细胞增殖。因此，本发明一个方面是提供一种给病人施用有效量的KGF-2多肽，以刺激膀胱和前列腺上皮细胞增殖的方法。更重要的是，如图54和55所示，可使用KGF-2降低由具有副作用的细胞毒性剂引起的，导致膀胱和前列腺上皮细胞增殖抑制的损伤。为了减少这样的损伤，可在用细胞毒性剂治疗之前、之后或治疗期间施用KGF-2。因此，本发明的再一个方面是提供一种给个体施用有效量的KGF-2，以减少由于抑制膀胱或前列腺上皮细胞的正常增殖所导致的损伤的方法。正如已指出的，膀胱或前列腺上皮正常增殖的抑制剂包括放射治疗(引起急性或慢性放射损伤)，和环磷酰胺、白消安及ifosfamide等包括化疗或抗肿瘤药物在内的细胞毒性剂。在另一个方面，本发明涉及施用KGF-2以减少或阻止膀胱纤维变性和溃疡的方法。最好施用KGF-2以防止或缓解出血性膀胱炎。下文将描述适用剂量、配方及给药途径。本文所用的“个体”是指动物，优选指哺乳动物(如类人猿，奶牛，马，猪，公猪，绵羊，啮齿动物，山羊，狗，猫，鸡，猴，兔，雪貂，鲸，海豚)，更优选指人。
通常，使用KGF-2编码氨基酸1至35或36的信号序列，通过杂交和/或计算机检索的算法规则来鉴定分泌的蛋白质。
可使用KGF-2的核苷酸序列通过杂交来分离5’序列，然后将含有受其天然启动子/增强子序列控制的KGF-2基因的质粒用于体外研究，目的是鉴定出KGF-2基因表达的内源性细胞的和病毒的反式激活蛋白。
在设计用于鉴定对KGF-2受体起作用的肽模拟物的实验中，也可将KGF-2蛋白用作阳性对照。
根据本发明的另一方面，提供了将这种多肽、或编码这种多肽的多核苷酸用于与科学研究、DNA合成和DNA载体的制备相关的体外目的和提供人类疾病之诊断和治疗的目的的方法。
全长KGF-2基因的片段可用作cDNA文库的杂交探针以分离全长的KGF-2基因和分离与所述基因具有高度序列相似性或相似的生物活性的其它基因。这种类型的探针一般至少具有20个碱基，然而，优选探针具有至少30个碱基，尽管探针可含有更多个碱基，但一般不超过50个碱基。所述探针可被用来鉴定对应于全长转录本的cDNA克隆和含有包括调节和启动子区域，外显子和内含子的完整KGF-2基因的基因组克隆。一个筛选的例子包括通过使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探针而分离KGF-2基因的编码区。使用具有与本发明基因互补的序列的经标记的寡核苷酸筛选人cDNA文库，基因组DNA文库或cDNA文库以确定探针与文库的哪些成员杂交。
本发明还提供了鉴定KGF-2多肽之受体的方法。通过本领域技术人员已知的多种方法，例如配体淘选和FACS分选(Coligan等，免疫学最新方法，1(2)，第5章(1991))可鉴定出编码该受体的基因。优选进行的表达克隆中聚腺苷酸化的RNA制备自对多肽反应的细胞，由此RNA产生的cDNA文库被分成若干群，并被用于转染COS细胞或对多肽不反应的其它细胞。将在玻璃载玻片上生长的经转染细胞暴露于经标记的多肽中。可通过包括位点特异性蛋白激酶之识别位点的碘化作用或包含作用等的多种方式标记所述多肽。固定和保温之后，对载玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性群，制备亚群，使用重复的亚分群和重新筛选的方法重新转染，最终产生编码推定受体的单一克隆。
作为受体鉴定的另一可替代方法，经标记的多肽可与表达受体分子的细胞膜或提取物制品进行光亲和连接。通过PAGE分析分辨交联的物质，并将所述物质暴露于X-射线胶片。切下含有多肽受体的经标记复合物，分离成肽片段，并进行蛋白质微量测序。使用得自微量测序的氨基酸序列设计一套简并的寡核苷酸探针以筛选cDNA文库从而鉴定出编码推定受体的基因。
本发明提供了筛选化合物以鉴定出可激发KGF-2作用或阻断KGF-2功能的那些化合物的方法。这种测定的一个例子包括在角质形成细胞可正常增殖的细胞培养条件下，将哺乳动物角质形成细胞，欲筛选的化合物和3[H]胸苷相混合。可在缺乏欲筛选的化合物的情况下进行对照试验，并与存在欲测定之化合物时角质形成细胞增殖的量相比较以确定该化合物是否可刺激角质形成细胞的增殖。
为了筛选拮抗剂，可在KGF-2存在下进行相同的试验，测定该化合物阻止角质形成细胞增殖的能力，并测定拮抗剂的能力。通过测定3[H]胸苷掺入的液体闪烁层析确定角质形成细胞增殖的量。
在另一种方法中，可在化合物存在下将表达KGF-2受体的哺乳动物细胞或膜制品与经标记的KGF-2一起保温，然后测定化合物增强或阻断此相互作用的能力。或者，在存在或缺乏该化合物的情况下测定和比较KGF-2和受体间相互作用后已知的第二信使系统的反应。这种第二信使系统包括但不限于cAMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌醇水解。
潜在的KGF-2拮抗剂的例子包括能与该多肽结合的抗体，或者有时为寡核苷酸。或者，潜在的KGF-2拮抗剂可以是KGF-2突变体形式，该突变体形式能与KGF-2受体结合，但不引发产生第二信使反应，因此，有效地阻断了KGF-2的作用。
另一潜在的KGF-2拮抗剂是使用反义技术制备的反义构建体。可使用反义技术通过三股螺旋的形成或者反义DNA或RNA来控制基因表达，这两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，使用编码本发明成熟多肽的多核苷酸序列5’编码部分设计长度约为10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成与涉及转录的基因区域互补(三股螺旋，例见Lee等，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456(1988)；和Dervan等，科学，251：1360(1991))，从而防止转录和产生KGF-2。反义RNA寡核苷酸在体内与cDNA杂交并阻断cDNA分子翻译成KGF-2多肽(反义-Okano，神经化学杂志，56：560(1991)；作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。上述寡核苷酸也可提供给细胞以在体内表达反义RNA或DNA，从而抑制KGF-2的产生。
潜在的KGF-2拮抗剂包括结合并占用KGF-2受体的结合位点从而使受体无法接近KGF-2，进而其正常的生物学活性受到抑制的小分子，这种小分子的例子包括但不限于小肽或肽类分子。
也可使用KGF-2拮抗剂抑制对肿瘤中新血管生长或血管生成的诱导。由KGF-2刺激的血管生成对也可由本发明拮抗剂治疗的几种病理状况同样可起一定的作用，所述病理状况包括糖尿病性视网膜病，和对病理组织生长的抑制，如类风湿性关节炎。
也可使用KGF-2拮抗剂治疗肾小球肾炎，肾小球肾炎的特征在于肾小球上皮细胞显著增殖，形成充满Bowman间隙的细胞团块。
也可使用拮抗剂来抑制外科手术后疤痕疙瘩形成中可见的疤痕组织的过量产生，心肌梗死后的纤维变性或与肺纤维变性和再狭窄相关的纤维损害。也可使用KGF-2拮抗剂治疗由KGF-2刺激的其它增殖性疾病，包括癌症和卡波济肉瘤。
也可使用KGF-2拮抗剂治疗角膜炎，所述角膜炎是特征在于表皮细胞增殖的眼色素层炎症对角膜深层的慢性浸润。
也可在具有下文所述的药学可接受的载体的组合物中使用拮抗剂。
可将本发明的多肽，激动剂和拮抗剂与适当的药用载体联合使用以制成药物组合物。这种组合物含有治疗有效量的多肽，激动剂或拮抗剂和药学可接受的载体或赋形剂。所述载体包括但不限于盐水，缓冲盐溶液，葡聚糖，水，甘油，乙醇及其联合。制剂应适合施用的模式。
本发明也提供了含有一个或多个被本发明药物组合物的一种或多种成分充满的容器的药物包装或试剂盒。随容器所附的是管理药品或生物制品的制备，应用或销售的政府机构建议形式的注意事项，该注意事项反映有关人用药的制备，应用或销售得到了该机构的许可。另外，也可将本发明的多肽，激动剂和拮抗剂与其它治疗性的化合物一起使用。
具有KGF-2活性的多肽可在药物组合物中与一种或多种药学可接受的赋形剂联合施用。应理解当施用于人患者时，护理医生在正确的医学判断范围内可决定本发明药物组合物每天的总用量。任何具体患者的特定治疗有效剂量水平取决于多种因素，包括欲达到的反应的类型和程度，所用其它药剂的特殊组合(如果有的话)；患者的年龄，体重，健康状况，性别和饮食；施用的时间，施用的途径和组合物外泌的速率；治疗的期限；与特定组合物联合或同时使用的药物(如化学治疗剂)；和医学领域众所周知的其它因素。本领域已知的适当制剂见于Remington’sPharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。
考虑到各个患者的临床条件(尤其是仅用KGF-2治疗时的副作用)，KGF-2组合物释放的位点，施用的方法，施用的计划和实际操作人员已知的其它因素，以与良好的医学实践一致的方式配制和服用治疗所用的KGF-2组合物。因此，通过上述考虑可确定用于本文目的的“有效量”的KGF-2(包括KGF-2有效量)。
可以简便的方式，如口服，局部，静脉内，腹膜内，肌内，动脉内，皮下，鼻内或皮内途径施用所述药物组合物。所施用药物组合物的量应能有效地治疗和/或预防特异性的指征。在大多数情况下，考虑到施用的途径，症状等，每天的剂量为每公斤体重约1微克至50毫克。在局部给药的特殊情况下，优选施用的剂量约为每平方厘米0.01微克至9毫克。
尽管如上所述，可在治疗上斟酌剂量，但一般建议每份更优选的剂量中胃肠外施用的KGF-2总的药物有效量范围为每天每公斤患者体重1微克至100毫克。如果连续给药，一般以约1微克/公斤/小时至50微克/公斤/小时的剂量速率，通过每天1-4次注射，或者通过使用例如微泵连续地皮下灌注来施用KGF-2。也可使用静脉内袋装溶液或瓶状溶液。
如果持续天数大于某一最小数目(对小鼠而言为7天)，影响纤维蛋白溶解系统的KGF-2治疗过程似乎是最适的。观察变化所需的治疗时间和治疗后发生反应的间隔长度似乎随所需影响的不同而不同。
通过缓释系统也适于施用KGF-2。缓释组合物适当的例子包括成形物质形式(如薄膜或微胶囊)的半透性聚合物基质。缓释基质包括聚交酯类(美国专利3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(U.Sidman等，生物聚合物，22：547-556(1983))，聚(2-羟乙基异丁烯酸酯)(R.Langer等，生物医学材料研究杂志，15：167-277(1981)，和R.Langer，化学技术，12：98-105(1982))，乙烯乙酸乙烯基酯(R.Langer，文献同上)或聚D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。缓释的KGF-2组合物也包括脂质体包裹的KGF-2。通过已知方法本身可制备含有KGF-2的脂质体，所述方法如：DE 3,218,121；Epstein等，美国国家科学院院报，82：3688-3692(1985)；Hwang等，美国国家科学院院报，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。一般而言，脂质体是小的(约200-800埃)单层型，其中脂类含量大于类固醇的约30摩尔百分比，调节百分比，以达到最佳的KGF-2治疗。
对于胃肠外施用而言，在一个实施方案中，一般通过将所需纯度水平的KGF-2以单位剂量的可注射形式(溶液，悬浮液或乳剂)与药学可接受的载体混合来配制KGF-2，所述载体在所用剂量和浓度下对受体无毒性，并且与制剂中的其它成分相容。例如，优选制剂不包括氧化剂和已知对多肽有害的其它化合物。
通常通过将KGF-2均匀和密切地与液体载体或精细分开的固体载体或这两者接触可制备制剂。然后，如有必要，将产物制成所需的制剂形状。优选载体是胃肠外载体，更优选为与受体血液等渗的溶液。这种载体的例子包括水，盐水，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。如固定油和乙基油酸之类的不含水的载体以及脂质体在本文中也是有用的。本领域中已知的适当的制剂见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。
载体可适当地含有极少量的添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。这种物质在所用剂量和浓度下对受体是无毒性的，包括如磷酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸，乙酸，和其它有机酸或其盐的缓冲液；如抗坏血酸之类的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)的多肽，如多精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；单糖，二糖和包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精等的其它碳水化合物；如EDTA之类的螯合剂；如甘露醇或山梨醇之类的糖醇；如钠之类的相反离子；和/或非离子型表面活性剂，如聚山梨酯，聚羟亚烃或PEG。
一般在pH约为3至8的条件下，以约为0.01微克/毫升至100毫克/毫升，优选为0.01微克/毫升至10毫克/毫升的浓度在所述载体中配制KGF-2。应理解使用上述某些赋形剂，载体或稳定剂会导致KGF-2盐的形成。
用于治疗应用的KGF-2应是无菌的。通过穿过无菌的滤膜(如0.2微米的膜)进行过滤可容易地完成除菌。治疗用的KGF-2组合物一般被置于具有无菌出入口的容器中，例如，静脉内溶液袋，或具有可被皮下注射针头穿透的塞子的小瓶。
通常，KGF-2可作为含水溶液或用于恢复的冻干制剂形式储存在单位剂量或多剂量的容器中，例如，密闭的安瓿瓶或小瓶中。冻干制剂的一个例子是将5ml经除菌过滤的1％(w/v)含水KGF-2溶液灌入10ml的小瓶，将所得混合物冻干。通过使用抑菌的注射用水恢复冻干的KGF-2可制备灌注溶液。
也可以以患者特异性的方式安排服药以便为血液提供经诸如RIA技术测定为预定浓度的KGF-2活性。因此，可调节患者的剂量安排以达到经RIA测定为以约50-1000ng/ml，优选为150-500ng/ml的浓度规则地不断流过血液的水平。
本发明药物组合物的施用方式有：口服，直肠，胃肠外，脑池内，真皮内，阴道内，腹膜内，局部(通过粉末，软膏，凝胶，乳油，滴剂或经皮的补片)，颊，或口或鼻喷雾给药。“药学可接受的载体”是指无毒性的固体，半固体或液体填充剂，稀释剂，包裹材料或任何形式的制剂辅助物。本文所用的术语“胃肠外”指的是包括静脉内，肌内，腹膜内，胸骨内，皮下和动脉内注射和灌注等的施用模式。
优选的KGF-2制剂如美国临时申请60/068493(1997年12月22日提交)所述，此处引入作为参考。
根据本发明，KGF-2多肽，身为多肽的激动剂和拮抗剂也可通过在体内表达而得以应用，这就是常说的“基因疗法”。
因此，例如，可离体用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)对来自患者的细胞进行改造，然后将经改造的细胞提供给需用该多肽治疗的患者。这种方法是本领域所熟知的方法。例如，可以通过本领域熟知的方法，利用含有编码本发明多肽之RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行改造。
类似地，可通过例如本领域熟知的方法，在体内改造细胞以在体内表达多肽。本领域中已知，可给患者施用能产生含有编码本发明多肽之RNA的逆转录病毒颗粒的生产者细胞以在体内改造细胞并在体内表达多肽。鉴于本发明的教导，本领域技术人员可轻易地掌握用来施用本发明多肽的这些和其它方法。例如，用于改造细胞的表达载体不仅可以是逆转录病毒，也可以是腺病毒，所述腺病毒与适当的传递载体联合后可用于在体内改造细胞。其它传递载体的例子包括基于HSV的载体系统，腺相关病毒载体，和惰性的载体，如包被有葡聚糖的铁颗粒。
可从中得到上文所述的逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒，脾坏死病毒，如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemiavirus)，人免疫缺损病毒，腺病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒，和乳癌病毒。在一个实施方案中，逆转录病毒质粒载体得自Moloney鼠白血病病毒。
载体包括一个或多个启动子，可以使用的适当的启动子包括但不限于逆转录病毒的LTR；SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller等，生物技术，第7卷，9：980-990(1989))或任何其它的启动子(例如细胞启动子，如包括但不限于组蛋白，polIII和β-肌动蛋白启动子等的真核细胞启动子)。可使用的其它病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子，胸苷激酶(TK)启动子，和B19细小病毒启动子。鉴于本文的教导，合适启动子的选择对于本领域技术人员而言是显而易见的。
编码本发明多肽的核酸序列受适当启动子的控制。可使用的适当启动子包括但不限于腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克蛋白启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR(包括上文所述的经修饰的逆转录病毒LTR)；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子也可以是控制编码所述多肽之基因的天然启动子。
可使用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产者细胞系。可被转染的包装细胞系的例子包括但不限于PE501，PA317，ψ-2，ψ-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，ψCRE，ψCRIP，GP+E-86，GP+envAm12和Miller，人基因疗法，1：5-14(1990)(全文列入本文作为参考文献)中所述的DAN细胞系。载体可通过本领域已知的任何方法转导包装细胞。所述方法包括但不限于电穿孔，脂质体的应用，和CaPO4沉淀。或者也可将逆转录病毒质粒载体包裹在脂质体中，或与脂类偶联，然后施用于宿主。
生产者细胞系产生含有编码多肽之核酸序列的感染性逆转录病毒载体颗粒。然后可使用这种逆转录病毒载体颗粒在体内或体外转导真核细胞。经转导的真核细胞会表达编码多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞，胚胎癌细胞以及造血干细胞，肝细胞，成纤维细胞，成肌细胞，角质形成细胞，内皮细胞和支气管上皮细胞。
本发明通过施与受试对象有效量的本发明之化合物或药物组合物，优选地本发明之抗体，提供治疗、抑制和预防方法。在一个优选的方面，化合物是基本上纯的(例如，基本上不含有限制其作用效果或产生不希望之副作用的物质)。受试对象优选动物，包括(但不限于)母牛、猪、马、鸡、猫、狗等，并且优选哺乳动物，最优选人。
当化合物包含核酸或免疫球蛋白时，可使用的制剂和施用方法如上所述；额外的合适制剂和施用途径可选自下述。
多种递送系统是公知的，并且可用于施与本发明的化合物，例如包封于脂质体、微颗粒或微胶囊内、可表达该化合物的重组细胞、受体介导的内吞(见例如，Wu和Wu，生物化学杂志262：4429-4432(1987))、将核酸构建为逆转录病毒或其它病毒载体的一部分等。导入方法包括(但不限于)真皮内的、肌内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、硬脑膜外的和经口的途径。化合物或组合物可用任一便捷途径施用，例如通过输液或大丸剂(bolus)注射、通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜)吸收，并且可与其它生物活性剂一同施用。施用可以是系统的或局部的。另外，可希望通过任一合适的途径将本发明的药物化合物或组合物导入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；通过例如，与容器(例如Ommaya容器)连接的脑室内导管可使脑室内注射变得容易。例如通过使用吸入器或喷雾器，以及具有气雾剂的剂型，可进行肺部施用。
在一个特定的实施方案中，可希望将本发明的药物化合物或组合物局部施用于需要治疗处，这一点可通过例如外科手术过程中的局部输注、局部应用来完成，并且以不受限制的方式，其中所述局部应用为，例如与外科手术后的伤口包扎相联系的局部应用、通过注射、通过导管、通过栓剂，或通过植入物方式的局部应用，所述的植入物为多孔的、非多孔的或凝胶状材料，包括膜，例如sialastic膜或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用蛋白质对其不吸收的材料。
在另一个实施方案中，化合物或组合物可于囊泡内递送，特别是脂质体(见Langer，科学249：1527-1533(1990)；Treat等人，脂质体在感染性疾病和肿瘤中的治疗(Liposomes in the Therapy of InfectiousDisease and Cancer)，Lopez-Berestein和Fidler(eds.)，Liss，纽约，353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同前，317-327页；一般来说见上。)
又在另一个实施方案中，化合物或组合物用受控制的释放系统递送。在一个实施方案中，可使用泵(见Langer，supra；Sefton，加拿大红十字会生物医学工程评论(CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.)14：201(1987)；Buchwald等人，外科学(Surgery)88：507(1980)；Saudek等人，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)321：574(1989))。在另一个实施方案中，可使用高分子材料(见受控制释放的医学应用(MedicalApplications of Controlled Release)，Langer和Wise(eds.)，CRCPres.，Boca Raton，弗罗里达(1974)；受控制药物的生物利用度，药物产品设计和性能(Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Designand Performance)，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，大分子科学杂志大分子化学综论(J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.)23：61(1983)；也见Levy等人，科学228：190(1985)；During等人，神经学纪事(Ann.Neurol.)25：351(1989)；Howard等人，神经外科学杂志(J.Neurosurg.)71：105(1989))。又在另一个实施方案中，受控制释放系统可置于治疗目标(即脑)的附近，这样只需要系统剂量的一小部分剂量(见例如Goodson，受控制释放的医学应用(Medical Applications of Controlled Release)，supra，第2卷，115-138页(1984))。
其它受控制的释放系统在Langer(科学249：1527-1533(1990))所写的综述中进行了讨论。
在一个特定的实施方案中，本发明的化合物是编码蛋白质的核酸，该核酸可体内施用，以促进其编码的蛋白质之表达。通过将该核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分，并且施用它使它成为胞内的，例如通过使用逆转录病毒载体(见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过微颗粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂类或细胞表面受体或转染试剂包被，或通过将它连接至已知可入核的同源异型框样肽(见例如Joliot等人，美国国家科学院院报88：1864-1868(1991))而施用它，等等。另外可将核酸胞内导入，并通过同源重组掺入宿主细胞DNA而表达。
本发明也提供了药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的化合物和药学可接受的载体。在一个特定的实施方案中，术语“药学可接受的”是指：经联邦或州政府的调节机构批准的，或列在美国药典或其它公认药典上的可用于动物，并且更明确地可用于人。术语“载体”是指：稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，治疗化合物和它一同施用。此类药学载体可为无菌液体，例如水和油，包括来源于石油、动物、植物或合成的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药学物合物静脉内施用时，水是优选的载体。盐溶液和含水葡萄糖和甘油溶液也可用作液体载体，尤其是可注射溶液。合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、化钠、干燥的脱脂奶、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。如果希望的话，组合物也可包含少量的湿润剂及乳剂，或pH缓冲剂。这些组合物可为溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等。组合物可与传统的结合剂和载体(例如三甘油三酯)制剂为栓剂。口服制剂可包括标准的载体，例如药物级的D-甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、含糖的钠盐、碳酸镁等。E.W.Martin在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中描述了合适的药学载体的实例。此类组合物包含治疗有效量的化合物，优选地以纯化形式、与适量的载体一起，以提供合适的施用形式施与患者。
在一个优选的实施方案中，组合物根据常规步骤配制为适于静脉内施予人的药物组合物。一般地，静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液的溶液。必要时，组合物也可包含溶解剂和局部麻醉剂(如利多卡因)，以减轻注射位点的疼痛。一般，分别地或混合在一起，以单位剂量形式提供成分，例如标有活性因子量的密封容器(例如安瓿或sachette)中的干燥之冷冻干燥粉或无水浓缩物。其中组合物通过输液施用，可用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶来执行之。其中组合物通过注射施用，可提供用于注射的一安瓿无菌水或盐水，以使诸成分可于施用前混合。
本发明的化合物可制剂为中性或盐形式。药学可接受的盐包括那些与阴离子形成的盐，例如那些来自盐酸、磷酸、醋酸、草酸和酒石酸等，以及那些与阳离子形成的盐，例如那些来自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等。
本发明之化合物的量可通过标准的临床技术测定，其中所述的量是治疗、抑制和阻止与本发明之多肽的异常表达和/或活性相关的疾病或紊乱的有效量。此外，可任选体外测定法用于帮助鉴定最佳的剂量范围。在制剂中使用的精确剂量也依赖于施用途径，以及疾病或紊乱的严重性，并且应根据开业医的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可从来自体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线外推。
至于抗体，施与患者的剂量一般为0.1mg/kg至100mg/kg患者体重。优选地，施与患者的剂量在0.1mg/kg至20mg/kg患者体重之间，更优选地为1mg/kg至10mg/kg患者体重。通常人抗体与来自其它种的抗体比较，因为对外源多肽的免疫反应，前者在人体内具有较长的半寿期。这样，施用较低剂量的人抗体和较少的注射频率往往是可能的。进一步地，本发明之抗体的施用剂量和频率可通过改进抗体(例如脂质化)，加强抗体的摄入和组织穿透力(例如，入脑)而减少。
本发明也提供了药物包装或试剂盒，其包含一种或多种容器，其中填充有本发明之药物组合物的一种或多种成分。任选地，与此容器相关的简介可以政府机构规定的形式给出，其中政府机构为系统管理药物或生物产品之生产、使用或销售的政府机构，简介反映了施用于人的生产、使用或销售之机构的批准。基于抗体的治疗用途
本发明还涉及基于抗体的疗法，其包括将本发明的抗体施用于动物，优选哺乳动物，且最优选人，以治疗一种或多种已知的疾病，紊乱或病症。本发明的治疗性化合物包括但不限于，本发明抗体(包括此处公开的片段、类似物和其衍生物)和编码本发明抗体的核酸(包括此处公开的片段、类似物和其衍生物以及抗独特型抗体)。本发明的抗体可用于治疗、抑制或防止与本发明的多肽表达和/或活性异常相关的疾病、病症和紊乱，包括但不限于，此处所述的一种或多种疾病、紊乱和病症。治疗和/或防止与本发明的多肽表达和/或活性异常相关的疾病、病症和紊乱包括但不限于，缓解与这些疾病、紊乱或病症相关的症状。本发明的抗体可以本领域已知的或如此处所述的药学可接受的组合物形式提供。
本发明抗体的治疗性使用的途径总体上包括将本发明的多核苷酸或多肽在体内局部或系统性地结合或通过抗体的直接细胞毒性(例如由补体(CDC)或效应细胞(ADCC)介导的)。这类途径的一些在下面详述。根据此处提供的教导，本领域技术人员无需过分的实验即可知晓如何使用本发明的抗体用于诊断、监测或治疗目的。
本发明的抗体可有利地与其他单克隆或嵌合抗体结合或与淋巴因子或造血生长因子(诸如，IL-2、IL-3、IL-7)一起，例如用于增加与抗体相互作用的效应细胞的活性。
本发明的抗体可单独施用或与其他类型的治疗(例如，放射治疗、化疗、激素疗法、免疫治疗和抗肿瘤剂疗法)一起施用。通常，与患者同源的物种或物种反应性相同(对于抗体而言)的产物的施用是优选的。因此，在一个优选实施方案中，将人抗体、片段衍生物、类似物或核酸施用到人类患者用于治疗或预防。
对于优选采用对于免疫疗法所施用的对象和与本发明的多核苷酸或多肽或其片段相关的疾病而言有高亲和力和/或强体内抑制和/或中和活性的抗体，其针对本发明的多肽或多核苷酸，片段或其中的区域。这类抗体、片段或区域优选地具有针对本发明多核苷酸或多肽(包括其片段)的亲和力。优选的结合亲和力包括那些具有低于如下所述值的解离常数或Kd的那些：5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M和10-15M。染色体测定
本发明的序列也可用于染色体鉴定。该序列特异性地靶向并能与各个人染色体上的特定座位杂交。另外，目前迫切需要鉴定染色体上的特定位点。目前可用来标记染色体座标的基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂较少。将那些序列同与疾病相关之基因相联系的重要的第一步是根据本发明将DNA作图于染色体上。
简言之，通过由cDNA制备PCR引物(优选为15-25bp)可将序列作图于染色体上。使用3’非翻译区的计算机分析快速选择引物，所述引物在基因组DNA中跨越的区域不超过一个外显子，因而不会使扩增过程变得复杂。然后使用这些引物进行含有各个人染色体的体细胞杂合体的PCR筛选。只有那些含有对应于引物的人基因的杂合体会产生扩增的片段。
体细胞杂合体的PCR作图是将特定DNA排布于特定染色体上的快速方法。使用相同寡核苷酸引物，通过本发明，可以类似的方法，用得自特定染色体或大基因组克隆库的一系列片段可进行亚定位。可类似地用于作图至其染色体的其它作图策略包括原位杂交，用经标记的流式分选的染色体进行预筛选和通过与构建染色体特异性cDNA文库杂交进行预选择。
可使用cDNA克隆与中期染色体涂布物的荧光原位杂交(FISH)一步提供精确的染色体定位。短至50或60个碱基的cDNA可使用此技术，有关此技术的综述例见Verma等，人类染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦序列被作图于精确的染色体座位，即可将序列在染色体上的物理位置与基因图谱资料相联系，所述资料例见V.McKusick，人类的孟德尔遗传(可通过约翰霍普金斯大学Welch医学图书馆在网上得到)。然后通过连锁分析(物理上相邻的基因的共遗传性)鉴定已作图于相同染色体区域的基因和疾病之间的关系。
接着，必需确定患病和不患病的个体之间cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或所有患病的个体中观察到突变，而在任何正常的个体中均未观察到突变，那么突变就可能是疾病的引发因子。
最新的物理作图和基因作图技术之分辨力表明，精确定位于与疾病相关之染色体区域的cDNA可以是50至500个潜在的致病基因中的一个(假定作图分辨力为106个碱基，一个基因为20kb)。
参照下列实施例进一步描述本发明；然而，应理解本发明并不局限于这些实施例。除非另有说明，所有的部分或量均为重量。
为了便于理解下列实施例，下面将描述一些常见的方法和/或术语。
“质粒”被命名为：首先是小写的p和/或接着是大写的字母和/或数字。本文的起始质粒或者是可商购的，公众可不费力地得到的，或者是可根据公知技术由可得到的质粒构建的。另外，与本文所述质粒等价的质粒是本领域中熟知的，对于本领域技术人员而言是显而易见的。
DNA的“消化”指的是用仅对DNA中的某些序列起作用的限制性酶催化切割DNA。本文所用的多种限制性酶可以商购，其所用的反应条件，辅因子和其它需求条件是本领域技术人员熟知的。为了进行分析，一般在约20微升的缓冲溶液中将1微克质粒或DNA片段与约2个单位的酶一起使用。为了分离DNA片段以构建质粒，一般在较大的体积中用20至250单位的酶消化5至50微克DNA。特定限制性酶的适当缓冲液和底物的量由制造商指定。一般是在37℃下保温约1小时，但可根据厂商的说明而改变保温时间。消化后，直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳反应产物以分离所需片段。
按Goeddel，D等，核酸研究，8：4057(1980)所述使用8％的聚丙烯酰胺凝胶进行已切割片段的大小分离。
“寡核苷酸”指可以化学合成的一条单链多脱氧核苷酸或两条互补的多脱氧核苷酸链。所述合成的寡核苷酸没有5’磷酸，因此，在存在激酶的条件下，没有用ATP加入磷酸时不能与另一寡核苷酸相连。合成的寡核苷酸可以与未去磷酸化的片段相连。
“连接”指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.等，Id.，p.146)。除非特别说明，每0.5μg近似等摩尔量的待连接DNA片段，可用已知的缓冲液和条件，用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)完成所述连接。
当外源DNA已经被导入细胞膜内时，则该细胞已被所述DNA“转化”。对于构成细胞基因组的染色体DNA来说，外源DNA可以被整合也可以不被整合(共价连接的)至染色体DNA间。例如对于原核生物和酵母而言，外源DNA可以保持在附加型元件如质粒上。就真核细胞而言，稳定转化或转染的细胞是其中外源DNA已经被整合至染色体中以致可通过染色体复制遗传至子代的细胞。通过真核细胞建立由含外源DNA之子代细胞的种群组成的细胞系或克隆的能力可证明这种能力。转化的实例参见Graham，F.& Van der Eb，A.，病毒学(Virology)，52：456-457(1973)。
“转导”或“转导的”指细胞吸收外源DNA并将外源DNA整合至它们的染色体中的过程。例如可通过转染(指细胞用以吸收DNA的各种技术)或感染(用病毒将DNA转移至细胞中)完成转导。基因治疗方法
本发明的另一方面是基因治疗方法，其用于治疗紊乱、疾病和情况。基因治疗方法涉及将核酸(DNA、RNA和反义DNA或RNA)序列导入动物，以获得本发明之KGF-2多肽的表达。该方法需要编码KGF-2多肽的多核苷酸，其与目标组织表达此多肽所必需的启动子和任意其它遗传因子有效连接。此类基因治疗和递送技术为本领域公知，见例如WO90/11092，其于此处引用作为参考。
这样，例如来自患者的细胞可用多核苷酸(DNA或RNA)进行离体构建，其中所述多核苷酸包含启动子，后者与KGF-2多核苷酸有效连接，然后将构建的细胞提供给患者，使患者可被多肽治疗。此类方法为本领域周知。例如见Belldegrun，A.等人，国立癌症研究所杂志(J.Natl.CancerInst.)85：207-216(1993)；Ferrantini，M.等人，肿瘤研究(Cancer Research)53：1107-1112(1993)；Ferrantini，M.等人，免疫学杂志(J.Immunology)153：4604-4615(1994)；Kaido，T.等人，国际肿瘤杂志(Int.J.Cancer)60：221-229(1995)；Ogura，H.等人，肿瘤研究50：5102-5106(1990)；Santodonato，L.等人，人类基因治疗(Human Gene Therapy)7：1-10(1996)；Santodonato，L.等人，基因治疗(Gene Therapy)4：1246-1255(1997)；以及Zhang，J.-F.等人，肿瘤基因治疗(Cancer GeneTherapy)3：31-38(1996)，它们于此处引用作为参考。在一个实施方案中，被构建的细胞为动脉细胞。通过直接注射至动脉、围绕动脉的组织，或通过导管注射，可将动脉细胞重新导入患者。
如下详述，KGF-2多核苷酸构建体可用任一方法递送，其中所述方法将可注射材料递送至动物细胞，例如注射入组织间隙(心脏、肌肉、皮肤、肺、肝等)。KGF-2多核苷酸构建体可以药学可接受的液体或含水载体递送。
在一个实施方案中，KGF-2多核苷酸以裸核苷酸形式递送。术语“裸”多核苷酸(DNA或RNA)指不含任一递送载体的序列，其中所述递送载体起到辅助、促进或利于进入细胞的作用，其包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、脂质转染物或沉淀试剂等。但KGF-2多核苷酸也可以脂质体制剂递送，并且脂质转染物制剂可通过本领域技术人员周知的方法制备。此类方法例如于美国专利号5,593,972、5,589,466和5,580,859中进行了描述，它们于此处引用作为参考。
用于基因治疗方法的KGF-2多核苷酸载体构建体优选既不整合入宿主基因组，也不含有允许复制之序列的构建体。合适的载体包括可从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；以及可从Invitrogen获得的pEF1/V5、pcDNA3.1和pRc/CMV2。其它合适的载体对本领域技术人员是显然的。
本领域技术人员公知的任一强启动子可用于驱动KGF-2 DNA的表达。合适的启动子包括腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；可诱导型启动子，例如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶激酶启动子，例如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子；逆转录病毒LTR；b-肌动蛋白启动子；以及人生长激素启动子。启动子也可以是KGF-2本身的启动子。
与其它的基因治疗技术不同，将裸核酸序列导入目标细胞的一个主要优点在于细胞内多核苷酸合成的暂时本性。研究表明可将非复制的DNA序列导入细胞，以提供长达6个月的目标多肽的产生。
KGF-2多核苷酸构建体可递送至动物的组织间隙，包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺体和结缔组织。组织间隙包含位于器官组织的网状纤维、血管壁或房壁弹性纤维、纤维组织的胶原纤维之间的细胞间流动粘多糖基质，或者包盖肌肉细胞之结缔组织内或骨腔隙内的相同基质。循环的血浆和淋巴管的淋巴液所占据的间隙也是同样的。因为下述原因，优选向肌肉组织间隙递送。它们可通过注射方便地递送至包含这些细胞的组织。虽然可在非分化的或不完全分化的细胞中进行递送和表达(例如血干细胞或皮肤成纤维细胞)，但优选地将它们递送至已分化之持续的、非分裂细胞并于其中表达。体内肌肉细胞摄入并表达多肽的能力特别强。
对于裸核酸序列的注射，DNA或RNA的有效剂量在从约0.05mg/kg体重至约50mg/kg体重的范围间。优选地剂量从约0.05mg/kg至约20mg/kg，以及更优选地从约0.05mg/kg至约5mg/kg。当然作为一般技术的技术人员，可以理解该剂量根据所注射之组织位点而不同。本领域一般技术人员很容易即可测定核酸序列的合适及有效剂量，并且该剂量依据治疗情况和使用途径的不同而不同。
优选的施用途径是通过肠胃外途径注射至组织间隙，但也可用其它肠胃外途径，例如气雾剂吸入法特别地用于向肺或支气管组织、咽喉或鼻粘膜的递送。另外裸KGF-2 DNA构建体可在血管成形术过程中通过导管递送至动脉。
可通过本领域公知的任一方法递送裸多核苷酸，其包括但不限于，直接注射于递送位点、静脉内注射、局部施用、导管输入以及所谓的“基因枪”。这些递送方法为本领域公知。
如实施例中所示，裸KGF-2核酸序列可体内施用实现KGF-2多肽在兔股动脉的成功表达。
构建体也可用递送载体递送，例如病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、脂质转染物、沉淀试剂等。此类递送方法为本领域公知。
在某些实施方案中，KGF-2多核苷酸构建体复合于脂质体制备物中。用于本发明的脂质体制备物包括阳离子的(带正电荷)、阴离子的(带负电荷)和中性制备物。但特别优选阳离子脂质体，因为阳离子脂质体和聚阴离子核酸之间可形成紧密的电荷复合体。阳离子脂质体已显示可介导质粒DNA(Felgner等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1987)84：7413-7416，其于此处引用作为参考)；mRNA(Malone等人，美国国家科学院院报(1989)86：6077-6081，其于此处引用作为参考)；和纯化的转录因子(Debs等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1990)265：10189-10192，其于此处引用作为参考)以有功能形式递送至胞内。
阳离子脂质体易于获得。例如N[1-(2，3-二油酰基氧)丙基]-N，N，N-三乙胺(DOTMA)脂质体尤其有用，并且可从GIBCO BRL，GrandIsland，纽约的Lipofectin商标下获得(也见，Felgner等人，美国国家科学院院报(1987)84：7413-7416，其于此处引用作为参考)。其它可购买到的脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boehringer)。
使用本领域周知的技术可从易于获得的材料制备其它阳离子脂质体。见例如PCT公开号WO90/11092(其于此处引用作为参考)描述的DOTAP(1，2-双(油酰基氧)-3-(三甲胺基)丙烷)脂质体。文献中解释了DOTMA脂质体的制备，见例如P.Felgner等人，美国国家科学院院报84：7413-7417，其于此处引用作为参考。可用类似方法从其它阳离子脂类制备脂质体。
阴离子脂质体和中性脂质体同样地易于获得，例如从Avanti PolarLipids(Birmingham，Ala.)获得，或可容易地用易于得到的材料制备。此类材料包括磷脂酰、胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。这些材料可与DOTMA和DOTAP起始材料以合适比例混合。用这些材料制备脂质体的方法为本领域周知。
例如，市售的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)可用于以多种组合、在加或不加胆固醇时，制备常规的脂质体。这样，例如DOPG/DOPC囊泡可通过将氮气通入超声小玻璃瓶，干燥50mg DOPG和50mg DOPC而制备。样品置于真空泵下过夜，并且第二天用去离子水使其水合。然后在一有盖小玻璃瓶中，用带有倒转杯(水浴型)探头的Heat Systems 350型超声仪，在最大设置下，水浴以15EC循环时，对样品超声2小时。另外，负电荷囊泡可不用超声制备，以产生多层囊泡，或通过挤压使通过核孔膜，以产生不连续大小的单层囊泡。其它方法为本领域技术人员公知并且可以应用。
脂质体包括多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)或大单层囊泡(LUV)，其中优选SUV。可用本领域周知的方法制备多种脂质体-核酸复合体。见例如，Straubinger等人，免疫学方法(Methods of Immunology)(1983)，101：512-517，其于此处引用作为参考。例如含有核酸的MLV可通过以下方法制备：将磷脂薄膜沉淀于玻璃管壁，接下来用含有欲包封材料的溶液使之水化。通过充分超声MLV制备SUV，以产生单层脂质体的均一群。将欲包封材料加至做好的MLVs悬液，然后超声。当使用含有阳离子脂质的脂质体时，用合适的溶液(例如无菌水或等渗缓冲液如10mM Tris/NaCl)重悬干燥的脂质膜，超声，然后将做好的脂质体直接与DNA混合。因为正电荷的脂质体与负电荷的DNA结合，故脂质体和DNA形成很稳定的复合体。发现SUV可用于小的核酸片段。用本领域周知的许多方法可制备LUV。常用方法包括Ca2+-EDTA螯合法(Papahadjopoulos等人，生物化学与生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta)(1975)394：483；Wilson等人，细胞(Cell)(1979)17：77)；乙醚注射(Deamer，D.和Bangham，A.生物化学与生物物理学报(1976)443：629；Ostro等人，生物化学与生物物理学研究快讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)(1977)76：836；Fraley等人，美国国家科学院院报(1979)76：3348)；去污剂透析(Enoch，H.和Strittmatter，P.，美国国家科学院院报(1979)76：145)；以及反相蒸发法(REV)(Fraley等人，生物化学杂志(1980)255：10431；Szoka，F.和Papahadjopoulos，D.，美国国家科学院院报(1978)75：145；Schaefer-Ridder等人，科学(Science)(1982)215：166)，它们于此处引用作为参考。
通常DNA与脂质体的比率从约10∶1至约1∶10，优选地该比率为从约5∶1至约1∶5，更优选地该比率为从约3∶1至约1∶3。而更优选地该比率为1∶1。
美国专利号5,676,954(其于此处引用作为参考)报道了对小鼠注射与阳离子脂质体载体复合的基因材料。美国专利号4,897,355、4,946,787、5,049,386、5,459,127、5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055，以及国际公开号WO94/29469(其于此处引用作为参考)提供了用于向细胞和哺乳动物转染DNA的阳离子脂质。美国专利号5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055，以及国际公开号WO94/29469(其于此处引用作为参考)提供了用于向哺乳动物递送DNA-阳离子脂质复合体的方法。
在某些实施方案中，使用含有RNA的逆转录病毒颗粒，离体或体内基因工程设计细胞，其中所述RNA含有编码KGF-2的序列。可衍生逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括，但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)、脾坏死病毒(spleen necrosisvirus)、劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、Harvey肉瘤病毒(HarveySarcoma Virus)、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒(Myeloproliferative Sarcoma Virus)、乳腺肿瘤病毒。
使用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系，以形成生产者细胞系。可被转染之包装细胞系的实例包括，但不限于，Miller在人类基因治疗1：5-14(1990)中描述的PE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系，其全部于此处引用作为参考。可通过本领域公知的任一方法将载体转导包装细胞。此类方法包括，但不限于，电穿孔、使用脂质体以及CaPO4沉淀。在另一个可选择的方案中，可将逆转录病毒质粒载体包封于脂质体中或与脂质偶联，然后施与宿主。
生产者细胞系产生感染性的逆转录病毒载体颗粒，其包含编码KGF-2的多核苷酸。然后此类逆转录病毒载体颗粒可用于体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达KGF-2。
在某些其它的实施方案中，用包含于腺病毒载体中的KGF-2多核苷酸，离体或体内基因工程设计细胞。可对腺病毒进行操作，使其编码并表达KGF-2，同时就它在正常裂解病毒生存周期中的复制能力而言可被失活。腺病毒的表达可实现，但病毒DNA不整合入宿主细胞染色体，因此减轻了对插入诱变的担心。进一步地，腺病毒被用作活的小肠疫苗已多年，具有相当好的安全特性(Schwartz，A.R.等人，(1974)美国呼吸道疾病综论(Am.Rev.Respir.Dis.)109：233-238)。最后，已在许多例子中对腺病毒介导的基因转移进行了阐述，包括将α-1-抗胰蛋白酶和CFTR转移至棉鼠肺(Rosenfeld，M.A.等人，(1991)科学252：431-434；Rosenfeld等人，(1992)细胞68：143-155)。而且，尝试建立腺病毒作为人肺癌引起因子的深入研究均为阴性结果(Green，M.等人，(1979)美国国家科学院报76：6606)。
可用于本发明的合适的腺病毒载体例如，于Kozarsky和Wilson，遗传学与发展的最新观点(Curr.Opin.Genet.Devel.)3：499-503(1993)；Rosenfeld等人，细胞68：143-155(1992)；Engellhardt等人，人类遗传治疗(Human Genet.Ther.)4：759-769(1993)；Yang等人，自然遗传学(Nature Genet.)7：362-369(1994)；Wilson等人，自然(Nature)365：691-692(1993)；以及美国专利号5,652,224中进行了描述，它们于此处引用作为参考。例如，腺病毒载体Ad2是有用的，其可于293细胞中生长。这些细胞含有腺病毒的E1区，并组成型地表达E1a和E1b，后者通过提供从载体上删除之基因的产物，而与缺陷的腺病毒互补。除Ad2外，其它腺病毒变体(例如Ad3、Ad5和Ad7)也可用于本发明。
优选地，用于本发明的腺病毒为复制缺陷的。复制缺陷的腺病毒需要辅助病毒和/或包装细胞系的帮助，以形成感染性颗粒。所得到的病毒可感染细胞，并且可表达与启动子有效连接的目标多核苷酸，但在大多数细胞中不能复制。复制缺陷的腺病毒可以是对一个或多个下列基因的全部或部分删除：E1a、E1b、E3、E4、E2a，或L1至L5。
在某些其它的实施方案中，用腺伴随病毒(AAV)离体或体内基因工程设计细胞。AAV是自然产生的缺陷病毒，其需要辅助病毒以产生感染性颗粒(Muzyczka，N.，微生物学和免疫学的当前课题(Curr.Topics inMicrobiol.Immunol.)158：97(1992))。它也是可将其DNA整合至非分裂细胞的为数不多的病毒之一。载体可被包装和整合，但外源DNA的空间限制在约4.5kb，其中所述载体含有AAV中的少至300的碱基对。产生和使用此类AAV的方法为本领域公知。见例如美国专利号5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,953、5,478,745以及5,589,377。
例如，用于本发明的合适的AAV载体包括所有DNA复制、包装和宿主细胞整合的所有必需序列。用标准的克隆方法将KGF-2多核苷酸构建体插入AAV载体，例如那些可在Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，纽约(1989)中找到的方法。然后将重组AAV用任一标准技术转染入感染了辅助病毒的包装细胞，其中所述标准技术包括脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀等。合适的辅助病毒包括腺病毒、巨细胞病毒、痘苗病毒或疱疹病毒。一旦包装细胞被转染和感染，它们将产生感染性的AAV病毒颗粒，其包含KGF-2多核苷酸构建体。这些病毒颗粒然后用于或离体或体内转导真核细胞。转导的细胞将含有整合入其基因组的KGF-2多核苷酸构建体，并将表达KGF-2。
基因治疗的另一方面涉及通过同源重组而有效连接异源控制区和内源多核苷酸序列(例如编码KGF-2)(见例如，美国专利号5,641,670，于1997年6月24日公布；国际公开号WO96/29411，于1996年9月26日公开；国际公开号WO94/12650，于1994年8月4日公开；Koller等人，美国国家科学院院报86：8932-8935(1989)；以及Zijlstra等人，自然342：435-438(1989)。该方法涉及基因的活化，其中所述基因存在于目标细胞中，但在细胞中往往不表达，或以较希望的水平要低的水平表达。
用本领域公知的标准技术制备多核苷酸构建体，其包含启动子和启动子侧翼的靶向序列。合适的启动子为此处所描述的启动子。靶向序列与内源序列充分互补，以允许启动子-靶向序列与内源序列之间的同源重组。靶向序列将充分靠近KGF-2目标内源多核苷酸序列的5’末端，以使启动子可通过同源重组而与内源序列有效连接。
启动子和靶向序列可用PCR扩增。优选地，扩增的启动子5’和3’末端含有不同的限制性酶切位点。优选地，第一个靶向序列的3’末端含有与扩增的启动子5’末端相同的限制性酶切位点，并且第二个靶向序列的5’末端含有与扩增的启动子3’末端相同的限制性酶切位点。消化扩增的启动子和靶向序列，并连接在一起。
启动子-靶向序列或以裸核苷酸形式，或以与转染-促进剂(例如上面详述的脂质体、病毒序列、病毒颗粒、全病毒、脂质转染物、沉淀剂等)连接的形式递送至细胞。P启动子-靶向序列可通过任一方法递送，包括直接的针注射、静脉内注射、局部施用、导管输入、粒子加速器等。这些方法在下面进行详述。
启动子-靶向序列构建体被细胞摄入。构建体和内源序列间发生同源重组，以使内源KGF-2序列置于启动子的控制下。然后启动子驱动内源KGF-2序列的表达。
编码KGF-2的多核苷酸可与编码其它造血蛋白质的其它多核苷酸一同施用。此类蛋白质包括，但不限于，酸性和碱性成纤维细胞生长因子、VEGF-1、表皮生长因子α和β、血小板来源的内皮细胞生长因子、血小板来源的生长因子α和β、肿瘤坏死因子α、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、氧化氮合酶。
优选地，编码KGF-2的多核苷酸含有分泌信号序列，其促进蛋白质的分泌。信号序列一般位于欲表达的多核苷酸编码区，朝向或在编码区的5’末端。信号序列对于目标多核苷酸而言，可为同源或异源的，并且信号序列对于被转染的细胞而言，可为同源或异源的。此外，信号序列可用本领域公知的方法化学合成。
可用任一施用模式施用任一上述多核苷酸构建体，只要该模式导致一种或多种分子以足够提供治疗效果的量表达。它包括直接的针注射、系统注射、导管输入、弹道发射注射、粒子加速器(即“基因枪”)、明胶海棉长效药剂、其它市售的长效药剂材料、渗透泵(例如Alza微型泵)、口服的或栓剂的固体(片或丸)药学制剂，以及外科手术过程中的植入或局部应用。例如，将磷酸钙沉淀的裸质粒直接注射至大鼠肝和大鼠脾，或将蛋白质包裹的质粒直接注射入门静脉，可导致大鼠肝中外源基因的表达(Kaneda等人，科学243：375(1989))。
局部施用的优选方法是通过直接注射。优选地，将与递送载体复合的本发明之重组分子通过直接注射施用入或局部施用在动脉区内。将组合物局部施用在动脉区内是指将组合物注射在动脉内数厘米并优选地数毫米。
局部施用的另一种方法是将本发明的多核苷酸构建体与外科伤口接触或在其周围。例如患者可经历外科手术，并且将多核苷酸构建体包被于伤口内的组织表面，或将该构建体直接注射入伤口内的组织区内。
用于系统性施用的治疗组合物包括与本发明之目标递送载体复合的本发明之重组分子。合适的用于系统施用之递送载体包含含有配体的脂质体，其用于将载体靶向特定的位点。
系统性施用的优选方法包括静脉内注射、气雾剂、口服的和经皮的(局部)递送。静脉内注射可用本领域的方法标准进行。气雾剂递送也可用本领域的方法标准进行(见例如，Stribling等人，美国国家科学院报189：11277-11281(1992)，其于此处引用作为参考)。口服递送可通过将本发明的多核苷酸构建体与载体复合而进行，其中所述载体能承受动物肠道消化酶的降解。此类载体的实例包括可塑胶囊或片，正如本领域公知的载体。局部递送可通过将本发明的多核苷酸构建体与可透过皮肤的亲脂试剂(例如DMSO)混合而进行。
对欲递送之物质有效剂量的确定依赖许多因素，包括例如，物质的化学结构和生物活性、动物的年龄和体重、需要治疗的精确情况和其严重性，以及施用途径。治疗频率依赖许多因素，例如每剂施用的多核苷酸构建体的量，以及受试者的健康和历史。精确的量、剂量数及剂量时间将由主治的内科医生或兽医确定。
本发明的治疗组合物可施与任一动物，优选哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、马和猪，其中人是特别优选的。
在一个特定的实施方案中，通过基因治疗方法施用核酸，以治疗、抑制或阻止与本发明之多肽的异常表达和/或活性相关的疾病或紊乱，其中所述核酸包含编码抗体或其功能衍生物的序列。基因治疗指通过施与受试者表达的或可表达的核酸而治疗。在本发明的这个实施方案中，核酸产生由它们编码的蛋白质，后者介导了治疗效应。
根据本发明，本领域用于基因治疗的任一方法均可使用。实例方法如下所述。
基因治疗的概述性综述，见Goldspiel等人，临床药学(ClinicalPharmacy)12：488-505(1993)；Wu和Wu，生物治疗(Biotherapy)3：87-95(1991)；Tolstoshev，药理学与毒理学年评(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)32：573-596(1993)；Mulligan，科学260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，生物化学年评(Ann.Rev.Biochem.)62：191-217(1993)；May，生物技术趋势(TIBTECH11)(5)：155-215(1993)。本领域普遍公知的可使用之重组DNA技术方法于Ausubel等人(eds.)，分子生物学最新方法(CurrentProtocols in Molecu1ar Biology)，John Wiley & Sons，纽约(1993)；以及Kriegler，基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual)，Stockton Press，纽约(1990)中进行了描述。
在一个优选的方面，化合物包括编码抗体的核酸序列，所述的核酸序列为表达载体的一部分，在合适的宿主内表达载体可表达抗体或其片段或其嵌合蛋白质或其重链或轻链。特别地，此类核酸序列具有与抗体编码区有效连接的启动子，所述的启动子可以为可诱导型的或组成型的，和任选的组织特异的启动子。在另一个特定的实施方案中，于所用的核酸分子内，抗体编码序列和任一其它目标序列的侧翼区域为促进在基因组目标位点处进行同源重组的区域，这样提供了核酸编码之抗体的染色体内表达(Koller和Smithies，美国国家科学院院报86：8932-8935(1989)；Zijlstra等人，自然342：435-438(1989))。在特定的实施方案中，表达的抗体分子是单链抗体；另外地，核酸序列包括编码抗体之重链和轻链的序列，或其片段。
核酸可直接或间接地递送给患者，在直接递送的情况时，患者直接接触核酸或携带核酸的载体；在间接递送的情况时，首先体外用核酸转化细胞，然后移植入患者。这两个方法分别公知为体内或离体基因治疗。
在一个特定的实施方案中，体内直接施用核酸序列，在体内该序列表达，产生编码产物。这可通过任一本领域公知的众多方法完成，例如通过将它们构建为合适的核酸表达载体的一部分，并例如，通过缺陷的或减毒的逆转录病毒或其它病毒载体(见美国专利号4,980,286)感染，或通过裸DNA的直接注射，或通过微颗粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，使包封于脂质体、微颗粒或微胶囊内，或通过与已知可进入核的肽连接而施用它们，通过与配体连接而施用它们，其中所述配体可进行受体介导的内吞(见例如，Wu和Wu，生物化学杂志262：4429-4432(1987))(其可用于特异地靶向表达受体的细胞类型)等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合体，其中配体包含破坏内体的融合病毒肽，使核酸可避免溶酶体的降解。又在另一个实施方案中，可将核酸体内靶向，通过靶向特异性受体，使细胞特异性地摄入和表达(见例如，PCT公开号WO92/06180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/14188；WO93/20221)。另外地，可将核酸导入细胞内，并通过同源重组掺入宿主细胞DNA而表达(见Koller和Smithies，美国国家科学院院报86：8932-8935(1989)；Zijlstra等人，自然342：435-438(1989)))。
在一个特定的实施方案中，使用了病毒载体，其含有编码本发明之抗体的核酸序列。例如，可使用逆转录病毒载体(见Miller等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有病毒基因组正确包装及整合入宿主细胞DNA所必需的成分。将用于基因治疗中的编码抗体之核酸序列克隆入一个或多个载体，其中载体促进基因递送给患者。在Boesen等人，生物治疗6：291-302(1994)中可找到对逆转录病毒载体的较详细描述，其描述了将mdr1基因递送至造血干细胞，使干细胞更能耐受化学治疗。阐述逆转录病毒载体用途的其它文献为：Clowes等人，临床检查杂志(J.Clin.Invest.)93：644-651(1994)；Kiem等人，血液学(Blood)83：1467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，人基因治疗4：129-141(1993)；以及Grossman和Wilson，遗传学与发展的最新观点3：110-114(1993)。
腺病毒为可用于基因治疗的另一种病毒载体。腺病毒是将基因递送至呼吸道上皮的特别有吸引力的载体。腺病毒可自然感染呼吸道上皮，它们在那儿引起轻微的疾病。基于腺病毒递送系统的其它目标为肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒有可感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson，遗传学与发展的最新观点3：499-503(1993)一文中给出了基于腺病毒基因治疗的综述。Bout等人，人类基因治疗5：3-10(1994)一文中阐述了用腺病毒载体将基因转移至恒河猴的呼吸道上皮。腺病毒用于基因治疗的其它例子见Rosenfeld等人，科学252：431-434(1991)；Rosenfeld等人，细胞68：143-155(1992)；Masrangeli等人，临床检查杂志91：225-234(1993)；PCT公开号WO94/12649；以及Wang等人，基因治疗2：775-783(1995)。在一个优选的实施方案中，使用了腺病毒载体。
腺伴随病毒(AAV)也被提出可用于基因治疗(Walsh等人，实验生物学与医学会学报(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.)204：289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。
基因治疗的另一种方法涉及将基因转移至组织培养中的细胞，所用方法如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染，或病毒感染。通常转移方法包含将选择标记转移至细胞中。然后将细胞置于选择条件下，以分离那些已摄入并且正在表达转移基因的细胞。然后将这些细胞递送给患者。
在这个实施方案中，先将核酸导入细胞，然后将所获得的重组细胞体内施用。此类导入可通过本领域公知的任一方法进行，其包括(但不限于)转染、电穿孔、微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质体融合等。外源基因导入细胞的许多技术为本领域公知(见例如Loeffler和Behr，酶学方法217：599-618(1993)；Cohen等人，酶学方法217：618-644(1993)；Cline，药学治疗(Pharmac.Ther.)29：69-92m(1985)，只要其不破坏受体细胞必需的进化功能和生理学功能，根据本发明均可使用。该技术应提供核酸至细胞的稳定转移，以使细胞可表达核酸，并且优选地，可被细胞子代遗传和表达。
可用本领域公知的多种方法将所得到的重组细胞递送至患者。重组血细胞(例如造血干细或胞共祖细胞)优选静脉内施用。拟使用的细胞量依据所希望的效果、患者状况等的不同而不同，并且本领域技术人员可确定之。
为了基因治疗目的，可被导入核酸的细胞包括任一希望的、可获得的细胞类型，并且包括(但不限于)上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞，如T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；多种干细胞或祖细胞，特别是例如来自骨髓、脐带血、外周血、胚肝等的造血干细胞或祖细胞。
在一个优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。
在重组细胞用于基因治疗的一个实施方案中，将编码抗体的核酸序列导入细胞，使细胞或其子代可表达它们，然后将重组细胞体内施用，以发挥治疗作用。在一个特定的实施方案中，使用了干细胞或祖细胞。根据本发明的这个实施方案，任一可于体外分离和维持的干细胞和/或祖细胞具有使用潜力(见例如PCT公开号WO94/08589；Stemple和Anderson，细胞71：973-985(1992)；Rheinwald，细胞生物学方法(Meth.Cell Bio)21A：229(1980)；以及Pittelkow和Scott，梅欧医院会议录(Mayo ClinicProc.)61：771(1986))。
在一个特定的实施方案中，为了基因治疗目的而被导入的核酸包含与编码区有效连接的可诱导型启动子，这样通过控制合适的转录诱导剂之存在与否，以使核酸的表达是可控制的。
本发明的化合物或药物组合物优选地，在应用于人之前，对目标治疗或预防活性先进行体外试验，然后进行体内试验。例如阐述化合物或药物组合物之治疗或预防用途的体外测定法包括化合物对细胞系或患者组织样本的作用效果。化合物或组合物对细胞系和/或患者组织样本的作用效果可用本领域技术人员公知的技术测定，其包括，但不限于，玫瑰花结形成测定法、细胞裂解测定法。根据本发明，体外测定法可用于确定是否可施用特定化合物，其包括体外细胞培养测定法，其中患者组织样本生长于培养物中，并且暴露于化合物或施与化合物，观察化合物对组织样本的作用效果。免疫活性
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可通过激活或抑制免疫细胞的增殖、分化或转移(趋化性)而用于治疗免疫系统的缺乏或疾病。免疫细胞通过从多能干细胞产生骨髓(血小板、血红细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)和淋巴(B和T淋巴细胞)细胞的称为血细胞生成的过程而发育。这些免疫缺乏或疾病的病因可能是遗传的、体细胞的(如癌症或一些自身免疫疾病)、获得性的(如通过化疗或毒素)或传染性的。此外，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用作特殊免疫系统疾病或疾病的标记或检测物。
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测造血细胞的缺乏或疾病。在治疗与某些(或许多)类型造血细胞的减少相关的疾病时，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于增加包括多能干细胞在内的造血细胞的分化和增殖。免疫缺陷综合症的例子包括，但不局限于：血液蛋白质疾病(如丙球蛋白缺乏血症、异常γ球蛋白血症)、共济疾病毛细血管扩张血症、常见的可变型免疫缺陷症、Digeorge综合症、HIV感染、HTLV-BLV感染、白细胞附着缺陷综合症、淋巴球减少症、吞噬细胞杀菌功能紊乱、严重联合免疫缺损(SCID)、Wiskott-Aldrich疾病、贫血、血小板减少症或血红蛋白尿症。
此外，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂还可用于调节止血(停止出血)或溶栓活性(血凝块形成)。例如，通过提高止血或溶栓活性，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于治疗血液凝结疾病(如纤维蛋白原缺乏血症、因子缺乏症)、血小板疾病(如血小板减少症)或创伤、手术或其他原因引起的伤口。或者，能降低止血或溶栓活性的KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于抑制凝血或溶解血块，这在治疗心脏病发作(梗塞)、中风或瘢疤形成中是重要的。
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂也可用于治疗或检测自身免疫疾病。许多自身免疫疾病是由于自身免疫细胞不适当地将自身物质识别成外来物而产生的。此不适当的识别引起免疫应答，导致宿主组织的破坏。因此，服用能抑制免疫应答，尤其是T-细胞增殖、分化或趋化性的KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可能是预防自身免疫疾病的有效治疗方法。
用KGF-2可治疗或检测的自身免疫疾病例子包括，但不局限于：艾迪生病、溶血性贫血、抗磷脂综合症、类风湿性关节炎、皮炎、变应性脑脊髓炎、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合症、Graves病、多发性硬化症、重症肌无力、神经炎、眼炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、多内分泌腺病、紫癜、赖特病、僵人综合症、自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性肺炎、Guillain-Barre综合症、胰岛素依赖性糖尿病和自身免疫性炎症性眼疾。
类似地，诸如哮喘(尤其是过敏性哮喘)之类的过敏性反应和状态或其他呼吸问题也可用KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂治疗。此外，这些分子可用于治疗过敏性反应、对抗原分子的超敏性或血型不合。
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂也可用于治疗和/或防止器官排斥或移植物抗宿主病(GVHD)。宿主细胞通过免疫应答破坏移植组织产生器官排斥。类似地，在GVHD中也涉及免疫应答，但在此情况下是外来移植的免疫细胞破坏宿主组织。服用能抑制免疫应答，尤其是T-细胞增殖、分化或趋化性的KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可能是预防器官排斥或GVHD的有效治疗方法。
类似地，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂也可用于缓解炎症。例如，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可抑制参与炎症反应的细胞的增殖和分化。这些分子可用于治疗慢性或急性炎症，包括与感染(如，脓毒性休克、脓毒病或全身炎性反应综合症(SIRS)、局部缺血-再灌注损伤、内毒素致死性、关节炎、补体介导的超急性排斥、肾炎、细胞因子或趋化因子诱发的肺损伤、感染性肠炎、局限性回肠炎或细胞因子过量产生引起的炎症(如，TNF或IL-1)。过度增殖疾病
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测包括瘤形成在内的过度增殖疾病。KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可通过直接或间接的相互作用抑制疾病的增殖。或者，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可使其他能抑制过度增殖疾病的细胞增殖。
例如，可通过提高免疫应答，尤其是提高过度增殖疾病的抗原性或通过T-细胞增殖、分化或转移来治疗过度增殖疾病。通过增强现有免疫应答或激发新的免疫应答可增加该免疫应答。或者，减少免疫应答可能也是治疗过度增殖疾病的方法，如化疗物质。
可用KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂治疗或检测的过度增殖疾病例子包括，但不局限于以下部位的瘤形成：腹部、骨、乳腺、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经(中枢和外周神经、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸和泌尿生殖系统。
类似地，其他的过度增殖疾病也可用KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂治疗或检测。这些过度增殖疾病例子包括，但不局限于：高丙球蛋白血症、淋巴组织增生疾病、异常蛋白血症、紫癜、结节病、赛塞综合症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、戈谢病、组织细胞增多病和位于上述器官系统中除瘤形成外的任何其他过度增殖疾病。心血管疾病
METH 1和/或METH 2多核苷酸或多肽，或METH 1和/或METH2的拮抗剂或激动剂，或编码METH 1和/或METH 2的均可用于治疗心血管疾病，包括外周动脉疾病，如肢体缺血。
心血管疾病包括心血管异常，诸如动脉-动脉瘘、动静脉瘘、脑动静脉畸形、先天性心脏缺陷、肺动脉瓣闭锁和弯刀综合征(部分肺静脉回流异常)。先天性心脏缺陷包括主动脉缩缝、三房心、冠脉异常、十字心、右位心、动脉导管未闭、Ebstein异常、艾森曼格尔复征(先天性心脏病)、左心发育不全综合征、左位心、法洛四联症、大血管移位、右心室双出口、三尖瓣闭锁、永久性躯体微动脉(persistent truncus arteriosus)、和心隔缺损，如主动脉肺动脉间隔缺损、心内膜垫缺损、卢特包阿舍尔综合征(二尖瓣狭窄伴有室间隔缺损)、法洛三联症、心室缺损。
心血管紊乱还包括心脏疾病，诸如心律失常、类癌心脏病、高心排出量、低心排出量、心脏填塞、心内膜炎(包括细菌性)、心动脉瘤、心脏停搏、充血性心力衰竭、充血性心肌病、阵发性呼吸困难、心源性水肿、心脏肥大、充血性心肌病、左心室肥大、右心室肥大、梗塞后心脏破裂、室中隔破裂、心瓣膜疾病、心脏疾病、心肌缺血、心包渗漏、心包炎(包括收缩性的和结核性的)、心包积气、心包切开术后综合征、肺心病、风湿性心脏病、室性障碍、充血、心血管妊娠综合征、弯刀综合征、心血管梅毒、和心血管结核。
心律失常包括窦性心律失常、房性纤颤、房性扑动、心搏徐缓、期前收缩、阿-斯综合征、束支传导阻滞、窦房阻断、QT延长综合征、并行收缩、劳-甘-莱综合征、曼海姆型刺激前综合征、沃-佩-怀综合征、病窦综合征、心动过速、和心室颤动。心动过速包括阵发性心动过速、室上性心动过速、心室自身性心动过速、房室结心动过速或心律不齐、异位房性心动过速、异位交接区性心动过速、窦房结心动过速或心律不齐、窦性心动过速、扭转峰值、和室性心动过速。
心瓣膜疾病包括主动脉瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、[心脏]杂音、主动脉瓣脱垂、二尖瓣脱垂、三尖瓣脱垂、二尖瓣闭锁不全、二尖瓣狭窄、肺动脉瓣闭锁、肺动脉瓣闭锁不全、肺动脉瓣狭窄、三尖瓣闭锁、三尖瓣闭锁不全、和三尖瓣狭窄。
心脏疾病包括酒精性心肌病、充血性心肌病、肥大性心肌病、主动脉瓣膜下狭窄、肺动脉瓣膜下狭窄、限制型心肌病、Chagas心肌病、心内膜弹力纤维增生症、心肌内膜纤维化、Kearns综合征、心肌响应损伤和心肌炎。
心脏缺血包括冠脉疾病，诸如，心绞痛、冠脉瘤、冠状动脉粥样硬化症、冠状动脉血栓形成、冠脉血管痉挛、心肌梗死、心肌击昏。
心血管疾病还包括血管疾病，诸如动脉瘤、血管发育不良、血管瘤病、杆菌性血管瘤病、Hippel-Lindau疾病、克-特-韦综合征、Sturge-WeberSyndrome、血管神经性水肿、主动脉疾病、高安动脉炎、主动脉炎、Leriche综合征、动脉闭锁疾病、动脉炎、enarteritis、结节性多动脉炎、脑血管疾病、糖尿病性血管病、糖尿病性视网膜炎、栓塞、血栓形成、红斑性肢痛病、痔疮、肝静脉闭合疾病、高血压、低血压、缺血、周围血管疾病、静脉炎、肺静脉闭塞性疾病、雷诺氏病、肢端硬皮综合征、视网膜静脉闭塞、弯刀综合征、上腔静脉综合征、毛细管扩张、atacia毛细管扩张、遗传性出血性毛细血管扩张、静脉节瘤、静脉曲张、静脉曲张性溃疡、静脉性不全。
动脉瘤包括夹层动脉瘤、假性动脉瘤、传染性动脉瘤、破裂性动脉瘤、主动脉动脉瘤、脑动脉瘤、冠脉动脉瘤、心动脉瘤和回肠动脉瘤。
动脉闭塞病包括动脉硬化、间歇性跛行、颈动脉狭窄、纤维肌性发育不良、肠系膜血管闭塞、Moyamoya疾病、肾动脉梗塞、视网膜动脉阻塞和血栓性脉管炎消灭。
脑血管疾病包括颈动脉病、脑淀粉样蛋白血管病、大脑瘤、脑缺氧、大脑动脉硬化、脑动静脉畸形、脑动脉疾病、脑栓塞和血栓形成、颈动脉血栓形成、窦血栓形成、Wallenberg综合征、大脑出血、硬膜外血肿、硬膜下血肿、subaraxhnoid血肿、脑梗塞、脑缺血(包括瞬时性的)、锁骨下动脉盗血综合征、脑室周围白质软化、血管性头痛、丛集性头痛、偏头痛、椎基底动脉供血不足。
栓塞包括空气栓塞、羊水栓塞、胆固醇栓塞、蓝趾综合征、脂肪栓塞、肺栓塞和血栓栓塞。血栓形成包括冠状动脉血栓形成、肝静脉血栓形成、视网膜静脉闭塞、颈动脉血栓形成、窦血栓形成、Wallenberg综合征和血栓性静脉炎。
缺血包括脑缺血、缺血性结肠炎、筋膜室综合征、前筋膜室综合征、心肌缺血、再灌注损伤和周围肢体缺血。血管炎包括主动脉炎、动脉炎、Behcet综合征、Churg-Strauss综合征、皮肤粘膜淋巴结综合征、血栓性脉管炎、血栓闭塞性血管炎、过敏性脉管炎、Schoenlein-Henoch紫癜、过敏性皮肤脉管炎、Wegener肉芽肿病。
KGF-2多核苷酸或多肽或KGF-2的拮抗剂或激动剂，特别有效地用于治疗临界肢体缺血和冠脉疾病。
可利用任何本领域已知的方法施用KGF-2，包括但不限于在递送部位直接针头注射、静脉内注射、局部注射、导管灌注、颗粒轰击注射器、颗粒加速器、凝胶泡沫海绵储药物、其他市售的储药材料、蠕动泵、经口、suppositorial固体药物制剂、滗析或在手术中局部应用、气溶胶递送。这些方法为本领域已知。KGF-2多肽可作为药物组合物中的一部分施用，如下面详述。递送KGF-2多核苷酸的方法在下面详述。抗血管生成活性
在内源性刺激物与血管生成抑制剂之间天然存在的平衡是这样的，其中抑制性的影响是占优势的。Rastinejad等，Cell56：345-355(1989)。在那些罕见的情况中，即新血管生成出现在正常生理条件下(诸如创伤愈合、器官再生、胚胎发育和女性生殖过程)时，血管发生受到严格的调控，且在空间和时间上有严格的界定。在病理条件下(诸如表征实体肿瘤生长的那些)血管发生时，这些调控无效。不受调控的血管生成变成病理性的，支持了许多肿瘤和非肿瘤疾病的进展。许多严重的疾病受到非正常血管发生的支配，包括实体瘤的生长和转移、关节炎、一些类型的眼疾和牛皮癣。见例如如下综述：Moses等，Biotech.9：630-634(1991)；Folkman等，N.Engl.J.Med.，333：1757-1763(1995)；Auerbach等，J.Microvasc.Res.29：401-411(1985)；Folkman，Advances in Cancer Research，Klein和Weinhouse编，Academic Press，New York，175-203(1985)页；Patz，Am.J.Opthalmol.94：715-743(1982)；以及Folkman等，Science221：719-725(1983)。在一些病理条件下，血管发生的进展有助于一些疾病状况。例如，已经积累了大量数据，提示实体瘤的生长依赖于血管生成。Folkman和Klagsbrun，Science 235：442-447(1987)。
本发明提供了与血管生成相关的疾病或病症的治疗方法，方法是施用本发明的KGF-2多核苷酸和/或多肽，以及KGF-2的拮抗剂或激动剂，可用本发明的多核苷酸、多肽、激动剂或拮抗剂治疗的恶性和转移性病症包括但不限于，转移、实体瘤和此处所述及本领域移植的癌症(这些实体瘤的综述见，Fishman等，Medicine，第2版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia(1985))。
其他与新血管生成相关、可用本发明的KGF-2多核苷酸和多肽(包括KGF-2的拮抗剂和/或激动剂)治疗的眼病包括但不限于，新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜炎、视网膜母细胞瘤、晶体后纤维增生症、色素层炎、早熟[儿]视网膜病、黄斑退化、角膜移植片新血管生成、以及其他眼部炎性疾病、眼肿瘤和与脉络膜或虹膜血管生成相关的疾病。见例如，Waltman等，Am.J.Ophthal.85：704-710(1978)和Gartner等，Surv.Ophthal.22：291-312(1978)的综述。
此外，可用本发明的KGF-2多核苷酸和多肽(包括KGF-2的拮抗剂和/或激动剂)治疗的疾病包括但不限于，血管瘤、关节炎、牛皮癣、血管纤维瘤、动脉粥样硬化性斑、延迟的创伤愈合、肉芽、血友病关节、肥厚性瘢痕、骨不连接骨折、Osler-Weber综合征、生脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼和血管粘附。
此外，可用本发明的KGF-2多核苷酸和多肽(包括KGF-2的拮抗剂和/或激动剂)治疗的疾病包括但不限于，实体瘤、血液造成的肿瘤，诸如白血病、肿瘤转移、卡波济肉瘤、良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和生脓性肉芽肿、类风湿关节炎、牛皮癣、眼血管生成疾病、例如糖尿病性视网膜炎、早熟[儿]视网膜病、黄斑退化、角膜移植片新血管生成、以及其他眼部炎性疾病、眼肿瘤和与脉络膜或虹膜血管生成相关的疾病、新生血管性青光眼、晶体后纤维增生症、潮红、视网膜母细胞瘤和色素层炎、延迟的创伤愈合、子宫内膜异位、脉管生成、肉芽、肥厚性瘢痕(瘢痕瘤)、骨不连接骨折、硬皮病、沙眼、血管粘附、心肌血管发生、冠脉侧突、大脑侧突、动静脉畸形、局部缺血血管生成、Osler-Webber综合征、黄斑血管生成、毛细管扩张、血友病关节、血管纤维瘤纤维肌性发育不良、创伤肉芽、Crohn病、动脉粥样硬化、生育控制药物，方法是阻止胚植入、控制月经所需的生育控制药、具有作为病理原因的结果之血管生成的疾病，诸如猫抓病(Rochele minalia quintosa)、巴尔通体病和杆菌性血管瘤病。消化系统疾病
KGF-2证明可以刺激胃肠道细胞增殖，因此，KGF多核苷酸、多肽、激动剂和(或)拮抗剂可以用来治疗和(或者)检测消化系统疾病。
能够治疗或检测的消化系统疾病包括：胆道疾病(像胆管类疾病如胆管瘤、胆管梗阻、卡洛里病、胆管炎；胆总管疾病如胆总管囊肿、胆总管结石、胆总管瘤；胆汁回流、胆管闭锁、胆囊运动障碍、胆囊瘘、胆道瘤、胆囊瘤；胆石病如胆总管结石、胆汁阻塞、胆管梗阻、阿拉惹综合症和肝硬变；胆囊疾病如胆囊炎、胆石病、胆囊瘤、胆道出血和胆囊切除术后综合症)，消化系统异常(像肛门闭锁、巴特雷食管、胆管闭锁、横膈突出、食道闭锁、赫希普氏病、肠闭锁、梅克尔氏憩室)，消化系统瘘管(包括胆瘘和食道瘘如气管食道瘘、胃瘘；肠瘘，如直肠瘘)，消化系统瘘管(像肠瘘中的直肠瘘，包括了直肠阴道瘘和胰瘘)，消化系瘤(如胆道瘤，包括胆总管瘤、胆囊瘤)、食道瘤、胃肠瘤如肠瘤如盲肠瘤包括阑尾瘤，如结肠息肉如腺瘤的结肠息肉病，结肠直肠赘如遗传性的结肠直肠瘤和非息肉病，乙状结肠瘤，十二指肠瘤，十二指肠瘤、回肠瘤，肠息肉如结肠息肉如腺瘤性结肠息肉，Gardner综合征和佩杰二氏综合征，空肠瘤，直肠瘤如肛门瘤)，消化系统瘤(像胃肠瘤像肠瘤像直肠瘤包括肛门瘤和肛腺瘤，胃瘤，胰瘤和腹膜瘤)，食道疾病(如巴特雷食管、食道和胃静脉曲张、食道闭锁、食道囊肿、食道憩室如蔡克氏憩室，食道自动能力紊乱如CREST综合征，吞咽紊乱如普温二氏综合征，食道驰缓不能，弥漫性食道痉挛和胃食道回流，食道瘤，食道穿孔如Mallory-Weiss综合症，食道狭窄，食道炎如消化性食道炎，膈疝如外伤性的膈疝，食道裂孔疝)。
可以治疗或检测的胃肠道疾病包括胃肠炎如霍乱，胃肠道出血(如吐血，黑粪症和消化性溃疡)，疝(如膈疝包括外伤性的膈疝和食道裂孔疝，股疝，腹股沟疝，闭孔疝，脐疝和腹壁疝)，肠道疾病(如盲肠病包括阑尾炎，盲肠瘤如阑瘤，结肠疾病如结肠炎包括缺血性结肠炎，溃疡性结肠炎如毒性巨结肠，小肠结肠炎如假膜性肠炎，直肠结肠炎，机能性结肠病如结肠假阻塞，结肠瘤如结肠息肉如腺瘤的结肠息肉病，结肠直肠瘤如遗传性的结肠直肠瘤和非息肉病，乙状结肠瘤，结肠憩室炎，结肠憩室病，巨结肠如赫希普氏病和毒性巨结肠，乙状结肠病如直肠结肠炎和乙状结肠瘤，便秘，克隆氏病，腹泻如婴儿腹泻，痢疾如阿米巴痢疾和杆菌痢疾，十二指肠疾病如十二指肠瘤，十二指肠梗阻如肠系膜上动脉综合征，十二指肠溃疡如库林氏溃疡和十二指肠炎，肠炎如小肠结肠炎其中包括假膜性结肠炎，回肠疾病如回肠瘤和回肠炎，免疫增殖性的小型肠疾病，炎性肠疾病如溃疡性结肠炎和克隆氏病，肠闭锁，肠内寄生虫如嗜伊红性颗粒瘤，滴虫病，球囊菌感染、隐孢子虫病，双核阿米巴病，双核阿米巴病，阿米巴痢疾和梨形虫病。肠瘘如直肠瘘包括直肠阴道瘘，肠瘤如盲肠瘤包括阑尾瘤，结肠瘤如结肠瘤如结肠息肉包括腺瘤的结肠息肉病，结肠直肠瘤如遗传性的结肠直肠瘤和非息肉病，乙状结肠瘤，十二指肠瘤，回肠瘤，肠息肉如结肠息肉如腺瘤的结肠息肉病，Gardner综合征，佩杰二低综合征，肠梗阻如afferent loopsyndrome十二指肠梗阻，嵌塞性粪便，假性肠梗阻如假性结肠梗阻，肠套叠，肠穿孔，肠息肉如结肠息肉包括腺瘤的结肠息肉病，空肠疾病如空肠瘤，吸收不良性综合征如盲环综合征，粥状泻，不耐乳糖症，肠性脂质营养不良，短肠综合征，热带性口炎性腹泻，肠系膜脉管闭合(occlusion mesenteric vascular)，肠壁囊样积气症，小肠蛋白丧失病如肠淋巴管扩张，直肠疾病如肛门疾病包括肛门肿瘤如肛腺，肛裂，肛门瘙痒[症]，大便失禁，痔疮，直肠炎如直肠结肠炎，直肠瘘如直肠阴道瘘，直肠肿瘤如肛门肿瘤如肛腺肿瘤，直肠疾病如直肠脱出，消化性溃疡，消化食管炎，边缘性溃疡，消化性溃疡出血，消化性溃疡穿孔，胃溃疡，Zollinger-Ellison综合征，胃切除术后综合征如倾倒综合征，胃病如无盐酸症，十二指肠胃反流如胆汁回流，胃瘘，胃粘膜脱出，胃出口梗阻如幽门狭窄，胃炎如萎缩性胃炎与肥厚性胃炎，胃轻瘫，胃膨胀，胃憩室，胃肿瘤，胃破裂，胃溃疡和胃肠扭转，胃肠结核[病]，内脏下垂，呕吐如呕血与妊娠剧吐)，胰疾病如囊性纤维化，胰腺囊肿如胰脏假性囊肿，胰腺瘘，胰腺功能不全，胰肿瘤与胰腺炎)，腹膜疾病如乳糜性水腹，腹腔积血，肠系膜囊肿，肠系膜淋巴结炎，肠系膜血管阻塞，腹膜paniculitis，腹膜肿瘤，腹膜炎，气腹，膈下脓肿与腹膜结核[病]。
可以治疗或检测的消化系统疾病包括肝疾病。肝疾病包括急性黄萎缩，肝内胆汁淤积如Alagille综合征和胆肝硬化，脂肪肝如酒精性脂肪肝与Reye综合征，肝静脉血栓形成，肝脏静脉闭塞性疾病，肝炎如酒精性肝炎，动物肝炎如动物病毒性肝炎如传染性犬肝炎与立夫特山谷热，中毒性肝炎，人[类]病毒性肝炎如三角州感染，病毒性甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，慢性活动性肝炎与戊型肝炎，肝豆状核变性，肝大，肝肾综合征，综合征如克-鲍综合征(先天性肝硬变)与食管与胃静脉曲张，肝脓肿如阿米巴[性]肝脓肿，肝硬变如酒精肝硬化，胆[道]的肝硬变与实验性肝硬化，酒精性肝疾病例如酒精性脂肪肝，酒精性肝炎与酒精性肝硬化，寄生性肝疾病如肝脏包虫病，片吸虫病，与阿米巴[性]肝脓肿，肝衰竭如肝性脑病与急性肝衰竭，肝肿瘤，肝紫癜，肝骨髓卟啉病，与肝卟啉症如急性间歇性卟啉病与迟发性皮肤卟啉症，肝结核病与脑-肝-肾综合征)。
能治疗或检测的口颌疾病包括颌疾病(如颌骨增大症，巨细胞肉芽肿，颌异常如腭裂，小颌病，罗宾序列征(原发缺陷-早期下颌发育不良)，凸颌与缩颌，颌囊肿如非牙源性囊肿，牙源性囊肿如戈兰综合征；基底细胞痣综合征，含牙囊肿，钙化性牙源性囊肿，牙周囊肿如牙根囊肿，无牙颌如部份无牙颌，颌肿瘤如下颌骨肿瘤，上颌骨肿瘤与腭肿瘤，下颌骨疾病如颅颌紊乱症包括颞下颌关节疾病如科斯泰综合征；颞下颌关节综合征，下颌骨肿瘤，凸颌与缩颌，上颌骨疾病如上颌骨肿瘤)，口疾病(如眼口生殖器三联综合征，口灼伤综合征，口念珠菌病，干槽症(牙槽窝骨髓炎)，灶性上皮细胞增生，口的白色水肿，口的扁平苔癣，唇疾病如唇炎，唇裂，唇疱疹与唇肿瘤，Ludwig咽峡炎，梅尔克松-罗森塔尔综合征，口异常如唇裂，腭裂，牙龈纤维瘤病，巨舌[症]，巨口，小口与腭咽关闭不全，缺齿口如无牙颌如部份无牙颌，口肿瘤如齿龈肿瘤如齿龈肿瘤，口部粘膜白斑病如毛状白斑，唇肿瘤，腭肿瘤，唾液腺肿瘤如腮腺肿瘤，舌下腺肿瘤与下颌下腺肿瘤与舌肿瘤，坏疽性口炎，口腔瘘如牙瘘，口腔上颌窦瘘与唾液腺瘘，口腔出血如齿龈出血，口的临床表现，口粘膜下纤维症，根尖周炎如根尖周脓肿和根尖周肉芽肿与牙根囊肿)，牙周疾病(如牙槽骨损失，分叉缺陷如齿龈出血，龈增生，龈肥大，齿龈肿瘤，牙龈退缩，牙龈炎如齿龈缝液，龈袋，坏死性溃疡性龈炎，巨细胞肉芽肿与冠周炎，牙周附着体损失，牙周囊肿，牙周炎如牙周脓肿，牙周袋与牙周病，牙脱落，牙丧失，牙移行如牙近中运动与牙齿松动)，舌下囊肿，唾液腺疾病(如米库利奇病(淋巴细胞性泪腺涎腺慢性肿大)，腮腺疾病如腮腺肿瘤与腮腺炎如腮腺炎，唾液腺结石如唾液管结石，唾液腺瘘，唾液腺肿瘤如腮腺肿瘤，舌下腺肿瘤与下颌下腺肿瘤)，唾液腺炎，坏死性唾液腺化生，流涎，下颌下腺疾病如下颌下腺肿瘤，口干燥症如Sjogren综合征，口炎(如Stevens Johnson综合征，阿弗他溃疡性口炎，阿弗他溃疡性口炎，托牙性口炎与疱疹性口炎)，舌疾病(如舌痛，舌炎如良性移行性舌炎)，巨舌[症]，舌疾病(如裂缝舌，多毛舌与舌肿瘤与口结核病)，咽疾病(如咽疾病如鼻咽疾病如鼻咽肿瘤与鼻咽炎)，扁桃体周脓肿，咽的肿瘤如咽下的肿瘤，鼻咽的肿瘤与口咽的肿瘤包括扁桃体肿瘤，咽炎，咽后脓肿，扁桃体炎与腭咽关闭不全)，口颌系统异常，-颞下颌关节疾病如颞下颌关节综合征，牙疾病(如夜间磨牙，牙沉积包括牙石与齿斑，牙齿漏，齿髓疾病包括齿髓自溶，牙髓钙化，牙髓暴露，  牙髓坏疽，继发性牙本质与牙髓炎，牙本质感光性，牙齿病灶感染，牙骨质增生，错颌如创伤的牙，齿隙，错颌角等级I，错颌角等级II，错颌角等级III，氟牙症，牙异常如釉质发生不全如牙轴质发育不全，无牙症，牙齿的密度，牙本质发育异常，牙本质生成不全，被融合的牙，牙体发育异常[症]与额外牙，牙磨损[症]，牙齿脱矿质化如龋齿包括齿裂与齿根龋，牙变色，牙糜烂，异位牙萌出，阻生牙，牙损伤如牙骨折如牙隐裂综合征与牙脱位，牙丧失，牙吸收如齿根吸收和未出牙与牙痛)。眼的疾病KGF-2可刺激眼细胞的增生。因此，KGF-2多聚核苷酸，多肽，激动剂，与/或拮抗剂可用于治疗或检测眼的疾病。
可以治疗或检测的眼部疾病包括眼力疲劳，结膜疾病，结膜肿瘤，结膜炎(过敏的，细菌的，包涵体，新生儿眼炎，沙眼，滤过性毒菌引起的，急性出血的)，角膜结膜炎，角膜结膜炎(传染性或干燥性(sicca))，Reiter’s疾病，翼状胬肉，眼干燥症，角膜的疾病，角膜的营养不良(遗传的)，Fuch’s内皮营养不良，角膜水肿，角膜的肿瘤血管形成，角膜混浊，老年环，角膜炎，棘阿米巴属角膜炎，角膜溃疡，疱疹性角膜炎，树枝状角膜炎，角膜结膜炎，圆锥形角膜，沙眼，眼异常(虹膜缺失，WAGR综合征，无眼[畸形]，睑裂狭小，缺损，晶状体异位，眼积水，小眼，视网膜发育不良)，遗传的眼疾病(白化病，眼白化病，眼皮肤白化病，眼皮肤白化病，无脉络膜，遗传的角膜营养不良，螺旋状萎缩，遗传性视神经萎缩，视黄醛发育异常，色素性视网膜炎)，眼出血(脉络膜出血，前房出血，视网膜出血，玻璃体出血)，眼感染(角膜溃疡，细菌的眼感染，细菌性结膜炎，包涵体性结膜炎，新生儿眼炎，沙眼，麦粒肿，传染性角膜结膜炎，眼的结核病)，真菌的眼感染，寄生的眼感染(棘阿米巴属角膜炎，眼的盘尾丝虫病，眼弓形体病)，病毒的眼感染(病毒性结膜炎，急性的出血性结膜炎，巨细胞病毒视网膜炎，带状疱疹眼炎，疱疹性角膜炎，树枝状角膜炎)，化脓性的色素层炎(眼内炎，全眼球炎)，眼损伤(眼灼伤，眼异物，眼贯通伤)，眼临床表现，眼肿瘤(结膜的肿瘤，睑肿瘤，眼眶瘤，眼色素层的肿瘤(脉络膜肿瘤，虹膜肿瘤)，睑疾病(睑缘炎，睑裂狭小，睑下垂，眼睑痉挛，睑板腺囊肿，睑外翻，睑内翻，睑肿瘤，睑腺炎)，泪器疾病(泪囊炎，干眼综合征，干燥性角结膜炎，Sjogren综合征，眼干燥症，泪管阻塞)，晶状体疾病(无晶状体，poscataract无晶状体，白内障，晶状体半脱，晶状体异位，眼高压，青光眼(角度闭合，新脉管(neovascular)，角度开放，眼积水)，低眼压，眼球能动性障碍(弱视，眼震，动眼神经麻痹，眼肌麻痹(杜安氏综合征(后退性斜视)，Horner′s综合征，慢性进行性外眼肌麻痹，Kearns综合征)，斜视(内斜视)，光学神经疾病(视神经萎缩，遗传性视神经萎缩，光学盘玻璃疣，视神经炎，视神经脊髓炎，视[神经]盘水肿)，眶疾病(眼球内陷，眼球突出，Graves′疾病，眶浆细胞肉芽肿，眶肿瘤)，瞳孔功能畸形(瞳孔不等，阿迪综合征，Adie综合征，瞳孔缩小，瞳孔放大，Horner′s综合征)，屈光误差(物象不等，屈光参差症，散光[眼]，远视，近视[眼]，老视)，视网膜疾病(血管样条纹症，糖尿病[性]视网膜病，视网膜动脉阻塞，视网膜变性，斑点变形，囊样黄斑水肿，视网膜玻璃疣，视网膜炎色素症，Kearns综合征，视网膜剥离，视网膜发育不良，视网膜出血，视网膜新血管形成，视网膜穿孔，视网膜静脉阻塞，视网膜炎(脉络膜视网膜炎，巨细胞病毒视网膜炎，急性视网膜坏死综合征)，早熟[儿]视网膜病，增殖性玻璃体视网膜病变)，巩膜疾病(巩膜炎)，眼色素层疾病(脉络膜疾病，脉络膜出血，脉络膜肿瘤，无脉络膜，脉络膜炎，脉络膜视网膜炎，pars lanitis，螺旋状萎缩)，虹膜疾病(表皮剥脱综合征，虹膜睫状体炎，虹膜肿瘤)，葡萄膜炎(全眼色素层炎，交感性眼炎，前面的Behcet综合征，虹膜睫状体(iriocyclitis)，虹膜炎，后葡萄膜炎，脉络膜炎，脉络膜视网膜炎，睫状体平部炎，中间葡萄膜炎，睫状体平部炎，化脓性的葡萄膜炎(眼内容炎，全眼球脓炎)，uveomeningoencephalitic综合征)，全眼球脓炎(弱视，失明，；偏盲，色觉缺陷，复视，夜盲症，盲点，正常以下的视力)，与增殖性玻璃体视网膜病变。皮肤与结缔组织病
KGF-2可以刺激皮肤与结缔组织细胞增殖。因此，KGF-2多聚核苷酸，多肽，激动剂，与/或拮抗剂可用于治疗与/或检测皮肤与结缔组织疾病。
结缔组织疾病包括：软骨疾病，如复发性多软骨炎与Tietze综合征；蜂窝[组]织炎；胶原病，例如Ehler′s Danlos综合征，瘢痕疙瘩(包括痤疮性瘢痕疙瘩)，粘多糖病I型，渐进性坏死病症(包括环形肉芽肿，脂性渐进性坏死)，与成骨不全；皮肤松弛症；皮肌炎；Dupytren′s挛缩，高胱氨酸尿；红斑狼疮(包括皮肤的，平圆形的，脂膜炎，系统性的与布赖特病；马凡综合征；混合性结缔组织病；粘蛋白沉积症，包括小囊的，粘多糖病(1，II，UU，IV，IV，和VII型)，粘液性水肿，成人硬化病与滑膜囊肿；结缔组织肿瘤；努南综合征；脆弱性骨硬化；脂膜炎，包括硬结性红斑，结节非化脓性的和腹膜的；阴茎硬结；弹性假黄色瘤；风湿性疾病，包括关节炎(类风湿，幼年期类风湿，卡普兰综合征，Felty综合征，类风湿小结，强直性脊柱炎，与Still病)，骨肥大，多肌痛风湿症；局限性硬皮病与系统性硬皮病(肢端硬皮综合征)。
皮肤病包括由于嗜酸[粒]细胞增多的血管淋巴样增生；瘢痕(包括肥大性的)；皮肤瘘，皮[肤]松懈；皮肤炎，包括肢皮炎，特应性皮炎，接触性皮炎(变应性的接触，光过敏，漆树属)，刺激剂皮炎(光毒[敏性植物]，尿布疹)，职业性皮肤炎，脱落皮肤炎，疱疹样皮肤炎，脂溢性皮炎，药疹(例如中毒性表皮坏死溶离，结节性红斑，血清病)湿疹，包括出汗障碍，擦烂，神经性皮炎，和放射性皮肤炎；皮肌炎；红斑，包括慢性迁移，硬结的(induratum)，传染性的(infectiosum)，多形性的(Stevens-Johnson综合征)，和结节性的(Sweet综合征)；疹，包括subitum；面部皮肤病，包括痤疮样疹(瘢痕瘤，酒渣鼻，普通的和Favre-Racouchot综合征)；足部皮肤病，包括脚癣；掌部皮肤病；角化棘皮瘤；角化症，包括胼胝，胆脂瘤(包括中耳)，鱼鳞病(包括先天性鱼鳞病样红皮病，表皮松解过度角化[症]，薄层状的-鱼鳞癣，普通鱼鳞藓，X-链锁性鱼鳞癣，与Sjogrcn-Larsson综合征)，淋病性皮肤角皮病，palmoplantar角皮病，小囊角化症，脂溢性角化病，角化不全与汗孔角化[病]；腿部皮肤病，肥大细胞增生(内特尔希普病)，渐进性坏死的病症(环形肉芽肿与脂性渐进性坏死)，感光性病症(光过敏或光毒性皮肤炎，夏季牛痘样疮，晒伤，与着色性干皮病)；色素沉着病症，包括银中毒，色素沉着过度，黑变病，aconthosis nigricans，斑痣，Peutz-Jeghers综合征，色素沉着不足，白化病，pibaldism，vitiglio，色素失调症，内特尔希普病，与皮肤干燥症着色性干皮病。
更多的皮肤病症的例子包括痒疹；瘙痒(包括肛门的与女阴)；脓皮病(包括深脓疱与脓皮病走马疳；sclap皮肤病；成人硬皮病；新生儿硬化病；皮肤附件疾病，包括毛发疾病(脱发，毛囊炎，(妇女)多毛症，多毛症，卷毛综合征)，甲疾病(指甲髌骨综合征，生进肉内的或畸形的指甲，甲真菌病，甲沟炎)，皮脂腺软垢(肥大性酒渣鼻，肿瘤)，汗腺疾病(汗腺炎，多汗症，少汗，粟粒疹，FoxFordyce疾病，肿瘤)；遗传的皮肤病，包括alfinism，皮肤松弛症，良性的家族性的天疱疮，卟啉病，肢端皮炎，外胚层发育不良症，埃利斯-万柯莱韦德综合征(软骨外胚层发育不良综合征)，病灶表皮再生不良，埃勒斯-当洛综合征，大疱性表皮松解症，鱼鳞病；感染性皮肤病，包括皮肤真菌病，芽生菌病，念珠菌病，着色芽生菌病，足[马杜拉]分支菌病，副球孢子菌病，孢子丝菌病，癣；细菌性皮肤病，例如面颈部放线菌病，杆菌性血管瘤病，深脓疱，丹毒，红斑慢性迁移，红癣，腹股沟肉芽肿，，化脓性的汗腺炎，足[马杜拉]分支菌病，甲沟炎，南美锥虫病，鼻硬结病，葡萄球菌皮肤感染(疖病，痈，脓疱病，鳞屑性皮肤综合征)，皮肤梅毒，皮肤结核病，印度痘；寄生性皮肤病，包括幼体迁徙动物，美洲利什曼病，虱病，与疥疮；病毒性皮肤病，包括传染性红斑，幼儿急疹，单纯疱疹，moolusum contagiosum，与疣。
更多的皮肤病包括新陈代谢的皮肤病，例如德卡姆病，脂质营养不良，脂性渐进性坏死，porhphyria，幼年黄色肉芽肿，黄瘤病(沃尔曼病)；丘疹鳞屑性皮肤病，包括青苔状疹，parpasoriasis，糠疹，和干癣；血管的皮肤病，例如Behcet综合征，皮肤粘膜的淋巴结综合征，结节性多动脉炎，脓皮病gangernosum，Takayasu动脉炎；vesculobullous皮肤病，包括皮肤棘层松解，大水疱，妊娠疱疹，hybroa vacciniforme，类天疱疮，天疱疮；皮肤肿瘤；皮肤溃疡，例如褥疮溃疡，腿部溃疡，足部溃疡，糖尿病的足部溃疡，静脉曲张性溃疡与脓皮病走马疳。泌尿生殖器疾病与障碍
KGF-2可刺激泌尿生殖器道细胞增生。因此，KGF-2多聚核苷酸，多肽，激动剂，与/或拮抗剂可用于治疗和/或检测男性和女性生殖疾病与/或障碍和妊娠并发症。
能治疗或检测的泌尿系和男性生殖系的疾病的例子包括附睾炎，男性生殖的肿瘤，阴茎肿瘤，前列腺肿瘤，睾丸肿瘤，鞘膜积血，生殖器疱疹，阴囊积水，男性不育症，精子减少[症]，阴茎疾病包括阴茎头炎，尿道下裂，阴茎硬结，阴茎肿瘤，包茎，嵌顿包茎，阴茎异常勃起，前列腺疾病例如肥大，肿瘤，与前列腺炎，性障碍例如阳萎与血管性阳萎，精索扭转，精液囊肿，睾丸疾病包括隐睾症，睾丸炎与睾丸肿瘤，男性生殖器结核病，静脉节瘤，泌尿生殖器的结核病(男性生殖的，肾的)，泌尿生殖器的异常，膀胱外翻，隐睾症，尿道上裂，尿道下裂，多囊肾(常染色体优势与常染色体隐性)，遗传性肾炎，性别分化障碍，性腺发育障碍症，混合的性腺发育障碍症，两性畸形，假两性畸形，性幼稚-失嗅综合征，克兰费尔特综合征，睾丸女性化，WAGR综合征，泌尿生殖器肿瘤，男性生殖器肿瘤(阴茎的，前列腺的，睾丸的)，泌尿肿瘤(膀胱，肾，输尿管的，尿道的)，膀胱疾病(结石，外翻，瘘，膀胱阴道瘘，颈梗阻，肿瘤，神经性的，膀胱炎，膀胱输尿管反流)，血尿，血红蛋白尿，AIDS-关联的肾病，无尿，少尿，糖尿病肾病，Fanconi综合征，肝肾综合征，肾积水，原发性高草酸盐尿症，肾性高血压，肾脉管高血压，肾结石，肾皮质坏死，囊肾，多囊肾，polycistic kidney(常染色体优势，常染色体隐性)，海绵肾，肾衰竭(肾源性disbetes insipidus，急性肾衰竭，肾乳头坏死)，肾炎(肾小球肾炎(IGA，膜增生性的，膜的，病灶的，Goodpasture综合征，狼疮肾炎)，遗传性肾炎，insterstitial肾炎，巴尔干肾病，肾盂肾炎，黄色肉芽肿性肾盂肾炎，肾钙沉着症，肾硬化症，肾变病，脂性肾病，肾病综合征，肾周围炎)，肾盂炎(pyelocystitis，肾盂肾炎，黄色肉芽肿性肾盂肾炎)，肾动脉梗阻，肾性骨营养不良[症]，先天性肾小管转运错误，肾小管性酸中毒，肾性氨基酸尿，胱氨酸尿症，哈特奈扑病，胱氨酸病，Franconi综合征，肾性葡糖尿症，先天性遗传性肾小管性酸中毒，眼脑肾综合征，假性醛固酮减少症，肾结核，尿毒症，加瑟综合征，Wegener肉芽肿病，泽韦格综合征，蛋白尿，白蛋白尿，输尿管疾病包括输尿管结石，输尿管肿瘤，输尿管梗阻，输尿管脱垂，尿道疾病包括尿道上裂，尿道肿瘤，尿道阻塞，尿道狭窄，尿道炎(Reiter病)，泌尿结石(膀胱，肾，输尿管)，尿瘘(膀胱瘘(膀胱阴道瘘))，尿道感染(细菌性的，脓尿，埃及血吸虫病)，与排尿障碍(遗尿[症]，多尿症，尿失禁，应激相关的尿失禁，尿潴留)。
可治疗或检测的女性生殖的疾病与妊娠并发症的例子包括附件疾病包括子宫附件炎(卵巢炎，子宫旁组织炎，输卵管炎)，输卵管疾病例如输卵管肿瘤与输卵管炎，卵巢疾病(不排卵，卵巢炎，卵巢囊肿，多囊卵巢综合征，卵巢功能早衰，卵巢过度刺激综合征，卵巢肿瘤，Meigs′综合征)，卵巢冠囊肿，子宫内膜异位[症]，女性生殖的肿瘤卵巢的肿瘤，子宫肿瘤，宫颈肿瘤，子宫内膜肿瘤，阴道肿瘤，外阴肿瘤，阴道闭锁，阴道积血，子宫积血，生殖器疱疹，女性不孕症，月经障碍包括无月经(因生病或怀孕)，痛经，月经过多，月经稀发，与月经前综合征，假孕，性别障碍例如dypareunia和女性的性冷淡，泌尿生殖器结核[病]，女性生殖器结核，泌尿生殖器疾病包括膀胱外翻，尿道上裂，多囊肾(常染色体优势与常染色体隐性)，遗传性肾炎，性别分化障碍包括性腺发育不全(46 XY，混合的)，Turners′综合征，两性畸形，假两性畸形，Kallmann′综合征，WAOR综合征，泌尿生殖器肿瘤，泌尿肿瘤(膀胱，输尿管，尿道)，子宫疾病包括子宫颈疾病(子宫颈炎，宫颈糜烂，宫颈肥大，宫颈无力，宫颈肿瘤)，子宫内膜增生，子宫内膜炎，子宫出血，月经过多，子宫不规则出血，子宫肿瘤包括宫颈肿瘤与子宫内膜肿瘤，子宫脱垂，子宫破裂，子宫穿孔，阴道疾病包括外阴阴道的念珠菌病，性交痛，阴道积血，白带，阴道瘘，直肠阴道瘘，膀胱阴道瘘，阴道肿瘤，阴道炎(毛滴虫阴道炎，细菌性阴道病，细菌性阴道病)，妊娠并发症包括习惯性流产，子宫颈无力，不完全流产，稽留流产，流产感染，先兆流产，兽医性流产，死胎，胚胎再吸收，胎儿再吸收，胎儿疾病(绒毛膜羊膜炎，胎儿骨髓成红血细胞增多症，水肿fetalis，胎儿酒精综合征，胎儿缺氧，胎儿窘迫，胎儿发育迟缓，巨大胎儿，与胎粪误吸，妊娠疱疹，分娩并发症包括胎盘分离，难产，宫缩乏力，早产儿胎膜破裂，绒毛膜羊膜炎，侵入性胎盘，前置胎盘，产后出血，子宫破裂，早产，羊水过少，母亲苯丙酮尿，胎盘疾病(胎盘分离，绒毛膜羊膜炎，侵入性胎盘，胎盘潴留，胎盘不适当)，羊水过多，心血管的妊娠并发症，羊水栓塞，血液学的妊娠并发症，感染性妊娠并发症(流产感染，寄生的-妊娠并发症，产褥感染)，瘤性妊娠并发症(滋养层肿瘤，绒毛膜癌，葡萄胎，侵袭性葡萄胎，胎盘部位滋养层肿瘤)，异位妊娠，腹腔妊娠，输卵管妊娠，糖尿病妊娠，糖尿病妊娠，巨大胎儿，妊娠outcome，妊娠毒血症(子痫，HELLP综合征，先兆子痫，EPH妊娠中毒，妊娠剧吐)，产褥期病症，泌乳障碍例如恰-弗综合征(哺乳期过长所致子宫萎缩)，乳溢，与乳腺炎，产后出血，与产褥感染。不育(孕)
如上所言，KGF-2多聚核苷酸，多肽，变体，抗体，激动剂与/或拮抗剂可用来治疗男性或女性不育(孕)症。因此，在一个实施方案中提供了如下方法：利用KGF-2多聚核苷酸，多肽，变体，抗体，激动剂与/或拮抗剂治疗与/或防止男性不育症。另一实施方案中可利用KGF-2多聚核苷酸，多肽，变体，抗体，激动剂与/或拮抗剂治疗与/或防止女性不育(孕)症。用于治疗不育(孕)优选的KGF-2多肽包括KGF-2 A33，全长和成熟的KGF-2，KGF-2 A28，和包含KGF-2氨基酸77至208，80至208，以及93至208的多肽；以及任何此处描述的KGF-2突变体也优选编码这些多肽的多核苷酸。
对于不孕的处理或防止，优选的KGF-2给药方式包括口服，直肠内，胃肠外，脑池内，皮内，阴道内，腹膜内，表皮(通过散剂，软膏，凝胶，乳膏，滴剂或透皮药贴)，口腔的，或作为口或鼻的喷雾剂。其他的给药方式在此处描述。优选的，KGF-2多核苷酸、多肽、变体、抗体、激动剂和/或拮抗剂与作为药用组合物的一部分之药物载体一起施用。适合的载体如此处所述。
KGF-2多聚核苷酸，多肽，变体，抗体，激动剂与/或拮抗剂可用来治疗各种原因引起的不育，包括环境原因，例如咖啡，MSG，塑料，Nutrasweet，酒精，食物添加剂，化学制品，香烟，杀虫剂，车辆排气，与污染；年龄；先天不育；低精子计数；传染病，例如腮腺炎，结核病，流感，天花，巨细胞病毒(CMV)，感染，衣原体，支原体，淋病，梅毒与其他的两性之间传输的疾病；内分泌疾病，例如糖尿病；神经学上的疾病，例如截瘫；高度发热；子宫内膜异位[症]；毒素，例如油漆的铅，防龋涂膜与自动制造业的因子，环氧乙烷，化学与原料工业物质例如纸张制造业；化学疗法；低体重或体重过失；肥胖症或体重增加过度；紧张；卵巢障碍；荷尔蒙失调，皮质醇增多综合征；输卵管堵塞；骨盆感染；手术粘连；子宫内避孕器(IUD)；颈的障碍，例如构造上的问题，颈的感染，与粘液质量；颈的狭窄；子宫病症，例如子宫内的粘连，创伤与/或子宫垫片感染，子宫腔粘连综合征，子宫平滑肌瘤；卵巢的瘢痕组织；卵巢囊肿，包括巧克力[样]囊肿；精子活力不足；成熟停止；hypospermia；Sertoli细胞综合征；促性腺[激]素不足，包括因为垂体瘤扩大而导致的LH与FSH分泌问题，源于外科损伤的，或对部分血液供应破坏的颅外部创伤；同化的类固醇类；烟碱；违禁药物，例如大麻，海洛因，和可卡因；碱性因子，procarbozine，一些用于杀虫剂的卤代烃，与频繁的暴露于大量的酒精；盆腔炎症性疾病(PID)；附睾炎；暴露于毒性物质或公害，例如铅，镉，汞，环氧乙烷，氯乙烯，放射性，与X-射线；用于溃疡或鳞癣的处方药；子宫内DES接触；男性生殖器暴露于高温--热沐浴，回旋池，蒸气室；疝复位；隐睾；维生素缺乏；先兆流产；与环磷酰胺。
KGF-2多聚核苷酸，多肽，变体，抗体，激动剂与/或拮抗剂可用于治疗或预防原发的或继发的不育(孕)。KGF2可用于治疗暂时的或永久的不育(孕)。
KGF-2多聚核苷酸，多肽，变体，抗体，激动剂与/或拮抗剂可连同其他的促生育力物质一起施用例如舒经酚柠檬酸盐(枸橼酸氯芪酚胺，磷酸丝氨酸)，孕[甾]酮，与/或17β雌二醇。
KGF-2可用于治疗女性在自然受孕或在辅助受孕中的不育(孕)。辅助再生技术包括体外授精(IVF)，胚胎移植(ET)，配子输卵管内转移(GIFT)，受精卵输卵管内转移(ZIFT)，利用供体精子、卵和供体胚胎的IV下，卵和胚胎的显微操作。在试管受精和胚胎移植中，卵母细胞如外科手术般地移出，体外受精，然后放置在同一个妇女的子宫或输卵管中。在卵母细胞的捐赠中，卵母细胞从供体取出，然后通过IVF它被转移到不孕的接受者如胚胎移植中所述。这过程需要供体与接受者之间同步化，其一般是通过向接受者施用类固醇激素来实现。
在常规试管受精和胚胎移植中，设定引起多卵泡发育的治疗常常导致黄体的功能不足。因此，植入受精卵进入子宫内膜的过程如果没有追加的如KGF-2的分子处理过程便不能发生。
用于治疗或预防女性不育(孕)的KGF-2递送传选方法是经由阴道环的持续释放，如美国专利No.5,869,081中所公开，此处引入作为参考。
聚硅氧烷载体用来做为孕[甾]酮的递送载体正如泌乳期妇女用的避孕剂  (Croxatto等，1991，in″Female Contraception and MaleFertility Regulation.Advances in Gynecological and ObstetricResearch Series″，Reinnebaum等，eds.)与雌二醇在停经妇女中的递送(Stumpf等(1982)，J.Clin.Endocrinol.Metab.，58：208)。Simon等，(1986)，受精与不育，46：619公开了17β-雌二醇与/或孕[甾]酮-饱和的聚硅氧烷阴道环与圆柱(体)用于在有功能的发生殖腺妇女中揶宫内膜准备。阴道环与圆柱(体)的使用可使血清中17β-雌二醇与孕[甾]酮水平在一个完整的月经周期达到正常。美国专利4,816,257公开了含有17β-雌二醇或17β-雌二醇和孕[甾]酮的聚硅氧烷环用于在有功能的无生殖腺女性人类中模仿正常类固醇激素水平的用途。
本发明提供了一种为怀孕的确立和维持而施用KGF-2的方法。发明方法为在女性阴道内插入包含KGF-2的载体并在阴道内保持该载体大约1-28天。在一个优选实施方案中，该载体是一种聚硅氧烷环，其体外释放率从约1μg/天至1000mg/天，这个剂量取决于治疗角度。
此外，这个方法可用来治疗或预防女性辅助生殖中的不孕。这个方法包括插入一个含有KGF-2的载体至女性阴道中并在阴道内保持载体直到怀孕大约7-12周。在一个优选实施方案中，载体是具约1μg/天到1000mg/天体外释放率的KGF-2的聚硅氧烷环。
本发明涉及KGF-2给药于具有卵巢功能的妇女和有功能的无生殖腺妇女的给药方法。因为他们的配偶不育而不孕或无法怀孕使具有行使卵巢功能的妇女，通过辅助的生殖技术是可以妊娠的。然而，用于导致多卵泡发育的荷尔蒙治疗办法可以引起身体黄体的黄体酮产生不足因此，植入受精卵进入子宫内膜过程的起始与维护是损害性的。有功能的无生殖腺女人不孕是由于未发育的或不适当发育的卵巢，卵巢外科除去术，或其他卵巢功能衰竭或机能障碍的结果象OD，IVF和ET等辅助性的生殖技术可以使有功能的无生殖腺妇女怀孕。然而，激素补充在辅助再生殖技术中是必要的，这样是为子宫内膜妊娠的建立与继续作准备。
因此，根据现在的发明，KGF-2可尤其通过促进胚胎的植入而用于治疗或防止不孕。本发明提供了一种KGF-2的给药方法，其用于在正常生殖腺和在有功能的无生殖腺妇女的辅助生殖技术中妊娠的确立与维持。该方法包括将含有KGF-2的载体插入正常生殖腺或有功能的无生殖腺妇女阴道中并且该载体在阴道内保留至少28天。
本发明也为实施辅助生殖技术的妇女提供了一种激素代替疗法的方法。该方法包括将含有KGF-2的载体插入接受辅助生殖技术的妇女的阴道中，并且将载体在阴道内保留直到怀孕大约7-17周。
本发明之方法的生理学上可接受的包含KGF-2的载体较好的是由硅橡胶组成的环形固体载体，在此也应提到如聚硅氧烷，或其他的适当的材料。通过聚硅氧烷阴道环递送类固醇激素是本领域已知的。KGF-2的聚硅氧烷环通道率取决于包括环表面面积的因素。因此，KGF-2在环中的含量被适宜的以KGF-2从环中的体外释放率的方式来描述。体外释放率为本领域常规用来表征含激素的聚硅氧烷环。每天KGF-2的释放率为0.001到1000mg的含有KGF-2的聚硅氧烷环被构思用于目前的方法中。在一个优选的实施方案中，聚硅氧烷环具有每天约0.1到约100mg的体外释放率。在最优选的实施方案中，聚硅氧烷环具有每天大约1到约10mg KGF-2的体外释放率。
含有KGF-2的聚硅氧烷载体被用于插入阴道中。环插入阴道中并且被定位在子宫颈周围。该环也可由女性受试者插入和移出，方法类似于常规使用的子宫帽，由此提供了本发明的又一有利之处。
在胚胎移植之前，含有KGF-2的载体可以使用大约2-7天，较好3天，并且可以增补其他的激素，例如口服给药雌二醇-17β或孕[甾]酮。优选的实施方案中，载体是一个环并且在胚胎移植前可以插入3天。该载体在28天后可以被移出或被另一个载体代替。如果妊娠发生，该载体允许足够的KGF-2维持妊娠直到黄体胎盘性转变，那时给药可能中止。在一个优选实施方案中，环连续地保留在阴道内，并且在大约怀孕第十二周时中止给药。损伤，职业病
KGF-2可以刺激多种组织的增生。因此，KGF-2多聚核苷酸，多肽，激动剂与/或拮抗剂可用于治疗损伤或职业病。
能治疗或检测的损伤，职业病，中毒的例子包括职业病例如农业劳动者疾病包括农民肺与地窖填料疾病，爱鸟者肺，职业性皮炎，高压神经综合征，惰性气体麻醉，实验室感染，肺尘病如石棉肺，铍中毒，绵纤维吸入性肺炎，类风湿尘肺，肺铁末沉着病，矽肺如炭末石末沉着病与矽肺结核，中毒例如酒精中毒包括[慢性]酒精中毒如酒精性心肌病，胎儿酒精综合征，酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，酒精性肝硬化，酒精性精神病如酒精性遗忘障碍，酒精停药谵语，银中毒，咬与螫伤如蛛毒中毒，昆虫咬伤与螫伤，蛇咬，壁虱中毒[症]如瞬间麻痹，镉中毒，四氯化碳中毒，药物毒性如药物招致的失静症，药疹例如莱尔综合征，结节性红斑与血清病，药物招致的运动障碍与精神安定剂诱发的恶性综合征，麦角中毒，氟化物中毒，食物中毒如肉毒中毒，蚕豆病，蘑菇中毒，沙门菌性食物中毒与葡萄球菌食物中毒，气体中毒如一氧化碳中毒，惰性气体麻醉，中毒性肝炎，铅中毒，汞中毒，真菌[毒素]中毒症如麦角中毒与蘑菇中毒，过量，植物毒素如麦角中毒，蚕豆病，山黧豆中毒，和奶病，物质诱发的精神病，创伤与损伤如腹部损伤包括创伤性横膈疝气，脾破裂如脾功能亢进，胃破裂，外伤截肢术，臂损伤如前臂损伤包括桡骨骨折与尺骨骨折，肱骨骨折，肩脱位，肩骨折，网球肘与腕损伤，窒息，运动损伤，气压伤如爆炸性损伤与减压病，产伤例如产科麻痹，咬与螫伤如人咬伤，烧伤例如化学烧伤，电烧伤，吸入烧伤例如烟吸入损伤，眼烧伤和晒伤，挫伤，脱位例如髋[部]与肩脱位，溺水例如近乎溺死，电烧伤与闪电损伤，食管穿孔，诊断与治疗材料外渗，异物如胃[肠]石，眼异物，异物位移，异物反应如异物性肉芽肿，骨折如股骨骨折例如髋骨折包括股骨的颈骨折，关闭性骨折，粉碎性骨折，骨连接不正的骨折(malunited fractures)，开放性骨折，自发性骨折，应力性骨折，不连接的骨折(ununited fracture)例如假关节，肱骨骨折，桡骨骨折例如Colles′骨折，肋[骨]骨折，肩骨折，头骨骨折例如颚骨折例如下颌骨与上颌骨的骨折，眶骨折与颧骨骨折，脊柱骨折，胫骨骨折，尺骨骨折例如Monteggia′s骨折，冻伤如冻疮例如，手伤例如手指损伤，头损伤例如脑损伤。包括脑振荡，脑脊髓的耳漏，脑脊液鼻漏，关闭性的头损伤，上颌面损伤例如面损伤包括眼损伤例如眼烧伤，眼异物与贯通性损伤，颌骨折例如下颌骨的与上颌骨的骨折，下颌骨的损伤例如下颌骨的骨折，与颧骨的骨折，上颌骨的骨折，颅腔积气，颅骨折例如颌骨折包括下颌骨的和上颌骨的骨折，眶骨折与颧骨骨折，中暑衰竭例如中暑，腿损伤例如踝损伤，股骨骨折例如髋[部]骨折包括大腿骨颈骨折，足损伤，髋[部]脱位，膝[关节]损伤与胫骨骨折，运动病例如太空运动病，多创伤，放射[性损]伤例如辐射招致的异常，辐射招致的白血病，辐射招致的肿瘤，放射性骨坏死，实验性的放射[性损]伤，辐射肺炎和放射性皮肤炎，气腹后(retropneumoperitoneum)，破裂例如主动脉破裂，脾破裂如脾功能亢进，胃破裂与子宫破裂例如子宫穿孔，自身致残，创伤性休克例如挤压综合征，软组织损伤，脊髓损伤例如脊髓受压，脊髓损伤例如脊柱骨折与颈部扭伤，扭伤与劳损例如重复性损伤，跟腱损伤，胸部损伤例如连枷胸，心损伤与肋[骨]骨折，牙损伤例如牙骨折包括牙隐裂综合征，牙脱位，鼓膜穿孔，伤口感染，非穿透性创伤例如脑震荡与关闭性头损伤与贯通性伤口如眼贯通伤，枪弹伤与刺伤例如针刺伤。血与淋巴[管]疾病
KGF-2多聚核苷酸，多肽，激动剂与/或拮抗剂可用于治疗与/或检测淋巴[管]疾病。可治疗与/或检测的血与淋巴[管]疾病包括再生障碍性贫血(例如Fanconia′s贫血)，溶血性贫血(如自体免疫性溶血性贫血与先天性溶血性贫血包括先天性红细胞生成异常性贫血，先天性非球形红细胞性溶血性贫血，镰状细胞性贫血，例如血红蛋白SC疾病与镰状细胞特性；遗传性椭圆形红细胞增多症和葡糖磷酸脱氢酶不足，例如蚕豆病，血红蛋白C病，遗传性球形红细胞增多症，珠蛋白生成障碍性贫血(地中海贫血)，例如α地中海贫血包括胎儿水肿病，与β-地中海贫血，蚕豆病，血红蛋白尿，例如突发性的heboglobinuria，与溶血尿毒症综合征)，低色性贫血(例如缺铁性贫血)，大细胞性贫血(例如巨幼细胞贫血，包括恶性贫血)，骨髓痨性贫血，新生儿贫血(例如胎儿(fetofatal)输血与妇婴输血)，顽固性贫血(例如顽固性贫血)，铁粒幼细胞贫血，伴有过量胚细胞的纯红细胞发育不全，胎儿成红细胞增多病(例如胎儿水肿病和胆红素脑病)，Rh Isimmunization，无β-脂蛋白血症，血丙种球蛋白缺乏，异常丙种球蛋白血症(例如IgA缺陷与IgG缺陷)，高丙种球蛋白血症(例如良性单克隆丙种球蛋白病)，高蛋白血症，异型[球]蛋白血症(例如淀粉样变性，包括淀粉样变性神经病与大脑淀粉样血管病，冷沉淀球蛋白血症，重链疾病，例如免疫增生性小肠病，多发性骨髓瘤，POEMS综合征，Waldenstrom巨球蛋白血症)，Waldenstrom巨球蛋白血症。
更多的可以治疗或检测的血与淋巴[管]的疾病的例子包括骨髓疾病例如再生障碍性贫血，脊髓发育不良综合征(包括顽固性贫血例如顽固性贫血伴过多胚细胞，铁粒幼细胞性贫血，突发性的血红蛋白尿，与髓样白血病)，脊髓增生病症(包括骨髓痨性贫血，急性的成红血球细胞白血病，类白血病反应，骨髓纤维化[症]，骨髓样化生，真性红细胞增多症，出血性血小板增多症，与血小板增多症)，血管内红细胞叠积，血红蛋白病如镰状细胞性贫血(包括血红蛋白SC疾病与镰状细胞特性)，血红蛋白SC疾病，珠蛋白生成障碍性贫血(地中海贫血)(包括α地中海贫血例如胎儿水肿病，与β地中海贫血)，出血性素质如abrinogenemia，克里斯马斯病(血友病B)，播散性血管内凝血，因子VII缺乏[症]，因子XI缺乏[症]，因子)Ul缺乏[症]，因子XII缺乏[症]，血友病，低凝血酶原血症(包括因子V缺乏与因子X缺乏)，Schwartzman现象，Bemard-Soulier综合征，溶血尿毒症综合征，血小板存储[代谢]池故障，血小板无力，出血性血小板减少症(包括血小板减少性紫癜例如特发性血小板减少性紫癜，血栓性血小板减少性紫癜，与维-奥综合征)，高球蛋白症性紫癜，Schoenlich-Henoch紫癜，高球蛋白血症性紫癜(特发性血小板减少性紫癜)，血栓性血小板减少性紫癜，维-奥综合征，遗传性出血性毛细血管扩张，维生素K缺乏(包括新生儿出血性疾病)，与von Willebrand因子疾病，白细胞病症如嗜酸性细胞增多[症](包括伴嗜酸性细胞增多[症]血管淋巴样增生，嗜酸细胞增多性肌痛综合征，嗜酸细胞肉芽肿，与嗜酸细胞过多综合征例如肺嗜酸细胞增多症)，传染性单核细胞增多症，白细胞增多(包括白血病样反应和淋巴细胞增多)，白细胞减少症(包括粒细胞缺乏例如嗜中性白血球减少症，与淋巴细胞减少症例如特发CD4-阳性T-淋巴细胞减少症)，Pelger-Huet异常，吞噬细胞杀菌功能障碍(包括Chediak-Higashi综合征，慢性肉芽肿性疾病，Job综合征)，高铁血红蛋白血症，全血细胞减少，红细胞增多症，血液学的，白血病前期，与硫血红蛋白血症。
另外的能治疗或检测的血与淋巴[管]的疾病之例子包括淋巴[管]的疾病例如淋巴结炎(包括猫抓伤疾病和肠系膜淋巴结炎)，淋巴管扩张，淋巴管炎，淋巴水肿(包括象皮肿与丝虫的象皮肿)，淋巴细胞，淋巴网状细胞增生性病症(包括血丙种球蛋白缺乏，淀粉样变性例如淀粉样变性神经病与大脑淀粉样的血管病，巨大淋巴结超常增生，重链疾病例如免疫增生性小肠病，免疫母细胞淋巴结病，传染性单核细胞增多症，毛细胞白血病，淋巴细胞白血病，髓样白血病(包括急性非淋巴细胞白血病与急性中幼粒细胞白血病)，淋巴管肌瘤(包括淋巴管肌瘤病)，与淋巴瘤(包括何杰金氏病，非Hodgkin淋巴瘤例如B细胞淋巴瘤包括Burkitt淋巴瘤，AIDS-有关联的淋巴瘤，粘膜相关[性]淋巴样组织淋巴瘤，与小细胞淋巴瘤，扩散性淋巴瘤包括扩散性大细胞淋巴瘤，免疫母细胞大细胞淋巴瘤，成淋巴细胞的淋巴瘤，扩散性混合细胞淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤，与小非核裂细胞淋巴瘤，小囊淋巴瘤包括小囊大细胞淋巴瘤，小囊混合细胞淋巴瘤，与小囊小核裂细胞淋巴瘤，高等的淋巴瘤包括免疫母细胞性大细胞淋巴瘤，成淋巴细胞淋巴瘤，与小非核裂细胞淋巴瘤如Burkitt淋巴瘤，中等程度的淋巴瘤包括扩散性大细胞淋巴瘤，小囊大细胞淋巴瘤，扩散性混合细胞淋巴瘤，与扩散性小核裂细胞淋巴瘤，大细胞淋巴瘤包括扩散性大细胞淋巴瘤，小囊大细胞淋巴瘤，免疫母细胞性大细胞淋巴瘤，Ki-I大细胞淋巴瘤，与免疫母细胞大细胞淋巴瘤，低程度淋巴瘤包括小囊混合细胞淋巴瘤，粘膜相关[性]淋巴样组织，小囊小核裂细胞淋巴瘤，与小淋巴细胞淋巴瘤，混合细胞淋巴瘤包括扩散性混合细胞淋巴瘤与小囊混合细胞淋巴瘤，小细胞淋巴瘤包括扩散性小核裂细胞淋巴瘤，小囊小核裂细胞淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤，与非小核裂细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤包括成淋巴细胞的淋巴瘤，皮肤的T细胞淋巴瘤例如Ki-I大细胞淋巴瘤，真菌样的霉菌病，与Sezary综合征，与周围T-细胞淋巴瘤，非分化淋巴瘤包括扩散性大细胞淋巴瘤，与非小核裂细胞淋巴瘤例如Burkitt淋巴瘤，淋巴瘤样的肉芽肿病)，Marek病，类肉瘤病，(包括肺结节病与眼色素层腮腺炎)，肿块溶解综合征，皮肤粘膜的淋巴结综合征，网状内皮增殖病(包括Gauchees病，组织细胞增多症例如恶性的组织细胞病症包括恶性的组织细胞增多症，急性单核细胞白血病，大细胞淋巴瘤例如Ki-I大细胞淋巴瘤，郎格罕细胞组织细胞增生症例如嗜酸细胞肉芽肿，Hand-Scheller-Christian综合征，与莱-西病(非类酯组织细胞增多症)，非郎格罕细胞组织细胞增生症例如窦组织细胞增生症，尼曼-皮克病，海蓝色组织细胞综合征，与幼年黄色肉芽肿，肥大细胞肉瘤)，脾的疾病(包括脾功能亢进，骨髓样化生，脾梗塞，脾肿瘤，脾破裂例如脾功能亢进，脾[肿]大，与脾结核病)，胸腺超常增生，胸腺肿瘤，淋巴结结核病如King′s病。新生儿疾病与异常
KGF-2多聚核苷酸，多肽，激动剂与/或拮抗剂可用于治疗，预防与/或检测新生儿疾病与异常。
能治疗或检测的新生儿疾病与异常包括Alagille综合征，Alagille综合征，基底细胞痣综合征，Beckwith-Widemann综合征，布卢姆综合征(胎儿期发育不全毛细血管扩张等常染色体隐性遗传病)，Bonnevie-Ulrich综合征，科凯恩综合征(视网膜退变、听力受损、皮肤薄且对光敏感)，猫叫综合征，德朗热综合征(精神发育阻滞伴有多种先天畸形)，唐氏综合征(先天愚征)，海-韦综合征(睑缘粘连-外胚层发育不全-裂综合征)例如埃利斯-万柯莱韦德综合征(软骨外胚层发育不良综合征)与病灶的表皮发育不良，加德纳综合征(家族性结肠息肉病伴纤维颅结构不良、骨瘤等)，前脑无裂畸形，色素失调症，洛-穆-比综合征(视网膜色素沉着、肥胖、多指和趾)，马凡综合征，指甲髌骨综合征，眼脑肾综合征，Orofaciodigital综合征，普-威综合征(张力减退、肥胖、手足小)，Proteus综合征，满腹综合征(腹壁畸形)，胎儿风疹综合征，耳-腭-指综合征，Short Rib-Polydactyly Syndrome，Waardenburg综合征，Wolfram综合征，Zelweger综合征，辐射招致异常，染色体异常包括Angelman综合征，Beckwith-Wiedemann，猫叫综合征，唐氏综合征，前脑无裂畸形，普-威综合征，性染色体异常例如Bonnevie-Ulrich综合征，外胚层发育不良症包括病灶的表皮发育不良，脆性X染色体综合征，46，XY性腺发育不全，混合性性腺发育障碍症，性幼稚-失嗅综合征，细精管发育障碍症(XXY综合征)，眼脑肾综合征，Orofaciodigital综合征，Tumer′s综合征，和XYY核型，与消化系统异常。呼吸系统疾病
KGF-2可刺激呼吸道细胞的增殖。因此，KGF-2多聚核苷酸，多肽，激动剂与/或拮抗剂可用于治疗与/或检测呼吸系统疾病。能治疗或检测的呼吸道疾病的例子包括支气管的疾病，例如哮喘(包括运动诱发的哮喘与持续哮喘状态)支气管瘘，支气管反应过度，支气管肿瘤，支气管痉挛，支气管扩张，支气管炎(包括细支气管炎，细支气管炎闭塞，组织性肺炎，病毒的细支气管炎，支气管源性囊肿，支气管源性囊肿，气管支气管扩大)，睫状能动性障碍例如Kartagener综合征，喉的疾病(例如喉肉芽肿，喉水肿，喉的肿瘤，喉的软骨膜炎，喉痉挛，喉炎例如哮吼，喉狭窄，喉的结核[病]，声带麻痹，语音障碍例如失音症与嘶哑)，肺病，例如[肺]膨胀不全，包括[肺]中叶综合征，支气管肺发育异常，先天的肺囊腺瘤畸形，囊性纤维化，肺的浆细胞肉芽肿，咯血，肺脓肿，真菌的肺病例如变应性支气管肺部曲霉病与卡氏肺囊虫肺炎，有空隙的肺疾病例如外源性变应性肺泡炎例如养鸟者肺，农民肺，Goodpasture综合征，朗氏细胞组织细胞增多症，肺尘埃沉着病例如石棉肺，铍中毒，绵纤维吸入性肺炎，卡普兰综合征，肺铁末沉着病，石末沉着病例如炭末石末沉着病与矽肺结核，肺纤维症，放射性肺炎，肺结节病，Wegener肉芽肿病)，梗阻性肺病，病毒的细支气管炎，肺气肿，寄生的肺病例如肺的棘球蚴病，肺肿瘤例如支气管源性癌，肺的硬币状病损(X线片)与潘科斯特综合征，胎粪吸入，肺炎(例如支气管肺炎，胸膜肺炎，吸入性肺炎例如脂类肺炎，细菌性肺炎例如大叶性肺炎，支原体肺炎，立克次体肺炎与葡萄球菌性肺炎，卡氏肺囊虫性肺炎，病毒性肺炎)，肺泡蛋白沉着症，肺水肿，肺栓塞，肺嗜酸细胞增多症，肺静脉闭塞性疾病，呼吸窘迫综合征例如透明膜病，成人呼吸窘迫综合征，弯刀综合征(部分肺静脉回流异常)，Silo Fillees疾病，肺的结核[病]例如矽肺结核；鼻疾病，例如鼻后孔闭锁，鼻衄，致死性中线肉芽肿，鼻塞，鼻息肉，后天的鼻畸形，鼻肿瘤例如鼻息肉，旁鼻窦肿瘤例如上颌窦肿瘤，旁鼻窦肿瘤例如上颌窦肿瘤，鼻窦炎例如筛骨鼻窦炎，额窦炎，上颌窦炎与蝶骨鼻窦炎，鼻炎例如枯草热，常年性变应性鼻炎，萎缩性鼻炎与血管运动性鼻炎，鼻硬结病)。能治疗或诊断的呼吸道疾病也包括胸膜的疾病，例如乳糜胸，胸膜的脓胸(例如结核性的脓胸)，血气胸，血胸，液气胸，胸腔积液，胸腔积液例如恶性肿瘤性胸腔积液，胸膜的肿瘤例如恶性肿瘤性胸腔积液，胸膜炎例如胸膜肺炎，气胸，胸膜的结核[病]例如结核性脓胸，呼吸障碍例如呼吸暂停例如睡眠呼吸暂停综合征包括Pickwick综合征，Cheyne-Stokes呼吸，咳[嗽]，呼吸困难例如阵发性呼吸困难，嘶哑，换气过度例如呼吸性碱中毒，喉头痉挛，胎粪误吸，口呼吸，呼吸窘迫综合征例如透明膜病，成人呼吸窘迫综合征，呼吸功能不全例如呼吸性酸中毒，呼吸道阻塞例如鼻塞，喉肉芽肿，汉坦病毒肺综合征，肺换气不足，内部正压呼吸与呼吸麻痹，呼吸高敏感性例如外源性变应性肺泡炎例如爱鸟者肺与农民肺，变应性的支气管肺曲霉病，哮喘如运动诱发的哮喘与持续哮喘状态，枯草热，常年性变应性鼻炎，呼吸系统异常例如支气管源性囊肿，支气管肺的死骨形成，鼻后孔闭锁，先天性肺囊性腺瘤样畸形，Kartagener综合征，弯刀综合征(部分肺静脉回流异常)，巨大气管支气管，呼吸道瘘例如支气管瘘包括气管食管瘘)，呼吸道感染(例如支气管炎包括细支气管炎例如病毒性细支气管炎，普通感冒，胸膜脓胸例如结核性脓胸，流感，喉炎例如会厌炎，军团病例如Legionnaries′病，肺脓肿，胸膜炎例如胸膜肺炎，肺炎例如支气管肺炎，胸膜肺炎，吸入性肺炎例如脂性肺炎，细菌性肺炎例如大叶性肺炎，支原体肺炎，立克次体肺炎与葡萄球菌性肺炎，卡氏肺囊虫性肺炎，病毒性肺炎，鼻炎，鼻硬结病，鼻窦炎例如筛骨鼻窦炎，额窦炎，上颌窦炎与蝶骨鼻窦炎，扁桃体炎例如扁桃体周脓肿，气管炎，喉的结核[病]，胸膜的结核[病]例如结核性脓胸，肺结核例如矽肺结核，百日咳，呼吸道肿瘤例如支气管的肿瘤，喉的肿瘤，肺肿瘤例如支气管源癌，肺的硬币状病损(X线片)与潘科斯特综合征，鼻肿瘤如鼻息肉，鼻旁窦肿瘤例如上颌窦肿瘤，胸膜肿瘤例如恶性肿瘤性胸腔积液，气管的肿瘤，气管疾病例如气管的肿瘤，气管狭窄，气管炎，巨大气管支气管与气管食管瘘。
能治疗或检测的耳鼻喉科疾病包括睫状的能动性障碍例如Kartagener综合征，耳疾病例如中耳胆脂瘤，后天的耳畸形，耳肿瘤，耳痛，听觉障碍例如耳聋包括突然的耳聋，部分的听力丧失例如双侧听力丧失，传导性的听力丧失，功能性的听力丧失，高频率听力丧失，感觉神经性听力丧失例如中枢性听力丧失，噪音招致的听力丧失与老年性耳聋，响度重振，耳鸣，耳带状疱疹，迷路疾病例如耳蜗的疾病，内淋巴水肿例如美尼尔斯病(耳性眩晕病)，迷路炎，前庭的疾病例如运动病包括间隙运动病，眩晕，耳炎例如外耳炎，中耳炎例如乳突炎，中耳炎伴积液与化脓性的中耳炎，耳硬化，Retrocochlear疾病例如听神经疾病包括听神经瘤例如神经纤维瘤病2，中枢的听觉疾病例如听觉的知觉的障碍与中枢性听力丧失，鼓膜穿孔)，喉的疾病例如喉肉芽肿，喉水肿，喉的肿瘤，喉的软骨膜炎，喉痉挛，喉炎例如哮吼，喉狭窄，喉的结核[病]，声带麻痹，语音障碍例如失音症与嘶哑，鼻疾病(例如鼻后孔闭锁，鼻出血，致死性中线肉芽肿，鼻塞，鼻息肉，后天的鼻畸形，鼻肿瘤例如鼻息肉，鼻旁窦肿瘤例如上颌窦肿瘤，鼻旁窦疾病例如鼻旁窦肿瘤包括上颌窦肿瘤，鼻窦炎例如筛骨鼻窦炎，额窦炎，上颌窦炎与蝶骨鼻窦炎，鼻炎例如枯草热，常年性变应性鼻炎，萎缩性鼻炎与血管运动性鼻炎，鼻硬结病)，耳鼻喉科肿瘤例如耳肿瘤，喉肿瘤，听神经瘤例如神经纤维瘤病2，鼻肿瘤，例如鼻息肉，鼻旁窦肿瘤例如上颌窦肿瘤，咽的肿瘤例如咽下的肿瘤，鼻咽的肿瘤，口咽的肿瘤例如扁桃体的肿瘤，咽的肿瘤例如咽下的肿瘤，鼻咽的肿瘤，口咽的肿瘤包括扁桃体的肿瘤，咽炎，希波克拉底咽峡炎，扁桃体炎，与腭咽关闭不全。神经科疾病
KGF-2多聚核苷酸，多肽，激动剂与/或拮抗剂可用于治疗与/或检测神经学上的疾病。
能治疗或检测的神经学上的疾病包括脑疾病(例如新陈代谢的脑疾病包括苯丙酮酸尿症例如母性的苯丙酮酸尿症，丙酮酸盐羧化酶缺乏，丙酮酸盐脱氢酶复合体缺乏，Wemicke′s脑病，脑水肿，脑瘤例如小脑的肿瘤包括幕下的肿瘤，脑室肿瘤例如脉络丛肿瘤，下丘脑的肿瘤，幕上的肿瘤，卡纳万病([脑]海绵变性)，小脑的疾病例如小脑性共济失调包括脊髓小脑的变形例如毛细管扩张失调症，小脑的协同失调，Friederich′s共济失调，马-约病，橄榄体脑桥小脑萎缩，小脑的肿瘤例如幕下的肿瘤，肖尔茨脑硬化症例如弥漫性轴周性脑炎，[麦粉蛋白]球状体(麦粉蛋白粒中的球状体)细胞克拉贝病(脑白质营养障碍)，异染性脑白质营养不良由于芳基硫酸酯酶A缺乏引起的疾病-与亚急性硬化性全脑炎，脑血管的病症(如颈动脉疾病包括颈动脉血栓形成，颈动脉狭窄和烟雾病，大脑的淀粉样的血管病，大脑的颈内动脉-后交通动脉动脉瘤，脑缺氧，大脑动脉硬化，大脑的动静脉畸形，大脑动脉疾病，脑栓塞与血栓形成例如颈动脉血栓形成，窦血栓形成与Wallenberg综合征，大脑出血如硬膜外血肿，硬膜下血肿与蜘蛛膜下腔出血，脑梗塞，脑缺血例如暂时性脑局部缺血，锁骨下动脉盗血综合征和椎基底动脉供血不足，血管性痴呆例如多发性脑梗塞性痴呆，脑室周围白质软化，血管性头痛例如丛集性头痛，偏头痛，痴呆例如AIDS痴呆综合病，老年前期痴呆例如Alzheimer病与Creutzfeldt-Jakob综合征，老年性痴呆例如Alzheimer病与进行性核上性麻痹，血管性痴呆例如多发性脑梗塞性痴呆，脑炎包括弥漫性轴周性脑炎，病毒性脑炎例如流行性脑炎，日本脑炎，St.Louis脑炎，蜱传脑炎与西尼罗河热(蚊传热)，急性播散性脑脊髓炎，脑膜脑炎例如眼色素层弥漫性脑膜炎综合征，脑炎后帕金森病和亚急性硬化性全脑炎，脑软化例如脑室周围白质软化，癫痫例如全身性癫痫包括婴儿性痉挛，失神(癫痫的小发作)癫痫，肌阵挛型癫癎包括肌强直癫痢和破碎红纤维综合征，强直的-阵挛性的癫痫，部分癫痫例如复合的部分癫痫，额叶癫痫与颞叶癫痫，创伤后癫痫，癫痫持续状态例如持续性不全癫痫，哈-施综合征(淡苍球和黑质网状部的进行性变性)，脑积水例如丹-沃综合征(脑脊液潴留于第四脑室所致脑积水综合征)与常压性脑积水，下丘脑的疾病例如下丘脑的肿瘤，脑型疟，发作性睡病包括猝倒[症]，球的脊髓灰质炎，大脑的假瘤，Rett综合征，Reye综合征，丘脑的疾病，大脑的弓形体病，颅内的结核瘤与泽韦格综合征，中枢神经系统感染例如AIDS痴呆综合征，脑脓肿，硬膜下积脓，脑脊髓炎例如马脑脊髓炎，危内端拉马脑脊髓炎，坏死性出血性脑脊髓炎，绵羊脱髓鞘性脑白质炎，脑型疟，脑膜炎例如蛛网膜炎，无菌的脑膜炎例如病毒的脑膜炎包括淋巴细胞[性]脉络丛脑膜炎。细菌的脑膜炎包括嗜血菌脑膜炎，李斯特杆菌脑膜炎，脑膜炎球菌性脑膜炎例如沃-弗综合征(急性暴发性脑膜炎球菌菌血症；出血性肾上腺综合征)；，肺炎球菌的脑膜炎与脑脊膜的结核[病]，真菌性脑膜炎例如隐球菌性脑膜炎，硬脑膜下积液，脑膜脑炎例如眼色素层弥漫性脑膜炎综合征，脊髓炎例如横贯性脊髓炎，神经梅毒例如脊髓痨，脊髓灰质炎包括球的脊髓灰质炎与脊髓灰质炎后综合征，朊病毒病(例如Creutzfeldt-Jakob综合征，牛海绵型大脑炎，格斯特曼综合征(脑顶枕叶综合征)，库鲁病(新几内亚震颤病、慢病毒感染)，羊迟发性病毒感染)大脑的弓形体病，中枢神经系统肿瘤例如脑肿瘤包括小脑肿瘤例如幕下的肿瘤，脑室肿瘤如脉络丛肿瘤，下丘脑的肿瘤与幕上的肿瘤，脑脊膜的肿瘤，脊髓肿瘤包括硬膜外肿瘤，脱髓鞘病例如卡纳万病([脑]海绵变性)，肖尔茨脑硬化症包括脑白质肾上腺萎缩症，弥漫性轴周性脑炎，[麦粉蛋白]球状体细胞克拉贝病(脑白质营养障碍)，肖尔茨脑硬化症例如异染性脑白质营养不良由于芳基硫酸酯酶A缺乏引起的疾病，过敏性脑脊髓炎，necrotizing出血性脑脊髓炎，进行性多灶性白质脑病，多发性硬化症，脑桥中央髓鞘溶解，横贯性脊髓炎，神经脊髓炎视觉羊迟发性病毒感染，摇摆病，慢性疲乏综合征，Visna，高压神经综合征，假性脑[脊]膜炎，脊髓病例如先天的肌张力缺失，肌萎缩侧索硬化，脊髓性肌萎缩例如婴儿型进行性脊髓性肌萎缩症，脊髓受压，脊髓肿瘤例如硬(脑)膜上的肿瘤，脊髓空洞症，脊髓痨，僵人综合征(持续性痛肌痉挛)，智力低下例如Angelman综合征，猫叫综合征，德朗热综合征(精神发育阻滞伴有多种先天畸形)，唐综合征，神经节苷脂病如神经节苷脂G(M1)，桑德霍夫病(氨基己糖苷A-B酶缺乏症)，泰-萨克斯病，哈特奈扑病，高胱氨酸尿症，洛-穆-比综合征(视网膜色素沉着、肥胖、多指和趾)，莱施-奈恩综合征，枫糖尿病，粘膜脂质沉积症例如岩藻糖苷贮积病，乙溴醋胺〔催眠镇静药〕蜡样脂褐质沉积症，眼脑肾综合征，苯丙酮尿例如母亲的苯丙酮尿，普-威综合征(张力减退、肥胖、手足小)，Rett综合征，鲁-塔综合征(先天智力和发育迟缓、并多发畸形)，结节性硬化症，WAGR综合征，神经系统异常例如，神经管缺陷例如无脑畸形包括hydrangencephaly，Arnold-Chairi畸形，脑膨出，脑[肯]膜膨出，脊膜脊髓膨出，脊柱的闭合不全例如囊性脊柱裂与隐性脊柱裂，遗传的运动和感觉神经病包括沙尔科病(神经原性关节病)-Marie病，遗传性视神经萎缩，Refsum病，遗传性痉挛性截瘫，韦德尼希-霍夫曼综合征，遗传性的感觉与自主神经障碍例如先天的痛觉缺失与家族性自主神经功能异常，神经科临床表现(例如失认症包括格斯特曼综合征(脑顶枕叶综合征)，遗忘[症]例如逆行性遗忘，[精神性]运用不能，神经原性膀胱障碍，猝倒[症]，毫无隐讳交谈的病症例如听觉障碍包括聋，部分的听力丧失，响度重振与耳鸣，语言障碍例如失语症包括失写症，名称健忘症，表达性失语症，与Wernicke失语症，诵读困难例如后天的诵读困难，语言发展障碍，言语障碍例如失语症包括名称健忘症，表达性失语症与Wernicke失语症，发音清晰度障碍，毫无隐讳交谈的病症例如言语障碍包括发音困难，模仿言语，缄默症与口吃，语音障碍如失音症与嘶哑，去大脑状态，谵语，[肌纤维]自发性收缩，幻觉，假性脑[脊]膜炎，运动障碍例如Angelman综合征，共济失调，手足徐动症，舞蹈症，张力障碍，运动功能减退，肌张力减退，肌阵挛，抽搐，斜颈与震颤，肌张力过强例如肌强直例如僵人综合征(持续性痛肌痉挛)，肌痉挛状态，麻痹例如面神经麻痹包括耳带状疱疹，胃轻瘫，偏瘫，眼肌麻痹例如复视，杜安氏综合征(后退性斜视)，霍纳氏综合征(颈交感神经麻痹)，慢性的进行性外眼肌麻痹例如Kearns综合征，延髓性麻痹，热带的痉挛的下身轻瘫，截瘫例如Brown-Sequard综合征，四肢麻痹，呼吸麻痹与声带麻痹，轻瘫，幻肢，味觉障碍例如味觉缺乏与味觉障碍，视觉障碍例如弱视，盲，色觉缺陷，复视，偏盲，盲点与正常以下的视力，睡眠障碍例如睡眠过度包括Kleine-Levin综合征失眠[症]，与梦游症，痉挛例如牙关紧闭，意识丧失例如昏迷，持久性植物神经状态与晕厥与眩晕，神经肌肉病例如先天的肌张力缺失，肌萎缩侧索硬化，Lambert-Eaton肌无力综合征，运动神经元疾病，肌肉萎缩例如脊髓性肌萎缩，沙尔科病(神经原性关节病)-Marie病与WerdnigHoffmann疾病，脊髓灰质炎后综合征，肌营养不良，重症肌无力，萎缩性肌强直，肌强直Confenita，线状体肌病，家族性周期性麻痹，多发性肌阵挛，热带的痉挛的下身轻瘫与僵人综合征，周围神经系统疾病例如肢端痛，淀粉样蛋白神经障碍，自主神经系统疾病例如Adie综合征，巴-柳综合征(后颈部交感神经综合征)，家族性自主神经功能异常，Homer′s综合征，反射交感性营养不良与夏-德综合征(原因不明的一种自主神经功能不全)，颅神经疾病例如听神经疾病例如听神经瘤包括神经纤维瘤病2，面神经疾病例如面神经痛，梅-罗综合征，眼球能动性障碍包括弱视，眼震，动眼神经麻痹，眼肌麻痹例如杜安氏综合征(后退性斜视)，Homer′s综合征，慢性进行性外眼肌麻痹包括Kearns综合征，斜视如内斜视与外斜视，动眼神经麻痹，视神经疾病例如视神经萎缩包括遗传性视神经萎缩，光学盘玻璃疣，视神经炎例如视神经脊髓炎，视神经乳头水肿，三叉神经痛，声带麻痹，脱髓鞘病例如视神经脊髓炎与摇摆病，糖尿病神经病变例如糖尿病脚，神经压迫综合征例如腕管综合证。跗管综合征，胸廓出口综合征例如颈肋综合征，尺神经肢体压迫综合征，神经痛例如灼性神经痛，颈臂神经痛，面神经痛与三叉神经痛，神经炎例如实验性过敏性神经炎，视神经炎，多发性神经炎，多神经根神经炎和脊神经根炎例如多发性神经根炎，遗传性运动感觉神经病例如沙尔科病(神经原性关节病)，遗传性视神经萎缩，Refsum病，遗传性痉挛性截瘫与Werdnig-Hoffinann疾病，遗传的感觉与自主神经障碍包括先天的痛觉缺失与家族性自主神经功能异常，POEMS综合征，坐骨神经痛，出味汗与手足搐搦)。新陈代谢的与内分泌的疾病
KGF-2多聚核苷酸，多肽，激动剂与/或拮抗剂可用于治疗与/或检测新陈代谢的与内分泌的疾病
可治疗或检测的营养与代谢性疾病的例子包括无盐酸症，酸碱平衡失调，酸中毒(包括乳汁的，肾管的，或呼吸器官的)，糖尿病酮症酸中毒，酮病，硷毒症，呼吸性碱中毒，钙新陈代谢障碍，钙质沉着[症]，钙化防卫，肢端硬皮综合征，肾钙沉着症，病理的脱钙作用，高钙血症，低钙血症，手足搐搦，骨质软化症，假性甲状旁腺功能低下，佝偻病，尿崩症，肾性尿崩症，Wolfram综合征，糖尿病(包括实验性的与胰岛素-依赖的，脂肪萎缩，非-胰岛素-依赖的)，糖尿病的血管病，糖尿病脚，妊娠糖尿病，巨大胎儿，葡萄糖不耐受，糖尿，肾性葡糖尿症，高血糖症，高脂血症，血胆脂醇过多，高脂蛋白血症，高甘油三酯血症，高催乳素血症，维生素A过多症，低血糖症，胰岛素昏迷，吸收不良综合征(包括盲袢(襻)综合征(肠道)，乳糜泻，乳糖不耐受[症]，肠脂肪营养不良，热带口炎性腹泻)，新陈代谢的先天性过失(包括氨基酸新陈代谢的先天性过失，眼白化病，眼皮肤白化病，部分白化病)，尿黑酸尿，组织褐变症，肾性氨基酸尿，胱氨酸尿症，哈特奈扑病，高胱氨酸尿症，枫糖尿病，多羧化酶缺乏，苯丙酮尿，母亲的苯丙酮尿，淀粉样变性，淀粉样变性神经病，大脑的淀粉样的血管病，碳水化合物新陈代谢的先天性过失例如果糖新陈代谢的先天性过失(果糖-1，6-二磷酸酶缺乏，果糖不耐受)，半乳糖血症，葡萄糖不耐受，糖原贮积病(类型1，II，III，IV，V，VI，VII，VHI)，草酸尿，原发草酸尿，甘露糖苷贮积症由于α或β-甘露糖苷酶缺乏引起的疾病，粘多糖增多症(I，II，III，IV，VI，VII)，多羧化酶缺乏，丙酮酸盐新陈代谢先天性过失，亚急性坏死性脑病，丙酮酸盐羧化酶缺乏，丙酮酸盐脱氢酶复合体缺乏，葡糖磷酸脱氢酶缺乏，遗传的高胆红素血[症]，克里格勒-纳贾尔综合征，Gilbert病，慢性特发性黄疸，脂类新陈代谢先天性过失例如高脂蛋白血症，家族的血胆脂醇过多，家族性复合高脂血症，高胆固醇血症(家族的，类型III，IV，V)，家族性脂蛋白脂酶缺乏症，低脂蛋白血症(无β-脂蛋白血症，β低脂蛋白血症，卵磷脂乙酰转移酶缺乏，坦吉尔病(一种家族性疾病；其特点为血液中缺乏高密度脂蛋白)；)，脂质贮积病(胆固醇酯贮积症，类脂蛋白质沉积症，乙溴醋胺〔催眠镇静药〕蜡样脂褐质沉积症，植烷酸贮积症(由于植烷酸α-羟化酶缺乏引起的疾病)，Sjogren-Larsson综合征，[神经]鞘脂类贮积症(脑白质肾上腺萎缩症，法布里病(酰基鞘氨醇己三糖苷酶缺乏症)，神经节苷脂，桑德霍夫病(氨基己糖苷A-B酶缺乏症)，泰-萨克斯病，Gaucher病，[麦粉蛋白]球状体(麦粉蛋白粒中的球状体)细胞克拉贝病(脑白质营养障碍)，异染性脑白质营养不良由于芳基硫酸酯酶A缺乏引起的疾病，尼曼-皮克病，海蓝色组织细胞综合征，沃尔曼病(酸性脂肪酶缺乏所致溶酶体贮积病)，线粒体肌病，脑肌病，MELAS综合征，肌强直癫痢和破碎红纤维综合征，外部的慢性进行性眼肌麻痹，溶酶体贮积病例如胆甾醇酯贮积病，甘露糖苷贮积症由于α或β-甘露糖苷酶缺乏引起的疾病，粘膜脂质沉积症，岩藻糖苷贮积病，muchopolysaccharidosis(1，II，III，IV，′VI，和VII)，生来的金属新陈代谢错误包括血色病，肝豆状核变性，磷酸酶过少症，家族性低磷[酸盐]血症，卷毛综合征(铜缺乏致之脑变性)，家族性周期性麻痹，与假性甲状旁腺功能低下，粘膜脂质沉积症，岩藻糖苷贮积病，卟啉病，(erythroheatic，红血球生成的，肝脏的，急性的间歇的，cutanea tarda)，嘌呤-嘧啶新陈代谢先天性过失例如痛风，痛风关节炎，与Lesch-Nyhah综合征，肾小管转运先天性过失例如肾小管性酸中毒，肾性氨基酸尿，胱氨酸尿症，哈特奈扑病，胱氨酸病，Fanconi综合征，肾性糖尿，先天性遗传性肾小管性酸中毒，眼脑肾综合征，和假醛固酮减少症，磷新陈代谢障碍，低磷酸盐血症，蛋白丢失性肠病，肠淋巴管扩张，水电解质失调(脱水，高钙血症，高钾血症，hypematremia，血钙过少，低钠血症，不适当的抗利尿激素综合征，水中毒)，黄瘤病，沃尔曼病(酸性脂肪酶缺乏所致溶酶体贮积病)，儿童营养障碍例如婴儿营养障碍，营养缺乏症例如维生素缺乏症，抗坏血酸缺乏，坏血病，维生素A缺乏病，维生素B缺乏，胆碱缺乏症，叶酸缺乏症，糙皮病，吡哆醇缺乏，核黄素缺乏，硫胺素缺乏，脚气病，Wemicke′s脑病，维生素B12缺乏(非贫血性)(贫血，致命的)，维生素D缺乏病，(骨质软化症，脂肪组织炎)，维生素E缺乏(脂肪组织炎)，维生素K缺乏，镁缺乏，钾缺乏，蛋白质缺乏(蛋白质-能量性营养不良，小儿恶性营养不良症(因缺蛋白质所引起)。)，羊缺铜病，糖尿病肥胖症，病态肥胖症，儿童肥胖综合征，普-威综合征(张力减退、肥胖、手足小)，与饥饿。
可治疗或检测的内分泌的疾病包括肾上腺疾病(皮质疾病，nortex肿瘤)，肾上腺功能亢进(库欣综合征，醛甾酮过多症，巴特尔病(先天性醛固酮增多症))，肾上腺功能减退(Addison病，脑白质肾上腺萎缩症，醛固酮减少症)，肾上腺肿瘤，肾上腺皮质肿瘤，类固醇21-羟化酶缺乏症，出血性肾上腺综合征，乳房肿瘤，男性乳房肿瘤，乳房纤维囊性病，男子乳腺发育，哺乳障碍例如恰-弗综合征(哺乳期过长所致子宫萎缩)与乳溢，乳腺炎，Bowie乳腺炎，糖尿病(实验的，胰岛素-依赖的，Wolfram综合征，脂肪萎缩，与非-胰岛素-依赖的)，糖尿病的血管病，糖尿病脚，糖尿病[性]视网膜病，糖尿病[性]昏迷，高血糖高摩尔量(hyperosmolar)非酮性昏迷，糖尿病酮症酸中毒，糖尿病肾病与糖尿病脚关联的，糖尿病肥胖症，妊娠期糖尿病，巨大胎儿，侏儒症(科凯恩综合征(视网膜退变、听力受损、皮肤薄且对光敏感)，脑下垂体，致死性发育不良)，内分泌腺肿瘤例如肾上腺皮质肿瘤，多发性内分泌瘤病(1，2a，2b型)，瘤的内分泌物-相似综合征，ACTH综合征(异位)，佐-埃综合征(胰原性溃疡病、为胰之促胃泌素瘤所致)，卵巢的肿瘤，梅格斯综合征(卵巢纤维瘤伴有胸水和腹水)，甲状旁腺的肿瘤，垂体的肿瘤，纳尔逊综合征，睾丸的肿瘤，胸腺肿瘤，甲状腺肿瘤，甲状腺结节，性腺障碍例如肾上腺增生(先天的)，女性化，睾丸女性化，雄激素过多症，性腺功能减退[症]，阉人状态，Kallmann综合征，克兰费尔特综合征，卵巢的疾病例如不排卵，卵巢炎，卵巢囊肿，卵巢多囊综合征，卵巢功能早衰，卵巢过度刺激综合征，卵巢肿瘤，Meigs′综合征，青春期延迟，与早熟的青春期，性别分化障碍例如性腺的发育不全(46，XY，混合)与Tumer′s综合征，两性畸形，假两性畸形，Kallmann综合征，克兰费尔特综合征，睾丸女性化，睾丸的疾病例如隐睾症，睾丸炎，睾丸的肿瘤，女子男性化，妇女多毛症，胰岛机能亢进，瘤的内分泌物-相似综合征例如ACTH综合征(异位)与佐-埃综合征(胰原性溃疡病、为胰之促胃泌素瘤所致)，甲状旁腺疾病包括甲状旁腺功能亢进症(次级的)，肾性骨营养不良[症]，甲状旁腺功能减退症，多发性肌阵挛，甲状旁腺肿瘤，垂体疾病，Empy Sella综合征，垂体机能亢进，肢端巨大症，巨大发育，垂体功能减退症(尿崩症，肾性尿崩症，Wolfram综合征，垂体性侏儒症)，不适当的抗利尿激素综合征，垂体卒中，垂体肿瘤，纳尔逊综合征，自身免疫性多内分泌病，早老症，沃纳综合征(白内障皮肤薄-皮下组织变厚且纤维化-头发呈灰色且稀少)，胸腺超常增生，甲状腺疾病例如正常甲状腺功能病态综合征，甲状腺肿(地方性的，有节[瘤]，胸骨下的，Graves′疾病)，与Graves′疾病关联的甲状腺功能亢进[症]，高甲状腺素血症，甲状腺功能低下(呆小病和粘液性水肿)，甲状腺激素抵抗综合征，甲状腺肿瘤，甲状腺结节，甲状腺炎(自身免疫，亚急性的，化脓性的)，甲状腺毒症，甲状腺危象，与内分泌的结核[病]。
细胞水平的疾病
与细胞存活或细胞凋亡的抑制有关的、可由KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂治疗或检测的疾病的例子，包括癌症(诸如卵泡淋巴癌、带有p53突变的肉瘤和激素依赖的肿瘤，包括但不限于，结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胶质母细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波济肉瘤和卵巢癌)；自身免疫病(如，多发性硬化症、Sjogren’s综合征、Hashimoto’s甲状腺炎、胆汁肝硬变、Behcet’s病、Crohn’s病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球肾炎以及类风湿关节炎)和病毒感染(如肝炎病毒，痘病毒和腺病毒)，炎症、移植物对抗宿主疾病，急性移植排斥和慢性移植排斥。在优选实施方案中，本发明的KGF-2多核苷酸、多肽和/或拮抗剂用于抑制特别是上述所述癌症的生长、发展和/或转移。
与细胞存活提高有关的、可由KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂治疗或检测的疾病，包括但不限于恶病质及相关疾病的进展和/或转移，诸如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、单核细胞和红细胞白血病)和慢性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链疾病，和实体肿瘤，包括但不限于，肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊素瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮层肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、味蕾、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、气管发生癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌性细胞、肾母细胞瘤、颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质[细胞]瘤、menangioma、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
与细胞凋亡提高有关的、可由KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂治疗或检测的疾病，包括但不限于AIDS；神经变性疾病(诸如，Alzheimer病、Parkinson病、肌萎缩侧索硬化、色素性视网膜炎、小脑变性和大脑肿瘤或先前相关的疾病)；自体免疫病(诸如，如，多发性硬化症、Sjogren’s综合征、Hashimoto’s甲状腺炎、胆汁肝硬变、Behcet’s病、Crohn’s病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关肾小球肾炎以及类风湿关节炎)；骨髓增生异常综合征〔诸如，再生障碍性贫血〕移植物对抗宿主疾病，缺血损伤(诸如，由心肌梗塞、中风和再灌注损伤引起的)；肝损伤(例如，与肝损伤相关的肝炎，缺血/再灌注损伤、cholestosis(胆管损伤)和肝癌)；毒物诱导的肝脏疾病(诸如由酒精引起的)、感染性休克、恶病质和厌食症。创伤愈合以及上皮细胞增生
根据本发明的另一方面，提供了一种利用KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂用于治疗目的的方法，例如刺激上皮细胞增生和基底角质形成细胞用于创伤愈合目的，以及刺激头发毛囊产生和真皮创伤的愈合。KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可临床上用于刺激创伤愈合，包括手术创伤、切割伤、涉及真皮和表皮破坏的深度创伤、眼组织创伤、牙组织创伤、口腔创伤、糖尿病性溃疡、皮肤溃疡、肘溃疡、动脉溃疡、静脉停滞溃疡、由于热接触或化学物接触造成的烧伤和其他异常创伤愈合疾病，诸如尿毒症、营养不良、维生素缺乏和与、使用类固醇、放疗和抗肿瘤剂/抗代谢物的系统性治疗相关的并发症。KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于促进在皮肤丧失后的皮肤重建。
KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于增加皮肤移植物与创伤床的粘附，并刺激由创伤床的上皮再形成。下面是KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于增加皮肤移植物与创伤床的粘附之粘附物的类型：自体移植、人工皮肤、同种异体移植、自体皮肤移植、自体表皮移植、avacular移植、Blair-Brown移植、骨移植、胚胎期形成的移植、膜皮移植、延迟移植物、真皮植皮片、表皮植皮片、筋膜移植物、全厚移植物、异源移植物、异种移植物、同源移植物、增生性移植物、板状移植物、筛状移植物、粘膜移植物、Ollier-Thiersch移植物、omenpal移植物、片移植、蒂状皮肤移植片、贯通移植物、分裂皮肤移植物、厚分裂移植。KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于促进皮肤强度和改善老化皮肤的外观。
据信，KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂也会产生如下方面的改变：肝细胞增生、和肺、乳腺、胰腺、胃、小肠、大肠中上皮细胞增生。KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂也能促进上皮细胞的增生，诸如皮脂细胞、毛发毛囊、肝细胞、II型肺细胞、产生粘蛋白杯状细胞和其他上皮细胞及其包含在皮肤、肺、肝和胃肠道中的先祖细胞。KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可促进内皮细胞、角质形成细胞和基底角质形成细胞的增生。
KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂还可用于减少由于放疗、化疗或病毒感染造成的胃肠道毒性的副作用。KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可具有对小肠粘膜的细胞保护作用。KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂还可刺激由于化疗和病毒感染造成的粘膜炎(粘膜溃疡)的愈合。
KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂还可用于皮肤在全部或部分厚度的皮肤损伤中的完全再生，包括烧伤(即：毛发毛囊、汗腺和皮脂腺的细胞重新形成)，其他皮肤缺损的治疗，诸如牛皮癣。KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂还可用于治疗大疱性表皮松解症，一种表皮与下层皮肤粘附缺陷，其通过加速这些损伤的重新上皮细胞化而造成经常性、开放且疼痛的大庖。KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂还可用于治疗胃溃疡和十二指肠溃疡，并通过粘膜衬里的疤痕形成和腺粘膜与十二脂肠粘膜衬里的再生帮助愈合更加迅速。炎性肠疾病诸如局限性肠炎和溃疡性结肠炎，为分别造成小肠或大肠粘膜表明破坏的疾病。因此，KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于促进粘膜表面的重新形成，以帮助更快的愈合和防止炎性肠疾病的发展。期望利用KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂的治疗可具有对通过胃肠道之粘液产生具有明显作用，且可被用于保护肠粘膜免受摄入的或手术后之损伤性物质的破坏。KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可被用于治疗与KGF-2表达不足相关的疾病。
此外，KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于防止和治疗由于多种病理状态造成对肺的损伤。生长因子，诸如KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可刺激增生和分化，并促进肺泡和细支气管上皮的修复，以防止或治疗急性或慢性肺损伤。例如，肺气肿，其造成肺泡的进行性损失，和吸入性损伤(即由于烟雾吸入造成的)，和烧伤(其引起细支气管上皮和肺泡的坏死)均可由KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂有效的治疗。另外，KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于刺激II型肺泡细胞的增生和分化，其可帮助早产婴儿中疾病(诸如透明膜病、诸如婴儿呼吸窘迫综合征和支气管肺displasia)的治疗或预防。
KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可刺激肝细胞的增殖和分化，因此可用于缓解或治疗肝脏疾病，诸如由于肝硬化。造成的爆发性肝衰竭，由病毒性肝炎和毒性物质(即对乙酰氨基酚、四氯化碳和其他已知的肝脏毒性物质)造成的肝脏损伤。
此外，KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或预防糖尿病的发病。在新近诊断为I或II型糖尿病的患者中，如果有些胰岛细胞功能仍保留，KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于维持胰岛功能，使得缓解、延迟或防止疾病的永久性发作。此外，KGF-2多核苷酸(或多肽)以及KGF-2的激动剂或拮抗剂可用作胰岛细胞移植的辅助剂，以改善或促进胰岛细胞功能。感染性疾病
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测传染因子。例如，通过提高免疫应答，尤其是提高B和/或T-细胞的增殖和分化，可治疗传染病。可通过增强现有免疫应答或激发新的免疫应答来增加免疫应答。或者，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂也可直接抑制传染因子，无需引起免疫反应。
病毒是能引起可被KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂治疗或检测之疾病或症状的传染因子例子。病毒的例子包括，但不局限于以下DNA和RNA病毒科：虫媒病毒、腺病毒科、砂粒病毒科、动脉病毒、双RNA病毒、Bunyaviridae、杯状病毒科、环状病毒科、冠形病毒科、黄病毒科、嗜肝DNA病毒科(肝炎)、疱疹病毒科(如巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、带状疱疹)、Mononegavirus(如副粘病毒科、麻疹病毒科、弹状病毒科)、正粘病毒科(如流感病毒)、乳多空病毒科、细小病毒科、微小RNA病毒科、痘病毒科(如天花病毒或痘苗病毒)、呼肠孤病毒科(如轮状病毒)、逆转录病毒科(HTLV-I、HTLV-II或慢病毒属)和披膜病毒科(如风疹病毒)。在这些科内的病毒可引起多种疾病或症状，包括但不局限于：关节炎、细支气管炎、脑炎、眼部感染(如结膜炎、角膜炎)、慢性疲劳综合症、肝炎(A、B、C、E、慢性活动性、丁型肝炎)、脑膜炎、机会性感染(如AIDS)、肺炎、伯基特淋巴瘤、水痘、出血热、麻疹、流行性腮腺炎、副流感、狂犬病、普通感冒、脊髓灰质炎、白血病、风疹、性传播疾病、皮肤病(如卡波西病、疣)和病毒血症。KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。
类似地，能引起可被KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂治疗或检测之疾病或症状的细菌和真菌包括，但不局限于以下革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌及真菌：放线菌目(如棒杆菌、分枝杆菌、Norcardia)、曲霉、芽孢杆菌科(如炭疽、梭菌)、拟杆菌科、芽酵母、博德特氏菌、疏螺旋体、普鲁氏杆菌、念珠菌、弯曲杆菌、球孢子菌、隐球菌、Dermatocycoses、肠杆菌科(克雷伯氏菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、耶尔森氏菌)、丹毒丝菌、螺杆属菌、军团菌、钩端螺旋体病、利斯特氏菌、枝原体目、奈瑟氏球菌科(如不动杆菌、淋病、Menigococcal)、巴斯德氏菌科感染(如放线菌、嗜血菌(Heamophilus)、巴斯德氏菌)、假单胞菌、立克次氏体科、衣原体科、梅毒和葡萄球菌。这些细菌或真菌家族能引起以下疾病或症状，包括但不局限于：菌血症、心内膜炎、眼感染(如结膜炎、结核病、眼色素层炎)、齿龈炎、机会感染(如AIDS相关感染)、甲沟炎、与修复术相关的感染、赖特氏病、呼吸道感染(如百日咳或脓胸)、脓毒症、莱姆病、猫抓病、痢疾、副伤寒热、食物中毒、伤寒、肺炎、淋病、脑膜炎、衣原体、梅毒、白喉、麻风病、类结核、结核病、狼疮、肉毒中毒、坏疽、破伤风、脓胞病、风湿热、猩红热、性传播疾病、皮肤病(如蜂窝织炎、dermatocycoses)、毒血症、尿道感染、伤口感染。KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。
此外，能引起可被KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂治疗或检测之疾病或症状的寄生物包括，但不局限于以下家族：变形虫、巴贝虫、球虫、隐孢子虫双核阿米巴(Dientamoebiasis)、姌疫(Dourine)、外寄生虫、贾第鞭毛虫、蠕虫、利什曼虫、泰勒尔梨浆虫、弓形体、锥虫和毛滴虫(Trichomonas)。这些寄生虫能引起多种疾病或症状，包括但不局限于：疥疮、恙螨病、眼感染、肠疾病(如痢疾、贾第鞭毛虫病)、肝病、肺病、机会感染(如AIDS相关疾病)、症疾、妊娠并发症和弓形体病。KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于治疗或检测任何这些症状或疾病。
优选的，利用KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂进行的治疗可通过施用有效量KGF-2多肽于病人，或从患者体内取出细胞，给细胞提供KGF-2多核苷酸，并将该改造后的细胞重新引入患者体内(离体疗法)而进行。此外，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用作疫苗中的抗原以产生抗传染病的免疫应答。再生
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于分化、增殖和吸引细胞，导致组织再生。(见，科学276：59-87(1997)。)组织的再生可用于修复、置换或保护由于先天缺陷、损伤(创伤、烧伤、割伤或溃疡)、年龄、疾病(如骨质疏松症、骨性关节炎、牙周疾病、肝衰竭)、外科手术，包括整容手术、纤维变性症、再灌注损伤或系统性细胞因子损伤而受损的组织。
可用本发明再生的组织包括器官(如胰、肝、肠、肾、皮肤、内皮)、肌肉(平滑肌、骨胳肌或心肌)、血管(包括血管内皮)、神经、造血和骨胳(骨、软骨、腱和韧带)组织。优选地，再生发生时无或减少瘢疤形成。再生也可包括血管形成。
此外，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可促进难以愈合的组织的再生。例如，促进腱/韧带再生会加快损伤后的恢复时间。也可预防性地使用本发明的KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂以避免损伤。可治疗的特异疾病包括腱炎、腕管综合症和其他腱或韧带损伤。非愈合性创伤的组织再生的其他例子包括强制性溃疡(pressure ulcer)、与血管不足相关的溃疡、外科手术创伤和外伤。
类似地，通过利用KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂增殖和分化神经细胞也可再生神经和脑组织。用此方法可治疗的疾病包括中枢和外周神经系统疾病、神经病或机械性和创伤性疾病(如脊髓紊乱、头部创伤、脑血管疾病和中风)。特别是，与外周神经损伤相关的疾病、外周神经病(如由于化疗或其他医学治疗所产生)、局部神经病和中枢神经系统疾病(如早老性痴呆、帕金森症、亨亭顿氏舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化和Shy-Drager综合症)均可用KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂治疗。趋化性
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可能具趋化活性。趋化分子吸引或迁移细胞(如单核细胞、成纤维细胞、嗜中性粒细胞、T-细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、上皮细胞和/或内皮细胞)至身体的特殊位点，如发炎、感染或过度增殖位点。然后迁移细胞去除和/或治愈特殊损伤或异常。
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可增加特殊细胞的趋化性。然后这些趋化分子可通过增加定向于身体内特殊位置的细胞数而用于治疗炎症、感染、过度增殖疾病或任何免疫系统疾病。例如，趋化分子可通过吸引免疫细胞至受伤部位而用于治疗组织的创伤和其他损伤。作为趋化分子，KGF-2还能吸引可用于治疗创伤的成纤维细胞。
也考虑到KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可抑制趋化活性。这些分子也可用于治疗疾病。因此，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用作趋化性的抑制剂。结合活性
KGF-2多肽可用于筛选可结合KGF-2的分子或者KGF-2结合的分子。KGF-2与分子的结合可激活(激动剂)、提高、抑制(拮抗物)或降低KGF-2或者所结合分子的活性。所说分子的例子包括抗体、寡核苷酸、蛋白质(如受体)或小分子。
优选地，该分子与KGF-2的天然配基紧密相关，如配基片段、天然底物、配基、结构或功能模拟物。(见，Coligan等，免疫学通用方法(Currentprotocols in Immunology)1(2)：第5章(1991)。)类似的，该分子可能与KGF-2所结合的天然受体或至少能被KGF-2结合的受体片段(如活性位点)紧密相关。任何一种情况中分子均可用已知技术合理设计。
优选地，这些分子的筛选包括产生表达KGF-2(作为分泌蛋白或在细胞膜上)的适当细胞。优选的细胞包括哺乳动物、酵母、果蝇或大肠杆菌的细胞。然后将表达KGF-2的细胞(或含表达多肽的细胞膜)与可能含此分子的检测化合物接触，以观察KGF-2或此分子的结合、活性的刺激或抑制。
试验可只检测候选化合物与KGF-2的结合，其中结合用标记或包括与标记竞争物竞争的试验来检测。另外，试验可检测候选化合物是否通过与KGF-2结合产生信号。
或者，可用无细胞制品、粘附于固相支持物的多肽/分子、化学药品或天然产物混合物进行试验。试验也可简单地包括以下步骤：混合候选化合物与含KGF-2的溶液，检测KGF-2/分子的活性或结合，并与标准品比较KGF-2/分子的活性或结合。
优选地，ELISA试验可用单克隆抗体或多克隆抗体检测样品(如生物样品)中KGF-2水平或活性。抗体可通过直接或间接地与KGF-2结合或与KGF-2竞争底物而检测KGF-2的水平或活性。
此外，与KGF-2结合的受体可由本领域已知的多种方法鉴别，例如，配体淘选(panning)和FACS分选(Coligan等，Current protocols inImmun.，1(2)，第5章，(1991))。例如，利用表达克隆，其中从应答多肽的细胞中制备多聚腺苷酸化的RNA，例如从已知含有FGF家族蛋白质的多种受体之NIH3T3细胞，和SC-3细胞，和由此RNA产生的cDNA文库被分成了多个集合(pool)且用于转染COS细胞或其他不能应答多肽的细胞。在玻璃载玻片上生长的转染的细胞接触本发明的多肽(已经被标记)。可利用包括碘化作用或包涵对于位点特异性蛋白激酶的识别位点的多种方法标记多肽。
在固定和温育后，将载玻片经过自动放射显影分析。鉴定阳性集合，制备亚集合(subpool)，利用反复亚集合和再筛选方法重新转染，最终产生了编码推定受体的单一克隆。
作为鉴定受体的另一种方法，标记的多肽可被光亲和连接到细胞膜或表达受体分子的提取物制剂。利用PAGE解析交联的材料，并对X-射线胶片暴光。含有多肽之受体的标记的复合物可被从胶上切割，解析成肽片段，并经历蛋白质微量测序。获自微量测序的氨基酸序列将用于设计一套简并性寡核苷酸探针筛选cDNA文库，鉴定编码推定受体的基因。
此外，可用基因改构、基元改构、外显子改构和/或密码子改构(一并称为“DNA改构”)技术来调节KGF-2的活性，由此有效的产生KGF-2的激动剂和拮抗剂。见例如，美国专利5605793；5811238；5830721；5834252和5837458，以及Patten等，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33(1997)；Harayama，Trends biotechnol.16(2)：76-82(1998)；Hansson等，分子生物学杂志，287：265-76(1999)；以及Lorenzo和Blasco，生物技术，24(2)：308-13(1998)(在此各个全文引入作为参考)。在一个实施方案中，KGF-2的多核苷酸以及相应的的多肽之改变可通过DNA改构实现。DNA改构包括通过同源或定点重组组装两个或多个DNA区段以产生期望的KGF-2分子。在另一个实施方案中，KGF-2多核苷酸和相应的多肽可被改变，方法是在重组前经过差错倾向PCR、随机核苷酸插入或其他方法。在另一个实施方案中，可将KGF-2的一个或多个成分、基元、区段、部分、结构域、片段等与一个或多个异源分子的一个或多个成分、基元、区段、部分、结构域、片段等重组。在一个优选实施方案中，异源分子是生长因子，诸如，例如血小板衍生的生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGI-I)，转化生长因子(TGF)-α，表皮生长因子(EGF)，成纤维生长因子(FGF)，TGF-β，骨形态生成蛋白(BMP)-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP7，激活素A和B，decapentaplegic(dpp)，60A，OP-2，dorsalin，生长分化因子(GDF)，节(nodal)，MIS，抑制素α，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β5，和神经胶质衍生的嗜中性因子(GDNF)。
其他优选的片段为生物活性的KGF-2片段。生物活性片段是那些显示与KGF-2多肽活性相似但不一定相同的片段。片段的生物活性可包括改善的期望活性，或降低的不期望的活性。
此外，本发明提供了一种筛选化合物以从中鉴定那些调节本发明多肽的作用化合物之方法。这种检测的一个例子包括在成纤维细胞可正常增殖的细胞培养条件下，结合哺乳动物细胞、本发明多肽、待筛选的化合物以及3[H]胸腺嘧啶。在不存在待筛选化合物的条件下进行对照检测，并与在存在化合物时成纤维细胞增殖的数量，以通过测定每一例中3[H]胸腺嘧啶的摄入确定该化合物是否刺激增殖。利用测量3[H]胸腺嘧啶的掺入之液体闪烁色谱测量成纤维细胞增殖的量。用此方法可鉴别激动剂和拮抗剂化合物。
在另一个方法中，用标记的本发明多肽在存在化合物的条件下，温育表达本发明多肽的受体之哺乳动物细胞或膜制剂。化合物增加或阻断此相互作用的能力由此可测。或者，在待筛选化合物与KGF-2受体相互作用测量后，可测量KGF-2抑制第二信号系统的反应，和测量化合物结合到受体并引发第二信号反应的能力，以鉴定是否该化合物是潜在的激动剂或拮抗剂。这类第二信号系统包括但不限于，cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道或磷酸肌醇水解。
所有以上试验均可用作诊断或预后标记。用这些试验发现的分子可用于通过活化或抑制KGF-2分子而治疗疾病或在患者中产生特殊的效果(如血管生长)。此外，这些试验能发现可抑制或增强适当处理细胞或组织中KGF-2产生的物质。因此，本发明包括鉴定与KGF-2可结合的化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)温育候选结合化合物与KGF-2；和(b)测定结合是否发生。另外，本发明包括鉴定激动剂/拮抗物的方法，该方法含以下步骤：(a)温育候选化合物与KGF-2；(b)检测生物学活性，和(c)测定KGF-2的生物学活性是否已改变。
此外，可以利用在图4以及表1中公开的β-片层区实验性鉴定结合KGF-2的分子。因此，本发明的特定实施方案涉及编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括或者由在图4/表1中公开的每一个β-片层区之氨基酸序列组成。本发明的额外的实施方案涉及编码KGF-2多肽的多核苷酸，所述多肽包括或者由在图4/表1中公开的β-片层区之氨基酸序列的任一组合以及其全部组成。本发明额外优选的实施方案涉及这样的多肽，所述多肽包括或者由在图4/表1中公开的β-片层区之KGF-2氨基酸序列组成。本发明额外的实施方案涉及KGF-2多肽，所述多肽包括或者由在图4/表1中公开的β-片层区的任一组合或全部组成。反义与核酶(拮抗剂)
在特定实施方案中，根据本发明的拮抗剂是相应于包含在SEQ IDNO：1的核酸，或其互补链，和/或包含在保藏的克隆中的核苷酸序列。在一个实施方案中，反义序列在生物体内部产生。在另一实施方案中，反义序列分别施用(见如，O’Connor，J.Neurochem.56：560(1991).Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)。反义技术通过反义DNA或RNA，或通过三链螺旋形成，可用于控制基因表达。反义技术详述见例如，Okano，J.Neurochem.56：560(1991)；Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)。三链螺旋形成详述于例如Lee等，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456(1988)；和Dervan et at.，科学，251：1300(1991)。这些方法均基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。
例如，表明本发明多肽之多核苷酸的5’编码部分可用于设计长度约10-40破基对的反义RNA寡核苷酸。设计互补于基因的一个区域之DNA寡核苷酸，所述基因参与转录，籍此防止了转录和受体的产生。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交，并阻断了mRNA分子翻译为受体多肽。
在一个实施方案中，本发明的KGF-2反义核酸通过外源序列的转录在细胞内产生。例如，转录了一个载体或其部分，产生本发明的反义核酸(RNA)。这类载体含有编码KGF-2反义核酸的序列。这类载体可在染色体外保留或整合入染色体，只要它能够被转录以产生期望的反义RNA。这类载体可通过本领域标准的重组DNA技术构建。载体可为用于在脊椎动物细胞中复制和表达的质粒、病毒或其他本领域已知的材料。编码KGF-2的序列或其片段之表达可由本领域已知的在脊椎动物优选为人中有功能的任一启动子引导。这样的启动子可为诱导型的或组成型的。这类启动子包括但不限于SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，自然，29：304-310(1981))，包含于劳氏肉瘤病毒3’长末端重复中的启动子(Wagner等，美国国家科学院院报，78：1441-1445(1981))，金属硫蛋白的调控序列(Brinster等，自然，296：39-42(1982))等等。
本发明的反义核酸序列包括互补于KGF-2基因的RNA转录物的至少一部分的序列。但是，绝对的互补性(虽然优选)并不必需。“与RNA的至少一部分互补”的序列在此是指具有足够的互补性，能够与RNA杂交形成稳定的双螺旋的序列；在双链KGF-2反义核酸的情况中，双螺旋DNA的单链由此可被检测，或可鉴定三螺旋的形成。杂交的能力将取决于互补性的程度和反义核酸的长度。一般地，杂交的核酸越大，含有的与KGF-2RNA错配就越多，但仍形成稳定的双螺旋(或三螺旋)。本领域技术人员利用确定杂交复合物熔点的标准方法可确定错配的可容忍程度。
与信息的5’端例如，5’非翻译序列甚至包括到AUG起始密码子，互补的寡核苷酸在起始翻译中最有效。但是，互补于mRNA 3’非翻译序列的序列显示在起始mRNA翻译中也有效。见如，Wagner，R.，1994，自然，372：333-335。因此，互补于示于图1A-B中的KGF-2之5’或3’非翻译、非编码区的寡核苷酸可用于反义方法中以抑制内源性KGF-2mRNA的翻译。互补于mRNA的5’非翻译区的寡核苷酸应当包括AUG起始密码子的互补物。互补于mRNA的编码区之反义寡核苷酸不是那么有效的翻译抑制物，但是根据本发明可以使用。无论是否设计用来与KGF-2 mRNA的5’、3’或编码区域杂交，反义核酸长度应当至少为6核苷酸，且优选为长度从6-约50个核苷酸的反义核酸。在特定的方面，寡核苷酸至少为10个核苷酸，至少17个核苷酸，至少25个核苷酸，或至少50个核苷酸。
本发明的多核苷酸可为DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰的版本，单链或双链。寡核苷酸可在碱基基团、糖基团或磷酸骨架部分被修饰，例如，以改善核酸的稳定性、杂交等等。寡核苷酸可包括其他附加的基团，诸如肽(例如，为了体内靶定宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的因子(见如，Lestinger等，1989，美国国家科学院院报，86：6553-6556；Kemaitre等，1987，美国国家科学院院报，84：648-652；PCT公开文本WO88/09810，公开于1988年12月15日。)或是促进跨越血-脑屏障的因子(见如，PCT公开文本WO89/10134，公开于1988年4月25日)，杂交引发的切割剂(见如，Krol等，1988，BioTechniques6：958-976)或嵌入剂(见如，Zon，1988，Pharm.Res.，5：539-549)。为此，寡核苷酸可与其他分子例如肽、杂交引发的交联剂、转运剂、杂交引发的切割剂等偶联。
反义寡核苷酸可包括至少一种修饰的碱基基团，其选自如下但不限于此：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基化queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基化queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧-乙酸(V)，wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
反义寡核苷酸可还包含至少一种修饰的糖基团，其选自，包括但不限于，阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一种修饰的磷酸骨架，其选自包括但不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和formacetal或其类似物。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸是一种异头物化寡核苷酸。一种异头物化寡核苷酸与互补RNA形成特定的双链杂合体，其中与通常的b单元不同，链彼此以平行方向延伸(Gautier等，1987，核酸研究，15：6625-6641)。寡核苷酸是2’-O-甲基核苷酸(Inoue等，1987，核酸研究15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBSLett.，215：327-330)。
本发明的多核苷酸可利用本领域周知的方法合成，例如利用自动DNA合成仪(诸如市售的Biosearch，Applied Biosystems，等)。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可利用Stein et al，1988，核酸研究16：3209，的方法合成。甲基磷酸酯寡核苷酸可利用控制孔径的玻璃聚合物支持物制备(Sarin etal，1988，美国国家科学院院报，85：7448-7451)等。
虽然互补于KGF-2编码区序列的反义核苷酸可以使用，那些互补于转录的非翻译区的是最优选的。
根据本发明的潜在拮抗剂也包括催化性RNA，或核酶(见如，PCT公开文本/11364；公开于1990年10月4日；Sarver et al，.科学，247：1222-1225(1990))。虽然在特定识别位点切割mRNA序列的核酶可用于破坏KGF-2的mRNA，优选使用锤头核酶。锤头核酶在由侧翼区表明的位置切割mRNA，所述侧翼区与靶mRNA形成互补性碱基对。唯一的要求是靶mRNA具有如下的两个碱基序列：5’-UG-3’。锤头核酶的构建和产生为本领域周知，且在Haseloff和Gerlach，自然，334：585-591(1988)中有描述。在KGF-2的核苷酸序列内有多种潜在的锤头核酶切割位点(图1A-B)。优选地，核酶被构建使得切割识别位点位于靠近KGF-2 mRNA的5’端；即：增加效率和减小非功能性mRNA转录物的胞内积累。
在反义途径中，本发明的核酶可由修饰的寡核苷酸组成(例如，用于改进稳定性，靶向性等)，且应被递送到体内表达KGF-2的细胞中。编码核酶的DNA构建体可以如上述导入反义编码DNA的相同的方法被导入细胞中。递送的优选方法包括利用“编码”在强组成型启动子，如pol III或pol II启动子，控制下的核酶之DNA构建体，使得转染的细胞产生足够量的核酶以破坏内源性KGF-2信息，并抑制翻译。由于核酶，不同于反义分子，其是催化性的，需要较低的胞内浓度以发挥功效。
拮抗剂/激动剂化合物可用于抑制细胞生长和本发明的多肽对肿瘤细胞和组织的增殖作用，即肿瘤所血管生成的刺激，因此阻滞或防止异常细胞生长和增殖，例如在肿瘤形成或生长中。
拮抗剂/激动剂也可用于防止血管过多的疾病，防止在囊外白内障手术后上皮角膜细胞的增殖。本发明多肽之促有丝分裂活性的防止在有些情况中，例如气囊血管扩张术后的再狭窄中，也是期望。
拮抗剂/激动剂也可用于防止在创伤愈合过程中疤痕组织的生长。
拮抗剂/激动剂也可用于治疗此处所述的疾病。其他活性
本发明的多肽作为刺激血管内皮细胞增殖能力的结果，可用于治疗由于刺激多种疾病造成的缺血组织的再血管化，诸如血栓、动脉粥样硬化和其他心血管疾病。这些多肽可用于刺激血管生成和肢体再生，如上述。
多肽可用于治疗由于损伤、烧伤、手术后组织修复和溃疡造成的创伤，因为其促进细胞分裂为不同器官的多种细胞，诸如成纤维细胞和骨骼肌细胞，因此，促进损伤或患病的组织修复和替换。
本发明的多肽也可用于刺激神经元生长，并治疗和预防神经元性损伤，其发生在某些神经元疾病或神经退化性疾病诸如阿尔次海默症、帕金森氏症和艾滋病相关综合征。KGF-2可具有刺激软骨细胞生长的能力，因此，其可用来增强骨骼和牙周再生，并有助于组织移植或骨移植。
通过刺激角质形成细胞，本发明多肽可用于防止因日晒造成的皮肤老化。
KGF-2可用于防止头发脱落，因为FGF家族成员激活头发形成细胞，并促进黑素细胞生长。同时，本发明多肽可用于刺激造血细胞和骨髓细胞的生长和分化，当与其他细胞因子联合使用时。
KGF-2多肽可用于在移植前维持器官，或用于支持原代组织的细胞培养。
本发明多肽可用于诱导早期胚胎中的中胚层组织开始分化。
除了以上所述的造血细胞系外，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂或KGF-2的激动剂或拮抗剂还可增加或减少胚胎干细胞的分化或增殖。
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂或KGF-2的激动剂或拮抗剂还可用于调节哺乳动物的特性，如身高、体重、发色、眼的颜色、皮肤、脂肪组织的百分比、色素沉着、大小和形状(如整容手术)。类似地，KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于调节哺乳动物的代谢，影响分解代谢、合成代谢、加工、利用和能量的储存。
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂可用于通过影响生物节律、caricadic节律、抑郁(包括抑郁性疾病)、暴力倾向、耐痛力、生殖能力(优选通过活化素或类抑制素活性)、激素或内分泌水平、食欲、性欲、记忆力、应激力或其他认知性而改变哺乳动物的精神状态或身体状况。
KGF-2多核苷酸或多肽，或KGF-2的激动剂或拮抗剂还可用做食品添加剂或防腐剂，如用于增加或减少储存能力、脂肪含量、脂类、蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质、辅助因子或其他营养成分。
上述应用可用于多种宿主。这些宿主包括但不限于人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、微型猪、鸡、牛、绵羊、狗、猫、非人灵长类动物和人。在特定实施方案中，宿主是小鼠、兔、山羊、豚鼠、鸡、大鼠、仓鼠、猪、绵羊、狗或猫。在优选实施方案中，宿主是哺乳动物。在最优选实施方案中宿主是人。诊断和成像
特异性结合目标多肽的标记的抗体、其衍生物和类似物可用于诊断目的，以检测、诊断或监测与本发明的多肽之表达和/或活性异常相关的疾病、紊乱和/或病症。本发明提供了用于检测目标多肽表达异常的方法，包括(a)利用一种或多种目标多肽特异性的抗体检测个体的细胞或体液中目标多肽的表达；和(b)将基因表达水平与标准基因表达水平相比较，籍此，相对于标准表达水平的所检测的多肽基因表达水平之增加或降低就是异常表达的指征。
本发明提供了用于诊断紊乱的诊断方法，包括(a)利用一种或多种目标多肽特异性的抗体检测个体的细胞或体液中目标多肽的表达；和(b)将基因表达水平与标准基因表达水平相比较，籍此，相对于标准表达水平的所检测的多肽基因表达水平之增加或降低就是特定紊乱的指征。具体到癌症，来自个体的活检组织之相对高的转录物的存在可能提示疾病形成的易感性，或提供了一种在实际临床症状表现之前检测疾病的方法。这种类型的更为确定的诊断可允许健康个体采用预防性措施或早期的介入性治疗，由此防止了疾病的发生或进展。
本发明的抗体可用于利用本领域已知的经典免疫组织学方法检测生物样品中蛋白质的水平(见如，Jalkanen，等，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；alkanen，等，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。其他基于抗体的用于检测蛋白质基因表达的方法包括免疫检测，诸如酶联免疫检测(ELISA)和放射免疫检测(RIA)。适当的抗体检测标记为本领域周知，包括酶标记，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)铟(112In)和锝(99Tc)；萤光素标记，如鲁米诺；和荧光素标记，如荧光黄和罗丹明，和生物素。
本发明的一个方面是一种与本发明的多肽异常表达相关的动物，优选哺乳动物，最优选人中的疾病或紊乱之检测和诊断方法。在一个优选的实施方案中，诊断包括：a)向受试者施用(例如，肠胃外、皮下或腹膜内)治疗有效量可特异性与目标多肽结合的标记分子；b)在施用后等候一段时间，使得标记的分子在该多肽(和对于待清除至背景水平的非结合的标记)表达的患者部位优势性聚集；c)确定背景水平；以及d)检测受试者中标记分子，使得高于背景水平的标记分子的检出表明该受试者具有与目标多肽的异常表达相关的特定疾病或紊乱。标记水平可通过多种方法确定，并将所检测的标记分子与事先确定的特定系统之标准值相比较。
本领域技术人员知晓，受试者的体积和所用的成像系统将确定需要生成诊断性图象之成像分子的数量。对于放射性同位素分子，和人受试者而言，注射入的放射活性的量之范围一般在大约5-20毫居里的99mTc。标记的抗体或抗体片段将优势性聚集在含有特异性蛋白质的细胞所在之处。体内肿瘤成像见S.W.Bruchiel等，“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments”(Chpt.13，TumorImaging：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Bruchiel & B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)中所述。
取决于多种变化，包括所用标记的类型和给药方式，以允许标记分子优势性聚集于受试者的位点以及对于待清除至背景水平之未结合分子而言，给药后的时间间隔在6-48小时或6-24小时或6-12小时。在另一实施方案中，给药后的间隔为5-20天，或5-10天。
在一个实施方案中，疾病或紊乱的监测是通过重复诊断该疾病或紊乱来进行的，例如，在首次诊断后1个月，首次诊断后6个月，首次诊断后1年再次诊断。
利用本领域已知的关于体内筛查的方法可检测患者中标记分子的存在与否。这些方法取决于所用标记的类型。本领域技术人员能够确定检测特定标记的适当方法。可用于本发明的检测之方法和装置包括但不限于，计算机断层扫描技术(CT)，全身扫描，诸如正电子发射断层摄影术，磁共振成象和超声仪。
在一个特定实施方案中，用一种放射性同位素标记分子，利用放射应答型手术器械在患者中检测(Thurston等，美国专利5441050)。在另一个实施方案中，用一种荧光化合物标记分子，利用荧光应答型扫描装置检测患者。在又一种实施方案中，用正电子发射金属标记分子，利用正电子发射断层扫描术检测患者。在又一种实施方案中，分子用顺磁标记分子标记，用磁共振成像仪(MRI)检测患者。试剂盒
本发明提供了可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括在一个或多个容器中的本发明抗体，优选为纯化的抗体。在一个特定实施方案中，本发明的试剂盒含有基本上分离的多肽，其包含可与试剂盒中所含抗体有特异性免疫反应的一种表位。优选的，本发明的试剂盒还包括一种不与目标多肽反应的对照抗体。在另一个特定实施方案中，本发明的试剂盒含有一种用于检测抗体与目标多肽结合的手段(例如，抗体可与一种可检测底物(如荧光素化合物、酶底物、放射活性化合物或萤光素化合物)偶联，或可识别第一种抗体的第二种抗体可与可检测底物偶联。)。
在本发明的另一个特定实施方案中，试剂盒是一种用于筛选血清的诊断试剂盒，所述血清含有特异于增殖性和/或癌症性多核苷酸和多肽的抗体。这种试剂盒可包括不与目标多肽反应的一种对照抗体。这种试剂盒可包括基本上分离的多肽抗原，其含有与至少一种抗多肽抗原的抗体特异性免疫反应的表位。此外，这种试剂盒包括用于检测该抗体与抗原结合的手段(例如，抗体可与荧光化合物(如荧光素或罗丹明，其可被流式细胞仪检测)偶联)。在一个特定实施方案中，试剂盒可包括重组制备的或化学合成的多肽抗原。试剂盒的多肽抗原也可与一种固相支持物结合。
在又一特定实施方案中，上述试剂盒的检测手段包括该多肽抗原所附着的一种固相支持物。这类试剂盒还可包含非附着的报道分子标记的抗人抗体。在此实施方案中，抗体与多肽抗原的结合可利用该报道分子标记的抗体的结合检测。
在一个额外的实施方案中，本发明包括一种用于筛选血清的诊断试剂盒，所述血清含有本发明多肽的抗原。诊断试剂盒包含一种基本上分离的与多肽或多核苷酸抗原特异性免疫反应的抗体，以及一种用于检测多核苷酸或多肽抗原与抗体结合的手段。在一个实施方案中，抗体与一种固相支持物结合。在一个特定实施方案中，抗体可为单克隆抗体。试剂盒的检测手段可包括第二种标记的单克隆抗体。或者，检测手段可包括一种标记的竞争性抗原。
在一个诊断方法中，待测血清与具有表面结合的抗原(通过本发明的方法获得)之固相试剂反应。用特异性抗原抗体结合该试剂，并用洗涤去除未结合的血清成分，将该试剂与报道分子标记的抗人抗体反应，以固相支持物上结合的抗抗原抗体之比例结合报道分子到该试剂上。再次洗涤该试剂以去除未结合的标记的抗体，确定与该试剂结合的报道分子的量。通常，报道分子是一种可被检测的酶，检测方法为通过在适当的荧光、萤光或发色底物存在下温育固相。(Sigma，St.Louis，MO)。
上述检测中的固相表面试剂可利用本领域已知的用于将蛋白质材料结合到固相支持物(诸如聚合物珠、试纸条(dip sticks)、96孔板或过滤材料)上的方法制备。这些结合方法一般包括蛋白质对支持物的非特异性吸附或蛋白质，一般地，通过游离氨基对固相支持物上化学活泼的基团(如活化的羧基、羟基或醛基)之共价连接。或者，链亲和素包被的板可用于与生物素化的抗原结合。
因此，本发明提供了一种用于进行这样的诊断方法的检测系统或试剂盒。试剂盒一般包括带有表面结合的重组抗原和报道分子标记的抗人抗体的支持物，用于检测表面结合的抗抗原抗体。
以上已对本发明进行了综述，参照举例说明的以下实施例将更易理解本发明，但本发明并不局限于这些实施例。
                      实施例1KGF-2的细菌表达和纯化
将编码KGF-2的DNA序列ATCC#75977首先用PCR寡核苷酸引物扩增，所述引物对应于加工过的KGF-2 cDNA(包括信号肽序列)的5’和3’序列。5’寡核苷酸引物含有序列5’CCCCACATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3’(SEQ ID NO.3)，该序列含有Afl III限制酶位点，该位点包括并随后是从推测的起始密码子开始的KGF-2编码序列的30个核苷酸。3’序列5’CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3’(SEQ ID NO.4)含有Hind III位点的互补序列，随后是KGF-2的26个核苷酸。这些限制酶位点与细菌表达载体pQE-60(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA)上的限制酶位点相容。pQE-60编码抗生素抗性(AMpr)，一个细菌复制起点(ori)，IPTG调节型启动子操纵子(P/O)，核糖体结合位点(RBS)，6-His标记和限制酶位点。然后将pQE-60用NcoI和HindIII消化。将扩增的序列连接到pQE-60中，并符合读框地插入。然后按照Sambrook，J.等在分子克隆：实验室操作手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(1989))中描述的方法，用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)。M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，该质粒表达lacI阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。根据其在LB平板上的生长能力来鉴定转化体，并筛选出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA并通过限制分析进行鉴定。使含所期望的构建体的克隆在补加了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。以1∶100至1∶250的比例，用O/N培养物接种大体积培养基。使细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6。然后加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)达到1mM的终浓度。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导清理所述P/O，从而导致基因表达的增加。使细胞再生长3至4小时。然后通过离心收集细胞。将细胞沉淀溶解于离液剂6M盐酸胍中。澄清后，在可以紧密结合蛋白质的条件下，在肝素亲和柱上通过色谱从该溶液中纯化溶解的KGF-2(Hochuli，E.等，色谱学杂志，411：177-184(1984))。用高盐缓冲液从该柱上将KGF-2(75％纯)洗脱下来。
                          实施例2KGF-2截短变体的细菌表达和纯化
将编码KGF-2的DNA序列，ATCC#75977首先用PCR寡核苷酸引物扩增，所述引物对应于KGF-2多肽之截短变体的5’和3’序列。所述截短变体含所述多肽减去所述36个氨基酸的信号序列，在构成全长蛋白质氨基酸37的半胱氨酸残基前加入一个甲硫氨酸和丙氨酸残基。所述5’寡核苷酸引物含有序列5’CATGCCATGGCGTGCCAAGCCCTTGGTCAGGACATG3’(SEQ ID NO：5)，该序列含有NcoI限制酶位点，该位点接着KGF-2编码序列的24个核苷酸。3’序列5’CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3’(SEQ IDNO：6)含有与HindIII位点互补的序列，随后是KGF-2基因的26个核苷酸。所述限制酶位点与细菌表达载体pQE-60(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA)上的限制酶位点相容。pQE-60编码抗生素抗性(Ampr)，一个细菌复制起点(ori)，IPTG调节型启动子操纵子(P/O)，核糖体结合位点(RBS)，6-His标记和限制酶位点。然后将pQE-60用NcoI和HindIII消化。将扩增的序列连接到pQE-60中，并符合读框地插入。然后按照Sambrook，J.等在分子克隆：实验室操作手册(冷泉港实验室出版社(1989))中描述的方法，用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)。M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，该质粒表达lacI阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。根据其在LB平板上的生长能力来鉴定转化体，并筛选出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA并通过限制分析进行鉴定。使含所需要的构建体的克隆在补加了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。以1∶100至1∶250的比例，用O/N培养物接种大体积培养基。使细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6。然后加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)达到1mM的终浓度。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导清理所述P/O，从而导致基因表达的增加。使细胞再生长3至4小时。然后通过离心收集细胞。将细胞沉淀溶解于离液剂6 M盐酸胍中。澄清后，在可以紧密结合蛋白质的条件下，在肝素亲和柱上通过色谱从该溶液中纯化溶解的KGF-2(Hochuli，E.等，色谱学杂志，411：177-184(1984))。用高盐缓冲液从该柱上将KGF-2洗脱下来。
                     实施例3用杆状病毒表达系统克隆并表达KGF-2
将编码全长KGF-2蛋白质的DNA序列ATCC#75977用PCR寡核苷酸引物扩增，所述引物对应于该基因的5’和3’序列：
5’引物含有序列5’GCGGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTCAC3’(SEQ ID NO：7)并含有BamHI限制酶位点(斜体字)，该位点后接有6个核苷酸，所述核苷酸组装成真核细胞中的一个有效翻译起始信号(Kozak，M.，分子生物学杂志，196：947-950(1987))并正好在KGF-2基因的前17个核苷酸后(划线部分为翻译起始密码子“ATG”)。
3’引物含有序列5’GCGCGGTACCACAAACGTTGCCTTCCT3’(SEQ ID NO：8)并含有限制内切酶Asp718的切割位点和与KGF-2基因之3’非翻译序列互补的19个核苷酸。用市售试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)从1％琼脂糖凝胶上分离扩增的序列。然后将该片段用内切酶BamHI和Asp718消化，再在1％琼脂糖凝胶上纯化。将该片段命名为F2。
用杆状病毒表达系统(有关综述参见：Summers，M.D. & Smith，G.E.，杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册(A manual of methods forbaculovirus vectors and insect cell culture procedures)，TexasAgricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987))，将载体pA2(修饰的pVL941载体，下文讨论)用于表达KGF-2蛋白质。该表达载体含有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，该启动子后接有限制内切酶BamHI和Asp718的识别位点。将猿猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了易于筛选重组体病毒，将大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子相同的方向插入，所述启动子后接有多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧均有病毒序列，所述病毒序列用于细胞介导的共转染的野生型病毒DNA之同源重组。可以用许多其它杆状病毒载体例如pAc373，pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A. & Summers，M.D.，病毒学170：31-39)。
将该质粒用限制酶BamHI和Asp718消化。然后用市售试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)从1％琼脂糖凝胶上分离该DNA。将该载体命名为V2。
将片段F2和质粒V2用T4 DNA连接酶连接。然后转化大肠杆菌HB101，通过使用两个克隆寡核苷酸的PCR，鉴定含带KGF-2基因之质粒(pBacKGF-2)的细菌。用DNA测序确定该克隆片段的序列。
用脂转染法(Felgner等，美国国家科学院院报，84：7413-7417(1987))将5μg质粒pBacKGF-2与1.0μg市售线性化杆状病毒(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA)共转染。
在含50μl无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)之微滴定板的无菌孔中，将1μg BaculoGoldTM杆状病毒DNA与5μg质粒pBacKGF-2混合。此后，加入10μl Lipofectin加90μl Grace’s培养基，混合并在室温培养15分钟。然后将转染混合物滴加至Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)中，所述Sf9昆虫细胞接种于含1毫升无血清的Grace’s培养基的35毫米组织培养平板中。将该平板前后摇动以混合新加入的溶液。然后将平板在27℃保温5小时。5小时后，从平板中除去转染溶液，并加入1毫升补加了10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。将平板放回至培养箱中，在27℃继续培养4天。
4天后，收集上清液，然后按照与Summers和Smith(出处同前)所述相似的方法完成噬斑试验。作为一种改进，使用含“Blue Gal”(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg)的琼脂糖凝胶，这样可以容易分离出蓝色噬斑。(“噬斑试验”的详细描述可参见Life Technologies Inc.提供的有关昆虫细胞培养和杆状病毒学的用户指南，9-10页)。
系列稀释后4天，将病毒加到细胞中，用Eppendorf取液器的吸头挑出染成蓝色的噬斑。然后将含重组病毒的琼脂重悬在含200μl Grace’s培养基的Eppendorf管中。通过简单离心除去琼脂，利用含重组杆状病毒的上清液来感染接种于35毫米平皿中的Sf9细胞。4天后，收集这些培养平皿的上清液，然后贮存于4℃。
使Sf9细胞在补加了10％热失活的FBS的Grace’s培养基中生长。以感染复数(MOI)2用重组杆状病毒V-KGF-2感染所述细胞。6小时后，除去培养基，并换成SF900II培养基减甲硫氨酸和半胱氨酸(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg)。42小时后，加入5μCi 35S甲硫氨酸和5μCi 35S半胱氨酸(Amersham)。再培养细胞16小时，然后离心收集细胞并通过SDS-PAGE和放射自显影肉眼观察被标记上的蛋白质。
                           实施例4
大部分用于在哺乳动物细胞中瞬时表达KGF-2蛋白质基因序列的载体都应携有SV40复制原点。这样在表达T抗原的细胞(例如COS细胞)中可以复制很多拷贝的载体，所述T抗原是启动病毒DNA合成所需的。也可将任何其它哺乳动物细胞系用于该目的。
典型的哺乳动物表达载体含有介导mRNA转录起始的启动子，蛋白质编码序列和终止转录所需的信号，以及转录本聚腺苷酸化所需的信号。其它元件包括增强子，Kozak序列，和侧翼是用于RNA剪接的供体和受体位点的间插序列。用SV40的早期和晚期启动子，逆转录病毒(例如RSV，HTLVI，HIVI)的长末端重复序列(LTR)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子可达到高效转录。然而，也可以使用细胞信号(例如人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的适宜的表达载体包括例如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，pRSVcat(ATCC 37152)，pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela细胞，283细胞，H9细胞和Jurkart细胞，小鼠NIH3T3细胞和C127细胞，Cos1细胞，Cos7细胞和CV1细胞，非洲绿猴细胞，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢细胞。
或者，可在稳定的细胞系中表达该基因，所述细胞系含有整合到染色体中的该基因。与选择性标记如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素基因共转染可鉴定并分离出被转染的细胞。
还可扩增被转染的基因以表达大量的编码蛋白。DHFR(二氢叶酸还原酶)是一种有用的标记，可用来培育携带数百甚至数千拷贝之所需基因的细胞系。另一个有用的选择性标记是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等，生物化学杂志，227：277-279(1991)；Bebbington等，生物/技术，10：169-175(1992))。利用这些标记，可以使哺乳动物细胞在选择性培养基中生长并筛选出有最大抗性的细胞。这些细胞系含有整合至染色体中的扩增的基因。经常利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来生产蛋白质。
表达载体pC1和pC4含有劳氏肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，分子和细胞生物学，438-447(1985年3月))和CMV增强子片段(Boshart等，细胞，41：521-530(1985))。多克隆位点，例如限制酶切割位点BamHI，XbaI和Asp718有利于所需基因的克隆。所述载体还含有大鼠前胰岛素原基因的3’内含子及聚腺苷酸化和终止信号。A.在COS细胞中表达重组KGF-2
表达质粒KGF-2 HA衍生于载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，该载体中含有：1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)接有多接头区的CMV启动子，SV40内含子和聚腺苷酸化位点。HA标记对应于前述衍生于流感病毒血凝素蛋白的一个表位(Wilson，I.等，细胞，37：767(1984))。HA标记融合于靶蛋白上，使得用识别HA表位的抗体很容易检测该重组蛋白。编码整个KGF-2前体HA标记的DNA片段与HA标记读框一致地融合，因此该重组蛋白质的表达是在CMV启动子的指导下。
将质粒构建策略描述于下：
用下列两个引物通过PCR构建编码KGF-2的DNA序列ATCC#75977：5’引物5’TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC3’(SEQ ID NO：9)含有BamHI位点，后接有从起始密码子开始的KGF-2编码序列的22个核苷酸；3’序列5’TAAGCACTCGAGTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG3’(SEQ ID NO：10)含有与XhoI位点互补的序列，HA标记和KGF-2编码序列的最后26个核苷酸(不包括终止密码子)。因此，该PCR产物含有BamHI位点，KGF-2编码序列并接有一个XhoI位点，一个符合读框地融合的HA标记，与HA标记相接的翻译终止密码子。将PCR扩增的DNA片段和载体pcDNA-3’HA用BamHI和XhoI限制酶消化并连接，得到pcDNA-3’HA-KGF-2。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株XL1Blue(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)中，将转化培养物铺在氨苄青霉素培养基平板上并筛选抗性菌落。从转化体中分离出质粒DNA，通过PCR和限制分析以检测是否存在正确的片段。为了表达重组KGF-2，通过DEAE-DEXTRAN方法(Sambrook，J.，等，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社(1989))，用所述表达载体转染COS细胞。通过放射性标记和免疫沉淀法(Harlow，E.& Lane，D.，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社(1988))检测KGF-2 HA蛋白质的表达。转染2天后，将细胞用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基，并用去污剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5))(Wilson，I.等，出处同前，37：767(1984))裂解细胞。细胞裂解产物和培养基均用HA特异性单克隆抗体进行沉淀。将沉淀的蛋白质在15％SDS-PAGE凝胶上分析。B-利用CHO表达系统表达并纯化人KGF-2蛋白质
将载体pC1用于KGF-2蛋白质的表达。质粒pC1是质粒pSV2-dhfr[ATcc登记号37146]的衍生物。这两个质粒均含有在SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。用这些质粒转染的不具有二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢细胞或其它细胞可通过使细胞在补加了化疗剂氨甲喋呤的选择性培养基(α-MEM，Life Technologies)上生长来进行筛选。对在氨甲喋呤(MTX)抗性细胞中扩增DHFR基因已经有许多记载(参见例如Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，和Schimke，R.T.，1978，生物化学杂志，253：1357-1379，Hamlin，J.L.和Ma，C.1990，生物化学和生物物理学通报，1097：107-143，Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技术，9：64-68)。通过目标酶DHFR的过生产，在浓度不断增加的MTX中生长的细胞发展了对该药物的抗性，所述DHFR的过生产是DHFR基因扩增的结果。如果将第二种基因与DHFR基因相连，则该基因通常也会被共扩增和过表达。这是本领域用来培育含1000拷贝以上目标基因之细胞系的方式。随后，当除去氨甲喋呤后，细胞系含有整合至染色体中的扩增的基因。
为了表达所需基因，质粒pC1含有劳氏肉瘤病毒之长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen，等，分子和细胞生物学(Molecular and CellularBiology)，1985年3月号：438-4470)加上从人巨细胞病毒(CMV)之即早期基因的增强子中分离出的一个片段(Boshart等，细胞，41：521-530，1985)。所述启动子下游是下列可使基因进行整合的单一限制酶切割位点：BamHI，PvulI和Nrul。在这些克隆位点后，该质粒在所有三种阅读框架中含有翻译终止密码子，其后接有大鼠前胰岛素原基因的3’内含子和聚腺苷酸化位点。也可将其它高效启动予用于该表达，例如人β肌动蛋白启动子，SV40早期或晚期启动子或其它逆转录病毒例如HIV和HTLVI的长末端重复序列。对于mRNA的聚腺苷酸化，也可以使用例如来自人生长激素或球蛋白基因的其它信号。
在与选择性标记例如gpt，G418或潮霉素基因共转染后，也可以筛选携带整合至染色体中之基因的稳定细胞系。开始时最好使用一种以上的选择性标记，例如G418加氨甲喋呤。
将质粒pC1用限制酶BamHI消化，然后通过本领域已知的方法，用牛肠磷酸酶去磷酸化。再从1％琼脂糖凝胶中分离所述载体。
用下列PCR寡核苷酸引物扩增编码KGF-2的DNA序列ATCCNo.75977，所述寡核苷酸引物对应于该基因的5’和3’序列。5’引物含有序列5’TAACGA GGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC3’(SEQ ID NO：9)，其中含有BamHI位点(下划线)，后接有图1(SEQID NO：1)的KGF-2编码序列的21个碱基。如下所述，插入到一表达载体后，编码人KGF-2的扩增片段的5’末端提供了一有效的信号肽。如Kozak，M.(分子生物学杂志，196：947-950(1987))所述，用于真核细胞翻译起始的有效信号适当地插在所述构建体的载体部分。
3’引物含有序列5’TAAGCA GGATCCTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG 3’(SEQ ID NO：10)，该序列含有BamHI限制位点，后接有与图1(SEQ ID NO：1)所列KGF-2编码序列的最后26个核苷酸(不包括终止密码子)互补的核苷酸。
按上述从1％琼脂糖凝胶中分离扩增的片段，用内切核酸酶BamHI消化，然后再在1％琼脂糖凝胶上纯化。
将分离的片段和去磷酸化的载体用T4 DNA连接酶连接。然后转化大肠杆菌HB101细胞，鉴定含质粒pC1的细菌。通过DNA测序确定插入基因的序列和方向。CHO-DHFR细胞的转染
将缺乏活性DHFR酶的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。用脂转染法(Felgner等，出处同前)将5μg质粒C1与0.5μg质粒pSV-neo共转染。质粒pSV2-neo含有显性选择性标记neo基因，该基因来自Tn5，它编码一种酶，该酶可赋予对一组抗生素包括G418的抗性。将细胞接种在添加了1mg/ml G418的αminus MEM中。2天后，将细胞用胰蛋白酶消化并接种于杂交瘤克隆平板(Greiner，Germany)，然后培养10-14天。该期间后，将单个克隆用胰蛋白酶消化，然后接种于含不同浓度氨甲喋呤(25nM，50nM，100nM，200nM，400nM)的6孔培养皿中。将在最高浓度的氨甲喋呤中生长的克隆转移到含更高浓度氨甲喋呤(500nM，1μM，2μM，5μM)的新的6孔平板中。重复相同的过程，直到克隆在100μm的浓度中生长。
用Western印迹分析和SDS-PAGE分析所需基因产物的表达。
                        实施例5重组KGF-2的体外转录和翻译
PCR产物衍生于pA2载体中克隆的cDNA，该载体用于KGF-2的昆虫细胞表达。用于该PCR的引物是：5’ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGCCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3’(SEQID NO：11)和5’CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3’(SEQ ID NO：12)。
第一个引物含有ATG起始密码子5’侧的T3启动子的序列。第二个引物与KGF-2开放阅读框架的3’末端互补，并编码终止密码子的反向互补序列。
用市售的Qiagen试剂盒纯化所得PCR产物。将0.5μg的该DNA作为模板用于体外转录-翻译反应。用品名为TNT的Promega试剂盒完成该反应。利用放射性标记的甲硫氨酸为底物，按有关试剂盒的说明完成试验，不同的是，只按说明体积的1/2使用试剂，使反应在33℃进行1.5小时。
在10-15％变性聚丙烯酰胺凝胶上，电泳分离5μl反应物。将凝胶用比例为6∶3∶1的水∶甲醇∶乙酸混合物固定30分钟。然后在加热和真空下干燥凝胶，随后将凝胶对X射线胶片曝光16小时。该胶片显影结果表明存在与理论上翻译的KGF-2大小一致的放射性蛋白质带，这有力地说明克隆的KGF-2 cDNA含有编码具有预期大小之蛋白质的开放阅读框架。
                      实施例6经基因治疗进行表达
通过皮肤活组织解剖从一个受试者中得到成纤维细胞。将所得的组织放在组织培养基中并将其分成小片。将所述组织块放在组织培养瓶的湿表面，每个瓶中大约放10块。将瓶底部朝上，拧紧并在室温下放置过夜。在室温下24小时后，将培养瓶倒过来，组织块仍固定于烧瓶底部，加入新鲜培养基(例如Ham’s F12培养基，含10％FBS，青霉素和链霉素)。然后将其在37℃培养约1周。此时，加入新鲜培养基，然后每隔数天换液一次。再培养2周后，就出现成纤维细胞单层。将所述单层用胰蛋白酶消化并刮出放入较大的培养瓶中。
将两侧为莫洛尼鼠肉瘤病毒之长重复序列的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7：219-25(1988))用EcoRI和HindIII消化，随后用牛肠磷酸酶处理。将线性载体在琼脂糖凝胶上进行分离并用玻璃珠纯化。
用分别对应于5’和3’末端序列的PCR引物扩增编码本发明多肽的cDNA。5’引物含有EcoRI位点，3’引物还含有HindIII位点。存在T4DNA连接酶的条件下，将等量莫洛尼鼠肉瘤病毒线性骨架和该扩增的EcoRI和HindIII片段加到一起。将所得混合物保持于可使所述两片段进行连接的条件下。用连接混合物转化细菌HB101，然后将转化的HB101铺在含卡那霉素的琼脂上，以确定载体含有正确插入的所需基因。
在含10％牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco改进的Eagles培养基(DMEM)中，使兼性pA317或GP+aml2包装细胞在组织培养基中生长至铺满密度。然后将含所述基因的MSV载体加到该培养基中，用所述载体转导所述包装细胞。现在，包装细胞会产生含所述基因的感染性病毒颗粒(此时将所述包装细胞称为生产者细胞)。
将新鲜培养基加到转导的生产者细胞中，然后从铺满生产者细胞的10cm平板中收集培养基。将含感染性病毒颗粒的已消耗的培养基通过millopore滤纸过滤以除去脱附的生产者细胞，然后用该培养基感染成纤维细胞。从成纤维细胞的次铺满平板中除去培养基，迅速地换入来自生产者细胞的培养基。除去该培养基，换入新鲜培养基。如果病毒效价高，将会感染所有成纤维细胞，而且无需进行筛选。如果效价很低，则需使用具有选择性标记如 neo和 his的逆转录病毒载体。
然后，将加工过的成纤维细胞单独或已在cytodex3微载体玻珠生长至铺满后，注射到宿主中。现得到的成纤维细胞生产蛋白质产物。
                         实施例7在糖尿病小鼠模型中KGF-2刺激伤口愈合
为了证明角质形成细胞生长因子2(KGF-2)可加快伤口愈合过程，使用伤口愈合的遗传性糖尿病小鼠模型。db+/db+小鼠的全层皮(fullthickness)伤口愈合模型是一种被表征过的临床相关的可重现的伤口愈合受损的模型。糖尿病性伤口的愈合依赖于肉芽组织的形成和上皮再形成而不是收缩(Gartner，M.H.等，外科研究杂志，52：389(1992)；Greenhalgh，D.G.等，美国病理学杂志，136：1235(1990))。
糖尿病动物有许多II型糖尿病特征。与其正常的杂合(db+/+m)同窝幼畜相比，纯合(db+/db+)小鼠比较肥胖。突变体糖尿病小鼠(db+/db+)在染色体4上有一常染色体隐性突变(db+)(Coleman等，美国国家科学院院报，77：283-293(1982))。动物有贪食、烦渴和多尿症。突变体糖尿病小鼠(db+/db+)的血糖升高，胰岛素水平升高或正常，细胞介导的免疫受到抑制(Mandel等，免疫学杂志，120：1375(1978)；Debray-Sachs，M等，临床实验免疫学，51(1)：1-7(1983)；Leiter等，美国病理学杂志，114：46-55(1985))。在这些动物中还有外周性神经病、心肌并发症和微血管损伤、基膜增厚和肾小球过滤异常(Norido，F.等，实验神经学，83(2)：221-232(1984)；Robertson等，糖尿病，29(1)：60-67(1980)；Giacomelli等，实验室研究，40(4)：460-473(1979)；Coleman，D.L.，糖尿病，31(增刊)：1-6(1982))。这些纯合糖尿病小鼠发展成高血糖，即具有胰岛素抗性，这与人II型糖尿病类似(Mandel等，免疫学杂志，120：1375-1377(1978))。
在这些动物观察到的特征表明，该模型中的愈合可能与在人糖尿病中观察到的愈合相似(Greenhalgh等，美国病理学杂志，136：1235-1246(1990))。该研究结果表明，在糖尿病性和非糖尿病性杂合的同窝幼畜中，KGF-2对全层皮伤口的愈合有强刺激作用。在经KGF-2处理的动物中，可观察到对上皮再形成和胶原原纤维的增加以及真皮内的肉芽组织有显著的影响。外源施用生长因子可通过将炎性细胞吸入到伤口中而加快肉芽组织的形成。动物
在这项研究中使用遗传性的糖尿病雌性C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠和其非糖尿病(db+/+m)的杂合的同窝幼畜(Jackson实验室)。购买6周龄的动物，在开始研究时是8周龄。将动物单独安置并不限量地供应食物和水。所有操作均用无菌技术完成。按照人类基因组科学公司社会事业性动物饲养和利用委员会的规则和指南，以及实验室动物的饲养和使用指南完成试验。KGF-2
在pQE60-Cys37中过表达并将用于伤口愈合研究的重组人KGF-2纯化，pQE60-Cys37是一种大肠杆菌表达载体系统(pQE-9，Qiagen)。从该构建体表达的蛋白质是从37位半胱氨酸至208位丝氨酸的KGF-2，并在该蛋白质N末端带有6X(His)标记(SEQ ID NO：29-30)(图15)。将含有95％以上纯的重组物质的诸级分用于所述试验。用含100mM Tris，8.0和600mM NaCl的载体配制角质形成细胞生长因子2。终浓度为80μg/ml和8μg/ml储备液。用相同的载体从储备液制备稀释溶液。外科创伤
按以前报道的方法(Tsuboe，R.和Rifkin，D.B.，实验医学杂志，172：245-251(1990))产生伤口。简而言之，在受伤当天，通过腹膜内注射溶解于去离子水中的三溴乙醇(0.01mg/ml)，2，2，2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇而使动物麻醉。剃干净动物背部的毛，用70％乙醇溶液和碘清洗此块皮肤。在损伤前，用无菌纱布擦干外科手术区。然后用Keyes组织穿孔器产生8mm全层皮伤口。损伤后立即轻轻伸展周围的皮肤以避免伤口扩张。在试验过程中，伤口一直暴露于外。从损伤当天开始，进行连续5天的局部治疗。治疗前，用无菌盐水和纱布轻轻清洗伤口。
肉眼检查伤口，并在手术当天及手术后每隔2天从固定的距离位置拍照。通过在1-5天每天进行测量并在第8天也进行测量来确定伤口的闭合。用校正的Jameson测径器水平和垂直地测量伤口。如果肉眼再观察不到肉芽组织而且伤口被连续的上皮所覆盖，就可以认为伤口已经愈合了。
按KGF-2的两种不同剂量施用KGF-2，一种剂量是每一伤口每天施用50μl载体中的4μg KGF-2，持续8天，另一种剂量是每一伤口每天施用50μl载体中的40μg KGF-2，持续8天。对载体对照组施用50μl载体溶液。
在第8天，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(300mg/kg)对动物实行安乐死。然后收集伤口和伤口周围的皮肤用于组织学和免疫组织化学分析。将组织样品放在组织盒内组织活体解剖用海绵之间的10％中性缓冲的福尔马林中以便进一步加工。试验设计
对三组动物进行评估，每组10只动物(5只糖尿病动物，5只非糖尿病对照动物)：1)载体安慰剂对照，2)KGF-2 4μg/天，和3)KGF-2 40μg/天。按如下设计该研究：
N                组        治疗
N＝5 db+/db+     载体      50μlN＝5 db+/+m      载体      50μl
N＝5 db+/db+     KGF-2     4μg/50μlN＝5 db+/+m      KGF-2     4μg/50μl
N＝5 db+/db+     KGF-2     40μG/50μlN＝5 db+/+m      KGF-2     40μg/50μl
伤口面积和闭合的测量
通过在垂直和水平轴测量面积并得到伤口的总面积来分析伤口的闭合。然后通过确定最初的伤口面积(第0天)和治疗后的面积(第8天)之间的差异来评估收缩情况。在第1天的伤口面积是64mm2，相当于真皮孔的大小。用下列公式计算：[第8天的开口面积]-[第1天的开口面积]/[第1天的开口面积]组织学
将样品固定在10％缓冲的福尔马林中，将石蜡包埋的样品块以与伤口表面垂直的方向切开(5μm)，并用Reichert-Hung切片机切片。在一分为二的伤口的横断面切片上进行常规苏木精-曙红(H&E)染色。通过伤口的组织学检查来评估是否因KGF-2的治疗而改变了被修补皮肤的愈合过程和形态外观。所述评估包括确定是否存在细胞积累、炎性细胞、毛细管、成纤维细胞、上皮再形成和表皮成熟(Greenhalgh，D.G.等，美国病理学杂志，136：1235(1990))(表1)。由盲观测者使用校正的透镜测微计进行测量。免疫组织化学
上皮再形成
利用ABC Elite检测系统，用多克隆兔抗人角蛋白抗体，对组织切片进行免疫组织化学染色。用人皮肤作为阳性组织对照，而用非免疫IgG作为阴性对照。用校正的透镜测微计，通过评估伤口上皮再形成的程度来确定角质形成细胞的生长。
细胞增殖标记
利用ABC Elite检测系统，用抗PCNA抗体(1∶50)来证实皮肤样品中增殖细胞核抗原/细胞周期蛋白(PCNA)。人结肠癌作为阳性组织对照，用人脑组织作为阴性组织对照。每个样品都包括略去基本抗体、而代之以非免疫小鼠IgG的一张切片。这些切片的排列次序是基于增殖的程度，用0-8级表示，级别越低反映增殖较少，而级别越高反映增殖越强。统计分析
用非成对t检验分析试验数据。p值＜0.05即认为有显著性。将数据表示为平均值±SEM。结果
KGF-2对伤口闭合的影响
与杂合的正常小鼠相比，糖尿病小鼠显示出愈合受损。在糖尿病和非糖尿病动物中，每一位点4μg KGF-2的剂量可产生最大响应(图5，6)。与缓冲液对照组相比，这些结果有统计显著性(p＝0.002和p＜0.0001)。用KGF-2处理后，在剂量为4μg/天的组中，平均闭合为60.6％，在剂量为40μg/天的组中，平均闭合为34.5％。到第8天，缓冲液对照组动物的伤口仅有3.8％闭合。在损伤后第2-5天和第8天，从用KGF-2治疗的db+/db+小鼠的伤口得到的重复测量值表明，与缓冲液对照组相比，到损伤后第3天，总伤口面积(mm2)有显著改善。这种改善一直持续着，并且，在试验结束时可观察到统计学上显著的结果(图7)。在接受了KGF-2的db/+m组的动物中，与缓冲液对照组相比，重复测量也表明伤口面积有较大的减少(图8)。这些结果证实了在KGF-2处理的动物中，其伤口闭合率较大。
KGF-2对组织学评分的影响
在第8天，KGF-2在糖尿病(db+/db+)模型中的组织病理学评估结果表明，与缓冲液对照相比，伤口评分有统计学上显著的提高(p＜0.0001)。用4μg和40μg剂量的KGF-2观察到的药理学作用之间没有显著差异。缓冲液对照组具有最小的细胞积累，没有肉芽组织或上皮迁移，而4μg和40μg剂量的KGF-2(分别为p＜0.0001 &p＝0.06)出现上皮覆盖伤口，新血管形成，肉芽组织形成和成纤维细胞和胶原沉积(图9)。
用苏木精-曙红染色的样品完成皮肤伤口的组织病理学评估。记分标准有1-12级，1分表示细胞积累最小并很少或几乎没有肉芽形成，12分表示有丰富的成纤维细胞出现，大量胶原沉积并有大量覆盖伤口的新上皮(表1)。
表1
组织学切片评分
分数 标准
1-3 没有至最小细胞积累。没有肉芽组织或上皮迁移
4-6 薄的不成熟的肉芽，即炎性细胞占优势，但有很少的成纤维细胞、毛细管或胶原沉积。上皮迁移最少。
7-9 中等程度厚的肉芽组织，从炎性细胞占优势至有更多的成纤维细胞和胶原沉积。大量的新血管形成。上皮从最小至中等程度的迁移。
10-12 成纤维细胞占优势的厚的血管肉芽组织，大量胶原沉积。上皮部分覆盖至完全覆盖伤口。
在施用这两种剂量的KGF-2后，评估非糖尿病同窝幼畜，表明与缓冲液对照组相比，评估的所有测量值均没有显著活性(图10)。缓冲液对照组显示出不成熟的肉芽组织，炎性细胞和毛细管。其平均值高于糖尿病组，表明在糖尿病(db+/db+)小鼠中愈合受损。
KGF-2对上皮再形成的影响
用细胞角蛋白免疫染色确定上皮再形成的程度。评分以闭合程度为基础，分为0(无闭合)至8(完全闭合)级。在接受了4μg/天剂量的组中，与缓冲液对照组相比，上皮再形成的分数有统计学上显著的提高，p＜0.001(图11)。在该组中，观察到角质形成形成细胞位于新形成的覆盖伤口的表皮内。在不同阶段，两种剂量的KGF-2都有有丝分裂外观。在所述两种KGF-2剂量，评估非糖尿病组也有显著提高的上皮再形成级别(分别为p＝0.006和0.01)(图12)。
KGF-2对细胞增殖的影响
增殖细胞核抗原免疫染色说明，在4μg和40μg组内均有显著增殖(图13)。非糖尿病组接受两种剂量KGF-2有相似的结果，与缓冲液对照组相比，这两个组均有明显较高的分数(图14)。特别是在表皮的基层观察到表皮增殖。另外，在真皮，特别是在毛囊中观察到高密度的PCNA-标记的细胞。结论
这些结果表明KGF-2特异性地刺激初级表皮角质形成细胞的生长。另外，这些试验表明，在糖尿病小鼠中，局部施用的重组人KGF-2显著加快了全层皮切割的真皮伤口的愈合速度。组织学评估表明KGF-2可诱导角质形成细胞增殖，同时诱导表皮增厚。根据增殖细胞核抗原(PCNA)显示，所述增殖位于上皮的基层。在真皮水平，胶原沉积、成纤维细胞增殖和新血管形成重建了皮肤的正常结构。
与有较少PCNA标记之细胞的缓冲液组相比，KGF-2处理之动物上的PCNA标记细胞密度较高，说明了对真皮-表皮水平的角质形成细胞、成纤维细胞和毛囊的刺激作用。因KGF-2导致的愈合过程的增强与该试验所观察到的一致。对应所评估的参数(上皮再形成和伤口闭合百分比)，这一效果是统计学上显著的。重要的是，主要在表皮较内层的基层中观察到PCNA标记的角质形成细胞。真皮表现为含成纤维细胞、胶原和肉芽组织的正常化组织。
以每天的测量值为基础，在非糖尿病动物中观察到的活性表明KGF-2对第8天以及试验过程中的伤口闭合百分比产生显著的药理学反应。尽管与缓冲液对照相比，组织病理学评估没有显著差异，但角质形成细胞生长和PCNA分数表明有显著影响。
总之，这些结果说明，在使用db+/db+小鼠的损伤和正常切割伤口模型中，KGF-2均有显著活性，因此，可将KGF-2用于治疗伤口，包括外科手术伤口、糖尿病溃疡、静脉停滞性溃疡、灼伤和其它皮肤疾病。
                         实施例8在类固醇损伤的大鼠模型中KGF-2介导的伤口愈合
在各种体外和体内系统中类固醇对伤口愈合的抑制作用已有许多记载(Wahl，S.M.糖皮质激素和伤口愈合。《抗炎类固醇作用：基础和临床应用》，280-302(1989)；Wahl，S.M.等，免疫学杂志，115：476-481(1975)；Werb，Z.等，实验医学杂志，147：1684-1694(1978))。糖皮质激素通过下列途径来抑制伤口愈合：抑制血管生成，降低血管通透性(Ebert，R.H.等，An.Intern.Med.37：701-705(1952))，减少成纤维细胞增殖和胶原合成(Beck，L.S.等，生长因子，5：295-304(1991)；Haynes，B.F.等，临床研究杂志，61：703-797(1978))并可使循环中的单核细胞暂时减少(Haynes，B.F.等，临床研究杂志，61：703-797(1978)；Wahl，S.M.，糖皮质激素和伤口愈合。《抗炎类固醇作用：基础和临床应用》，学术出版社，纽约，280-302(1989))。全身性施用类固醇以阻碍伤口愈合是大鼠中很常见的现象(Beck，L.S.等，生长因子，5：295-304(1991)；Haynes，B.F.等，临床研究杂志，61：703-797(1978)；Wahl，S.M.，糖皮质激素和伤口愈合《抗炎类固醇作用：基础和临床应用》，学术出版社，纽约，280-302(1989)；Pierce，G.F.等，美国国家科学院院报，86：2229-2233(1989))。
为了说明KGF-2可加快愈合过程，对向大鼠全层皮切割的皮肤伤口多次局部施用KGF-2的效果进行评估，在所述大鼠中，已通过全身性施用甲基氢化泼尼松损害了愈合。体外研究已表明KGF-2特异性地刺激初级人表皮角质形成细胞的生长。本实施例通过用校正的Jameson测径器测量伤口缺口并通过组织形态测量法(histomorphometry)和免疫组织化学法，说明了局部施用重组人KGF-2可加快大鼠全层皮切割皮肤伤口的愈合速度。组织学评估表明KGF-2能加快上皮再形成，并由此加快伤口修复。动物
在本实施例中使用重量为250-300克的年青成年雄性SpragueDawley大鼠(Charles River Laboratories)。购买8周龄动物，在研究开始时，动物为9周龄。在损伤时，通过全身性施用甲基氢化泼尼松(17mg/kg/大鼠，肌肉内注射)来损害大鼠的愈合反应。将动物单独安置并不受限制地供给食物和水。用无菌技术完成所有操作。按照人基因组科学公司社会事业性动物饲养和利用委员会的规则和指南以及实验室动物的饲养和使用指南完成试验。KGF-2
在pQE60-Cys37中过表达并纯化重组人KGF-2，pQE60-Cys37是一种大肠杆菌表达载体系统(pQE-9，Qiagen)。从该构建体表达的蛋白质是从37位半胱氨酸至208位丝氨酸的KGF-2，并在该蛋白质的N末端带有6X(His)标记(图15)(SEQ ID NO：29-30)。将含有95％以上纯的重组物质的诸级分用于所述试验。用含有1X PBS的载体配制KGF-2。终浓度为20μg/ml和80μg/ml储备液。用相同的载体从储备液制备稀释溶液。
在大肠杆菌表达载体系统中过表达并纯化KGF-2Δ28。将含有95％以上纯的重组物质的诸级分用于所述试验。用含有1X PBS的载体配制KGF-2。终浓度为20μg/ml和80μg/ml储备液。用相同的载体从储备液制备稀释溶液。外科损伤
按上述实施例7的方法产生伤口。在损伤那天，通过肌肉内注射氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)而使动物麻醉。剃干净动物的背部，用70％乙醇和碘溶液清洗皮肤。在损伤前，用无菌纱布擦干外科手术区。利用Keyes组织穿孔器产生一个8mm的全层皮伤口。在试验过程中，伤口一直暴露于外。从损伤当天开始，连续7天每天局部施用试验物质一次，随后施用甲基氢化泼尼松。处理前，用无菌盐水和纱布轻轻清洗伤口。
肉眼检查伤口，并在损伤当天及治疗结束时隔一段固定的距离拍照。通过在1-5天每天进行测量并在第8天也进行测量来确定伤口的闭合，以进行作图。用校正的Jameson测距器水平和垂直地测量伤口。如果肉眼再观察不到肉芽组织，而且连续的上皮覆盖了伤口，就可以认为伤口已经愈合了。
用两种不同剂量的KGF-2完成剂量反应，一种剂量为每伤口每天施用50μl载体中的1μg KGF-2，第二种剂量为每伤口每天施用50μl载体中的4μg KGF-2，均持续5天。载体对照组接受50μl 1X PBS。
在第8天，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(300mg/kg)对动物实行安乐死。然后收集伤口和伤口周围的皮肤用于组织学分析。将组织样品放在组织盒内组织活体解剖用海绵之间的10％中性缓冲的福尔马林中以便进一步加工。试验设计
对四组动物进行评估，每组10只动物(5只用甲基氢化泼尼松，5只不用糖皮质激素)：1)未处理对照，2)载体安慰剂对照，3)KGF-2 1μg/天，4)KGF-2 4μg/天。按如下设计该研究：
  N                       组                  治疗
  ·用糖皮质激素处理
  N＝5                    未处理              -
  N＝5                    载体                50μl
  N＝5                    KGF-2(1μg)         50μl
  N＝5                    KGF-2(4μg)         50μl
  ·未用糖皮质激素处理
  N＝5                    未处理              -
  N＝5                    载体                50μl
  N＝5                    KGF-2(1μg)         50μl
  N＝5                    KGF-2(4μg)         50μl伤口面积和闭合的测量
通过在垂直和水平轴测量面积并得到伤口的总面积来分析伤口的闭合。然后通过确定最初的伤口面积(第0天)和治疗后的面积(第8天)之间的差异来评估收缩情况。在第1天的伤口面积是64mm2，相当于真皮孔的大小。用下列公式计算：[第8天的开口面积]-[第1天的开口面积]/[第1天的开口面积]组织学
将样品固定在10％缓冲的福尔马林中，将石蜡包埋的样品块以与伤口表面垂直的方向切开(5μm)，并用Olympus切片机切片。在一分为二的伤口的横断面切片上进行常规苏木精-曙红(H&E)染色。通过伤口的组织学检查使我们可以评估是否因KGF-2的治疗而改变了被修补皮肤的愈合过程和形态外观。由盲观测者使用校正的透镜测微计来测定伤口缺口的距离。统计分析
用非成对t检验分析试验数据。p值＜0.05视为有显著性。将数据表示为平均值±SEM。结果
将用和不同甲基氢化泼尼松的未处理对照组的伤口闭合情况进行比较的结果表明，与正常大鼠相比，在损伤后第8天，经甲基氢化泼尼松处理的大鼠的伤口愈合明显受损。在注射甲基氢化泼尼松的组中，总伤口面积为58.4mm2，而在未接受糖皮质激素的组中为22.4mm2(图16)。
KGF-2对伤口闭合的影响
在损伤时向大鼠全身性施用甲基氢化泼尼松延缓了正常大鼠的伤口闭合(p＝0.002)。在第8天试验结束时，甲基氢化泼尼松损害组的伤口闭合测量值表明，与未处理组相比，用KGF-2时伤口闭合在统计学上显著加快(1μg p＝0.002&4μg p＝0.005)(图16)。在接受1μg KGF-2的组中伤口闭合百分比为60.2％(p＝0.002)，在接受4μg KGF-2的组中伤口闭合百分比为73％(p＝0.0008)。与之相比，未处理组的伤口闭合百分比为12.5％，载体对照组的为28.6％(图17)。
从第1天至第8天，糖皮质激素组中的伤口闭合长度分析表明，在处理组中，用这两种KGF-2剂量时，从损伤后的第3天至第8天，伤口大小均有显著减小(图18)。
这些结果表明，与未处理组相比，用4μg KGF-2处理的组显著(p＝0.05)加快了伤口闭合(图19A)。尽管在正常动物中很难评估蛋白质或其它化合物加快伤口愈合的能力(由于恢复很快)，但是已显示在该模型中KGF-2可加快伤口愈合。用KGF-2处理过的伤口的组织病理学评估
伤口缺口的组织形态测量学表明KGF-2处理组的伤口距离减小。未处理组的伤口缺口为5336μ，而用1μg KGF-2处理过的组的伤口缺口减小至2972μ；用4μg KGF-2(p＝0.04)处理组的伤口缺口减小至3086μ(图20)。KGF-2Δ28在伤口愈合中的作用
在甲基氢化泼尼松损害的大鼠模型中，评估KGF-2Δ28和PDGF-BB在伤口愈合中的作用。该试验按照与上述有关KGF-2蛋白质相同的方法完成，不同之处在于KGF-2Δ28蛋白质未被His标记，并且在第2，4，6，8和10天测量伤口愈合。用于蛋白质的缓冲液载体均为40mM NaOAc和150mM NaCl，pH6.5，但不用于全长KGF-2的“E2”制剂。用于“E2”KGF-2制剂的缓冲液载体为20mM NaOAc和400mM NaCl，pH6.4。
图19B中的结果表明，与未处理组相比，KGF-2Δ28在统计学上显著地加快伤口闭合，并可逆转甲基氢化泼尼松对伤口愈合的影响。结论
本实施例说明KGF-2可逆转甲基氢化泼尼松对伤口愈合的影响。外源性地施用生长因子通过将炎性细胞吸引至伤口而加速肉芽组织形成。以每天测量值为基础，在未接受甲基氢化泼尼松的动物中也观察到相似的活性，表明KGF-2对第5天的伤口闭合百分比有显著的药理学反应。对于测量KGF-2和其它化合物对伤口愈合面积影响的效力来说，大鼠的糖皮质激素损害的伤口愈合模型是一个适宜的和可重现的模型。
总之，这些结果表明在糖皮质激素损伤的和正常切割的伤口模型中，KGF-2均有显著活性。因此，可将KGF-2临床上用于刺激伤口愈合，所述伤口包括外科手术伤口、糖尿病溃疡、静脉停滞溃疡，灼伤和其它异常伤口愈合疾病如尿毒症，营养不良，维生素缺乏和用类固醇和抗肿瘤药物所进行的全身性治疗。
                      实施例9KGF-2 mRNA表达的组织分布
用Sambrook等所述的方法(上文所述)，完成Northern印迹分析以检测人组织中编码KGF-2蛋白质之基因的表达水平。通过PCR得到对应于本发明KGF-2完整开放阅读框架(SEQ ID NO：1)的探针，将所述探针用rediprimeTMDNA标记系统(Amersham Life Science)按照生产商的说明用32P标记。标记后，按照生产商方法号PT1200-1，用CHROMASPIN-100TM柱(Clontech Laboratories Inc.)纯化探针。然后用纯化过的标记探针检测各种人组织，分析编码KGF-2的基因的表达情况。
从Clontech得到多组织Northern(MTN)印迹，所述诸印迹含有来自各种人组织(H)的polyA RNA或人免疫系统组织(IM)的polyA RNA，按照生产商方法号PT1190-1，用ExpressHybTM杂交溶液(Clontech)通过标记的探针检测诸印迹。杂交并洗涤后，将印迹固定并在-70℃对胶片曝光过夜，按照标准方法对胶片显影。
在大部分人组织中，均可观察到一种约4.2kb的主要mRNA类型。KGF-2 mRNA在心、胰、胎盘和卵巢中相对丰富。约5.2kb的少量mRNA类型也普遍存在。此5.2kb mRNA的“身分”不清楚。有可能5.2kb转录本编码KGF-2的另一种剪接形式或KGF家族的第三个成员。KGF-2cDNA是4.1kb，与4.2kb mRNA的大小一致。
                      实施例10角质形成细胞增殖试验
真皮角质形成细胞是皮肤表皮中的细胞。皮肤中角质形成细胞的生长和扩展是伤口愈合中的一个重要过程。因此，角质形成细胞增殖试验是刺激角质形成细胞生长以及伤口愈合的蛋白质活性的一项重要指标。
但是，角质形成细胞很难在体外生长。仅有极少量的角质形成细胞系。这些细胞系有不同的细胞和遗传缺陷。为了避免因细胞缺陷如关键生长因子受体的丢失或生长依赖于关键生长因子而给该试验带来的复杂化，因而选择初级真皮角质形成细胞完成该试验。这些初级角质形成细胞是从Clonetics，Inc.(San Diego，CA)得到的。使用alamarBlue的角质形成细胞增殖试验
alamarBlue是一种活性蓝色染料，当加到培养基中时，由线粒体代谢。然后该染料在组织培养上清液中变成红色。通过570nm与600nm之间的光密度读数差就可直接定量确定红色染料的量。该读数反应了细胞活性和细胞数量。
从Clonetics，Inc.购买正常的初级真皮角质形成细胞(CC-0255，NHEK-Neo群的)。这些细胞是第2代细胞。角质形成细胞在完全的角质形成细胞生长培养基(CC-3001，KGM；Clonetics，Inc.)中生长至达到80％铺满。按照生产商的说明，用胰蛋白酶消化细胞。简而言之，将细胞用Hank’s平衡的盐溶液洗涤两次。将2-3ml胰蛋白酶加至细胞中，在室温消化约3-5分钟。加入胰蛋白酶中和溶液并收集细胞。在室温将细胞以600×g离心5分钟，然后使用预热的培养基，以3000个细胞/cm2的密度将其铺在新培养瓶中。
为了进行增殖分析，除最外行外，以1000-2000个角质形成细胞/孔将细胞铺在Corning平底96孔平板的完全培养基中。向外侧孔中加入200μl无菌水。这样有助于使孔的温度湿度的波动达到最小。在37℃，在5％CO2中使细胞生长过夜。用角质形成细胞基础培养基(CC-3101，KBM，Clonetics，Inc.)将细胞洗涤两次，然后向各孔中加入100μl KBM。培养24小时。用KBM连续稀释生长因子并向各孔加入100μl。用KGM作为阳性对照，用KBM作为阴性对照。每个浓度点使用6个孔。培养2-3天。在培养结束时，用KBM将细胞洗涤一次，加入100μl在培养基中预先混有10％v/v alamarBlue的KBM。培养6-16小时直到KGM阳性对照的培养基颜色开始变红。将平板直接放在平板读数仪下，测量O.D.570nm减去O.D.600nm的值。结果KGF-2对角质形成细胞增殖的刺激作用
为了证实KGF-2(即如上述实施例7和8所述，从氨基酸Cys37开始的KGF-2)和N-末端缺失突变体KGF-2Δ33和KGF-2Δ28对于刺激表皮角质形成细胞生长是有活性的，将正常的人初级表皮角质形成细胞与大肠杆菌中表达并纯化的KGF-2蛋白质(批号E3)(SEQ ID NO：2)，KGF-2Δ33(批号E1)和KGF-2Δ28(批号E2)一起保温。KGF-2蛋白刺激表皮角质形成细胞的生长，EC50为约5ng/ml，与FGF7/KGF-1的相同(图21A)。相比之下，其它FGF，如FGF-1和FGF-2不能刺激初级角质形成细胞的生长。KGF-2Δ33的EC50为0.2ng/ml，KGF-2Δ28的EC50为2ng/ml(见图21B和C)。因此，在刺激初级表皮角质形成细胞的增殖方面，KGF-2似乎与FGF7/KGF一样有效。但是，在刺激角质形成细胞增殖方面，KGF-2Δ33比上述实施例7和8所述的“Cys(37)”KGF-2和KGF-2Δ28更有效。
伤口组织的结疤涉及真皮成纤维细胞的过度增殖。为确定KGF-2的刺激作用是否对角质形成细胞而不是成纤维细胞特异，对小鼠Balb.c.3T3成纤维细胞和人肺成纤维细胞进行检测。在增殖试验中，这两种成纤维细胞对KGF-2都没有反应。因此，KGF-2看起来是表皮角质形成细胞特异性的促分裂原，而不是间充质细胞如成纤维细胞的促分裂原。这表明KGF-2引起伤口组织结疤的可能性很小。
                         实施例11A.KGF-2对用特异性FGF受体转染之细胞的促有丝分裂作用
为了确定哪种FGF受体同工型介导KGF-2的增殖作用，按照Santos-Ocampo等，生物化学杂志，271：1726-1731(1996))中所述的方法，检测KGF-2对表达特异性FGF受体同工型之细胞的影响。已知FGF7/KGF通过与FGFR2iiib形式结合并特异性地激活FGFR2iiib形式而诱导上皮细胞的有丝分裂(Miki等，科学，251：72-75(1991))。因此，用表达下列FGF受体同工型之一的细胞检测KGF-2在有丝分裂试验中的增殖作用：FGFR1iiib、FGFR2iiib、FGFR3iiib和FGFR4。表达FGF受体之细胞的有丝分裂试验
按Santos-Ocampo等，生物化学杂志，271：1726-1731(1996))中所述的方法，将胸苷掺入表达特异性FGF受体的BaF3细胞中。简而言之，洗涤表达特异性FGF受体的BaF3细胞并重悬在Dubeco改进的Eagle培养基，10％新生牛血清，L-谷胺酰胺中。在96孔试验平板的培养基中，每孔铺约22500个细胞，所述培养基含有2μg/ml肝素。将检测试剂加到各孔中，使每孔的体积达到200μl。在37℃将细胞培养2天。向各孔中加入50μl体积中的1μCi 3H-胸苷。4-5小时后，通过玻璃纤维滤纸过滤收集细胞。用Wallacβ平板闪烁计数器对掺入的3H-胸苷计数。结果
如通过3H-胸苷掺入所说明的(图22A)，这些结果表明KGF-2蛋白质(添加了N末端Met的图1所示的Thr(36)-Ser(208)(SEQ ID NO：2))可强烈刺激表达KGF受体FGFR2iiib同工型之Baf3细胞的增殖。令人感兴趣的是，KGF-2对表达FGFR1iiib同工型之Baf3细胞的增殖只有轻微的刺激作用。KGF-2对表达受体的FGFR3iiib或FGFR形式的细胞没有任何作用。
FGF7/KGF刺激表达KGF受体FGFR2iiib同工型之细胞的增殖，但不刺激表达FGFR1iiib同工型的细胞的增殖。KGF-2与FGF7/KGF之间的差异是非常有趣的。在对照试验中，aFGF刺激其受体FGFR1iiib和iiic，而bFGF刺激其受体FGFR2iiic。因此，这些结果表明KGF-2与FGFR2iiib同工型结合并刺激有丝分裂。与FGF7/KGF相比，KGF-2也与FGFR1iiib同工型结合并刺激有丝分裂。B.KGF-2Δ33对用特异性FGF受体转染之细胞的促有丝分裂作用
如上所证实，FGF或KGF-1和-2均与FGF2iiib受体(FGFR2 iiib)结合并将其激活。用表达下列FGF受体同工型之一的细胞检测KGF-2Δ33在有丝分裂试验中的增殖作用：FGFR2iiib或FGFR2iiic(2iiic受体转染的细胞作为阴性对照)。
按照本实施例上述部分A完成试验。简而言之，在RPMI中培养BaF3细胞，该RPMI含有10％牛血清(BCS-不是胎牛血清)，10％来自WEHI3细胞(在含5％BCS的RPMI中生长)培养物的条件培养基，50nMβ-巯基乙醇，L-Glu(100X储备液的2％)和青霉素/链霉素(100X储备液的1％)。
为了进行试验，用含10％BCS和1μg/ml肝素的RPMI培养基将BaF3细胞润洗两次。将BaF3细胞(22000个细胞/孔)铺在96孔平板的150μlRPMI培养基中，该RPMI培养基含有10％BCS和1μg/ml肝素。以从约0至10nM的浓度，加入酸性FGF、碱性FGF、KGF-1(HG15400)或KGF-2蛋白质(HG03400，03401，03410或03411)。在37℃，将细胞在200μl的终体积中培养48小时。所有试验均以一式三份完成。将氚标记的胸苷(0.5μCi)加至各孔中，并在37℃保温4小时，然后通过玻璃纤维滤纸过滤收集细胞。用液体闪烁计数确定掺入的放射性总量。使用下列阳性对照：FGFR2iiic细胞使用碱性FGF和酸性FGF；FGFR2iiib细胞使用酸性FGF和KGF-1。使用下列阴性对照：基础培养基(含有10％BCS和1μg/ml肝素的RPMI)。结果
如用3H-胸苷掺入所说明的(图22A-C)，这些结果表明KGF-2(N末端加有Met的Thr(36)-Ser(208))，KGF-2Δ33和KGF-2Δ28蛋白质可强烈刺激表达KGF-2受体FGFR2iiib同工型的BaF3细胞的增殖。KGF-2蛋白质对表达该受体的FGFR2iiic形式的细胞没有任何作用。这些结果表明KGF-2蛋白质与FGFR2iiib同工型结合并刺激有丝分裂。另外，似乎KGF-2Δ33也能够比KGF-2(Thr(36)-Ser(208))更好地刺激BaF3细胞的增殖。
                          实施例12A.构建大肠杆菌优化的全长KGF-2
为了提高全长KGF-2在大肠杆菌表达系统中的表达水平，将该基因的氨基末端部分的密码子优化成最常用的大肠杆菌密码子。为了合成最佳的KGF-2区，合成6种寡核苷酸：1-6号(序列如下所示)。在下列条件下，将这些重叠寡核苷酸用于7轮PCR反应：变性               95℃               20秒退火               58℃               20秒延伸               72℃               60秒
用与上述相同的条件，用第一个PCR反应物1μl，KGF-2的合成引物6作为3’引物，KGF-2合成的5’BamHI作为5’引物，经25个循环完成第二个PCR反应。将由最终反应产生的产物用AvaII和BamHI消化。将实施例1的KGF-2构建体用AvaII和HindIII消化，并分离片段。将这两个片段在一个三片段连接中克隆至已用BamHI和HindIII消化的pQE-9中。
用于构建优化的合成KGF-2 1/208的引物如下：KGF-2的合成引物1：ATGTGGAAATGGATACTGACCCACTGCGCTTCTGCTTTCCCGCACCTGCCGGGTTGCTGCTGCTGCTGCTTCCTGCTGCTGTTC(SEQ ID NO：31)KGF-2的合成引物2：CCGGAGAAACCATGTCCTGACCCAGAGCCTGGCAGGTAACCGGAACAGAAGAAACCAGGAACAGCAGCAGGAAGCAGCAGCA(SEQ ID NO：32)KGF-2的合成引物3：GGGTCAGGACATGGTTTCTCCGGAAGCTACCAACTCTTCTTCTTCTTCTTTCTCTTCTCCGTCTTCTGCTGGTCGTCACG(SEQ ID NO：33)KGF-2的合成引物4：GGTGAAAGAGAACAGTTTACGCCAACGAACGTCACCCTGCAGGTGGTTGTAAGAACGAACGTGACGACCAGCAGAAGACGG   (SEQ IDNO：34)KGF-2的合成引物5：CGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAA(SEQ ID NO：35)KGF-2的合成引物6：TTTGGTCCCAGAAACTTTACCGTTTTTTTCGATTTTCAG   (SEQ IDNO：36)KGF-2的合成5’BamHI：AAAGGATCCATGTGGAAATGGATACTGACCCACTGC(SEQ ID NO：37)在图23中列出了所得的克隆(SEQ ID NO：38和39)。B.构建大肠杆菌优化的成熟KGF-2
为了进一步提高KGF-2成熟形式在大肠杆菌表达系统中的表达水平，将该基因氨基末端部分的密码子优化成最常用的大肠杆菌密码子。与KGF-2的成熟形式相对应，构建从苏氨酸36开始的KGF-2的截短形式。将实施例12A的大肠杆菌合成KGF-2作为PCR反应的模板，所述PCR反应用BspHI 5’KGF-2作为5’引物(下文给出的序列)，用HindIII3’KGF-2作为3’引物(下文给出序列)。用在实施例12A中的标准条件进行25个循环完成扩增。将所得产物用BspHI和HindIII消化，然后克隆至已用NcoI和HindIII消化的大肠杆菌表达载体pQE60中。BspHI 5’KGF-2引物：TTTCATGACTTGTCAAGCTCTGGGTCAAGATATGGTTC(SEQ ID NO：40)HindIII3’KGF-2引物：GCCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCC(SEQ ID NO：41)
在图24A中列出了所得的克隆(SEQ ID NO：42和43)。C.构建另一大肠杆菌优化的成熟KGF-2
为了进一步提高KGF-2成熟形式在大肠杆菌表达系统中的表达水平，将所述大肠杆菌优化基因之氨基末端部分53个氨基酸的密码子变成其它常用的大肠杆菌密码子。为了合成优化的KGF-2区，合成6个寡核苷酸：编号为18062，18061，18058，18064，18059和18063(下文给出序列)。在下列条件下，将这些重叠寡核苷酸用于7轮PCR反应：变性               95℃               20秒退火               58℃               20秒延伸               72℃                  60秒
完成7轮合成后，将该区的5’引物18169和该整个区的3’引物18060加到PCR反应中，所述PCR反应含1μl来自所述6个寡核苷酸的初始反应物。用下列条件，将该产物扩增30轮：变性               95℃                  20秒退火               55℃                  20秒延伸               72℃                  60秒
在与上述相同的条件下，用引物18066和18065开始第二个PCR反应以扩增该基因的3’区25轮。在琼脂糖凝胶上分离所得的产物。将含该产物的凝胶块用10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5稀释。利用每一稀释过的凝胶块各1μl再进行另一个PCR反应，其中使用引物18169作为5’引物，引物18065作为3’引物。用与上述相同的条件将产物扩增25轮。将最后这次反应产生的产物用EcoRI和HindIII限制性切割，然后克隆至也用EcoRI和HindIII切割的pQE60中(现在为pQE6)。5’合成引物的序列：18169 KGF2 5′EcoRI/RBS：TCAGTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAATCATGACTTGCCAGG[SEQ ID NO：44]18062 KGF2 synth新R1有义：TCATGACTTGCCAGGCACTGGGTCAAGACATGGTTTCCCCGGAAGCTA[SEQ ID NO：45]18061 KGF2 synth R2有义：GCTTCAGCAGCCCATCTAGCGCAGGTCGTCACGTTCGCTCTTACAACC[SEQ ID NO：46]18058 KGF2 Synth R3有义：GTTCGTTGGCGCAAACTGTTCAGCTTTACCAAGTACTTCCTGAAAATC[SEQ ID NO：47]
18066 KGF 2 20 bp Ava II有义：
TCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGAC[SEQ ID NO：48]
18064 KGF2 synth F1反义：
GATGGGCTGCTGAAGCTAGAGCTGGAGCTGTTGGTAGCTTCCGGGG
AA[SEQ ID NO：49]
18059 KGF2 Synth F2反义：
AACAGTTTGCGCCAACGAACATCACCCTGTAAGTGGTTGTAAGAG
[SEQ ID NO：50]
18063 KGF2 Synth F3反义：
TTCTTGGTCCCAGAAACTTTACCGTTTTTTTCGATTTTCAGGAAGTA
[SEQ ID NO：51]
18060 KGF 2 Ava II反义，
TTCTTGGTCCCAGAAACTTTACCG[SEQ ID NO：52]
18065 KGF2 HindIII 3′终止：
AGATCAGGCTTCTATTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG
[SEQ ID NO：53]
在图24B中列出了合成的KGF-2基因序列和其相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：54和55)。
                         实施例13构建KGF-2缺失突变体
用实施例12A的优化KGF-2构建体为模板，从KGF-2基因的5’末端和3’末端构建缺失突变体。以可能对大肠杆菌中表达产生不利影响的基因区为基础，选择缺失。对应5’缺失，用下文所列的引物作为5’引物。这些引物含有标明的限制位点和编码起始甲硫氨酸的ATG。将KGF-2(FGF-12)208氨基酸3’HindIII引物用作3’引物。用与实施例12所列相同的标准条件完成25轮的PCR扩增。用BspHI限制性切割KGF-236aa/208aa缺失突变体产物的5’位点，用HindIII限制性切割3’位点，然后克隆至已用BspHI和HindIII消化过的pQE60中。用NcoI作为5’限制酶，用HindIII作为3’位点限制酶，对所有其它产物进行限制性切割，然后克隆至已用NcoI和HindIII消化过的pQE60中。对于KGF-2(FGF-12)36aa/153aa，用128aa 3’HindIII作为3’引物，用FGF-1236aa/208aa作为5’引物。对于FGF-12 62aa/153aa，用128aa 3’HindIII作为3’引物，用FGF-12 62aa/208aa作为5’引物。所得克隆的名称显示因所述缺失而产生之多肽的第一个和最后一个氨基酸。例如，KGF-236aa/153aa表示该缺失突变体的第一个氨基酸是KGF-2的氨基酸36，最后一个氨基酸是KGF-2的氨基酸153。另外，如在图25-33中所说明的，每个突变体均加有N-末端Met。缺失引物的序列如下：
FGF12 36aa/208aa：
5′BsphI GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC[SEQ ID
NO：56]
FGF12 63aa/208aa：
5′NcoI GGACAGCCATGGCTGGTCGTCACGTTCG[SEQ ID NO：57]
FGF12 77aa/208aa：
5′NcoI GGACAGCCATGGTTCGTTGGCGTAAACTG[SEQ ID NO：58]
FGF12 93aa/208aa：
5′NcoI GGACAGCCATGGAAAAAAACGGTAAAGTTTC[SEQ ID NO：59]
FGF12 104aa/208aa：
5′NcoI GGACCCCCATGGAGAACTGCCCGTAGAGC[SEQ ID NO：60]
FGF12 123aa/208aa：
5′NcoI GGACCCCCATGGTCAAAGCCATTAACAGCAAC[SEQ ID NO：61]
FGF12 138aa/208aa：
5′NcoI GGACCCCCATGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAG[SEQ ID
NO：62]
FGF12 3′HindIII：(用于所有上述缺失克隆)
CTGCCCAAGCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG[SEQ ID NO：63]
FGF12 36aa/153aa：
5′BsphI(如上述)
3′HindIII CTGCCCAAGCTTATTACTTCAGCTTACAGTCATTGT[SEQ ID
NO：64]
FGF12 63aa/153aa：
5’NcoI和3’HindIII，如上述。
在图25-33中列出了所得缺失突变体的序列。(SEQ ID NO：65-82)
当在大肠杆菌中表达KGF-2Δ28(氨基酸63-208)时，使用蛋白酶抑制剂如盐酸胍(Gu-HCl)防止蛋白质降解。例如，将大肠杆菌菌泥重悬于50mM Tris乙酸，10mM EDTA-NA2，pH7.7±0.2，随后裂解。用等体积1.0M Gu-HCl溶液处理裂解的悬液，并在2-8℃轻搅2-4小时。然后离心并过滤悬液，再上样到第一个纯化柱。最初的纯化在SP-SepharoseFF柱上，其中结合的KGF-2用盐梯度洗脱。所得SP-Sepharose洗脱液汇合物经稀释，用0.2微米滤膜过滤，上样至Fractogel COO-(S)柱。通过盐梯度进行洗脱，洗脱液汇合物透析并浓缩入缓冲液。
                          实施例14构建KGF-2的半胱氨酸突变体
为了构建C-37突变，用引物5457 5’BsphI和5258 173aa 3’HindIII扩增来自实施例12A的KGF-2(FGF-12)模板。引物5457 5’BsphI将半胱氨酸37变成丝氨酸。用实施例12A的标准条件进行25轮完成扩增。将所得产物用BsphI和HindIII限制性切割，然后克隆至已用BsphI和HindIII消化的大肠杆菌表达载体pQE60中。(图34)(SEQ ID NO：83)
为了将半胱氨酸106突变为丝氨酸，进行两个PCR反应以便进行该半胱氨酸的寡核苷酸定点诱变。在一个反应中，用5453 BsphI作为该反应的5’引物，用5455作为该反应的3’引物。在第二个反应中，用5456作为5’引物，用5258 HindIII作为3’引物。在实施例12所列的标准条件下，将反应扩增25轮。在用5453 BsphI作为5’引物、用5258 HindIII作为3’引物的随后反应中，用1μl各PCR反应的产物作为模板。用实施例12所列的标准条件完成25轮的扩增。将所得产物用BspHI和HindIII消化，然后克隆至已用NcoI和HindIII消化的大肠杆菌表达载体pQE60中。
需要进行两个PCR反应来产生C-37/C-106突变体。用引物5457BsphI和5455来产生含半胱氨酸37被丝氨酸所替换的突变体的5’区，用引物5456和5258 HindIII来产生含半胱氨酸106被丝氨酸所替换的突变体的3’区。在第二个反应中，用从每个前期反应得到的各1μl产物一起作为模板，利用5457 BsphI引物作为5’引物，用5258 HindIII引物作为3’引物来产生C-37/C-106突变体。将该PCR产物用BsphI和HindIII限制性消化，然后克隆至已用NcoI和HindIII消化的pQE60中。所得克隆列于图35(SEQ ID NO：84)。半胱氨酸突变引物的序列：5457 BspHI：GGACCCTCATGACCTCTCAGGCTCTGGGT(SEQ ID NO：85)5456：AAGGAGAACTCTCCGTACAGC(SEQ ID NO：86)5455：GCTGTACGGTCTGTTCTCCTT(SEQ ID NO：87)5453 BspHI：GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC(SEQID NO：88)5258 HindIII：CTGCCCAAGCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(SEQ IDNO：89)
                            实施例15KGF-2(FGF-12)的生产和纯化
将编码实施例12B中所述的优化成熟蛋白质(即KGF-2的氨基酸T36至S208)的DNA序列克隆至质粒pQE-9(Qiagen)中。在37℃，含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB中，让大肠杆菌(M15/rep4；Qiagen)过夜生长至稳定期。以1∶50的稀释度，用该培养物接种含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的新鲜LB培养基。使细胞在37℃生长至O.D.595为0.7，通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至1mM的终浓度进行诱导。3-4小时后，离心收集细胞，然后以5体积缓冲液：1体积细胞糊的比例，将细胞重悬于含60mM NaPO4和360mM NaCl的缓冲液中。在Mautin Gaulin中破碎细胞后，通过加入NaOH将提取物的pH调至8.0，然后离心澄清。
将澄清的可溶性提取物上样于Poros HS-50柱(2.0×10.0cm；PerSeptive Biosystems，Inc.)，然后用含0.5M，1.0M和1.5M NaCl的50mM NaPO4 pH8.0分步洗脱已结合的蛋白质。然后用50mM NaPO4pH6.5将在1.5M的盐级分中洗脱下来的KGF-2稀释5倍，达到300mM的最终盐浓度。使含KGF-2的该级分依次通过Poros HQ-20柱(2.0×7.0cm；PerSeptive Biosystems，Inc.)，然后结合于Poros CM-20柱(2.0×9.0cm；PerSeptive Biosystems，Inc.)中。收集在约500mM-约750mMNaCl下洗脱出来的含KGF-2(FGF-12)的诸级分，稀释，再重上样于CM-20柱以便进行浓缩。最后，在凝胶过滤柱(S-75；Pharmacia)上于40mM NaOAc pH6.5，150mM NaCl中分离该蛋白质(E-5批)。或者，在磷酸缓冲盐溶液(PBS，E-4批)上跑凝胶过滤柱。收集含KGF-2的级分并用Bio-Rad蛋白质测定确定蛋白质的浓度。经SDS-PAGE判断蛋白质的纯度＞90％。最后，用Limulus Amebocyte Lysate检测(Cape CodAssociates)确定的内毒素水平≤1Eu/mg。经这种方式制备的蛋白质能够与肝素结合，这是FGF家族成员的一个标志。
                               实施例16A.构建N-末端缺失突变体KGF-2Δ33
为了提高KGF2在大肠杆菌中的表达水平，并提高大肠杆菌表达的KGF2的溶解性和稳定性，制备从加工前的KGF2中除去了前68个氨基酸的缺失变体KGF-2Δ33(KGF-2 aa 69-208)。产生该缺失变体的原理是基于下列观察结果。首先，成熟KGF2(KGF-2 aa 36-208)含奇数个(3个)半胱氨酸残基，这可因分子内二硫键形成而发生聚集。KGFΔ33缺失变体仅含有2个半胱氨酸残基，这样降低了分子内二硫键形成以及随后发生聚集的可能性。聚集的减少可导致活性KGF2蛋白质产率提高。第二，KGFΔ33缺失变体除去了多丝氨酸区，所述多丝氨酸区在KGF-1中不存在，而且似乎对活性并不重要，但可能会阻碍所述蛋白质在大肠杆菌中的表达。因此，除去多丝氨酸区可提高活性KGF-2蛋白质的表达水平。第三，KGFΔ33在大肠杆菌中的表达会引起KGF-2在残基68和69之间的自然裂解。因此，预期KGF2Δ33可以被有效地加工并在大肠杆菌中是稳定的。
在pQE6中构建KGF2Δ33
为了进行聚合酶链反应指导的扩增并将KGF2Δ33亚克隆至大肠杆菌表达载体pQE6中，合成与所需KGF2区互补的两个寡核苷酸引物(5952和19138)，它们的序列如下：引物5952：5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′(SEQID NO：91)引物19138：5′GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT 3′(SEQ IDNO：92)
在N-末端引物(5952)的情况下，插入一个AflIII限制位点，而在C-末端引物(19138)的情况下，插入一个HindIII限制位点。引物5952还含有一个与KGF2编码区邻接并符合读框的ATG序列以便在大肠杆菌中翻译克隆的片段，而引物19138含有与KGF2编码区邻接并符合读框的2个终止密码子(在大肠杆菌中优先使用的)，这样可确保在大肠杆菌中正确地进行翻译终止。
用本领域技术人员熟知的标准条件，将成熟KGF-2(aa 36-208)的核苷酸序列(在实施例12C中构建的)为模板，完成聚合酶链反应。将所得的扩增子用AflIII和HindIII限制性消化并亚克隆至经NcoI/HindIII消化的pQE6蛋白质表达载体中。
在pHE1中构建KGF2Δ33
为了进行聚合酶链反应指导的扩增并将KGF2Δ33亚克隆至大肠杆菌表达载体pHE1中，合成对应于所需KGF2区的两个寡核苷酸引物(6153和6150)，它们的序列如下：引物6153：5′CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG3′(SEQ ID NO：93)引物6150：5′CCGGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGG 3′(SEQ ID NO：94)
在N-末端引物(6153)的情况下，插入一个NdeI限制位点，而在C-末端引物(6150)的情况下，插入一个Asp718限制位点。引物6153还含有一个与KGF2编码区邻接并符合读框的ATG序列以便在大肠杆菌中翻译克隆的片段，而引物6150含有与KGF2编码区邻接并符合读框的2个终止密码子(在大肠杆菌中优先使用的)，这样可确保在大肠杆菌中正确地进行翻译终止。
用本领域技术人员熟知的标准条件，将成熟KGF-2(aa 36-208)的核苷酸序列(在实施例12C中构建的)为模板，完成聚合酶链反应。将所得的扩增子用NdeI和Asp718限制性消化并亚克隆至经NdeI/Asp718消化的pHE1蛋白质表达载体中。KGF2Δ33的核苷酸序列：ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAA (SEQ ID NO：95)KGF2Δ33的氨基酸序列：MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO：96)B.构建优化的KGF-2Δ33
为了提高KGF2Δ33在大肠杆菌中的表达水平，将完整基因的密码子进行优化以便与大肠杆菌中最常使用的密码子相匹配。由于用于产生KGF2Δ33的模板在N末端区内已进行了密码子优化，因此，需要将C末端氨基酸(84-208)优化。
首先，将氨基酸172-208进行密码子优化以产生KGF2Δ33(s172-208)。通过重叠PCR策略可达到此目的。将寡核苷酸PM07和PM08(对应于氨基酸172-208)合并在一起，并通过将它们加热至70℃然后冷却至37℃而一起退火。然后将已退火的寡核苷酸用作标准PCR反应的模板，所述标准PCR反应由引物PM09和PM10指导。在按照本领域技术人员熟知的标准条件并用KGF2Δ33为模板进行的另一个PCR反应中，用寡核苷酸PM05(它与KGF2编码区内的Pst1位点重叠)和PM11扩增对应于氨基酸84-172的KGF2区。在第三个PCR反应中，将第一个PCR反应的产物(对应于已优化密码子的氨基酸172-208)和第二个PCR反应的产物(对应于密码子未被优化的氨基酸84-172)合并并作为寡核苷酸PM05和PM10指导的标准PCR反应的模板。将所得扩增子用Pst1/HindIII消化，并亚克隆至Pst1/HindIII消化的pQE6KGF2Δ33中，有效地替换对应的密码子未被优化的区，从而产生pQE6KGF2Δ33(s172-208)。
为了完成KGF2的密码子优化，用重叠寡核苷酸产生对应于KGF2氨基酸84-172区的已优化密码子的合成基因。首先，将四个寡核苷酸(PM31、PM32、PM33和PM34)合并并完成7个循环的PCR：94℃，30秒；46.5℃，30秒；和72℃，30秒。
按照标准方法，用1μl第一个PCR反应产物为模板，完成由引物PM35和PM36指导的第二个PCR反应。将所得的已优化密码子的基因片段用PstI/SalI消化并亚克隆至PstI/SalI消化的pQE6KGF2Δ33(s172-208)中以产生一个已完全优化的KGF2编码基因，pQE6KGF2Δ33s。
为了构建另一种大肠杆菌蛋白质表达载体，利用PQE6KGF2Δ33s上的引物PM102和PM130对KGF2Δ33s进行PCR扩增。所得的扩增子用NdeI和EcoRV消化，并亚克隆至已用NdeI和Asp718消化的pHE1表达载体(钝末端形式)中，从而形成pHE1Δ33s。
在构建密码子优化的KGF2Δ33s中所用的寡核苷酸序列：PM05：CAACCACCTGCAGGGTGACG(SEQ ID NO：97)PM07：AACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACC(SEQ ID NO：98)PM08：GGGCCCAAGCTTAAGAGTGTACCACCATTGGCAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTACGACGGGTTTTCTGACCACG(SEQ ID NO：99)PM09：GCCACATACATTTGTCGACCGTT(SEQ ID NO：100)PM10：GGGCCCAAGCTTAAGAGTG(SEQ ID NO：101)PM11：GCCACATACATTTGTCGACCGTT(SEQ ID NO：102)PM31：CTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAG(SEQ ID NO：103)PM32：AGCTTTAACAGCAACAACACCGATTTCAACGGAGGTGATTTCCAGGATGGAGTACGGGCAGTTTTCTTTCTTGGTACCAGAAACTTTACC(SEQ ID NO：104)PM33：GGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAAGAATTTAACAAC(SEQ ID NO：105)PM34：GTCGACCGTTGTGCTGCCAGTTGAAGGAAGCGTAGGTGTTGTAACCGTTTTCTTCGATACGTTCTTTCAGTTTACAGTCGTTGTTAAATTCTTTGGAACC(SEQ ID NO：106)PM35：GCGGCGTCGACCGTTGTGCTGCCAG (SEQ ID NO：107)PM36：GCGGCCTGCAGGGTGACGTTCGTTGG(SEQ ID NO：108)PM102：CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG(SEQID NO：109)PM130：CGCGCGATATCTTATTAAGAGTGTACCACCATTG(SEQ IDNO：110)KGF2Δ33(s172-208)的核苷酸序列：ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAGAAAGAAAACTGCCCGTACTCCATCCTGGAAATCACCTCCGTTGAAATCGGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAAGAATTTAACAACGACTGTAAACTGAAAGAACGTATCGAAGAAAACGGTTACAACACCTACGCTTCCTTCAACTGGCAGCACAACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTGCCAATGGTGGTACACTCTTAA(SEQ ID NO：111)KGF2Δ33(s172-208)的氨基酸序列：MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO：112)C.构建N末端缺失突变体KGF-2Δ4
为了提高KGF2在大肠杆菌中的表达水平，并提高大肠杆菌表达的KGF2的溶解性和稳定性，构建从加工前KGF2中除去了前38个氨基酸(包括37位的半胱氨酸)的一种缺失变体KGF-2Δ4(氨基酸39-208)。由于所得KGF2缺失分子含偶数个半胱氨酸残基，因分子内二硫键形成所引起的聚集问题就可以减少，从而提高了活性蛋白质的表达水平。
为了进行聚合酶链反应指导的扩增并将KGF2Δ4亚克隆至大肠杆菌蛋白质表达载体pQE6中，合成两个寡核苷酸引物(PM61和19138)，它们的碱基序列如下：PM61： BCGCGGCCATGGCTCTGGGTCAGGACATG(SEQ ID NO：113)19138：GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT(SEQ ID NO：114)
在N-末端引物(PM61)的情况下，插入一个NcoI限制位点，而在C-末端引物(19138)的情况下，插入一个HindIII限制位点。PM61还含有一个与KGF2编码区邻接且读框一致的ATG序列以便在大肠杆菌中翻译已克隆的片段，而19138含有与KGF2编码区邻接且读框一致的2个终止密码子(在大肠杆菌中优先使用的)，这样可确保在大肠杆菌中正确地发生翻译终止。
用本领域技术人员熟知的标准条件，以全长KGF2(aa 36-208)(在实施例12C中构建的)为模板，完成聚合酶链反应。将所得的扩增子用NcoI和HindIII限制性消化并亚克隆至已用NcoI/HindIII消化过的pQE6蛋白质表达载体中。KGF2Δ4的核苷酸序列：ATGGCTCTGGGTCAAGATATGGTTTCTCCGGAAGCTACCAACTCTTCCTCTTCCTCTTTCTCTTCCCCGTCTTCCGCTGGTCGTCACGTTCGTTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAA(SEQ ID NO：115)KGF2Δ4的氨基酸序列：MALGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO：116)
                            实施例17在正常大鼠内KGF-2Δ33刺激的伤口愈合
为了证实KGF-2Δ33可加快伤口愈合，用下列模型检查切割伤口的伤口愈合情况。
用Keyes皮肤打孔器在Sprague Dawley大鼠(n＝5)背上打出一6mm的切割伤口。将伤口敞开并用各种浓度KGF-2Δ33(在40mM NaOAc和150mM NaCl，pH6.5缓冲液中)和缓冲液(40mM NaOAc和150mMNaCl，pH6.5)从创伤当天开始进行局部处理，连续处理4天。每天用校正的Jameson测径器测量伤口。用平方毫米表示伤口的大小。在最后一天测量伤口，并收集伤口进一步分析。用非成对t检验完成统计学分析(平均值±SE)。评估参数包括伤口闭合百分比，组织学分数(1-3表示有最少的细胞积累，没有肉芽；4-6表示不成熟肉芽，炎性细胞，毛细血管；7-9表示肉芽组织，细胞、成纤维细胞、新上皮；10-12表示含成纤维细胞、胶原和上皮的成熟真皮)，上皮再形成和免疫组织化学。
在创伤后第3天，与缓冲液对照的38.9mm2相比，用KGF-2Δ33处理减小了伤口大小(用4μg，伤口大小为30.4mm2，p＝0.006；用1μg，伤口大小为33.6mm2，p＝0.0007)。在创伤后第4天，与缓冲液对照的33.8mm2相比，用KGF-2Δ33处理减小了伤口大小(用0.1μg，伤口大小为27.2mm2，p＝0.02；用0.4μg，伤口大小为27.9mm2，p＝0.04)。在创伤后第5天，与缓冲液对照的25.1mm2相比，用KGF-2Δ33处理减小了伤口大小(用4μg，伤口大小为18.1mm2 p＝0.02)。参见图36。
在第5天收集伤口后，评估其它参数。与缓冲液对照的60.2％相比，用4μg KGF-2Δ33提高了伤口闭合的百分比(71.2％，p＝0.02)。与缓冲液对照的6.4相比，施用1μg和4μg KGF-2Δ33还可提高组织学分数(用1μg为8.4，p＝0.005；用4μg为8.5，p＝0.04。)。相对于缓冲液对照的923μm，施用1μg和4μg KGF-2Δ33改善了上皮再形成(用1μg为1389μm，p＝0.007；用4μg为1220μm，p＝0.02)。参见图37。
该研究说明，正如通过总伤口面积的减少所表明的，每日用KGF-2Δ33处理加快了正常动物中的伤口愈合速率。另外，伤口样品的组织学评估和上皮再形成的评估也表明，在所述正常大鼠模型中，KGF-2Δ33也提高了愈合速率。
                         实施例18在正常大鼠中KGF-2Δ33对抗拉强度和表皮厚度的影响
为了证实KGF-2Δ33可提高伤口的抗拉强度和表皮厚度，进行下列试验。
在雄性Sprague Dawley大鼠(n＝8或9)的背部切割一2.5cm的全层皮切割伤口。用3个等距离的金属皮肤夹子缝合皮肤切口。在切割时局部涂抹缓冲液(40mM NaOAc和150mM NaCl，pH6.5)或KGF-2Δ33(在40mMNaOAc和150mM NaCl，pH6.5缓冲液中的溶液)。在第5天切割四条0.5cm宽的伤口带。用InstronTM皮肤张力计来研究样品的破裂强度，并将样品用于羟脯氨酸测定和组织病理学分析。破裂强度是指各伤口在裂开前所承受的最大力量。用非成对t检验进行统计学分析(平均值±SE)。
在切割皮肤大鼠模型中，切割后在伤口内局部涂抹一次KGF-2Δ33可使破裂强度、抗拉强度和表皮厚度在统计学上显著增加。在一项研究中，用KGF-2以1、4和10μg处理的伤口的抗断强度明显高于用缓冲液处理的对照组(1μg时107.3g，p＝0.0006；4μg时126.4g，p＜0.0001；10μg时123.8g，p＜0.0001)。参见图38。
在光学显微镜下对马森氏三色切片进行表皮厚度测定。与缓冲液对照组的54.8μ相比，用KGF-2Δ33处理的伤口表现出表皮厚度增加(1μg时60.5μ，4μg时66.51μ，p＝0.01，10μg时59.6μ)。参见图39。
这些研究表明，单次伤口内涂抹KGF-2提高并加快了伤口的愈合过程，表现为切割伤口的破裂强度和表皮厚度增加。
                      实施例19KGF-2Δ33对正常大鼠皮肤的影响
为了说明真皮内注射KGF-2Δ33后，KGF-2Δ33对正常大鼠皮肤的影响，进行如下实验。
在第0天，对雄性成年SD大鼠(n＝3)真皮内注射6次50μl安慰剂或50μl的浓度为1和4μg的KGF-2Δ33(在40mM NaOAc和150mMNaCl，pH6.5缓冲液中的溶液)。在第24和48小时处死动物，处死动物前2小时对动物注射5-2’-溴-脱氧尿苷(BrdU)(100mg/kg i.p.)。测定从颗粒层到基底层底部的表皮厚度。沿注射部位进行约20次测量并计算出平均厚度。用校准的测微计在光学显微镜下对马森氏三色切片进行测量。由两个盲观察者在光学显微镜下用如下计分系统进行BrdU计分：0-3表示没有至很少量的BrdU标记的细胞；4-6表示中等标记；7-10表示强标记的细胞。注射后24和48小时处死动物。用非成对t检验进行统计学分析。(平均值±SE)。
与缓冲液对照的27.1μ相比，KGF-2Δ33处理过的皮肤在24小时时表现出表皮厚度增加(1μg时为32.2μ，p＜0.001；4μg时为35.4μ，p＜0.0001)。与缓冲液对照的27.8μ相比，KGF-2Δ33处理的皮肤在48小时时表现出表皮厚度增加(1μg时为34.0μ，p＝0.0003，4μg时为42.4μ，p＜0.0001)。参见图40。与缓冲液对照的3.33相比，KGF-2Δ33处理过的皮肤在48小时时还表现出BrdU免疫染色增加(1μg时为4.37，p＝0.07，4μg时为6.85，p＜0.0001)。参见图41。
这些研究表明，皮肤内注射KGF-2提高并加快了表皮厚度增加。因此，KGF-2可用于预防或缓解皱纹，改善老化的皮肤和减少伤疤或改善美容手术后的伤口愈合。此外，KGF-2还可预防性地用于预防或减少口腔粘膜炎(口腔溃疡)、由于化疗或其它试剂引起的肠炎。
                      实施例20KGF-2对PAF引起的爪水肿的抗炎效果
为了说明KGF-2的抗炎效果，用PAF引起的爪水肿炎症模型进行如下实验。
将lewis大鼠(190-210克)每4只分成一组，对大鼠右后爪的足垫用120μl含有2.5纳摩尔PAF的溶液进行皮下注射，该溶液中同时含有如下试剂：125μg Ckb-10(B5)，24μg LPS，73μg KGF-2[图1(SEQ ID NO：2)的Thr(36)-Ser(208)，N-末端为Met]或不加蛋白质。对左后足注射相同量的缓冲液作为平行对照。在临注射PAF前、注射PAF后30分钟和90分钟用体积描记图系统测量大鼠足的体积。计算鼠爪体积改变的百分数(％)。实验1和实验2的试验试剂
组(N＝4) PAF(R.)2.5nMol Ckβ-10(R.)1.04mg/ml LPS(R.)200μg/ml KGF-2(R.)0.73mg/ml 缓冲液
1234 20μl20μl20μl20μl -100μl-- --100μl- ---100μl 100μl---
如图42所示，正如所预期的，右后爪单独注射PAF 0.5小时后使鼠爪的体积显著增加(对于实验1或实验2，分别为75或100％)；而注射缓冲液的左后爪或单独注射LPS或SEB的右后爪仅表现出轻微的水肿症状(数据未给出)。但当将KGF-2与PAF同时局部注射时，与单独用PAF攻击的鼠爪相比，前一情况下鼠爪的体积明显减小(对于实验1或实验2，分别为25或50％)。当将PAF与Ckb-10(一种不同的蛋白质)、LPS或SEB(两种炎性介体)一起注射动物时未观察到爪水肿的减弱。这些结果表明KGF-2的抗炎效果是特异性的，而不是由于该蛋白质的某些非特异性性质引起的。KGF-2Δ33对大鼠中PAF引起的足水肿的影响
在上述用KGF-2Δ33证实其刺激角质形成细胞增殖的体外生物学活性及其在体内对伤口愈合的影响的各实验后，还在大鼠内评估了KGF-2Δ33对PAF引起的大鼠爪水肿模型的效果。将lewis大鼠(190-210克)每4只分成一组，对大鼠右后爪的足垫用120μl含有2.5纳摩尔PAF的溶液进行皮下注射，该溶液中还含有210μg KGF-2Δ33或白蛋白。对左后爪单独注射相同量的缓冲液、白蛋白或KGF-2Δ33作为平行对照。在注射PAF后的不同间隔时间用体积描记图系统测量大鼠爪的体积。计算鼠爪体积改变的百分数(％)。
如图43所示，正如所预期的，右后爪在注射PAF和白蛋白0.5小时后，爪体积显著增加(75％)；而只注射缓冲液、白蛋白或KGF-2Δ33的左后爪仅表现出轻微的水肿症状。但是，当将KGF-2Δ33与PAF同时局部注射时，与用PAF+白蛋白攻击的鼠爪相比，在持续4小时的整个实验过程中，前一情况下鼠爪的体积明显减小(平均20％)。这些结果证实了KGF-2Δ33的抗炎性质。
                    实验试剂
组(N＝4) PAF2.5nMol 白蛋白2.1mg/ml KGF-2Δ332.1mg/ml 缓冲液
1 20μl 100μl - -
2 20μl - 100μl -
3 - 120μl - -
4 - - 120μl -
5 - - - 120μl
因此，KGF-2可用于治疗炎症是主要病因的急性或慢性病症，所述病症包括但不仅限于牛皮癣、湿疹皮炎和/或关节炎。
                           实施例21KGF-2Δ33对结肠端-端吻合术大鼠模型的影响
本实施例说明KGF-2Δ33可以在Wistar或Sprague Dawley大鼠的肠或结肠吻合术模型中提高肠修复的速率。
实验性吻合术中应用大鼠是一种已很好表征过的、外科手术伤口愈合相关的可重现的模型。该模型还可用于研究长期类固醇治疗或各种化疗方案对结肠和小肠内外科手术伤口愈合的质量和速度的影响(Mastboom W.J.B.等，英国外科手术杂志(Br. J.Surg.)，78：54-56(1991)，Salm R.等，外科手术肿瘤学杂志(J.Surg.Oncol.)，47：5-11，(1991)，Weiber S.等，欧洲外科手术研究(Eur.Surg.Res.)，26：173-178(1994))。吻合术的愈合与身体其它部位伤口的愈合相似。愈合早期的特征是急性炎症，随后是成纤维细胞的增殖和胶原的合成。胶原逐渐成型，当新的胶原合成时伤口变坚固(Koruda M.J.和Rolandelli，R.H.，外科手术研究杂志(J.Surg.Res.)，48：504-515(1990))。大部分术后并发症例如吻合泄漏发生于手术后的最初几天--该期间内结肠的强度主要由伤口边缘承受缝合线的能力来保证。据报道，在手术后的最初几天内胃肠道承受缝合线的能力下降了80％(Hogstrom H和Haglund U.Acta Chir Scand 151：533-535(1985)，Jonsson K等，美国外科手术杂志(Am.J.Surg.)，145：800-803(1983))。
肌肉内联合注射氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)将雄性成年SD大鼠(n＝5)麻醉。沿中线切开4cm长打开腹腔。在距腹膜反射区3cm处从左结肠切下1cm宽的片段并保留边缘血管。进行单层端-端吻合术，用5-0 Vicryl反转缝合线缝8-10针恢复肠的连续性。然后通过注射器用缓冲液或1和4μg浓度的KGF-2Δ33局部处理吻合处。然后用3-0连续丝缝合线缝合肌肉层并用外科夹子闭合皮肤使切割伤口闭合。然后每日皮下施用缓冲液或1和5mg/kg的KGF-2Δ33。在手术当天进行称重，然后每天称座一次。最后一次处理(第5天)24小时后对动物实行安乐死。将动物麻醉并进行钡灌肠，然后以固定的距离进行X-射线透视。结肠内给药后由两个盲观察者进行放射分析，结果表明用KGF-2Δ33处理的组1)在手术部位的钡泄漏速率降低，2)手术部位的收缩程度降低，和3)远离手术部位的粪便量增加。
                     结肠吻合术放射学分析
组                   粪便量     吻合处    近端膨胀  腹膜泄漏
                                的收缩
未处理组             20％       80％      80％      60％
(N＝5)
缓冲液组             40％       60％      80％      75％
(N＝5)
KGF-2Δ33            60％       20％      100％     20％
[1mg/kg](N＝5)
KGF-2Δ33            100％      0％       75％      25％
[5mg/kg](N＝4)
                              实施例22构建KGF-2羧基末端突变
KGF-2的羧基末端带有大量电荷。这些带电荷残基的密度有可能会影响该蛋白质的稳定性，从而影响溶解性。为了产生在溶液中稳定的突变蛋白，在所述基因的所述区域产生一系列突变。
为了产生点突变体194R/E、194R/Q、191K/E、191K/Q，188R/E、188R/Q，用本领域技术人员熟知的标准条件，在PCR反应中用KGF2Δ33为模板，用5952 KGF2Δ33 5’Afl III5’引物和标明的3’引物(所述引物含有KGF-2的适宜点突变)。将所得产物用Afl III和HindIII消化，然后克隆至已用NcoI和HindIII消化的大肠杆菌表达载体pQE60中。KGF2Δ33，194R/E的构建：使用下列引物：5952 KGFΔ33 5′Afl III：5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′(SEQ ID NO：117)KGF2 3’HindIII 194aa R至E：5′CTGCCC AAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTT TTCTCGTGTTTTCTGTCC 3′(SEQ ID NO：118)KGF2Δ33，194R/E的核苷酸序列：ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGA GAAAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (SEQ ID NO：119)KGF2Δ33，194R/E的氨基酸序列：MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNIKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTR EKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO：120)KGF2Δ33，194R/Q的构建：使用下列引物：5952KGFΔ33 5′Afl III：5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′(SEQ ID NO：121)KGF2 3’HindIII 194aa R至Q：5′CTGCCC AAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTT CTGTCGTGTTTTCTGTCC 3′(SEQ ID NO：122)KGF2Δ33，194R/Q的核苷酸序列：ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGA CAGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG(SEQ ID NO：123)KGF2Δ33，194R/Q的氨基酸序列：MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTR QKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO：124)KGF2Δ33，191K/E构建：使用下列引物：5952KGFΔ33 5′Afl III：5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′(SEQ ID NO：125)KGF2 3’HindIII 191aa K至E：5′CTGCCC AAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGT TTCCTGTCCTCTCCTTGG 3′(SEQ ID NO：126)KGF2Δ33，191K/E核苷酸序列：ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAG GAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG(SEQ ID NO：127)KGF2Δ33，191K/E氨基酸序列：MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQ ETRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO：128)KGF2Δ33，191K/Q的构建：使用下列引物：5952 KGFΔ33 5′Afl III：5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′(SEQ ID NO：129)KGF2 3’HindIII 191aa K至Q：5′CTGCCC AAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGT CTGCTGTCCTCTCCTTGG 3′(SEQ ID NO：130)KGF2Δ33，191K/Q的核苷酸序列：ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAG CAGACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (SEQ ID NO：131)KGF2Δ33，191K/Q的氨基酸序列：MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQ QTRRKGNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO：132)KGF2Δ33，188R/E的构建：使用下列引物：5952 KGFΔ33 5′Afl III：5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′(SEQ ID NO：133)KGF2 3’HindIII 188aa R至E：5′CTGCCC AAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTTCTGTCC TTCCCTTGGAGCTCCTTT3′(SEQ ID NO：134)KGF2Δ33，188R/E的核苷酸序列：ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGG GAAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG(SEQ ID NO：135)KGF2Δ33，188R/E的氨基酸序列：MYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPR EGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO：136)KGF2Δ33，188R/Q的构建：使用下列引物：5952 KGFΔ33 5′Afl III：5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′(SEQ ID NO：137)KGF2 3’HindIII 188aa R至Q：5′CTGCCC AAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTTCTGTCC CTGCCTTGGAGCTCCTTT3′(SEQ ID NO：138)KGF2Δ33，188R/Q的核苷酸序列：ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGG CAGGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (SEQ ID NO：139)KGF2Δ33，188R/Q的氨基酸序列：MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPR QGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO：140)KGF2Δ33，183K/E的构建：
为完成突变183K/E，进行两个PCR反应以便对该赖氨酸进行寡核苷酸定点诱变。在一个反应中，用5952 KGFΔ33 5’AflIII为5’引物，用KGF2 183aa K至E有义序列作为该反应的3’引物。在第二个反应中，用KGF2 5’183aaK至E反义序列作为该反应的5’引物，用KGF2 3’HindIIITAA终止序列作为3’引物。用KGF2Δ33作为这些反应的模板。在本领域技术人员熟知的标准条件下扩增所述反应。在随后的反应中，用来自这些PCR反应的产物各1μl作为模板，5’引物为5453 BsphI，3’引物为5258HindIII。在本领域技术人员熟知的标准条件下进行扩增。将所得产物用AflIII和HindIII消化，然后克隆至已用NcoI和HindIII消化的大肠杆菌表达载体pQE60中。使用下列引物：5952KGFΔ33 5′Afl III：5′GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3′(SEQ ID NO：141)KGF2 5’183aa K至E有义序列：5′TTGAATGGAGAA GGAGCTCCA 3′(SEQ ID NO：142)KGF2 183aa K至E反义序列：5′TGGAGCTCC TTCTCCATTCAA 3′(SEQ ID NO：143)KGF2 3’HindIII TAA终止序列：5′CTGCCC AAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGG 3′(SEQ ID NO：144)KGF2Δ33，183K/E的核苷酸序列：ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGA GAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG(SEQ ID NO：145)KGF2Δ33，183K/E的氨基酸序列：MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNG EGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO：146)
                        实施例23在Balb/c小鼠中，全身照射后KGF-2对存活的影响
通常将电离辐射用于治疗许多恶性肿瘤，包括肺癌和乳腺癌，淋巴瘤和骨盆肿瘤(Ward，W.F.等，肺病动物模型的CRC手册(CRC Handbookof Animal Models of Pulmonary Disease)，CRCPress，pp.165-195(1989))。但是，辐射诱导的损伤(肺、肠等)限制了辐射疗法的强度和成功(Morgan，G.W.等，国际辐射肿瘤学生物物理杂志(Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.)，31：361(1995))。胃肠粘膜的细胞周期比较快，并对细胞毒性试剂特别敏感(Potten，C.S.等，In：Cytotoxic Insult toTissue，Churchill Livingstone，pp.105-152(1983))。肠辐射损伤的部分表现包括急性直肠炎、肠纤维变性、狭窄或瘘形成(Anseline，D.F.等，外科手术纪事(Ann.Surg.)，194：716-724(1981))。可保护正常结构免受辐射影响但不改变肿瘤的辐射敏感性的治疗方法在这些疾病的治疗中是非常有益的。不管照射面积多大，辐射剂量受正常组织的辐射敏感性所限制。全身或局部身体照射后的并发症包括肺炎、纤维变性、胃肠损伤和骨髓疾病。
在TBI后，还证实了包括IL-1、TNF、IL-6、IL-12等的多种细胞因子有辐射保护作用(Neta，R.等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，173：1177(1991))。已经表明在辐射和化疗联用后(Du，X.X.等，血液，83：33(1994))以及辐射诱导的胸损伤后(Redlich，C.A.等，免疫学杂志，157：1705-1710(1996))，IL-11可保护小肠粘膜细胞。动物
所有试验均用BALB/c小鼠完成。购买6周龄的动物，在研究开始时，动物为7周龄。所有操作均用无菌技术完成。按照人类基因组科学公司社会事业性动物饲养和使用委员会的规则和指南以及实验室动物的饲养和使用指南完成该项研究，该委员会审查过并赞成这一实验方案。KGF-2
该蛋白质是具有141个氨基酸的人蛋白质，称为KGF-2Δ33。KGF-2Δ33为KGF-2的截短同工型，不含成熟蛋白质的前33个氨基末端残基。已经将编码所述蛋白质的基因克隆至一个大肠杆菌表达载体中。将含纯度大于95％的重组物质的级分用于所述试验。用含40mM乙酸钠+150mM氯化钠，pH6.5的载体配制KGF-2。用相同的载体从储备液配制稀释溶液。全身辐射和试验设计
用68 Mark I Shepherd Cesiμm辐照器以519拉德(5.19戈瑞)照射小鼠。将KGF-2Δ33每天皮下施用，从照射前2天开始，并在照射后持续7天。每天记录所有小鼠的体重。让各组小鼠随机接受下列三种治疗之一：全身照射(total body irradiation，TBI)加缓冲液，TBI加KGF-2Δ33(1mg/kg sq)，TBI加KGF-2Δ33(5mg/kg sq)。进行2个独立的试验。结果
用照射过的动物完成2项研究。在第一项研究中，用519拉德(5.19戈瑞)照射动物。在照射前2天，用缓冲液或1和5mg/kg(s.q.)KGF-2Δ33处理动物，此后每天处理，持续7天。在全身照射后第25天，缓冲液组中的动物有1/5存活。相比之下，KGF-2处理组中，1mg/kg组有5/5动物存活，5mg/kg组有4/5动物存活(图44)。
另外，在TBI后第20天，KGF-2处理的动物体重分别增加了0.9％和5.3％。相比之下，在第20天，缓冲液处理组动物的体重减轻了4.2％。在相同的时间内，正常的未照射的年龄匹配的对照动物，体重增加了6.7％(图45)。
在第二项研究中的动物也用519拉德(5.19戈瑞)照射。在照射前2天，用缓冲液或1和5mg/kg(s.q.)KGF-2Δ33处理动物，此后每天处理，持续7天。在全身照射后第15天，缓冲液组中的动物全部死亡。施用1mg/kgKGF-2的动物组中有30％存活，施用5mg/kg KGF-2的动物组中有60％存活。在TBI后第25天，施用1mg/kg KGF-2的组有20％动物存活，施用5mg/kg KGF-2的组有50％动物存活(图46)。结论
总之，这些结果表明在TBI后，KGF-2有保护作用。KGF-2提高经TBI后之动物的存活率的能力表明KGF-2在辐射诱导的损伤中是有用的，而且在恶性肿瘤的治疗中可提高辐射的治疗率。
                      实施例24用小鼠皮炎TPA模型评估KGF-2
为了证实KGF-2可减弱接触性皮炎的发展，使用十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)诱导的小鼠皮炎模型。在试验性皮炎中利用雌性BALB/c和雄性Swiss Webster小鼠是接触性皮炎已被很好地表征过的、相关的且可重复的模型。在局部施用TPA后，这些小鼠品系会产生长期炎性反应，所述炎性反应包括局部血液动力学，血管渗透性和白细胞的局部迁移，这些病理学变化与人皮炎症状相似(Rao等，1993，炎症，17(6)：723；Rao等，1994，J.Kipid Mediators Cell Signalling，10：213)。
局部施用TPA(4μg/耳，耳的内外表面各10μl)的丙酮溶液(200μg/ml)后60分钟，给小鼠组腹膜内、皮下或静脉内施用载体或KGF-2。对照组接受20μl丙酮作为局部给药。施用TPA 4小时后，测量耳厚度的增加，并将耳切下进行组织学分析。为了确定血管渗透性对TPA的反应，在局部施用TPA后的选定时间，通过尾静脉给小鼠静脉内注射埃文氏蓝(Evans blue)(300mg/kg)，15分钟后，杀死小鼠。切下耳，取下来，再用二甲基甲酰胺提取并离心。用分光光度计测量590nm的吸收值。
                      实施例25KGF-2Δ33在伤口愈合中的作用
以开始的体外数据为基础，检测KGF-2Δ33在皮肤中的生物学作用，所述体外数据证实了KGF-2具有刺激初级人表皮角质形成细胞和已用FGFR同工型2iiib转染的鼠原B BaF3细胞的能力。进行初步试验以确定真皮内施用后KGF-2Δ33的生物学作用。真皮内研究后，用各种伤口愈合模型(包括全层皮打孔器活检伤口和切割伤口)研究KGF-2Δ33以确定其作为伤口愈合剂的潜力。KGF-2Δ33在糖皮质激素损害的大鼠伤口愈合模型中的作用
伤口愈合受损是与各种疾病如糖尿病有关的一个重要临床问题，它是全身性施用类固醇或抗代谢产物导致的并发症。已知在人和组织修复的动物模型中全身性地施用糖皮质激素进行治疗会损害伤口愈合。在施用糖皮质激素后，已经观察到循环中的单核细胞水平有所降低，前胶原合成受到抑制。因此，愈合的炎症期和基质合成是与组织修复的复杂过程有关的重要因素。在本发明研究中，用大鼠全层皮切割的皮肤伤口评估了多次局部施用KGF-2的效果，在所述大鼠中，已全身性施用甲基氢化泼尼松而损害了愈合。
在Sprague Dawley大鼠(n＝5/治疗组)背部产生8mm的伤口，并接受甲基氢化泼尼松(17mg/kg，肌肉内)以损害愈合。每天用50μl体积的缓冲液或0.1，0.5和1.5μg KGF-2局部处理伤口。用校正的Jameson测径器在第2、4、6和8天测量伤口。在第6天(数据未列出)和第8天(图47)，与缓冲液对照组相比，KGF-2处理组的伤口闭合在统计学上显著减小。在糖尿病小鼠模型中KGF-2Δ33对伤口愈合的影响
用6mm活检打孔器在6周龄体重为30-35g的遗传性糖尿病纯合雌性(db+/db+)小鼠(n＝6)背部打出一全层皮伤口。将伤口敞开，每天用安慰剂或0.1，0.5和1.5μg KGF-2处理。用Jameson测径器测量伤口的闭合。在第10天，对动物实行安乐死并收集伤口进行组织学分析。
与安慰剂处理组或未处理组相比，0.1μg KGF-2可显著提高伤口闭合百分比(p＝0.02)。与安慰剂处理组或未处理组相比，施用0.1μg KGF-2可提高组织学分数(p＝0.03)，与未处理组相比，施用0.5μg(p＝0.01)和1.5μg(p＝0.05)也可提高组织学分数。结论
以上述结果为基础，在受到损害的条件下如施用糖皮质激素和患有糖尿病的情况下，KGF-2有显著的活性。因此，KGF-2在临床上可用来刺激手术后的伤口愈合，用于刺激糖尿病患者或循环不良患者的慢性溃疡(例如静脉功能不全和静脉溃疡)、灼伤和其它异常伤口愈合疾病如尿毒症、营养不良、维生素缺乏症以及用类固醇和抗肿瘤药物进行全身性治疗产生的异常伤口愈合疾病的愈合。
                        实施例26KGF-2Δ33对口腔粘膜的作用
临床使用的细胞毒性试剂有不合适的作用，即它们可抑制某些部位正常上皮例如口腔粘膜的增殖，从而在粘膜屏障引起威胁生命的紊乱。我们已经进行了研究以确定KGF-2在所述临床区的效力。在粘膜炎模型中，数据说明KGF-2有治疗作用。KGF-2Δ33对仓鼠口腔粘膜的作用
我们着手确定KGF-2是否可诱导正常口腔粘膜上皮的增殖。用雄性Golden Syrian仓鼠评估KGF-2在口腔粘膜中的作用。每天用缓冲液或KGF-2Δ33(0.1，1和10μg/颊)，以100μl/颊的体积局部施用于被麻醉的仓鼠的颊部从而处理仓鼠的颊囊。将所述化合物与颊接触最少60秒然后咽下。处理7天后，按上述方法给动物注射BrdU并杀死。用抗BrdU抗体标记增殖中的细胞。图48表明，当用1μg和10μg KGF-2Δ33处理动物时，BrdU标记有显著增加(细胞增殖)(与缓冲液处理相比)。
用KGF-2局部处理诱导了正常粘膜上皮细胞的增殖作用。基于这些结果，可将KGF-2临床上用于避免因任何化疗剂(或其它毒性药物方案)、辐射治疗或化疗-辐射治疗组合引起的口腔粘膜炎。另外，KGF-2可用作治疗试剂，它可减轻因毒性试剂(化疗)或放射疗法而造成的口腔粘膜损伤的严重性。
                        实施例27KGF-2Δ33对大鼠局部缺血伤口愈合的作用
本实施例所列试验的目的是用局部缺血伤口愈合模型，确定KGF-2在伤口愈合中的效力。
通过增加一个全层皮随机肌皮带状瓣(3×4cm)而部分地阻碍局部皮肤的血液供应。在局部皮肤上产生全层皮伤口，该伤口由该肌皮瓣组成。使用60只成年Sprague-Dawley大鼠，并将其随机分成KGF-2Δ33治疗组和安慰剂组以用于该研究(5只动物/组/时间点)。分别在创伤后第1、3、5、7、10和15天收集伤口。
在创伤后第10天和15天前，KGF-2和缓冲液处理组之间的伤口抗断强度均没有显著差异。
结果表明，在创伤后10天之后，在局部缺血的伤口修复中，KGF-2可显著提高伤口抗断强度。这些结果还说明，与以前在正常伤口愈合中得到的数据相比，在这两组中局部缺血延迟了愈合过程。
所述肌皮瓣模型提供了有关因静脉血回流而引起的局部缺血情况的数据和资料。这些结果说明KGF-2可用于治疗因静脉血回流受损和/或静脉功能不全而引起的慢性静脉性腿溃疡。
                              实施例28评估KGF-2在大鼠结肠吻合术中的愈合效果
本发明试验的结果说明在Wistar或Sprague Dawley大鼠的肠或结肠吻合术模型中，KGF-2Δ33可提高肠修复的速率。另外，可用该模型说明KGF-2和其同工型具有提高胃肠或结肠壁与缝线结合的能力。
在试验性吻合术中使用大鼠是一个已很好地表征过的、外科手术伤口愈合中相关的并可重现的模型。该模型还可用于研究在结肠和小肠中，长期类固醇治疗或各种化疗方案对手术伤口愈合质量和愈合速率的影响(Mastboom，W.J.B.等，英国外科手术杂志，78：54-56(1991)；Salm，R.等，外科肿瘤学杂志，47：5-11(1991)；Weiber，S.等，欧洲外科手术研究，26：173-178(1994))。吻合术的愈合与身体其它部位的伤口愈合相似。愈合早期的特征是有急性炎症，随后成纤维细胞增殖并有胶原合成。胶原逐渐定型，伤口由于新胶原的合成而变坚固(Koruda，M.J.和Rolandelli，R.H.，外科手术研究杂志，48：504-515(1990))。大多数术后并发症如吻合泄漏都发生在手术后的最初几天--在此期间结肠的强度主要通过伤口边缘固定缝线的能力来保证。已经报道在手术后的最初几天，胃肠道固定缝线的能力降低了80％(Hogstrom，H.和Haglund，U.，Acta Chir.Scand.151：533-535(1985)；Jonsson，K.等，美国外科手术杂志，145：800-803(1983))。
肌肉内联用氯胺酮(50mg/kg)甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉大鼠。在皮肤消毒、手术过程中和手术后整个过程中均将动物保持于加热的垫上。将腹腔切开一4cm长的中线切口。切除距离腹膜反射区(peritoneal reflection)3厘米的1厘米宽的左结肠段，同时保留边缘血管。完成单层端-端吻合术，使用8-0聚丙烯纺织纤维反转缝线，缝8-10针以保持肠的连续性。肌肉层用3-O连续丝线缝合切割伤口，皮肤用外科夹子闭合。每天对每只动物进行临床评估，包括个体体重，体温和食物消费情况。
手术后，立即每天皮下、局部、腹膜内、肌肉内、胃内或结肠内施用KGF-2Δ33和安慰剂，并一直持续至第7天将动物杀死时。有未处理对照、安慰剂组和KGF-2Δ33组。安乐死前2小时，经腹膜内注射给动物注射100mg/kg BrdU。最后一次处理(第5天)后24小时，对动物实行安乐死。在前腹膜壁切割一中线伤口，取出1厘米长的结肠片段，包括实行吻合术的片段。取出手术位点的第三段片段用于总胶原分析。
在两个试验中，将雄性成年SD大鼠(n＝5)麻醉并用6-0聚丙烯纺织纤维反转缝线，缝8-10针以完成远端结肠的单层端-端吻合术。在吻合位点用注射器局部施用缓冲液或1和4μg KGF-2Δ33。然后每天将缓冲液或浓度为1mg/kg或5mg/kg的KGF-2Δ33腹膜内施用给动物。在第5天对动物实行安乐死，切下结肠并用液氮骤冷，冻干并进行胶原分析。胶原浓度表示为μg胶原/mg组织干重。用非成对t检验完成统计学分析。平均值±SE。在第5天，将大鼠麻醉并进行钡灌肠，然后进行放射照相分析。对这两个试验的端-端左结肠吻合术的钡灌肠放射学评估表明用1mg/kg和5mg/kg KGF-2处理的动物，其腹膜泄漏有一致的减少。该数据列于下表。另外，用张力计检测手术位点的抗断强度。在KGF-2Δ33处理组和缓冲液组之间未观察到显著差异。如图49所示，相对于缓冲液对照组，施用1mg/kg KGF-2Δ33(p＝0.02)和5mg/kg KGF-2Δ33(p＝0.004)后，在手术位点的胶原含量显著增加。
                         表
                   结肠吻合术放射学分析
组                 粪便量         吻合处的收缩*     腹膜泄漏
未处理组           50％           2.0                75％
(n＝8)
缓冲液组           57％           1.0                50％
(n＝7)
KGF-2Δ33[1mg/kg]  50％           1.3                37％
(n＝8)
KGF-2Δ33[5mg/kg]  77％           1.6                11％
(n＝9)
*吻合的收缩分数：0-没有收缩；1-5最小至严重收缩
肌肉内联用氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉成年SD大鼠(n＝5)。将腹腔切开一4cm长的中线切口。切除靠近腹膜反射(peritonealreflection)3cm的1厘米宽的左结肠段，同时保留边缘血管。完成单层端-端吻合术，使用8-10间断的6-0聚丙烯纺织纤维反转缝线以恢复肠的连续性。然后通过注射器用缓冲液或浓度为1μg和4μg的KGF-2局部处理吻合处。肌肉层用3-O连续丝线缝合切割伤口，皮肤用外科夹子闭合。然后每天将缓冲液或浓度为1mg/kg或5mg/kg的KGF-2Δ33皮下施用给动物。手术后当天给动物称重并此后每天称动物的体重。在最后一次处理(第5天)后24小时，动物实行安乐死。麻醉动物并使动物接受钡灌肠，从固定的距离进行X-射线分析。然后切下吻合处以进行组织病理学和生物机械分析。
                           实施例29用炎性肠疾病模型评估KGF-2
KGF-2是一种体外可诱导角质形成细胞增殖并且在体内对各种伤口愈合模型有活性的蛋白质。本研究的目的是确定KGF-2在鼠结肠炎模型中是否是有效的，所述结肠炎是由于无限制地与饮用水中的葡聚糖硫酸钠接触而诱发的。
在炎性肠疾病模型中，使用6-8周龄的雌性Swiss Webster小鼠(20-25g，Charles River，Raleigh，NC)，所述炎性肠疾病是无限制地施用4％葡聚糖硫酸钠(DSS，36,000-44,000MW，American InternationalChemistry，Natick，MA)一周而引发的。每天非肠道地施用KGF-2(n＝10)。用三种参数确定效力：1)临床分数，以对粪的评估为基础；2)组织学分数，以对结肠的评估为基础；和3)体重变化。临床分数由两部分组成，总最高分为4分。将粪便的坚松度记为：0＝坚固；1＝松；2腹泻。同样以0-2级评估粪便中的血液情况，0＝无血；1＝隐约有血；2＝大量直肠出血。组内平均分数在3分以上表明可能致死，而且疾病已经发展至不可治疗的阶段。在第0、4、5、6和7天记录临床分数。为了得到组织学分数，以基于炎症分数(0-3)和隐窝分数(0-4)的盲方式评估上升段、横行段和下降段结肠的玻片。每天称量体重。将数据表示为平均值±SEM。用非成对的Student’s t检验确定与疾病对照之间的显著差异(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)。
当每天给DSS处理的小鼠腹膜内(IP)施用剂量为1，5或10mg/kg的KGF-2Δ33，施用7天后，KGF-2显著降低了临床分数，即分别降低了28％，38％和50％。组织学评估与临床分数的剂量依赖性抑制作用非常平行，施用1，5和10mg/kg KGF-2Δ33，将组织学分数分别显著降低了26％、48％和51％。KGF-2还显著降低了与DSS诱发的结肠炎有关的体重减轻。
在第二项研究中，比较每天腹膜内或皮下施用KGF-2Δ33的相对效力。在第7天试验结束时，腹膜内注射KGF-2的动物，其临床分数降低了34％，而皮下注射KGF-2的动物，降低了46％。相比于DSS对照，皮下给药也显著地降低了体重减轻的程度。基于临床分数和体重的测量，皮下施用KGF-2至少与腹膜内施用一样有效。
                          实施例30KGF-2Δ33对正常膀胱和前列腺及环磷酰胺诱发的大鼠出血性膀胱炎的影响
本实施例证明KGF-2Δ33能够刺激正常大鼠膀胱增殖，并且KGF-2Δ33在环磷酰胺诱导的出血性膀胱炎大鼠模型中有治疗作用。
临床上使用的某些细胞毒性剂具有副作用，如导致膀胱中正常上皮增殖的抑制，造成潜在的致命性溃疡及膀胱被覆上皮的破坏。环磷酰胺作为一种细胞毒性剂，其引起某些病人的出血性膀胱炎——一种严重的并且有时是致命性的并发症。有或没有膀胱炎时也可发生膀胱的纤维变性。这种损伤被认为是由于尿中排出的环磷酰胺代谢产物引起的。环磷酰胺引起的血尿一般可持续几天，也可能长期存在。有些严重病例需要进行药物或外科手术治疗。严重的出血性膀胱炎须中断环磷酰胺治疗。另外，在环磷酰胺治疗的两年内和以前已有过出血性膀胱炎的病人可发生膀胱癌(Cytoxan(环磷酰胺)包装内插页)。环磷酰胺对前列腺和雄性生殖系统有毒性作用。环磷酰胺治疗可导致不孕的发展，并导致一定程度的睾丸萎缩。KGF-2Δ33对正常膀胱、睾丸和前列腺的影响
实验设计
这些研究中使用雄性Sprague-Dawley大鼠(160-220g)(n＝4-6只/治疗组)。以5mg/kg/天的剂量施用KGF-2Δ33。每天腹膜内或皮下注射重组KGF-2Δ33或缓冲液(40mM乙酸钠+150mM NaCl，pH6.5)，连续1-7天，然后次日处死动物。为了检查KGF-2Δ33诱导的作用的可逆性，另一些动物每天腹膜内注射KGF-2Δ33或缓冲液共7天，再经过7天无处理阶段后处死动物。
处死动物这一天，给大鼠腹膜内注射100mg/kg Brd U。2小时后给大鼠过量吸入乙醚并除去动物的某些器官。将组织样品放在10％中性缓冲的福尔马林中固定24小时并用石蜡包埋。为了检测复制细胞中的Brd U掺入量，将组织切成5μm切片，并使用小鼠抗Brd U单克隆抗体和ABCElite检测系统进行组织化学检查。用苏木精轻微负染组织切片。
由不知情的观察者读片。对于前列腺，以10×放大倍数，每个动物随机计数10个视野中的增殖细胞数。为了估计KGF-2Δ33对膀胱的作用，制备这些组织的横断切片，并以20×放大倍数计数10个随机视野中的增殖和未增殖细胞数。结果以标记细胞比未标记细胞的百分数表示。数据表示为平均数+SEM。用Stat View Software Package软件进行统计学分析(两尾未配对T检验)，并将统计学显著性限定为p＜0.05。
结果
膀胱
腹膜内注射KGF-2Δ33 7天期间(黑方块，图52)诱导了膀胱上皮细胞的增殖，但这没有影响器官的重量。皮下给药引起增殖数小量增加，但这没有达到统计学的显著差异(黑圈，图52)。前列腺和睾丸
皮下(sc)和腹膜内(ip)施用KGF-2Δ33诱导了前列腺的显著增殖(图53)，但2次注射后变为正常。长期用KGF-2Δ33腹膜内注射治疗没有增加前列腺或睾丸的重量。KGF-2Δ33对环磷酰胺诱发的出血性膀胱炎的作用
实验设计
以1或5mg/Kg的浓度通过尾静脉给雄性Sprague Dawley大鼠(300-400g)(n＝5/组)注射KGF-2Δ33或缓冲液安慰剂，24小时后腹膜内注射环磷酰胺200mg/Kg。最后1天，即注射环磷酰胺后48小时，给大鼠腹膜内注射100mg/Kg Brd U。2小时后，用CO2吸入法杀死动物。以向腔内直接注射10％福尔马林方法固定膀胱，并用福尔马林淋洗膀胱外部。5分钟后，取出膀胱和前列腺。将膀胱和前列腺石蜡包埋，制成横切片，并用H&E和小鼠抗Brd U单克隆抗体染色。使用下列记分系统估计尿路上皮损伤的程度：由两个独立的观察者对膀胱损伤分级，描述尿道上皮损失程度(记为尿道上皮损失0,25％、50％、75％和100％)。此外，以每切片10个随机部位测定膀胱壁的厚度，表示为μm。
结果
肉眼观察
在用安慰剂和环磷酰胺处理的大鼠中，膀胱粗厚且紧硬。注射10％福尔马林后，膀胱很少膨胀。但在KGF-2Δ33处理组，直接注射福尔马林后膀胱有较大弹性，表明纤维变性程度较小。
显微镜观察
膀胱
图54显示KGF-2Δ33预处理对膀胱溃疡形成程度的影响。用盐水腹膜内处理的正常大鼠(盐水对照组)中，膀胱组织学上表现正常，没有观察到尿道上皮的溃疡形成。腹膜内施用200mg/Kg环磷酰胺导致膀胱上皮溃疡形成，占总上皮面积的25-50％(平均37％)。施用环磷酰胺24小时前注射KGF-2Δ33，与施用环磷酰胺前用安慰剂处理的动物相比，显著地降低了溃疡程度(1mg/Kg，0.4％，p＝0.0128；5mg/Kg，5％，p＝0.033)。
图55显示KGF-2Δ33对膀胱壁(包括上皮、平滑肌层和浆膜表面)厚度的影响。在只用缓冲液处理的组中，膀胱壁厚度约为40μm。用环磷酰胺处理使膀胱壁厚度增加5倍，至210μm。KGF-2Δ33预处理环磷酰胺治疗的动物可显著地抑制环磷酰胺对膀胱壁的增厚作用(1mg/Kg98.6μm(p＝0.007)；5mg/Kg 52.3μm(p＜0.0001))。
前列腺
与正常动物相比，可见接受缓冲液和环磷酰胺的大鼠前列腺(腺泡)明显萎缩，并伴有胞间隙增大和显著水肿。此外，观察到前列腺的上皮细胞层变短，而且不如相应的正常前列腺组织致密。用1mg/Kg和5mg/KgKGF-2Δ33预处理则前列腺呈现正常的组织学外观。未观察到胞间隙增大或水肿，而且前列腺上皮被复细胞大小和密度与正常前列腺组织相似。
结论
结果证明KGF-2可特异性地诱导膀胱上皮细胞和前列腺被覆上皮细胞的增殖。结果还证明KGF-2可特异性地显著降低环磷酰胺诱发之出血性膀胱炎溃疡发生的程度。
                        实施例31KGF-2对正常大鼠细胞增殖的影响前言
KGF-2，FGF家族的一员，诱导正常人和大鼠角质形成细胞的增殖。它与KGF-1(FGF家族的一员)大约有57％的同源性。已报道KGF可诱导许多器官上皮细胞的增殖(Housley等，角质形成细胞生长因子诱导肝细胞和大鼠整个胃肠道上皮细胞的增殖。J Clin Invest 94：1764-1777(1994)；Ulich等，角质形成细胞生长因子在体内是II型肺细胞的生长因子。J Clin Invest 93：1298-1306(1994)；Ulich等，角质形成细胞生长因子是体内乳房上皮细胞的生长因子。哺乳期大鼠对角质形成细胞生长因子的作用有抗性。Am J Pathol 144：862-868(1994)；Nguyen等，角质形成细胞生长因子在转基因小鼠胚胎肝中的表达引起上皮生长的变化和导致多囊肾和其它器官畸形的分化。致癌基因12：2109-2119(1996)；Yi等，角质形成细胞生长因子诱导胰管上皮细胞的增殖。Am J Pathol 145：80-85(1994)；和Yi等，角质形成细胞生长因子在体内引起尿道上皮细胞的增殖。J Urology 154：-1566-1570(1595))。我们用KGF-2进行了类似实验，确定利用皮下和腹腔途径系统给药时它是否诱导大鼠正常上皮细胞的增殖。方法：
雄性Sprague Dawley大鼠，体重160-220g，获自Harlan SpragueDawley，用于这些研究。KGF-2Δ33(HG03411-E2)给药剂量为5mg/kg/天。每天通过腹腔或皮下注射KGF-2Δ33或重组缓冲液(40mM乙酸钠+150mMNaCl，pH6.5)，持续1-7天，次日处死大鼠(见下文)。为检查KGF-2Δ33诱导作用的可逆性，另外的动物每天腹膜内注射KGF-2Δ33或缓冲液，并在不给药7天后处死。
在处死当天，给大鼠腹膜内注射100mg/kg BrdU。两小时后，给大鼠服用过量乙醚并取出选定的器官。组织样品用10％中性缓冲福尔马林固定24小时并用石蜡包埋。为检测增殖细胞中BrdU的掺入，用小鼠抗-BrdU单克隆抗体(Boehringer Mannheim)和ABC Elite系统(载体实验室)对五微米切片进行免疫组化方法处理。用溶血毒素对这些切片进行轻度复染。
由不明详情的观察者观测切片。对每只动物的下列组织放大10倍计数10个随机视野的增殖细胞数：肝脏、胰腺、前列腺和心脏。10个随机视野也用于肺部分析，只是放大20倍对增殖进行定量。由于肾脏有许多功能不连续的区域，用取自每只动物一个肾脏的中心的冠状横切片来评定增殖。为评定KGF-2Δ33在食管和膀胱中的作用，制备了这些组织的横切片，分别放大10倍和20倍在10个随机视野计数增殖和非增殖的细胞数。结果以标记细胞对非标记细胞的百分比来表示。
数据表示为平均数±SEM。用StatView Software Package(AbacusConcepts，Inc.，Berkeley，CA)进行统计学分析(双尾非配对t检验)，统计学显著性定义为p＜0.05。结果
图56显示了总的实验流程。每组使用6只动物。然而在不明详情的观察者分析的过程中，BrdU的注射有时候是不成功的。在对结果编码之前，116只大鼠有8只大鼠的数据(或7％的动物)被从研究中排除，产生组的大小列于下表。这些研究中使用的组的大小
                                                    n＝处理            时间             腹膜内(ip)        皮下(sc)KGF-2Δ33       1天              6                 5缓冲液          1天              6                 6KGF-2Δ33       2天              6                 4缓冲液          2天              6                 6KGF-2Δ33       3天              5                 5缓冲液          3天              5                 5KGF-2Δ33       7天              6                 6缓冲液          7天              6                 5KGF-2Δ33       7天+不处理的7天  6                 ND缓冲液          7天+不处理的7天  6                 ND
肝脏：当腹膜内给药时，注射1针后KGF-2Δ33诱导肝细胞(实心方块)(图57)的快速增殖，并且这种增加的有丝分裂活性持续3天，每天注射7天后恢复正常。与腹膜内注射KGF-2产生的戏剧性效果相反，当皮下给药时(实心方块，图57)，证明该生长因子作用较小。在处理一天后增殖增加，但在每天注射两天后返回正常。
胰腺：与腹膜内注射KGF-2Δ33对肝脏产生的快速逆转效果相反，这种注射在研究的14天内诱导胰腺的持续增殖(实心方块，图58)。令人惊奇地是，皮下施用KGF-2Δ33(实心圆圈)不能在任何时间点诱导增殖。
肾脏和膀胱：无论通过皮下还是腹腔途径，KGF-2Δ33都诱导肾上皮细胞的增殖，但前者诱导的效果更强。皮下给药诱导快速的增殖(实心圆圈)，2天后达到高峰，然后每天处理7天后返回正常(图59)。当KGF-2Δ33通过腹膜内给药时(实心方块)有适度的增殖，但只在第2和3天看到增殖的显著增加。在研究的7天时间内，腹膜内注射KGF-2Δ33也诱导膀胱上皮细胞的增殖(实心方块，图52)。皮下给药引起低增殖，但没有达到统计学显著性(实心圆圈，图52)。
前列腺：皮下和腹膜内注射KGF-2Δ33都诱导前列腺的显著增殖(图53)，但注射两针后又变正常。
食管：皮下或腹膜内注射KGF-2Δ33引发食管细胞增殖的早期短时间增加(分别为1和2天)，很快恢复正常(结果未列出)。
其它器官：KGF-2Δ33通过腹膜内和皮下途径系统给药，在给药的7天内不能引发肺上皮细胞的增殖(结果未列出)。
讨论
当通过皮下途径给药时，我们在有些器官(肝、肾、食管和前列腺)观察到对正常上皮细胞增殖的刺激，但这些作用绝大部分是短期的，而且都是可逆转的。即使每天皮下注射KGF-2，在这些器官的增殖也会逆转。
给药途径对所观察到的增殖有戏剧性的影响。每天通过腹膜内给药时，在3天内加快了肝的增殖速度，而每天通过皮下施用KGF-2时，只在处理1天后增殖速度加快。甚至更令人惊奇地是胰腺的反应。当动物通过腹腔给予KGF-2时，胰腺在研究的14天时间内显示了增殖水平的显著提高。然而，皮下给予KGF-2不能诱导胰腺的有丝分裂活性。同样，通过腹膜内途径而非皮下途径用KGF-2处理引发膀胱粘膜细胞的增殖。
腹膜内给予KGF-2引发短期的小爆发性肾增殖，集中在含有集合管的区域。每天皮下处理诱导该区域长期过度的增殖。
                           实施例32
            KGF-2Δ33气管内给药后对肺细胞增殖的影响
该实施例目的是为了显示KGF-2Δ33气管内给药后(将KGF-2Δ33直接给予肺)能够刺激正常大鼠的肺增殖。
方法：这些研究使用雄性Lewis大鼠(220-270g)，(n＝5/处理组)。KGF-2Δ33或安慰剂(40mM乙酸钠+150mMNaCl，pH6.5)通过气管内给药，剂量为1mg/kg和5mg/kg，体积为0.6ml，然后给予3ml空气。在实验流程第1天和第2天进行处理。
在第3天，即处死当天，给大鼠注射100mg/kg BrdU。两个小时后用CO2窒息杀死大鼠。通过气管用10％缓冲福尔马林使肺膨胀，箭头形的肺切片用石蜡包埋。为检测增殖细胞中BrdU的掺入，用小鼠抗-BrdU单克隆抗体和ABC Elite系统对五微米切片进行免疫组化方法处理。用溶血毒素对这些切片进行轻度复染。
由不明详情的两名观察者观测切片。对每个切片放大20倍计数10个随机视野的增殖细胞数。结果用每个视野BrdU阳性的细胞数表示。数据表示为平均数±SEM。用Instat v2.0.1进行统计学分析(非配对t-检验)，统计学显著性定义为p＜0.05。
结果：气管内注射1mg/kg和5mg/kg KGF-2Δ33导致肺上皮细胞增殖的加速，如图60所示。KGF-2Δ33处理导致BrdU阳性细胞数/视野统计学的显著性增加，相对于缓冲液对照每个视野1.58个细胞，1mg/kg为23.4个细胞/视野(p＝0.0002)，5mg/kg为10.3个细胞/视野(p＝0.0003)。
                           实施例33
                   在感染切割伤局部的KGF-2
伤口细菌感染一直具有很大的临床重要性。在正常情况下，伤口愈合的复杂过程进行顺利。然而，对伤口接种细菌后引起炎症反应中细胞中介体的不平衡，导致伤口愈合的延迟。开放伤口的污染抑制了伤口愈合过程，特征为减少了伤口收缩，伤口胶原蛋白的含量比正常低，并降低了拉伸强度。在第一天用氯胺酮(53mg/kg im)和甲苯噻嗪(5.3mg/kg im)麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(n+10/组)。刮削背部并用70％乙醇消毒。用无菌10号解剖刀造成一条从肩胛骨下大约1cm处开始长2.5cm的全厚度外伤(贯穿表皮、真皮到皮下层)。在切割处接种悬浮于PBS的金黄色葡萄球菌(107cfu/50μl)。在制造伤口时(第0天)表皮接种KGF-2Δ33，剂量为每个伤口0.1、1和10μg，体积为50μl。然后用可透气的(Tegaderm)覆盖。在第5天用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，然后心内给予戊巴比妥钠(300mg/kg)处死动物。切除伤口中部0.5cm长的片段，速冻用来测定胶原蛋白。另外切除宽0.5cm的两条伤口，利用Instron皮肤张力计研究破裂强度。破裂强度定义为每处创伤破裂前忍受的最大力，1l 1b负荷细胞，速率为0mm/sec。每只动物的两个值平均以提供每处创伤的平均破裂强度值。利用非配对t检验进行统计学分析(平均值±SE)。
如通过破裂强度所测量的那样，金黄色葡萄球菌在伤口切割处的使用导致伤口愈合的重大损害(在一个实验中，未感染伤口用136±6g细菌载体处理；感染伤口用87±6g处理；p＜0.0001；在另一个实验中，未感染伤口用200±14g处理；感染伤口用154±10g处理p＝0.01)。局部给予KGF-2引起破裂强度的增加，与KGF-2缓冲液+金黄色葡萄球菌对照相比，在0.1、1和10μg具有统计学显著性(在一个实验中，KGF-2 0.1μg152±16g(p＝0.002)；1μg 135±12g(p＝0.003)；10μg 158±10g(p＜0.0001)；在另一个实验中，0.1μg 185±10g(p＝0.03)；1μg 186±11g(p＝0.03)；10μg 190±7g(p+0.009))。中部0.5cm伤口的胶原蛋白分析表明在KGF-2处理的创伤中胶原蛋白的含量增加。然而，与缓冲液对照相比，在胶原蛋白上没有观察到统计学显著性。
                          实施例33
           隔日静脉注射1mg/kg KGF-2Δ33的增殖效果
给雄性Sprague Dawley大鼠静脉注射剂量为1mg/kg的KGF-2Δ33或缓冲液。每天或隔日注射动物。每个处理组注射1周并在周末处死。处死那天，给动物腹膜内注射100mg/kg BrdU。两个小时后，处死动物并采集血清。采集各种组织并在10％中性缓冲福尔马林中固定。对这些组织进行组织学评价。用溶血毒素和黄色曙红、过碘酸-希夫试剂、或爱茜蓝对组织染色。用抗BrdU的抗体对另外切片进行组织化学染色。用影像分析光谱，Iplab Spectrum对增殖进行定量。用自动化学分析仪对血清进行化学分析。对下列参数进行定量：甲状腺重量、小肠(十二指肠、空肠和回肠)杯形细胞的增殖；结肠杯形细胞的增殖；腮腺和下颌下腺的增殖；和血清化学分析指标(葡萄糖、BUN、钙、总蛋白、白蛋白、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、胆固醇和甘油三酯)。
在小肠和结肠中每天用KGF-2处理，引起杯形细胞数的显著增加。隔日处理确实引起杯形细胞数的轻度增加，但没达到显著性水平。在唾液腺中，只在腮腺观察到了细胞的增加。两处理组没有差异。两种剂量方案都使腮腺增大。这种增加程度在每天处理组中较大。用KGF-2每天处理导致下列分析指标的显著性增加：甘油三酯、碱性磷酸酶、钙、白蛋白和总蛋白。隔日处理对这些分析指标没有影响。在两个处理组中胆固醇水平都有提高。但在每天处理组中增加的程度较大。细胞伤害的标记如ALT和AST，在两个处理组有同样减少。
                          实施例34
                          配制多肽
KGF-2组合物的配制和剂量要符合好的药品实施规范，考虑个别患者的临床症状(尤其是单独用KGF-2多肽处理产生的副反应)、运送地点、给药方法、给药时间安排和实施者熟知的其它因素。因此本文所用的“有效量”由这些方面的考虑来确定。
总的来说，非肠道给药每剂量KGF-2的总药物有效量对于患者体重来说，为1μg/kg/天-10mg/kg/天，虽然如上所述，这要根据治疗的判断力。更优选地，该剂量至少为0.01mg/kg/天，对人最优选的激素量是在大约0.01和1mg/kg/天之间。如果连续给药，KGF-2典型地给药速度为大约1μg/kg/小时-50μg/kg/小时，或者通过每天注射1-4次，或者通过连续的皮下输液，例如使用微泵。也可使用静脉袋装溶液。观察到变化所需的处理时间和处理后到发生反应的时间间隔根据预期效果而变动。
含有KGF-2的药物组合物通过口服、直肠、非肠道、intracistemally、生殖道内、腹腔内、表皮(以粉末、药膏、凝胶、滴剂或透皮药贴的形式)、口颊的、或作为口鼻喷剂给药。“适用于药物的载体”指非毒性固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊形成材料或任何类型的配制辅助物。术语“非肠道”在此是指给药方式，包括静脉、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输液。
KGF-2也适合通过持续释放系统给药。持续释放组合物的合适实例，包括以成形物品形式的半透性多聚基质，例如膜或微胶囊。持续释放基质包括(美国专利No.3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和γ-乙基-谷氨酸的共聚体(Sidmen，U.等，生物多聚物(Biopolymers)22：547-556(1983))，聚(2-羟乙基异丁烯酸酯)(R.Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)，和R.Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))，乙烯乙烯基乙酸(R.Langer等)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。持续释放组合物也包括脂质体包裹的KGF-2多肽。含有KGF-2的脂质体通过本领域熟知的方法来制备：DE 3,218,121；Epstain等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP142,641；日本专利申请83-118008；U.S.Pat.Nos.4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。通常脂质体是小的单层类型(大约200-800)，其中的脂含量大于30％摩尔百分数的胆固醇，所选比例根据达到最佳分泌的多肽治疗效果来调整。
在一个实施方案中，对于非肠道给药，通常通过将KGF-2以预期纯度1单位可注射剂量的形式(溶液、悬液或乳剂)与适用于药物的载体，即使用剂量和浓度对接受者无毒性并与配方中其它成分相容的载体混合。例如，配方优选不包括氧化剂和其它已知对多肽有害的化合物。
通常通过将KGF-2与液体载体或精细打碎的固体载体或两者均匀密切地接触来制备配方。然后，如果需要，则将产物制成预期配方形式。载体优选非肠道载体，更优选与受体血液等渗的溶液。这类载体的实例包括水、盐水、Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。非水载体如固定油、油酸乙酯和脂质体在本文中也是有用的。
载体适合含有微量添加剂如促进等渗性和化学稳定性的物质。这类材料在使用剂量和浓度对接受者无毒性，包括缓冲液，例如磷酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸和其它有机酸或其盐；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量多肽(少于10个残基)，如多聚精氨酸或三肽；蛋白如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性多聚物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；平衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如多聚山梨酸酯、poloxamers或PEG。
KGF-2典型地按浓度大约为0.1mg/ml-100mg/ml，优选1-10mg/ml，pH大约为3-8在这类载体中配制。推测使用某些前述的赋形剂、载体或稳定剂将导致多肽盐的形成。
用于治疗的KGF-2能够做成无菌的。通过无菌滤膜过滤很容易达到无菌(例如0.2微米的膜)。通常将治疗性多肽放入有无菌入口的容器中，例如静注溶液袋或具有可用皮下注射针穿刺的塞子的小瓶。
KGF-2通常以水溶液或用于复原的冻干配方形式贮存在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿或小瓶。冻干配方的一个实例为10ml小瓶中填充了5ml无菌过滤的1％(w/v)KGF-2多肽水溶液，并将产生的混合物冻干。灌输液通过用抑菌的注射用水复原冻干的KGF-2多肽来制备。
本发明也提供含有填充了一种或多种本发明药物组合物成分的一个或多个容器的包装或试剂盒。与这类容器相关的是由调控药物或生物产品制造、使用或销售的政府机构发布的一个通告，该通告反映了人用药品制造、使用或销售机构的批准。另外，KGF-2可与其它治疗性化合物联合使用。
本发明的组合物可单独或与其它治疗剂联合给药。可与本发明的组合物联合给药的治疗剂包括但不限于TNF家族的其它成员，化学治疗剂、抗生素、类固醇和非类固醇的抗炎症剂、常规的免疫治疗剂、细胞因子和/或生长因子。联合给药可以为伴随给药，例如以混合物形式单独但同时或顺序给药。这包括联合药剂作为治疗性混合物一起给药的形式，也包括联合药剂单独但同时给药的程序，例如，通过单独的静脉输入同一个体。“联合给药”此外也包括先给予一种化合物或药剂，然后给予第二种。
在一个实施方案中，本发明的组合物与TNF家族的其它成员联合给药。可与本发明组合物联合给药的TNF、TNF相关的或类似TNF的分子包括但不限于TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，也称为TNF-β)、LT-β(存在于溶血毒素复合物LT-α2-β中)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(国际公布文本WO96/14328)、AIM-I(国际公布文本WO97/33899)、内分泌因子-α(国际公布文本WO98/07880)、TR6(国际公布编号WO98/30694)、OPG、和中性因子-γ(国际公布文本WO98/18921、OX40、神经生长因子(NGF)、和Fas、CD30、CD27、CD40和4-IBB的可溶性形式、TR2(国际公布文本WO96/34095)、DR3(国际公布编号WO97/33904)、DR4(国际公布文本WO98/32856)、TR5(国际公布文本WO98/30693)、TR6(国际公布文本WO98/30694)、TR7(国际公布文本WO98/41629)、TRANK、TR9(国际公布文本WO98/56892)、TR10(国际公布文本WO98/54202)、312C2(国际公布文本WO98/06842)、TR12、和CD154、CD70、CD153的可溶性形式。
可与本发明组合物联合给药的常规非特效免疫抑制剂包括但不限于类固醇、环孢菌素、环孢菌素类似物、环磷酰胺甲基强的松、强的松、硫唑嘌呤、FK-506、15-脱氧精胍菌素和通过抑制效应T细胞功能而起作用的其它免疫抑制剂。
在进一步的实施方案中，本发明组合物与一种抗菌剂联合给药。可与本发明组合物联合给药的抗菌剂包括但不限于；四环素、甲硝基羟乙唑、阿莫西林、β-内酰胺酶、氨基糖苷、大环内酯、喹诺酮、氟喹诺酮、头孢菌素、红霉素、环丙沙星和链霉素。
在另外的实施方案中，本发明组合物单独或与抗炎剂联合给药。可与本发明组合物联合给药的抗炎症剂包括但不限于：糖皮质激素、和非类固醇抗炎症剂、氨基芳香基羧酸衍生物、芳香基乳酸衍生物、芳香基丁酸衍生物、芳香基羧酸、芳香基丙酸衍生物、吡唑、吡唑酮、水杨酸衍生物、噻嗪酰胺类、乙酰氨基乙酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟丁酸、amixetrine、苄达酸、苄达酮、布可龙、双苯哌醋胺、双苯唑醇、依莫法宗、愈创蓝油烃、那布米酮、nimesulide、奥古蛋白、醋羟脯氨酸、胍苯叉芴、哌异噁唑、哌酰苯肟、丙喹酮、胺丙噁二唑、替尼达普。
在另一个实施方案中，本发明组合物与一种化疗剂联合给药。可与本发明组合物联合给药的化疗剂包括但不限于：抗生素衍生物(如阿霉素、博来霉素、道诺红菌素和放线菌素)；抗雌激素(如三苯氧胺)；抗代谢物(如5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、5-氟脱氧尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、褶皱霉素、巯基嘌呤和6-巯基鸟嘌呤)；细胞毒性剂(如亚硝基脲氮芥、BCNU、罗氮芥、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌氮芥、羟基脲、普鲁苄肼、丝裂霉素、白消安、顺式铂氨和长春花新碱硫酸盐)；激素(如甲羟孕酮、磷酸钠雌氮芥、炔雌醇、雌二醇、甲地孕酮乙酸盐、甲基睾酮、二乙基己烯雌酚二磷酸、氯烯雌醚和睾酮)；氮芥衍生物(如mephalen、chorambucil、mechlorethamine(氮芥)和硫化三磷)；类固醇及其组合物(如bethamethasone sodium phospharate)；和其它化疗剂(如dicarbazine、天冬酰胺酶、长春花新碱硫酸盐、长春花碱硫酸盐和表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)。
在另外的实施方案中，本发明组合物与细胞因子联合给药。可与本发明组合物联合给药的细胞因子包括但不限于：IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、抗-CD40、CD40L、IFN-γ和TNF-α。
在另外的实施方案中，本发明组合物与血管生成蛋白联合给药。可与本发明组合物联合给药的血管生成蛋白包括但不限于：如欧洲专利编号EP-399816中公开的胶质瘤衍生的生长因子(GDGF)；欧洲专利编号EP-682110中公开的血小板衍生的生长因子-A(PDGF-A)；欧洲专利编号EP-282317中公开的血小板衍生的生长因子-B(PDGF-B)；国际公布编号WO92/06194中公开的胎盘生长因子(PIGF)；Hauser等在生长因子(Growth Factors)，4：259-268(1993)中公开的胎盘生长因子-2(PIGF-2)；国际公布文本WO90/13649中公开的血管内皮生长因子(VEGF)；欧洲专利文本EP-506477中公开的血管内皮生长因子-A(VEGF-A)；国际公布文本WO96/39515中公开的血管内皮生长因子-2(VEGF-2)；国际公布文本WO96/26736中公开的血管内皮生长因子B-186(VEGF-B186)；国际公布文本WO98/02543中公开的血管内皮生长因子-D(VEGF-D)；国际公布文本WO98/07832中公开的血管内皮生长因子-D(VEGF-D)；德国专利文本DE19639601中公开的血管内皮生长因子-E(VEGF-E)。上面提到的参考文献引入本文作为参考。
在另外的实施方案中，本发明组合物与纤维生长因子联合给药。可与本发明组合物联合给药的纤维生长因子包括但不限于：FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。
在另外的实施方案中，本发明组合物与其它治疗或预防方案联合给药，例如放射治疗。
                          实施例35
                   治疗KGF-2水平降低的方法
本发明也涉及用于治疗体内KGF-2活性水平需要增加的个体的方法，包含给予这种个体含有有效治疗量的KGF-2或其激动剂的组合物。
而且，由于个体中KGF-2标准或正常表达水平的降低而引起的疾病可通过给予KGF-2，优选以分泌形式给予来治疗。这样，本发明也提供了一种治疗需要增加KGF-2多肽水平的个体的方法，包含给予这种个体含有增加这种个体KGF-2活性水平需要量的KGF-2的药物组合物。
例如，KGF-2水平降低的患者每天接受剂量为0.1-100μg/kg的该多肽连续6天。该多肽优选分泌形式。实施例24中提供了基于给药方式和配方的精确详细的剂量方案。
                          实施例36
                   治疗KGF-2水平增加的方法
本发明涉及治疗体内KGF-2活性水平需要降低的个体的方法，包含给予这种个体含有有效治疗量的KGF-2拮抗物的药物组合物。本发明中使用的优选拮抗物为KGF-2特异性抗体。
反义技术被用来抑制KGF-2的产生。该技术是降低KGF-2多肽(优选的为分泌形式)水平方法的一个实例，由于各种病因，如癌症。
例如，向诊断KGF-2水平异常增加的患者每天静脉注射0.5、1.0、1.5、2.0和3.0mg/kg反义多核苷酸，共21天。如果该疗法能够被很好耐受，就在7天间歇期之后重复治疗。实施例24中提供了该反义多核苷酸的配方。
                          实施例37
                   利用体外基因治疗的疗法
一种基因治疗方法是将能够表达KGF-2多肽的成纤维细胞移植给患者。通常成纤维细胞通过皮肤活检获自被试者。形成的组织放入组织培养基中并被分成小片。组织小块放在组织培养瓶的湿润表面上，大约每瓶中放10片。将瓶子倒置，密封并且放在室温过夜。室温24小时后，颠倒瓶子，组织块在瓶子底部保持固定，加入新鲜培养基(如Ham′s F12培养基，含10％FBS，青霉素和链霉素)。然后培养瓶在37℃孵育大约1周。
在这期间，每隔几天加入新鲜培养基并随后替换培养基。再培养两周后，出现成纤维细胞单层。用胰酶消化单层并放大到大培养瓶。
两侧为莫洛尼鼠类肉瘤病毒长末端重复序列的pMV-7(Kirschmrier，P.T.等，DNA，7：219-25(1988))用EcoRI和HindIII消化随后用小牛小肠磷酸酶处理。线性载体在琼脂糖凝胶上分离并用玻璃珠纯化。
可利用实施例1所阐明的分别相应于5′和3′末端序列的PCR引物扩增编码KGF-2的cDNA。优选5′引物含有EcoRI位点并且3′引物包括HindIII位点。在T4 DNA连接酶存在时一起加入等量的莫洛尼鼠类肉瘤病毒线性骨架和扩增的EcoRI和HindIII片段。产生的混合物维持在适于两片段连接的条件下。然后用连接混合物转化细菌HB101，然后该细菌铺含有卡那霉素的琼脂平板上，用来证实载体含有正确插入的KGF-2。
兼嗜性pA317或GP+am12包装细胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco’s修饰Eagles培养基(DMEM)组织培养中生长成片。然后将含有KGF-2的MSV载体加入培养基中，用载体转导包装细胞。包装细胞产生出含有KGF-2基因的感染性病毒颗粒(现在称包装细胞为生产细胞)。
将新鲜培养基加入转导的生产细胞中，随后从10cm平板成片生产细胞中收获培养基。含有感染性病毒颗粒的用过的培养基通过Millipore滤器过滤以去除脱离的生产细胞，然后用该培养基感染成纤维细胞。从亚成片的成纤维细胞平板中去除培养基并迅速用来自生产细胞的培养基替换。如果病毒滴度高，那么实际上所有的成纤维细胞被感染，不需要选择。如果滴度非常低，那么必需使用有选择标记如neo或his的逆转录病毒载体。一旦成纤维细胞被有效感染，那么就分析成纤维细胞确定是否产生KGF-2蛋白。
然后将单个或在cytodex3微载体珠上生长成片的工程化成纤维细胞移植到宿主中。
                           实施例38
                利用内源性KGF-2基因的基因治疗
根据本发明的另一种基因治疗方法涉及通过如下所述的同源重组用一个启动子控制内源KGF-2序列：例如1997年6月24日发布的美国专利编号5641670；1996年9月26日发表的国际公布编号WO96/29411；Koller等1994年8月4日，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935公布的国际公布编号WO94/12650(1989)；和Zijlstra等，自然(Nature)342：435-438(1989)。这种方法涉及存在于靶细胞但在细胞中不表达或比预期表达水平低的基因的活化。
制备含有启动子和位于启动子两侧的靶序列的多核苷酸构建体，靶序列与内源KGF-2的5′非编码序列同源。靶序列要与KGF-2的5′末端足够近，这样在同源重组时可使启动子与内源序列连接。利用PCR可扩增启动子和靶序列。优选地，扩增的启动子在5′和3′末端含有不同的限制位点。优选地，第一靶序列的3′末端与扩增的启动子5′末端含有相同限制酶位点，第二靶序列的5′末端与扩增的启动子3′末端含有相同限制酶位点。用适当的限制酶消化扩增的启动子和扩增的靶序列，随后用小牛小肠磷酸酶处理。消化的启动子和消化的靶序列在T4 DNA连接酶存在时一起加入。产生的混合物维持在适于两片段连接的条件。构建物在琼脂糖凝胶上按大小分离，然后用酚抽提和乙醇沉淀纯化。
在该实施例中，多核苷酸结构以裸核苷酸的形式通过电穿孔施用。然而，多核苷酸结构也可与便于转染的试剂如脂质体、病毒序列、病毒颗粒、沉淀剂等一起施用。这类运送方法为本领域所熟知。
一旦细胞被转染，就会发生同源重组，导致启动子与内源KGF-2序列连接。这导致KGF-2在细胞中的表达。可用免疫学染色或本领域熟知的其它任何方法检测表达。
成纤维细胞通过皮肤活检获自一个被试者。产生的组织放入DMEM+10％胎牛血清中。用胰酶消化指数生长期或稳定期早期的成纤维细胞，并用营养培养基将其从塑料表面冲洗下来。取出一份细胞悬液用来计数，剩余细胞离心。吸出上清，沉淀重新悬浮于5ml电穿孔缓冲液中(20mM HEPES pH 7.3，137mM NaCl，5mM KCl，0.7mMNa2HPO4，6mM右旋糖)。重新离心这些细胞，吸出上清，细胞重新悬浮于含有1mg/ml乙酰化牛血清白蛋白的电穿孔缓冲液中。
根据标准技术制备质粒DNA。例如，为了构建靶向KGF-2位点的质粒，用HindIII消化质粒pUC18(MBI Fermentas，Amherst，NY)。通过PCR扩增CMV启动子，其5′末端为XbaI位点，3′末端为BamHI位点。通过PCR扩增了两个KGF-2非编码序列：一个KGF-2的非编码序列用5′末端的HindIII位点和3′末端的Xba位点扩增；另一个KGF-2的非编码序列用5′末端的BamHI位点和3′末端的HindIII位点扩增。用适当的酶消化CMV启动子和KGF-2片段(CMV启动子-XbaI和BamHI；KGF-2片段1-XbaI；KGF-2片段2-BamHI)并连接在一起。产生的连接产物用HindIII消化并与HindIII消化的pUC18质粒连接在一起。
质粒DNA加入到无菌的带有0.4cm电极槽的小玻璃杯中(Bio-Rad)。DNA终浓度通常为至少120μg/ml。然后将0.5ml细胞悬液(含有大约1.5×106细胞)加入小玻璃杯中，轻轻混合细胞悬液和DNA溶液。用Gene-Pulser仪器进行电穿孔(Bio-Rad)。电容和电压分别设为960μF和250-300V。随着电压增加，细胞存活数减少，但基因组中稳定整合了导入DNA的存活细胞百分数大大增加。给定这些参数，应观察到大约14-20mSec的电击时间。
经电穿孔的细胞在室温保持大约5分钟，然后用无菌的移液管轻轻吸出小玻璃杯中的内容物。细胞直接加入到10cm平皿中的10ml预热营养培养基中(DMEM，含有15％小牛血清)并在37℃孵育。第二天，吸出培养基并用10ml新鲜培养基替换，再孵育16-24小时。
然后将工程化成纤维细胞注射到宿主中，或者单个注射或者在cytodex 3微载体珠上生长成片以后。此时成纤维细胞就可产生蛋白产物。然后可如前所述将成纤维细胞导入患者体内。
                         实施例39
                利用体内基因治疗的治疗方法
基因研究的进展已导致在人细胞中运送和表达基因的技术的开发。基因治疗的理想目标是运送正常基因以产生活性蛋白来互补内源性生产的缺乏(Gorecki，D.C.等，Arch.Immunol.Ther.Exp.45(5-6)：375-381(1997))。
参与创伤愈合和组织修复不同时期的细胞因子和生长因子编码基因之递送具有改变创伤口愈合结果的潜能(Taub，P.J.等，J.Reconst.Microsur.14(6)：387-390(1998))。生长因子或其它细胞因子cDNA用于创伤口愈合和组织修复已被广泛描述(Tchorzewski，M.T.等，J.Surg.Res.77：99-103(1998))。通过载体转移的基因可用来产生新的细胞系，鉴定移植细胞和表达生长因子或酶。基因治疗的优点之一为在病灶位点局部可获得治疗浓度的基因衍生蛋白。已表明人重组KGF-2蛋白可刺激皮肤、胃肠道和含有上皮起源细胞的其它器官的创伤愈合：使用KGF-2基因预期具有与重组蛋白相似的药理学作用。KGF-2基因可能参与和组织修复有关的事件，如细胞增殖、迁移和胞外基质的形成。
转录和翻译的cDNA已用于运送基因到目标位点。以这种方式使用的基因的一些实例包括aFGF、BMP-7(Breitbart，A.S.等，Ann.Plast.Surg.24(5)：488-495(1999))。这些细胞被接种到细胞载体上，包括可生物降解的基质(如polyglycoloic acid)、组织替代品或等同物(如人工皮肤)、人工器官、胶原来源的基质等。脂质体已用于运载cDNA。在髌韧带的愈合中研究了日本血凝病毒(HVJ)-脂质体悬液中的PDGF-BBcDNA(Nakamura等，Gene Ther.5(9)：1165-1170(1998))。基因也可通过直接注射直接运送到作用位点(如心脏)。
这样，本发明另一方面是利用体内基因治疗方法来治疗疾病。基因治疗方法涉及将KGF-2序列的裸核酸(DNA、RNA和反义RNA)导入动物中，以增加或减少KGF-2多肽的表达。KGF-2多核苷酸可连接到靶组织表达KGF-2多肽必需的启动子或任何其它基因元件上。这类基因治疗和运送技术和方法为本领域所熟知，参见如WO90/11092、WO98/11779；美国专利编号5693622、5705151、5580859；Tabata，H.等，Cardiovasc.Res.35(3)：470-479(1997)，Chao，J.等，Pharmacol.Res.35(6)：517-522(1997)，Wolff，J.A.Neuromuscul.Disord.7(5)：314-318(1997)，Schwartz B.等，Gene Ther.3(5)：405-411(1996)，Tsurumi，Y.等，Circulation 94(12)：3281-3290(1996)(引入本文作为参考)。
KGF-2多核苷酸结构可通过运送可注射材料的任何方法运送到动物细胞中，如注射到组织(心脏、肌肉、皮肤、肺、肝、小肠等)胞间隙。KGF-2多核苷酸结构可以适用于药物的液体和水样载体形式运送。
术语“裸”多核苷酸、DNA或RNA指无任何辅助、促进或有助于进入细胞的任何运送载体的序列(包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体配方、lipofectin或沉淀剂等)。
然而，KGF-2多核苷酸也可以脂质体配方运送(如那些在FelgnerP.L.等，Ann.NY Acad.Sci.772：126-139(1995)和Abdallah B.等，Biol.Cell 85(1)：1-7(1995)中所描述的)，该配方可通过本领域技术人员所熟知的方法制备。
在基因治疗方法中使用的KGF-2多核苷酸载体构建体优选地为既不会整合到宿主基因组也不会有允许复制的序列的结构。本领域技术人员已知的任何强启动子可用来驱动DNA表达。不象其它基因治疗技术，将裸核酸序列导入靶细胞的一个主要优势是多核苷酸在细胞中合成的暂时性。研究表明非复制DNA序列可导入细胞中，并提供长达六个月的目标多肽生产。
KGF-2多核苷酸结构可运送到动物的组织胞间隙。包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾脏、膀胱、胃、小肠、睾丸、卵巢、尿道、直肠、神经系统、眼、腺体和结缔组织。组织的胞间隙包含细胞间液、器官组织的网状纤维、脉管壁或房室壁的弹性纤维和纤维组织的胶原纤维之间的粘多糖基质，或包围肌肉细胞的结缔组织中或骨腔中的相同基质。循环系统的血浆和淋巴管中的淋巴液所占据的空间相似。由于下述原因，运送到肌肉组织的胞间隙为优选。它们可通过注射方便地运送到含有这些细胞的组织中。它们优先运送到持久性的、已分化的非分裂细胞中并表达，虽然可在非分化或尚未完全分化细胞如血液干细胞或皮肤成纤维细胞中获得运送和表达。体内肌肉细胞特别擅长摄取和表达多核苷酸：
对于裸KGF-2多核苷酸注射，DNA或RNA的有效剂量范围为大约0.05g/kg体重-大约50mg/kg体重。优选的剂量为大约0.005mg/kg体重-大约20mg/kg体重，更优选的剂量为大约0.05mg/kg体重-大约5mg/kg体重。当然，如普通技术人员所认为的那样，该剂量可根据注射的组织位点而变化。核酸序列的合适和有效剂量可以很容易由本领域普通技术人员并可依赖治疗的疾病和给药途径来确定。优选的给药途径为通过非肠道途径注射到组织胞间隙。然而，也可利用其它非肠道途径，如特别适合运送到肺部或支气管组织、咽喉或鼻腔粘膜的吸入气溶胶配方。此外，在血管形成术中可由该过程中使用的导管将裸KGF-2多核苷酸结构可运送到动脉。
体内肌肉注射的KGF-2多核苷酸的剂量反应效果确定如下。根据标准重组DNA技术制备用于生产编码KGF-2多核苷酸的mRNA的合适KGF-2模板DNA。可以为环状或线性的模板DNA或以裸DNA的形式或与脂质体形成复合物形式来使用。然后小鼠的股四头肌注射不同量的模板DNA。
5-6周龄雌性和雄性Balb/c小鼠通过腹膜内注射0.3ml 2.5％Avertin麻醉。在前大腿做一个1.5cm长的切口，直接暴露股四头肌。在1分钟内用1cc注射器通过27号针头将0.1ml载体中的KGF-2模板DNA从距肌肉远侧插入位点大约0.5cm处注射到膝部，深度约为0.2cm。在注射位点放置一条缝合线，用于以后定位，并用不锈钢镊子夹紧皮肤。
合适孵育时间(如7天)后，通过切下整个股四头肌来制备肌肉抽提物。对于单独股四头肌的15μm横切片，每5个取样进行组化染色的检测KGF-2蛋白表达。除了在不同时间从不同小鼠获取股四头肌。也可以相似方式检测KGF-2蛋白表达的时间过程。可通过从注射的和对照小鼠制备总细胞DNA和HIRT上清后的DNA杂交分析测定注射后KGF-2 DNA在肌肉中的持久性。上述小鼠实验结果可用来外推在人和其它动物中使用KGF-2裸DNA的合适剂量和其它治疗参数。
                           实施例40
                     KGF-2治疗炎症性肠病
在本实施例中，测定了通过系统性(鼻内)和腹腔内给予KGF-2多核苷酸对暴露于饮水中的葡聚糖硫酸钠(DSS)引起的小鼠结肠病理变化的抑制。
鼻内给药：通过钝的26号针头将编码KGF-2Δ33的多核苷酸导入麻醉的雌性Swiss webster小鼠(n＝10/组)的鼻腔，剂量为1、10或100μg多核苷酸。将对照多核苷酸给予一组独立的小鼠。鼻内给予多核苷酸5天后，将5％DSS加入饮水中。监测小鼠的体重、血细胞比容和粪便评分。暴露于饮水中的DSS 7天后，处死小鼠。进行结肠和小肠的组织病理评估。RT-PCR分析确定肝、脾和结肠中KGF-2的表达。
腹腔内给药：在0天和3天将编码KGF-2Δ33的多核苷酸通过钝的26号针头腹膜内注射雌性Swiss webster小鼠(n＝10/组)，剂量为1、10或100μg多核苷酸。将对照多核苷酸给予一组独立的小鼠，使用相同的给药方案。在第7天，将5％DSS加入饮水中。监测小鼠的体重、血细胞比容和粪便分数。在第14天处死小鼠。进行结肠和小肠的组织病理评估。RT-PCR分析确定肝、隔膜和结肠中KGF-2的表达。
本实施例所描述的研究测试KGF-2Δ33多核苷酸的活性。然而，本领域技术人员可以很容易对所举例的研究进行改动，以测试其它KGF-2多核苷酸的活性，包括全长和成熟的KGF-2、KGF-2Δ28和编码KGF-2的77-208、80-208和93-208位氨基酸的多核苷酸；和KGF-2多肽、变异体、片段、激动剂和/或拮抗物以及这里描述的任何KGF-2突变体。
                          实施例41
                    KGF-2治疗眼表面疾病
在本实施例中，测定结膜下给予Δ33 KGF-2多核苷酸对大鼠结膜、角膜和泪腺的作用。
将编码Δ33 KGF-2的多核苷酸注射到麻醉的雌性Sprague Dawley大鼠(150-200g体重，6只/处理组)的结膜下间隙，剂量为1、10或100μg。将对照多核苷酸以相似方式注射一组独立的对照大鼠。在注射后3、7和14天处死各组大鼠。在安乐死之前30分钟，将BrdU注射到一些大鼠腹腔。取出眼和周围组织进行组织学分析。测量角膜、结膜和泪腺上皮细胞中BrdU掺入的程度。评价角膜和结膜上皮层的厚度。测量结膜中杯形细胞的数目。
本实施例所描述的研究测试KGF-2Δ33多核苷酸的活性。然而，本领域技术人员可以很容易对所举例的研究进行改动，以测试其它KGF-2多核苷酸的活性，包括全长和成熟的KGF-2、KGF-2Δ28和编码KGF-2的77-208、80-208和93-208位氨基酸的多核苷酸；和KGF-2多肽、变异体、片段、激动剂和/或拮抗物以及这里描述的任何KGF-2突变体。
                          实施例42
              KGF-2治疗唾液腺功能失调
在本实施例中，测定KGF-2多核苷酸注射到正常大鼠腮腺唾液腺导管的舌乳头中对腺管和腺泡上皮细胞的作用。
雌性Sprague Dawley大鼠(150-250g，6/组)通过肌肉注射氯酮胺和甲苯噻嗪麻醉。使用30号钢针将编码Δ33 KGF-2的多核苷酸导入腮腺唾液腺的舌乳头，剂量为1、10或100μg。多核苷酸灌注时间为10分钟，速度每分钟1μl。将对照多核苷酸给予一组独立的大鼠。在灌注后3、7和14天处死各组大鼠。在安乐死之前30分钟，腹膜内注射BrdU。称量唾液腺的重量，在组织切片上计数BrdU染色细胞数。在一个独立的实验中，在灌注后第7天测量用毛果碱刺激的大鼠的唾液分泌。
本实施例所描述的研究测试KGF-2Δ33多核苷酸的活性。然而，本领域技术人员可以很容易对所举例的研究进行修饰，以测试其它KGF-2多核苷酸的活性，包括全长和成熟的KGF-2、KGF-2Δ28和编码KGF-2的77-208、80-208和93-208位氨基酸的多核苷酸；和KGF-2多肽、变异体、片段、激动剂和/或拮抗物以及这里描述的任何KGF-2突变体。
                          实施例43
                    KGF-2治疗皮肤创伤愈合
在本实施例中，测定KGF-2多核苷酸在正常大鼠和糖尿病小鼠中刺激创伤愈合的能力。
正常大鼠：用8mm活检穿刺针对麻醉的雌性Sprague Dawley大鼠(175-250g，6只/处理组)造成创伤。沿着伤口在四个不同位点皮内导入Δ33KGF-2多核苷酸(1、10或30μg)。将对照多核苷酸以相似方式给予一组独立的大鼠。用无菌通气布垫覆盖伤口。放好布垫以后，在大鼠的上腹部缠上防水胶带。在形成创伤以后第2和5天处死各组大鼠。受伤组织用10％福尔马林固定，石蜡包埋。测量原有增殖上皮细胞和新生表皮中BrdU的掺入以及新生上皮叶舌的长度和厚度。
糖尿病小鼠：在糖尿病小鼠(db+/db+，10只/处理组)和非糖尿病小鼠(db+/m+，10只/处理组)的背部产生6mm穿孔伤。沿着伤口在四个不同位点皮内导入Δ33 KGF-2多核苷酸(1、10或30μg)。将对照多核苷酸以相似方式给予一组独立的大鼠。用Tegaderm(糖尿病小鼠)或Tegaderm加胶带(非糖尿病小鼠)覆盖伤口。在受伤后第0、3、7、10和14天拍照。通过影像分析测量伤口的表面积。
本实施例所描述的研究测试KGF-2Δ33多核苷酸的活性。然而，本领域技术人员可以很容易对所举例的研究进行改动，以测试其它KGF-2多核苷酸的活性，包括全长和成熟的KGF-2、KGF-2Δ28和编码KGF-2的77-208、80-208和93-208位氨基酸的多核苷酸；和KGF-2多肽、变异体、片段、激动剂和/或拮抗物以及这里描述的任何KGF-2突变体。
                         实施例44
                     运送KGF-2的结构
用于KGF-2基因治疗运送的合适构建体为pVGI.0-KGF-2。该构建体含有克隆到表达载体pVGI.0的KGF-2的全部天然开放读码框。pVGI.0含有卡那霉素抗性基因、一个CMV启动子和一个RSV启动子。pVGI.0-KGF-2于1999年6月30日保藏在美国典型培养物保藏中心专利存放处，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，给定的ATCC保藏号为PTA290。该构建体用本领域所熟知的方法从证实KGF-2结构的已有序列亚克隆到表达载体pVGI-0来制备。
另一个用于KGF-2运送的合适构建体为pVGI-0-MPIFspKG2Δ33。该结构含有与克隆到表达载体pVGI-0的MPIF(CK68)异源信号肽融合的KGF-2Δ33天然序列。pVGI-0-MPIFspKG2Δ33于1999年6月30日保藏在美国典型培养物保藏中心专利存放处，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，给定的ATCC保藏号为PTA289。该结构用本领域所熟知的方法和下列引物来制备：5′引物：GAGCGCGGATCCGCCACCATGAAGGTCTCCGTGGCTGCCCTCTCCTGCCTCATGCTTGTTACTGCCCTTGGATCTCAGGCCAGCTACAATCACCTTCAAGGAGATG(SEQ ID NO：149)3′引物：GAGCGCGGATCCCTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(SEQ ID NO：150)
                          实施例45
                  在KGF-2治疗期间的血管发生
在小鼠透明窗口系统中表征微血管生理学的多个方面给血管发生、炎症、微血管运输、组织排斥和肿瘤生理学提供了有价值的数据。在本实施例中，在植入的胶原蛋白凝胶中伤口愈合反应过程中维管结构的发生通过植入的皮肤窗口直接观察组织和相关微血管床来评估。该模型用来测定KGF-2基因治疗是否能够同时诱导加速的组织再生长和微管再形成。
用胶原蛋白酶消化来自裸小鼠的皮肤活检组织，洗涤产生的细胞悬液，然后培养在含有10％FBS的DMEM中以获得皮肤成纤维细胞。用KGF-2或对照多核苷酸转染长成片的成纤维细胞培养物，然后收集细胞并用PBS洗涤。将106细胞悬浮于20μl胶原蛋白基质中。取细胞悬液样品，用蛋白杂交技术证实KGF-2的产生。将2mm穿刺活检组织放入已有的背部皮肤窗口中，然后将该皮肤夹在两片盖玻片中。将细胞胶原混合物放入圆形伤口并密封小室。定期观察植入凝胶的血管发生。在三周内观察胶原蛋白凝胶光密度的改变来监测伤口的组织再生长。在研究得出结论之后从背部小室取出组织用于组织学评估。对照实验涉及将KGF-2或缓冲液代替成纤维细胞加入到胶原蛋白凝胶中。
小鼠制备：对Swiss裸鼠施行外科手术。为了施行外科手术，每kg体重皮下注射90mg氯胺酮和9mg甲苯噻嗪的混合物来麻醉动物。用蒸汽、气体或化学灭菌的器械在水平层流罩无菌条件下施行所有外科手术。在外科手术中，利用加热的工作台表面使动物的体温保持恒定。所有小鼠在miscroisolator笼中分开饲养，并且所有操作均在层流罩内进行。在移植后3天内给予Buprenorphine(0.1mg/kg q 12h)作为止痛药。
放置小鼠使小室夹在背部表面上伸展的两层皮肤中间。在直径～15mm的圆形区域内取出一层皮肤。第二层皮肤放在小室框架上并用无菌盖玻片覆盖。用尼龙posts通过伸展的皮肤和沿小室顶部的洞使小室保持在合适的位置。3天后，小心去除盖片并插入凝胶。然后将新的无菌盖片放在观察表面上。利用加强CCD摄像机、S-VHS录像机和直接数码影像的获得而进行的形态度量分析来测量。观察小鼠的植入变化28天。
测量：每kg体重皮下注射90mg氯胺酮和9mg甲苯噻嗪的混合物来麻醉小鼠，然后将小鼠放在无菌塑料台装置上。利用透射或注射100μlBSA-FITC(1mg/ml，静注)后并照射来制作窗口血管图。放大1X-4X制作血管床录像，还做成数码画面用于离线分析。从对录像磁带的离线分析测定血管发生。
本实施例所描述的研究测试KGF-2Δ33多核苷酸的活性。然而，本领域技术人员可以很容易对所举例的研究进行改动，以测试其它KGF-2多核苷酸的活性，包括全长和成熟的KGF-2、KGF-2Δ28和编码KGF-2的77-208、80-208和93-208位氨基酸的多核苷酸；和KGF-2多肽、变异体、片段、激动剂和/或拮抗物以及这里描述的任何KGF-2突变体。
                            实施例46
                         KGF-2转基因动物
KGF-2多肽也可在转基因动物中表达。任何种属的动物包括但不限于：小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、豚鼠、猪、小型猪、山羊、绵羊、奶牛和非人灵长类，例如狒狒、猴子和大猩猩，可用来制备转基因动物。在具体的实施方案中，用本文描述的技术或本领域熟知的其它技术在人体中表达多肽，作为基因治疗方案的一部分。
可用本领域熟知的任何技术将转基因(如本发明的多核苷酸)导入动物中以产生转基因动物的起始品系。这类技术包括但不限于：原核微注射(Paterson等，Appl.Microbiol.Biotechnol.40：691-698(1994)；Carver等，生物技术(Biotechnology)(NY)11：1263-1270(1993)；Wright等，生物技术(NY)9：830-834(1991)；和Hoppe等，美国专利编号4873191(1989))；逆转录病毒介导的基因向生殖系(Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，usa82：6148-6152(1985))、囊胚泡或胚胎的转移；在胚胎干细胞中的基因靶向(Thompson等，细胞(Cell)56：313-321(1989))；细胞或胚胎的电穿孔(Lo，Mol.Cell.Biol.3：1803-1814(1983))；利用基因枪导入本发明的多核苷酸(见例如Ulmer等，科学(Science)259：1745(1993))；将核酸构建体导入胚胎多能干细胞并将干细胞回输到囊胚泡；精子介导的基因转移(Lavitrano等，细胞57：717-723(1989))等。这类技术综述见Gordon的“转基因动物，”Intl.Rev.Cytol.115：171-229(1989)，其全文引入本文作为参考。
可用本领域熟知的任何技术产生含有本发明多核苷酸的转基因克隆，例如，将来自培养的胚胎、胎儿或成熟细胞的核转移到去核卵母细胞中诱导静止期(Campell等，自然(Nature)380：810-813(1997))。
本发明提供所有细胞都带有转基因的转基因动物和某些细胞而不是所有细胞都带有转基因的动物，即嵌合性动物。转基因可以单个转基因整合或以多拷贝如多联体形式整合，例如头对头串联或头对尾串联。转基因也可通过例如Lasko等所讲的方式(Lasko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6232-3236(1992))选择性导入特殊细胞类型并在其中活化。这种细胞类型特异性活化所需的调控序列取决于特殊的目的细胞类型，并且对那些本领域技术人员来说是很明确的。当希望多核苷酸整合到内源性基因的染色体位点时要对基因的靶向进行优选。
简言之，当利用这样一项技术时，设计含有一些内源基因核苷酸同源序列的用于整合的载体，通过与染色体序列同源重组进入并破坏内源基因的核苷酸序列。转基因也可通过例如Gu等所讲的方法(Gu等，Science265：103-106(1994))选择性导入一种特殊细胞类型，从而仅仅灭活那种细胞类型的内源基因。这种细胞类型特异性灭活所需的调控序列取决于特殊的目的细胞类型，并且对那些本领域技术人员来说是很明确的。该段落中叙述的每篇文献的内容引入本文作为参考。
一旦产生了转基因动物，则利用标准技术分析重组基因的表达。可通过DNA杂交分析或PCR技术分析动物组织证实发生了转基因的整合从而完成初步筛查。可利用包括(但不限于)下列技术评估转基因动物组织中转基因mRNA的表达水平：RNA杂交分析获自动物的组织样品、原位杂交分析和反转录酶-PCR(rt-PCR)。也可利用转基因产物特异性抗体对转基因表达组织样品进行免疫细胞化学或免疫组织化学评价。
一旦产生了起始动物，它们可以是自身繁殖、近交系、远交系、或杂交系，用来生产特殊动物的克隆。这种繁殖策略的实例包括但不限于：具有一个以上整合位点的起始动物远系繁殖用于建立独立品系；独立品系近系繁殖以生产由于每个转基因的额外表达导致高水平表达转基因的复合转基因品系；杂合的转基因动物杂交生产给定整合位点的纯合动物，从而既增加表达又消除了通过DNA分析筛选动物的需要；单纯合品系杂交生产复合杂合品系或纯合品系；以及繁殖使转基因处于适宜于目的实验模型的独特背景。
本发明的转基因动物使用包括但不限于在下列方面有用的动物模型：阐述KGF-2多肽的生物学功能，研究与异常KGF-2表达相关的疾病，以及筛选改善这类疾病中有效的复合物。
                            实施例47
                         KGF-2敲除动物
利用靶向同源重组通过灭活或“敲除”KGF-2基因和/或其启动子也可降低内源KGF-2基因的表达。(例如，见Smithies等，自然界317：230-234(1985)；Thomas和Capecchi，细胞51：503-512(1987)；Thompson等，细胞5：313-321(1989)；它们的全文引入本文作为参考)。例如，本发明中两侧为与内源性多核苷酸序列同源的DNA的一种突变无功能多核苷酸(或完全无关的DNA序列)，可以与可选择标记和/或阴性可选择标记一起使用，也可不与其一起使用，用于体内转染表达本发明多肽的细胞。在另一个实施方案中，使用本领域熟知的技术产生在含有但不表达目的基因的细胞中的敲除。通过靶向同源重组插入DNA结构导致靶基因的灭活。这种方法特别适合于研究和农业领域，在这些领域中对胚胎干细胞的改造可用来产生靶基因被灭活的动物后代(例如，见前面的Tomas和Capecchi 1987和Thompson 1989)。然而如果利用本领域那些技术人员了解的合适病毒载体将重组DNA结构直接给予或靶向体内需要的位点，那么这种方法可以常规适用于人体。
在本发明另外的实施方案中，将基因工程表达本发明多肽的细胞或者基因工程不表达本发明多肽的细胞(例如敲除)输入患者体内。这种细胞可获自患者(即动物，包括人)或MHC匹配的供体，包括但不限于：成纤维细胞、骨髓细胞、血细胞(如淋巴细胞)、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞等。这些细胞通常在体外进行基因工程改造，利用重组DNA技术将本发明多肽编码序列导入细胞中，或者破坏与本发明多肽相关的内源调控序列，例如通过转导(利用病毒载体，优选将转基因整合到细胞基因组的载体)或转染程序，包括但不限于使用质粒、粘粒、YAC、裸DNA、电穿孔、脂质体等。本发明多肽编码序列可放在强组成型或诱导型启动子或启动子/增强子的调控之下，以获得表达，优选分泌KHG-2多肽。可将表达并优选分泌本发明多肽的工程细胞系统性导入患者，例如导入循环系统或腹膜内。
或者，可将细胞掺入一种基质并植入体内，例如将基因工程成纤维细胞可作为皮肤移植物的一部分植入；基因工程内皮细胞作为淋巴或血管移植物的一部分植入。(见，例如Anderson等，美国专利编号5399349；Mulligan和Wilson，美国专利编号5460959，每一篇的全文都引入本文作为参考)。
如果输入的细胞不是自体的或MHC不相容，可利用防止发生宿主对导入细胞的免疫反应的熟知技术输入细胞。例如，细胞可以胶囊化形式导入，允许在紧靠细胞外环境中进行成分交换，而同时不让宿主免疫系统识别导入的细胞。
本发明的转基因动物使用包括但不限于在下列方面有用的动物模型：阐述KGF-2多肽的生物学功能，研究与异常KGF-2表达相关的疾病，以及筛选改善这类疾病中有效的复合物。
                            实施例48
                        KGF-2突变体的构建
为了产生点突变，利用本领域那些技术人员熟知的标准条件在PCR反应中使用指定引物。如说明的那样，产物用Nde和Asp718限制性酶切并克隆到pHE4中，或者用BamHI和Xba限制性酶切并克隆pcDNA3中。可用本领域熟知的方法在其它载体或其自身产生任一种所描述的KGF-2突变体。
pHE4：KGF2：R80-S208用下列引物构建：5′引物：CCGGCCATATGCGTAAACTGTTCTCTTTCACC(SEQ IDNO：151)3′引物：CCGGCGGTACCTTATTATTATGAGTGTACCACCATTGG(SEQ ID NO：152)
pHE4：KGF2：A63-S208(R68G)用下列引物构建：5′引物：GATCGCCATATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTC(SEQ IDNO：153)3′引物：GATCGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(SEQID NO：154)
pHE4：KGF2：A63-S208(R68S)用下列引物构建：5′引物：GATCGCCATATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTC(SEQ IDNO：155)3′引物：GATCGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(SEQID NO：156)
pHE4：KGF2：A63-S208(R68A)用下列引物构建：5′引物：GATCGCCATATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTC(SEQ IDNO：157)3′引物：GATCGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(SEQID NO：158)
pHE4：KGF2：A63-S208(R78R80K81A)用下列引物构建：5′引物：GATCGCCATATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTC(SEQ IDNO：159)3′引物：GATCGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(SEQID NO：160)
pcDNA3：KGF2(K136137139144A)用下列引物构建：5′引物：GATCGCGGATCCGCCACCATGTGGAAATGGATACTGACACATT GTGC(SEQ ID NO：161)3′引物：GATCGCTCTAGATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG(SEQ ID NO：162)
pcDNA3：KGF2(K151153R155A)用下列引物构建：5′引物：GATCGCGGATCCGCCACCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGC(SEQ ID NO：163)3′引物：GATCGCTCTAGATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG(SEQ ID NO：164)
pcDNA3：KGF2(R174K183A)用下列引物构建：5′引物：GATCGCGGATCCGCCACCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGC(SEQ ID NO：165)3′引物：GATCGCTCTAGATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG(SEQ ID NO：166)
pcDNA3：KGF2(R187R188A)用下列引物构建：5′引物：GATCGCGGATCCGCCACCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGC(SEQ ID NO：167)3′引物：GATCGCTCTAGATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG(SEQ ID NO：168)
pcDNA3：KGF2.A63(K136137139144A)用下列引物构建：5′引物：GATCGCCATATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTC(SEQ IDNO：169)3′引物：GATCGCGGTACCTATTATGATGTACCACCATTGGAAG(SEQ ID NO：170)
pcDNA3：KGF2.A63(K151153R155A)用下列引物构建：5′引物：GATCGCCATATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTC(SEQ IDNO：171)3′引物：GATCGCGGTACCTATTATGATGTACCACCATTGGAAG(SEQ ID NO：172)
                            实施例49
                    使用KGF-2治疗和/或预防不育
植入是成功怀孕唯一最关键的因素，具有临床和经济上的重要价值。人类最大部分70％胚胎流产的发生是在植入时。小鼠是选择用来研究哺乳动物植入的模型。三个基本细胞谱系分化并在小鼠植入前胚胎中分裂：胚胎、胎盘和卵黄囊前体。成纤维细胞生长因子(KGF)-4对这三种细胞谱系的发育都是必需的。
利用“瞬时转基因”方法运送获得功能和丧失功能(显性阴性)的FGF受体基因，已发现内源性FGF信号传导对在植入前两天第5次细胞分裂时开始的小鼠胚胎中胚胎和胎盘谱系的所有干细胞的分裂都是必需的。
有趣地是，已经发现fgfr-2和fgf4的裸突变体在植入后1天内死于子宫中，并且ICM死亡。在胚胎植入子宫之前，胚胎谱系和胎盘谱系中的细胞需要FGF来继续增殖。
其它19种FGF配基的一种或多种可能在小鼠植入前胚胎中瞬时表达，并且该配基会将fgfr-2和fgf4突变体的效应直延迟到植入后。我们利用RT-PCR已经试验了6种FGF配基。迄今为止，KGF-2和KGF-8是在植入前胚胎中检测到的除KGF-4以外的仅有配基。在二细胞期后的胚胎中和整个植入后早期检测到了KGF-2 mRNA。
KGF-2裸突变体提示在植入前小鼠胚胎中的KGF-2表达过程中KGF-2不是存活必需的(Min等，1988；Sekine等，1999)。但是，在植入前胚胎发育过程中其它FGF家族成员可以补偿KGF-2或对于KGF-2是多余的。在分析小鼠裸突变体的过程中已观察到许多冗余基因效应，也已观察到一个基因家族内的补偿效应(Thomas等，1995；Stein等，1994)。KGF-2裸突变体提示KGF-2在早期发育中可能更重要。
当裸突变体提示KGF-2无必需功能时，检测KGF-2是否在早期发育中起作用的最好方法是做功能获得实验。这些实验测试KGF-2是否对植入前胚胎的生长(Rappolee等，1994)、对胚细胞生长晕中的胎盘/滋养层细胞(Chai等，1998)和内细胞群(ICM)生长晕中的内皮谱系细胞(Rappolee等，1994)有影响。功能缺失试验通过利用反义寡核苷酸(Rappolee等，1992)或阻断抗体(LaFleur等，1996)的有限方法来进行。众所周知经历大小调节和细胞数目巨大的阳性和阴性变化的胚胎在植入之后很快进行自稳性调节(Rappolee等，1998)。这提示小的KGF-2亚致死依赖效应在KGF-2裸突变体中可能完全没有。缺失和获得功能实验用来测试KGF-2对植入前小鼠胚胎的作用。
迄今为止，对植入前小鼠胚胎生长因子mRNA的检测已普遍导向对相应蛋白的检测。(Rappolee等，1998、1992、1994；综述见Rappolee，1998、1999)。为了在检测到KGF-2 mRNA的胚胎中测定是否(和在何处)存在KGF-2蛋白，使用了适合免疫细胞化学的KGF-2抗体。
                         实施例50
                    检测临床样品中的KGF-2
纯化的山羊PAb在包被缓冲液中稀释到2μg/ml(0.05M NaHCO3，pH9.5)。将100μl稀释的抗体加到Immuno 4微量滴定板的每孔中。微量滴定板在4℃贮存过夜。从板中倒出抗体溶液。将200μl阻断缓冲液(1％干牛奶(BioRad)，溶于包被缓冲液)加入每孔。板在室温孵育2小时。从板中倒出阻断缓冲液。对板抽真空并在真空室中于32℃放置1.5小时使其完全干燥。从真空室中取出板，并密封于带有3个干燥剂包的聚酯薄膜袋中。板贮藏在4℃直至使用。
用稀释液1将KGF-2稀释到16ng/ml(0.1％Tween 20，1xPBS，1％BSA和0.001％硫柳汞)，然后稀释2.5x，以进行接下来的7个稀释。标准浓度范围为10ng/ml-0.026ng/ml。本底孔由不含蛋白的稀释液组成。
未知样品用稀释液1稀释10X、50X和250X。向包被的ELISA板每孔中加入100μl系列稀释标准溶液和未知样品。板在4C贮存过夜。从板中倒出溶液。使用Wheaton仪器设置在1.6ml(每孔每次洗涤得到200μl)，用洗涤缓冲液(0.1％Tween 20和1xPBS)洗涤板子5次。每次洗涤之间洗涤液的孵育时间为15秒。
检测物生物素化的鸡抗-KGF-2用稀释液1稀释到0.5μg/ml。每孔中加入100μl检测物。板在室温孵育2小时。倒出溶液并用洗涤液和前面一样洗涤5次。每次洗涤之间洗涤液的孵育时间为15秒。
过氧化物酶链霉亲和素在稀释液1中1∶2000稀释。板中每孔加入100μl稀释的过氧化物酶链霉亲和素，并在室温孵育1小时。倒出溶液并用洗涤液洗涤5次。每次洗涤之间洗涤液的孵育时间为15秒。然后使板子干燥。
将等量室温TMB过氧化物酶底物和过氧化物酶溶液B(来自TMB过氧化物酶微孔底物系统，KPL)混合。将100μl混合溶液加入每孔，室温显色10分钟。每孔加入50μl1M H2SO4终止显色。在450nm读板。
                           实施例51
                 构建大肠杆菌最优的截短的KGF-2
为了增加大肠杆菌表达系统中截短的KGF-2的表达水平，对基因密码子进行优化以高效利用大肠杆菌密码子。
例如，制备称为pHE4：KGF-2.A63-S608的下列构建体。5′CATATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACA
CCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAATAAGGTACC
3′(SEQ ID NO：173)
含有具有SEQ ID NO：173核苷酸序列的cDNA的质粒于2000年7月3日保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏处，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，ATCC保藏编号为＿＿＿＿。
利用下列引物构建称为pHE4：KGF-2.A63-S208的另一个构建体。正义5′GACTACATATGGCTGGTCGTGACGTTCGTTCTTACAACCACCTGCAGG3′(SEQ ID NO：174)反义5′CTAGTCTCTAGATTATTATGAGTGTACAACCATCGGCAGGAAGTGAG(SEQ ID NO：175)
pHE4：KGF-2.A63-S208 cod.opt的核苷酸序列如下：5′ATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAGAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAGAAAGAAAACTGCCCGTACTCTATCCTGGAAATCACCTCCGTTGAAATCGGTGTTGTAGCCGTTAAAGCCATCAACTCCAACTATTACCTGGCCATGAACAAAAAGGGTAAACTGTACGGCTCTAAAGAATTCAACAACGACTGCAAACTGAAAGAACGTATCGAAGAGAACGGTTACAACACCTACGCATCCTTCAACTGGCAGCACAACGGTCGTCAGATGTACGTTGCACTGAACGGTAAAGGCGCTCCGCGTCGCGGTCAGAAAACCCGTCGCAAAAACACCTCTGCTCACTTCCTGCCGATGGTTGTACACTCATAATAA 3′(SEQ IDNO：176)
含有具有SEQ ID NO：176核苷酸序列的cDNA的质粒于2000年7月3日保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏处，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，ATCC保藏编号为＿＿。
本实施例中描述的两种构建体在生产KGF-2多肽中都是有用的，例如实施例13所描述的。SEQ ID NO：173的第4-444位核苷酸和SEQ IDNO：176的第1-441位核苷酸编码SEQ ID NO：2的第63-208位氨基酸和一个N末端甲硫氨酸。
很明显本发明可以用前述和实施例特别描述以外的其它方法来实施。
根据前面所讲的，本发明可以有大量的修饰和变动，因此，在所附的权利要求范围内，可用特别描述以外的其它方法实施本发明。
所有发表的全部公开(包括专利、专利申请、杂志文章、实验手册、书籍或其它文献)引入本文作为参考。
                                                  414.1
Applicant′s or agent′s filereference number              1488.036PCOK International application No.(TO BE ASSIGNED)
              INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
                         OR 0THER BIOLOGICAL MATERIAL
                                (PCT Rule 13bis)
Figure A0081234103291
Form PCT/RO/134(July 1998)                                                 036PCK-75977.insertapp
                                                 414.2
Applicant′s or agent′s filereference number        1488.036PCOK International application No.(TO BE ASSIGNED)
                          INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
                                     OR OTHER BIOLOGICAL MATERIAL
                                            (PCT Rule 13bis) Form PCT/RO/134(July 1998)                                              036PCK-75901.insertapp
                                   414.3
Applicant′s or agent′s filereference number          1488.036PCOK International application No.(TO BE ASSIGNED)
                       INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
                                    OR OTHER BIOLOGICAL MA TERIAL
                                           (PCT Rule 13bis)
Figure A0081234103311
Figure A0081234103312
                                    414.4
Applicant′s or agent′s filereference number            1488.036PCOK International applicaition No.(TO BE ASSIGNED)
                           INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
                                     OR OTHER BIOLOGICAL MA TERIAL
                                             (PCT Rule 13bis)
Figure A0081234103321
Figure A0081234103322
Form PCT/RO/134(July 1998)                                                036PCK-PTA289.insertapp
                                414.5
Applicant′s or agent′s filereference number        1488.036PCOK International application No.(TO BE ASSIGNED)
                            INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
                                       OR OTHER BIOLOGICAL MA TERIAL
                                              (PCT Rule 13bis)
Figure A0081234103331
Figure A0081234103332
Form PCT/RO/134(July 1998)
                                  414.6
Applicant′s or agent′s filereference number        1488.036PCOK International application No.(TO BE ASSIGNED)
                     INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
                                   OR OTHER BIOLOGICAL MA TERLAL
                                          (PCT Rule 13bis)
Figure A0081234103341
Form PCT/RO/134(July 1998)                                            0316PCK-UNKNOWN1.insertapp
                                     414.7
Applicant′s or agent′s filereference number          1488.036PCOK International application No.(TO BE ASSIGNED)
                            INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
                                      OR OTHER BIOLOGICAL MA TERIAL
                                              (PCT Rule 13bis)
A.The indications made below relate to the deposited microorganism or other biological material referred to in thedescription on page 413.line 23.
B.IDENTIFICATION OF DEPOSIT                                         Further deposits are identified on an additional sheet □
Name of depositary institutionAmerican Type Culture Collection
Address of depositary institution(including postal code and country)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209United States of America
Date of dcposit03 July 2000   Accession NumberTO BE ADVISED
C.ADDITIONAL INDICATIONS(leave blank if not applicable)             This information is continued on an additional sheet □
(TO BE ADVISED)
D.DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE(if the indications are not for all designated States)
E.SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS(leave blank if not applicable)
The indications listed below will be subtnitted to the international Bureau later(specify the general nature of the indications e.g.，″AccessionNumber of Deposit″)
                                   序列表<110>Ruben，Steven M.
 Jimenez，Pablo
 Duan，D.Roxanne
 Rampy，Mark A.
 Mendrick，Donna
 Zhang，Jun
 Ni，Jian
 Moore，Paul A.
 Coleman，Timothy A.
 Gruber，Joachim R.
 Dillon，Patrick J.
 Gentz，Reiner L.<120>角质形成细胞生长因子-2<130>1488.036PCOK<140><141><150>60/142,343<151>1999-07-02<150>60/143,648<151>1999-07-14<150>60/144,024<151>1999-07-15<150>60/148,628<151>1999-08-12<150>60/149,935<151>1999-08-19<150>60/163,375<151>1999-11-03<150>60/171,677<151>1999-12-22<150>60/205,417<151>2000-05-19<150>60/198,322<151>2000-04-19<160>176<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>627<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(624)<400>1atg tgg aaa tgg ata ctg aca cat tgt gcc tca gcc ttt ccc cac ctg    48Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu1               5                  10                  15ccc ggc tgc tgc tgc tgc tgc ttt ttg ttg ctg ttc ttg gtg tct tcc    96Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser
         20                  25                  30gtc cct gtc acc tgc caa gcc ctt ggt cag gac atg gtg tca cca gag    144Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu
     35                  40                  45gcc acc aac tct tct tcc tcc tcc ttc tcc tct cct tcc agc gcg gga    192Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly
 50                  55                  60agg cat gtg cgg agc tac aat cac ctt caa gga gat gtc cgc tgg aga    240Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg65                  70                  75                  80aag cta ttc tct ttc acc aag tac ttt ctc aag att gag aag aac ggg    288Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly
             85                  90                  95aag gtc agc ggg acc aag aag gag aac tgc ccg tac agc atc ctg gag    336Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu
        100                 105                 110ata aca tca gta gaa atc gga gtt gtt gcc gtc aaa gcc att aac agc    384Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser
    115                 120                 125aac tat tac tta gcc atg aac aag aag ggg aaa ctc tat ggc tca aaa    432Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys
130                 135                 140gaa ttt aac aat gac tgt aag ctg aag gag agg ata gag gaa aat gga    480Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly145                 150                 155                 160tac aat acc tat gca tca ttt aac tgg cag cat aat ggg agg caa atg    528Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met
            165                 170                 175tat gtg gca ttg aat gga aaa gga gct cca agg aga gga cag aaa aca    576Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr
        180                 185                 190cga agg aaa aac acc tct gct cac ttt ctt cca atg gtg gta cac tca    624Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
    195                 200                 205tag                                                                627<210>2<211>208<212>PRT<213>人<400>2Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu1               5                  10                  15Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser
         20                  25                  30Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu
     35                  40                  45Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly
 50                  55                  60Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg65                  70                  75                  80Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly
             85                  90                  95Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu
        100                 105                 110Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser
    115                 120                 125Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys
130                 135                 140Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly145                 150                 155                160Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met
            165                 170                 175Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr
        180                 185                 190Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
    195                 200                 205<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>3ccccacatgt ggaaatggat actgacacat tgtgcc                         36<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>4cccaagcttc cacaaacgtt gccttcctct atgag                     35<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>5catgccatgg cgtgccaagc ccttggtcag gacatg                    36<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>6cccaagcttc cacaaacgtt gccttcctct atgag                            35<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>7gcgggatccg ccatcatgtg gaaatggata ctcac                           35<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>8gcgcggtacc acaaacgttg ccttcct                                     27<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>9taacgaggat ccgccatcat gtggaaatgg atactgacac                      40<210>10<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>10taagcactcg agtgagtgta ccaccattgg aagaaatg                         38<210>11<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>11attaaccctc actaaaggga ggccatgtgg aaatggatac tgacacattg tgcc       54<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>12cccaagcttc cacaaacgtt gccttcctct atgag                            35<210>13<211>206<212>PRT<213>人<400>13Met Ser Gly Pro Gly Thr Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu1               5                  10                  15Leu Ala Leu Leu Ala Pro Trp Ala Gly Arg Gly Gly Ala Ala Ala Pro
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130                 135                 140Glu Glu Cys Lys Phe Arg Glu Thr Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala145                 150                 155                 160Tyr Glu Ser Asp Leu Tyr Gln Gly Thr Tyr Ile Ala Leu Ser Lys Tyr
            165                 170                 175Gly Arg Val Lys Arg Gly Ser Lys Val Ser Pro Ile Met Thr Val Thr
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    115                 120                 125Gly Ile Val Gly Ile Arg Gly Val Phe Ser Asn Lys Phe Leu Ala Met
130                 135                 140Ser Lys Lys Gly Lys Leu His Ala Ser Ala Lys Phe Thr Asp Asp Cys145                 150                 155                 160Lys Phe Arg Glu Arg Phe Gln Glu Asn Ser Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser
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        180                 185                 190Asn Lys Arg Gly Lys Ala Lys Arg Gly Cys Ser Pro Arg Val Lys Pro
    195                 200                 205Gln His Ile Ser Thr His Phe Leu Pro Arg Phe Lys Gln Ser Glu Gln
210                 215                 220Pro Glu Leu Ser Phe Thr Val Thr Val Pro Glu Lys Lys Asn Pro Pro225                 230                 235                 240Ser Pro Ile Lys Ser Lys Ile Pro Leu Ser Ala Pro Arg Lys Asn Thr
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        260                 265<210>16<211>155<212>PRT<213>人<400>16Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe1               5                  10                  15Asn Leu pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser
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             85                  90                  95Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr
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130                 135                 140Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp145                 150                 155<210>17<211>155<212>PRT<213>人<400>17Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1               5                  10                  15Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu
         20                  25                  30Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg
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 50                  55                  60Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn65                  70                  75                  80Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys
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130                 135                 140Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg145                 150                 155                 160Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr
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130                 135                 140Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly145                 150                 155                 160Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly
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             85                  90                  95Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu
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130                 135                 140Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly145                 150                 155                 160Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met
            165                 170                 175Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr
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    195                 200                 205<210>21<211>239<212>PRT<213>人<400>21Met Gly Leu Ile Trp Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Glu Pro Gly Trp1               5                  10                  15Pro Ala Ala Gly Pro Gly Ala Arg Leu Arg Arg Asp Ala Gly Gly Arg
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             85                  90                  95Leu Ala Met Asn Lys Arg Gly Arg Leu Tyr Ala Ser Glu His Tyr Ser
        100                 105                 110Ala Glu Cys Glu Phe Val Glu Arg Ile His Glu Leu Gly Tyr Asn Thr
    115                 120                 125Tyr Ala Ser Arg Leu Tyr Arg Thr Val Ser Ser Thr Pro Gly Ala Arg
130                 135                 140Arg Gln Pro Ser Ala Glu Arg Leu Trp Tyr Val Ser Val Asn Gly Lys145                 150                 155                 160Gly Arg Pro Arg Arg Gly Phe Lys Thr Arg Arg Thr Gln Lys Ser Ser
            165                 170                 175Leu Phe Leu Pro Arg Val Leu Asp His Arg Asp His Glu Met Val Arg
        180                 185                 190Gln Leu Gln Ser Gly Leu Pro Arg Pro Pro Gly Lys Gly Val Gln Pro
    195                 200                 205Arg Arg Arg Arg Gln Lys Gln Ser Pro Asp Asn Leu Glu Pro Ser His
210                 215                 220Val Gln Ala Ser Arg Leu Gly Ser Gln Leu Glu Ala Ser Ala His225                 230                 235<210>22<211>268<212>PRT<213>人<400>22Met Gly Ser Pro Arg Ser Ala Leu Ser Cys Leu Leu Leu His Leu Leu1               5                  10                  15Val Leu Cys Leu Gln Ala Gln Val Arg Ser Ala Ala Gln Lys Arg Gly
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             85                  90                  95Asp Gln Leu Ser Arg Arg Leu Ile Arg Thr Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg
        100                 105                 110Thr Ser Gly Lys His Val Gln Val Leu Ala Asn Lys Arg Ile Asn Ala
    115                 120                 125Met Ala Glu Asp Gly Asp Pro Phe Ala Lys Leu Ile Val Glu Thr Asp
130                 135                 140Thr Phe Gly Ser Arg Val Arg Val Arg Gly Ala Glu Thr Gly Leu Tyr145                 150                 155                 160Ile Cys Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Ile Ala Lys Ser Asn Gly Lys
            165                 170                 175Gly Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu Ile Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr
        180                 185                 190Ala Leu Gln Asn Ala Lys Tyr Glu Gly Trp Tyr Met Ala Phe Thr Arg
    195                 200                 205Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Ser Lys Thr Arg Gln His Gln Arg Glu
210                 215                 220Val His Phe Met Lys Arg Leu Pro Arg Gly His His Thr Thr Glu Gln225                 230                 235                 240Ser Leu Arg Phe Glu Phe Leu Asn Tyr Pro Pro Phe Thr Arg Ser Leu
            245                 250                 255Arg Gly Ser Gln Arg Thr Trp Ala Pro Glu Pro Arg
        260                 265<210>23<211>4177<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(593)..(1216)<400>23ggaattccgg gaagagaggg aagaaaacaa cggcgactgg gcagctgcct ccacttctga 60caactccaaa gggatatact tgtagaagtg gctcgcaggc tggggctccg cagagagaga 120ccagaaggtg ccaaccgcag aggggtgcag atatctcccc ctattcccca ccccacctcc 180cttgggtttt gttcaccgtg ctgtcatctg tttttcagac ctttttggca tctaacatgg 240tgaagaaagg agtaaagaag agaacaaagt aactcctggg ggagcgaaga gcgctggtga 300ccaacaccac caacgccacc accagctcct gctgctgcgg ccacccacgt ccaccattta 360ccgggaggct ccagaggcgt aggcagcgga tccgagaaag gagcgagggg agtcagccgg 420cttttccgag gagttatgga tgttggtgca ttcacttctg gccagatccg cgcccagagg 480gagctaacca gcagccacca cctcgagctc tctccttgcc ttgcatcggg tcttaccctt 540ccagtatgtt ccttctgatg agacaatttc cagtgccgag agtttcagta ca atg tgg 598
                                                      Met Trp
                                                        1aaa tgg ata ctg aca cat tgt gcc tca gcc ttt ccc cac ctg ccc ggc   646Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu Pro Gly
      5                  10                  15tgc tgc tgc tgc tgc ttt ttg ttg ctg ttc ttg gtg tct tcc gtc cct    694Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser Val Pro
 20                  25                  30gtc acc tgc caa gcc ctt ggt cag gac atg gtg tca cca gag gcc acc    742Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr35                  40                  45                  50aac tct tct tcc tcc tcc ttc tcc tct cct tcc agc gcg gga agg cat    790Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His
             55                  60                  65gtg cgg agc tac aat cac ctt caa gga gat gtc cgc tgg aga aag cta    838Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu
         70                  75                  80ttc tct ttc acc aag tac ttt ctc aag att gag aag aac ggg aag gtc    886Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val
     85                  90                  95agc ggg acc aag aag gag aac tgc ccg tac agc atc ctg gag ata aca    934Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr
100                 105                 110tca gta gaa atc gga gtt gtt gcc gtc aaa gcc att aac agc aac tat    982Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr115                 120                 125                 130tac tta gcc atg aac aag aag ggg aaa ctc tat ggc tca aaa gaa ttt    1030Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe
            135                 140                 145aac aat gac tgt aag ctg aag gag agg ata gag gaa aat gga tac aat    1078Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn
        150                 155                 160acc tat gca tca ttt aac tgg cag cat aat ggg agg caa atg tat gtg    1126Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val
    165                 170                 175gca ttg aat gga aaa gga gct cca agg aga gga cag aaa aca cga agg    1174Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg
180                 185                 190aaa aac acc tct gct cac ttt ctt cca atg gtg gta cac tca            1216Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser195                 200                 205tagaggaagg caacgtttgt ggatgcagta aaaccaatgg ctcttttgcc aagaatagtg  1276gatattcttc atgaagacag tagattgaaa ggcaaagaca cgttgcagat gtctgcttgc  1336ttaaaagaaa gccagccttt gaaggttttt gtattcactg ctgacatatg atgttctttt  1396aattagttct gtgtcatgtc ttataatcaa gatataggca gatcgaatgg gatagaagtt  1456attcccaagt gaaaaacatt gtggctgggt tttttgttgt tgttgtcaag tttttgtttt  1516taaacctctg agatagaact taaaggacat agaacaatct gttgaaagaa cgatcttcgg  1576gaaagttatt tatggaatac gaactcatat caaagacttc attgctcatt caagcctaat  1636gaatcaatga acagtaatac gtgcaagcat ttactggaaa gcacttgggt catatcatat 1696gcacaaccaa aggagttctg gatgtggtct catggaataa ttgaatagaa tttaaaaata 1756taaacatgtt agtgtgaaac tgttctaaca atacaaatag tatggtatgc ttgtgcattc 1816tgccttcatc cctttctatt tctttctaag ttatttattt aataggatgt taaatatctt 1876ttggggtttt aaagagtatc tcagcagctg tcttctgatt tatcttttct ttttattcag 1936cacaccacat gcatgttcac gacaaagtgt ttttaaaact tggcgaacac ttcaaaaata 1996ggagttggga ttagggaagc agtatgagtg cccgtgtgct atcagttgac ttaatttgca 2056cttctgcagt aataaccatc aacaataaat atggcaatgc tgtgccatgg cttgagtgag 2116agatgtctgc tatcatttga aaacatatat tactctcgag gcttcctgtc tcaagaaata 2176gaccagaagg ccaaattctt ctctttcaat acatcagttt gcctccaaga atatactaaa 2236aaaaggaaaa ttaattgcta aatacattta aatagcctag cctcattatt tactcatgat 2296ttcttgccaa atgtcatggc ggtaaagagg ctgtccacat ctctaaaaac cctctgtaaa 2356ttccacataa tgcatctttc ccaaaggaac tataaagaat ttggtatgaa gcgcaactct 2416cccaggggct taaactgagc aaatcaaata tatactggta tatgtgtaac catatacaaa 2476aacctgttct agctgtatga tctagtcttt acaaaaccaa ataaaacttg ttttctgtaa 2536atttaaagag ctttacaagg ttccataatg taaccatatc aaaattcatt ttgttagagc 2596acgtatagaa aagagtacat aagagtttac caatcatcat cacattgtat tccactaaat 2656aaatacataa gccttatttg cagtgtctgt agtgatttta aaaatgtaga aaaatactat 2716ttgttctaaa tacttttaag caataactat aatagtatat tgatgctgca gttttatctt 2776catatttctt gttttgaaaa agcattttat tgtttggaca cagtattttg gtacaaaaaa 2836aaagactcac taaatgtgtc ttactaaagt ttaacctttg gaaatgctgg cgttctgtga 2896ttctccaaca aacttatttg tgtcaatact taaccagcac ttccagttaa tctgttattt 2956ttaaaaattg ctttattaag aaattttttg tataatccca taaaaggtca tatttttccc 3016attcttcaaa aaaactgtat ttcagaagaa acacatttga ggcactgtct tttggcttat 3076agtttaaatt gcatttcatc atactttgct tccaacttgc tttttggcaa atgagattat 3136aaaaatgttt aatttttgtg gttggaatct ggatgttaaa atttaattgg taactcagtc 3196tgtgagctat aatgtaatgc attcctatcc aaactaggta tctttttttc ctttatgttg 3256aaataataat ggcacctgac acatagacat agaccaccca caacctaaat taaatgtttg 3316gtaagacaaa tacacattgg atgaccacag taacagcaaa cagggcacaa actggattct 3376tatttcacat agacatttag attactaaag agggctatgt gtaaacagtc atcattatag 3436tactcaagac actaaaacag cttctagcca aatatattaa agcttgcaga ggccaaaaat 3496agaaaacatc tcccctgtct ctcccacatt tccctcacag aaagacaaaa aacctgcctg 3556gtgcagtagc tcacacctgt aatcccagca gtttgggaga ctgtgggaag atggcttgag 3616tccaggagtt ctagacaggc ctgagaaacc tagtgagaca tccttctctt aaacaaaaca 3676aaacaaaaca aatgtagcca tgcgtggtgg catatacctg tggtcccaac tactcaggag 3736gctgaaacgg aaggatctct tgggccccag gagtttgagg ctgcagtgag ctataatctt 3796gccattgcac tccagcctgg gtgaaaaaga gccagaaaga aaggaaagag agaaaagaga 3856aaagaaagag agaaaagaca gaaagacagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa 3916ggaagcaagg aaagaaggaa ggaaggaaag aagggaggga aggaaggaga gagaaagaaa 3976gattgtttgg taaggagtaa tgacattctc ttgcatttaa aagtggcata tttgcttgaa 4036atggaaatag aattctggtc ccttttgcaa ctactgaaga aaaaaaaaag cagtttcagc 4096cctgaatgtt gtagatttga aaaaaaaaaa aaaaaaactc gagggggggc ccgtacccaa 4156ttcgccctat agtgagtcgt a                                           4177<210>24<211>208<212>PRT<213>人<400>24Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu1               5                  10                  15Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser
         20                  25                  30Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu
     35                  40                  45Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly
 50                  55                  60Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg65                  70                  75                  80Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly
             85                  90                  95Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu
        100                 105                 110Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser
    115                 120                 125Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys
130                 135                 140Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly145                 150                 155                 160Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met
            165                 170                 175Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr
        180                 185                 190Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
    195                 200                 205<210>25<21l>3l<212>PRT<213>人<400>25Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser1               5                  10                  15Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn
         20                  25                  30<210>26<211>19<212>PRT<213>人<400>26Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys1               5                  10                  15Pro Tyr Ser<210>27<211>30<212>PRT<213>人<400>27Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys1               5                  10                  15Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr
         20                  25                  30<210>28<211>19<212>PRT<213>人<400>28Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn1               5                  10                  15Thr Ser Ala<210>29<211>555<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(552)<220><223>人工序列描述：pQE60-Cys37构建体<400>29atg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac gga tcc tgc cag gct ctg   48Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Cys Gln Ala Leu1               5                  10                  15ggt cag gac atg gtt tct ccg gaa gct acc aac tct tcc tct tcc tct   96Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser
         20                  25                  30ttc tct tcc ccg tct tcc gct ggt cgt cac gtt cgt tct tac aac cac   144Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His
     35                  40                  45ctg cag ggt gac gtt cgt tgg cgt aaa ctg ttc tct ttc acc aaa tac   192Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr
 50                  55                  60ttc ctg aaa atc gaa aaa aac ggt aaa gtt tct ggg acc aag aag gag   240Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu65                  70                  75                  80aac tgc ccg tac agc atc ctg gag ata aca tca gta gaa atc gga gtt   288Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val
             85                  90                  95gtt gcc gtc aaa gcc att aac agc aac tat tac tta gcc atg aac aag   336Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys
        100                 105                 110aag ggg aaa ctc tat ggc tca aaa gaa ttt aac aat gac tgt aag ctg   384Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu
    115                 120                 125aag gag agg ata gag gaa aat gga tac aat acc tat gca tca ttt aac   432Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn
130                 135                 140tgg cag cat aat ggg agg caa atg tat gtg gca ttg aat gga aaa gga   480Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly145                 150                 155                 160gct cca agg aga gga cag aaa aca cga agg aaa aac acc tct gct cac   528Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His
            165                 170                 175ttt ctt cca atg gtg gta cac tca tag                               555Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
        180<210>30<211>184<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述：pQE60-Cys37构建体<400>30Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Cys Gln Ala Leu1                   5              10                  15Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser
             20              25                  30Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His
         35              40                  45Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr
     50              55                  60Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu65                  70                  75                  80Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val
             85                  90                  95Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys
        100                 105                 110Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu
    115                 120                 125Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn
130                 135                 140Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly145                 150                 155                 160Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His
            165                 170                 175Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
        180<210>31<211>84<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成引物<400>31atgtggaaat ggatactgac ccactgcgct tctgctttcc cgcacctgcc gggttgctgc 60tgctgctgct tcctgctgct gttc                                        84<210>32<211>82<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成引物<400>32ccggagaaac catgtcctga cccagagcct ggcaggtaac cggaacagaa gaaaccagga  60acagcagcag gaagcagcag ca                                           82<210>33<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成引物<400>33gggtcaggac atggtttctc cggaagctac caactcttct tcttcttctt tctcttctcc  60gtcttctgct ggtcgtcacg                                              80<210>34<211>81<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成引物<400>34ggtgaaagag aacagtttac gccaacgaac gtcaccctgc aggtggttgt aagaacgaac  60gtgacgacca gcagaagacg g                                            81<210>35<211>75<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成引物<400>35cgttggcgta aactgttctc tttcaccaaa tacttcctga aaatcgaaaa aaacggtaaa  60gtttctggga ccaaa                                                   75<210>36<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成引物<400>36tttggtccca gaaactttac cgtttttttc gattttcag                         39<210>37<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成引物<400>37aaaggatcca tgtggaaatg gatactgacc cactgc                            36<210>38<211>627<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<220><221>CDS<222>(1)..(627)<400>38atg tgg aaa tgg ata ctg acc cac tgc gct tct gct ttc ccg cac ctg    48Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu1               5                  10                  15ccg ggt tgc tgc tgc tgc tgc ttc ctg ctg ctg ttc ctg gtt tct tct    96Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser
         20                  25                  30gtt ccg gtt acc tgc cag gct ctg ggt cag gac atg gtt tct ccg gaa    144Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu
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 50                  55                  60cgt cac gtt cgt tct tac aac cac ctg cag ggt gac gtt cgt tgg cgt    240Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg65                  70                  75                  80aaa ctg ttc tct ttc acc aaa tac ttc ctg aaa atc gaa aaa aac ggt    288Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly
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            165                 170                 175Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr
        180                 185                 190Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
    195                 200                 205<210>40<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>40tttcatgact tgtcaagctc tgggtcaaga tatggttc                         38<210>41<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>41gcccaagctt ccacaaacgt tgccttcc                                    28<210>42<211>525<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(522)<400>42atg acc tgc cag gct ctg ggt cag gac atg gtt tct ccg gaa gct acc   48Met Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr1               5                  10                  15aac tct tcc tct tcc tct ttc tct tcc ccg tct tcc gct ggt cgt cac   96Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His
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         20                  25                  30gtt cgt tct tac aac cac ctg cag ggt gac gtt cgt tgg cgt aaa ctg    144Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu
     35                  40                  45ttc tct ttc acc aaa tac ttc ctg aaa atc gaa aaa aac ggt aaa gtt    192Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val
 50                  55                  60tct ggg acc aag aag gag aac tgc ccg tac agc atc ctg gag ata aca    240Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr65                  70                  75                  80tca gta gaa atc gga gtt gtt gcc gtc aaa gcc att aac agc aac tat    288Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr
             85                  90                  95tac tta gcc atg aac aag aag ggg aaa ctc tat ggc tca aaa gaa ttt    336Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe
        100                 105                 110aac aat gac tgt aag ctg aag gag agg ata gag gaa aat gga tac aat    384Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn
    115                 120                 125acc tat gca tca ttt aac tgg cag cat aat ggg agg caa atg tat gtg    432Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val
130                 135                 140gca ttg aat gga aaa gga gct cca agg aga gga cag aaa aca cga agg    480Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg145                 150                 155                 160aaa aac acc tct gct cac ttt ctt cca atg gtg gta cac tca tag        525Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
               165             170<210>66<211>174<212>PRT<213>人<400>66Met Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr1               5                  10                  15Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His
         20                  25                  30Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu
     35                  40                  45Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val
 50                  55                  60Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr65                  70                  75                  80Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr
             85                  90                  95Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe
        100                 105                 110Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn
    115                 120                 125Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val
130                 135                 140Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg145                 150                 155                 160Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
            165                 170<210>67<211>444<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)..(444)<400>67atg gct ggt cgt cac gtt cgt tct tac aac cac ctg cag ggt gac gtt    48Met Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val1               5                  10                  15cgt tgg cgt aaa ctg ttc tct ttc acc aaa tac ttc ctg aaa atc gaa    96Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu
         20                  25                  30aaa aac ggt aaa gtt tct ggg acc aag aag gag aac tgc ccg tac agc    144Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser
     35                  40                  45atC ctg gag ata aca tca gta gaa atc gga gtt gtt gcc gtc aaa gcc    192Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala
 50                  55                  60att aac agc aac tat tac tta gcc atg aac aag aag ggg aaa ctc tat    240Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr65                  70                  75                  80ggc tca aaa gaa ttt aac aat gac tgt aag ctg aag gag agg ata gag    288Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu
             85                  90                  95gaa aat gga tac aat acc tat gca tca ttt aac tgg cag cat aat ggg    336Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly
        100                 105                 110agg caa atg tat gtg gca ttg aat gga aaa gga gct cca agg aga gga    384Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly
    115                 120                 125cag aaa aca cga agg aaa aac acc tct gct cac ttt ctt cca atg gtg    432Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val
130                 135                 140gta cac tca tag                                                    444Val His Ser145<210>68<211>147<212>PRT<213>人<400>68Met Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val1               5                  10                  15Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu
         20                  25                  30Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser
     35                  40                  45Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala
 50                  55                  60Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr65                  70                  75                  80Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu
             85                  90                  95Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly
        100                 105                 110Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly
    115                 120                 125Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val
130                 135                 140Val His Ser145<210>69<211>402<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)..(402)<400>69atg gtt cgt tgg cgt aaa ctg ttc tct ttc acc aaa tac ttc ctg aaa    48Met Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys1               5                  10                  15atc gaa aaa aac ggt aaa gtt tct ggg acc aag aag gag aac tgc ccg    96Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro
         20                  25                  30tac agc atc ctg gag ata aca tca gta gaa atc gga gtt gtt gcc gtc    144Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val
     35                  40                  45aaa gcc att aac agc aac tat tac tta gcc atg aac aag aag ggg aaa    192Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys
 50                 55                   60ctc tat ggc tca aaa gaa ttt aac aat gac tgt aag ctg aag gag agg    240Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg65                  70                  75                  80ata gag gaa aat gga tac aat acc tat gca tca ttt aac tgg cag cat    288Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His
             85                  90                  95aat ggg agg caa atg tat gtg gca ttg aat gga aaa gga gct cca agg    336Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg
        100                 105                 110aga gga cag aaa aca cga agg aaa aac acc tct gct cac ttt ctt cca    384Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro
    115                 120                 125atg gtg gta cac tca tag                                            402Met Val Val His Ser
130<210>70<211>133<212>PRT<213>人<400>70Met Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys1               5                  10                  15Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro
         20                  25                  30Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val
     35                  40                  45Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys
 50                  55                  60Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg 65                  70                  75                  80Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His
             85                  90                  95Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg
        100                 105                 110Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro
    115                 120                 125Met Val Val His Ser
130<210>71<211>354<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)..(354)<400>71atg gaa aaa aac ggt aaa gtt tct ggg acc aag aag gag aac tgc ccg    48Met Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro1               5                  10                  15tac agc atc ctg gag ata aca tca gta gaa atc gga gtt gtt gcc gtc    96Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val
         20                  25                  30aaa gcc att aac agc aac tat tac tta gcc atg aac aag aag ggg aaa    144Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys
     35                  40                  45ctc tat ggc tca aaa gaa ttt aac aat gac tgt aag ctg aag gag agg    192Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg
 50                  55                  60ata gag gaa aat gga tac aat acc tat gca tca ttt aac tgg cag cat    240Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His65                  70                  75                  80aat ggg agg caa atg tat gtg gca ttg aat gga aaa gga gct cca agg    288Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg
             85                  90                  95aga gga cag aaa aca cga agg aaa aac acc tct gct cac ttt ctt cca    336Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro
        100                 105                 110atg gtg gta cac tca tag                                            354Met Val Val His Ser
    115<210>72<211>117<212>PRT<213>人<400>72Met Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro  1               5                  10                  15Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val
         20                  25                  30Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys
     35                  40                  45Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg
 50                  55                  60Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His65                  70                  75                  80Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg
             85                  90                  95Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro
        100                 105                 110Met Val Val His Ser
    115<210>73<211>321<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)..(321)<400>73atg gag aac tgc ccg tac agc atc ctg gag ata aca tca gta gaa atc    48Met Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile1               5                  10                  15gga gtt gtt gcc gtc aaa gcc att aac agc aac tat tac tta gcc atg    96Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met
         20                  25                  30aac aag aag ggg aaa ctc tat ggc tca aaa gaa ttt aac aat gac tgt    144Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys
     35                  40                  45aag ctg aag gag agg ata gag gaa aat gga tac aat acc tat gca tca    192Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser
 50                  55                  60ttt aac tgg cag cat aat ggg agg caa atg tat gtg gca ttg aat gga    240Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly65                  70                  75                  80aaa gga gct cca agg aga gga cag aaa aca cga agg aaa aac acc tct    288Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser
             85                  90                      95gct cac ttt ctt cca atg gtg gta cac tca tag                        321Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
        100                 105<210>74<211>106<212>PRT<213>人<400>74Met Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile1               5                  l0                  15Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met
         20                  25                  30Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys
     35                  40                  45Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser
 50                  55                  60Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly65                  70                  75                  80Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser
             85                  90                  95Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
        100                 105<210>75<211>264<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)..(261)<400>75atg gtc aaa gcc att aac agc aac tat tac tta gcc atg aac aag aag   48Met Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys1               5                  10                  15ggg aaa ctc tat ggc tca aaa gaa ttt aac aat gac tgt aag ctg aag   96Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys
         20                  25                  30gag agg ata gag gaa aat gga tac aat acc tat gca tca ttt aac tgg   144Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp
     35                  40                  45cag cat aat ggg agg caa atg tat gtg gca ttg aat gga aaa gga gct   192Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala
 50                  55                  60cca agg aga gga cag aaa aca cga agg aaa aac acc tct gct cac ttt   240Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe65                  70                  75                  80ctt cca atg gtg gta cac tca tag                                   264Leu Pro Met Val Val His Ser
             85<210>76<211>87<212>PRT<213>人<400>76Met Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys1               5                  10                  15Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys
         20                  25                  30Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp
     35                  40                  45Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala
 50                  55                  60Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe65                  70                  75                  80Leu Pro Met Val Val His Ser
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         20                  25                  30tgg cag cat aat ggg agg caa atg tat gtg gca ttg aat gga aaa gga    144Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly
     35                  40                  45gct cca agg aga gga cag aaa aca cga agg aaa aac acc tct gct cac    192Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His
 50                  55                  60ttt ctt cca atg gtg gta cac tca tag                                219Phe Leu Pro Met Val Val His Ser65                  70<210>78<211>72<212>PRT<213>人<400>78Met Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu1               5                  10                  15Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn
         20                  25                  30Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly
     35                  40                  45Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His
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    115<210>81<211>276<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)..(276)<400>81atg gct ggt cgt cac gtt cgt tct tac aac cac ctg cag ggt gac gtt    48Met Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val1               5                  10                  15cgt tgg cgt aaa ctg ttc tct ttc acc aaa tac ttc ctg aaa atc gaa    96Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu
         20                  25                  30aaa aac ggt aaa gtt tct ggg acc aag aag gag aac tgc ccg tac agc    144Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser
     35                  40                  45atc ctg gag ata aca tca gta gaa atc gga gtt gtt gcc gtc aaa gcc    192Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala
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             85                  90                  95Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala
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         20                  25                  30Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser
     35                  40                  45Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr
 50                  55                  60Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn65                  70                  75                  80Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr
             85                  90                  95Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala
        100                 105                 110Leu Asn Gly Glu Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys
    115                 120                 125Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
130                 135                 140<210>147<211>3974<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：pHE4-5载体<400>147ggtacctaag tgagtagggc gtccgatcga cggacgcctt ttttttgaat tcgtaatcat 60ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 120ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 180cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 240tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 300ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 360taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 420agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 480cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 540tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 600tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 660gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 720acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 780acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 840cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 900gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 960gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 1020agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 1080ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcgtcga 1140caattcgcgc gcgaaggcga agcggcatgc atttacgttg acaccatcga atggtgcaaa 1200acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg 1260aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc 1320cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg 1380atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg 1440ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg 1500gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga 1560agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg 1620ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact 1680aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc 1740tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa 1800atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg 1860cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt 1920gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg 1980atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg 2040ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt 2100tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg 2160gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc 2220tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 2280ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 2340gcgcaacgca attaatgtaa gttagcgcga attgtcgacc aaagcggcca tcgtgcctcc 2400ccactcctgc agttcggggg catggatgcg cggatagccg ctgctggttt cctggatgcc 2460gacggatttg cactgccggt agaactccgc gaggtcgtcc agcctcaggc agcagctgaa 2520ccaactcgcg aggggatcga gcccggggtg ggcgaagaac tccagcatga gatccccgcg 2580ctggaggatc atccagccgg cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa 2640ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc 2700gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 2760gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc 2820tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc 2880cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag 2940gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg 3000aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 3060ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 3120caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 3180tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 3240cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 3300gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 3360gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 3420cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 3460gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga 3540tcagatcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggca agaaagccat ccagtttact 3600ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct 3660gtccataaaa ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt 3720ctctttgcgc ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt 3780cagcaccgtt tctgcggact ggctttctac gtgttccgct tcctttagca gcccttgcgc 3840cctgagtgct tgcggcagcg tgaagcttaa aaaactgcaa aaaatagttt gacttgtgag 3900cggataacaa ttaagatgta cccaattgtg agcggataac aatttcacac attaaagagg 3960agaaattaca tatg                                                   3974<210>148<211>112<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：pHE4-5启动子序列<400>148aagcttaaaa aactgcaaaa aatagtttga cttgtgagcg gataacaatt aagatgtacc 60caattgtgag cggataacaa tttcacacat taaagaggag aaattacata tg         112<210>149<21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Claims (12)

1.一种含有编码一种多肽的核酸序列之核苷酸序列，其中除了具有选自下述的一个或多个突变不同之外，所述多肽与序列号2的参照多肽相同：R68G，R68S，R68A，R78A，R80A，K81A，K87A，K91A，K136A，K137A，K139A，K144A，K148E，K149E，K151A，K153A，K155A，R174A，K183A，K183Q，K183E，R187A，R188A，R188E，K191E，在包含两个端点的R68-K91之间带正电的残基被丙氨酸替换，在包含两个端点的R68-K91之间带正电的残基被中性残基替换，在包含两个端点的R68-K91之间带正电的残基被带负电的残基替换。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述参照多肽包含SEQ ID No：2的氨基酸63-208，69-208，69-208，77-208，80-208或是93-208。
3.一种含有权利要求1的多核苷酸的载体。
4.一种含有权利要求1的多核苷酸的宿主细胞。
5.一种制备多肽的方法，包括在使得所述多肽表达的条件下培养权利要求4的宿主细胞，并回收所述多肽。
6.一种由权利要求1的多核苷酸编码的多肽。
7.一种用于患者中刺激上皮细胞增殖的方法，包括向该患者施用权利要求6的多肽。
8.权利要求7的多肽，其中所述患者患有选自如下的疾病：创伤、粘膜炎、溃疡、炎性肠疾病、肝脏疾病、肺损坏、糖尿病、眼损伤、胃肠道损伤、肠毒性、大疱性表皮松懈症、皮移植、皮肤病、肾衰竭、脑损伤、心脏组织损伤、尿路损伤、女性生殖道疾病、肠纤维化、直肠炎、肺纤维化、肺炎、胸膜收缩、造血综合征以及骨髓中毒性。
9.一种用于治疗或预防患者卵巢损伤、不孕或肝脏纤维化的方法，包括向患者施用有效量的SEQ ID No：2的多肽或其活性片段或变体。
10.一种用于促进患者的内部愈合、供体位点愈合、内部手术性创伤愈合或在美容手术过程中造成的切割伤的愈合的方法，包括向患者施用有效量的SEQ ID No：2的多肽或其活性片段或变体。
11.一种制备多肽的方法，包括：
(a)将编码氨基酸63-208的多核苷酸插入一种载体；
(b)将所述载体转染宿主细胞；
(c)在使得该多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；
(d)在盐酸胍存在下裂解所述细胞；且
(e)回收所述多肽。
12.一种包含SEQ ID No：173的4-444核苷酸或者SEQ IDNo：176的1-441核苷酸的多核苷酸。
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