CZ304224B6 - Monoklonální protilátka - Google Patents

Abstract

Monoklonální protilátka, kde tato monoklonální protilátka se imunospecificky váže na čištěný protein, který je tvořený sekvencí aminokyselin s více než 90% identitou po celé délce se SEQ ID NO: 29 a je prostý jakéhokoliv myelinového materiálu centrálního nervového sytému, s nímž je přirozeně spojen, pro použití jako léčivo.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká monoklonální protilátky, která se imunospecificky váže na čištěný protein, který má více než 90% identitu sekvence se SEQ ID NO: 29. Tato monoklonální protilátka je určena pro použití jako léčivo.

Dosavadní stav techniky

V centrálním nervovém systému (CNS) vyšších obratlovců skoro nedochází po poranění k regeneraci axonů a strukturální plasticita je omezena. Je pravděpodobné, že inhibitory růstu spojené s myelinem CNS mají důležitou úlohu. Tato skutečnost se dokazuje monoklonálními protilátkami (mAb) IN-1, které neutralizují protein myelin, jenž silně inhibuje růst neuritů, čímž podněcuje po lézích mozku a míchy regeneraci axonů a zesiluje kompenzační plasticitu.

Rada pozorování in vitro a in vivo ukazuje nový aspekt regulace růstu neritů, kterým je přítomnost repulzivních a inhibičních signálů a faktorů (popisuje se v publikaci Keunes and Cook, 1995, Curr. Opin. Neurosci. 5: 75-82). Zdá se, že většina těchto signálů jsou proteiny nebo glykoproteiny. Prvním důležitým úspěchem při identifikaci faktorů je izolace a klonování cDNA molekuly vyvolávající kolaps růstu neuronových kónusů získaných z mozku kuřete, kterou je kolapsin-1 nazývající se také semaforin 3A.

Druhá skupina repulzivních řídících molekul, které se nedávno izolovaly a klonovaly, jsou efriny. Jsou to ligandy pro rodinu Eph receptorových tyrozinových kináz. Efrin-A5 a efrin A2 se exprimují jako gradienty ve zrakovém tektu kuřecího embrya ajejich ektopická exprese a delece způsobuje chyby růstu retinálních axonů. Podobně jako semaforiny také rodina efrinů má 15 až 20 členů, přičemž každý vykazuje komplexní a dynamickou expresi uvnitř a vně nervového systému. Funkce většiny z těchto molekul se musí ještě zkoumat.

Třetí skupinou řídících faktorů, které mohou zabránit růstu axonů a exprimují se ve vyvíjejícím se nervovém systému jsou neutriny. Netrin se izoloval jako chemoatraktant komisurálních axonů v časné fázi vývoje míchy podobně jako ortholog unc-6 mikroorganizmu C. elegans. Netrin-1 naopak vykazuje repulzivní účinky v případě jistých typů neuronů v závislosti na typu receptoru přítomném na cílových neuronálních růstových kónusech (Tessier-Lavigne et al., 1996, Science 274: 1123-33).

Dříve se silná inhibiční aktivita růstu neuritů spojená s oligodendrocyty a myelinem CNS dospělých jedinců popisuje v publikaci Canoni and Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106: 1281-1288). Hlavní konstituent je membránový protein s vysokou molekulovou hmotností (NI-250, s menším komponentem NI-35, vyskytuje se u krys), který se nedávno izoloval a kterýje předmětnou věcí vynálezu a váže se na neutralizační monoklonální protilátky IN-1 (popisuje se v publikaci Canoni and Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106: 1281-1288, patent US 5 684 133, US 5 250 414, přihláška PCT WO 93/00427).

Inhibitory růstu neuritů spojené s myelinem mají důležitou úlohu při prevenci tvorby porušených axonů CNS. Jestliže se u krys a kuřat blokuje vývoj oligodendrocytů a tvorba myelinu, pak se prodlouží regenerační permisivní doba následující po lézích CNS. Tvorba myelinu se shoduje s koncem období vývoje, kdy CNS vykazuje vysokou strukturální plasticitu a vysoký potenciál regenerace.

Je pravděpodobné, že molekuly NI-250 a NI-35 jsou hlavními komponenty inhibice růstu spojené s myelinem, což se může dokázat aplikací in vivo IN-1 při lézích míchy u dospělých krys, což

-1 CZ 304224 B6 vyvolává regeneraci kortikospinálních axonů na velkou vzdálenost a umožňuje obnovení motorických funkcí a funkcí chování zvláště s ohledem na pohyb. Podobné experimenty se zrakovým nervem a cholinergní dráhou septo-hippocamu také demonstrují význam in vivo antigenu rozeznávaného protilátkou IN-1, což je NI-35/250 (popisuje se v publikaci Schnell and Schwab, 1990, Nátuře 343: 269-272, Bregman et al., 1995, Nátuře 378: 498-501).

Vláknité systémy, které nevykazují léze také odpovídají za neutralizaci inhibitorů růstu neuritů pomocí protilátek IN-1. Nedávné experimenty ukázaly, že po selektivní lézi kortikospinální dráhy (pyramidotomy) se v přítomnosti IN-1 neporušená vlákna tlačí skrz střední část míchy a mozkového kmene a tvoří bilaterální inervační patem doprovázený skoro plným navrácením funkcí chování a přesného pohybu (popisuje se v publikaci ZOraggen et al., 1998, J. Neuroscience 18(12): 4744-4757).

Izolace genu, který kóduje protein inhibující růst neuritů poskytuje řadu možností pro vývoj produktů použitelných při regeneraci neuronů a při léčbě různých neurologických poruch, mezi něž patří také nádory.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří monoklonální protilátka, kde tato monoklonální protilátka se imunospecificky váže na čištěný protein, který je tvořený sekvencí aminokyselin s více než 90% identitou po celé délce se SEQ ID NO: 29 a je prostý jakéhokoliv myelinového materiálu centrálního nervového systému, s nímž je přirozeně spojen, pro použití jako léčivo.

Vynález také popisuje způsob identifikace genů, které interagují s genem Nogo.

Gen Nogo je gen podle vynálezu identifikovaný způsobem podle vynálezu, který kóduje a interaguje s proteiny regulujícími růst neuronů.

Vynález také popisuje deriváty a analogy genu Nogo podle vynálezu, které jsou funkčně aktivní. To znamená, že jsou schopny vykazovat jednu nebo více funkčních aktivit spojených s přirozeně se vyskytujícím proteinem Nogo. Mezi aminokyselinami 542 až 722 se identifikovala hlavní inhibiční oblast. Takové funkční aktivity zahrnují, ale nejsou omezeny na neuritovou růstovou inhibici neurálních buněk, rozptýlení a migraci fibroblastů nebo libovolné buňky vykazující neoplastický růst, schopnost interagovat s proteiny regulujícími neurální růst nebo soutěžit o interakci s těmito proteiny, antigenicitu, což je schopnost vázat se (nebo soutěžit s proteinem Nogo o navázání) na protilátku vytvořenou proti proteinu Nogo, imunogenicitu, což je schopnost generovat protilátku, která se váže na protein Nogo. Tyto protilátky vykazují potenciál indukovat růst neuritů nebo předcházet poklesu růstu ganglií dorzálních kořenů čípku inhibici funkce proteinu Nogo a jeho funkčních fragmentů nebo derivátů, které mají schopnost inhibovat růst neuritů.

Vynález dále popisuje fragmenty (a jeho deriváty a analogy) proteinu Nogo, které obsahují jednu nebo více oblastí proteinu Nogo, jako je kyselý a na prolin bohatý N-konec (například aminokyseliny 31 až 58 sekvence SEQ ID NO: 2), vysoce konzervativní C-konec a dva hydrofobní pruhy tvořené 35 a 36 aminokyselinami krysího proteinu Nogo, které se vyskytují také na Ckonci (například aminokyseliny 988 až 1 023 a 1 090 až 1 125 sekvence SEQ ID NO: 2).

Dále se popisují protilátky vytvořené proti různým proteinům Nogo a jejich derivátům a analogům. Získaly se dvě protilátky. První protilátka se nazývá AS 472 a získala se v případě, kdy se jako imunogen použil syntetický peptid odpovídající aminokyselinám 623 až 640 sekvence SEQ ID NO: 2 a sekundární protilátka, která se nazývá AS Bruna, se vytvořila proti C-konci, který obsahuje aminokyseliny 762 až 1 163 sekvence SEQ ID NO: 2 proteinu Nogo.

-2CZ 304224 B6

Popisují se také způsoby produkce proteinů Nogo, jeho derivátů a analogů, například rekombinantními způsoby.

Vynález také popisuje terapeutické a diagnostické způsoby a prostředky založené na proteinech Nogo a na jeho nukleových kyselinách. Terapeutické prostředky podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na proteiny Nogo, jeho analogy a deriváty (zahrnují fragmenty), protilátky, nukleové kyseliny kódující proteiny Nogo, analogy nebo derivát a ribozymy Nogo nebo „antisense“ nukleové kyseliny.

Vynález také popisuje terapeutické a diagnostické metody a prostředky založené na proteinech Nogo a nukleových kyselinách a anti-Nogo protilátkách. Vynález popisuje léčbu nádorů CNS a neurálních nádorů aplikací sloučenin, které podporují aktivitu Nogo (například proteiny Nogo a jejich funkčně aktivní analogy a deriváty zahrnující jejich fragmenty, nukleové kyseliny kódující proteiny Nogo, jejich analogy nebo deriváty, agonisty proteinů Nogo).

Vynález dále popisuje léčbu onemocnění, poruch nebo poškození, které hlavně vedou k poškození nervového systému. Taková onemocnění, poruchy nebo poškození zahrnují, ale nejsou omezeny na traumata centrálního nervového systému (CNS) (například poranění míchy nebo mozku), infarkt, infekce, maligní nádory, působení toxických činidel, nedostatečnou výživu, paraneoplastické syndromy a degenerativní nervové onemocnění (zahrnující, ale není omezeno na Alzeimerovu nemoc, Parkinsonovu nemoc, Huntingtonovu choreu, roztroušenou sklerózu, amyotrofní laterální sklerózu a progresivní supranukleámí paralýzu) aplikací sloučenin, které interferují s aktivitou Nogo (například dominantní negativní derivát proteinu Nogo, protilátky proti proteinu Nogo, „antisense“ nukleové kyseliny genu Nogo, ribozymy Nogo a chemické skupiny, které se vážou na aktivní místo proteinu Nogo).

Vynález dále popisuje zvířecí modely, diagnostické metody a testovací metody vhodné pro zjišťování dispozic pro vhodné poruchy a způsoby identifikace a hodnocení agonistů a antagonistů proteinu Nogo.

Definice

Podtržený nebo italikou napsaný název genu indikuje gen, naopak jím kódovaný proteinový produkt je označen jménem napsaným normálním písmem. Termín „Nogo“ znamená gen Nogo, zatímco termín „Nogo“ označuje proteinový produkt genu Nogo.

Vynález popisuje nukleotidové sekvence genů Nogo a aminokyselinové sekvence jimi kódovaných proteinů. Vynález dále popisuje fragmenty, jejich deriváty a analogy proteinů Nogo. Vynález dále popisuje nukleové kyseliny kódující takové fragmenty nebo deriváty. Vynález popisuje geny Nogo a jejich kódované proteiny řady různých druhů. Geny Nogo podle vynálezu zahrnují lidský, krysí a bovinní gen Nogo a příbuzné geny (homology) v jiných druzích. Vynález také popisuje bovinní subsekvence doložené v publikaci Spillman et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 19 283 - 19293. Ve specifických provedeních geny Nogo a proteiny pocházejí z obratlovců nebo zvláště ze savců. V preferovaném provedení vynálezu geny Nogo a jejich proteiny jsou lidského původu. Vynález dále popisuje produkci následujících proteinů a derivátů, například metodami rekombinace.

Vynález popisuje gen Nogo, molekuly nukleových kyselin kódující tři izoformy proteinu Nogo jmenovitě pak protein Nogo A, Nogo B a Nogo C. Gen Nogo zahrnuje molekuly nukleové kyseliny kódující všechny tři izoformy, pokud není uvedeno jinak. Protein Nogo zahrnuje všechny tři izoformy proteinu Nogo, není-li uvedeno jinak. Proteiny Nogo podle vynálezu mohou předcházet regeneraci neuronů v míše nebo mozku (to je nepermisivní vlastnosti substrátu), inhibovat růst neuritů ganglií dorzálních kořenů, indukovat zpomalení růstu kónusu ganglií dozálních kořenů, blokovat rozšíření buněk NIH 3T3, blokovat růst neuritů PC 12 atd.

-3 CZ 304224 B6

Proteiny Nogo, jejich fragmenty a deriváty neobsahují žádný myelinový materiál centrálního nervového systému. Zvláště pak neobsahují žádný myelinový materiál centrálního nervového systému, se kterým je protein Nogo přirozeně spojen. Takový materiál může zahrnovat jiné myelinové proteiny CNS, lipidy a uhlovodíky. Upřednostňuje se, aby proteiny Nogo, jejich fragmenty a deriváty podle vynálezu také neobsahovaly žádná činidla používaná při izolaci z biologického materiálu, jako jsou například detergenty.

Ve specifickém provedení podle vynálezu se popisují rekombinantní proteiny, jejich fragmenty a deriváty připravené metodami podle vynálezu, jako je exprese genu Nogo v geneticky upravené buňce.

Vynález také zahrnuje deriváty Nogo a analog podle vynálezu, které jsou funkčně aktivní. To znamená, že jsou schopny vykazovat jednu nebo více známých funkčních aktivit spojených s plnou délkou proteinu Nogo (divoký typ). Takové funkční aktivity zahrnují, ale nejsou omezeny na schopnost interagovat (nebo soutěžit s navázáním) s regulačními proteiny neurálního růstu, antigenicitou (schopnost vázat se /nebo soutěžit sNogo o navázání) na anti-Nogo protilátky/, imunogenicitou (schopnost vytvořit protilátky, které se váží na Nogo), předcházet regeneraci neuronů v míše nebo v mozku, propůjčit substrátu vlastnost omezení růstu, rozšíření a migrace neurálních buněk a neoplastických buněk, inhibici růstu neuritů ganglií dorzálních kořenů, vyvolání zpomalení růstu kónusu ganglií dorzálních kořenů, blokování rozšíření in vitro buněk NIH 3T3, blokováni růstu neuritů PC 12, restrikci neurální plasticity atd.

Vynález dále popisuje fragmenty (jejich deriváty a analogy) proteinu Nogo, které obsahují jednu nebo více oblastí proteinu Nogo.

Popisují se protilátky proti proteinu Nogo, jeho deriváty a analogy.

Vynález dále popisuje terapeutické a diagnostické metody a prostředky založené na proteinech Nogo a nukleových kyselinách a anti-Nogo protilátkách. Vynález popisuje léčbu poruch růstu regulovaných buněk nebo orgánů aplikací sloučenin, které podporují aktivitu Nogo (například proteiny Nogo a funkčně aktivní analogy a jejich deriváty (zahrnující fragmenty), nukleové kyseliny kódující proteiny Nogo, analogy nebo deriváty, nebo agonisty proteinu Nogo).

Vynález také popisuje metody léčby poškození nebo poruchy nervového systému aplikací sloučenin, které antagonizují nebo inhibují funkci proteinu Nogo (například protilátky, antisense nukleové kyseliny Nogo, antagonistické deriváty proteinu Nogo).

Vynález také popisuje zvířecí modely, diagnostické metody a testovací metody vhodné pro stanovení predispozice k poruchám.

Izolace genů Nogo

Vynález popisuje nukleotidové sekvence genů Nogo nebo nukleové kyseliny. V jednom provedení vynálezu nukleové kyseliny Nogo obsahují sekvence krysí cDNA uvedené na obrázku č. 2a (SEQ ID NO: 1) označené jako Nogo A, jak je zobrazeno na obrázku č. lb nebojejich kódující oblasti nebo nukleotidové sekvence kódující protein Nogo obsahující 1 163 aminokyselin nebo jeho libovolný funkční fragment nebo derivát (například protein vykazující sekvenci SEQ ID NO: 2, jak je zobrazeno na obrázku č. 2a).

V jiném provedení vynálezu nukleové kyseliny Nogo obsahují nukleovou sekvenci kódující protein Nogo B, zatímco protein Nogo B je ekvivalentní s 172 aminokyselinami N-konce fúzovanými s 188 aminokyselinami C-konce proteinu Nogo A, přičemž vzniká zkrácený protein obsahující 360 aminokyselin. Transkripty proteinu Nogo B vznikly jako výsledek alternativního sestřihu, který odstraní intervenující nukleotidovou kódující sekvenci.

-4CZ 304224 B6

V dalším provedení vynálezu nukleové kyseliny Nogo obsahují nukleotidové sekvence kódující protein Nogo C, zatímco protein Nogo C obsahuje na svém N-konci 11 aminokyselin, které nejsou přítomny v proteinu Nogo a 188 aminokyselin C-konce proteinu Nogo A a B. Protein Nogo C obsahuje 199 aminokyselin. Transkript kódující Nogo C je výsledkem transkripce z alternativního promotoru Nogo.

V jiném specifickém provedení vynálezu se popisují sekvence nukleových kyselin bovinního Nogo (SEQ ID NO: 28).

V jiném provedení vynálezu se popisují nukleotidové sekvence kódující lidský protein Nogo a fragmenty lidských proteinů Nogo zahrnující lidské ekvivalenty s krysím proteinem Nogo A, Nogo B a Nogo C. Sekvence nukleové kyseliny Nogo se objasnila za použití transkriptu krysího Nogo A jako templátu a sestřihávají dohromady lidskou exprimovanou sekvenci tags (EST), aby vznikla kontinuální nukleotidová sekvence. Krysí a bovinní aminokyselinové sekvence Nogo také poskytují informace o správném translačním čtecím rámci tak, že se dedukovala aminokyselinová sekvence lidského Nogo. Vynález také popisuje aminokyselinové sekvence fragmentů lidského genu Nogo.

Vynález také popisuje izolované nukleové kyseliny alespoň 8 nukleotidů (to je hybridizovatelná část) sekvence Nogo. V jiném provedení nukleové kyseliny obsahují alespoň 25 (kontinuálních) nukleotidů, 50 nukleotidů, 100 nukleotidů, 150 nukleotidů, 20 nukleotidů, 500 nukleotidů, 700 nukleotidů nebo 800 nukleotidů sekvence genu Nogo nebo kódující sekvence Nogo plné délky.

V jiném provedení vynálezu nukleové kyseliny jsou menší než 35 000 nebo 500 nukleotidů. Nukleová kyselina může být jedno- nebo dvouřetězcová. Vynález dále popisuje nukleové kyseliny hybridizovatelné nebo komplementární s dále v textu uvedenými sekvencemi. Vynález popisuje nukleové kyseliny, které obsahují sekvenci komplementární s alespoň 10, 25, 50, 100 nebo 200 nukleotidy nebo kódující oblast genu Nogo.

Specifické provedení vynálezu popisuje nukleovou kyselinu, která hybridizuje s nukleovou kyselinou Nogo (má například sekvenci SEQ ID NO: 2, obrázek č. 2a) nebo s nukleovou kyselinou kódující derivát Nogo za málo přísných podmínek. Postupy při kterých se používá takových málo přísných podmínek se popisují v publikaci Shilo and Weinberg, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 6 789-6 792 a jsou následující: Filtry obsahující DNA se předem ošetřily po dobu 6 hodin při teplotě 40 °C v roztoku, který obsahuje 35 % formamidu, 5x SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1 % PVP, 0,1 % fikol 1 % BSA a 500 gg/ml denaturované DNA spermatu lososa. Hybridizace probíhají ve stejném roztoku s následující modifikací: 0,02 % PVP, 0,02 % fikolu, 0,2 % BSA, 100 gg/ml DNA spermatu lososa, 10 % (hmotnost/objem) sulfátu dextranu a použije se 5 až 20 χ 10⁶ cpm sondy značené ³²P. Filtry se inkubovaly v hybridizační směsi po dobu 1,5 hodiny při teplotě 60 °C. Filtry se přenášely suchým způsobem a podrobily se autoradiografii. Jestliže je to nezbytné, filtry se promyly třikrát při teplotě 65 až 68 °C a znova se exponoval film. Další podmínky při nízké přísnosti jsou dobře známé v oboru (například jak se používá při hybridizaci mezi specie, jak se popisuje shora v textu).

V jiném specifickém provedení vynálezu se popisuje nukleová kyselina, kteráje hybridizovatelná s nukleovou kyselinou Nogo za podmínek s vysokou přísností. Postupy, při kterých se používají takové přísné podmínky jsou následující: Prehybridizace filtrů obsahující DNA probíhá po dobu 8 hodin přes noc při teplotě 65 °C v pufru, který se skládá z 6x koncentrovaného roztoku SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,2 % PVP, 0,02 % fikol, 0,02 % BSA a 500 gg/ml DNA spermatu lososa. Filtry se hybridizovaly po dobu 48 hodin při teplotě 65 °C v prehybridizační směsi, která obsahuje 100 gg/ml denaturované DNA spermatu lososa a 5 až 20x10⁶ cpm sondy značené ³²P. Promývání filtrů se provedlo při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny v roztoku, který obsahuje 2x koncentrovaný SSC, 0,01 % PVP, 0,01 % fikol a 0,01% BSA. Pak následuje promytí v pufru 0,lx koncentrovaném SSC při teplotě 50 °C po dobu 45 minut a pak následuje autoradiografie. Dále se mohou použít jiné podmínky s vysokou přísností, které jsou dobře známy v oboru.

-5CZ 304224 B6

V jiném specifickém provedení vynálezu se popisuje nukleová kyselina, která může hybridizovat s nukleovou kyselinou Nogo za podmínek upravené přísnosti. Postupy za použití takových podmínek upravené přísnosti jsou následující. Filtry obsahující DNA se předem ošetřovaly po dobu 6 hodin při teplotě 55 °C v roztoku, který obsahuje 6x koncentrovaný SSC, 5x koncentrovaný Denhartův roztok, 0,5 % SDS a 100 pg/ml denaturované DNA spermatu lososa. Hybridizace se provedly ve stejném roztoku a použila se sonda 5 až 20 x 10⁶ cpm značená ³²P. Filtry se inkubovaly v hybridizační směsi po dobu 18 až 20 hodin při teplotě 55 °C a pak se promyly dvakrát po dobu 30 minut při teplotě 60 °C v roztoku obsahujícím lx koncentrovaný SSC a 0,1 % SDS. Filtry se pak přenesly suchým způsobem a vystavily se autoradiografii. Jiné podmínky upravené přísnosti, které se mohou použít jsou dobře známy v oboru. Promývání filtrů se provedlo při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny v roztoku, který obsahuje 2x koncentrovaný roztok SSC, 0,1 % SDS. Takové přísné podmínky jsou vhodné pro izolaci molekul nukleové kyseliny obsahující sekvence genu Nogo u jiného druhu, například za použití krysích nebo bovinních klonů cDNA Nogo, jako sondu pro izolaci lidské cDNA Nogo.

Řada lidských exprimovaných značících sekvencí (EST) popisovaných v publikované databázi sekvence nukleové kyseliny vykazuje vysoký stupeň shody sekvence ve srovnání se segmenty sekvencí genu Nogo podle vynálezu. Identifikoval se předběžný seznam lidského ETS a jsou uvedeny přístupová čísla v Genbank: AA158636 (SEQ ID NO: 35), AA333267 (SEQ ID NO: 36), AA081783 (SEQ ID NO: 37), AA167765 (SEQ ID NO: 38), AA322918 (SEQ ID NO: 39), AA092565 (SEQ ID NO: 40), AA081525 (SEQ ID NO: 41) a AA081840 (SEQ ID NO: 42) za použití ENTREZ Nucleotide Query. Před tímto vynálezem nikdo necharakterizoval shora v textu uvedené EST s ohledem na aminokyselinové sekvence, které uvedené EST mohou kódovat in vivo. Nic není známo o funkci proteinů, které obsahují předpovězené aminokyselinové sekvence lidským EST. Dále EST, jako je AA158636, které souhlasí s 5'koncem cDNA Nogo a jiným EST nebo AA081840, který souhlasí s 3 koncem krysí cDNA nepřesahuje a není chápána jako součást stejné sekvence lidské cDNA.

Založeno na sekvencích genu Nogo podle vynálezu se věří, že tyto lidské EST reprezentují části lidského genu Nogo, které se exprimují v tkáni, ze které se získal EST. Vynález dále popisuje molekuly nukleové kyseliny obsahující dvě nebo více shora identifikovaných lidských EST. EST se mohou exprimovat ve stejné lidské tkáni nebo v jiných lidských tkáních. Upřednostňuje se, aby molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu obsahovaly nukleotidové sekvence alespoň dvou lidských EST, které se vzájemně nepřekrývají nebo se nepřekrývají s třetím ani dalším lidským EST.

Protože shora v textu identifikované lidské EST se nyní identifikovaly jako fragmenty lidského genu Nogo, což se provedlo klonováním nukleových kyselin. Uvažuje se, že lidské EST má podobné funkce ve srovnání sjinými molekulami nukleových kyselin Nogo při různých metodách podle vynálezu, jako je například exprese lidských polypeptidů Nogo, hybridizační testy a inhibice exprese Nogo jako molekul antisense nukleové kyseliny atd.

Vynález však poskytuje a zahrnuje předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského proteinu Nogo a jeho fragmenty. Jak je zobrazeno na obrázku č. 13, aminokyselinová sekvence krysího proteinu Nogo (obrázek č. 2a, SEQ ID NO: 2) se uspořádává s předpokládanou aminokyselinovou sekvencí lidského proteinu Nogo (obrázek č. 13, SEQ ID NO: 29). Vynález popisuje lidské proteiny Nogo obsahující předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského proteinu Nogo, obrázek č. 13 a SEQ ID NO: 29 nebo subsekvence předpokládané aminokyselinové sekvence lidského Nogo, který obsahuje alespoň aminokyselinové zbytky nebo jeden nebo více následujících předpokládaných aminokyselinových sekvencí lidských fragmentů Nogo. Jsou to MEDLDQSPLVSSS (lidský protein Nogo, odpovídající aminokyselinám 1 až 13 se sekvencí SEQ ID NO: 43), KIMDLKEQPGNTISAG (lidský protein Nogo odpovídající aminokyselinám 187 až 203 se sekvencí SEQ ID NO: 44), KEDEVVSSEKAKDSFNEKR (lidský protein Nogo odpovídající aminokyselinám 340 až 358 se sekvencí SEQ ID NO: 45), QESLYPAAQLCPS-6CZ 304224 B6

FEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSS (lidský protein Nogo odpovídající aminokyselinám 570 až 619) se sekvenci SEQ ID NO: 46). Přirozeně se vyskytující lidský protein Nogo a rekombinantní lidský protein Nogo a jeho fragmenty mají aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinovým sekvencím, jak se popisují shora v textu ajsou schopny se vázat na protilátky řízené proti proteinu Nogo podle vynálezu.

Vynález dále popisuje molekuly nukleové kyseliny, které kódují lidský protein Nogo, který má aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci zobrazené na obrázku č. 13 (obrázek č. 13, SEQ ID NO: 29). Ve specifickém provedení vynálezu molekuly nukleové kyseliny kódující fragmenty lidského proteinu Nogo mají aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci, jakje zobrazeno na obrázku č. 13 (SEQ ID NO: 29) s tou výjimkou, že takové molekuly nukleové kyseliny neobsahují nukleotidovou sekvenci shora identifikovaných lidských EST.

Aminokyselinová sekvence se zdá být v podstatě podobná předpokládané aminokyselinové sekvenci lidského proteinu Nogo, když více než 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % nebo 97 % aminokyselinových zbytků ve dvou molekulách je shodných, když se použije počítačový algoritmus, kde uspořádání se provede počítačovým programem, který je dobře znám v oboru například když se použije vyhledávací program BLAST (popisuje se v publikaci Altschul et al., 1994, Nátuře Genet. 6: 119-129).

Použitelné počítačové homologické programy zahrnují: program „Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih.gov) (popisuje se v publikaci Altschul et al., 1990, J. of Molec. Biol,m 215: 403-410, „The BLAST Algorithm“., Altschul et al., 1997, Nuc. Acids. Res. 25: 3 389-3 402) heuristický vyhledávací algoritmus určený pro vyhledávání podobnosti sekvencí. V publikaci Karlin and Altschul 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87: 2 264-68, 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5 873 - 77 se popisuje důležitost statistických metod. Pět specifických programů plní následující úkoly:

1) Program BLASTP porovnává aminokyselinovou sekvenci s databází proteinových sekvencí.

2) Program BLASTN porovnání šesti rámcové pojmové translační produkty nukleotidové zkoumané sekvence (oba řetězce) s databází nukleotidových sekvencí.

3) Program BLASTX porovnává šesti rámcové pojmové translační produkty nukleotidové zkoumané sekvence (oba řetězce) s databází proteinových sekvencí.

4) Program BLASTN porovnává proteinovou zkoumanou sekvenci s databází nukleotidových sekvencí přeložených do všech šesti čtecích rámců (oba řetězce).

5) Program BLASTX porovnává šestirámcové translace nukleotidové zkoumané sekvence se šesti rámcovými translacemi nukleotidové sekvenční databáze.

Program BLASTN se používá pro identifikaci nukleových kyselin s požadovaným procentem shody a program BLASTP se může zvláště použít k identifikaci aminokyselinových sekvencí s požadovaným procentem shody.

Smith-Waterman (databáze: European Bioinformatics Institute www.ebi.ac.uk/bic-sw/) (popisuje se v publikaci Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147: 195-197) je matematicky rigorózní algoritmus vhodný pro uspořádání sekvencí.

FASTA (popisuje se v publikaci Pearson et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 2 4442 448) je heuristické přiblížení Smith-Watermanovu algoritmu. V případě obecné diskuse postupu a výhod algoritmů BLAST, Smith-Waterman a FASTA (popisuje se v publikaci Nicholas et al., 1998, „A Tutoriál on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods“ (www.psc.edu).

-7CZ 304224 B6

Použití předpokládaných aminokyselinových sekvencí lidského proteinu Nogo nebo nukleotidových sekvencí lidského EST zahrnující vytvoření sekvence kódující předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského Nogo použitelnou pro izolaci a identifikaci lidského genu Nogo, fragmentů přirozeně se vyskytujících mutantů a jejich variant. Takové použití, které je známé v oboru, zahrnuje, ale není omezeno na použití informace pro přípravu sond nukleové kyseliny pro testování knihovny DNA, amplifikací DNA, genetickému testování lidské populace a pro přípravu syntetických peptidů pro vytvoření protilátek. Dále v textu se popisují taková použití.

Popisují se nukleové kyseliny kódující deriváty a analogy proteinů Nogo a antisense nukleových kyselin Nogo. Je zřejmé, že termín „nukleová kyselina kódující fragment nebo část proteinu Nogo“ je nukleová kyselina kódující pouze tento uvedený fragment nebo část proteinu Nogo a nikoli jiné kontinuální části proteinu Nogo jako kontinuální sekvenci. V tomto kontextu část znamená jednu nebo více aminokyselin.

Vynález také popisuje fragmenty nukleových kyselin Nogo obsahující oblasti konzervativní mezi (vykazující homologii s) jinými nukleovými kyselinami Nogo stejného nebo odlišného druhu. Nukleové kyseliny kódující jeden nebo více oblastí Nogo jsou zobrazeny na obrázku č. 2a. Je to například konzervativní oblast C-konce krysího proteinu Nogo, která obsahuje přibližně 180 aminokyselin aje kódována přibližně 540 nukleotidy kódující sekvence před stop kodonem. Také se popisují nukleotidové a aminokyselinové sekvence dvou hydrofóbních oblastí v konzervativní oblasti C-konce, to znamená od aminokyselin 988 do 1 023 a od aminokyseliny 1 090 do 1 125 v krysím proteinu Nogo A. Dále se popisují nukleotidové a aminokyselinové sekvence kyselé oblasti N-konce krysího proteinu Nogo A od zbytku 31 do zbytku 58.

Aby se uskutečnila funkční analýza různých oblastí proteinu Nogo, provedla se série delecí v genu Nogo a ten se klonoval do expresívního vektoru metodou rekombinace DNA a exprimoval se jako fúzní protein. Popisují se nukleové kyseliny, které kódují fragment proteinu Nogo. Jsou to například nukleové kyseliny, které kódují aminokyselinové zbytky 1 až 171, 172 až 974, 259 až 542 až 722, 172 až 259, 722 až 974 nebo 975 až 1 1562 SEQ ID NO: 2 nebo jejich kombinace a nukleové kyseliny, které kódují aminokyselinové zbytky 1 až 131, 132 až 939, 206 až 501, 501 až 680, 132 až 206, 680 až 939 a 940 až 1 127 SEQ ID NO: 30 nebo jejich kombinace. Některé deleční konstrukce obsahují zkrácené části proteinu Nogo a další nukleotidové sekvence kódující hexahistidinovou značku a/nebo T7-tag. Vynález popisuje nukleové kyseliny kódující zkrácené proteiny Nogo, kterým chybí aminokyselinové zbytky 172 až 259, aminokyselinové zbytky 974 až 1 162 nebo aminokyselinové zbytky 172 až 259 a 974 až 1 162 sekvence SEQ ID NO: 2, ale v jiném případě obsahuje zbytek sekvence SEQ ID NO: 2 nebo aminokyselinové zbytky 132 až 206, aminokyselinové zbytky 939 až 1 127 nebo aminokyselinové zbytky 132 až 206 a 939 až 1 127 sekvence SEQ ID NO: 30, ale v jiném případě obsahuje zbytek sekvence SEQ ID NO: 30. Struktura příkladu delečních konstrukcí je zobrazena na obrázku č. 18. Deleční konstrukce, když se zavedou do buňky produkují fragmenty nebo zkrácené části proteinu Nogo. Biologické aktivity těchto mutantů se testovaly v různých funkčních testech, jak se popisuje v tabulce č. 2. Specifická provedení klonování genu Nogo jsou následující:

V případě exprese klonů (metoda běžně známá v oboru) se zkonstruovala expresní knihovna metodami, které jsou dobře známy v oboru. Izolovala se například mRNA (lidská), vytvořila se cDNA a ligovala do expresního vektoru (například odvozeného z bakteriofága) tak, že je možné ji exprimovat v hostitelské buňce, do které se pak vektor zavede. Aby se vybral exprimovaný produkt Nogo je možné použít různé testy. V jednom provedení vynálezu se při selekci mohou použít protilátky proti proteinu Nogo.

V jiném provedení vynálezu se před selekcí při amplifikací požadované sekvence v genomové knihovně nebo v knihovně cDNA použije polymerázová řetězcová reakce (PCR). Oligonukleotidové primery reprezentující známé sekvence Nogo se mohou použít jako primery při reakci PCR.

V preferovaném provedení oligonukleotidové primery reprezentují alespoň část konzervativních segmentů Nogo se silnou homologií mezi geny Nogo různých druhů. Syntetické oligonukleotidy

-8CZ 304224 B6 se mohou využívat jako primery při amplifikaci PCR sekvencí ze zdroje (RNA nebo DNA), přičemž se upřednostňuje knihovna cDNA. PCR se provedla například za použití teplotního cyklovače Perkin-Elmer Cetus a Taq polymerázy (Gene Amp™). DNA, která se může amplifikovat, zahrnuje mRNA nebo cDNA nebo genomovou DNA z libovolných eukaryontů. Je možné syntetizovat několik různých degenerativních primerů, kteréjsou vhodné pro použití v reakcích PCR. Je také možné měnit přísnost podmínek hybridizace při navázání v reakcích PCR, což umožňuje dosažení vyššího nebo nižšího stupně podobnosti mezi známou nukleotidovou sekvencí Nogo a homologem nukleové kyseliny, která se má izolovat. Při hybridizaci, která se provádí mezi jednotlivými druhy, se preferují mírně přísné podmínky.

Po úspěšné amplifikaci segmentu homologu Nogo, segment se může molekulárně klonovat a sekvenovat a využívat jako sonda při izolaci celkové cDNA nebo genomového klonu. To naopak umožní stanovení celé nukleotidové sekvence genu, analýzu její exprese a produkci jejího proteinového produktu při funkční analýze, jak se popisuje dále v textu. Tímto způsobem se mohou identifikovat další geny kódující proteiny Nogo ajejich analogy.

Shora v textu popsané metody neomezují následující obecný popis metod, které umožňují získání klonů Nogo.

Libovolná eukaryontní buňka může sloužit jako zdroj nukleové kyseliny pro molekulární klonování genu Nogo. Sekvence nukleové kyseliny kódující protein Nogo se mohou izolovat z obratlovce, savce, člověka, prasete, myši, skotu, kočky, ptáka, koně, psa stejně jako z primáta nebo hmyzu atd. DNA se může získat standardním postupem, který je dobře znám v oboru, z klonované DNA (například z knihovny DNA), chemickou syntézou, klonováním cDNA nebo klonováním genomické DNA nebo jejích fragmentů, které se získaly izolací z požadované buňky (popisuje se na příklad v publikaci Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Glover, D. M. (ed.), 1985, DNA Clonning: A Particular Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II). Klony odvozené zgenomové DNA mohou vedle kódujících oblastí obsahovat regulační a intronové oblasti DNA. Klony získané z cDNA budou obsahovat pouze exonové sekvence. Nehledě na zdroj se gen může molekulárně klonovat do vhodného vektoru za účelem propagace genu.

Při molekulárním klonování genu z genomové DNA se vytvořily genomové fragmenty, kdy některý z nich bude kódovat požadovaný gen. DNA se může štěpit ve specifických místech za použití různých restrikčních enzymů. V jiném případě se může použít DNáza v přítomnosti manganu, přičemž dojde k fragmentaci DNA nebo DNA se může fyzikálně nastříhat, například sonikací. Lineární fragmenty DNA se pak mohou separovat podle velikosti standardní metodou, která zahrnuje elektroforézu na agarózovém a polyakrylamidovém gelu a kolonovou chromatografu.

Po té, co se vytvořily fragmenty DNA, může se provést identifikace specifického DNA fragmentu, který obsahuje požadovaný gen, řadou způsobů. Jestliže například množství části genu Nogo (libovolného druhu) nebo jeho specifické RNA nebo jeho fragment jsou dostupné a mohou se čistit a značit, vytvořené fragmenty DNA se mohou testovat hybridizaci nukleové kyseliny značenou sondou (popisuje se v publikaci Benton, W. and Davis, R., 1977, Science 196: 180, Grunstein, M. and Hogness, D., 1975, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72: 3961). Tyto fragmenty DNA budou hybridizovat se sondou s podstatnou homologií. Je také možné identifikovat vhodný fragment štěpením restrikčním enzymem a porovnat velikost fragmentů s těmi, které se očekávaly podle známé restrikční mapy, v případě, že je taková mapa dostupná. Další selekce se může provést na základě vlastností genu.

V jiném případě se přítomnost genu může detekovat testy založenými na fyzikálních, chemických nebo imunologických vlastnostech svého exprimovaného produktu. Mohou se vybrat klony cDNA nebo DNA, které produkují protein, který například vykazuje podobnou nebo identickou elektroforetickou migraci, izoelektrickou fokusující reakci, mapy proteolytického štěpení, post-9CZ 304224 B6 translační úpravy, kyselé a bazické vlastnosti nebo antigenní vlastnosti, které jsou známy v případě proteinu Nogo. Protilátky proti proteinu Nogo jsou dostupné a jsou to IN-1 a ΓΝ-2 (patent US 5 684 133), AS Bruna a AS 472. Příprava protilátek AS Bruna a AS 472 se popisují dále v textu. Protein Nogo se může identifikovat navázáním značené protilátky na putativně syntetizující klony Nogo v testu ELISA nebo western přenosem čištěných nebo celobuněčných extraktů.

Může se také identifikovat gen Nogo selekcí mRNA hybridizaci nukleové kyseliny, která následuje po translaci in vitro. Při tomto postupu se používají fragmenty pro izolaci komplementární mRNA pomocí hybridizace. Takové fragmenty DNA mohou reprezentovat dostupnou izolovanou DNA Nogo jiných druhů (například myší, lidská). Imunoprecipitační analýza nebo funkční testy (například schopnost tvorby agregátů in vitro, navázání na receptor) translačních produktů in vitro izolovaných produktů izolované mRNA identifikuje mRNA a komplementární fragmenty DNA, které obsahují požadované sekvence. Navíc specifická mRNA se může vybrat na základě adsorpce polyzomů izolovaných z buněk, aby se imobilizovaly protilátky specificky řízené proti proteinu Nogo. Radioaktivně značená cDNA Nogo se může syntetizovat za použití vybrané mRNA (z adsorbovaných polyzomů) jako templát. Radioaktivně značená mRNA nebo cDNA se může pak použít jako sonda při identifikaci fragmentů DNA Nogo mezi jinými fragmenty genomové DNA.

Alternativy pro izolaci genomové DNA Nogo zahrnují, ale nejsou omezeny na chemickou syntézu samotné genové sekvence ze známé sekvence nebo vytvořením cDNA z mRNA, která kóduje protein Nogo. RNA vhodná pro klonování cDNA genu Nogo se může izolovat z buněk, které exprimují Nogo. Je možné použít i jiné metody podle vynálezu.

Identifikovaný a izolovaný gen se pak může začlenit do vhodného klonovacího vektoru. Může se použít velký počet systémů vektor-hostitel, které jsou známy v oboru. Možné vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na plazmidy nebo upravené viry, ale vektorový systém musí být kompatibilní s použitou hostitelskou buňkou. Takové vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na bakteriofágy, jako jsou deriváty lambda nebo plazmidy, jako jsou deriváty plazmidu pBR322 nebo pUC nebo vektor Bluescript (Stratagene). Ve specifickém příkladu vynálezu se gen Nogo klonuje do pcDNA3 s epitopem tag, čímž se zjednoduší analýza exprese proteinu.

Začlenění do klonovacího vektoru se může například uskutečnit ligací fragmentu DNA do klonovacího vektoru, který má komplementární kohezivní konec. Jestliže však komplementární restrikční místa používaná ve fragmentu DNA nejsou přítomny v klonovacím vektoru, pak konce molekul DNA se mohou enzymaticky upravit. V jiném případě libovolné požadované místo se může produkovat ligací nukleotidových sekvencí (linkerů) na konec DNA. Tyto ligované linkery mohou obsahovat specificky chemicky syntetizované oligonukleotidy kódující sekvence, které rozeznávají restrikční endonukleázy. Při alternativní metodě se štěpený vektor a gen Nogo může modifikovat homopolymémím zakončením. Rekombinantní molekuly se mohou zavést do hostitelských buněk prostřednictvím transformace, transfekce, infekce, elektroporace atd., tak, že se vytvoří řada kopií genových sekvencí.

Při jiné metodě se požadovaný gen může identifikovat a izolovat po začlenění do vhodného klonovacího vektoru pomocí „děla“. Obohacení požadovaným genem například frakcionací podle velikosti se může provést před začleněním do klonovacího vektoru.

Ve specifickém provedení vynálezu transformace hostitelských buněk rekombinantních molekul DNA, které začleňují izolovaný gen Nogo, cDNA nebo syntetizovanou sekvenci DNA umožňuje vytvoření velké množství kopií genu. Gen se tak může získat ve velkém množství pomocí rostoucích transformantů, izolací molekul rekombinantní DNA z transformantů a jestliže to je nutné, izolací začleněného genu z izolované rekombinantní DNA.

Sekvence Nogo podle vynálezu zahrnují tyto nukleotidové sekvence kódující v podstatě stejné aminokyselinové sekvence, jak se vyskytují v přirozených proteinech Nogo a ty kódované ami- 10CZ 304224 B6 nokyselinovými sekvencemi s funkčně ekvivalentními aminokyselinami stejně jako sekvencemi, které kódují deriváty nebo analogy Nogo, jak se popisuje dále v textu v případě derivátů a analogů Nogo.

Exprese genů Nogo

Nukleotidová sekvence kódující protein Nogo nebo funkčně aktivní analog nebo fragment nebo jiný jeho derivát (zobrazeno na obrázcích č. 1 b a 2a, popisuje se dále v textu) se může začlenit do vhodného expresního vektoru, to znamená do vektoru, který obsahuje nezbytné elementy vhodné pro transkripci a translaci začleněné sekvence kódující protein. Nezbytné transkripční a translační signály se mohou také poskytnout přirozeným genem Nogo a/nebo její lemující sekvencí. Kódující sekvence se může také značit sekvencí, která kóduje dobře popsaný antigen nebo biologickou molekulu, která má známé vazebné vlastnosti s vazebným partnerem (například epitop myc, histidinovou značku, epitop T7 atd., zobrazeno na obrázku č. 1 la až 11c dále v textu). Tato další sekvence se může využít při izolaci proteinu Nogo, proteinového fragmentu nebo derivátu za použití interakce vazebné skupiny s odpovídajícím partnerem, kterýje přichycen na pevný podklad.

Různé systémy hostitel-vektor se mohou využít k expresi sekvence kódující protein. Tyto systémy zahrnují, ale nejsou omezeny na savčí buněčné systémy infikované virem (například virus vakcínie, adenovirus atd.), systémy hmyzích buněk infikované virem (například bakulovirus), mikroorganizmy, takové jako jsou kvasinky obsahující kvasinkové vektory nebo bakterie transformované bakteriofágem, DNA, plazmidová DNA nebo kosmidová DNA. Expresivní elementy vektorů se liší v jejich intenzitě a specifitě. V závislosti na využívaném systému vektor-hostitel se může použít libovolný z počtu vhodných transkripčních a translačních elementů. Ve specifických provedeních vynálezu se exprimuje lidský gen Nogo, buď jako Nogo A, Nogo B nebo Nogo C (zobrazeno na obrázku č. lb). V jiném provedení vynálezu se exprimuje fragment Nogo obsahující oblast proteinu Nogo.

Termín „buňka se transformovala nukleovou kyselinou“ znamená, že taková buňka obsahuje po zavedení nukleové kyseliny do buňky nebo do její rodičovské buňky například transfekcí, elektroporací, transdukcí atd., nukleovou kyselinu, která není přirozeně přítomna v buňce.

Vynález popisuje nukleotidové sekvence kódující fragmenty lidského Nogo A obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 131, 132 až 939, 206 až 501, 501 až 680, 132 až 206, 680 až 939 a 940 až 1 127 sekvence SEQ ID NO: 30. Také se popisují nukleotidové sekvence, které kódují zkrácené oblasti lidského proteinu Nogo A, zkráceným proteinům chybí aminokyselinové zbytky 132 až 206, aminokyselinové zbytky 939 až 1 127 nebo aminokyselinové zbytky 132 až 206 a 939 až 1 127 sekvence SEQ ID NO: 30, ale jinak obsahují zbytek sekvence SEQ ID NO: 30.

Libovolné dříve popsané metody vhodné pro začlenění fragmentů DNA do vektoru se mohou použít ke konstrukci expresivních vektorů, které obsahují chimérický gen obsahující vhodný transkripční/translační kontrolní signály a proteinové kódující sekvence. Tyto metody mohou zahrnovat rekombinantní DNA in vitro a syntetické metody a in vivo rekombinanty (genetická rekombinace). Exprese sekvence nukleové kyseliny kódující protein Nogo nebo peptidový fragment se může regulovat druhou sekvencí nukleové kyseliny tak, že protein nebo peptid Nogo se exprimuje v hostiteli transformován s molekulou rekombinantní DNA. Exprese proteinu Nogo se může řídit libovolným elementem promotoru/zesilovače, který je znám v oboru. V příkladném provedení vynálezu je vhodné použít jeden z přirozených promotorů Nogo, buď Pl nebo P2, který se popisuje dále v textu. Může se také použít nepřirozený promotor. Promotory, které se mohou použít, řídí expresi genu Nogo a zahrnují, ale nejsou omezeny na oblast časného promotoru SV40 (popisuje se v publikaci Bemoist and Chambon, 1981, Nátuře 290: 304-310), promotor obsažený v dlouhé terminální repetici 3'konce viru Rousova sarkomu (popisuje se v publikaci Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-797), promotor thymidinové kinázy viru herpes (popisuje

- 11 CZ 304224 B6 se v publikaci Wagner et al., 1981, Proč. Nati. Acad.Sci U.S.A. 78: 1 441-1 445), regulační sekvence genu metalothioneinu (popisují se v publikaci Brinster et al., 1982, Nátuře 296: 39<12), prokaryontní expresní vektory, jako jsou promotor β-laktamázy (popisuje se v publikaci Villa— Kamaroff, et al., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3 727-3 731) nebo promotor tac (popisuje se v publikaci DeBoer et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25, „Useful proteins from recombinant bacteria“ Scientific American, 1980, 242: 74-94), rostlinné expresní vektory obsahující oblast promotoru neopalinové syntetázy (Herrera-Estrella et al., Nátuře 303: 209-213) nebo 35S RNA promotor květákového mozaikového viru (popisuje se v publikaci Gerdner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871) a promotor fotosyntetické enzymové ribulózové bifosfátové karboxylázy (popisuje se v publikaci Herrera-Estrella et al., 1984, Nátuře 310: 115-120), promotorové elementy z kvasinek nebo jiných hub, takové jako je promotor Gal 4, promotor ADC (dehydrogenáza alkoholu), promotor PGK (fosfoglycerolová kináza), promotor alkalické fosfatázy a následující zvířecí transkripční řídící oblasti, které vykazují tkáňovou specifitu a využívají se u transgenních zvířat: řídící oblast genu elastázy I, která je aktivní v pankreatických acinámích buňkách (popisuje se v publikaci Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646, Omitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409, MacDonald, 1987, Hepatology, Ί: 425-515), oblast řídící gen inzulínu, kteráje aktivní v pankreatických buňkách beta (Hanahan, 1985, Nátuře 315: 115-122), řídící oblast genu imunoglobulinu, kteráje aktivní v lymfoidních buňkách (popisuje se v publikaci Grosscheld et al., 1984, Cell 38: 647-658, Adames et al., 1985, Nátuře 318: 533-538, Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1 436-1 444), řídící oblast viru nádoru prsní žlázy u myší, která je aktivní v testikulámích, prsních, lymfoidních a žímých buňkách (popisuje se v publikaci Leder et al., 1986, Cell 45: 485—495), oblast řídící gen albuminu, kteráje aktivní v játrech (popisuje se v publikaci Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), oblast řídící gen alfa-fetoproteinu, kteráje aktivní v játrech (popisuje se v publikaci Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1 639-1 648, Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58) oblast řídící gen alfa 1-antitrypsin, který je aktivní v játrech (popisuje se v publikaci Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), oblast kontrolující gen beta-globinu, kteráje aktivní v myeloidních buňkách (Mogram et al., 1985, Nátuře 315: 338-340, Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94, oblast řídící gen myelinového základního proteinu, který je aktivní v oligodendrocytech v mozku (popisuje se v publikaci Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712), oblast řídící gen myosinového lehkého řetězce 2, kteráje aktivní v kosterním svalu (popisuje se v publikaci Sani, 1985, Nátuře 314: 283-286) a oblast řídící gen uvolňování gonadotropického hormonu, který je aktivní v hypotalamu (popisuje se v publikaci Mason et al., 1986, science 234: 1372-1378).

Ve specifickém provedení vynálezu používaný vektor obsahuje promotor operativně spojený s nukleovou kyselinou kódující Nogo, jeden nebo více počátků replikace a jeden nebo více selekčních markérů (například gen rezistence na antibiotika).

Ve specifickém provedení vynálezu se expresní konstrukce připravila subklonováním sekvence kódující Nogo do restrikčního místa enzymu EcoRI každého ze tří vektorů pGEX (expresní vektory glutathionové S transferázy, popisuje se v publikaci Smith and Johnson, 1988, Gene 7: 3140). To umožňuje exprimovat protein Nogo ze subklonu ve správném čtecím rámci.

Expresní vektory obsahující inzerty genu Nogo se mohou identifikovat třemi obecnými přístupy a) hybridizací nukleové kyseliny, b) přítomností nebo absencí funkcí „markerového“ genu a c) expresí začleněných sekvencí. V prvním přístupu přítomnost genu Nogo začleněného do expresního vektoru se může detekovat hybridizací nukleové kyseliny za použití sond, které obsahují sekvence homologní se začleněným genem Nogo. Ve druhém přístupu se může identifikovat a vybrat rekombinantní vektor/hostitelský systém na základě přítomnosti nebo absence jistých markerových genových funkcí (například aktivity thymidin kinázy, rezistence na antibiotika, transformační fenotyp, vytvoření okluze v bakuloviru atd.), což je způsobeno inzercí genu Nogo do vektoru. Jestliže se gen Nogo začlenil do sekvence markerového genu vektoru, mohou se rekombínanty obsahující inzert Nogo identifikovat nepřítomností funkce markerového genu. Rekombinantní expresní vektory se mohou identifikovat testováním produktu Nogo exprimova- 12CZ 304224 B6 ného rekombinantem. Takové testy mohou být založeny na fyzikálních a funkčních vlastnostech proteinu Nogo v testovacích systémech in vitro například navázáním na protilátky proti Nogo.

Po té, co se identifikovala a izolovala rekombinantní molekula DNA, může se pro její propagaci použít několik metod, které jsou dobře známy v oboru. Po té, co je zaveden vhodný hostitelský systém a růstové podmínky, rekombinantní expresní vektory se mohou propagovat a připravovat ve velkém množství. Jak už se vysvětlilo dříve v textu, expresní vektory, které se mohou využít, zahrnují, ale nejsou omezeny na následující vektory nebo jejich deriváty: lidské a zvířecí viry, jako je virus vakcínie a adenovirus, hmyzí viry, jako je bakulovirus, kvasinkové vektory, bakteriofágové vektory (například lambda)) a plazmidové nebo kozmidové DNA vektory.

Navíc se může vybrat kmen hostitelské buňky, který upravuje exprese začleněných sekvencí nebo upravuje a zpracovává genový produkt požadovaným specifickým způsobem. Exprese z jistých promotorů může zesílit v přítomnosti jistých indukčních činidel, čímž je možné řídit expresi geneticky manipulovaného proteinu Nogo. Různé hostitelské buňky dále vykazují charakteristické a specifické mechanizmy pro translační a post-translační postup a úpravu (například glykosylaci, fosforylaci proteinů). Vhodné buněčné linie nebo hostitelské systémy se mohou vybrat k zajištění požadované modifikace a zpracování exprimovaného cizorodého proteinu. Například exprese bakteriálního systému se může použít k produkci neglykosylovaného jaderného proteinového produktu. Exprese v kvasinkách bude produkovat glykosylační produkt. Exprese v savčích buňkách se může použít k zajištění přirozené glykosylace heterologního proteinu. Různé vektorové/expresní systémy mohou ovlivňovat reakce zpracování v různém rozsahu.

V jiných provedeních vynálezu protein Nogo, fragment, analog nebo derivát se může exprimovat jako fúze nebo produkt chimérického proteinu (obsahující protein, fragment, analog nebo derivát spojený prostřednictvím peptidové vazby na heterologní proteinovou sekvenci (odlišného proteinu)). Takový chimérický produkt se může připravit ligací vhodných sekvencí nukleové kyseliny, které kódují sekvence požadované aminokyseliny, metodami, které jsou dobře známy v oboru. To probíhá ve vhodném kódujícím rámci a exprimuje se chimérický produkt vyrobený syntézou proteinu, například použitím syntetizátoru peptidu.

Sekvence cDNA a genomové sekvence se mohou klonovat a exprimovat.

Identifikace a izolace produktů genu Nogo

Vynález poskytuje aminokyselinové sekvence Nogo, přednostně lidské Nogo ajeho fragmenty a deriváty, které obsahují antigenní determinantu (to znamená, že mohou být rozeznány protilátkou) nebo které jsou jinak funkčně aktivní, stejně jako jejich sekvence nukleových kyselin. Termín „funkčně aktivní“ materiál Nogo znamená, že materiál vykazuje jednu nebo více známých funkčních aktivit spojených s plnou délkou (divoký typ) proteinu Nogo A, například vlastnosti nepermisivního substrátu, kolaps růstu ganglií dorzálních kořenů, inhibice rozšíření buněk NIH 3T3, inhibice nadměrného růstu neuritů, navázání na substrát Nogo nebo vazebného partnera Nogo, antigenicita (navázání na protilátky proti Nogo), imunogenicita atd.

Ve specifických provedeních podle vynálezu fragmenty proteinu Nogo obsahují alespoň 6 aminokyselin, 10 aminokyselin, 17 aminokyselin, 50 aminokyselin, 100 aminokyselin nebo alespoň 220 aminokyselin. V jiném provedení podle vynálezu proteiny obsahují podstatně vysoce konzervativní oblast C-konce proteinu Nogo (188 aminokyselin C-konce proteinu Nogo A). Vynález dále popisuje fragmenty nebo proteiny obsahující fragmenty, kterým chybí konzervativní oblast C-konce nebo hydrofobní části C-konce nebo aminoterminální kyselé oblasti nebo aminoterminální polyprolinovou oblast nebojejí libovolnou kombinaci nebo protein Nogo. Vynález také popisuje nukleové kyseliny kódující uvedené oblasti, fragmenty a proteiny.

Po té, co se identifikoval rekombinant, který exprimuje sekvenci genu Nogo, analyzoval se genový produkt. Toho se dosáhlo testy založenými na fyzikálních a funkčních vlastnostech produktu,

- 13 CZ 304224 B6 které zahrnují radioaktivní značení produktu následované analýzou gelovou elektroforézou, imunitním testem atd.

Po té, co se identifikoval protein Nogo, může se izolovat a čistit standardními metodami, které zahrnují chromatografii (například chromatografií s výměnou iontů, afinitní chromatografií a kolonovou chromatografií dělící podle velikosti), centrifugaci, dělení na základě rozdílné rozpustnosti nebo jinými standardními metodami čištění proteinů. Funkční vlastnosti se mohou hodnotit za použití libovolného vhodného testu zahrnující snížení růstu ganglií dorzálních kořenů, inhibici rozšíření buněk NIH 3T3, inhibici regenerace neuritů ve zrakovém nervu (popisuje se dále v textu).

V jiném případě vynálezu po identifikaci proteinu Nogo produkovaného rekombinantem se může odvodit aminokyselinová sekvence proteinu z nukleotidové sekvence chimérického genu obsaženého v rekombinantu. Protein se může syntetizovat pomocí standardních chemických metod, které jsou dobře známy v oboru (popisuje se například v publikaci Hunkapiller, M., et al., 1984, Nátuře 310: 105-111).

V jiném alternativním provedení vynálezu se může přirozený Nogo C izolovat z přirozených zdrojů standardními metodami, které se popisují shora v textu (například imunoafinitním čištěním).

Ve specifickém provedení vynálezu takové proteiny Nogo, ať už jsou produkovány metodou rekombinace DNA nebo metodami chemické syntézy nebo čištěním přirozených proteinů zahrnují primární aminokyselinovou sekvenci, všechny nebo část aminokyselinové sekvence, jak je znázorněna na obrázku č. 2a (SEQ ID NO: 2), nebo lidskou sekvenci znázorněnou na obrázku č. 13 (SEQ ID NO: 29, stejně jako fragmenty nebo jiné deriváty (které jsou například znázorněny na obrázku č. 18) a jejich analogy, které zahrnují jejich homologní proteiny. Upřednostňuje se, aby proteiny Nogo neobsahovaly žádný volný CNS myelinový materiál, se kterým je v normálním případě spojen.

Struktura genu a proteinu Nogo

Struktura genu a proteinu Nogo se může analyzovat různými metodami, které jsou dobře známy v oboru a několika dalšími metodami, které se popisují v následujícím textu.

Genetická analýza

Klonovaná DNA nebo cDNA odpovídající genu Nogo se může analyzovat metodami zahrnujícími Southemovou hybridizaci (Southern, E. M., 1975, J. Mol. Biol. 98: 503—517), northem hybridizaci (například Freeman et al., 1983, proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4094^4098), mapování pomocí restrikčních endonukleáz (popisuje se v publikaci Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) a analýza sekvence DNA. Polymerázová řetězcová reakce (PCR, popisuje se v dokumentech US 4 683 202, US 4 683 195 a US 4 889 818, Gyllenstein et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7652-7656, Ochman et al., 1988, Genetics 120: 621-623, Loh et al., 1989, Science 243: 217-220) následovaná Southemovou hybridizaci se sondou specifickou pro Nogo umožňuje detekci genu Nogo v DNA pocházející z různých buněčných typů. Mohou se také použít metody amplifikace, které jsou jiné než PCR. V jednom provedení vynálezu se může použít Southemovy hybridizace, aby se stanovilo genetické spojení genu Nogo. Analýza northemu hybridizaci se může použít ke stanovení exprese genu Nogo. V různých buněčných typech v různém stádiu vývoje nebo aktivity se může testovat, zda dochází k expresi genu Nogo. Přísnost hybridizačních podmínek při Southemově a northem hybridizaci se může ovlivňovat, aby se zajistila detekce nukleových kyselin s požadovaným stupněm vztahu k používané specifické sondě Nogo. Může se použít modifikace těchto metod a jiných metod, které jsou dobře známy v oboru.

- 14CZ 304224 B6

Mapování restrikčními endonukleázami se může použít při hrubém stanovení genetické struktury genu Nogo. Restrikční mapy získané štěpením restrikčními endonukleázami se mohou potvrdit analýzou sekvence DNA.

Analýza sekvence DNA se může uskutečnit libovolnou metodou známou v oboru, která zahrnuje, ale neomezuje se na metodu podle Maxama a Gilberta (popisuje se v publikaci Maxam and Gilbert et al., 1980, Meth. Enzymol. 65: 499-560), Sangerovu dideoxy metodu (popisuje se v publikaci Sanger, F., et al., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463), použití DNA polymerázy T7 (popisuje se v publikaci Tábor and Richardson, dokument US 4 795 699) nebo použití automatizovaného sekvenátoru DNA (například Applied Biosystems, Foster City, CA).

Analýza proteinů

Aminokyselinová sekvence proteinu Nogo se může odvodit dedukcí ze sekvence DNA nebo v jiném případě přímou sekvenací proteinu například automatickým sekvenátorem aminokyselin.

Sekvence proteinu Nogo se může dále charakterizovat analýzou hydrofility (popisuje se v publikaci Hopp, T. and Woods, K., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824). Profil hydrofility se může použít k identifikaci hydrofobních a hydrofilních oblastí proteinu Nogo a odpovídajícím oblastem genové sekvence, která kóduje takové oblasti.

Může se také provést analýza struktury (popisuje se v publikaci Chou, P. and Fasman, G., 1974, Biochemistry 13: 222), aby se identifikovaly oblasti Nogo, které předpokládají specifickou sekundární strukturu.

Manipulace, translace a předpoklad sekundární struktury, předpoklad a vynesení otevřeného čtecího rámce, stejně jako stanovení sekvenční homologie se může také uskutečnit použitím počítačových programů, které jsou dostupné v oboru.

Mohou se použít také jiné metody strukturální analýzy. Ty zahrnují krystalografii pomocí paprsků X (popisuje se v publikaci Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13) a počítačové modelování (popisuje se v publikaci Fletterick, R. and Zoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, New York).

Vytvoření protilátek proti proteinům Nogo ajejich deriváty

Protein Nogo, jeho fragment nebo jiné deriváty nebo analogy se mohou použít jako imunogen při vzniku protilátek, které se imunospecificky váží na takový imunogen. Takové protilátky zahrnují, ale nejsou omezeny na polyklonální, monoklonální, chimérické protilátky, jednotlivé řetězce, fragmenty Fab a expresní knihovnu Fab. Produkují se protilátky řízené proti rekombinantnímu fragmentu krysího nebo bovinního proteinu Nogo (popisuje se dále v textu), přičemž tyto protilátky také zkříženě reagují s epitopy jiných druhů. V jiném provedení vynálezu, fragmenty proteinu Nogo identifikované jako hydrofilní se také používají jako imunogeny při produkci protilátek.

Při produkci polyklonálních protilátek proti proteinu Nogo nebo derivátu nebo analogu se mohou použít různé postupy, které jsou dobře známy v oboru. V určitém provedení vynálezu se mohou získat králičí polyklonální protilátky vůči epitopu proteinu Nogo kódované sekvencí SEQ ID NO:2 na obrázku č. 2a, SEQ ID NO: 29 na obrázku č. 12, SEQ ID NO: 32 na obrázku č. 14 nebo SEQ ID NO: 30 na obrázku č. 13 (krysí protein Nogo A, bovinní protein Nogo, krysí protein Nogo C nebo lidský protein Nogo) nebo jeho subsekvence. Při produkci protilátky se různí zvířecí hostitelé mohou imunizovat injekcí s přirozeným proteinem Nogo nebo sjeho syntetickou verzí nebo derivátem (například fragment), který zahrnuje králíky, myši, krysy atd. Ke zvýšení imunologické odezvy se mohou použít různá adjuvans v závislosti na druzích hostitele. Tato

- 15CZ 304224 B6 adjuvans zahrnují Freundovo adjuvans (úplné nebo neúplné), minerální gely, jako jsou například hydroxid hlinitý, povrchově aktivní činidla, jako je lyzolecitin, pluronní polyoly, polyanionty, peptidy, olejové emulze, hemocyaniny přílipkovitých plžů, dinitrofenol a potencionálně použitelné lidské adjuvans, jako je BCG (bacil Calmette-Guerin) a corynobacterium parvum.

Při přípravě monoklonálních protilátek určených proti sekvenci proteinu Nogo nebo jeho analogu se může použít libovolný způsob, při kterém dochází k produkci molekul protilátek kontinuálními buněčnými liniemi. Může se například použít metoda hybridomů podle Kohlera a Milsteina (popisuje se v publikaci Kohler and Milstein, 1975, Nátuře 256: 495^497) stejně jako metoda triomů, metoda hybridomů lidské B-buňky (popisuje se v publikaci Koznor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) a metoda EBV-hybridomu, přičemž vznikají lidské monoklonální protilátky (popisuje se v publikaci Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., pp. 77-96). Monoklonální protilátky se mohou produkovat u zvířat, která neobsahují parazity za použití jisté technologie popsané v dokumentu PCT/US90/02545. Podle vynálezu se mohou lidské protilátky použít a získat za použití lidských hybridomů (popisuje se v publikaci Cote et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2 026-2 030) nebo transformací lidských B buněk virem EBV in vitro (popisuje se v publikaci Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96). Ve skutečnosti podle vynálezu metoda vyvinutá pro produkci „chimérických protilátek“ (popisuje se v publikaci Morrison et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855, Neuberger et al., Nátuře 312: 604-608, Takeda et al., 1985, Nátuře 314: 452—454) sestřihává geny z myší molekuly protilátek, která je specifická pro protein Nogo spolu s geny z lidské protilátkové molekuly vhodné biologické aktivity. Takové protilátky jsou také předmětnou věcí vynálezu.

Postup vhodný pro produkci jednořetězcových protilátek (popisuje se v publikaci - patent US 4 946 778) se může upravit tak, aby se produkovaly jednořetězcové protilátky specifické pro protein Nogo. Mohou se také použít metody popsané pro konstrukci expresní knihovny Fab (popisuje se v publikaci Huse et al., 1989, Science 246: 1 275-1 281), což umožňuje rychlou a jednoduchou identifikaci mononukleálních fragmentů Fab s požadovanou specifitou v případě proteinů Nogo nebo jeho analogů nebo derivátů.

Fragmenty protilátek, které obsahují idiotyp molekuly, se mohou vytvořit známou metodou. Takové fragmenty například zahrnují, ale nejsou omezeny na fragment F(ab')₂, který se může produkovat štěpením pepsinem molekuly protilátky, fragmenty F(ab')₂, které se mohou vytvořit redukcí disulfidových můstků fragmentu F(ab')₂, fragmenty Fab, které se mohou vytvořit ošetřením molekulou protilátky s papainem a redukčním činidlem a fragmenty Fv.

Při produkci protilátek se může uskutečnit testování žádaných protilátek metodou, která je dobře známa v oboru. Touto metodou je například test ELISA. Aby se vybraly protilátky, které rozeznávají specifickou oblast proteinu Nogo, je možné testovat vytvořené hybridomy za účelem zjištění přítomnosti produktu, který se váže na fragment Nogo obsahující uvedenou oblast. Při selekci protilátky, která se specificky váže na první homolog proteinu Nogo, ale která se neváže specificky na odlišný homolog Nogo, je možné zvolit na základě pozitivního navázání prvního homologu Nogo a chybějícímu navázání druhého homologu Nogo.

Vynález také popisuje protilátky specifické pro oblast proteinu Nogo.

Cizorodé protilátky se mohou použít při metodě, která je známa v oboru a vztahuje se k lokalizaci a aktivitě sekvencí proteinu Nogo podle vynálezu. Je to například zviditelnění těchto proteinů, měření jejich množství ve vhodných fyzikálních vzorcích a to například při diagnostické metodě atd.

Protilátky proti Nogo ajeho fragmentům, které obsahují vazebnou oblast, se mohou použít jako terapeutika.

- 16CZ 304224 B6

Proteiny Nogo, jeho deriváty a analogy

Vynález dále popisuje proteiny Nogo a deriváty (zahrnující fragmenty) a analogy proteinů Nogo. Popisují se nukleové kyseliny kódující protein Nogo, deriváty a proteinové analogy. V jednom provedení vynálezu se proteiny Nogo kódují nukleovými kyselinami Nogo popsanými shora v textu. Proteiny Nogo A, Nogo B nebo Nogo C a deriváty a analogy jsou zvířecí proteiny a jsou popisovány vynálezem. Mezi uvedená zvířata patří myš, krysa, prase, kráva, pes, opice, člověk, moucha nebo žába.

Vynález také popisuje produkci a použití derivátů a analogů příbuzných proteinu Nogo. Ve specifickém provedení vynálezu je derivát i analog funkčně aktivní, to znamená, že je schopný vykazovat jednu nebo více funkčních aktivit spojených s proteinem Nogo divokého typu v plné délce. Mohou se použít deriváty a analogy, které vykazují požadovanou imunogenicitu nebo antigenicitu v imunologických testech, při imunizaci, při inhibici aktivity Nogo atd. Deriváty nebo analogy, které si ponechávají nebo v jiném případě jim chybí nebo inhibují požadované vlastnosti proteinu Nogo (například navázání na vazebného partnera proteinu Nogo) se mohou použít jako indukční činidla nebo inhibitory takových vlastností. Specifické provedení vynálezu popisuje fragment proteinu Nogo, který se váže na protilátky proti Nogo. U derivátů a analogů proteinu Nogo se může testovat požadovaná aktivita postupem, který je znám v oboru, který zahrnuje testy popsané shora v textu.

Za účelem mapovat aktivní oblasti proteinu Nogo se připravila série delečních mutantů Nogo pomocí metody rekombinace DNA, jak se popisuje dále v textu. Oblasti Nogo, kteréjsou přítomny v delečních mutantech jsou zobrazeny na obrázku č. 18. Ve specifickém provedení vynálezu se popisují fragmenty proteinu Nogo, například fragmenty obsahující aminokyseliny proteinu Nogo A (SEQ ID NO: 2) čísla 1 až 171, 172 až 974, 259 až 542, 542 až 722, 722 až 974, 172 až 259 nebo 975 až 1 162 nebo jejich kombinaci. Vynález dále popisuje zkrácené mutanty proteinu Nogo neobsahující aminokyseliny čísla 172 až 259 a/nebo 975 až 1 162 sekvence SEQ ID NO: 2, přičemž uvedené oblasti se jeví být nepodstatné a mohou se odstranit, aniž se ovlivní biologická aktivita. Popisují se také odpovídající fragmenty lidského proteinu Nogo A obsahující aminokyseliny číslo 1 až 131, 132 až 939, 206 až 501, 501 až 680, 132 až 206, 680 až 939 nebo 940 až 1 127 sekvence SEQ ID NO: 30. Vynález dále popisuje zkrácené mutanty lidského proteinu Nogo A, kterým chybí aminokyseliny číslo 132 až 206, aminokyselinové zbytky 939 až 1 127 nebo aminokyselinové zbytky 132 až 206 a 939 až 1 127 sekvence SEQ ID NO: 30.

Ve specifickém provedení vynálezu fragmenty neobsahují žádný volný CNS myelinový materiál a/nebo vykazují inhibiční aktivitu proteinu Nogo. Vynález dále popisuje fúzní proteiny obsahující jeden nebo více shora popsaných fragmentů fúzovaných se sekvencí, který není sekvencí proteinu Nogo.

Deriváty genu Nogo se mohou připravit změnou sekvence genu Nogo substitucemi, adicemi nebo delecemi, které poskytují funkčně ekvivalentní molekuly. Vzhledem k degeneraci nukleotidových kódujících sekvencí jiné sekvence DNA, které kódují v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako je gen Nogo, se mohou použít při praktickém použití vynálezu. Tyto sekvence zahrnují, ale nejsou omezeny na nukleotidové sekvence obsahující celou nebo části genů Nogo, které se změnily substitucí různých kodonů, které kódují funkčně ekvivalentní aminokyselinový zbytek v sekvenci, čímž dochází k tiché změně. Deriváty Nogo podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na primární aminokyselinovou sekvenci, celou nebo část aminokyselinové sekvence proteinu Nogo, která zahrnuje změněné sekvence, ve které funkčně ekvivalentní aminokyselinové zbytky se substituovaly za zbytky v sekvenci, což vede k tichým změnám. Jeden nebo více aminokyselinových zbytků v sekvenci se může konzervativně substituovat jinou aminokyselinou s podobnou polaritou, která působí jako funkční ekvivalent, což vede k tiché změně. Substituenty aminokyseliny v sekvenci se mohou vybrat z jiných členů třídy, do které aminokyselina patří. Monopolámí (hydrofobní) aminokyseliny zahrnují alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. Polární neutrální aminokyseliny zahrnují glycin, serin, treo- 17CZ 304224 B6 nin, cystein, tyrozin, asparagin a glutamin. Pozitivně nabité (bazické) aminokyseliny zahrnují arginin, lyzin a histidin. Negativně nabité (kyselé) aminokyseliny zahrnují kyselinu asparagovou a glutamovou.

Ve specifickém provedení vynálezu proteiny obsahují fragment proteinu Nogo, který zahrnuje alespoň 10 kontinuálních aminokyselin proteinu Nogo. V jiných provedeních vynálezu takové fragmenty nejsou větší než 35, 100 nebo 200 aminokyselin. Deriváty nebo analogy proteinu Nogo zahrnují, ale nejsou omezeny na molekuly obsahující oblasti, které jsou v podstatě homologní s proteinem Nogo nebo sjeho fragmenty (například v různých provedeních vynálezu se pomocí počítačového programu zjistilo alespoň 60 % nebo 70 % nebo 80 % nebo 90 % nebo 95 % shody v aminokyselinové sekvenci shodné velikosti nebo když se porovnává s uspořádanou sekvencí, ve které se uspořádání provede počítačovým programem, který je dobře znám v oboru; je to například počítačový program BLAST (popisuje se v publikaci Altschul et al., 1994, Nátuře Genet. 6: 119-129)), nebo jejichž kódující nukleová kyselina je schopná hybridizovat s kódující sekvencí Nogo za přísných, mírně přísných a mírných podmínek.

Dále se popisují molekuly obsahující fragmenty Nogo, které například obsahují uhlovodíkové vazby sjinými částmi, které zahrnují značky nebo bioaktivní části.

Deriváty a analogy Nogo podle vynálezu se mohou produkovat různými metodami, které jsou známy v oboru. Manipulace, které vedou k produkci derivátů a nebo analogů Nogo se mohou vyskytovat na úrovni genu nebo proteinu. Klonovaná sekvence genu Nogo se může upravit libovolným počtem strategií, které jsou známy v oboru (popisuje se v publikaci Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor, New York). Sekvence se může štěpit ve vhodných místech restrikčními endonukleázami a pak následují, jestliže je to nutné, další enzymatické úpravy, izolace a ligace in vitro. Při produkci genu, který kóduje derivát nebo analog proteinu Nogo, by se mělo zajistit, aby upravený gen zůstal ve stejném translačním čtecím rámci jako Nogo, nepřerušily se stop signály translace v genové oblasti, kde se kóduje požadovaná aktivita proteinu Nogo.

Navíc sekvence nukleové kyseliny kódující protein Nogo se může mutovat in vitro nebo in vivo, přičemž vzniká a/nebo zaniká translační, iniciační a/nebo terminační sekvence nebo vznikají variace v kódujících oblastech a/nebo se tvoří nová místa rozeznávaná restrikčními endonukleázami nebo se odstraňují dříve existující místa, přičemž to umožňuje další modifikace in vitro. Může se použít libovolná metoda mutageneze, která je známa v oboru, přičemž jsou zahrnuty chemická mutageneze, in vitro místně řízená mutageneze (popisuje se v publikaci Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem 253: 6 551), použití linkerů TAB® (Pharmacia) atd.

Manipulace sekvence Nogo se může také vytvořit na úrovni proteinu. Vynález popisuje fragmenty proteinu Nogo nebo jeho deriváty nebo analogy, které se během nebo po translaci odlišně upravují, například glykosylací, acety lácí, fosforylací, amidací, derivatizací známými ochrannými nebo blokačními skupinami, proteolytickým štěpením, navázáním na molekulu protilátek nebo jiného buněčného ligandu atd. Libovolný počet chemických modifikací se může provést pomocí metod dobře známých v oboru, které zahrnují specifické chemické štěpení cyanogenbromidem, trypsinem, chymotrypsinem, papainem, proteázou V8, NaBH₄, acetylací, formylací, oxidací, redukcí, metabolickou syntézou v přítomností tunikamycinu atd.

Navíc analogy a deriváty Nogo se mohou syntetizovat chemicky. Peptid odpovídající části proteinu Nogo, který obsahuje požadovanou oblast nebo který zprostředkovává požadovanou aktivitu in vitro se může syntetizovat použitím peptidového syntetizátoru. Dále, je-li to nutné, do sekvence Nogo se mohou zavést jako substituce nebo adice neklasické aminokyseliny nebo chemické analogy aminokyselin. Neklasické aminokyseliny zahrnují, ale nejsou limitovány na D-izoméry běžných aminokyselin, α-aminobutyrová kyselina, Abu, 2-aminobutyrová kyselina, γ-Abu, s-Ahx, 6-aminohexanová kyselina, Aib, 2-aminoizobutyrová kyselina, 3-aminopropanová kyselina, ornitin, norleucin, norvalin, hydroxyprolin, sarkosin, citrulin, kyselina cysteová, t- 18CZ 304224 B6 butylglycin, t-butylalanin, fenylglycin, cyklohexylalanin, β-alanin, fluoro-aminokyselina, navržené aminokyseliny, jako je β-methylaminokyseliny, Coc-methylaminokyseliny, Na-methylaminokyseliny a aminokyselinové analogy obecně. Aminokyselina může být D (pravotočivá) nebo L (levotočivá).

Ve specifickém provedení vynálezu derivát Nogo je chimérický nebo fúzní protein obsahující protein Nogo nebo jeho fragment (upřednostňuje se, aby obsahoval alespoň oblast nebo motiv proteinu Nogo nebo alespoň 10 aminokyselin proteinu Nogo) spojených svým amino- nebo karboxylovým koncem prostřednictvím peptidové vazby k aminokyselinové sekvenci odlišného proteinu. V jednom provedení vynálezu takový chimérický protein vzniká rekombinantní expresí nukleové kyseliny kódující protein (obsahující sekvenci kódující Nogo spojenou v rámci s kódující sekvencí různého proteinu). Takový chimérický produkt se může připravit vzájemnou ligací vhodných sekvencí nukleové kyseliny, která kóduje požadované aminokyselinové sekvence, metodami, které jsou dobře známy v oboru, ve vhodném čtecím rámci a expresí chimérického produktu metodami, které jsou dobře známy v oboru. V jiném případě takový chimérický produkt se může připravit metodou syntézy proteinu, například použitím peptidového syntetizéru. Mohou se zkonstruovat chimérické geny obsahující části Nogo fúzované s libovolnými heterologními sekvencemi kódujícími protein. Takové heterologní sekvence kódující protein zahrnují například hexahistidinovou značku a značku T7. Specifické provedení vynálezu se vztahuje na chimérický protein obsahující fragment Nogo, který zahrnuje alespoň šest aminokyselin.

V jiném specifickém provedení vynálezu derivát Nogo je molekula obsahující oblast homologie s proteinem Nogo.

V preferovaném provedení vynálezu jsou deriváty Nogo (například fragmenty) proteiny, které se neobjevují přirozeně.

V jiném specifickém provedení vynálezu deriváty a analogy se popisují dále v textu v sekci příkladů.

Deriváty Nogo obsahující jednu nebo více oblastí proteinu

Ve specifickém provedení vynálezu se popisují deriváty a analogy Nogo, zvláště pak fragmenty a deriváty Nogo jako jsou fragmenty, které obsahují nebo v jiném případě se skládají z jedné nebo více oblastí proteinu Nogo, které zahrnují konzervativní hydrofóbní oblasti C-konce nebo kyselé oblasti N-konce bohaté na polyprolin nebo jejich funkční fragmenty (například vazebné) nebo jejich libovolnou kombinaci.

Specifické provedení podle vynálezu zahrnuje specifické fragmenty proteinu Nogo, což jsou ty fragmenty proteinu Nogo, které jsou nejvíce homologní ke specifickým fragmentům krysího nebo bovinního proteinu Nogo. Fragment obsahující oblast homologu Nogo se může identifikovat metodami analýzy proteinu, jak se popisuje dále v textu.

V jiném specifickém provedení vynálezu se popisuje molekula, která obsahuje jeden nebo více oblastí (nebo jejích funkčních částí) proteinu Nogo, ale které také chybí jedna nebo více oblastí (nebojejich funkčních částí) proteinu Nogo. V jiném provedení vynálezu se popisuje molekula, která obsahuje jednu nebo více oblastí (nebojejich funkčních částí) proteinu Nogo a která vykazuje jeden nebo více mutantních (mutace je například způsobena deleci nebo bodovou mutací) oblastí proteinu Nogo (například tak, že u mutantní oblasti se zesílila funkce).

Testy proteinů Nogo, jejich derivátů a analogů

Funkční aktivita proteinů Nogo, derivátů a analogů se může testovat různými metodami. Popis funkčních testů v následujících sekcích neznamená jejich omezení, ale mohou se použít jiné testy, které jsou dobře známy v oboru.

- 19CZ 304224 B6

Testy Nogo in vitro inhibice růstu neuritů

Ve specifickém provedení vynálezu se mohou proteiny Nogo, deriváty a analogy testovat, zda inhibují rozšíření buněk N1H 3T3 nebo nadměrný růst neuritů PC 12 za použití tkáňových kultur in vitro.

V alternativním provedení vynálezu proteiny Nogo, deriváty a analogy se mohou použít při testování kolapsu růstu kónusu explantovaných ganglií dorzálních kořenů u kuřete, což se indukuje přítomností proteinu Nogo. Podobně u proteinu Nogo se může testovat inhibice nadměrného růstu explantovaných ganglií dorzálních kořenů u kuřete (popisuje se v publikaci Spillman et al., 1998 J. Biol. Chem. 273: 19 283 - 19 293).

Testy funkčních vlastností Nogo in vivo

V jednom příkladu vynálezu antagonisté proteinů Nogo, deriváty a analogy se mohou použít při testech funkce in vivo za použití zvířecího modelu regenerace kortikospinální dráhy (CST) na dlouhou vzdálenost a navrácení chování.

V jednom provedení vynálezu je kortikospinální dráha poškozena chirurgickou resekcí nebo kontuzí míchy a zvířeti se aplikuje antagonista proteinu Nogo. Neurální plasticita, regenerace a návrat funkce se porovnává se kontrolními zvířaty, která nebyla ošetřena uvedeným způsobem, nebo se kontrolními zvířaty, která se ošetřila aplikací protilátky. Anatomickými metodami se sleduje strukturální plasticita nebo regenerace a to hlavně značením definovaných neurálních drah. Navrácení funkce se měří testy pohyblivosti a elektrofyziologické dovednosti, které se provádějí na hlodavcích (například test lepivého papíru, test dosažení potravy atd.) (popisuje se v publikaci Thallmair et al., 1998, Nat. Neuroscience 1(2): 124-131).

Inhibice navázání ligandu Nogo a její testování

V jednom provedení vynálezu se testuje schopnost vázat se nebo soutěžit proteinem Nogo divokého typu o navázání na protilátku proti Nogo. V tomto případě se mohou použít různé imunitní testy, které jsou dobře známy v oboru a zahrnují kompetitivní a nekompetitivní testovací systémy za použití metod, jako jsou radioimunotesty, ELISA, sendvičové imunotesty, imunoradiometrické testy, gelové difúzní precipitinové reakce, imunodifúzní testy, in šitu imunotesty (za použití koloidního zlata, enzymatických nebo radioizotopových značek), western bloty, precipitační reakce, aglutinační testy (například gelové aglutinační testy, hemaglutinační testy), testy fixace komplementu, imunofluorescenční testy, testy s proteinem A a imunoelektroforetické testy atd.

V jednom provedení podle vynálezu se navázání protilátek detekovalo detekcí značky na primárních protilátkách. V jiném provedení vynálezu se primární protilátky detekovaly detekcí navázání sekundární protilátky nebo činidla na primární protilátku. V jednom provedení vynálezu jsou značeny sekundární protilátky. V oboru je známo řada metod detekce navázání v imunotestu a tyto metody jsou předmětnou věcí vynálezu.

Vjiném provedení vynálezu, kde se identifikoval protein vázající Nogo, se může navázání například testovat například způsobem dobře známým v oboru. V jiném provedení vynálezu se mohou testovat fyziologické koreláty navázání Nogo na jeho substrát.

Vynález dále popisuje jiné metody, které jsou dobře známy v oboru.

Terapeutické použití

Vynález popisuje léčbu a prevenci různých onemocnění a poruch aplikací terapeutické sloučeniny (terapeutické činidlo). Takové terapeutická činidla zahrnují, ale nejsou omezeny na proteiny Nogo a jejich analogy a deriváty (zahrnující fragmenty) (například jak se popisuje shora v textu),

-20CZ 304224 B6 jejich protilátky (jak se popisuje shora v textu), nukleové kyseliny kódující proteiny Nogo, analogy a deriváty (jak se popisuje shora v textu), antisense nukleové kyseliny Nogo a agonisty a antagonisty proteinu Nogo. Poruchy zahrnující deregulovaný buněčný růst, například nádory CNS, se ošetřují nebo se jim předchází aplikací terapeutických činidel, které podporují funkci Nogo. Poruchy, při kterých je růst, regenerace a udržování neuritů deficitní nebo se požaduje, se léčí aplikací terapeutického činidla, které antagonizuje (inhibuje) funkci Nogo. Tato skutečnost se popisuje dále v textu.

V obecném případě se preferuje aplikace produktů druhového původu nebo druhého reaktivity (v případě protilátky) stejného druhu, do kterého patří pacient. V preferovaném provedení vynálezu se tak lidský protein Nogo, derivát nebo analog nebo nukleová kyselina nebo protilátka proti lidskému proteinu Nogo aplikuje pacientovi.

Léčba a prevence poruch zahrnující deregulovaný buněčný růst

Onemocnění a poruchy zahrnující deregulaci buněčného růstu se ošetřily nebo se jim předchází aplikací terapeutických činidel, které podporují (to znamená zvyšují nebo propůjčují) funkci Nogo. Příklady takových terapeutických činidel zahrnují, ale nejsou omezeny na proteiny Nogo, deriváty nebo fragmenty, které jsou funkčně aktivní, zvláště které jsou aktivní při inhibici extenze neuritů nebo inhibice buněčného růstu (například jak se demonstruje v testech in vitro nebo ve zvířecích modelech) a nukleové kyseliny kódující protein Nogo nebo jeho funkčně aktivní derivát nebo fragment (například při použití genové terapie). Upřednostňuje se, aby proteiny, deriváty nebo fragmenty Nogo neobsahovaly žádný volný CNS myelinový materiál, který je přirozeně asociován. Mohou se také použít jiná terapeutická činidla. Jsou to například agonisty Nogo, které se mohou identifikovat za použití testů in vitro nebo zvířecích modelů, příklady se popisují dále v textu.

Ve specifických provedeních vynálezu se terapeutická činidla, která podporují funkci Nogo, aplikují terapeuticky (což zahrnuje také profylaxi): (1) u onemocnění a poruch, která zahrnují absenci nebo snížení (vztaženo na normální nebo požadované množství) množství proteinu Nogo nebo zeslabení funkce například u pacientů, kterým chybí protein Nogo nebo je geneticky defektní nebo není biologicky aktivní nebo vykazuje nízkou aktivitu nebo je jeho exprese zeslabena, nebo (2) u onemocnění nebo poruch kde testy in vitro (nebo in vivo) (popisuje se dále v textu) indikují využití aplikace agonisty Nogo. Nepřítomnost nebo snížení množství proteinu Nogo nebo jeho funkce je možné snadno detekovat, například získáním vzorku pacientovy tkáně (například tkáně z biopsie) a testováním in vitro množství RNA nebo proteinu, struktury a/nebo aktivity exprimované RNA Nogo nebo proteinu. Tak je možné použít řady metod, které se v oboru považují za standardní a které zahrnují, ale neomezují se na kinázové testy, imunotesty vhodné pro detekci a/nebo vizualizaci proteinu Nogo (například western blot, imunoprecipitace následovaná elektroforézou na polyakrylamidovém gelu SDS, imunocytochemickým testem atd.) a/nebo hybridizační testy, které jsou vhodné pro detekci exprese pomocí detekce a/nebo vizualizace mRNA Nogo (například northem testy, testy dot blot, hybridizaci in sítu) atd.

Onemocnění a poruchy, které zahrnují deregulovaný buněčný růst a které se dají léčit nebo se jim dá předcházet, zahrnují, ale nejsou omezeny na proliferativní poruchy, maligní nádory, nádory nervového systému atd. Příklady jsou uvedeny dále v textu.

Neoplastický růst

Neoplastický růst a příbuzné poruchy, které se mohou léčit nebo se jim může předcházet aplikací terapeutického činidla, které podporuje funkci Nogo, zahrnují, ale nejsou omezeny na onemocnění uvedené v tabulce č. 1 (takové poruchy se také popisují v publikaci Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia):

-21 CZ 304224 B6

Tabulka č: 1: Neoplastický růst a příbuzné poruchy pevné nádory sarkomy a karcinomy gliom, glioblastom astrocytom meduloblastom kraniofaryngiom ependymom pinealom hemangiomblastom sluchový neuron oligodendrogliom menangiom neuroblastom retinoblastom

Ve specifických provedeních vynálezu malignantní nebo dysproliferativní (jako jsou metaplázie a dysplázie) nebo hyperproliferativní poruchy se ošetřují nebo se jim předchází v centrálním nervovém systému, v míše nebo v libovolné neurální tkáni.

Premaligní stavy

Aby se léčily premaligní stavy a předcházelo se postupu do neoplastického nebo maligního stádia onemocnění uvedených v tabulce č. 1, mohou se také aplikovat terapeutická činidla podle vynálezu, která podporují aktivitu proteinu Nogo. Takové léčebné nebo profylaktické použití se indikuje u stavů, u kterých se očekává postup do stádia neoplázie nebo karcinomu, zvláště tam, kde růst buněk, který není neoplastický, zahrnuje hyperplázii, metaplázii nebo dysplázii (abnormální stavy růstu se popisují v publikaci Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79). Hyperplázie je forma řízené buněčné proliferace zahrnující zvýšení počtu buněk v tkáni nebo orgánu, aniž se podstatně změní jeho funkce nebo struktura. Metaplázie je forma řízeného růstu buněk, při němž jeden typ dospělých nebo zcela diferenciovaných buněk substituuje jiný typ dospělých buněk. Metaplázie se může vyskytovat v epiteliálních nebo pojivových tkáňových buňkách. Netypická neoplázie zahrnuje libovolný mimořádně metaplastický epitel. Dysplázie často předchází stádiu karcinomu a vyskytuje se hlavně v epitelu. Jde většinou o netypickou formu růstu buněk, který není neoplastický, a zahrnuje ztrátu jednotnosti jednotlivých buněk a architektonickou orientaci buněk. Buňky tvořící dysplázie jsou často abnormálně velké, jádro je tmavě zbarveno a vykazují pleomorfizmus. Výskyt dysplázie je charakteristický pro místa s chronickým drážděním nebo zánětem.

V alternativním případě nebo vedle přítomnosti abnormálního růstu buněk, který se charakterizuje jako hyperplázie, metaplázie nebo dysplázie, přítomnost jedné nebo více charakteristik transformovaného fenotypu nebo maligního fenotypu vyjádřeného in vivo nebo in vitro ve vzorku buněk pacienta může indikovat požadavek profylaktické/terapeutické aplikace terapeutického činidla, které podporuje funkci proteinu Nogo. Jak se uvádí shora v textu, takové charakteristiky transformovaného fenotypu zahrnují morfologické změny, dochází k odloučení od spodní vrstvy, ztrátu kontaktní inhibice, ztrátu kotvící závislosti, uvolnění proteáz, zvýšený transport cukrů, snížení sérových požadavků, expresi fetálních antigenů, vymizení buněčného povrchového proteinu o molekulové hmotnosti 250 000 (popisuje se dále v textu ve spojení s charakteristikami souvisejícími s transformovaným nebo maligním fenotypem).

V jiných provedeních vynálezu se popisuje léčba pacienta, který vykazuje jeden nebo více z následujících predispozičních faktorů maligních nádorů, aplikací účinného množství terapeutického činidla: neurofibromatóza Von Recklinghausen nebo retinoblastom (popisuje se v publikaci

-22CZ 304224 B6

Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 112113).

V jiném specifickém provedení vynálezu se terapeutická činidlo podle vynálezu aplikuje lidskému pacientovi aby se předešlo postupu zhoubnému bujení ledvin, chrupavky (prsní kosti), kůže, skeletového svalu, plic nebo sleziny, melanomu nebo sarkomu.

Hyperproliferativní a dysproliferativní poruchy

V jednom provedení vynálezu se terapeutická činidla, která podporují aktivitu Nogo, používají k léčbě nebo prevenci hyperproliferativních nebo benigních dysproliferativních poruch. Specifická provedení vynálezu jsou použita při léčbě a prevenci cirhózy jater (podmínky, kdy zjizvení předčilo normální regenerační proces), při léčbě koloidních formací (hypertrofní jizvy) (dochází k deformaci kůže, kdy proces tvorby jizvy interferuje s normálním obnovením), lupénky (což jsou běžné stavy kůže charakterizované nadměrnou proliferací kůže a oddálení správné buněčné determinace), benigní nádory, fibrocystické stavy a tkáňová hypertrofie (například prostatická hyperplázie).

Genová terapie

Ve specifickém provedení nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující protein Nogo nebo jeho funkční derivát se aplikovaly, aby se podpořila funkce Nogo cestou genové terapie. Genová terapie se uskutečnila aplikací nukleové kyseliny subjektu. V tomto provedení vynálezu nukleová kyselina produkuje svůj kódovaný protein, který zprostředkovává terapeutický účinek při vyvolání funkce Nogo.

Libovolná z metod genové terapie dostupná v oboru se může použít podle vynálezu. Příklady metod se popisují dále v textu.

Obecné metody v genové terapii se popisují v publikaci Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505, Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95, Tolstoshev, 1993, Ann. rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596, Mulligan, 1993, Science 260, 926-932 a Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217, May, 19993, TIBTECH 11(5): 155-215. Používané metody běžně známé v oboru technologie rekombinace DNA se popisují v publikaci Ausubel et al., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY a Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje terapeutické činidlo obsahující nukleovou kyselinu Nogo, která je součástí expresního vektoru, jenž exprimuje protein Nogo nebo jeho fragment nebo chimérický protein ve vhodném hostiteli. Taková nukleová kyselina vykazuje promotor operativně spojený s kódující oblastí Nogo, přičemž uvedený promotor je indukovatelný nebo konstitutivní a může být tkáňově specifický. V jiném určitém provedení vynálezu se používá molekula nukleové kyseliny, ve které kódující sekvence Nogo a libovolné jiné požadované sekvence jsou lemovány oblastmi, které podporují homologní rekombinaci v požadovaném místě v genomu, přičemž poskytují intrachromozomální expresi nukleové kyseliny Nogo (popisuje se v publikaci Koller and Smithies, 199, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8 932-8 935, Zijlstra et al., 1989, Nátuře 342: 435—438).

Zavedení nukleové kyseliny do pacienta se může provést buď přímo, přičemž se pacient přímo vystaví nukleové kyselině nebo vektoru, který nese nukleovou kyselinu nebo nepřímo, kdy buňky se nejdříve transformovaly nukleovou kyselinou in vitro a pak se transplantovaly do pacienta. Tyto dva přístupy jsou známy jako in vivo nebo ex vivo genová terapie.

Ve specifickém provedení vynálezu se nukleová kyselina přímo aplikuje in vivo, kde se exprimuje, aby se produkoval kódovaný produkt. Toho je možné dosáhnout libovolným počtem metod

-23CZ 304224 B6 známých v oboru, například konstrukcí, kdy je součástí expresního vektoru vhodné nukleové kyseliny a její aplikací, která se provede tak, aby se stala vnitrobuněčnou, například infekcí za použití defektivního nebo atenuovaného retrovirového nebo jiného virového vektoru (popisuje se například v dokumentu - patent US 4 980 286) nebo přímým zavedením injekcí samotnou DNA nebo použitím bombardováním partikulemi (například genové dělo, Biolistic Dupont) nebo potažení lipidy nebo buněčnými povrchovými receptoiy nebo transfekčními činidly, kapsualizací v lipozómech, mikročásticemi nebo mikrokapsulemi nebo aplikací ve spojení s peptidem, kterýje znám tím, že vstupuje do jádra, ve spojení s ligandem, čímž se vystavuje endocytóze zprostředkované receptorem (popisuje se například v publikaci Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4 429—4 432) (která se může použít v případě cílových buněčných typů, které specificky exprimují receptory) atd. V jiném provedení vynálezu se tvoří komplex nukleová kyselina-ligand, kde ligand obsahuje fúzogenní virový peptid za účelem porušení endozómů, což umožňuje nukleové kyselině zabránit lysozomálnímu rozpadu. V jiném provedení vynálezu nukleová kyselina se může cílit in vivo za účelem specifického buněčného pohlcení a exprese cílením specifického receptoru (popisuje se v PCT dokumentu WO 92/06180 s datem ló.dubna 1992 (Wu et al.), WO 92/22635 s datem 23. prosince 1992 (Wilson et al.,) WO 92/20316 s datem 26. listopadu 1992 (Findeis et al.,), WO 93/14188 s datem 22. červenec 1993 (Clarke et al.,) WO 93/20221 s datem 14. října 1993 (Young)). V jiném případě nukleová kyselina se může zavést do buňky a začlenit do hostitelské buňky vhodné pro její expresi homologní rekombinaci (popisuje se v publikaci Koller and Smithies, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935, Zijlstra et al., 1989, Nátuře 342: 435 438).

Ve specifickém provedení se používá virový vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu Nogo. Může se například použít retrovirový vektor (popisuje se v publikaci Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599). Tyto retrovirové vektory se mohou modifikovat, aby se deletovaly retrovirové sekvence, které nejsou nezbytné pro zabalení virového genomu a začlenění DNA do hostitelské buňky. Nukleová kyselina Nogo, která se může použít při genové terapii, se klonuje do vektoru, který umožňuje začlenění genu do pacienta. Více detailů o retrovirových vektorech je možné nalézt v publikaci Bosen et al., 1994, Biotherapy 6: 291-302, kde se popisuje použití retrovirového vektoru pro zavedení genu mdrl do hematopoietických kmenových buněk, aby se kmenové buňky staly více rezistentní vůči chemoterapii. Retrovirové vektory použitelné v genové terapii se dále popisují v publikaci Clowes et al., 1994, J, Clin. Invest. 93: 644-651, K.iem et al., 1994, Blood 83: 1 467-1 473, Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141 a Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin., Genetics and Devel. 3: 110-114.

Adenoviry jsou další virové vektory, které se mohou použít při genové terapii. Adenoviry jsou zvláště atraktivní při zavedení genů do centrálního nervového systému. Adenoviry přirozeně infikují respirační epitel, kde způsobují lehké onemocnění. Jiným cílem pro zaváděcí systémy založené na adenovirech jsou játra, respirační epitel, endoteliální buňky a svaly. Adenoviry jsou výhodné tím, že dokáží infikovat buňky, které se nedělí. V publikaci Kozarsky and Wilson 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503 poskytuje přehled genové terapie založené na adenovirech. V publikaci Bout et al., 1994, Human Gen Therapy 5: 3-10 ukazuje použití adenovirových vektorů pro transfer genů do respiračního epitelu opice rhesus. Jiné příklady použití adenovirů při genové terapii se popisují v publikacích Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 431-434, Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143-155 and Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234.

Vedle adenovirů adenoasociovaný virus (AAV) je také možné použít při genové terapii (Walsh et al., 1993, Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300).

Další přístup genové terapie zahrnuje transfer genu do buněk v tkáňové kultuře metodami, jako jsou elektroporace, lipofekce, transfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým nebo virovou infekcí. Způsob transferu zahrnuje v obvyklém případě transfer selektovatelného markéru do buněk. Buňky se pak umístí do selekčního prostředí, aby se daly izolovat ty buňky, které pohltily DNA a exprimují transferovaný gen. Takové buňky se pak zavedou do pacienta.

-24CZ 304224 B6

V tomto provedení vynálezu se nukleová kyselina zavede do buňky dříve než se aplikuje in vivo výsledná rekombinantní buňka. Takové zavedení se může provést libovolnou metodou známou v oboru, které zahrnují, ale nejsou omezeny na transfekci, elektroporací, mikroinjekci, infekci s virovým nebo bakteriofágovým vektorem, který obsahuje sekvence nukleové kyseliny, buněčnou fúzi, transfer genů zprostředkovaný chromozómem, transfer genů zprostředkovaný mikrobuňkou, sféroplastovou fúzi atd. V oboru je známo řada metod, které jsou vhodné pro zavedení cizorodých genů do buněk (popisuje se například v publikaci Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618, Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644, Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92) a mohou se použít v souladu s přítomným vynálezem, což ukazuje, že nezbytné vývojové a fyziologické funkce recipientní buňky nejsou poškozeny. Metoda by měla poskytnout stabilní transfer nukleové kyseliny do buňky tak, že nukleová kyselina se exprimuje buňkou a přednostně se dědí a exprimuje na její potomstvo.

Výsledné rekombinantní buňky se mohou zavést do pacienta různými metodami známými v oboru. V preferovaném provedení vynálezu se epiteliální buňky zavedly podkožní injekcí.

V jiném provedení vynálezu se mohou pacientovi aplikovat rekombinantní kožní buňky jako kožní štěpy. Rekombinantní krevní buňky (například hematopoietické kmenové nebo progenitorové buňky) se přednostně aplikují intravenózně. Množství buněk určených pro použití závisí na požadovaném účinku, stádiu onemocnění pacienta atd. a odborník je může snadno stanovit.

Buňky, do kterých je možné zavést nukleovou kyselinu pro účely genové terapie zdůrazňují libovolný požadovaný dostupný buněčný typ a zahrnují, ale nejsou omezeny na epiteliální buňky, endoteliální buňky, keratinocyty, fibroblasty, svalové buňky, hepatocyty, krevní buňky, jako jsou T lymfocyty, B lymfocyty, monocyty, makrofágy, neutrofily, eosinofily, megakaryocyty, granulocyty, různé kmenové nebo progenitorové buňky, zvláště hematopoetické kmenové nebo progenitorové buňky například získané z kostní dřeně, z pupečníkové krve, periferní krve, fetálních jater atd.

V preferovaném provedení buňka užívaná při genové terapii je pro pacienta autologní.

V provedení vynálezu, ve kterém se rekombinantní buňky používají v genové terapii se nukleová kyselina Nogo zavede do buněk tak, že jí buňky nebo jejich potomstvo exprimuje a rekombinantní buňky se pak aplikují in vivo pro terapeutický účinek. Ve specifickém provedení vynálezu se mohou použít kmenové nebo progenitorové buňky. Libovolné kmenové a/nebo progenitorové buňky, které se mohou izolovat a udržovat in vitro se mohou potencionálně použít v souladu s tímto provedením vynálezu. Takové kmenové buňky zahrnují, ale nejsou omezeny na neurální kmenové buňky (Stemple and Anderson, 1992, Cell 71: 973-985).

Ve specifickém provedení vynálezu nukleová kyselina, která se zavedla pro účely genové terapie obsahuje indukovatelný promotor operativně spojený s kódující oblastí tak, že exprese nukleové kyseliny je řiditelná tak, že se řídí přítomnost nebo absence vhodného induktoru transkripce.

Další metody se mohou upravit při použití pro zavedení nukleové kyseliny kódující protein Nogo nebo funkční derivát.

Léčba a prevence poruch, při kterých protein Nogo blokuje regeneraci.

Onemocnění a poruchy, při kterých je nutné zvětšení neuritů, jejich růst a regenerace, se ošetřují aplikací terapeutického činidla, který antagonizuje (inhibuje) funkci proteinu Nogo. Onemocnění, poruchy nebo poškození, které vedou k poškození nervového systému zahrnují, ale nejsou omezeny na trauma centrálního nervového systému (CNS) (například poranění míchy nebo mozku), infarkt, infekce, maligní nádory, vystavení toxickým činidlům a degenerativní nervové onemocnění (zahrnující Alzheimerovu nemoc, Parkinsonovu nemoc, Huntingtonovu Choreu, roztroušenou sklerózu a progresivní supra-jademou paralýzu), aplikací sloučenin, které interferují

-25CZ 304224 B6 s aktivitou Nogo (například dominantní negativní derivát Nogo, protilátky proti proteinu Nogo, Anti-sense nukleové kyseliny, které kódují protein Nogo, ribozymy nebo chemické skupiny, které se vážou na aktivní místa proteinu Nogo).

Terapeutická činidla, která se mohou použít, zahrnují, ale nejsou omezeny na antisense nukleovou kyselinu Nogo, kteráje dysfunkční (což je například způsobeno heterologní inzercí (sekvence, která není sekvencí Nogo) do sekvence kódující Nogo), které se používají k vyjmutí endogenní funkce Nogo homologní rekombinací (popisuje se například v publikaci Capecchi, 1989, Science 244: 1 288-1 292). Protilátky proti proteinu Nogo (jejich fragmenty a deriváty obsahující jejich vazebnou oblast) se mohou použít jako antagonisti proteinu Nogo. Ve specifickém provedení vynálezu nukleová kyselina obsahující část genu Nogo, ve kterém sekvence Nogo lemují (na 5' i 3'konci) odlišnou genovou sekvenci se používá jako antagonist Nogo, aby podpořil deaktivaci genu Nogo homologní rekombinací (popisuje se také v publikaci Koller and Smithies, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8 932-8 935, Zijlstra et al., 1989, Nátuře 342: 435—438). Jiná terapeutická činidla, která inhibují funkci Nogo se mohou identifikovat použitím známých vhodných testů in vitro například založených na jejich schopnosti inhibovat navázání proteinu Nogo na jiný protein nebo inhibovat libovolnou známou funkci Nogo, jak se přednostně testuje in vitro nebo v buněčné kultuře ačkoli se mohou také použít genetické testy. Upřednostňuje se vhodné in vitro nebo in vivo testy se využívají ke stanovení účinku specifického terapeutického činidla a ačkoli jeho aplikace je indikována pro léčbu postižené tkáně.

Ve specifickém provedení vynálezu terapeutická činidla, která inhibují funkci Nogo, se aplikují terapeuticky (zahrnují profylakci): (1) při onemocnění nebo poruchách, které zahrnují zvýšené množství (vztaženo k normálnímu nebo požadovanému) proteinu Nogo nebo funkci, například u pacientů, kde protein Nogo je nadměrně reaktivní nebo se nadměrně exprimuje nebo (2) při onemocnění nebo poruchách, kde in vitro testy (nebo in vivo) (popisuje se shora v textu) indikují, že využitelnost aplikace antagonisty Nogo. Snadno detekovatelné je zvýšené množství proteinu Nogo nebo funkce, například kvantifikací proteinu a/nebo RNA získáním vzorku pacientovy tkáně (například z biopsie tkáně) a jejím testováním in vitro za účelem zjištění množství RNA nebo proteinu, struktury a/nebo aktivity exprimované RNA Nogo nebo proteinu. Může se použít řada metod, které se považují v oboru za standardní. Jsou to například kinázové testy, imunologické testy za účelem detekce a/nebo vizualizace proteinu Nogo (například western přenos, imunoprecipitace, po níž následuje elektroforéza na SDS polyakiylamidovém gelu, imunocytochemie, atd.) a/nebo hybridizaění testy za účelem detekce exprese Nogo detekci a/nebo vizualizací mRNA Nogo (například northem testy, dot bloty, hybridizace in sítu atd.).

„Antisense“ regulace exprese genu Nogo

Ve specifickém provedení vynálezu se funkce Nogo inhibuje použitím „antisense“ nukleové kyseliny Nogo. Vynález poskytuje terapeutické nebo profýlaktické použití nukleových kyselin, které obsahuje alespoň šest nukleotidů, které vystupují jako pozitivní vůči genu nebo cDNA kódující Nogo nebo jeho část. Kódující nukleová kyselina Nogo je nukleová kyselina schopná hybridizovat s částí RNA Nogo (upřednostňuje se mRNA) na základě sekvenční komplementarity. „Antisense“ nukleová kyselina může být komplementární s kódující a/nebo nekódující oblastí mRNA Nogo. Takové „antisense“ nukleové kyseliny se mohou použít jako terapeutická činidla, která inhibují funkci Nogo a mohou se použít při léčbě nebo prevenci poruch popsaných shora v textu.

„Antisense“ nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být oligonukleotidy, které jsou jednořetězcové nebo dvouřetězcové, RNA nebo DNA nebo jejich modifikace nebo deriváty, které se mohou přímo aplikovat do buňky nebo které se mohou produkovat vnitrobuněčně transkripcí exogenních zavedených sekvencí.

Ve specifickém provedení vynálezu se „antisense“ nukleové kyseliny Nogo mohou použít k podpoře regenerace neuronů centrálního nervového systému zvláště zahrnující regeneraci kor-26CZ 304224 B6 tikospinální dráhy, plasticitu během získávání, opětný růst neuronů a hojení poškození spojeného s traumatickým poraněním, mrtvice a neurodegenerativní onemocnění.

Vynález dále popisuje farmaceutické prostředky obsahující účinné množství antisense nukleové kyseliny Nogo podle vynálezu na farmaceuticky přijatelném nosiči jak se popisuje dále v textu.

V jiném provedení vynálezu se popisují metody inhibující expresi sekvence nukleové kyseliny Nogo v prokaryontní nebo eukaryontní buňce obsahující buňku s účinným množstvím prostředku, který obsahuje „antisense“ nukleovou kyselinu Nogo podle vynálezu.

„Antisense“ nukleové kyseliny Nogo ajejich použití se popisují dále v textu.

„Antisense“ nukleové kyseliny Nogo „Antisense“ nukleové kyseliny Nogo obsahují alespoň šest nukleotidů ajsou to přednostně oligonukleotidy (v rozsahu 6 až přibližně 50 oligonukleotidů). Ve specifických případech oligonukleotid obsahuje alespoň 10 nukleotidů, alespoň 15 nukleotidů, alespoň 100 nukleotidů nebo alespoň 200 nukleotidů. Oligonukleotidy mohou být DNA nebo RNA nebo chimérické směsi nebo deriváty nebo jejich modifikované verze, jednořetězcové nebo dvouřetězcové. Oligonukleotid se může modifikovat v části báze, v části cukru nebo fosfátové kostry. Oligonukleotid může zahrnovat další připojené skupiny, jako jsou peptidy nebo činidla umožňující transport skrz buněčnou membránu (popisuje se například v publikaci Letsinger et al„ 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553—6556, Lemaitre et al., 1987, Proč. Nati. Acad. Sci. 84: 648-652, dokument PCT WO 88/09810 publikovaný 15. prosince 1988) nebo bariéra krev-mozek (popisuje se například v dokumentu PCT WO89/10134 publikovaný 25. dubna 1988), štěpící činidla podněcovaná hybridizací (popisuje se například v publikaci Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958-976) nebo interkalační činidla (popisují se v publikaci Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549).

Vynález dále popisuje „antisense“ oligonukleotid Nogo, přičemž se upřednostňuje jednořetězcová DNA. Dále se uvádí, že takový nukleotid obsahuje „antisense“ sekvenci vzhledem k sekvenci blízko jedné ze dvou promotorových sekvencí genu Nogo nebo sekvenci kódující C-terminální část genu Nogo. Může být nutné, aby se selektivně inhibovala exprese jedné z izoformy Nogo. Oligonukleotid se může upravit v libovolné poloze na své struktuře pomocí substituentů, které jsou obecně známy v oboru.

„Antisense“ oligonukleotid může obsahovat alespoň jednu část modifikované báze, která se vybrala ze skupiny zahrnující například 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-jodouracil, hypoxantin, xantin, 4-acetylcytosin, 5-(karboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-karboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-karboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktosylkveozin, Inozin, N6-izopentenyladenin, 1-methylguanin, 1-methylinozin, 2,2-dimethylguanin, 2-methyladenin, 2-methyladenin, 2-methylguanin, 3-methylcytosin, 5-methylcytosin, N6-adenin, 7-methylguanin, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-manosylkveozin, 5'-methoxykarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6izopentenyladenin, kyselina uracil-5-oxyoctová (v), wybutoxozin, pseudouracil, kveozin, 2thiocytosin, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, methylester kyseliny uracil-5-oxyoctové, kyselina uracil-5-oxyoctová(v), 5-methyl-2-thiouracil, 3-(3-amino3-A-2-karboxypropyl)uracil, (acp3)w a 2,6-diaminopurin.

V jiném provedení vynálezu oligonukleotid obsahuje alespoň jednu upravenou cukernou část vybranou ze skupiny zahrnující například arabinózu, 2-fluoroarabinózu, xylulózu a hexózu.

V jednom provedení podle vynálezu oligonukleotid obsahuje alespoň jednu upravenou fosfátovou kostru vybranou ze skupiny obsahující fosforothioát, fosforodithioát, fosforamidothioát, fosforamidát, fosfordiamidát, methylfosfonát, alkylfosfotriester a formacetyl nebo jeho analog.

-27CZ 304224 B6

V dalším provedení vynálezu oligonukleotid je α-anomémí oligonukleotid. α-anomémí oligonukleotid tvoří specifické dvouřetězcové hybridy s komplementární RNA, ve které na rozdíl od obvyklých β-jednotek, se řetězce vyskytují paralelně jeden k druhému (popisuje se v publikaci Gautier et al., 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 6 625-6 641).

Oligonukleotid může konjugovat s jinou molekulou například s peptidem, hybridizaci podněcovaným síťovacím činidlem, transportním činidlem, hybridizaci podněcovaným štěpícím činidlem atd.

Oligonukleotidy podle vynálezu se mohou syntetizovat standardními metodami, které jsou dobře známy v oboru, například použitím automatického syntetizéru DNA (který je například běžně dostupný u firmy Biosearch, Applied Biosystems, atd.). Fosforothioátové oligonukleotidy se mohou syntetizovat způsobem popsaným v publikaci Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3 209), methylfosfonátové oligonukleotidy se mohou připravit za použití pórového skleněného polymérového podkladu (popisuje se v publikaci Sarin et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7 448-7 451) atd..

Ve specifickém provedení vynálezu antisense oligonukleotid Nogo obsahuje katalytickou RNA nebo ribozym (popisuje se například v PCT mezinárodní přihlášce WO 90/11364 publikované 4. října 1990, Sarvel et al., 1990, Science 247: 1 222-1 225). V jiném provedení vynálezu oligonukleotid je 2'-O-methylribonukleotid (popisuje se v publikaci Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6 131-6 148) nebo chimérický analog RNA-DNA (popisuje se v publikaci Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).

V jiném provedení vynálezu „antisense“ nukleová kyselina Nogo podle vynálezu se produkuje vnitrobuněčně transkripcí z exogenní sekvence. Vektor je možné například zavést in vivo tak, že je pohlcen buňkou, ve které je vektor nebo jeho část přepsána za vzniku antimediátorové nukleové kyseliny (RNA) podle vynálezu. Takový vektor bude obsahovat sekvenci kódující „antisense“ nukleovou kyselinu Nogo. Uvedený vektor může zůstat epizomální nebo se může začlenit do chromozomu. Pokud se vektor přepisuje, vzniká požadovaná antimediátorová RNA. Takové vektory se mohou konstruovat technologií rekombinace DNA, která se v oboru považuje za standardní. Vektory mohou být plazmidy, viry nebo jiné dobře známé v oboru, které se používají při replikaci a expresi v savčích buňkách.

Exprese sekvence kódující antimediátorovou RNA Nogo se může řídit pomocí libovolného promotoru známého v oboru, který působí v savčích, upřednostňuje se v lidských, buňkách. Takové promotory mohou být indukovatelné nebo konstitutivní. Uvedené promotory zahrnují, ale nejsou omezeny na oblast časného promotoru SV40 (popisuje se v publikaci Bemoist and Chambon, 1981, Nátuře 290: 304-310), promotor obsahoval na 3'konci dlouhou opakovanou repetici viru Rousova sarkomu (popisuje se v publikaci Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), promotor thymidinové kinázy viru herpes (popisuje se v publikaci Wagner et al., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1 441-1 445), regulační sekvence metallothioneinového genu (popisuje se v publikaci Brinster et al., 1982, Nátuře 296: 39-42) atd.

„Antisense“ nukleové kyseliny podle vynálezu obsahují sekvenci komplementární s alespoň jednou částí transkriptu RNA genu Nogo, upřednostňuje se lidský gen Nogo. Avšak absolutní komplementarita, ačkoli se preferuje, není nutná. Termín sekvence „komplementární s alespoň částí RNA“ znamená sekvenci vykazující dostatečnou komplementaritu, aby byla schopná hybridizovat s RNA, která tvoří stabilní duplex. V případě dvouřetězcových „antisense“ nukleových kyselin Nogo se může tak testovat jediný řetězec duplexní DNA nebo se může testovat triplexová formace. Schopnost hybridizovat bude záviset na stupni komplementarity a délce „antisense“ nukleové kyseliny. V obecném případě delší hybridizující nukleová kyselina tvořící více chybných párů s RNA Nogo může obsahovat a stále tvořit stabilní duplex (nebo triplex podle daného případu). Odborník může stanovit tolerovatelný stupeň nesprávných párů použitím standardních postupů za účelem stanovení bodu denaturace hybridizovaného komplexu.

-28CZ 304224 B6

Terapeutické použití „antisense“ nukleových kyselin Nogo

Antisense nukleové kyseliny Nogo se mohou použít k léčbě (nebo prevenci) poruch typu buněk, které exprimují nebo přednostně nadměrně exprimují, gen Nogo. Nq specifickém provedení vynálezu taková porucha je růstová proliferativní porucha. V preferovaném provedení vynálezu se používá jednořetězcový DNA „antisense“ oligonukleotid Nogo.

Buněčné typy, které exprimují nebo nadměrně exprimují RNA Nogo, se mohou identifikovat různými metodami, kteréjsou dobře známy v oboru. Takové metody zahrnují, ale nejsou omezeny na hybridizaci s nukleovou kyselinou, která je specifická pro gen Nogo (například northem hybridizace, „dot blot“ hybridizace, hybridizace in šitu), pozorování schopnosti RNA pocházející z buněčného typu být přeložena in vitro na protein Nogo, imunotesty atd. V preferovaném provedení vynálezu se popisuje, že u primární tkáně pocházející z pacienta se může testovat, zda dochází před léčbou k expresi, například za použití imunocytochemických metod nebo hybridizací in šitu.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahující účinné množství „antisense“ nukleové kyseliny Nogo ve farmaceuticky přijatelném nosiči se mohou aplikovat pacientovi, který trpí onemocněním nebo poruchou, což je typ, kde dochází k expresi nebo k nadměrné expresi RNA Nogo nebo proteinu.

Množství „antisense“ nukleové kyseliny Nogo, která bude účinná při léčbě určité poruchy nebo stavu, bude záviset na podstatě poruchy nebo podmínek a může se stanovit standardní klinickou poruchou. Kde je to možné, je nutné stanovit „antisense“ toxicitu typu nádoru, který se bude léčit, in vitro a pak v použitelných zvířecích modelových systémech dříve než se otestují a použijí na lidech.

Ve specifickém provedení vynálezu farmaceutické prostředky obsahující „antisense“ nukleové kyseliny Nogo se aplikují prostřednictvím lipozómů, mikročástic nebo mikrokapsulí. V různých provedeních vynálezu se mohou použít takové prostředky, aby se dosáhlo nepřerušovaného uvolnění „antisense“ nukleových kyselin Nogo. Nq specifickém provedení vynálezu může být nutné využít lipozómy cílené prostřednictvím protilátek na specifické identifikovatelné nádorové antigeny (popisuje se v publikaci Leonetti et al., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2 4482 451, Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16 337-16 342).

Demonstrace terapeutického a profylaktického použití

U terapeutických činidel se přednostně testuje požadovaná terapeutická nebo profylaktická aktivita před použitím v případě člověka in vitro a pak in vivo. Testy in vitro, které se mohou použít při stanovení, zda se indikovala aplikace specifického terapeutického prostředku, zahrnuje testy in vitro buněčné kultivace, kde rostou v kultuře tkáňové vzorky pacienta, a vystavují se působení terapeutického činidla nebo terapeutické činidlo se aplikuje jiným způsobem. Pozoruje se účinek uvedeného terapeutického činidla na vzorek tkáně. Terapeutické činidlo, které je inhibitor funkce Nogo, se může například testovat měřením opětného růstu neuritů nebo funkční navrácení motoriky u pacienta.

V různých specifických provedeních vynálezu se mohou provádět testy in vitro s reprezentativními buňkami buněčných typů, které jsou zahrnuty v pacientově poruše, aby se stanovilo, zda terapeutické činidlo vykazuje požadovaný účinek na takové buněčné typy.

Sloučeniny vhodné pro použití při terapii se mohou testovat ve vhodných zvířecích modelových systémech dříve, než se testují na lidech. Tyto zvířecí modely zahrnují krysy, myši, kuřata, krávy, opice, králíky atd. Při testování in vivo, dříve než se aplikují člověku, se může použít libovolný zvířecí modelový systém.

-29CZ 304224 Β6

Terapeutická/profylaktická aplikace a prostředky

Vynález popisuje způsoby léčby (a profylaxe) aplikací subjektu účinného množství terapeutického činidla podle vynálezu. V preferovaném provedení vynálezu se používají v podstatě čistá terapeutická činidla. Subjektem je přednostně zvíře, které zahrnuje například krávy, prasata, koně, kuřata, kočky, psi atd. a přednostně jsou to savci a nejvíce se preferuje člověk. Ve specifických provedeních vynálezu subjektem je savec, nikoli však člověk.

Přípravky a metody aplikace, které se mohou použít, když terapeutické činidlo obsahuje nukleovou kyselinu, se popisují shora v textu.

Jsou známy různé zaváděcí systémy a mohou se použít při aplikaci terapeutického činidla podle vynálezu. Je to například kapsualizace v lipozómech, mikročástice, mikrokapsule, rekombinantní buňky schopné exprimovat terapeutické činidlo, endocytóza zprostředkovaná receptorem (popisuje se v publikaci Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4 429—4 432), konstrukce terapeutické nukleové kyseliny, jako část retrovirového nebo jiného vektoru atd. Metody zavedení zahrnují, ale nejsou omezeny na intradermální, intramuskulámí, intraperitoneální, intravenózní, podkožní, intranasální, epidurální nebo orální. Sloučeniny se mohou aplikovat libovolným vhodným způsobem, například infuzi nebo jednorázovou injekcí, absorpcí epitelem nebo sliznici (například orální sliznici, rektální a střevní sliznici) a může se aplikovat spolu sjinými biologicky aktivními činidly. Aplikace může být systémová nebo lokální. Navíc může být nutné zavést farmaceutické kompozice podle vynálezu do centrálního nervového systému libovolnou vhodnou cesto, která zahrnuje intraventrikulámí a intratekální injekci. Intraventrikulámí injekce se může provést intravertikulámím katetrem například napojeným na rezervoár, jako je rezervoár podle Ommaya.

Pulmorální aplikace se může použít například při použití inhalátoru a nebulizátoru a přípravků s činidlem tvořící aerosol.

Ve specifické provedení vynálezu je možné aplikovat farmaceutické kompozice podle vynálezu lokálně v oblasti potřeby léčby. Toho je možné dosáhnout například lokální infúzí během chirurgického zákroku, povrchové aplikace například ve spojení s obvazováním ran po chirurgickém zákroku, injekcí, katetrem nebo způsoby implantátu, přičemž uvedený implantát je porézní, neporézní nebo želatinový materiál, který zahrnuje membrány, jako jsou silastické membrány nebo vlákna. V jednom provedení vynálezu se aplikace může provést přímo injekcí do místa (nebo do předešlého místa) maligního nádoru nebo neoplastové nebo pre-neoplastové tkáně.

V jiném provedení vynálezu terapeutické činidlo se může zavést do vezikuly, zvláště do lipozómu (popisuje v publikaci Langer, Science 249: 1 527-1 533 (1990), Trest et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez—Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989), Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327).

V jiném provedení vynálezu terapeutické činidlo se může zavést do systému s řízeným uvolňováním. V jednom provedení vynálezu se může pro aplikaci použít pumpa (popisuje se v publikaci Langer, Science 249: 1 527-1 533 (1990), Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987), Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980), Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)).

V jiném provedení vynálezu se mohou použít polymemí materiály (popisuje se v publikaci Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Přes., Boča Raton, Florida (1974), Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Balí (eds.), Wiley, New York (1984), Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983), Levý et al., Science 228: 190 (1985), During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989), Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)). V jiném provedení vynálezu řízený uvolňovací systém se může umístit do blízkosti terapeutického cíle, to znamená mozku, což vyžaduje použití pouze části systémové dávky (popisuje se v publikaci Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

-30CZ 304224 B6

Jiné systémy s řízeným uvolňováním se popisují v publikaci Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).

Ve specifickém provedení vynálezu, kde terapeutické činidlo je nukleová kyselina kódující proteinové terapeutické činidlo, nukleová kyselina se může aplikovat in vivo, aby se podpořila exprese kódovaného proteinu, přičemž se připraví konstrukce, kde vhodná nukleová kyselina je součástí expresního vektoru a aplikuje se tak, že se stává vnitrobuněčnou, například použitím retrovirového vektoru (popisuje se v publikaci-patent US 4 980 286) nebo přímou injekcí nebo použitím bombardováním mikročásticemi (například genovým dělem, Biolistic, Dupont) nebo potažením lipidy nebo buněčnými povrchovými receptory nebo transfekčními činidly nebo aplikací ve spojení s peptidem, který je podobný homeoboxu a který je znám tím, že vstupuje do jádra (popisuje se například v publikaci Joliot et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1864— 1868) atd. V jiném případě nukleová kyselina terapeutického činidla se může zavést do buňky a začlenit se do DNA hostitelské buňky, aby došlo k expresi, homologní rekombinací.

Vynález také popisuje farmaceutické kompozice. Takové kompozice obsahují terapeuticky aktivní množství terapeutického činidla a farmaceuticky přijatelný nosič. Ve specifickém provedení vynálezu termín „farmaceuticky přijatelný“ znamená, že vyhovuje regulační agentuře federální nebo státní vlády nebo je uveden na seznamu v U.S. Pharmacopeia nebo v jiných obecně známých pharmacopeia vhodných pro zvířata a zvláště pro lidi. Termín „nosič“ znamená ředidlo, adjuvans, excipient nebo vehikl, ve kterém se mohou aplikovat terapeutická činidla, takové farmaceutické nosiče mohou být sterilní kapaliny, takové jako je voda nebo oleje, které zahrnují olej, který je zvířecího, rostlinného nebo syntetického původu, jako je arašídový olej, sójový olej, minerální olej, sezamový olej a podobně. Voda je preferovaný nosič v případě, že se farmaceutická kompozice aplikuje intravenózně. Fyziologické roztoky a vodné roztoky dextrózy a glycerolu se mohou také použít jako kapalné nosiče, zvláště pak injektovatelné roztoky. Vhodní farmaceutičtí excipienti zahrnují škrob, glukózu, laktózu, sacharózu, želatinu, slad, rýži, mouku, křídu, silika gel, stearát sodný, glycerol monostearát, talek, chlorid sodný, sušené netučné mléko, glycerol, propylen, glykol, vodu, ethanol a podobně. Kompozice, jestliže je to nutné, může také obsahovat malé množství zvlhčovacího nebo emulgačního činidla nebo činidla, která upraví pH. Tyto kompozice mohou být ve formě roztoků, suspenzí, emulze, tablet, pilulí, kapsulí, prášků, formulací pro nepřerušované uvolňování a podobně. Orální formulace mohou zahrnovat standardní nosiče, jako jsou manitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodíku, celulóza, uhličitan hořečnatý, které odpovídají farmaceutickému stupni čistoty atd. Příklady vhodných farmaceutických nosičů se popisují v publikaci „Remingtonů Pharmaceutical Science“ E. W. Martin. Takové kompozice budou obsahovat terapeuticky účinné množství terapeutického činidla, které se přednostně vyskytuje v čisté formě spolu s vhodným množstvím nosiče, za vzniku formy, která je vhodná pro aplikaci pacientovi. Formulace by měla být aplikována pacientovi podle vhodného módu.

V preferovaném provedení vynálezu se kompozice tvoří podle vhodných postupů, jako farmaceutická kompozice upravená pro intravenózní aplikaci lidským jedincům. V typickém případě kompozice pro intravenózní aplikaci jsou roztoky ve sterilním izotonickém vodném pufru.

V případě, že je to nezbytné, kompozice může také zahrnovat rozpustné činidlo a lokální anestetikum, jako je například lignokain, aby se zmenšila bolest v místě aplikace injekce. V obecném případě se ingredience dodávají buď odděleně nebo smíšené dohromady s jednotkovou dávkovou formou například jako suchý lyofilizovaný prášek nebo bezvodý koncentrát v hermeticky uzavřeném kontejneru, jako jsou ampule nebo taštičky, které indikují množství aktivního činidla.

V případě, že kompozice se má aplikovat infúzí, podává se z infúzní lahve, která obsahuje sterilní vodu nebo fyziologický roztok farmaceutického stupně čistoty. V případě, že se kompozice aplikuje injekcí, ampule sterilní vody vhodné pro injekce nebo fyziologický roztok se může před aplikací, smíchat.

-31 CZ 304224 B6

Terapeutická činidla podle vynálezu mohou vytvořit neutrální nebo solné formy. Farmaceuticky přijatelné sole zahrnují ty, které se tvoří s volnými aminoskupinami, jako jsou ty odvozené od kyseliny chlorovodíkové, fosforečné, octové, oxalové, vinné atd. Ty jsou tvořené volnými karboxylovými skupinami, jako jsou ty získané z hydroxidu sodného, draselného, amonného, vápenatého, železitého, izopropylaminu, triethylaminu, 2-ethylaminoethanolu, histidinu, prokainu atd.

Množství terapeutického činidla podle vynálezu, které bude účinné při léčbě zvláštní poruchy nebo stavu závisí na podstatě poruchy nebo stavu a může se stanovit standardní klinickou metodou. Navíc testy in vitro mohou pomoci identifikovat rozmezí optimální dávky. Přesná použitelná dávka ve formulaci bude také záviset na způsobu aplikace a vážnosti onemocnění nebo poruchy a měla by se určit na základě úvahy praktického lékaře a stavu pacienta. Vhodné rozmezí dávky v případě intravenózní aplikace je v obecném případě přibližně 20 až 500 mikrogramů aktivní sloučeniny na kilogram tělesné hmotnosti. Rozmezí vhodné dávky při intranasální aplikaci je v obecném případě přibližně 0,01 pg/kg tělesné hmotnosti až 1 mg/kg tělesné hmotnosti. Účinné dávky se mohu extrapolovat z křivky vyjadřující odezvu na dávku získanou z testovacích systémů in vitro nebo zvířecích modelů.

Vynález také poskytuje farmaceutický balíček nebo sadu, která obsahuje jeden nebo více kontejnerů naplněných jednou nebo více ingrediencí farmaceutických kompozic podle vynálezu. Ve spojení s takovými kontejnery je nutné poznamenat, že forma musí vyhovovat vládní agentuře regulující výrobu, použití nebo prodej léků nebo biologických produktů, které získaly povolení být aplikovány člověku.

Diagnóza a testování

Proteiny Nogo, analogy, deriváty a jejich subsekvence, nukleové kyseliny Nogo (a s nimi komplementární sekvence), protilátky proti Nogo nacházejí využití při diagnostice. Takové molekuly se mohou použít v testech, jako jsou imunologické testy, při detekci, prognóze, diagnostice nebo monitorování různých stavů, onemocnění nebo poruch, které ovlivňují expresi Nogo nebo monitorují jejich léčbu. Takové testy se zvláště provádějí způsobem, který zahrnuje kontakt vzorku získaného z pacienta s protilátkami proti Nogo za podmínek, při kterých může dojít k imunospecifickému navázání a detekci nebo měření množství libovolného imunospecifického navázání protilátek. Takové navázání protilátek v tkáňových sekcích se může použít při detekci lokalizace aberujícího proteinu Nogo nebo aberujícího množství proteinu Nogo (například malé množství nebo v případě, že není přítomen). Ve specifickém provedení vynálezu se protilátky proti proteinu Nogo mohou použít při testu v pacientově tkáni nebo vzorku séra, kdy se testuje přítomnost proteinu Nogo, kde aberující množství proteinu Nogo je indikace stavu onemocnění. Termín „aberující množství“ znamená zvýšené nebo snížené množství vztaženo na přítomné nebo standardní množství, které reprezentuje množství přítomné v analogickém vzorku z části těla nebo ze subjektu, který netrpí poruchou.

Používané imunologické testy zahrnují kompetitivní a nekompetitivní testovací systémy, které používají imunohistochemické, patologické metody, western přenosy, radioimunologické testy, test ELISA, sendvičové imunologické testy, imunoprecipitační testy, precipitační reakce, gelové difúzní precipitační reakce, imunodifúzní testy, aglutinační testy, testy fixující komplement, imunoradiometrické testy, fluorescenční imunotesty, imunohistochemické testy, imunotesty s proteinem A.

V hybridizačních testech se mohou také použít geny Nogo a příbuzné sekvence a subsekvence nukleové kyseliny zahrnující komplementární sekvence. Sekvence nukleové kyseliny Nogo nebo jejich subsekvence obsahující přibližně alespoň 8 nukleotidů se mohou použít jako hybridizační sondy. Hybridizační testy se mohou použít při detekci, prognóze a diagnostice nebo monitorování stavů, poruch nebo stádia onemocnění spojeného s aberujícími změnami v expresi proteinu Nogo a v aktivitě, jak se popisuje shora v textu. Takový hybridizační test je možné provést způsobem zahrnujícím kontakt vzorku, který obsahuje nukleovou kyselinu se sondou nukleové kyseliny,

-32CZ 304224 B6 která je schopna hybridizovat DNA nebo RNA Nogo za podmínek, při kterých dojde k hybridizaci a detekci nebo měření libovolné výsledné hybridizace.

Ve specifických provedeních vynálezu se onemocnění a poruchy zahrnující buněčný růst a vývojové poruchy mohou diagnostikovat nebo se může testovat jejich očekávaná přítomnost nebo se může detekovat predispozice pro vývoj takových poruch detekcí zvýšeného množství proteinu Nogo, RNA Nogo nebo funkční aktivity proteinu Nogo, jak ukazuje inhibice růstu nebo detekce mutací v RNA, DNA nebo proteinu Nogo (například translokace v nukleových kyselinách, zkrácení genu nebo proteinu Nogo, změny v nukleotidové nebo aminokyselinové sekvenci vztažené kNogo divokého typu), které způsobují zeslabení exprese nebo aktivity proteinu Nogo. Takové onemocnění nebo poruchy zahrnují, ale nejsou omezeny na ty popsané shora v textu. Množství proteinu Nogo se může detekovat imunologickými testy, množstvím RNA Nogo se může detekovat hybridizačními testy (například northem přenos, dot bloty), navázání Nogo na buněčné růstové inhibiční proteinové receptory se může provést vazebnými testy, které jsou běžně známy v oboru, translokace a bodové mutace v nukleových kyselinách Nogo se mohou detekovat Southemovými přenosy, analýzou RFLP, PCR za použití primerů, které přednostně tvoří fragment, který zahrnuje alespoň většinu genu Nogo, sekvenování genomové DNA nebo cDNA Nogo získané od pacienta atd.

Také se popisují sady pro diagnostické použití, které obsahují jeden nebo více kontejnerů protilátek proti Nogo a mohou obsahovat značeného partnera vázajícího se na protilátky. Vjiném případě se protilátky proti proteinu Nogo mohou značit (s detekovatelnou značkou, například chemoluminiscenční, enzymatickou, fluorescenční nebo radioaktivní částí). Také se popisuje sada, která obsahuje v jednom nebo ve více kontejnerech sondu nukleové kyseliny, která je schopna hybridizovat s RNA Nogo. Ve specifickém provedení sada může obsahovat v jednom nebo více kontejnerech pár primerů (například v rozmezí velikosti 6 až 30 nukleotidů), které jsou schopny vyvolat amplifikaci (například polymerázovou řetězcovou reakcí (popisuje se v publikaci Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academie Press, lne., San Diego, CA), ligázová řetězcová reakce (popisuje se v dokumentu EP 320,308) používá replikázu ζ)β, cyklickou reakci se sondou nebo jiné metody známé v oboru) za vhodných podmínek reakce alespoň části nukleové kyseliny Nogo. Sada může dále v kontejneru obsahovat předem stanovené množství čištěného proteinu Nogo nebo jeho nukleové kyseliny například jako standardní nebo kontrolní.

Testování agonistů a antagonistů Nogo

Nukleové kyseliny, proteiny a deriváty Nogo se také používají v testech vhodných pro detekci molekul, které specificky váží nukleové kyseliny, proteiny nebo deriváty Nogo a tak mají potencionální použití jako agonisté nebo antagonisté Nogo, zvláště molekuly, které tak regulují buněčný růst. V preferovaném provedení vynálezu testy slouží k testování molekul s potencionálním použitím jako neurální růstové promotory při vývoji léků. Vynález tak popisuje testy vhodné pro detekci molekul, které se specificky váží na nukleové kyseliny, proteiny Nogo nebo jejich deriváty. Rekombinantní buňky exprimující nukleové kyseliny Nogo se mohou použít při rekombinantní produkci proteinů Nogo v uvedených testech, přičemž se testují molekuly, které se váží na protein Nogo. Molekuly (například putativní vazební partneři proteinu Nogo) přijdou do kontaktu s proteinem Nogo (nebo sjeho fragmentem) za podmínek podporujícího navázání a pak se identifikují molekuly, které se specificky váží na protein Nogo. Podobné metody se mohou použít k testování molekul, které se váží na deriváty Nogo nebo nukleové kyseliny. Metody, které se mohou použít, jsou dobře známy v oboru.

Různé knihovny, jako je náhodná peptidová nebo kombinační peptidová nebo nepeptidová knihovna se mohou testovat za účelem zjištění přítomnosti molekul, které se specificky váží na protein Nogo. Může se použít řada knihoven, které jsou dobře známy v oboru. Jsou to například chemicky syntetizovaná knihovna, rekombinantní (například knihovna vykazujícího fága) a knihovna založená na translaci in vitro.

-33 CZ 304224 B6

Příklady chemicky syntetizovaných knihoven se popisují v publikaci Fodor et al., 1991, Science 251: 767-773, Houghten et al., 1991, Nátuře 354: 84-86, Lam et al., 1991, Nátuře 354: 82-84, Medynski, 1994, Bio/Technology 12: 709-710, Gallop et al., 1994, J. Medicine Chemistry 37(9): 1 233-1 251, Ohlmeyer et al., 1993, proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 10 922-10 926, Erb et al., 1994, Porc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 11 422-11 426, Houghten et al., 1992, Biotechniques 13: 412, Jayawickreme et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 1 614-1 618, Salmon et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 11 708-11 712, přihláška PCT č. WO 93/20242 a Brenner and Lemer, 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5 381-5 383.

Příklady knihovny, která vykazuje fága, se popisuje v publikaci Scott and Smith, 1990, Science 249: 386-390, Devlin et al., 1990, Science, 249: 404-406, Christian, R. B., et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 711-718), Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152: 149-157, Kay et al., 1993, Gene 128: 59-65 a přihláška PCT č. WO 94/18318 s datem 18. srpna 1994.

Knihovny založené na translaci in vitro se popisují v dokumentu přihláška PCT č. WO 91/05058 s datem 18. dubna 1991 a v publikaci Mattheakis et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci USA 91: 9 022-9 026.

Nepeptidové knihovny, jako je například benzodiazepinová knihovna (popisuje se například v publikaci Bunin et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 4 708 4 712), se mohou upravovat, aby byly vhodné pro další použití. Dále se mohou také použít peptidové knihovny (popisuje se v publikaci Simon et al., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9 367-9 371). Může se použít jiný příklad knihovny, kde amidové funkce v peptidech se předem methylovaly za vzniku chemicky transformované kombinační knihovny, jak se popisuje v publikaci Ostresh et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 11 138-11 142).

Testování knihoven se může provést libovolnou z běžně známých metod. Testování peptidových knihoven se popisuje v publikaci Parmley and Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218, Scott and Smith, 1990, Science 249: 386-390, Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422-427, Oldenburg et al., 1992, Proč, Nati. Acad. Sci. USA 89: 5 393-5 397, Yu et al., 1994, cell 76: 933-945, Staudt et al., 1988, Science 241: 577-580, Bock et al., 1992, Nátuře 355: 564-566, Tuerk et al., 1992, Porc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 6 988-6 992, Ellington et al., 1992, Nátuře 355: 850-852, patent US 5 096 815, patent US 5 223 409 a patent US 5 198 346, Ladner et al., Rebar and Pabo, 1993, Science 263: 671-673 a přihláška PCT č. WO 94/18318.

Ve specifickém provedení vynálezu se může provést testování tak, že se členové knihovny dostanou do kontaktu s proteinem Nogo (nebo nukleovou kyselinou nebo derivátem) imobilizovaným na pevné fázi a izoluje se ta knihovna, jejíž členové se vážou na protein (nebo nukleovou kyselinu nebo derivát). Příklady takových testovacích metod se popisují například v publikaci Parmley and Smith, 1988, Gene 73: 305—318, Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422—427, přihláška PCT WO 94/18318.

V jiném provedení vynálezu se popisuje dvouhybridní systém vhodný pro selekci interakčního proteinu v kvasinkách (popisuje se v publikaci Fields and Song, 1989, Nátuře 340: 245-246, Chien et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88. 9 578-9582), který je možné použít k identifikaci molekul, které se specificky váží na protein nebo derivát Nogo.

Zvířecí modely

Vynález také popisuje zvířecí modely, které zahrnují modely myší, křečků, ovce, prasete, telete a upřednostňují se savci, kterým není člověk.

V jednom provedení vynálezu se popisují zvířecí modely onemocnění nebo poruch, které zahrnují pomnožení, růst a regeneraci neuritů. Takové zvíře může vznikat vyvoláním homologní rekombinace mezi genem Nogo ve svém chromozomu a exogenním genem Nogo, který není bio-34CZ 304224 B6 logicky aktivní (upřednostňuje se začlenění heterologní sekvence například gen rezistence na antibiotika). V preferovaném provedení vynálezu se homologní rekombinace provede transformací kmenových buněk získaných z embrya (ES) vektorem, který obsahuje inzercí deaktivovaný gen Nogo, přičemž dochází k homologní rekombinaci, pak se buňky ES zavedou injekcí do blastocytu a blastocyty se implantují do náhradní matky. Pak následuje narození chimérického zvířete („knockoutované zvíře“), kde gen Nogo se deaktivoval (popisuje se v publikaci Capecchi, 1989, Science 244: 1 288-1 292). Chimérické zvíře se může křížit za vzniku dalších „knockoutovaných“ zvířat. Mezi taková zvířata patří myši, křečci, ovce, prasata, telata atd. a preferují se savci, kteří nejsou člověkem. Ve specifickém provedení vynálezu se produkuje „knockoutovaná“ myš.

Očekává se, že u takových zvířat dojde k vývoji onemocnění nebo poruch nebo taková zvířata mají predispozice k vývoji uvedeného onemocnění, která zahrnují centrální nervový systém a tak se mohou použít jako zvířecí modely vhodné pro takové onemocnění a poruchy, například při testování molekul (například potencionální terapeutická činidla pro léčbu poruchy nervového systému) za účelem zjištění jejich schopnosti inhibovat nádory nervové tkáně a tak léčit nebo předcházet takovým onemocněním nebo poruchám.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek č. la až lb: (a) klony cDNA Nogo: CPW1-3 je klon bovinní cDNA izolovaný při testování knihovny cDNA bílé hmoty bovinní míchy s degenerovanými oligonukleotidy MSC5-8 (dané dohromady) a MSC9. Komplementární RNA získaná z tohoto klonu se následně použila při testování knihovny krysí cDNA. Oli3 a Oli8 se izolovaly z knihovny krysích oligodendrocytů s vneseným oligo d(T). R1-3U21, RO18U1 a RO18U37-3 se izolovaly z knihovny krysího mozkového kmene/míchy s vnesenými hexanukleotidy (Stratagene). Polohy šesti bovinních peptidových sekvencí NI220 (bNI220) se označily na CWP1-3 a R13U21. Sekvence ve spojení různých exonů jsou označeny na vrcholu každého klonu. Otazníky u RO18U1 identifikují sekvenci na tomto klonu, který se napáruje se sekvencemi s libovolného jiného klonu Nogo. RO18U37-3 se sekvenoval pouze z 5'-konce a nesekvenovaná část je označena tečkami, (b) Schémata demonstrují hypotetický mechanizmus tvorby tří transkriptů Nogo. Pl a P2 reprezentují putativní lokaci alternativních promotorů. Pro vytvoření tří transkriptů je nutný minimální počet tří exonů, ačkoli každý exon by mohl být potencionálně rozdělen na více exonů.

Obrázek č. 2a až 2b: (a) Nukleotidové (SEQ ID NO: 1) a aminokyselinové sekvence (SEQ ID NO: 2) transkriptů A genu Nogol (sekvence vytvořená spojením sekvencí cDNA RO18U373, O1Í18 a R1-3Ú21). Oválný rámeček: předpokládaný iniciační kodon, podtrženo tečkami: kyselý pruh, potenciální místa PKC, V: potenciální místa kaseinové kinázy II, tlustě podtrženo: hydrofobní oblasti C-konce a potencionální transmembránové oblasti, tence podtrženo: potencionální místa A-glykosylace. (b) Porovnání peptidové sekvence mezi sekvenovanými, izolovanými bovinními sekvencemi NI220 (bNI220, SEQ ID NO: 3 až 8) a odpovídajícími bovinními sekvencemi (SEQ ID NO: 9 až 14) a krysími sekvencemi (SEQ ID NO: 15 až 20) překládanými z krysí a bovinní cDNA. Krysí a bovinní aminokyselinové sekvence, které se nepárují s peptidovými sekvencemi bNI220 jsou v nižším rámečku.

Obrázek č. 3a až 3b: (a) Porovnání aminokyselinové sekvence 180 aminokyselinových oblastí Ckonce NSP (lidská, SEQ ID NO: 21), S-REX krysí, SEQ ID NO: 22), CHS-REX (kuřecí, SEQ ID NO: 23), NOGOBOV (bovinní, SEQ ID NO: 24), NOGORAT (krysí, SEQ ID NO: 25) a klon EST E.elegans (WO6A7A, SEQ ID NO: 26) a klon EST D. melanogaster (US51048, SEQ ID NO: 27). (b) Evoluční konzervovanost dvou hydrofóbních oblastí. Na obrázku je zobrazeno procento podobnosti sjinými druhy nebo v jednom druhu běžných hydrofóbních oblastí. Stínovaným písmem: konzervativní aminokyseliny.

-35CZ 304224 B6

Obrázek č. 4a až 4c: (a) Northern hybridizace různých tkání s běžnou sondou Nogo. Běžná sonda obsahuje transkript A sekvence mezi nukleotidy 2 583 až 4 678. Zkratka ON znamená zrakový nerv a zkratka SC znamená míchu. Symbol C znamená cerebrální kortex. Zkratka DRG znamená dorzální kořeny ganglií. Zkratka SN znamená ischiatický nerv. PC 12 označuje buněčnou linii PC 12. (b) Northern hybridizace RNA míchy a buněk PC 12 se sondou specifickou pro exon 1 (levý panel) a zadní mozek (HB) a RNA skeletálního svalu (M) se specifickou sondou exonu 2 (pravý panel), (c) Northern hybridizace se sondou běžnou pro Nogo. Symbol K znamená ledviny. Symbol B znamená chrupavku z prsní kosti). Zkratka Sk znamená kůži. Symbol M znamená skeletální sval. Symbol Lu znamená plíce. Symbol Li znamená játra a symbol Sp znamená slezinu. Označily se tři hlavní transkripty (4,6 kb, 2,6 kb a 1,7 kb). Symbol V značí difúzní, ale konzistentní pruh o přibližné velikosti 1,3 kb.

Obrázek č. 5a až 5f: Hybridizace in šitu míchy a sekcí malého mozku dospělých krys. (a,d). Radu oligodendrocytů (OL) v míše a v bílé hmotě malého mozku je možné vidět po označení Nogo „antisense“ běžnou ribosondou. To je velmi podobné pro signály detekované v případě, že konsekutivní sekce míchy hybridizovala s „antisense“ ribosondou (b). (c) Neurony v šedé kůře (GM) jsou také značeny Nogo „antisense“ běžnou ribosondou. Zkratka WM znamená bílou mozkovou hmotu. Jasné pole a fluorescenční pohled sekce malého mozku dvojitě značené Nogo „antisense“ běžné ribosondy (e) a anti-GFAP protilátkou (f). Buňky Perkinje (dvojitá šipka) jsou silně značeny sondou Nogo, zatímco astrocyty (černobílá šipka) jsou negativní. Několik buněk granulámí buněčné vrstvy (Gr) je také značeno sondou Nogo. Symbol m znamená molekulovou vrstvu. Měřítko: a, b, d-f: 50 p.m. a c: 280 p.m.

Obrázek č. 6a až 6i: In šitu hybridizace zrakových nervů v různých dnech postnatálního (a, f: PO, b, g: P3, c, h: P7, d, e, i: P22) období buď se sondami Nogo nebo plp (antisense nebo sense). (ad) antisense sonda Nogo, (e) sense sonda Nogo, (g-i) antisense sonda plp, (f) sense sonda plp. Exprese genu Nogo v prekurzorech oligodendrocytů se může detekovat už v časové fázi PO, zatímco exprese plp začíná být detekovatelné už ve fázi P3 ve zrakovém nervu blízko chiazma (g)·

Obrázek č. 7: Protilátky AS Bruna a AS 472 rozeznávají protein myelin o přibližné velikosti 200 kD. Příprava extraktu krysího proteinu myelin a bovinního proteinu q-pool se popisuje v publikaci Spillmenn et al., 1998, J. Biol. Chem., 273(30): 19 283-19 293. Protilátky AS Bruna a AS 472 rozeznávají pruh o velikosti 200 kD, stejně jako několik menších pruhů vbovinním myelinu, které se mohou štěpit produkty bNI220. Protilátky AS Bruna obarvily v krysím proteinu myelin pruh odpovídající velikosti 200 kD. Symbol I znamená protilátky AS Bruna. Symbol P označuje protilátky AS Bruna preimunizační sérum. Symbol E značí protilátky AS 472 čištěné na základě afinity.

Obrázek č. 8a až 8i: Imunohistochemie provedená s krysí míchou a malým mozkem za použití protilátek IN-1 (a-e), AS Bruna (d-f) a AS 472 (g-i), jak je zobrazeno na levé části každého panelu. Silné zbarvení proteinu myelin se pozorovalo v obou tkáních za použití všech tří protilátek, kdy zmrazené sekce se fixovaly se směsí ethanolu/kyseliny octové (a, b, c, d, e, g, h). Ošetření sekcí methanolem odstranilo obarvení myelinem s výjimkou těla buněk oligodendrocytů (šipky, c, f, i). Hrot špičky: buňky Purkinje, WM, bílá hmota; GM, šedá hmota, DR: dorzální kořeny; Gr vrstva granulámích buněk; m, molekulární vrstva. Měřítko: a, d, g: 415 pm, b, c, e, f, h, i: 143 pm.

Obrázek č. 9a až 9d: Obrázky znázorňují neutralizační aktivitu protilátek AS 472 a AS Bruna v různých biotestech. (a) Fibroblasty NIH 3T3 se nanesly na buněčné kultivační misky s proteinem q-pool a předem ošetřené protilátkou IN-1, AS Bruna, AS 472 nebo odpovídajícím pre-imunitním sérem. Polyklonální sérum vykazuje dokonce o trochu lepší neutralizaci inhibičního substrátu ve srovnání s protilátkou IN-1. Pre-imunitní séra nevykazují podstatný účinek na rozšíření buněk NIH 3T3. Přidání přebytku peptidu (P472), který se použil ke vzniku protilátek AS 472 soutěžil s neutralizační aktivitou, zatímco nespecifický peptid (Px) nevykazoval žádný

-36CZ 304224 B6 účinek, (b) Když se inhibiční substrát ošetřil předem protilátkami AS Bruna nebo AS 472 vedlo to ke vzniku výrůstků neuritů DRG, který je srovnatelný s tím, co se pozorovalo na laminámím substrátu. Příklady vyrůstání neuritů z DRG na q-pool předem ošetřených PBS (c, skoré = 0) a předem se ošetřil protilátkami AS Bruna (d, skoré = 4).

Obrázek č. 10a až lOd: Injekce explantátů zrakového nervu s AS 472 vede k růstu axonů. (a) Získaly se páry zrakových nervů dospělé krysy, injekcí se do nich zavedla protilátka AS 472 nebo preimunní sérum a nechaly se kultivovat tak, že jeden konec nervů byl v kontaktu s disociovanými PO krysích DRG neuronů, (b) Po dvou týdnech in vitro se odřízly sekce EM nervů ve vzdálenosti 3,5 mm od odříznutého místa (šipky v panelu A a systematicky se hledaly neporušené axony (3 experimenty), (c) Snopce regenerovaných axonů (šipky) prorůstají degenerovaným zrakovým nervem po injekci s protilátkami AS 472. (d) Regenerující axony v kontaktu s proteinem myelin. Zvětšení: c, 12 OOOx, d: 35 OOOx.

Obrázek č. 11a až 11c: Exprese rekombinantního proteinu Nogo A v transfekovaných buňkách COS. (a) Western blot vykazující imunoreaktivitu protilátek AS Bruna s rekombinantním proteinem Nogo A (dráha 2) a endogenní Nogo A z primárních kultivovaných krysích oligodendrocytů (dráha 3). Hybnost těchto dvou proteinů je na 5% denaturačním gelu SDS skoro shodná s fragmenty o velikosti 200 kD. Kontrolní vzorek transfekovaný konstrukcí LacZ (dráha 1) nevykazuje imunoreaktivitu s protilátkou AS Bruna. Stejný blot se také testoval protilátkou anti-myc 9E10. Pruh, který reagoval s protilátkou AS Bruna také reagoval s protilátkou anti-myc tag 9E10 (dráha 5), zatímco endogenní protein Nogo A nereagoval (dráha 6). Kontrolní vzorek transfekce LacZ vykazoval očekávaný pruh o přibližné velikosti 118 kD (dráha 4). Buňky COS dočasně transfekované konstrukcí Nogo A s dvojitě obarvily protilátkou AS Bruna (b) a IN-1 (c). Buňky pozitivně obarvené protilátkou As Bruna byly také pozitivní s protilátkou IN-1.

Obrázek č. 12: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 28) bovinní cDNA genu Nogo.

Obrázek č. 13: Aminokyselinová sekvence krysího proteinu Nogo A (SEQ ID NO: 2) se porovnávala s teoretickou aminokyselinovou sekvencí lidského Nogo (SEQ ID NO: 29. Aminokyselinová sekvence lidského proteinu Nogo se odvodila z uspořádání exprimované sekvence tags (EST) spolu se sekvencí krysího Nogo a překládala se do uspořádaného lidského ETS za použití krysího Nogo jako templátu.

Obrázek č. 14 zobrazuje sekvenci nukleové kyseliny krysího Nogo C (SEQ ID NO: 31) a jeho odpovídající aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 32).

Obrázky č. 15a až 15e zobrazují, že protein Nogo A je přítomen v plazmatické membráně oligodendrocytů, jak se prokazuje imunocytochemií a biotinylací buněčného povrchu oligodendrocytů v kultuře.

Imunocytochemie (a-d): Oligodendrocyty získané ze zrakového nervu krys P10 se disociovaly a kultivovaly po dobu dvou dní. Barvení živých buněk monoklonální protilátkou In—1 (a) nebo AS 472 (c) vykazují imunoreaktivitu na těla oligodendrocytů. V přítomnosti soutěžícího peptidu P472, AS 472 došlo pouze k zabarvení pozadí (všechny typy buněk) (d). Podobné nespecifické barvení bylo možné vidět, když se vynechaly primární protilátky (b).

Hodnocení: Destičky zakódované číslem se náhodně mixovaly a klasifikovaly třemi nezávislými pozorováními. Osm z deseti destiček se správně klasifikovaly jako AS 472 pozitivní, IN-1 pozitivní a v případě všech tří pozorování se provedly kontroly.

Biotinylace (e): Kultury celého mozku krys P4 bohaté na oligodendrocyty se na buněčném povrchu značily biotinovým činidlem, které po sedmi dnech v kultuře prochází membránou. Následně se buněčné homogenáty ošetřily Dynabeads se streptavidinem. Sraženina (Ppt) a supernatant (sup) testovaly na membráně protilátkou AS 472, přičemž vykazují odlišný proteinový

-37CZ 304224 B6 patem: Buněčný povrchový protein Nogo A zjištěný ve sraženině vykazuje vyšší zjevnou molekulovou hmotnost ve srovnání s vnitrobuněčným proteinem Nogo A. Tento posun je pravděpodobně způsoben glykosylací. Luminální ER protein BiP a většina β-tubulinu se mohou zjistit pouze ve vnitrobuněčné frakci.

Obrázek č. 16a až 16j: Funkční testy ukazují přítomnost proteinu Nogo A na buněčné membráně oligodendrocytů. Preinkubace kultur zrakového nervu s protilátkou AS 472 (a, b) umožňuje fibroblasty NIH 3T3 rozšířit se přes vysoce větvené oligodendrocyty, které jsou nastíněny imunofluorescenčním barvením, kdy se testuje přítomnost GalC (protilátky 01) (a). Šipky v odpovídající fázi kontrastního zobrazení (b) indikují fibroblasty NIH 3T3 rozseté na povrchu oligodendrocytů (c, d): kdy protilátka AS 472 se přidala spolu s P472, přičemž fibroblasty NIH 3T3 se striktně vyhýbají oblastem oligodendrocytů pozitivních na GalC (šipka) (popisuje se v publikaci Caroni and Schwab, 1988 Neuron 1: 85-96). (e, f): V přítomnosti protilátky AS472 PO krysí disociované DRG neurony jsou schopny rozšířit neurity přes oblast vysoce rozvětvených oligodendrocytů (šipka na obrázku 16f). (g, h): Peptid P472 účinně soutěží s neutralizační aktivitou AS 472: neurity se zcela vyhýbají oligodendrocytům. Protilátka AS 472 užívaná v těchto experimentech se vytvořila proti krysí peptidové sekvenci 472. (i, j): Kvantifikace těchto výsledků (jak se popisuje v metodách) demonstruje silnou neutralizační aktivitu protilátek AS 472 v obou typech testů. Měřítko 40 pm.

Obrázek č. 17a až 17e: Rekombinantní protein Nogo A je inhibiční substrát ajeho inhibiční aktivita je neutralizována monoklonální protilátkou In-1. Extrakty bohaté na RecNogoA pocházející ze stabilní buněčné linie CHO-Nogo A nebo [3-galaktozidáza izolovaná paralelně ze stabilní buněčné linie CHO-LacZ se použily v případě testů nanesení fibroblastů NIH 3T3 a růstu neuritů DRG. (a) Stříbrný gel myc-his-značený recLacZ (dráha 1) a recNogo A (dráha 2) vykazuje pruh Nogo A o velikosti 180 kD. Shoda pruhu Nogo A se potvrdila western přenosem inkubovaným s protilátkou AS Bruna (dráha 3) a anti-myc protilátkou 9E10 (dráha 4). (b) Plotny potažené RecNogo A jasně inhibovaly rozšíření buněk NIH 3T3. Předchozí inkubace s monoklonální protilátkou IN—1 nebo s AS Bruna vedla k vysoce podstatné neutralizaci (p je menší než 0,01) inhibiční aktivity. 1 gm kontrolních monoklonálních protilátek 01 a preimunní séra nebyla účinná. Extrakt CHO-LacZ vykazuje částečně inhibiční účinek na buňky NIH 3T3, což je pravděpodobně způsobeno endogenními proteiny CHO. Tato inhibiční aktivita nebyla ovlivněna předchozí inkubací s protilátkou.

(c) Při růstových testech neuritů DRG se smíchal s lamininem stejný proteinový materiál jako v případě (b) a směs se použila k potažení. RecNogo A vykazuje velmi silný inhibiční účinek na růst neuritů v disociovaném DRG způsobem závislým na dávce. Aktivita se neutralizovala monoklonální protilátkou IN-1 (p je menší než 0,001), ale nikoli kontrolní monoklonální protilátkou 01. Proteinový materiál z buněk CHO-LacZ nepůsobil inhibičně v libovolné použité koncentraci. Příklady skóre jsou zobrazeny na obrázku (d): 1 pg recNogo A, žádné nebo krátké neurity (šipka), skóre 2 a na obrázku (e): 1 pg CHO-LacZ, dlouhé, větvené neurity (šipka) skóre 5 až 6. Statistická analýza za použití Studentského testu t. Měřítko je 280 pm.

Na obrázku č. 18 je znázorněna funkční analýza mutantů s deleci Nogo. Následující deleční konstrukce kódující fúzní proteiny obsahující fragmenty Nogo nebo zkrácené části Nogo (jak se uvádí dále v textu) se vytvořily jak se popisuje dále v textu.

Nogo-A: H i s-tag/T7-tag/vektor/Nogo-A seq. ak 1 -1162

Nogo-B: His-tag/T7-tag/vektor/Nogo-A seq ak—171+975—1162

Nogo-C: His-tag/T7-tag/Nogo-C N-konec (11 ak) + Nogo-A seq ak975-l 162

NiAext: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-974/His-tag

EST: Hist-tag/T7-tag/Nogo-A seq ak760-l 162

NiG-Dl: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-908/vektor

NÍG-D2: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl722-866/his-tag

-38CZ 304224 B6

NÍG-D3: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-734/His-tag

NÍG-D4: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-646/His-tag

NÍG-D5: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq ak291 -646/His-tag

NÍG-D7: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-234+292-974/His-tag

NÍG-D8: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl 72-628

NÍG-D9: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-259+646-974/His-tag

NiG-D 10: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq ak291-974/His-tag

NÍG-D14: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl 72-259

NÍG-D15: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-189+491-974/His-tag

NÍG-D16: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl 72-189+619-974/His-tag

NiG-Dl 7: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-189+257-974/His-tag

NiG-Dl8: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-189+261-974/His-tag

NÍG-D20: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq ak542-722/His-tag

Čísla aminokyselin (ak) jsou založena na číslování aminokyselinové sekvence Nogo A (SEQ ID NO: 2) začínající prvním metioninem. His-tag a T7-tag obsahuje 34 aminokyselin. N-a C-terminální vektorové sekvence se získaly z expresního vektoru pET28.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Charakterizace nukleotidu a proteinového produktu genu Nogo

Zde popsané příklady demonstrují, že klonovaný gen Nogo kóduje protein, který je silný inhibitor růstu neurálních buněk a je také rozeznáván monoklonálními protilátkami popsanými v dokumentu Schwab et al., patent US 5 684 133.

Materiály a metody

V následující sekci se popisují materiály a metody používané podle vynálezu. Odborník ví, že uvedené materiály a metody jsou toliko ilustrativní a je možné provést jejich modifikace. Takové modifikace jsou také předmětnou věcí vynálezu.

Izolace bovinního proteinu Nogo z myelininu

Všechny kroky čištění se provádějí při teplotě 4 °C a inhibiční aktivita substrátu získaných frakcí se rutinně stanovila rozšířením buněk NIH 3T3 a testem nadměrného růstu neuritů PC 12 (popisuje se dále v textu). Z tkáně bovinní míchy se opatrně odstranily mozkové blány a nakrájela se na malé kousky. Myelin se pak extrahoval v extrakčním pufru (60 mM CHAPS, 100 mM TrisHC1, pH 8,0, lOmM pufr EDTA pH 8,0, 2,5 mM jodacetamid, 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid, 0,1 pg/ml aprotininu, 1 pg/ml leupeptinu, 1 pg/ml pepstatinu 1).

Aby se získal míšní extrakt, tkáň se homogenizovala přímo v extrakčním pufru CHAPS v poměru (1:1, hmotnost:objem). Homogenát se centrifugoval dvakrát při 100 000 x g (Kontron, typ: K.50.13, fixovaný úhel rotoru) po dobu jedné hodiny při teplotě 4 °C. Čistý supernatant (extrakt) se bezprostředně aplikoval na kolonu Q-sefaróza (2,6 x 11,5 cm) a uvedl se do rovnováhy pufrem A (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,5 % (hmotnost/objem) CHAPS). Vázané proteiny se eluovaly pětinásobným objemem lineárního gradientu od 0 do 1M NaCl v pufru A (100 ml gradient v 50 minutách). Aktivní frakce obsahující bovinní NI220 se eluovaly při přibližné koncentraci 0,4M NaCl a slily se (q-pool 1) a pak se nanesly na kolonu Superdex 200 (2,6 x 60 cm), která se uvedla do rovnováhy pufrem B (150 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,5 % (hmotnost/objem) CHAPS).

-39CZ 304224 B6

Aktivní frakce se po gelové filtraci (s-pool 1) separovaly 6 % SDS-PAGE za redukčních podmínek a s nízkou konstantní silou (2 watty na gel) při celkové hodnotě 2 500 Volt-hodin. Pruhy a oblasti gelu se identifikovaly po obarvení Coomassiovou modří (0,1 % hmotnost/objem R250 v 50% methanolu a 10% kyselině octové), vyřízly se a extrahovaly se v 800 μΐ gelového elučního pufru (0,5 % (hmotnost/objem) CHAPS, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, pH 8,0, 2,5 mM jodacetamid, 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid, 0,1 pg/ml aprotininu, 1 pg/ml leupeptinu, 1 pg/ml pepstatinu A) po dobu alespoň 48 hodin při teplotě 4 °C.

Mikrosekvence izolovaného proteinu Nogo

Na 10% SDS polyakrylamidovém gelu za redukčních podmínek se opětně provedla separace materiálu eluovaného z několika neutrálizovatelných aktivních gelů IN—1 a polyakrylové gely se obarvily 0,1 % (hmotnost/objem) Coomassieovou modří R250 v 50% methanolu a 10% kyselinou octovou. Pruh o molekulové hmotnosti 220 000 se vyřízl a štěpení endoproteinázou Lys-C (v molámím poměru 1;50) se provedlo přímo v gelu. Vzorek se okyselil a aplikoval se na kolonu vysokovýkonné kapalinové chromatografie a peptidy se separovaly lineárním gradientem (ΟΙ 00) 0,04% kyseliny trifluoroctové a 80% acetonitrilem a frakce obsahující jediné druh peptidu se vystavily automatizované degradaci podle Edmana.

Elektroforéza izolovaného proteinu Nogo

SDS-PAGE s vysokým rozlišením se provedla za použití 6% (hmotnost/objem) SDS-polyakrylamidových gelů (10 x 24 x 0,01 cm) za redukčních podmínek (lOOmM dithiotreitol). Přenos na membrány Immobilon-P (Millipore) se provedl v 20mM Tris bázi, 192mM glycinu, pH 8,3, 0,03% (hmotnost/objem) SDS, 20% methanolu se semisuchým transferovým přístrojem (BioRad, Trans Blot SD). Čas přenosu byl 2 hodiny při 0,8 mA/cm². Blokační činidlo (1 hodina při teplotě místnosti) byla 3% želatina v PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, pH 7,2, 8 g NaCl, 0,2 g KH2PO4, 2,8 g Na2HPO₄ 12H₂O a 0,2 g KC1, rozpuštěný v jednom litru vody) a promývací roztok obsahoval 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl a 0,4% Tween (3 x 10 minut při teplotě místnosti). Inkubace v případě první protilátky (pro ředění 1 % želatiny v PBS) se provedla obvykle přes noc při teplotě 4 °C. Sekundární protilátka anti-myší IgG konjugovaná s křenovou peroxidázou (1:2 000) se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Při detekci se použil chemoluminiscenční systém ECL (Amersham Pharmacia Biotech).

Testování cDNA knihovny sondou

Bílá hmota čerstvě získaná z bovinní míchy a poly(A)⁺RNA se extrahovala za použití sady FastTrack (Invitrogen).Konstrukce knihovny cDNA se uskutečnila za použití sady Uni-ZAP (Stratagene) podle instrukcí výrobce. Komplexnost knihovny byla větší než 4 x 10⁶ jednotek tvořících plaky celkem a průměrná velikost inzertů byla přibližně 1,8 kilobáze.

Degenerované oligonukleotidy MSC5-8 (MSC5:

TCIGTIGGYAAIACIGCIGGYAARTC (SEQ ID NO:47); MSC6: TCIGTIGGIAGIACIGCIGGYAAYTC (SEQ ID NO:48); MSC7: TCIGTIGGYAAIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO:49); MSCS: TCIGTIGGIAGIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO:50)) se vytvořily ze sekvence peptidu 1 bNI220 a MSC9 (GARATHGCIGAIATHCARGAYGGIGA (SEQ ID NO: 51)) se vytvořily ze sekvence peptidu 2 bNI220. Oligonukleotidy se syntetizovaly pomocí MWG Biotech (Munchenstein, Švýcarsko) a značily se značícím kitem „DIG DNA 3'end“. Ribonukleové sondy se syntetizovaly za použití značící sady DIG RNA (Boehringer Mannheim).

-40CZ 304224 B6

Použila se hybridizace sondy a podmínky promývání, jak je popisuje výrobce (MSC5-8 a MSC9 se použily při hybridizaci a teplota promývání je 57 °C). Detekce sondy se uskutečnila za použití systému CDP-star (Boehringer Mannheim). Používání a testování knihovny cDNA se provádí podle protokolů vhodných pro knihovny cDNA lambda ZAP (Stratagene). Při přenosu plaků se použily nylonové membrány „Genescreen“ (DunPont).

Sekvenování DNA

Oba řetězce CWP1-3, Olil8, 0113 a R1-3U21 se sekvenovaly za použití systému Perkin Elmer AB1377 pomocí Microsynth (Balgach, Švýcarsko). Sekvence DNA se analyzovaly pomocí programu DNASIS (hitachi). Vyhledávání v databázi se provedlo za použití programu BLAST (NCBI).

Analýza RNA

Celková RNA a poly(A)⁺RNA se extrahovaly z tkání za použití „RNAgent“ (Promega) nebo sady „FastTrack“ (Invitrogen). RNA se separovaly elektroforézou na 1% formaldehydovém gelu a přenesly se na membrány Genescreen. Bloty se hybridizovaly s antisense ribonukleovými sondami, které se vytvořily pomocí značícího kitu DIG RNA (Boehringer Mannheim) z relevantních plazmidů. Hybridizace blotů, promývání a podmínky detekce za použití kitu „CDP-star“ jsou popsány výrobcem. „Běžná“ sonda ESTI 11410 (TIGR, ATCC, Rockville, MD, USA) obsahuje transkript A sekvence mezi nukleotidy 2 535—4 678, sonda specifická pro exon 1 obsahuje transkript A sekvence mezi nukleotidy 65-769 a sonda specifická pro exon 2 obsahuje transkript A sekvence mezi nukleotidy 815-3 183.

Produkce antiséra

Antisérum 472 (AS 472) se připravilo ve firmě Research Genetics, lne. (Huntsville, AL, USA) proti syntetickému peptidů P472, SYDSIKLEPENPPYEEA (bovinní sekvence, SEQ ID NO: 33), který odpovídá aminokyselinové sekvenci krysího proteinu Nogo v poloze 623 až 640 SEQ ID NO: 2 se třemi nesprávnými páry.

Antisérum Bruna (AS Bruna) se vytvořilo proti fragmentu rekombinantního proteinu Nogo, který se exprimuje v mikroorganizmu E. coli jako fúzní protein. Specificky C-konec nukleotidové sekvence krysího Nogo A kódující aminokyseliny 762 až 1 163 sekvence SEQ ID NO: 2 (exprimovaný v mikroorganizmu E. coli za použití systém Novagen pET) se použil při tvorbě antiséra A Bruna proti proteinu Nogo.

Elektroforéza a western přenos

SDS-PAGE a western přenos se provedl za použití standardních metod, které jsou dobře známy v oboru. Protilátky se ředily následovně: AS Bruna 1:7 500, AS 472 1:2 000, anti-myc(9E 10) 1:5 000 (Invitrogen), anti-BiP 2 pg/ml (Stressgen), supematant hybridomů mAb IN-1 se použil neředěný. Jako sekundární protilátky se použily: antikráličí protilátky konjugované s HRP (Pierce, 1:20 000), antimyší IgM (1:50 000) a anti-myší protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou (Analytica AG, La Roche, Švýcarsko, 1:5 000).

Imunohistochemické metody

Z dospělých krys se rychle vyňala mícha a cerebellum, ponořily se do OTC a zamrazily se při teplotě —40 °C. Dvacet posmrtných sekcí se nařezalo a fixovaly se směsi ethanolu a kyseliny octové při teplotě 40 °C. Provedlo se imunologické barvení, jak se popisuje v publikaci Rubin et al., 1994, J. Neurocytol. 23: 209-217 s výjimkou vypuštění kroku rychlého chlazení. V jiném případě se tkáňové sekce fixovaly methanolem (po dobu 2 minuty při teplotě -20 °C) a provedlo

-41 CZ 304224 B6 se imunologické barvení, jak se popisuje v publikaci Rubin et al., 1994, J. Neurocytol. 23: 209217. Jako primární protilátky se použily (protilátka: (ředění)): supematant hybridomu ΓΝ-1: (neředěno), AS Bruna: (1:5 000) nebo afinitně čištěné AS 472 (1:50).

Test rozšíření fibroblastů NIH 3T3

Fibroblasty NIH 3T3 se nanesly na kultivační plotny potažené 5 mikrogramy na jednu prohlubeň (=1 cm²) q-pool. Q-pool jsou smíchané aktivní frakce extraktu bovinní míchy separovaného na koloně Q sefaróza. IN—1 se použily jako naředěný supematant kultury a AS 472 a pre-imunizované sérum se ředilo v poměru 1:500 v PBS. Aby se kompenzovaly výchylky aktivity u různých q-pool, množství buněk nanesených na q-pool se normalizovalo na 100 % a na 0 % nanesených na kontrolní pufr (popisuje se v publikaci Spillman et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 19 283-93).

Test růstu neuritů DRG

Ganglie dorzálních kořenů (DRG) se vyňaly z embryí kuřat El 6 a daly se do Hankova roztoku s vyváženými solemi (HBSS), rozdělily se na části a nanesly se na plotny předem potažené qpool ve 100 μΐ média F12 s 10 % (FCS) a 1% metocelem. Výrůstky neuritů zjednotlivých ganglií dorzálních kořenů se hodnotily po 24 hodinách při teplotě 37 °C semi-kvantitativním způsobem za použití měřítka od 0 (žádné výrůstky) do 4 (maximální výrůstky).

Ko-kultivační test DRG a zrakového nervu

Zrakové nervy se vyňaly z dospělých krys, ozářily se 5 500 Gray a injekcí se aplikovalo sérum AS 472 nebo odpovídající preimunizované sérum (ředění 1:10). Páry nervů se kultivovaly ve 3komorových kulturách tak, že jeden konec každého nervu dosahoval přes silikonový tuk/teflonovou kruhovou bariéru do střední komory, kde se umístily disociované kultivované primární neurony DRG z krys PO. Po dvou týdnech v kultuře se tyto nervy fixovaly metodami, které jsou dobře známy v oboru a fixovaly se způsobem vhodným pro elektronovou mikroskopii (EM) a připravily se ultratenké sekce ve vzdálenosti 3,5 mm DRG exponovaného kořene. Sekce se systematicky analyzovaly za účelem zjištění přítomnosti znovu rostoucích axonů za použití mikroskopu Zeiss EM 902.

Exprese Nogo v buňkách COS

Otevřený čtecí rámec Nogo A se subklonoval do vektoru pcDNA3.1 mychis (Invitrogen) za použití standardních klonovacích metod, které jsou dobře známy v oboru. Výsledný plazmid (NOGO-mycl9) dává vzniku rekombinantního proteinu, který obsahuje sekvenci Nogo A fúzovanou s myc-his Tag (21 aminokyselin). Nogo-mycl9 (2 pg DNA na plotnu o průměru 35 mm) nebo kontrolní plazmid (pcDNAmychisLacZ) se transfekovaly do buněk COS za použití kitu „Superfact“ (Qiagen) podle protokolu výrobce. Na základě imunofluorescenčního barvení s protilátkou anti-myc a enzymatickou barevnou reakcí s β-galaktozidázou se odhadl průměrný poměr transfekce na hodnotu přibližně 20 %. Transfekované buňky COS se fixovaly směsí 95 % ethanolu a 5% kyselinou octovou (při teplotě 4 °C po dobu 25 minut), blokovaly se směsí PBS a 10 % FCS a inkubovaly se sérem AS Bruna (v ředění 1:200) nebo IN-I (v ředění 1:2) po dobu 2 hodin ve směsi PBS a 1% FCS při teplotě místnosti. Buňky se promyly PBS a při detekci IN-1 se použily kozí protilátky anti-myš-TRITC (popisuje se v publikaci Jackson Immuno Research Fab. lne., West Grove, PA).

Kultury oligodendrocytů

Oligodendrocyty izolované z mozku nově narozených krys se umístily do polylyzinových nádob o objemu 75 cm² (Sigma, St. Fouis, MO) a kultivovaly se po dobu 10 až 12 dní v DMEM doplněném 5 % FCS. Obohacená smáčená populace oligodendrocytů a jejich potomci se uvolnily z astrocytové monovrstvy mícháním přes noc při 210 otáčkách za minutu v orbitální míchačce.

-42CZ 304224 Β6

Buňky se nanesly na plotnu při hustotě 1 až 2 χ 10⁶ buněk o ploše 35 cm² potažené polylyzinem. Potomstvo se nechalo diferenciovat v chemicky definovaném médiu (CDM) po dobu 3 až 4 dní. Biotinylace buněčného povrchu

Připravily se kultury celého mozku krys P4, jak se popisuje v publikaci van der Haar, et al., (1998, J. Neurosci, Res. 51: 371-81). V den 7 in vitro se biotinylovaly s EZ-LINK-Sulfo-NHSLC-Biotin (Pierce), který nevstupuje do buněk podle popsaného postupu s výjimkou, že všechny kroky se prováděly při teplotě 15 °C a buňky se lyžovaly v 1 ml lyzačního pufru (0,05 M NaH₂PO₄ pH 8,0, 0,15 M NaCl, 0,5% CHAPS (Sigma), 2,5 mM jodacetamid, lmM fenylmethylsulfonylfluorid, 0,1 pg/ml pepstatinu A). Biotinylované proteiny se imunologicky srážely pomocí přípravku Dunabeads M-280 Streptavidin (Dynal), provedla se s nimi analýza SDS-Page a přenesly se na nitrocelulózové membrány, které se testovaly použitím AS472, α-BiP a α-β-tubulinu. Membrány se stripovaly za použití sady Re-Blot Western Blot Recykling (Chemicon). Imunocytochemické metody

Oligodendrocyty zrakového nervu se připravily způsobem, který se popisuje v publikaci Achwab and Caroni, 1988, J. Neurosci. 8: 2 381-2 393). Dva dny staré kultury se inkubovaly se sérem AS 472 (v ředění 1:200) nebo monoklonální látky IN-1 (v ředění 1:3) po dobu 25 minut při teplotě místnosti (RT). Kultury se promyly, fixovaly směsí 4% paraformaldehydu a 5% sacharózy v PBS a blokovaly se směsí 0,lM kyseliny maleové a 2% blokačního činidla (Boehringer Mannheim) po dobu 1 hodiny. Sekundární protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou (Milan Analytica) se použily v ředění 1:7 500 ve směsi 0,lM kyseliny maleinové a 1% blokačního činidla (po dobu jedné hodiny a při teplotě místnosti). Transfekované buňky COS se fixovaly směsí 95 % ethanolu a 5% kyseliny octové (při teplotě 4 °C, po dobu 25 minut), blokovaly se a inkubovaly se sérem AS Bruna (v ředění 1:200) nebo s mAb IN-1 po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Buňky se nechaly reagovat s kozími anti-králičími-FITC protilátkami a kozími anti-myšímiTRITC protilátkami (Jackson Immuno Research Lab).

Komora vhodná pro zrakový nerv

Páry zrakového nervu se kultivovaly v 3-komorovém kultivačním systému, jak se popisuje v publikaci Schwab et al., 1988, J. Neurosci. 8: 2 381-2 393) a injekcí se aplikovalo AS 472 nebo odpovídající preimunizované sérum (v ředění 1:10). Zrakové nervy se fixovaly způsobem vhodným pro elektronovou mikroskopii (EM) a připravily se ultratenké sekce ve vzdálenosti 3,5 mm DRG exponovaného kořene. Sekce se systematicky analyzovaly za účelem zjištění přítomnosti znovu rostoucích axonů za použití mikroskopu Zeiss EM 902.

Výsledky experimentů

Dále v textu se uvádějí experimentální výsledky získané za použití metod popsaných shora v textu.

Izolace cDNA Nogo

Bovinní homolog krysího NI-250 se čistil a štěpením proteinázou se připravily peptidy čištěného proteinu. Podle šesti různých peptidových sekvencí bNI220 se připravilo velké množství degenerovaných oligonukleotidů značených digoxygeninem. Několik klonů cDNA se izolovalo při testování knihovny bovinní bílé hmoty za použití těchto oligonukleotidů. Inzert nejdelšího klonu (CWP1-3, zobrazený na obrázku č. la) se požil k syntéze sond v případě následného testování krysí cDNA knihovny. Vybrané klony z takového testování se zobrazily na obrázku č. la. Analýza DNA sekvence těchto klonů cDNA naznačuje, že tři různé transkripty pocházejí zjednoho genu a tento gen se označil jako gen Nogo. Odlišné transkripty jsou pravděpodobně výsledkem alternativního použití promotorů a alternativního sestřihu (Nogo A, Nogo B a Nogo C, zobrazeno

-43 CZ 304224 B6 na obrázku č. lb). Sekvence DNA se kompilovaly z klonů zobrazených na obrázku č. 1A za vzniku transkriptu A, přičemž sekvence DNA uvedeného transkriptu je uvedena na obrázku č. 2a.

Pojmová translace tří transkriptů vede ke vzniku proteinových produktů označených Nogo A (1 163 aminokyselin), Nogo B (360 aminokyselin) a Nogo C (199 aminokyselin). Protože Nogo A obsahuje všech šest peptidových sekvencí získaných z čištěných bNI220 (zobrazeno na obrázku č. 2b), je pravděpodobně ekvivalentní s čištěným proteinem krysí NI-250. Nogo A, B a C vykazuje běžný C-konec 188 aminokyselin (běžná oblast) a Nogo A a B sdílí N-konec obsahující 172 aminokyselin. Nogo Aje delší než Nogo B o 803 aminokyselin, což způsobuje alternativní sestřih.

Žádná z izoforem Nogo nevykazuje hydrofobní pruh aminokyselin na N-konci, který by se mohl použít jako běžný signální peptid. Avšak popsaly se proteiny, kterým chybí běžný signální peptid, ale stále procházejí membránami, jako je například fibroblastový růstový faktor (popisuje se v publikaci Florkiewicz et al., 1995, J. Cell. Physiology 162: 388-399), ciliámí neurotrofický faktor (popisuje se v publikaci Sendtner et al., 1994, J. Neurobiology 25: 1 436-1 353) a interleukin-1 (popisuje se v publikaci Rubartelli et al., 1990, EMBO J. 9: 1 503-1 510). Membránové proteiny, jako je například „commissureless“ (popisuje se v publikaci Tear et al., 1996, Neuron 16: 501-514), které také nevykazují signální peptid, se začlenily do membrány.

Ačkoli v putativní 5'nepředkládané oblasti neexistuje stop kodon, který by jednoznačně definoval počáteční kodon, následující důkaz naznačuje, že methionin indikovaný na obrázku č. 2a je počáteční kodon Nogo A a Nogo B: (1) sekvence kolem uvedeného předpokládaného startovacího kodonu souhlasí se sekvencí počátečních míst translace (GCCGCC A/G CCATGG, SEQ ID NO: 39), (2) Velké úsilí se věnovalo vyhledávání více „upstream“ sekvencí testováním knihovny a 5'-Race. Žádný z těchto průzkumů nevedl k identifikaci více „upstream“ sekvencí a (3) eukaryontní rekombinantní protein Nogo A se exprimoval ze shora uvedeného methioninu a vykazuje zjevnou molekulovou hmotnost okolo 200 000, jak se odhaduje pomocí testu SDS PAGE, který se může odlišit od endogenního proteinu Nogo A, jenž pochází z krysích oligodendrocytů (zobrazeno na obrázku č. 1 la).

Analýza sekvence Nogo

Protein Nogo A obsahuje potenciální N-glykosylační místa, avšak biochemický důkaz indikuje, že protein Nogo A nevykazuje hlavní polysacharidový komponent. Protein Nogo A také vykazuje devatenáct míst, které rozeznává PK.C a sedm míst, které rozeznává kaseinová kináza II (obrázek č. 2a). Všechny tři proteiny Nogo mají dvě běžné hydrofobní oblasti C-konce, které obsahují 35 a 36 aminokyselin. Libovolná z nich nebo obě se mohou použít jako trans- nebo intramembránové oblasti, které jsou konzistentní s charakterizací bNI220, jako integrálový membránový protein. Protein Nogo A (stejně jako Nogo B a C) neobsahuje žádné motivy známých buněčných adhezivních molekul, proteiny extrabuněčné matrice nebo jiné molekuly.

Sekvence Nogo se použily k průzkumu různých databází za účelem vyhledávání homologních genů. Běžná oblast C-konců tří produktů Nogo je podobná (62,5 %) s identifikovaným lidským genem nsp tel 13 a s-rex u krys a chs-rex u kuřat) (zobrazeno na obrázku č. 3). EST z mikroorganizmu C.elegans a Drosophila melanogaster EST také vykazuje podstatnou podobnost (16,6 % a 13,6 %) s oběma geny Nogo a nsp v této stejné oblasti. 180 aminokyselin oblastí C-konce obou proteinů Nogo a Nsp jsou vysoce konzervativní ve všech druzích savců (98,3 % a 97,3 %), což naznačuje, že mohou uskutečňovat stejné a podstatné funkce. Mimo tuto oblast podobnost s daným proteinem mezi druhy je také vysoká (73 % mezi krysím a bovinním proteinem Nogo A, 76,2 % mezi NSP-A a S-rexb, 50 % mezi Chs-rexb a NSP-A nebo S-rexb). Podobnost mezi NSP a Nogo je však omezená na jejich hydrofobní, běžnou oblast C-konce (obrázek č. 3a) a na kyselou podstatu proteinů vně této konzervativní oblasti. NSP (NSP-A, -B a -C) se už dříve popisují jako neuro-endokrinní specifické produkty se známými funkcemi. Hybridizace in šitu a imunohistologie vykazuje neuronální lokalizaci NSP v nervovém systému. Identifikoval se jiný

-44CZ 304224 B6 lidský gen nsp—like—1, který také obsahuje C-terminální hydrofobní oblast s 50% podobností s Nsp a Nogo.

Exprese proteinu Nogo v tkáni

Expresní patem Nogo se testoval northem přenosem a hybridizací in šitu. Když se použila běžná sonda (popisuje se shora v textu) detekovaly se ve zrakovém nervu, míše a v mozkové kůře tri hlavní transkripty Nogo (označené : A, 4,6 kb, B, 2,6 kb a C, 1,7 kb) (zobrazeno na obrázku č. 4a). V gangliích dorzálních kořenů se detekovaly pouze dva větší transkripty. Hlavní transkript obsahující 2,6 kb se detekoval v buňkách PC12, zatímco pruh obsahující 4,6 kb se detekoval pouze po dlouhé expozici (zobrazeno na obrázku č. 4a). El sciatického nervu se detekovalo menší množství transkriptů, přičemž pruh odpovídající velikosti 2,6 kb byl hlavním transkriptem. Když se poly(A)⁺RNA míchy a buněk PC 12 hybridizovaly se sondou specifickou pro exon 1 detekovaly se pouze transkripty odpovídající 4,6 kb a 2,6 kb. V případě, že se hybridizovala poly(A)⁺RNA zadního mozku a skeletálního svalu se sondou specifickou pro exon 2, detekoval se pouze transkript odpovídající 4,6 kb (zobrazeno na obrázku č. 4b). Tyto výsledky potvrdily transkripční mapu zobrazenou na obrázku č. 1. Výsledky northem blotu však ukazují, že exprese proteinu Nogo není omezena na nervový systém (zobrazeno na obrázku č. 4c). Transkripty Nogo se také detekovaly v skeletovém svalu (odpovídá velikosti 1,7 kb), v ledvinách (2,6 kb a 1,7 kb), v chrupavce (pocházející z prsní kosti, odpovídá 1,7 kb), v kůži (odpovídá velikosti 1,7 kb), v plicích (odpovídá velikosti 2,6 kb) a slezině (odpovídá velikosti 2,6 kb). S výjimkou skeletálního svalu, ve kterém dochází k expresi transkriptů Nogo C ve velkém množství, množství transkriptů Nogo vně nervového systému je nižší než je množství transkriptů v nervovém systému. Zdá se, že transkripty Nogo A odpovídající velikosti 4,6 kb se jednoznačně přepisují v nervovém systému.

Při hybridizacích in šitu sekce tkáně CNS dospělých krys za použití běžné sondy vykazovaly slabé značení čar v těle buňky v bílé hmotě různých částí mozku a míchy. Toto uspořádání je typické pro interfascikulámí oligodendrocyty (obrázek č. 5a,d). Vedle oligodendrocytů několik typů neuronů také exprimuje transkripty Nogo ve vysokém množství (obrázek č. 5c, e). V případě malého mozku dvakrát barvené sekce s protilátkou anti-GFAP a in šitu hybridizace jasně vykazují silné značení buněk Purkinje sondou Nogo, zatímco astrocyty nebyly značeny (zobrazeno na obrázku č. 5e,f). Při vyvíjení zrakových nervů se detekovaly transkripty Nogo už v postnatální den 0 (PO), to znamená několik dní před tím, než se mohly detekovat mRNA hlavních myelinových proteinů proteolipidového proteinu (PLP) a myelinového základního proteinu (MBP) (zobrazeno na obrázku č. 6). Uvedené načasování je konzistentní s objevením prvních oligodendrocytů, které jsou pozitivní na galaktocerebrosid a exprimují inhibiční aktivitu růstu neuritů, která může být neutralizována IN-1.

Vytvořilo se antisérum proti syntetickému peptidu založenému na specifické sekvenci bovinního proteinu Nogo A (AS 472) a proti rekombinantnímu částečnému krysímu proteinu Nogo A o molekulové hmotnosti 45 000 (AS Bruna). Sérum AS 472 a AS Bruna rozeznává protein o přibližně molekulové hmotnosti 200 000 v bovinním myelinu a sérum AS Bruna rozeznává dále krysí myelinový protein o molekulové hmotnosti 200 000 na western blotech (zobrazeno na obrázku č. 7). Sekce míchy a malého mozku z dospělých krys se barvily pomocí AS 472, AS Bruna a IN-1. Když se sekce fixovaly směsí ethanolu a kyseliny octové (dříve zobrazený postup se zdá být nutný při ochraně a dostupnosti antigenů IN-1) silné obarvení bílé hmoty/myelinu se dosáhlo za použití všech tří protilátek (zobrazeno na obrázku č. 8). Barvení těl oligodendrocytových buněk bylo zvláště zřetelné se sérem AS Bruna. Ošetření čerstvých zmražených sekcí methanolem místo směsi ethanol a kyselina octová se dosáhlo obarvení myelinu s výjimkou těl oligodendrocytových buněk.

Sérum AS Bruna a AS 472 také obarvilo některé typy neuronů, které zahrnují řídící neurony v míše a granulámí a molekulovou vrstvu v malém mozku. Buňky Purkinje se silně obarvily pomocí AS 472 a As Bruna, ale nedošlo k detekci barvením s IN-1.

-45CZ 304224 B6

Protilátky Nogo inhibují in vitro inhibici růstu indukovaný Nogo

Přípravek semičištěné bovinní míchy NI-220 (q-pool) může předcházet rozšíření fibroblastů NIH 3T3 a tvorbě výrůstků neuritů. V přítomnosti antiséra Nogo se snížila inhibiční aktivita buď AS Bruna, AS 472 nebo IN-1, q-pool. To znamená, že fibroblasty NIH 3T3 se rozšířily a neurity ganglií dorzálních kořenů (DRG) rostly na plotnách potažených q-pool (zobrazeno na obrázku č.9). Specificita se projevila přidáním peptidů P472, kterým byl peptid používaný k vytvoření AS 472 (popisuje se shora v textu). P472 úspěšně blokuje inhibiční účinek AS 472, zatímco kontrolní peptid neměl účinek na inhibici.

Přítomnost proteinu Nogo A na oligodendrocyty na buněčném povrchu se demonstroval imunocytochemicky, funkčně a biochemicky za použití AS 472. Když se živé primárně kultivované oligodendrocyty obarvily buď mAb IN-1 nebo AS 472, pozorovalo se relativně slabé (ve srovnání s imunocytochemickou metodou v případě galaktocerebrosidu), ale jasné povrchové barvení na diferenciovaných oligodendrocytech (zobrazeno na obrázku č. 15 a, c). Vedle konkurenčního peptidů (P 472) v případě AS 472 nebo vynechání primární protilátky se eliminovalo specifické barvení (zobrazeno na obrázku č. 15b, d). Biotinylace buněčného povrchu a následná precipitace streptavidinem dále prokázala přítomnost proteinu Nogo A v plazmatické membráně oligodendrocytů. Ve sraženině AS 472 detekoval pruh, který se nachází nad intracelulámím, pravděpodobně nezpracovaným a neglykosylovaným AS 472 imunopozitivním pruhem. ER protein BiP by se nemohl detekovat v biotinylované frakci (zobrazeno na obrázku č. 15e).

Protein Nogo A jako povrchová molekula oligodendrocytu se také funkčně analyzoval. Společná kultivace oligodendrocytů a fibroblastů NIH 3T3 nebo oligodendrocytů a neuronů DRG jasně ukazují inhibiční vlastnosti zralých oligodendrocytů. Tyto testy demonstrují, že fibroblasty NIH 3T3 a neurity DRG silně vyhýbaly oblasti oligodendrocytů, přičemž tento účinek se neutralizoval monoklonální protilátkou In—1. V přítomnosti AS 472 se tato inhibice redukovala rovnou měrou (zobrazeno na obrázku č. 16a, b, c a e, f), zatímco preinkubace AS 472 s P472 obnovila inhibici zprostředkovanou oligodendrocyty (zobrazeno na obrázku č. 16 c, d a g, h). Kvantifikace vykázala vysoce podstatnou neutralizační kapacitu monoklonálních protilátek IN-1 a AS 472 v obou typech testů (zobrazeno na obrázku 16i aj).

RecNogo-A (obrázek č.l7a) produkovaný stabilně transfekovanou buněčnou linií CHO se testoval za účelem zjištění jeho aktivity na rozšíření fibroblastů NIH 3T3 a tvorbu výrůstků DRG neuritů. Rekombinantně produkovaná β-galaktozidáza izolovaná ze stabilní buněčné linie CHO (CHO-LacZ) se obohatila paralelně recNogo-A a použila se jako kontrola inhibiční aktivity endogenních proteinů CHO v obou testech. V testu rozšíření fibroblastů NIH 3T3 extrakt CHO obsahující recNogo-A (Nogo A: přibližně 1 až 5 % celkového proteinu, obrázek č. 9a) vykazoval jasné inhibiční účinky na rozšíření buněk při hustotě 10 pg/cm² (zobrazeno na obrázku č. 17b). Tento účinek závisí na dávce: při hustotě 20 pg/cm² byla inhibiční aktivita vyšší, zatímco při hustotě 5 pg/cm² nedošlo k žádné inhibici (data nejsou uvedeny). Inhibiční aktivita by se mohla neutralizovat na úroveň pozadí preinkubací potaženého proteinu s monoklonální protilátkou IN-1 nebo AS Bruna, zatímco kontrolní protilátky proti preimunnímu séru galaktocerebrosidu (mAb 01) nebo AS Bruna neměly žádný účinek (zobrazeno na obrázku č. 17b).

Vedle silného účinku na rozšíření fibroblastů NIH 3T3, CHO extrakt obsahující recNogo-A, ale nikoli extrakt CHO-LacZ vykazují potencionální inhibiční účinek na růst neuritů z primárních kultivovaných neuronů: Disociované neurony DRG se inhibovaly pomocí recNogo-A způsobem, který je závislý na dávce (zobrazeno na obrázku č. 17c). Tato inhibiční aktivita by se mohla neutralizovat monoklonálními protilátkami In-1, ale nikoli kontrolní monoklonální protilátkou 01 (zobrazeno na obrázku č. 17c až e). Rekombinantní protein izolovaný z CHO-LacZ nevykazoval inhibici v množství 1 a 5 mikrogramů a vedle monoklonálních protilátek 01 nebo IN-1 neměly žádný účinek na vytvoření výrůstků neuritů.

-46CZ 304224 B6

Opětný růst neuritů in vitro

Zkoumala se schopnost nově narozených krysích DRG neuritů regenerovat a prorůstat dospělou tkání CNS. Páry zrakových nervů se vyňaly z dospělých krys a kultivovaly se ve speciálním komorovém kultivačním systému tak, že DRG neurity měly přístup k jednomu konci každého nervu (zobrazeno na obrázku č. 10a). V každé kultuře se do jednoho z nervů injekcí aplikovalo preimunizované králičí sérum a do druhého nervu se injekcí aplikovalo sérum AS 472, které je také přítomné v boční komoře okolo nervu. Následují dva týdny in vitro v přítomnosti NGF, kultury se fixovaly, rozebraly a fixovaly se za účelem zkoumání elektronovou mikroskopií (EM). EM sekce se odebraly ve vzdálenosti 3,5 mm od konce nervu v kontaktu s neurony DRG. Nervy, kterým se injekcí aplikovalo preimunizované sérum, neobsahovaly nebo obsahovaly pouze několik axonů (zobrazeno na obrázku č. 10b). Později se nalezly pouze ve spojení z bazální membránou a astrocyty na povrchu nervů. Naopak většina optických nervů se zavedlo injektovaných AS 472 obsahovala podstatné množství axonů, často až několik stovek. Také je často možné vidět kontakt s myelinem (zobrazeno na obrázku č. 10c, d).

Rekombinantní Nogo na rozeznávání pomocí IN-1

V případě, že se Nogo A exprimoval jako karboxyterminální rekombinantní protein značený myc-his v transfekovaných buňkách COS, western přenos za použití protilátek proti myc a AS Bruna demonstrovaly, že rekombinantní Nogo A má zjevnou molekulovou hmotnost přibližně 200 000, což se zjistilo na denaturaěním SDS gelu (zobrazeno na obrázku č. 11a). Na stejném blotu se detekoval v primární kultuře krysích oligodendrocytů pruh se stejnou mobilitou za pomocí séra AS Bruna, což naznačuje, že rekombinantní Nogo A má skoro identickou molekulovou hmotnost jako endogenní Nogo A z oligodendrocytů (zobrazeno na obrázku č. la). Když se transfekované buňky obarvily imunofluorescencí pomocí IN-1 a AS Bruna, IN-1 a AS Bruna rozeznávaly stejné transfekované buňky (zobrazeno na obrázku č. 11b, c). Většina imunoreaktivity se lokalizovala uvnitř v buňce a byla dostupná pouze po permeabilizaci.

Mapování aktivní oblasti(í) Nogo

Série delečních mutantů Nogo se vytvořila za účelem mapování inhibiční oblasti(í) proteinu Nogo. Deleční konstrukce genu Nogo se vytvořila použitím vnitřního restrikčního místa, štěpením exonukleázou III z fazolí mungo a polymerázovou řetězcovou reakcí. Popis mutací se popisuje na obrázku č. 18 a shora v textu. Většina konstrukcí má N-konec označený T7 za účelem identifikace monoklonálními protilátkami proti T7 a dále obsahuje N- nebo C-terminální hexahistidinovou značku („His-tag“), která se využívá při čištění imobilizovanou Co(II)-afinitní chromatografií. Deleční mutanti Nogo, které se nazývají NiG-Dl, NÍG-D2 až NÍG-D20 se také testovaly za použití testu rozšíření fibroblastů NIH 3T3, aby se stanovila inhibiční aktivita. Někteří mutanti se testovaly při tvorbě výrůstků neuritů PC 12, při tvorbě výrůstků disociovaných krysích DRG neuritů nebo testů za použití retinálních ganglií. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 2 dále v textu.

-47CZ 304224 B6

Tabulka č. 2: Funkční aktivity delečních mutantů Nogo

	3T3	PC12	DRG	RGC
Nogo-A	+ +		+	+
Nogo-B	+
Nogo-C	-			-
NiAext	+ +	+		+
EST	+ /-
NiR	+

NiG	+ +
NiG-Dl	+
NÍG-D2	+
NÍG-D3	+ +
NÍG-D4
NÍG-D5	-
NÍG-D7	4-
NÍG-D8	-U
N4G-D9	T
NiG-DlO	+/-
NÍG-D14	-
NÍG-D15	+
NÍG-D16	+
NÍG-D17	+
NÍG-D18	+
NÍG-D20	+ +

Pozitivní výsledek v testu fibroblastů NIH 3T3 (3T3) nebo v testu PC 12 se hodnotil, když se inhibovalo rozšíření fibroblastů nebo buněk PC 12 na plotně potažené přípravkem Nogo získaného z delečního mutantu. Pozitivní výsledek v testu růstu gangliomu dorzálních kořenů embrya kuřete (DRG) nebo testu růstu kónusu gangliomu (RGC) indikuje, že růst neuritů se inhibuje io nebo že růst je zpomalen v přítomnosti přípravku Nogo, který se získal z delečního mutantu.

Data naznačují, že hlavní inhibiční oblast se identifikovala ve specifické oblasti Nogo-A z aminokyselin čísla 172 až 974, zvláště aminokyselin čísla 542 až 722. Navíc A-terminální sekvence Nogo-A a Nogo-B (aminokyseliny číslo 1 až 171) také inhibují rozšíření 3T3. Na základě výsledků oblasti Nogo obsahující aminokyseliny číslo 172 až 259 a 975 až 1 162 se jeví být nepodstatné a mhou se odstranit, aniž dojde ke ztrátě aktivity.

-48CZ 304224 B6

Příklad 2: Nukleové kyseliny lidského Nogo a proteiny, deriváty a fragmenty

Vynález popisuje nukleotidové sekvence kódující lidský protein Nogo a fragmenty lidských proteinů Nogo, které zahrnují lidské ekvivalenty s krysím proteinem Nogo A, Nogo B a část Nogo C. Lidská aminokyselinová sekvence Nogo je znázorněna na obrázku č. 13 aje zobrazena v sekvenci SEQ ID NO: 29.

Vynález dále popisuje nukleotidové sekvence fragmentů lidského genu Nogo. Nukleotidová sekvence lidského Nogo se může stanovit za použití krysího transkriptů Nogo A s cílem uspořádat a sestřihem upravit dohromady lidské exprimované sekvence tag (EST), které jsou homologní se sekvenci krysí nebo bovinní cDNA.

EST AA081783 a AA333267 (popisuje se shora v textu) se vzájemně překrývají a odpovídají nukleové kyselině krysího proteinu Nogo A (Obrázek č. 2a, SEQ ID NO: 1) v polohách 765 až 1 272. EST AA322592, AA092565 a AA081525 (popisuje se shora v textu) se také vzájemně překrývají a odpovídají nukleové kyselině krysího proteinu Nogo A (Obrázek č. 2a, SEQ ID NO: 1) v polohách 765 až 1 272. EST AA322592, AA092565 a AA081525 (popisuje se shora v textu) se také vzájemně překrývají a překrývající se sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 642 až 2 131. Tyto dvě nezávislé sady překrývajících se ESR se nemohou uspořádat za vzniku lidské sekvence, aniž se provede přímé porovnání za použití počítače s nukleotidovou sekvencí krysího nebo bovinního Nogo podle vynálezu. V případě počátečního počítačového uspořádání se preferuje ENTREZ Nucleotide QUERRY. Jiné počítačové programy pro uspořádání se popisují shora v textu jako alternativní příklady, přičemž neomezují výběr programů, které se mohou použít pro tyto účely.

Diskuze

Klonování inhibitoru růstu neuritů Nogo

Protein Nogo A má řadu vlastností, které podporují to, co se dříve napsalo o krysím NI-250, což je hlavní inhibiční protein růstu neuritů CNS myelinu a o antigenu IN-1. Na molekulové úrovni všech šest peptidů se původně získalo sekvenováním bNI-220, což je nejvíce inhibiční komponent bovinního míšního myelinu. Na úrovni exprese oligodendrocyty jsou hlavní buněčný typ u dospělého CNS v případě exprese Nogo A a načasování exprese Nogo ve zrakovém nervu souhlasí s dřívějším popisem IN-1 neutralizované myelinové inhibiční aktivity růstu neuritů. Western přenos ukázal přítomnost proteinu Nogo A v aktivních frakcích q-pool a bílá hmota z různých oblastí CNS se obarvila sérem AS Bruna stejně jako s AS 472 (specifické pro protein Nogo A) u pacienta identického s pacientem IN-1. Obě tyto skutečnosti souhlasí s interpretací, že Nogo Aje NI-250.

Dvě antiséra vytvořená proti sekvencím Nogo A, což jsou AS Bruna a AS 472, velice snižují inhibiční aktivitu částečně čištěného bovinního míšního přípravku (q-pool). Sérum AS 472 také umožní prorůstání velkého množství axonů ganglií dorzálních kořenů do explantátů dospělého zrakového nervu, což je velmi podobné jako v případě IN-1.

Ačkoli vypočítaná molekulová hmotnost proteinu Nogo Aje přibližně 140 000, vykazuje zjevnou molekulovou hmotnost na denaturačním gelu SDS přibližně 200 000, což je v rozmezí předchozího odhadu hodnoty okolo 250 000. Aberující pohyblivost Nogo A na gelech SDS je pravděpodobně způsobena svou kyselou povahou spíše než post-translacní modifikací. Aberující pohyblivost proteinů na SDS-Page se také stanovila pro jiné vysoce kyselé proteiny, jako je srůstem spojený protein GAP-43, stejně jako NSP-A. Bakteriálně exprimovaný rekombinantní Nogo A vykazuje stejnou zjevnou molekulovou hmotnost jako je hmotnost endogenního Nogo A exprimovaného krysími oligodendrocyty. To namítá proti hlavním modifikacím proteinu Nogo A mechanizmem, jako je glykosylace.

-49CZ 304224 B6

Nogo brání regeneraci a omezuje plasticitu dospělého CNS

Exprese proteinu Nogo v oligodendrocytech krysího optického nervu z PO souhlasí s dřívějším zjištěním, že IN—1 neutralizuje inhibiční aktivitu růstu neuritů. Tato exprese předstihuje expresi hlavních myelinových proteinů a tvorbu kompaktního myelinu o několik dní. Výskyt proteinu Nogo pravděpodobně jako odezva na axonální signály může předcházet axonovému růstu v odpovídajících vláknitých drahách (maximální počet axonů při E20 v krysím zrakovém nervu). Protein Nogo může také inhibovat kolaterální formaci a tím stabilizovat obecnou strukturu diferenciovaného CNS. V šedé hmotě mozkové různých oblastí CNS obsah myelinu a IN-1 imunoreaktivita koreluje nepřímo s množstvím GAP-43 a s potenciálem plasticity dané oblasti. Protilátky ΓΝ-1 aplikované do dospělého CNS umožní, že se v mozkovém kmenu objeví klíčení a plasticita a mícha se prodlouží, což je známo pouze u CNS novorozenců. Velké obnovení funkcí, což přichází paralelně s plasticitou, indikuje že klíčící axony jsou schopny tvořit funkčně vhodné propojení.

Dříve se ukázalo, že odezva neuronů na inhibiční proteiny Nogo se liší podle stáří neuronů. To je způsobeno diferenciální expresí receptorů, které budou snad brzy charakterizovány. Jako v případě Netrinů a řady růstových faktorů existence různých receptorů Nogo, které způsobují různé odezvy, zůstává možnost. Skutečnost, že proteiny Nogo se také exprimují v některých typech neuronů, zdůrazňuje možné interakce mezi stejnými a různými izoformami Nogo.

Nogo patří do nové rodiny molekul regulující neurity

Sekvenční analýza proteinu Nogo ukázala neznámé motivy buněčných povrchových a matricových proteinů, které se podílejí na axonálním řízení (repulzivní nebo atraktivní). To znamená, že se nenašel žádný imunoglobulin, fibrinektin typu III nebo oblasti EGF. Ani neexistuje homologie s popsanými inhibitory neurálního růstu, se semaforiny, netriny ani efriny.

Proteiny Nogo tvoří nové rodiny se skupinou současně popsaných proteinů založené na podobnosti jejich karboxyterminálních 180 aminokyselin. Jsou to proteiny NSP/s-rex a NSP-like 1. Jako v případě Nogo použití alternativního promotoru (gen Nsp a Nsp-like 1) a alternativní sestřih (pouze Nsp) jsou odpovědné za produkci alternativních proteinových produktů s běžným karboxylovým koncem, který obsahuje dva pruhy hydrofóbních aminokyselin. NSP (neuroendokrinní specifické proteiny) se exprimují převážně v neuronech a v několika typech endokrynních buněk. Lokalizují se hlavně uvnitř buněk ve spojení s endoplazmatickým retikulem. Funkce rodiny NSP ani Nsp-like 1 nejsou známy. Skutečnost, že potencionální ortology existují jak u organizmu C. elegans a Drosophila melanogaster naznačují, že Nogo se schopností regenerovat nervy a vykazovat inhibiční aktivitu se může zahrnout do rodiny NSP a stát se nepopsaným členem této rodiny.

Nogo v tkáních, které nejsou neurální

Transkript Nogo se exprinuje v kosterních svalech v množství, které je srovnatelné s množstvím exprimovaným v nervovém systému. Jednou z představitelných funkcí svalového proteinu Nogo C je odstranit motorické axony a omezit je na motorickou oblast. Slabá exprese Nogo se může také detekovat v jiných tkáních, které nejsou nervové tkáně. Pozorovaná inhibice rozšíření fibroblastů a astrocytů myelinovým extraktem aNI-250 naráží na přítomnost receptorů a mechanizmů odezvy na proteiny Nogo v těchto buňkách. To naznačuje pravděpodobné obecné funkce proteinu Nogo při kontaktní inhibici pohybu buněk.

< 110> University of Zůrich <120> NUCLEOTIDE AND PROTEIN SEQUENCES OF NOGO GENES AND METHODS BASED THEREON

-50CZ 304224 B6

	<130>	32571-CZ-PCT
	<150>	99972673.0
5	<151>	1999-11-05
	<150>	PCT/US99/26160
	<151>	1999-11-05
10	<150>	60/107,446
	<151>	1998-11-06
	<160>	51
15	<170>	FastSEQ for Windows Version 3.0
	<210>	1
	<211>	3741
	<212>	DNA
20	<213>	Rattus sp.
	<220> <221>	CDS
	<222>	(253)...(3741)
25	<400>	1

attgctcgtc tgggeggcgg cggcggctgc agcctgggac agggcgggtg gcacatctcg 60 atcgcgaagg cagcagaagc agtctcattg ttccgggage cgtcgectcť gcaggttctt 120 cggctčggct cggcacgact cggcctgcct ggcccčtgcc agtcttgccc aacccccaca 180 accgcccgcg actctgagga gaagcggccc tgcggcggct gtagctgcag catcgtcggc 240 gacccgccag cc atg gaa gac ata gac cag tcg ttg ttg gtc tcc tcg tcc 291

Met Glu Asp lle Asp Gin Ser Ser Leu val Ser Ser ser 1 5 10

acg gac

agt ser

ccg ccc pro Pro

cgg Arg

cct Pro 20

ccg Pro

ccc gcc ttc aag tac

cag Gin

ttc Phe

gtg val

339

Thr

Asp 15

pro

Ala

Phe

Lys 25

Tyr

acg

gag

ccc

gag Glu

gac

gag

gag

gac

gag

gag

gag

gag

gag

gac

gag

gag

387

Thr

Glu

pro

Asp

Glu

GlU

Asp

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Asp

Glu

Glu

30

35

40

45

gag

gac

gac

gag

gac

cta

gag

gaa

ctg

gag

gtg

ctg

gag

agg

aag

CCC

435

Glu

ASp

ASp

Glu

Asp

Leu

Glu

Glu

Leu

Glu

val

Leu

Glu

Arg

Lys

Pro

50

55

60

gca

gcc

ggg

ctg

tcc

gca

get

gcg

gtg

ccg

ccc

gcc

gcc

get

gcg

ccg

483

Ala

Ala

Gly

Leu

Ser

Ala

Ala

Ala

val

Pro

Pro

Ala

Ala

Ala

Ala

Pro

65

70

75

ctg ctg

gac

ttc

age

age

gac

tcg

gtg val

ccc

ccc

gcg

ccc

cgc

ggg

ccg

531.

Leu

Leu

Asp

Phe

Ser

Sér

Asp

ser

Pro

pro

Ala

pro

Arg

Gly

Pro

80

85

90

ctg

ccg

gcc

gcg

ccc

cct

gcc

get

cct

gag

agg

cag

cca

tcc

tgg

gaa

579

Leu

Pro

Ala

Ala

Pro

pro

Ala

Ala

pro

Glu

Arg

Gl n

Pro

Ser

Trp

Glu

95

100

105

cgc

age

ccc

gcg

gcg

ccc

gcg

cca

tcc

ctg

ccg

ccc

get

gcc

gca

gtc

627

Arg

ser

pro

Ala

Ala

pro

Ala

Pro

ser

Leu

Pro

Pro

Ala

Ala

Ala

val

110

115

120

125

-51 CZ 304224 B6

ctg ccc tcc

aag ctc cca

gag gac gac gag cct

ccg Pro

gcg Ala

agg Arg

ccc Pro 140

ccg Pro

675

teu

Pro

Ser

Lys

Leu 130

Pro

Glu

Asp

Asp

Glu 135

Pro

cct

ccg

ccg

cca

gcc

ggc

gcg

age

CCC

ctg

gcg

gag

ccc

gcc

gcg

ccc

723

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala

Gly

Ala

Ser

Pro

Leu

Ala

Glu

Pro

Ála

Ala

Pro

145

150

155-

cct

tcc

acg

ccg

gcc

gcg

ccc

aag

ege

agg

ggc

tcc

ggc

tea

gtg

gat

771

pro

Ser

Thr

Pro

Al a

a i a

Pro

Lys

Arg

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

val

Asp

160

165

170

gag

acc

ctt

ttt

get

ctt

cct

get

gca

tet

gag

cct

gtg.

ata

ccc

tcc

819

Glu

Thr

Leu

Phe Ala

Leu

pro

Ala

Ala

Ser

Glu

Pro

val

ile

pro

Ser

175

180

185

tet

gca

gaa

aaa

att

atg

gat

ttg

atg

gag

cag

cca

ggt

aac

act

gtt

867

Ser

Ala

Glu

Lys

Ile

Met

ASp

teu

Met

Glu

Gin

Pro

Gly

Asn

Thr

Val

190

195

200

205

tcg

tet

ggt

caa

gag

gat

ttc

cca

tet

gtc

ctg

ctt

gaa

act

get

gcc

916

Ser

Ser

Gly

Gin

Glu

Asp

Phe

Pro

Ser

val

Leu

Leu

Glu

Thr

Ala

Al S:

210

215

220

tet

ctt

cet

tet

eta

tet

cct

ctc

tea

act

gtt

tet

ttt

aaa

gaa

cat

963

Ser

Leu

pro

Ser

Leu

ser

pro

Leu

ser

Thr

Val

ser

Phe

tys

GlU

HÍ s

225

230

235

gga

tac

ctt

ggt

aac

tta

tea

gca

gtg

tea

tcc

tea

gaa

gga

aca

att

1011

Gly

Tyr

Leu

Gly

Asn

Leu

Ser

Ala

Val

Ser

ser

ser

Glu

Gly

Thr

ÍTe

240

245

250

gaa

gaa

act

tta

aat

gaa

get

tet

aaa

gag

ttg

cca

gag

agg

gca

aca

1059

Glu

Glu

Thr

Leu

Asn

Glu

Ala

Ser

Lys

Glu

Leu

Pro

Glu

Arg

Ala

Thr

255

260

265

aat

cca

ttt

gta

aat

aga

gat

tta

gca

gaa

ttt

tea

gaa

tta

gaa

tat

1107

Asn

Pro

Phě

Val

Asn

Arg

Asp

Leu

Ala

Glu

Phe

ser

Glu

Leu

Gl u

Tyr

270

275.

280

285

tea

gaa

atg

gga

tea

tet

ttt

aaa

ggc

tcc

cca

aaa

gga

gag

tea

gcc

1155

Ser

Glu

Met

Gly

ser

Ser

Phe

Lys

Gly

Ser

Pro

Lys

Gly

Glu

ser

Ala

290

295

300

31.3

tta

gta

gaa

aac

act

aag

gaa

gaa

gta

att

gtg val

agg

agt

aaa

gac

1203

ile

Leu

Val

Gl U

Asn

Thr

Lys

Glu

Glu

Val

Ile

Arg

Ser

Lys

Asp

305

310

315

aaa

gag

gat

tta

gtt

tgt

agt

gca

gcc

ctt

cac

agt

cca

caa

gaa

tea

1251

Lys

Glu

Asp

Leu

val

cys

ser

Ala

Ala

Leu

His

Ser

pro

Gin

Glu

Ser

320

325

330

cct

gtg

ggt

aaa

gaa

gac

aga

gtt

gtg

tet

cca

gaa

aag

aca

atg

gac

1299

pro

Val

Giy

Lys

Glu

Ásp

Arg

val

Val

Ser

pro

Glu

Lys

Thr

Met

Asp

335

340

345:

att

ttt

aat

gaa

atg

cag

atg

tea

gta

gta

gca

cct

gtg

agg

gaa

gag

1347

Ile

Phe

Asn

Glu

Met

Gin

Met

Ser

val

val

Ala

Pro

val

Arg

Glu

Glu

350

355

360

365

tat

gca

gac

ttt

aag

cca

ttt

gaa

caa

gca

tgg

gaa

gtg

aaa

gat

act

1395

Tyr

Ala

Asp

Phe

L.ys

Pro

phe

Glu

Gl n

Ala

Trp

Glu

val

Lys

ASp

Thr

370

375

380

tat

gag

gga

agt

agg

gat

gtg

ctg

get

get'

aga

get

aat

gtg

gaa

agt

1443

Tyr

Glu

Gly

Ser

Arg

Asp

val

Leu

Al a

Ala

Arg

Ala

Asn

val

Glu

Ser

385

390

395

gtg

gac

aga

aaa

tgc.

ttg

gaa

gat

age

ctg

gag

caa

ddtl

agt

ctt

1491

-52CZ 304224 B6

Lys

val

Asp 400

Arg

tys

Cys

Leu

Glu 405

Asp

Ser

Leu

Glu

Gin 410

Lys

Ser

Leu

ggg

aag

gat

agt

gaa

ggc

aga

aat

gag

gat

get

tet

ttc

ccc

agt

acc

1539

Gly

Lys 415

Asp

sěr

Glu

Gly

Arg 420

Asn

Glu

Asp

Ala

ser 425

Phe

Pro

Ser

Thr

cca

9?a

cct

gtg val

aag

gac

age

tcc

aga

gca

tat

att

acc

tgt

qct

tcc

1587

ΡΓΟ 430

Glu

Pro

Lys

Asp 435

Ser

Ser

Arg

Ala

Tyr 440

Ile

Thr

Cys

Ala

Ser 445

ttt

acc

tca

qca

acc

qaa

age

acc

aca

qca

aac

act

ttc

cct

ttg

tta

1635

phe

Thr

ser

Ala

Thr 450

Glu

Ser

Thr

Thr

Ala 455

Asn

Thr

Phe

Pro

Leu 460

Leu

qaa

gat

cat

act

tca

gaá

aat

aaa

aca

gat

gaa

aaa

aaa

ata

GfctH

gaa

1683

Glu

Asp

HIS

Thr 465

Ser

Glu

Ásn

Lys

Thr 470

ASp

Glu

Lys

Lys

ile 475

Glu

Glu

agg

aag

gcc

caa

att

ata

aca

gag

aag

act

age

ccc

aaa

acg

tca

aat

1731

Arg

Lys

Ala 480

Gin

ile

Ile

Thr

Glu 485

Lys

Thr

ser

Pro

Lys 490

Thr

Ser

Asn

cct

ttc

ctt.

qta

gca

qta

cag

gat

tet

gag

gca

gat

tat

gtt

aca

aca

1779

Pro

phe 495

Leu

val

Ala

val

Gin 500

ASP

ser

Glu Ala

Asp 505

Tyr

val

Thr

Thr

gat

acc

tta

tca

aag

gtg val 515

act

gag

qca

gca

gtg

tca

aac

atg

cct

gaa

1827

Asp 510

Thr

Leu

Ser

Lys

Thr

61U

Ala

Ala

Val 520

Ser

Asn

Met

Pro

Glu 525

ggt

ctg

acg

cca

gat

tta

gtt

cag

gaa

9$a

tgt

Qaa

agt

gaa

ctg

aat

1875

Gly

Leu

Thr

Pro

ASp 530

Leu

val

Gin

Glu

Ala 535

cys

GlU

ser

Glu

Leu 540

Asn

gaa

gcc

aca

ggt

aca

aag

att

get

tat

gaa

aca

aaa

gtg

gac

ttg

gtc

1923

Glu

Ala

Thr

Gly 545

Thr

Lys

Ile

Ala

Tyr 550

Glu

Thr

Lys

val

Asp 555

Leu

Val

a

aca

tea

gaa

get

ata

caa

gaa

tca

ctt

tac

ccc

aca

gca

cag

ctt

1971

Gin

Thr

Ser 560

Glu

Ala

ile

Gin

Glu 565

Ser

Leu

Tyr

pro

Thr 570

Ala

Gin

Leu

tqč

cca

tca

ttt

gag

gaa

get

gaa

gca

act

ccg

tca

cca

gtt

ttg

cct

2019

cys

Pro 575

ser

Phe

Glu

Glu

Ala 580

Glu

Ala

Thr

pro

Ser 585

Pro

val

Leu

Pro

gat

att

gtt

atg

gaa

qca

cca

tta

aat

tet

ctc

Ctt

cca

age

get

ggt

2067

ASp 590

Ile

val

Met

Glu

Ala 595

pro

Leu

Asn

Ser

Leu 600

Leu

pro

ser

Ala

Gly 605

get

tet

gta

gtg Val

cag

ccc

agt

gta

tcc

cca

ctg

gaa

gca

cct

cct

cca

2115

Ala

Ser

val

Gin 610

pro

Ser

val

ser

Pro 615

Leu

Glu

Ala

Pro

Pro 620

Pro

gtt

agt

tat

gac aqt

ata

aag

ctt

gag

cct

gaa

aac

ccc

cca

cca

tat

2163

val

ser

Tyr

Asp 625

Ser

ile

Lys

Leu

Glu 630

Pro

Glu

Asn

Pro

Pro 635

Pro

Tyr

gaa

gaa

gcc

atg

aat

gta

gca

cta

aaa

get

ttg

9?a

aca

aag

gaa

gga

2211

Glu

Glu

Ala 640

Met

Asn

val

Ala

Leu 645

Lys

Ala:

Leu

Gly

Thr 650

Lys

Glu

Gly

ata

aaa

gag

cct

gaa

agt

ttt

aat

qca

get

gtt

cag

gaa

aca

gaa

get

2259

Ile

Lys 655

Glu

Pro

Glu

Ser

Phe 660

Asn

Ala

Ala

Val

Gin 665

Glu

Thr

Glu

Ala

cct

tat

ata

tcc

att

gcg

tgt

gat

tta

att

aaa

gaa

aca

aag

ctc

tcc

2307

-53CZ 304224 B6

ΡΓΟ 670

Tyr

Ile

ser

il e

Ala 675

Cys

Asp Leu ile

Lys Glu 680

Thr

Lys

Leu

Ser 685

act

gag

cca

agt

cca

gat

ttc

tet

aat

tat

tea

gaa

ata

gca Ala

aaa

ttc

2355

Thr

Glu

pro

Ser

Pro

Asp

Phe

Ser

Asn

Tyr

Ser

Glu

Ile

Lys

Phe

690

695

700

gag GiU

aag

tcg

gtg

ccc

gaa

cac

gct

gag

cta

gtg

gag

gat

tcc

tea

cct

2403

Lys

ser

val

pro

GlU

His

Ala

Glu

Leu

val

Glu

Asp

ser

Ser

Pro

705

710

715

gaa

tet

gaa

cca

gtt

gac

tta

ttt

agt

gat

gat

tcg

att

cct

gaa

gtc

2451

Glu

Ser

Glu

Pro

val

Asp

Leu

Phe

ser

Asp

Asp

ser

ile

pro

Glu

Val

720

725

730

cca

caa

aca

caa

gag

gag

gct

gtg

atg

ctc

atg

aag

gag

agt

ctc

act

2499

Pro

Gin

Thr

Gin

Glu

Glu

Ala

val

Met

Leu

Met

Lys

Glu

ser

Leu

Thr

735

740

745

gaa

gtg

tet

gag

aca

gta

ggc

cag

cac

aaa

gag

gag

aga

ctt

agt

g?c

2547

Glu

Val

ser

Gl u

Thr

val

Ala

Gin

Hi s

Lys

Glu

Glu

Arg

Leu

Ser

Ala

750

755

760

765

tea

cct

cag

gag

cta

gga

aag

cca

tat

tta

gag

tet

ttt

cag

ccc

aat

2595

Ser

pro

Gin

Glu

Leu

Gly

Lys

Pro

Tyr

Leu

Glu

ser

phe

Gin

Pro

Asn

770

775

780

tta

cat

agt

aca

aaa

gat

gct

gca

tet

aat

gac

att

cca

aca

ttg

acc

2643

Leu

His

Ser

Thr

Lys

ASp

Ala

Ala

Ser

Asn

Asp

ile

pro

Thr

Leu

Thr

785

790

795

aaa

aag

gag

aaa

att

tet

ttg

caa

atg

gaa

gag

ttt

aat

act

9La

att

2691

Lys

Lys

Glu

Lys

ile

Ser

Leu

Gin

Met

Glu

Glu

Phe

Asn

Thr

Ala

Ile

800

805

810

tat

tea

aat

gat

gac

tta

ctt

tet

tet

aag

gaa

gac

aaa

ata

aaa

gaa

2739

Tyr

Ser

Asn

Asp

Asp

Leu

Leu

Ser

Ser

Lys

Glu

Asp

Lys:

ile

Lys

Glu

815

820

825

agt

gaa

aca

ttt

tea

gat

tea

tet

ccg

att

gag

ata

ata

gat

gaa

ttt

2787

Ser

Glu

Thr

Phe

Ser

Asp

ser

Ser

Pro

ile

Glu

ile

ile

Asp

Glu

Phe

830

835

840

845

ccc

acg

ttt

gtc

agt

gct

aaa

gat

gat

tet

cct

aaa

tta

gcc

aag

gag

2835

Pro

Thr

Phe

val

Ser

Ala

Lys

Asp

Asp

Ser

Pro

Lys

Leu

Ala

tys

Glu

850

855

860

tac

act

gat

cta

gaa

gta

tcc

gac

aaa

agt

gaa

att

gct

aat

atc

caa

2883

Tyr

Thr

Asp

Leu

Glu

Val

ser

Asp

Lys

ser

Glu

ile

Ala

Asn

Ile

Gin

865

870

875

age

ggg

gca

gat

tea

ttg

cct

tgc

tta

gaa

ttg

ccc

tgt

gac

ctt

tet

2931

Ser

Gly

Ala

Asp

Ser

Leu

pro

Cys

Leu

Glu

Leu

Pro

cys

Asp

Leu

Ser

880

885

890

ttc

aag

aat

ata

tat

cct

aaa

gat

gaa

gta

cat

gtt

tea

gat

gaa

ttc

2979

Phe

Lys

Asn

Ile

Tyr

pro

Lys

Asp

Glu

val

His

val

Ser

Asp

Glu

Phe

895

900

905

tcc

gaa

aat

agg

tcc

agt

gta

tet

aag

gca

tcc

ata

tcg

cct

tea

aat

3027

Ser

Gl u

Asn

Arg

Ser

Ser

Val

Ser

Lys

Ala

Ser

ile

Ser

pro

ser

Asn

910

915

920

925

gtc

tet

gct

ttg

gaa

cct

cag

aca

gaa

atg

ggc

age

ata

gtt

aaa

tcc

3075

Val

Ser

A1 a

Leu

Glu

Pro

Gin

Thr

Glu

Met

Gly

Ser

ile

val

Lys

ser

930

935

940

aaa

tea

ctt

acg

aaa

gaa

gca

gag

aaa

aaa

ctt

cct

tet:

gac

aca

gag

3123

-54CZ 304224 B6

Lys ser Leu	Thr 945	Lys Glu	Ala	Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu
950	955
aaa gag gac	aga	tcc ctg	tca	get gta ttg tca	gca gag ctg agt aaa 3171
Lys Glu Asp Arg	Ser Leu	ser	Ala val Leu ser	Ala Glu Leu Ser Lys
960				965	970
act tca gtt	gtt	gac ctc	ctc	tac tgg aga gac	att aag aag act gga 3219
Thr ser val	val	Asp Leu	Leu	Tyr Trp Arg Asp	ile Lys Lys Thr Gly
975			980		985
gtg gtg ttt	ggt	gcc age	tta	ttc ctg ctg ctg	tet ctg aca gtg ttc 3267
vaT val Phe	Gly	Ala Ser	Leu	Phe Leu Leu Leu	Ser Leu Thr val Phe
990		995	1000 1005
age att gtc	agt	gta acg	gcc	tac att gcc ttg	gcc ctg ctc tcg gtg 3315
Ser ile Val	Ser	val Thr	Ala	Tyr ile Ala Leu	Ala Leu Leu Ser Val
		1010		1015	1020
act atc age	ttt	agg ata	tat	aag ggc gtg atc	cag get atc cag aaa 3363
Thr ile ser	Phe	_Arg Ile	Tyr	Lys Gly val Ile	Gin Ala Ile Gin Lys
	ÍOŽÍ			1030	1035
tca gat gaa	ggc	cac cca	ttc	agg gca tat tta	gaa tet gaa gtt get 3411
ser Asp Glu	Gly	His Pro	Phe	Arg Ala Tyr Leu	Glu Ser Glu Val Ala
1040			1045	1050
ata tca gag	gaa	ttg gtt	cag	aaa tac agt aat	tet get ctt ggt cat 3459
Ile ser Glu	Glu	Leu Val	Gin	Lys Tyr ser Asn	ser Ala Leu Gly His
1055			1060	1065
gtg aac age	aca	ata aaa	gaa	ctg agg cgg ctt	ttc tta gtt gat gat 3507
val Asn Ser	Thr	Ile Lys	Glu	Leu Arg Arg Leu	Phe Leu val Asp Asp
1070		1075:	1080 1085
tta gtt gat.	tcc	ctg aag	ttt	gca gtg ttg atg	tgg gtg ttt act tat 3555
Leu val Asp	Ser	Leu Lys	Phe	Ala val Letí Met	Trp val Phe Thr Tyr
		1090		1095	1100
gtt ggt gcc	ttg	ttc aat	ggt	ctg aca cta ctg	att tta get ctg atc 3603
val cly Ala	Leu	Phe Asn	cly	Leu Thr Leu Leu	ile Leu Ala Leu Tle
	1105		1110	1115
tca ctc ttc	agt	att cct	gtt	att tat gaa cgg	cat cag gtg cag ata 3651
Ser Leu Phe	Ser	Ile Pro	val	ile Tyr Glu Arg	His Gin val Gin ile
1120			1125	1130
gat cat tat	cta	gaa ctt	gca	aac aag agt gtt	aag gat gcc atg gcc 3699
Asp His Tyr	Leu	Gly Leu	Ala	Asn Lys Ser val	Lys Asp Ala Met Ala
1135			1140	1145
aaa atc caa	gca	aaa atc	cct	gga ttg aag ege	aaa gca gat 3741
Lys ile Gin	Ala	Lys rle	Pro	Gly Leu Lys Arg	Lys Ala Asp
1150		1155	1160

<210>	2
<211>	1163
<212>	PRT
<213>	Rattus sp.
<400>	2

Met

Gl u

Asp

Ile

ASp

Gin

ser

Ser

Leu

Val

Ser

ser

Ser

Thr

Asp

ser

1

5

10

15

Pro

Pro

Arg

Pro

Pro

Pro

Ala

Phe

Lys

ryr

Gin

phe

val

Thr

Glu

Pro

20

25

30

Glu

Asp

Glu

Glu

Asp

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

ASp

Glu

Glu

Glu

Asp

ASp

35

40

45

-55CZ 304224 B6

Glu

Asp 50

Leu

Glu

Glu Leu

Glu val 55:

Leu

Glu Arg Lys Pro Ala 60

Ala

Gly

Leu

Ser

Ala

Ala

Ala

val

pro

Pro

Ala

Ala

Ala

Ala

Pro

Leu

Leu

Asp

65

70

75

80

Phe

Ser

Ser

Asp

Ser

val

Pro

Pro

Ala

Pro

Arg

Gly

Pro

Leu

Pro

Ala

85

90

95

Ala

Pro

Pro

Ala

Ala

Pro

Glu

Arg

Gin

Pro

Ser

Trp

Glu

Arg

ser

pro

100

105

110

Ala

Ala

Pro

Ala

Pro

Ser

Léu

Pro

Pro

Ala

Ala

Ala

val

Leu

Pro

Ser

115

120

125

Lys

Leu

Pro

Glu

Asp

Asp

Glu

Pro

Pro

Ala

Arg

Pro

Pro

Pro

Pro

Pro

130

135

140

Pro

Ala

cly

Ala

ser

Pro

Leu

Ala

Glu

Pro

Ala

Ala

Pro

Pro

Ser

Thr

145

150

155

160

Pro

Ala

Ala

Pro

Lys

Arg

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

Val

Asp

Gl u

Thr

Leu

165

170

175

Phe

Ala

Leu

Pro

Al a

Ala

Ser

Glu

pro

Val

ne

Pro

Ser

Ser

Ala

Glu

180

18 5

190

Lys

Ile

Met

Asp

Leu

Met

Glu

Gin

Pro

Gly

Asn

Thr

val

Ser

Ser

Gly

195

200

205

Gin

Glu

Asp

Phe

pro

Ser

val

Leu

Leu

Glu

Thr

Ala

Ala

Ser

Leu

Pro

210

215

220

Ser

Leu

Ser

Pro

Leu

Ser

Thr

Val

ser

Phe

Lys

Glu

HTS

Gly

Tyr

Leu

225

230

235

240

Gly

Asn

Leu

ser

Ala

val

ser

ser

ser

Glu

Gly

Thr

Ile

Glu

Gl u

Thr

245

250

255

Leu

Asn

Glu

Ala

Ser

Lys

Glu.

Leu

pro

Glu

Arg

Ala

Thr

Asn

Pro

Phe

260

265

270

val

Asn

Arg

Asp

Leu

Ala

Glu

Phe

Ser

Glu

Leu

Glu

Tyr

ser

Glu

Met

275

280

285

Gly

Ser

Ser

Phe

Lys

Gly

Ser

Pro

Lys

Gly

Glu

ser

Ala

ile

Leu

val

290

295

300

Glu

Asn

Thr

Lys

Glu

Glu

val

Ile

val

Arg

ser

Lys

ASp

Lys

Glu

Asp

305

310

315

320

Leu

val

cys

Ser

Ala

Ala

Leu

Hl S

Ser

pro

Gin

Glu

Ser

Pro

val

Gly

325

330

335

Lys

Glu

Asp

Arg

Val

val

ser

Pro

Glu 345

Lys

Thr

Met

Asp

Ile

Phe

Asn

340

val

350

Glu

Met

Gin

Met

Ser

Val

Ala

Pro

Val

Arg

GlU

Glu

Tyr

Ala

Asp

355

360

365

Phe

Lys

Pro

Phe

Glu

Gin

Ala

Trp

Glu

val

Lys

ASp

Thr

Tyr

Glu

Gly

370

375

380

Ser

Arg

ASp

val

Leu

Ala

Ala

Arg

Ala

Asn

val

Glu

Ser

L.ys

Val

Asp

385

390

395

400

Arg

Lys

cys

Leu

Glu

Asp

Ser

Leu

Glu

Gin

Lys

Ser

Leu

Gly

Lys

Asp

405

410

415

ser

Glu

Gly

Arg

Asn

Glu

Asp

Al a

Ser

Phe

Pro

Ser

Thr

pro

Glu

Pro

420

425

430

val

Lys

Asp

Ser

Ser

Arg

Al a

Tyr

Ile

Thr

cys

Ala

Ser

Phe

Thr

Ser

435

440

445

Al a

Thr

Glu

Ser

Thr

Thr

Ala

Asn

Thr

phe

Pro

Leu

Leu

Glu

Asp

HIS

450

455

460

Thr

Ser

Gl u

Asn

Lys

Thr

Asp

Glu

Lys

Lys

Ile

Gl u

Glu

Arg

Lys

Al a

465

470

475

480

Gin

Ile

Ile

Thr

GlU

Lys

Thr

Ser

Pro

Lys

Thr

Ser

Asn

pro

Phe

Leu

485

490

495

Val

Al a

Val

Gin

ASP

Ser

Glu

Ala

Asp

Tyr

val

Thr

Thr

Asp

Thr

Leu

500

505

51Ů

ser

Lys

val

Thr

Glu

Ala

Ala

Val

ser

Asn

Met

Pro

Glu

Gly

Leu

Thr

515

520

525

Pro

Asp

Leu

val

Gin

Glu

Ala

Cys

Glu

ser

Glu

Leu

Asn

Glu

Ala

Thr

530

535

540

Gl y

Thr

Lys

Ile

Ala

Tyr

Glu

Thr

Lys

val

Asp

Leu

Val

Gin

Thr

ser

545

550

555

560

Glu

Ala

ile

Gin

Glu

Ser

Leu

Tyr

Pro

Thr

Ala

Gin

Leu

Cys

pro

Ser

565

570

575

Phe

Glu

Glu

Ala

Glu

Ala

Thr

Pro

Ser

Pro

Val

Leu

Pro

ASp

Ile

val

580

585

590

-56CZ 304224 B6

Met Glu	Ala 595	ΡΓΟ	Leu Asn	Ser Leu Leu Pro 600	Ser	Ala	Gly 605	Ala	Ser	val
val Gin 610	Pro	Ser	Val Ser	Pro Leu Glu Ala 615	pro	Pro 620	Pro	val	Ser	Tyr
Asp ser 625	Ile	Lys	Leu Glu 630	Pro Glu Asn Pro	Pro 635	Pro	Tyr	Glu	Glu	Ala 640
Met Asn	val	Ala	Leu Lys 645	Ala Leu Gly Thr 650	Lys	Glu	Gly	Ile	Lys 655	Glu
Pro Glu	Ser	Phe 660	Asn Ala	Ala Val Gin Glu 665	Thr	Glu	Ala	pro 670	Tyr	ile
ser ile	Ala 675	cys	Asp Leu	lle Lys Glu Thr 680	Lys	Leu	Ser 685	Thr	Glu	Pro
Ser Pro 690	Asp	Phe	ser Asn	Tyr Ser Glu lle 695	Ala	Lys 709	Phe	Glu	Lys	Ser
val Pro 705	Glu	His	Ala Glu 710	Leu Val Glu Asp	Ser 715	Ser	Pro	Glu	Ser	Glu 720
Pro val	ASp	Leu	phe ser 725	Asp Asp Ser ile 730	Pro	Glu	val	Pro	Gin 735	Thr
Gin Glu	Glu	Ala 740	val Met	Leu Met Lys Glu 745	Ser	Leu	Thr	Glu 750	Val	Ser
Glu Thr	val 755	Ala	Gin His	Lys Glu Glú Arg 760	Leu	Ser	Ala 765	ser	Pro	Gin
Glu Leu 770	Gly	tys	Pro Tyr	Leu Glu Ser Phe 775	Gin	Přo 780	Asn	Leu	His	Ser
Thr Lys 785	ASp	Ala	Ala Ser 790	Asn Asp ile Pro	Thr 795	Leu	Thr	Lys	Lys	Glu 800
Lys lle	Ser	Leu	Gin Met 805	Glu Glu Phe Asn 810	Thr	Ala	ile	Tyr	Ser 815	Asn
Asp ASp	Leu	Leu 820	Ser ser	Lys Glu Asp Lys 825	lle	Lys	Glu	Ser 830	Glu	Thr
phe ser	Asp 835	Ser	ser Pro	ile Glu ile ile 840	ASP	Glu	Phe 845	Pro	Thr	Phe
val Ser 850	Ala	Lys	Asp ASp	Ser Pro Lys Leu 855	Ala	Lys 860	Glu	Tyr	Thr	Asp
Leu Glu 865	val	Ser	Asp Lys 870	Ser Glu ile Ala	Asn 875	Ile	Gin	Ser	Gly	Ala 880
Asp Ser	Leu	Pro	Cys Leu 885	Glu Leu Pro cys 890	Asp	Leu	Ser	Phe	Lys 895	Asn
ile Tyr	Pro	Lys 900	Asp Glu	Val His Val Ser 905	Asp	Glu	Phe	Ser 910	Glu	Asn
Arg Ser	Ser 915	val	Ser Lys	Ala ser lle Ser 920	Pro	Ser	Asn 925	Val	Ser	Ala
Leu Glu 930	pro	Gin	Thr Glu	Met Gly ser ile 935	val	Lys 940	Ser	Lys	Ser	Leu
Thr Lys 945	Glu	Ala	Glu Lys 950	Lys Leu Pro Ser	ASp 955	Thr	Glu	Lys	Glu	ASp 960
Arg Ser	Leu	ser	Ala val 965	Leu Ser Ala Glu 970	Leu	Ser	Lys	Thr	Ser 975	Val
val Asp	Leu	Leu 980	Tyr Trp	Arg Asp lle Lys 985	Lys	Thr	Gly	Val 990	val	Phe
Gly Ala	Ser 995	Leu	Phe Leu	Leu Leu ser Leu 1000	Thr	val	Phe ser 1005	ile	val
Ser val Thr 1010	Ala	Tyr lle	Ala Leu Ala Leu 1015	Leu	Ser Val 1020	Thr	lle	Ser
Phe Arg 1025	Ile	Tyr	Lys Gly val lle Gin Ala 1030	lle Gin 1035	Lys	Ser	Asp	Glu 1040
Gly His	Pro	Phe	Arg Ala 1045	Tyr Leu Glu Ser Glu '1050	val	Ala	Ile	Ser Glu 1055
Glu Leu	Val	Gin Lys Tyr 1060	Ser Asn S< Ala li	Leu	Gly	His	val Asn 1070	ser
Thr Ile	LVS Glu 1075	Leu Arg	Arg Leu Phe Leu 1080	Val	ASp	Asp Leu 1085	val	Asp
Ser Leu Lys 1090	Phe	Ala val	Leu Met Trp val 1095	Phe	Thr Tyr 1100	val	Gly	Ala
Leu phe Asn 1105	Gly	Leu Thr Leu Leu lle Leu 1110	Ala Leu 1115	lle	Ser	Leu	Phe 1120
Ser lle	Pro	val	ile Tyr 1125	Glu Arg His Gin Val 1130	Gin	ile	Asp	His Tyr 1135

-57CZ 304224 B6

Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gin 1140 1145 1150

Ala Lys ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp 1155 1Í6O

<210>	3
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Bos sp.
<400>	3

Glu Tyr Leu Gly Asp Leu pro Ala Val Leu pro Thr Glu 1 5 10

<210>	4
<211>	11
<212>	PRT
<213>	Bos sp.
<400>	4

Glu ile Ala Glu ile Gin Asp Gly Glú ser Leu 1 5 10

<210>	5
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Bos sp.
<220
<221>	VARIANT
<222>	2
<223>	Xaa = any amino acid
<400>	5

Lys xaa Tyr Leu Glu Ser ile Gin Pro Ser Leu. Gly Ile Thr Lys 1 5 10 15

<210>	6
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Bos sp.
<220>
<221>	VARIANT
<222>	2,5
<223>	Xaa = any amino acid
<400>	6

Lys xaa Phe Glu Xaa val Trp Glu val 1 5

-58CZ 304224 B6 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Bos sp.

<400> 7 val val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp ile Lys 15 10 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Bos sp.

<400> 8

Lys Ala Val Ala Ala Glu Ala ser Met Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe 1 5 10 15 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Bos sp.

<400> 9

Glu Tyr Leu Gly Asp Leu Pro Ala val Leu Pro Thr Glu 1 5 10

<210>	10
<211>	12
<212>	PRT
<213>	Bos sp.
<400>	10

Glu Ile Ala Asp ile Gin Asp Gly Ala Gly Ser Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Bos sp.

<400> 11 >ys Pro Tyr Leu Glu ser Phe .Gin Pro ser Leu Gly ile Thr Lys 1 5 10 is <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Bos sp.

-59CZ 304224 B6 <400> 12

Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Bos sp.

<400> 13 val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp ile Lys 1 5 10

<210>	14
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Bos sp.
<400>	14

Lys Gly val Ala Ala Glu Ala Ser Met Gly Glu Glu Tyr Ala Asp Phe

1
<210>	15
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Rattus sp.
<400>	15

Gly Tyr Leu Gly Asn Leu Ser Ala val Ser Ser Ser Glu 15 10

<210>	16
<211>	12
<212>	PRT
<213>	Rattus sp.
<400>	16

Glu ile Ala Asn ile Gin ser Gly Ala Asp Ser Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Rattus sp.

<400> 17

Lys Pro Tyr Leu Glu ser Phe Gin Pro. Asn Leu His Ser Thr Lys. 1 5 10 15

-60CZ 304224 B6

<210>	18
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Rattus sp.
<400>	18

Lys Pro Phe Glu Gin Ala Trp Glu val 1 5

<210>	19
<211>	11
<212>	PRT
<213>	Rattus sp
<400>	19

Val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp lle Lys: 1 5 10

<210>	20
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Rattus sp.
<400>	20

Met Gin Met Ser Val Val Ala Pro val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe 1 5 10 15 <210> 21 <211> 186 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21

ASp

Leu

Leu

Tyr

Trp

Arg

ASp

lle

Lys

Gin

Thr

Gly

lle

val

Phe

Gly

1

5

10

15

Ser

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Phe

ser

Leu

Thr

Gin

Phe

Ser

val

Val

Ser

20

25

30

val

val

Ala

Tyr

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

Leu

Ser

Ala

Thr

lle

ser

Phe

35

40:

45

Arg

lle

Tyr

Lys

Ser

Val

Leu

Gin

Ala

val

Gin

Lys

Thr

Asp

Glu

Gly

50

55

60

His

Pro

Phe

Lys

Ala

Tyr

Leu

Glu

Leu

GlU

lle

Thr

Leu

ser

Gin

Glu

65

70

75

80

Gin

lle

Glh

Lys

Tyr

Thr

Asp

cys

Leu

Gin

Phe

Tyr

val

Asn

Ser

Thr

85

90

95

Leu

Lys

Glu

Leu

Arg

Arg

Leu

Phe

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

val

ASp

ser

100

105

110

Leu

Lys

Phe

Ala

val

Leu

Met

Trp

Leu

Leu

Thr

Tyr

val

Gly

Ala

Leu

115

120

125

Phe

Asn

Gly

Leu

Thr

Leu

Leu

Leu

Met

Ala

val

val

Ser

Met

Phe

Thr

130

135

140

Leu

Pro

val

Val

Tyr

val

Lys

His

Gin

Ala

Gin

lle

Asp

Gin

ryr

Leu

145

150

153

L60

-61 CZ 304224 B6 tíly Leu Val Arg Thr His iTe Asn Ala Val Val Ala Lys Ile Gin Ala 165 170' 175

Lys Ile Pro Gly Ala Lys Arg His Ala Glu 180 185 <210> 22 <211> 186 <212> PRT <213> Rattus sp.

<400> 22

ASP

Leu

Leu

Tyr

Trp

Arg

ASp

Ile

Lys

Gin

Thr

Gly

Ile

val

Phe

Gly

1

5

10

15

ser

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Phe

Ser

Leu

Thr

Gin

Phe

Ser

Val

val

ser

20

25

30

val

val

Ala

Tyr

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

Leu

ser

Ala

Thr

ile

ser

Phe

35

40

45

Arg

Ile

Tyr

Lys

Ser

val

Leu

Gin

Ala

val

Gin

Lys

Thr

Asp

Glu

Gly

50

55

60

Bi s

Pro

Phe

Lys

Ala

Tyr

Leu

Glu

Leu

Glu

ile

Thr

Leu

Ser

Gin

Gl u

65

70

75'

80

Gin

ile

Gin

Lys

Tyr

Thr

ASp

cys

Leu

Gin

Leu

ryr

val

Asn

Ser

Thr

85

90

95

Leu

Lys

Glu

Leu

Arg

Arg

Leu

Phe

Leu

val

Gin

Asp

Leu

val

ASp

Ser

ioo:

105

110

teu

Lys

Phe

Ala

val

Leu

Met

Trp

Leu

Leu

Thr

Tyr

val

Gly

Ala

Leu

115

120

125

Phe

Asn

dy

Leu

Thr

Leu

Leu

Leu

Met

Ala

Val

val

Ser

Met

Phe

Thr

130

135

140

Leu

Pro

Val

val

Tyr

val

Lys

HIS

Gin

Ala

Gin

val

ASp

Gin

Tyr

Leu

145

150

Thr

155

160

Gly

Leu

val

Arg

Thr

His

ile

Asn

Val

val

Ala

Lys

ile

Gl n

Ala

165

170

175

Lys

Ile

pro

Gly

Ala

Lys

Arg

His

Ala

Glu

180

185

<210> 23 <211> 186 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 23

Asn

Leu

Leu

Tyr

Trp 5:

Arg

Asp

ile

Lys

Gin

Thr

Gly

Ile

Val

Phe

Gly

1

10

15

ser

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Phe

ser

Leu

Thr

Gin

Phe

ser

val

val

Ser

20

25

30

val

val

Ala

Tyr

Leu

Al a

Leu

Ala

Gly

Leu

Ser

Ala

Thr

ile

Ser

Phe

35

40

45

Arg

ile

Tyr

Lys

Ser

val

Leu

Gin

Ala

val

Gin

Lys

Thr

Asp

Glu

Gly

50

55

60

Hi 5

pro

phe

Lys

Ala

Tyr

Leu

Asp

Met

Glu

Met

Asn

Leu

Ser

Gin

ASp 80

65

70

75

Gl n

Ile

Gin

Lys

Tyr

Thr

ASp

Cys

Leu

Gin

Leu

Tyr

Val

Asn

Ser

Thr

85

90

95

Val

Lys

Glu

Leu

Arg

Arg

Leu

Phe

Leu

val

Gin

Asp

Leu

val

Asp

ser

100

105

110

Leu

Lys

Phe

Ala

Val

Leu

Met

Trp

Leu

Leu

Thr

Tyr

Val

Gly

Ala

Leu

115

120

125

Phe

Asn

Gly

Leu

Thr

Leu

Leu

ile

Met

Ala

Val

val

ser

Met

Phe

Thr

130

1.35

140

Leu

Pro

Val

Val

Tyr

Asp

Lys

Tyr

Gl n

Ala

Gin

Ile

Asp

Gl n

Tyr

Leu

1.45

150

155

160

cly

Leu

Val

Arg

Thr

HÍS

Ile

Asn

Thr

val

Val

Ala

Lys

ile

Gin

Ala

165

170

175

Lys

ile

Pro

Gly

Ala

Lys

Arg

Lys

Ala

Glu

180

185

-62CZ 304224 B6 <210> 24 <211> 186 <212> PRT <213> Bos sp.

<400> 24

Asp

Leu

Leu

Tyr

Trp

Arg

Asp.

Ile

Lys

Lys

Thr

Gly

val

val

Phe

Gly

1

5

10

15

Ala

Ser

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

ser

Leu

Thr

Val

Phe

Ser

ile

Val

ser

20

25

30

phe

val

Thr

Ala

Tyr

ile

Ala

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

val

Thr

ile

ser

35 Tyr

40

45

Glu

Gly

Arg

ile

Lys

Gly

Val

Ile

Gin

Ala

Ile

Gin

Lys

Ser

Asp

50

55

60

Glu

Glu

HIS

Pro

Phe

Arg

Ala

Tyr

Leu

Glu

ser

Glu

Val

Ala

ile

Ser

65

70

75

val

80

Leu

val

Gin

Lys

Týr

Ser

Asn

ser

Ala

Leu

Gly

His

Asn

Cys

Thr

85

90

val

95

Ile

Lys

Glu

L.eu

Arg

Arg

Leu

Phe

Leu

val

Asp

ASp

.Leu

Asp

Ser

100

105

110

Ala

Leu

Lys

Phe

Ala

val

Leu

Met

Trp

val

Phe

Thr

Tyr

val

Gly

Leu

115

120

Ile

12 5

Phe

Phe

Α5Π

Gly

Leu

Thr

Leu

Leu

Ile

Leu

Ala

Leu.

ser

Leu

Ser

130

135

Ala

Gin

140

His

val

Pro

Val

Ile

Tyr

Glu

Arg

Hi s

Gl n

ile

ASp;

Tyr

Leu

145

150

155

Gin

160

Gly

Leu

Ala

Asn

Lys

Asn

val

Lys

ASp

Ala

Met

Ala

Lys

Ile

Ala

165

170

175

Lys

ile

Pro

Gly

Leu

Lys

Arg

Lys

Ala

GlU

180

185

<210> 25 <211> 186 <212> PRT <213> Rattus sp.

<400> 25

Asp 1

Leu Leu Tyr

Trp 5

Arg Asp Ile Lys

Lys Thr Gly 10

val

Val

Phe 15

Gly

Ala

Ser

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

ser

Leu

Thr

val

Phe

ser

Ile

Val

Ser

val

Thr

Ala

20

25

30

Tyr

ile

Ala

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

Val

Thr

Ile

ser

Phe

Ile

35

Gly

40

45

Arg

Tyr

Lys

Val

ile

Gin

Ala

ile

Gin

Lys

Ser

Asp

Glu

Gly

His

50

Phe

Ala

55

60

Pro

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ser

Glu

val

Ala

ile

Ser

Glu

Glu

65

val

Gin

70

75

80

Leu

Lys.

Tyr

Ser

Asn

Ser

Ala

Leu

Gly

Hi S

Val

Asn

Ser

Thr

Ile

Glu

85

90

95

Lys

Leu

Arg

Arg

Leu

Phe

Leu

val

Asp ASP

Leu

Val

Asp

Ser

Phe

100

105

110

Leu

Lys

Ala

Val

Leu

Met

Trp

val

Phe

Thr

Tyr

val

Gly

Ala

Leu

Phe

115

120

125

Asn

Gly

Leu

Thr

Leu

Leu

ile

Leu

Ala

Leu

ile

Ser

Leu

Phe

ser

ile

130

val

135

140

Pro

ile

Tyr

Glu

Arg

His

Gin

val

Gin

Ile

Asp

Hi s

Tyr

Leu

145

Ala

150

155

160

Gly

Leu

Asn

Lys

Ser

val

Lys

Asp

Ala

Met

Ala

Lys

ile

Gin

Ala

Ile

Gly

165

170

175

Lys

pro

Leu

Lys

Arg

Lys

Ala

ASp

180

185

<210> 26 <211> 194

-63CZ 304224 B6 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 26

ASp

Val

ile

Tyr

Trp

Arg

Asp

Al a

Lys

Lys

ser

Ala

ile

Val

Leu

Ser

1

5

10

15

Leu

Ala

Leu

Leu

Val

Leu

Phe

Val

Leu

.Ala

Lys

Tyr

pro

Leu

Leu

Thr

20

25

30

Val

Val

Thr

Tyr

Ser

Leu:

Leu

Leu

Ala

Leu

Gly

Ala

Ala.

Al a

Gly

Phe

35

40

45

Arg

val

phe

Lys

Lys.

Val

Glu

Ala

Gin

ile

Lys

Lys

Thr

Asp

ser

Gl u

50

55

60

His

Pro

phe

Ser

Glu

Tle

Leu

Ala

Gl rt

ASp

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Glu

65

70

75

80

Lys

Val

His

Al a

Gin

Ala

ASp

val

Phe

Val

Glu

His

Ala

Thr

Cys

ile

85

90

95

Ala

Asn

Lys

Leu

Lys

Lys

Leu

val

phe

Val

Glu

ser

Pro

Leu

Glu

Ser

100

105

110

ile

Lys

Phe

Gly

Léu

Val

Leu

Trp

Ser

Leu

Thr

Tyr

Ile

Ala

Ser

Trp

115

120

125

Phe

Ser

Gly

Phe

Thr

Leu

Ala

Ile

Leu

Gly

Leu

Leu

Gly

Val

Phe

ser

130

135

140

val

Pro

Lys

Val

Tyr

Glu

Ser

Asn

Gin

Glu

Ala

ile

Asp

Pro

His

Leu

145

150

155

160

Ala

Thr

ile

ser

Gly

His

Leu

Lys

Asn

Val

Gin

Asn

ile

II e

Asp

Glu

165

170

175

Lys

Leu

Pro

Phe

Leu

Arg

Ser

Ala

pro

val

Ala

Ala

Glu

Glu

Lys

Lys

1.80

185

190

ASp

Gin

<210> 27 <211> 150 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 27

Asn 1

Leu Leu

Leu Trp 5

Arg Asn ser Arg Lys Thr Leu ile val 10

Phe Thr 15

Gly

Ile

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

ASp

val

Met

Val

H 'í s

Ser

Val

Ile

ser

20

25

30

val

Ile

Ser

Met

val

Gly

Ile

Thr

val

Leu

ile

Ala

Al a

ile

Gly

HÍS

35

40

45

Arg

Leu

Leu

val

Gin

Phe

Trp

ser

ile

Trp

Lys

Lys

ASp

Glu

Asn

Lys

50

Ile

55

60

ASp

Gl rt

Leu

Arg

Phe

Tyr

pro

His

Pro

uys

ile

Glu

Ile

pro

Arg

65

70

75

SO

Gl u

Glu

Thr

Leu

Tyr

Leu

Ala

Gly

tys

Ala

val

Ser

Hi S

ile

Asn

Leu

85

90

95

il &

Leu.

asíi

Arg

Met

Ile

Glu

Leu

Leu

Leu

val

Glu

Lys

Trp

Glu

ASp

100

105

110

Ser

Leu

Lys

Phe

Leu

Val

Leu

Leu

cys

Gly

Ile

Asn

Leu

Leu

Gly

Asp

115

120

125

cys

Phe

Asn

Gly

Leu

Thr

Leu

Leu

ile

Phe

Gly

Met

Cys

ile

Cys

Cys

130

135

140

Leu

Thr

Leu

Leu

Tyr

Leu

145

150

<210> 28 <211> 3833 <212> DNA <213> Bos sp.

-64CZ 304224 B6 <400> 28 cratctcctc tctcagccge tgcttttaaa gaacgtgaat accttggtga tttaccagca 60 gtactgccca ctgaaggaac acttccagca acttcaaatg aagcttctaa agcattctca 120 gagaaggcaa aaaatccatt tgtagagaga aatttaacag aattttcaga attggaatat 180 tcagaaatgg aatcatcatt cagtggctct caaaaggcag aacctqccgt aacagtageg 240 aatcctaggg acgaaatagt tgtgaggagt agagataaag aagaggactt agttagtctt 300 aacatccttc atactcagca ggagttatct acagtcctta cgaaatcagt tgaagaagaa 360 gatagagttc tgtctceaga aaaaacaaag gacagtttta aggaaaaggg agttgcagca 420 gaagctrcta tgggggagga atatgcagac ttcaaaccat ttgagcgágt atgggaagtq 480 aaagatactt acaagcaaga tagtgatgtt ttgattgctg gaggtaatat agagagcaaa 540 ttggaaggta aagtggataa gaaacacttt tcagatágcč ttgaacaaac aaatcgtgaa 600 aaagatagtg aaageagtaa tgatgacact tcatttccca gtacaccaga agctgtaaga 660 ggtggttccg gagegtacat eacgtgtgct ccctttaacc caacaactga gaatgtttca 720 acaaacattt ttcccttgtt ggaagatcat acttcggaaa ataagacaga tgaaaaaaag 780 atagaaaaaa aaaggcačaa attgtaacag agaagaatgc aagrgtcaag acatcaaacc 840 ctttccttat ggcagcacag gagtctaaga cagattacgt tacaacagat catgtgtcaa 300 aggtgaccga. ggaagtagtg gcaaacatgc ctgaaggtct aaecccagat ttggttcagg 960 aagcatgtga aagtgaattg aatgaagcta ctggtacaaa aattgccttt gaaacaaaaa 1020 tggacctggt tcaaacttca gaagctgtgc aggagtcact ttaccctgta acacagcttt 1080 gcccatcttt tgaagaatct gaagctactc cgtcaccggt tttgcctgac attgtcatgg 1140 aagcaccatt aaattctgta gttcctagtg ctggtgcttc tgcagtgcag ctcagttcat 1200 caccattaga aactcttcct tcagttaatt atgaaagcat aaagtttgag cctgaaaatc 1260 ccccaccata tgaggaggcc atgaatgtat cactaaaaaa agaatcagga atgaatgaag 1320 aaatcacaga gcctgaaggt attagtgtag ctgttcagga aacagaagct ccttatatat 1380 ctattgcatg tgatttaatt aaagaaáeaa agatctctac tgaaccgact ccagatttct 1440 ctagttattc agaaatagca gaagttgcac agccagtgcc cgagcattct gagctagttg 1500 aagattcctc ccccgattct gaaccagttg acttatttag tgatgattca acácccgaag 1560 ttccacaaaa aeaagatgaa gctgtaatac ttgtgaaaga aaacctcact gaaatttcat 1620 ctgagtcaat gacaggacat gacaataagg gaaaactcag tgcttcacca tcacctgagg 1680 gaggaaaacc gtatttggag tcttttcagc ccagtttagg catcacaaaa gataccttag 1740 čacctgatga agtttcagca ttgacccaaa aggagaaaat ccctttgcag atggaggagc 1800 tcaatactgc agtttattca agtgatggct tattcattgc tcaggaagca aacctaagag 1860 aaagtgaaac attttcagat tcatctccga ttgagattat agatgagttc ccgacctttg 1920 tcagftctaa agcagattct tctcctacát tagccaggga atacactgac ctagaagtag 1980 cccacaaaag tgaaattgct gacatccagg atggagčtgg gtcattggct tgtgcaggat 2040 tgccccatga cctttctttc aagagtatac aacetaaaga ggaagttcat gťcccagatg 2100 agttctccaa agataggggt gatgtttcaa aggtgcccgt actgčctcca gatgtttctg 2160 ctttggatgc teaagcagag ataggcagca tagaaaaacc caaagttctt gtgaaagaag 2220 ccgagagaaa acttccttct gatacagaaa aagagcgaag atctccatct gctatatttt 2280 cagcágágct gagtaaaact tcagttgttg acctcctcta ctggagagac attaagaaga 2340 ctggagtggt gtttggtgcc agcttgttcc tgctgctctc gctgacagta ttcagcattg 2400 tgagtgtaac ggcctacatt gccttggccc tgctctctgt gactatcagc tttaggatat 2460 ataagggtgt gatccaggct atccagaaat ctgatgaagg ccacccattc agggcatatt 2520 tggaatctga agttgctata tctgaggagt tggttcagaa gtacagcaat tctgctcttg 2580 gtcatgttaa ctgcacaata aaagaactca gaegcctctt cttagttgat gatttagttg 2640 attctctgaa gtttgcagtg ttgatgtggg tatttaccta tgttggtgcc ttgttcaatg 2700 gtctgacact actaattttg gctctgattt cactcttcag tgttcctgtt atttatgaač 2760 ggcatcagge gcaaatagat cattatctgg gacttgcaaa taagaatgtt aaagatgcta 2820 rggctaaaat ccaagcaaaa atccctggat tgaagcgtaa agctgaatga gaaagcctga 2880 aagagttaac aatagaggag tttatcttta aaggggatat tcatttgatt ccattgggga 2940 gggtčaggga agaacaáagc cttgacatrg cagtgčagtt tcacagatct ttatttttag 3000 caacgcagtg tctgaggaaa áatgacctgť cttgactgcc ctgtgtteat catcttaagt 3060 attgtaagcfc gctátgtatg gatttaaatc gtaatcatat ttgtttttcc tgtatgaggc 3120 actggtgaat áaacaaagat ctgagaaagc tgtatattac actttgtcgc aggtagtctt 3180 gctgtatttg gggaattgca aagaaagtgg agctgacaga aataaccctt ttcacagttt 3240 gtgcactgtg tacggtctgt gtaggttgat gcagattttc tgaaatgaaa tgtttagacg 3300 agatcatgcc accaaggcag gagtgaaaaa gcttgccttt cčtggtatgt tctaggtgtá 3360 ttgťgaaatt tactgttgtá ttaattgcca atataagtaa atatágatta tatatatcta 3420 tatatagtgt ttcacgaagc ttagcccttt acettcccag ctgccccaca gtgcttgata 3480 cttctgtcat gggttttatg tgtgtagtcc caaagcacat aagctaggga gaaacgtact 3540 tctaggcgca čtaccatctg ttttcaacac gaaccgacgc catgcaaaca gaactcctca 3600 acataaactt cactgcacag acttactgta gttaatttta tcacaaactc tggactgaat 3660 ctaatgcttc caaaaatgtt tgcaaatatc aaacattgtt atgtaagaaa atataaatga 3720 cgatttatac aattgtggtt taaqctgtat tgaactaaat čtgtggaatg cattgtgaac 3780 cgtaaaagca aagtatcaat aaagcttata gacttaaaaa aaaaaaaaaa aaa 3833 <210> 29 <211> 1178 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

-65CZ 304224 B6 <221> VARIANT <222> 187, 188, 189, 190, 221,328, 477 <223> Xaa = any amino acid <400> 29

Met

Glu

Asp

Leu

Asp 5

Gin

Ser

Pro

Leu

val

Ser

ser

Ser

Asp

Ser

Pro

1

10

15

Pro

Arg

Pro

Gin

Pro

Ala

Phe

tys

Tyr

Gin

Phe

Val

Arg

Glu

Pro

Glu

20

25

30

Asp

Gl U

cil u

Glu

Gl u

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

ASp

GTu

ASP

Glu

Asp

35

40

45

Leu

Glu

Glu

Leu

Glu

Val

Leu

Glu

Arg

Lys

pro

Ala

Ala

Gly

Leu

Ser

50

55

60

Ala

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Ala

Pro

Ala

Ala

Gly

Ala

Pro

Leu

Met

Asp

65

70

75

80

Phe

Gly

Asn

Asp

Phe

val

Pro

Pro

Ala

pro

Arg

Gly

Pro

Leu

Pro

Ala

85

90

95

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Pro

Glu

Arg

Gin

Pro

Ser

Trp

ASp

Pro

Ser

Pro

100

105

Ala

110

Val

Ser

Ser

Thr

Val

Pro

Ala

pro

Ser

Pro

Leu

ser

Ala

Ala

val

lis

120

125

Ser

pro

ser

Lys

Leu

Pro

Glu

Asp

ASp

Glu

pro

pro

Ala

Arg

ΡΓΟ

Pro

130

135

140

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala

ser

val

Ser

Pro

Gin

Ala

Glu

pro

val

Trp

Thr

145

150

155

160

Pro

pro

Ala

pro

Ala

Pro

Ala

Ala

Pro

pro

Ser

Thr

Pro

Ala

Ala

Pro

165

val

170

175

Lys

Arg

Arg

Gly

Ser

ser

Gly

Ala

val

xaa

xaa

xaa

Xaa

Lys

ile

180

185

190

Met

Asp

Leu

Lys

Glu

Gin

Pro

Gly

Asn

Thr

ile

Ser

Ala

Gly

Gin

Glu

195

val

200

205

Asp

Phe

Pro

ser

Leu

Leu

Glu

Thr

Ala

Ala

Ser

xaa

Pro

Ser

Leu

210

215:

220

ser

Pro

Leu

ser

Ala

Ala

ser

Phe

Lys

Glu

His

Glu

Tyr

Leu

Gly

Asn

225

230

235

240

Leu

ser

Thr

Val

Leu

Pro

Thr

Glu

Gly

rhr

Leu

Gin

Glu

Asn

Val

Ser

245

250

255

Gl u

Ala

Ser

Lys

Glu

Val

Ser

Glu

Lys

Ala

Lys

Thr

Leu

Leu

ile

ASP

260

265

270

Arg

Asp

Leu

Thr

Glu

Phe

Ser

Glu

Leu

G1 u

Tyr

ser

Glu

Met

Gly

Ser

275

280

285

Ser

Phe

Ser

val

Ser

Pro

Lys

Ala

Glu

Ser

Ala

val

lie

val

Ala

Asn

290

295

300

Pro

Arg

Glu

Glu

Ile

Ile

val

Lys

Asn

Lys

Asp

Glu

Glu

Glu

Lys

Leu

305

310

315

320

val

ser

Asn

Asn

Ile

Leu

His

xaa

Gin

Gin

Glu

Leu

Pro

Thr

Ala

Leu

325

330

335

Thr

Lys

Leu

val

Lys

Glu

ASp

Glu

Val

val

Ser

Ser

Glu

Lys

Ala

Lys

340

345

350

Asp

Ser

Phe

Asn

Glu

Lys

Arg

Val

Ala

Val

Glu

Ala

Pro

Met

Arg

Glu

355

360

365

Glu

Tyr

Ala

Asp

Phe

Lys

Pro

Phe

Glu

Arg

val

Trp

Glu

val

Lys

Asp

370

375

380

Ser

Lys

Glu

ASp

ser

Asp

Met

Leu

Ala

Ala

Gly

Gly

Lys

Ile

Glu

Ser

385

390

395

400

Asn

Leu

Glu

Ser

Lys

val

Asp

Lys

Lys

Cys

Phe

Ala

Asp

ser

Leu

GlU

405

410

415

Gl n

Thr

Asn

Hi s

Glu

Lys

Asp

ser

Glu

Ser

ser

Asn

Asp

Asp

Thr

Ser

420

425

4 30

Phe

Pro

Ser

Thr

Pro

GlU

Gly

ile

Lys

Asp

Arg

Ser

Gly

Ala

Tyr

ile

435

440

445

Thr

Cys

Ala

Pro

Phe

Asn

Pro

Ala

Ala

Thr

Glu

Ser

Ile

Ala

Thr

Asn

450

455

460

ile

Phe

Pro

Leu

leu

Glu

Asp

Pro

Th r

Ser

Glu

Asn

xaa

Thr

Asp

Glu

465

470

475

480

Lys

Lys

Ile

Glu

Glu

Lys

Lys

Ala

Gin

Ile

Val

Thr

Glu

Lys

Asn

Thr

485

490

495

Ser

Thr

Lys

Thr

Ser

Asn

Pro

phe

Phe

Val

Ala

Ala

Gin

Asp

Ser

Glu

500

505

510

Thr

ASP

Tyr

val

Thr

Thr

Asp

Asn

Leu

Thr

Lys

Val

Thr

Glu

Glu

val

515

520

525

va 1

Ala

Asn

Met

Pro

Glu

Gly

Leu

Thr

Pro

Asp

Leu

val

Gin

Glu

Ala

530

535

540

-66CZ 304224 B6

Cys

Glu

Ser

Glu

Leu

Asn

Glu

val

Thr

Gly

Thr

Lyš

ile

Ala

Tyr

Glu

545

550

555

560

Thr

Lys

Met

Asp.

.Leu

val

Gin

Thr

ser

GlU

vai

Met

Gin

Glu

Ser

Leu

565

570

575

Tyr

pro

Ala

Ala

Gin

Leu

cys

Pro

ser

Phe

Glu

Glu

ser

Glu

Ala

Thr

580

585

590

Pro

Ser

pro 595

Val

Leu

pro

Asp

ile

Val

Met

Glu

Ala

pro

Leu

Asn.

ser

600

605

Ala

val

Pro

Ser

Ala

Gly

Ala

Ser

Val

Ile

Gin

Pro

Ser

ser

Ser

Pro

610

615

620

Leu

Glu

Ala

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Glu

Ser

ile

Lys

Hi s

Glu

Pro

Glu

625

630

635

640

Asn

Pro

pro

Pro

Tyr

Glu

Glu

Ala:

Met

Ser

val

Ser

Leu

Lys

val

Ser

645

Ile

650

655

oiy

Ile

Lys

Glu

Glu

Lys

Glu

Pro

Glu

Asn

rle

Asn

Ala

Ala

Leu

660

665

670

Gin

Glu

Thr

Glu

Ala.

Pro

Tyr

ile

Ser

Ile

Ala

Cys

Asp

Leu

Ile

Lys

675

680

685

Glu

Thr

Lys

Leu

Ser

Ala

Glu

Pro

Al a

Pro

ASp

Phe

ser

Asp

Tyr

Ser

690

695

700

Glu

Met

Ala

Lys

Val

Gltí:

Gin

Pro

Val

pro

ASp

Hi s

Ser

Glu

Leu

val

705

710

715

720

Glu

ASp

Ser

Ser

Pro

ASp

Ser

Glu

Pro:

val

Asp

Leu

Phe

Ser

ASp

Asp

725

730

735

Ser

ile

pro

Asp

val

Pro

Gin

Lys

Gin

ASP

Glu

Thr

val

Met

Leu

Val

740.

745

750

Lys

Glu

Ser

Leu:

Thr

Glu

Thr

Ser

Phe

Glu

Ser

Met

tle

g1 u

Tyr

Glu

755

760

765

Ašh

Lys

Glu

Lys

Leu

Ser

Ala

Leu

Pro

Pro

Glu

Gly

Gly

Lys

pro

Tyr

770

775

780

Leu

Glu

Ser

Phe

Lys

Leu

Ser

Leu

ASp

Asn

Thr

Lys

Asp

Thr

Leu

Leu

785

790

795

800

Pro

Asp

Glu

val

Ser

Thr

Leu

Ser

Lys

Lys

Glu

Lys

ile

Pro

Leu

Gin

805

810

815

Met

Glu

Glu

Leu

Ser

Thr

Ala.

Val

Tyr

Ser

Asn

Asp

Asp

Leu

Phe

Ile

820

825

830

set'

Lys

Glu

Ala

Gin.

Ile

Arg

Glu

Thr

Glu

Thr

Phe

Ser

ASP

Ser

Ser

835

840

845

pro

ile

Glu

ile

Ile

ASp

Glu

Phe

Pro

Thr

Leu

ile

Ser

Ser

Lys

Thr

850

855

860

Asp

Ser

Phe

Ser

Lys

Leu

Ala

Arg

Glu

Tyr

Thr

Asp

Leu

Glu

val

ser

865

870

375

880

Hi S

Lys

ser

Glu

ile

Ala

Asn

Ala

Pro

Asp

Gly

Ala

Gly

Ser

Leu

Pro

885

890

895

cys

Thr

Glu

Leu

pro

His

Asp

Leu

Ser

Leu

Lys

Asn

ile

Gin

Pro

Lys

900

905

910

val

Glu

Glu

Lys

Ile

Ser

Phe

Ser

Asp

Asp

Phe

Ser

Lys

Asn

Gly

Ser

915

920

925

Al a

Thr

Ser

Lys

val

Leu

Leu

Leu

Pro

pro

Asp

val

Ser

Ala

Leu

Gly

930

935

940

Hi S

Thr

Gin

Ala

Glu

Ile

Glu

ser

Ile

Val

Lys

Pro

Lys

val

Leu

Glu

945

950

955

960

Lys

Glu

Ala

Glu

Lys

Lys

Leu

Pro

Ser

Asp

Thr

Glu

Lys

Glu

Asp

Arg

965

970

975

Ser

pro

Ser

Al a

Ile

Phe

Ser

Ala

ASP

Leu

Gly

Lys

Thr

Ser

Val

val

980

985

990

ASp

Leu

Leu

Tyr

Trp

Arg

ASp

ile

Lys

Lys

Thr

Gly

val

val

Phe

Gly

995

1000

1005

Ala

Ser

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Thr

Val

Phe

Ser

ile

Val

Ser

1010

1015

1020

va 1

Thr

Ala

Tyr

Ile

Ala

Leu

Ala

Leu

Leu

Ser

val

Thr

ile

Ser

Phe

1025

1030

1035

1040

Arg

Ile

Tyr

Lys

Gly

val

ile

Gin

Ala

Ile

Gin

Lys

ser

ASp

Glu

Gly

1045

1050

1055

Hl S

Pro

Phe

Arg

Ala

Tyr

Leu

Glu

Ser

Glu

Val

Al a

ile

ser

Glu

Glu

106Í

}

1065

1070

Leu

val

Gin

Lys

Tyr

Ser

Asn

Ser

Ala

t..eu

Gly

His

val

Asn

Cys

Thr

1075 1080 1085

-67CL 304224 B6

Ile Lys Glu 1090	Leu	Arg	Arg	Leu Phe Leu 1095	Val Asp	Asp Leu Val 1100	ASp	ser
Leu Lys Phe	Ala	val	Leu	Met Trp val	Phe Thr	Tyr val cly	Ala	Leu
1105			1110	1115		1120
Phe Asn Gly	Leu	Thr	Leu	Leu Ile Leu	Ala Leu	Ile Ser Leu	Phe	Ser
		1125		1130		1135
val Pro val	ile	Tvr	Glu	Arg His Gin	Ala Gin	ile Asp His	Tyr	Leu
	1140		1145	1150
Gly Leu Ala	Asn	Lys	Asn	val Lys Asp	Ala Met	Ala Lys Ile	Gin Ala
1155			1160		1165
tys Ile Pro Gly	Leu	Lys	Arg Lys Ala	Glu

1170 1175

<210>	30
<211>	1163
<212>	PRT
<213>	Rattus sp.
<220>
<221>	VARIANT
<222>	469
<223>	Xaa = any amino acid
<400>	30

Met

Glu

Asp

Ile

ASp

Gl n

ser

Ser

Leu

Val

ser

Ser

Ser

Thr

Asp

Ser

1

5

10

15

Pro

Pro

Arg

Pro

Pro

Pro

Ala

phe

Lys

Tyr

Gin

Phe

val

Thr

Glu

Pro

20

25

30

Glu

Asp

Glu

Glu

Asp

Glu

Glu

Glu

Glu

Glu

ASp

Glu

Glu

Glu

Asp

Asp

35

40

45

Glu

Asp

Leu

Glu

Glu

Leu

G1U

val

Leu

Glu

Arg

tys

Pro

Ala

Ala

Gly

50

5.5

60

Leu

Ser

Ala

Ala

Ala

val

Pro

Pro

Ala

Ala

Ala

Ala

Pro

Leu

Leu

Asp

65

70

75

80

phe

ser

Ser

Asp

Ser

val

Pro

pro

Ala

pro

Arg

Gly

pro

Leu

pro

Ala

85

90

95

Ala

Pro

Pro

Ala

Ala

Pro

Glu

Arg

Gin

Pro

Ser

Trp

Glu

Arg

ser

Pro

100

105

110

Ala

Ala

Pro

Ala

Pro

Ser

Leu

Pro

Pro

Ala

Ala

Ala

val

Leu

pro

ser

115

120

125

Lys

Leu

Pro

GlU

Asp

ASP

Glu

Pro

pro

Ala

Arg

Pro

pro

Pro

pro

pro

130

135

140

Pro

Ala

Gly

Ala

Ser

Pro

Leu

Ala

Glu

Pro

Al a

Ala

Pro

Pro

Ser

rhr

14 i

150

155

160

Pro

A1 a

Ala

Pro

Lys

Arg

Arg

Gly

ser

cly

Ser

val

Asp

Glu

Thr

Leu

165

170

175

Phe

a! a

Leu

pro

Al a

Ala

ser

Gl U

pro

val

ile

Pro

Ser

Ser

a! a

Glu

180

185

190

Lys

Π e

Met

ASp

Leu

Met

Glu

Gin

Pr©

Gly

Asn

Thr

Val

Ser

Ser

Gly

195

200

205

Gin

Gl u

Asp

Phe

pro

ser

val

Leu

Leu

Glu

Thr

Ala

Ala

Ser

Leu

Pro

210

215

220

Ser

Leu

Ser

Pro

Leu

Ser

Thr

val

Ser

Phe

Lys

Glu

Hi S

Gly

Tyr

Leu

225

230

235

240

Gly

Asn

Leu

Ser

Ala

Val

ser

Ser

Ser

Glu

Gly

Thr

Ile

Glu

Glu

Thr

245

250

255

Leu

Asn

Glu

Ala

Ser

Lys

Glu

Leu

Pro

Glu

Arg

Ala

Thr

Asn

ΡΓΟ

Phe.

260

265

270

Val

Asn

Arg

Asp

Leu

Ala

Glu

phe

Ser

Glu

Leu

Glu

Tyr

Ser

Gl u

Met

275

280

285

Gly

ser

Ser

Phe

Lys

G1 y

Ser

Pro

Lys

Gly

Glu

Ser

Ala

ile

Leu

val

290

295

300

Glu

Asn

Thr

Lys

Gl u

Glu

val

ile

val

Arg

ser

Lys

Asp

Lys

Glu

ASp

305

310

315

320

Leu

Val

Cys

ser

Ala

Ala

Leu

Hl S

Ser

Pro

Gin

Gl u

Ser

Pro

val

Gly

325

330

335

Lys

Glu

Asp

Arg

v a ϊ

Val

Ser

pro

Glu

Lys

Thr

Met

Asp

ile

Phe

Asn

340

345

350

-68CZ 304224 B6

GlU

Met

Gin 355

Met

Ser

val

val

Ala 360

Pro

Val

Arg

Glu

Gl u 365

Tyr

Al a

Asp

phe

Lys 370

Pro

Phe

G1 u

Gin

Ala .375

Trp

Glu

Val

Lys

Asp 380

Thr

Tyr

GlU

Gly

ser 3Š5

Arg

Asp

val

Leu

Ala 390

Ala

Arg

Ala

Asn

Val 395

Glu

ser

Lys

val

Asp 400

Arg

Lys

cys

Leu

Glu 405

Asp

Ser

Leu

Glu

Gl n 410

Lys

Ser

Leu

Gly

lys' 415

Asp

Ser

GlU

Gly

Arg 420

Asn

Glu

Asp

Ala

Ser 425

Phe

Pro

Ser

Thr

Pro 430

Glu

Pro

Val

Lys

ASP 435

ser

Ser

Arg

Ala

Tyr 440

rle

Thr

Cys

Ala

ser 445

Phe

Thr

Ser

Ala

Thr 450

Glu

Ser

Thr

Thr

Ala 455

Asn.

rhr

Phe

pro

Leu 460

Leu

Gl u

Asp

Hi s

Thr 465

ser

Glu

Asn

xaa Thr 470

Asp

Glu

Lys

Lýs

Ile 475

Gl U

Glu

Arg

Lys

Ala 480

Gin

Ile

Tle

Thr

Glu 485

Lys

Thr

Ser

Pro

L.ys 490

Thr

ser

Asn

Pro

Phe 495

Leu

val

Ala

Val

Gin 500

ASp

Ser

Glu

Ala

Asp 505

Tyr

Val

Thr

Thr

ASp 510

Thr

Leu

ser

Lys

Val 515

Thr

Glu

Ala

Ala

val 520

Ser

Asn

Met

pro

clu 525

Gly

Leu

Thr

Pro

ASp 530

Leu

Val

Gin

Glu

Ala 535

Cys

Glu

Ser

Glu

Leu 540

Asn

Glu

Ala

Thr

Gly 545

Thr

Lys

Ile

Ala

Tyr 550

Glu

Thr

Lys

val

ASp 555

Leu

val

Gin Thr

Ser 560

Glu

Ala

ile

Gin

Glu 565

Ser

Leu

Tyr

pro

Thr 570

Ala

Gin

Leu

cys

pro 575

ser

Phe

Glu

Glu

Ala 580

Glu

Ala.

Thr

pro

Ser 585

Pro

Val

Leu

Pro

Asp 590

Ile

val

Met

Glu

Ala 595

Pro

Letí val

Asn

ser

Leu 600

Leu

Pro

Ser

Ala

Gly 605

Ala

ser

val

val

Gin 610

pro

ser

Ser

Pro 615

Leu

Glu

Ala

Pro

Pro 620

Pro

val

ser

Tyr

Asp 625

Ser

ile

Lys

Leu

Glu 630

Pro

Glu

Asn

pro

Pro 635

Pro

Tyr

Glu

Glu

Ala 640

Met

Asn

val

Ala

Leu 645

Lys

Ala

Leu

Gly

Thr 650

Lys

Gl u

Gly

Ile

Lys 655

Glu

Pro

Glu

.ser

Phe 660

Asn

Ala

Ala

val

Gl n 665

Glu

Thr

Glu

Al a

Pro 670

Tyr

ile

Ser

ile

Ala 675

cys

ASp

Leu

ile

Lys 680

Glu

Thr

tys

Leu

ser 685

Thr

Glu

ΡΓΟ

ser

Pro 690

Asp

Phe

ser

Asn

Tyr 695

Ser

Glu

ile

Ala

Lys 700

Phe

Glu

tys

ser

val 705

Pro

Glu

HIS

Ala

Glu 710

Leu

val

Glu

Asp

Ser 715

Ser

Pro

Glu

Ser

Glu 720

pro

val

Asp

Leu

Phe 725

Ser

Asp

Asp

Ser

il e 730

Pro

Glu

Val

Pro

Gin 735

Thr

Gin

Glu

Glu

Ala 740

Val

Met

Leu

Met

Lys 745

Glu

ser

Leu

Thr

Glu 750

val

Ser

Glu

Thr

val 755

Ala

Gin

Hi s

Lys

Glu 760

Gl u

Arg

Leu

Ser

Ala 765

ser

Pro

Gin

Glu

Leu 770

Gly

Lys

Pro

Tyr

Leu 775

Glu

Ser

Phe

Gin

Pro 780

Asn

Leu

Hi s

Ser

Thr 785

Lys

Asp

Ala

Ala

Ser 790

Asn

ASp

ile

Pro

Thr 795

Leu

Thr

Lys

Lys

Glu 800

Lys

ile

Ser

Leu

Gin 805

Met

Glu

Glu

Phe

Asn 810

rhr

Ala.

ile

Tyr

Ser 815

Asn

ASp

Asp

Leu

Leu 820

ser

ser

Lys

GlU

ASp 825

Lys

rle

Lys

Glu

Ser 830

Glu

Thr

Phe

Ser

Asp 835

ser

Ser

pro

ile

Glu 840

ile

ile

Asp

Glu

Phe 845

Pro

Thr

Phe

val

Ser 850

Ala

tys

Asp

Asp

Ser 855

Pro

Lys

Leu

Ala

Lys 860

Glu

Tyr

Thr

Asp

Leu 865

Glu

val

Ser

Asp

Lys 870

ser

Glu

ile

Ala

Asn 875

Ile

Gin

Ser

Gly

Ala 880

Asp

Ser

Leu

Pro

cys 885

Leu

Glu

Leu

Pro

Cys 890

Asp

Leu

Ser

Phe

Lys 895

Asn

-69CZ 304224 B6 lle Tyr Pro Lys Asp Glu val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn 900 905 910

Arg ser ser val Ser Lys Ala Ser tle Ser Pro Ser Asn val ser Ala 915 920 925

Leu Glu pro Gin Thr Glu Mét Gly Ser lle Val Lys Ser Lys ser Leu

930 935 940

Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp

945 950 955 960

Arg ser Leu ser Ala val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser val

965 970 975 val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp lle Lys Lys Thr Gly Val val phe

980 985 990

Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr val Phe Ser lle Val

995 1000 1005

Ser Val Thr Ala Tyr lle Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr lle ser

1010 1015 1020

Phe Arg lle Tyr Lys Gly val xle Gin Ala lle Gin Lys ser Asp Glu

1025 1030 1035 _ 104(

Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu val Ala lle Ser Glu

1045 1050. 1055

Glu Leu val Gin Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Léu Gly His val Asn ser

1060 1065 1070

Thr lle Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu val Asp

1075 1080 1085

Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala

1090 1095 1100

Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu lle Leu Ala Leu lle Ser Leu Phe

1105 1110 1115 112C ser ile Pro Val lle Tyr Glu Arg His Gin Val Gin lle Asp His Tyr

1125 1130 1135 '

Leu Gly Leu Ala Asn Lys ser val Lys Asp Ala Met Ala Lys ile Gin

1140 1145 1150

Ala Lys lle Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp <210> 31 <211> 1568 <212> DNA <213> Rattus sp.

<400> 31 caggcttagt ctggggaagc gggtgtttca tgtctcaggg agaattttgc agtttacagc 60 qtttctgttg gtatgcataa tttgtaattg ctgctggagg gcagatcgtg gcaagaaatg 120 qacggacaga agaaacattg gaaggacaag gttgttgacc tcctctactg gagagaeatt 180 aagaagactg gagtggtgtt tggtgccagc ttattcctgc tgctgtctct gacagtgfctc 240 agcattgtca gtgtaacggc ctacattgcc ttggccctgc tctcggtgae tatcagcttt 300 aggatatata agggcgtgat ccaggctatc cagaaateag atgaaggcca cccattcagg 360 gcátatttag aatctgaagt tgctatatca gaggaattgg ttcagaaata cagtaattct 420 gctcttggtč atgtgaacag cacaataaaa gaactgaggc ggcttttctt agttgatgat 480 ttagttgatt ccctgaagtt tgcagtgttg atgtgggtgt ttacttatgt tggtgccttg 540 ttcaatggtc tgacactaet gattttagct ctgatctcac tcttcagtat tcčtgttatt 600 tatgaačggc atcaggtgca gatagatcat tatctaggac ttgcaaacaa cjaqtgttaag 660 qatgccatgg ccaaaatcca agcaaaaatc cetggattga agcgcaaagc agattgaaaa 720 agccccaaac agaagttcat ctttaaaggg gacactcact tgattacggg ggtgggaggt 780 caggggtgag cccttggtgg ccgtgcggtt tcagctcttt atttttagea gtgcactgtt 840 rgaggaaaaa ttacctgtct tgacttcctg tgtttatcat cttaagtatt gtaagctgct 900 gtgtatggat ctcattgtag tcacacttgt cttccccaat gaggcgcctg gtgaataaag 960 gactcgggga aagctgtgca ttgtatctgc tgcaggqtag tctagctgta tgcagagagt 1020 tgtaaagaag gcaaatctgg gggcagggaa aacccttttč acagtgtact gtgtttggtc 1080 agtgtaaaac tgatgcagat ttttctgaaa tgaaatgttt agatgagagc atactačtaa 1140 agcágagtgg aaaactctgt ctttatggtg tgttctaggt gcattgtgaa tttactgtta 1200 tattgccaat ataagtaaat atagacctaa tčtatatata gtgtttcaca aagcttágat 1260 ccttaacctt gcagctgccc cacagtgctt gacctctgag tcattggtta tgcagtgtag '1320 tcccaagcac ataaactagg aagagaáatg tatttgtagg agtgctacct accacctgtt 1380 ttcaagaaaa tatagaactc caacaaaaat atagaatgtc atttcaaaga cttactgtat 1440 gtatagttaa ttttgtcaca gactctgaaa ttctatggac tgaatttcat gcttccaaat 1500 gtttgcagtt atcaaacatt gttatgcaag aaatcataaa atgaagactt ataccattgt 1560 ggtttaag 1568

-70CZ 304224 B6

<210>	32
<211>	199
<212>	PRT
<213>	Rattus sp.

<400> 32

Met

Asp

Gly

Glh

Lys

Lys

His

Trp

Lys

Asp

Lys

val

val

ASP

Leu

Leu

1

5

10

15

Tyr

Trp

Arg:

Asp

lle

Lys

Lys

Thr

Gly

val

Val

Phe

Gly

Ala

ser

Leu

20:

25

30

Phe

Leu

Leu

Leu

ser

Leu

Thr

val

phe

Ser

lle

val

Ser

Val

Thr

Ala

35

40

45 Phe

Tyr

iTé

Ala

Leu

Ala

Leu

Leu

ser

val

Thr

Ile

Ser

ΑΓ®

tle

Tyr

50:

55

60

Lys

Gly

val

lle

Gin

Ala

ile

Gin

tys

ser

ASp

Git!

Gly

His

Pro

Phe

65

70

75

Glu

80

Arg

Ala

Tyr

Leu

Glu

Ser

Glu

Val

Ala

ile

Ser

Glu

Leu

val

Gin

85

90

95

Lys

Tyr

ser

Asn

ser

Ala

Leu

Gly

HÍS

Val

Asn

ser

Thr

ile

Lys

Glu

100

105

110

Leu

Arg

Arg

Leu

Phe

Leu

val

Asp

Asp

Leu

val

Asp

Ser

Leu

Lys

Phe

115

120

125

Ala

val

Leu

»et

Trp

val

Phe

Thr

Tyr

Val

Gly

Ala

Leu

Phe

Asn

Gly

130

135

140

lle

Leu

Thr

Leu

Leu

lle

Leu

Ala

Leů

lle:

Ser

Leu

Phe

Ser

ΡΓΟ

Val

145

150

155

160

lle

Tyr

Glu

Arg

His:

Gin

val

Gin

ile

ASp

His

ryr

Leu

Gly

Leu

Al a

165

170

175

Asn

Lys

ser

val

Lys

Asp

Ala

Met

Ala

Lys

ile

Gin

Ala

Lys

ile

Pro

180

185

190

Gly

Leu

Lys

Arg

LyS

Ala

Asp

195

<210>	33
<211>	18
<212>	PRT
<213>	Bos sp.
<400>	33

ser Tyr Asp Ser lle Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro pro Pro Tyr Glu 1 5 10 15

Glu Ala

20 <210>	34
<211>	13
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
25 <400>	34

gccgccrcca tgg

<210>	35
30 <211>	248
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<220>

-71 CZ 304224 B6

<221>	mise feature
<222>	110
<223>	n=a, c, g, or t
<400>	35
gagccgtcac cacagtaggt	ccctcggctc	agtcggccca	gcccctctca	gtcctcccca	60
ácccccacaa ccgcccgcgc	tcctgagacg	cgccccggcg	gcggcggcan	agetgeagea	120
tcatctccač cctccagcca	tggaagacct	ggaccagtct	cctctggtct	cgtcctcgga	180
cagcccaccc cggccgcagc	ccgcgttcaa	gtaccagťtc	gtgagggagc	ccgaggaega	240
ggaggaag					248
<210>	36
<211>	379
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	mise feature
<222>	91
<223>	n=a, c, g, or t
<400>	36

gaaaatatgy acttgaagga gcagccaggt aacactattt cggctggtca agaggatttc 60 ccatctgtxc tgcttgaaác tgctgcttct nttccttctc tgtctcctct ctcagccgct 120 tcttlcaaag aacatgaata ccttggtaat ttgtcaaeag tattacccac tgaaggaaca 180 cttcaagaaa atgtcagtga agcttctaaa gaggtctcag agaaggcaaa aactctactc 240 atagatagag atttaacaga gttttcagaa ttaggaatac tcagaaatgg gatcatcgtt 300 cagtgtctct ccaaaagcag áatctgccgt aaatagtagg caaatcctag gggaagaaat 360 aattcgtgga aaaataáag 379

<210>	37
<211>	281
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	mise feature
<222>	170,275
<223>	n=a, c, g, or t
<400>	37

gatagagatt taacagagtt ttcagaatta gaatactcag aaatgggatc atcgttcagt 60 gtctctccaa aagcagaatc tgccgtaata gtagcaaatc ctagggaaga aatáatcgtg 120 aaaaataaag atgaagaaga gaagttagtt agtaataaca. tccttcatan tcaacaagag 180 ttacctacag ctcttactaa attggttáaa gaggatgaag ttgtgtcttc agaaaaagca 240 aaagacagtt ttatgaaaga gagttgcagx ggaantccťt g 281

<210>	38
<211>	640
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	mise feature

-72CZ 304224 B6 <222> 371, 444, 474, 501, 506, 524, 544, 561, 580, 614, 620 <223> n=a, c, g, or t <400> 38 ttaaagagga tgaagttgtg tcttcagaaa aagcaaaaga cagttttaat gaaaagagag ttgcagtgga agctcctatg agggaggaat atgcagactt caaaccattt gagcgagtat gggaagtgaa agatagtaag gáagatagtg atatgttggc tgctggaggt aaaategaga gcaacttgga aagtaaagtg gataaaaaat gttttgcaga tagccttgág caaactaatc acgaaaaaga tagtgagagt agtaatgatg atacttcttt ccccaatacg ccagaaggta taaaggatcg ttcaggágca tatatcaeat gtgctccctt taaccčagca gcaactgaga gcattgcaac naacattttt cctttgttgg agatcctact tcagaaaatt agaccgtgaa aaaaaataga agaaaagaag gccnaatgtt accgagaaga atactagcac aaanctcaac cctttcttgt gcagcacagg ntctgngáca gatatgtccc acgnttatta ccaagtgctg agantcttgc aacatcctga ngctgactcc gattgttccn gagctttgaa tggattgtgg ttctggtcaa gttntttgan cáaatggctt gtcactcgat <210> 39 <211> 346 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221 > miscfeature <222> 149, 198, 207, 246, 312,317 <223> n=a, c, g, or t <400> 39 ctgtgcccgg ccccaccccc tgggcagatg tcccccactg ctaaggctgc tggcttcagg gagggttagc ctgcaccgcc gctatcctgc ccctaagtta ttacctctcc agttcctacc gtactccctg caccgtctca ctgtgtgtnt cgtgtcagta atttatatgg tgttaaaatg tgtatatttt tgtatgtnac tattttnact agggctgagg ggcctgcgcc cagagctggc ctcccncaac acctgctgcg cttggtaggt gtggtggcgt tatggcagcc eggctgctgc ttggatgcga gnttggnctt gggccggtgc tggggggcac agttgt <210> 40 <211> 325 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 gtggcaaaca tgcctgaagg cctgactcca gatttagtac aggaagcatg tgaaagtgaa ttgaatgaag ttactggtac aaagattgct tatgaaacaa aatggacttg gttcaaacat cagaagttat gcaagagtca ctctatcctg cagcacagct ttgcccatca tttgaagagt cagaagctac tccttcacca gttttgcctg acattgttat ggaagcacca ttgaattctg cagttcctag tgctggtgct tccgtgatac agcccagctc atcaccattá gaggcttctt cagttaattá tgaagcataa aeatg <210> 41 <211> 338 <212> DNA <213> Homo sapiens

120

180

240

300

360

420

480

540

600

640

120

180

240

300

346

120

180

240

300

325

-73CZ 304224 B6 <400> 41 gcatgtgaaa gacttggttc ccatcatttg gcaccattga ccattagaag ccatatgaag gtgaattgaa aaacatcaga aagagtcaga attctgcagt cttcttcagt aggccatgág tgaagttact ggtacaaaga agttatgcaa gagtcactct agctactcct tcaccagttt tcctagtgcc ggtgcttccg taattatgaa ágcataaaac tgtatcacta aaaaaagt ttgcttatga atcctgcagc tgcctgacat tgatacagcc atgagcctga aacaaaaatg acagctttgc tgttatggaa cagctcatca aaacecccca

120

180

240

300

338

<210>	42
<211>	480
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	mise feature
<222>	383,402, 421,433,441
<223>	n=a, c, g, or t
<400>	42

aagactggag tggtgtttgg tgccagccta ttcctgctgc tttcattgac agtattcagc attgtgagcg táacágcctá cattgčcttg gccctgctct ctgtgacčat cagctttagg atatacaagg gtgtgatcčá agctatccag aaatcagatg aaggccaccc attcagggca tatctggaat ctgaagttgc tatatetgag gagttggttc agáagtacag taaťtctgct cttggtcatg tgaactgcac gataaaggaa ctcaggcgcc tcttcttagt tgatgattta gttgattctc tgaagtttgc ágťgttgatg tgggtattta cctatgtťgg tgccttgttt aatggtctga cactáctgat ttnggctctc attccactcc tncaagtgtt cctggtattt ntgaacggca tcnggcacag ntagatcatt atccaggact tgcaaatagg aatgtaaaga

120

180

240

300

360

420

480

<210>	43
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	43

Met Glu Asp Leu Asp Gin Ser Pro Leu val ser ser Ser

5 10

<210>	44
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	44

Lys Ile Met Asp Leu Lys Glu Gin Přo Gly Asn Thr lle Ser Ala Gly

1 5
<210>	45
<211>	19
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens

-74CZ 304224 B6 <400> 45

Lys Glu Asp Glu val Vál Sér Ser Glu Lys Ala Lys Asp: ser Phe Asn 1 5 10 15

Glu Lys Arg <210> 46 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Gin

Glu

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gin

Leu

Cys

Pro

Ser

Phe

Glu

Glu

1

Thr

5

10

15

ser

G1 u

Ala

Pro

Ser

Pro

val

Leu

Pro

ASp

ile

val

Met

Glu

Ala

20

25

val

30

pro

Leu

Asn

ser

Ala

Val

Pro

Ser

Ala

Gly

Ala

Ser

Ile

Gin

Pro

35

40

45

Ser Ser 50 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> degenerate oligonucleotides designed from the bovine N1220 peptide 1 sequence <220>

<221 > modifiedbase <222> 3,6,12,15,18 <223> n=inosine <400> 47 tcngtnggya anaengcngg yaartc <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> degenerate oligonucleotides designed from the bovine NI220 peptide 1 sequence <220>

<221> modifiedbase <222> 3,6,9,12,15 <223> n=inosine <400> 48 tcngtnggna gnacnggyaa ytc 23

-75CZ 304224 B6 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> degenerate oligonucleotides designed from the bovine NI220 peptide 1 sequence <220>

<221> modified_base <222> 3,6,12,15,20 <223> n=inosine <400> 49 tcngtnggya anacngcggn agrtc 25 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> degenerate oligonucleotides designed from the bovine NI220 peptide 1 sequence <220>

<221> modified_base <222> 3,6,9,12,15,18,21 <223> n=inosine <400> 50 tcngtnggna gnacngcngg nagrtc 26 <210> 51 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> degenerate oligonucleotides designed from the bovine NI220 peptide 2 sequence <220>

<221 > modified_base <222> 9,12,24 <223> n=inosine <400> 51 garathgcng anathcarga yggnga 26

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   5 1. Monoklonální protilátka, kde tato monoklonální protilátka se imunospecificky váže na čištěný protein, který je tvořený sekvencí aminokyselin s více než 90% identitou po celé délce se SEQ ID NO: 29 a je prostý jakéhokoliv myelinového materiálu centrálního nervového systému, s nímž je přirozeně spojen, pro použití jako léčivo.