DE68923362T2 - Wachstumsregelfaktoren für neuriten. - Google Patents

Wachstumsregelfaktoren für neuriten.

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Description

    1. EINFÜHRUNG
  • Diese Erfindung betrifft Gene und die von diesen codierten, das Wachstum von Neuriten steuernden Proteine, die entsprechenden Antikörper sowie die therapeutischen und diagnostischen Einsatzmöglichkeiten dieser Proteine und Antikörper. Zu den Proteinen dieser Erfindung zählen die mit dem Zentralnervensystem-Myelin verbundenen inhibitorischen Proteine sowie mit bösartigen Tumoren, insbesondere primären Hirntumoren wie Glioblastomen und anderen, zur Metastasenbildung und Ausbreitung im Hirn fähigen Tumoren, verbundenen Metalloproteasen. Die zu dem Zentralnervensystem-Myelin gehörenden inhibitorischen Proteine hemmen den Auswuchs von Neuriten sowie die Verbreitung von Fibroblasten und können von hohem Nutzen bei der Behandlung von bösartigen Tumoren sein. Einsatzmöglichkeiten für gegen solche bösartigen Tumore gerichtete Antikörper bestehen in den Bereichen Diagnose von bösartigen Tumoren und Behandlung von Schäden des Zentralnervensystems sowie von degenerativen Nervenkrankheiten. In einer speziellen Verkörperung dieser Erfindung kann ein gegen Neuritenwachstumsinhibitoren gerichteter Antikörper eingesetzt werden, um die Regeneration von Neuronen über weite Strecken nach einer Schädigung des Rückenmarks zu fördern. Die Metalloproteasen dieser Erfindung ermöglichen ein invasives Wachstum von Glioblastomen und gestatten einen Auswuchs von Neuriten in Gewebe des Zentralnervensystems. Sie können bedeutende Einsatzmöglichkeiten bei der Behandlung einer Schädigung des Zentralnervensystems sowie degenerativer Nervenkrankheiten haben. Eine Hemmung der Metalloprotease kann im Rahmen der Behandlung von bösartigen Tumoren von therapeutischem Nutzen sein.
    • 2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG 2.1 Faktoren die das Neuritenwachstum im Zentralnervensystem beeinflussen
  • Zellanheftung, Zellausbreitung, Zellmotilität und insbesondere Neuritenauswuchs hängen in hohem Maße von Zellsubstrat-Interaktionen ab (Sanes, 1983, Ann. Rev. Physiol. 45: 581-600; Carbonetto u. a., 1987, J. Neurosci. 7: 610-620). Eine wachsende Anzahl von Substratmolekülen, die Neuroblastenmigration oder Neuritenauswuchs begünstigen, sind in Gewebe des zentralen Nervensystems sowie des peripheren Nervensystems festgestellt worden (Cornbrooks u. a., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3850-3854; Edelman, 1984, Exp. Cell Res. 161: 1-16; Liese, 1985, EMBO J. 4: 1163-1170; Chiu, A.Y. u. a.., 1986, J. Cell Biol. 103: 1383-1398; Fischer u. a., 1986, J. Neurosci. 6: 605-612; Lindner u. a., 1986, Brain Res. 377: 298-304; Mirsky u. a., 1986, J. Neurocytol. 15: 799-815; Stallcup u. a., 1986, J. Neurosci. 5: 1090-1101; Carbonetto u. a., 1987, J. Neurosci. 7 : 610-620). Das Auftreten einiger dieser Faktoren kann mit bestimmten Entwicklungsstufen in Beziehung gesetzt werden und im Falle des peripheren Nervensystems (PNS) auch mit einer Denervierung (Edelman, 1984, Exp. Cell Res. 161: 1-16; Liesi, 1985, EMBO J. 4: 1163-1170; Stallcup u. a., 1985, J. Neurosci. 5: 1090-1101; Daniloff u. a., 1986, J. Cell Biol. 103: 929-945; Carbonetto u. a., 1987, J. Neurosci. 7: 610-620). Das extrazelluläre Matrixprotein Tenascin besitzt, wie gezeigt worden ist, nichtpermissive Substrateigenschafen (Chiquet-Ehrismann u. a., 1986, Cell 47: 131-139).
  • Einer der charakteristischsten Faktoren der den Neuritenauswuchs begünstigenden löslichen Faktoren ist der Nervenwachstumsfaktor (NGF - "nerve growth factor"). Der Nervenwachstumsfaktor fördert den Nervenfaserauswuchs aus embryonalem Ganglion und sympathischem Ganglion in vivo und in vitro sowie den Neuritenauswuchs (behandelt in Thoenen u. a., 1982, in: Repair and Regeneration of the Nervous System, J. G., Nicholls, (Hrsg.), Springer-Verlag, NY, S. 173-185). Drei unterschiedliche molekulare Formen des NFG sind identifiziert worden. Ein Typ ist ein Dimer (Molekulargewicht ca. 26.000) bestehend aus zwei nichtkovalent verknüpften identischen Polypeptidketten. Die zweite Form ist im neutralen pH-Bereich stabil und umfaßt drei verschiedene Polypeptidketten, nämlich α, β und γ (Molekulargewicht ca. 140.000). Die β-Kette ist die biologisch aktive Kette und ist identisch mit der ersten Form des NFG. Die dritte Form, die in erster Linie aus L-Zellen von der Maus isoliert wird (siehe US-Patent Nr. 4.230.691 von Young, erteilt am 28. Oktober 1980, sowie darin zitierte Unterlagen), hat ein Molekulargewicht von ca. 160.000, ist jedoch im neutralen pH-Bereich instabil. NGF ist bisher aus den Unterkieferdrüsen von Mäusen, L-Zellen von der Maus und der Prostata vom Meerschweinchen und Stier isoliert worden (behandelt in Thoenen u. a., 1982, a.a.O.). Es sind keine Unterschiede zwischen der biologischen Wirkung des NGF von der Maus, vom Meerschweinchen und vom Stier festgestellt worden. Außerdem hat man festgestellt, daß sich von Mäusen isolierter NGF an NGF-Rezeptor vom Menschen anlagert (Johnson u. a., 1986, Cell 47: 545-554).
  • Das differenzierte Zentralnervensystem (ZNS) höherer Wirbeltiere zeigt nach Läsionen eine sehr begrenzte Fähigkeit zu regenerativem Neuritenwachstum. Eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration nach Läsion wurde in der Netzhaut festgestellt (McConnell und Berry, 1982, Brain Res. 241: 362-365) sowie in aminergen unmyelinierten Fasersystemen nach chemischen (Bjorklund und Stenevi, 1979, Physiol. Rev. 59: 62-95), nicht jedoch mechanischen Läsionen (Bregman, 1987, Dev. Brain Res. 34: 265-279). Das Neuritenwachstum aus implantierten embryonalen ZNS-Geweben im Zentralnervensystem ausgewachsener Ratten betrug in einigen Fällen festgestelltermaßen bis zu 14 mm innerhalb einiger Bereiche der grauen Gehirnsubstanz, niemals jedoch über 1 mm innerhalb weißer Gehirnsubstanz (Nornes u. a., 1983, Cell Tissue Res. 230: 15-35; Bjorklund und Stenevi, 1979, Physiol. Rev. 59 : 62-95; Commission, 1984, Neuroscience 12: 839-853). Demgegenüber hat man ein extensives regeneratives Wachstum in dem ZNS niedrigerer Wirbeltiere sowie in dem peripheren Nervensystem sämtlicher Wirbeltiere einschließlich des Menschen festgestellt. Ergebnisse aus Transplantationsexperimenten zeigen, daß der Mangel an Regenerationsvermögen keine inhärente Eigenschaft von ZNS-Neuronen ist, da diese leicht Fortsätze in implantiertes peripheres Nervengewebe ausbilden (Benfey und Aguayo, 1982, Nature (London) 296: 150-152; Richardson u. a., 1984, J. Neurocytol. 13: 165-182; So und Aguayo, 1985, Brain Res. 328: 349-354). PNS-Neuronen jedoch bildeten keine Fortsätze in ZNS-Gewebe aus, was auf das Vorliegen fundamentaler Unterschiede zwischen diesen beiden Gewebearten hinweist (Aguayo u. a., 1978, Neurosci. Lett. 9: 97-104; Weinberg und Spencer, 1979, Brain Res. 162: 273-279).
  • Ein wichtiger Unterschied zwischen PNS- und ZNS-Gewebe ist die differentielle Verteilung des den Neuritenauswuchs fördernden extrazellulären Matrixbestandteils Laminin (Liesi, 1985, EMBO J. 4: 2505-2511); Carbonetto u. a., 1987, J. Neurosci. 7: 610-620). Gleichwohl können andere Faktoren mit hineinspielen. Drastische Unterschiede sind bei den das Neuritenwachstum fördernden Eigenschaften von Ischiasnerven- oder Sehnerven-Explantaten in vitro trotz des Vorliegens von Laminin-Immunoreaktivität in beiden Explantaten festgestellt (Schwab und Thoenen, 1985, J. Neurosci. 5: 2415-2423). Diese Versuche wurden in Gegenwart von optimalen Mengen neurotropher Faktoren durchgeführt, und die Unterschiede blieben auch nach Einfrieren der Testsubstrate erhalten.
  • Es sind Vermutungen dahingehend geäußert worden, daß es dem differenzierten Zentralnervensystem möglicherweise an zellulären oder Substratbestandteilen mangelt, die für das Neuritenwachstum während der Entwicklung förderlich sind (Liesi,, 1985, EMBO J. 4: 2505-2511; Carbonetto u. a., 1987. J. Neurosci. 7: 610-620), oder daß es womöglich Bestandteile enthält, die eine Nervenfaserregeneration nicht zulassen oder hemmen (Schwab und Thoenen, 1985, J. Neurosci. 5: 2415-2423).
  • Erst vor kurzem konnte ein das Wachstum (die Zellproliferation) hemmender Faktor für Neuroblastomzellen von der Maus teilweise gereinigt und auf dem Kulturmedium aus Rattenfötus-Glioblasten sowie aus C6-Ratten-Gliomzellen gekennzeichnet werden (Sakazaki u. a., 1983, Brain Res. 262: 125-135). Der Faktor besaß nach Schätzungen mittels Gelfiltration unter Einsatz von BioGel P-20 ein Molekulargewicht von ca. 75.000 bei einem isoelektrischen Punkt von 5,8. Der Faktor schien die Wachstumsgeschwindigkeit oder Morphologie von Gliazellen (C6) oder Fibroblasten (3T3) nicht zu verändern. Außerdem konnte keine bedeutende Nervenwachstumshemmfaktor-Aktivität in bezug auf Neuroblastomzellen (Neuro La, Ns-20Y und NIE-1154) oder klonierte Fibroblasten (3T3) festgestellt werden.
  • Caroni und Schwab (1988, J. Cell Biol. 106: 1281-1288) wiesen myelinmembran-gekoppelte Proteine mit einem Molekulargewicht von 35 kD bzw. 230 kD und mit das Neuritenwachstum und die Fibroblastenausbreitung förderlichen nichtpermissiven Substrateigenschaften in vitro nach. Caroni und Schwab (März 1988, Neuron 1: 85-96) zeigten, daß gezüchtete, gegen die inhibitorischen Substratproteine gerichtete monoklonale Antikörper (IN-1 und IN-2 genannt) die Nichtpermissivität sowohl der 35-kD-Inhibitoren als auch der 250-kD-Inhibitoren von isolierten Myelinmembranfraktionen von kultivierten starkverzweigten Oligodendrozyten sowie von Sehnerven-Explantaten von ausgewachsenen Ratten neutralisierten oder stark herabsetzten.
    • 2.2 Proteasen und deren Inhibitoren
  • Verschiedene proteolytische Aktivitäten sind bereits als verstärkt aufgezeigt worden in tumorerzeugenden Zellinien (Matrisian u. a., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 9413-9417; Mignatti u. a., 1986, Cell 47 : 487- 498), in Primärtumor-Explantaten (Mullins und Rohrlich, 1983, Biochem. Biophys. Acta 695: 177-214) und in transformierten Zellen (Quigley 1976, J. Cell Biol. 71: 472-486; Mahdavi und Hynes, 1979, Biochem. Biophys. Acta 583: 167-178; Chen u. a., 1984, J. Cell. Biol. 98: 1546-1555; Wilhelm u. a., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 6725-6729). Eine solche Gruppe von Proteasen, Metalloproeasen, ist, wie aufgezeigt worden ist, an einer Reihe von Membranereignissen beteiligt, einschließlich Myoblastfusion (Couch und Stritmatter, 1983, Cell 32: 256-265) und Exocytosis in Mastzellen (Mundy und Stritmatter, 1985, Cell 40: 645-656).
  • Über die Isolierung und Charakterisierung einer plasmamembrangebundenen Metalloprotease (Endopeptidase 24.11, Enkephalinase) haben Almenoff und Orlowsky (1983, Biochemistry 22: 590-599) berichtet. Eine von mit Rous-Sarkom-Virus transformierten Hühnerembryo-Fibroblasten exprimierte Metalloprotease, die Fibronektin degradiert und die an Adhäsionsstellen sowie an "Invadopodia" ("Eindringfüßchen") lokalisiert worden war, ist von Chen und Chen (1987, Cell 48: 193-203) beschrieben worden.
  • Untersuchungen deuten darauf hin, daß Proteasen und deren Inhibitoren die Neuritenverlängerung in Neuroblastomzellen (Monard u. a., 1983, Prog. Brain Res. 58: 359-363) sowie in kultivierten neonatalen sensorischen Ganglien von der Maus (Hawkins und Seeds, 1986, Brain Res. 398: 63-70) beeinflussen können. Kultivierte Gliazellen und Gliome setzen, wie man festgestellt hat, ein 43-kD-Protein frei, ein gliaabgeleiteter Neurit-Beschleunigungsfaktor (GdNPF - "glia derived neurite promoting fador"), der den Neuritenauswuchs in Neuroblastomzellen induziert, jedoch die Zellwanderung hemmt (Monard u. a., 1983, a.a.O.). Der Faktor GdNPF ist nachgewiesenermaßen ein sehr fähiger Inhibitor in bezug auf eine mit der Zelloberfläche assoziierten Serinprotease-Aktivität. Der Neuritenauswuchs aus normalen sensorischen Mäuse-Ganglien kann durch die Zugabe von Serinprotease-Inhibitoren, Ovomucoid-Trypsin-Inhibitor, Leupeptin, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor oder Thrombin gesteigert werden (Hawkins und Seeds, 1986, Ref. wie oben. Demgegenüber hat man festgestellt, daß Proteasen einen solchen Neuritenauswuchs hemmen. Ergebnisse aus ersten Studien zeigen, daß solche Proteasen eine thrombin- oder trypsinähnliche Aktivität aufweisen (Hawkins und Seeds, 1986, a.a.O.).
  • Auch andere Proteasen sind charakterisiert worden, wenngleich auch noch unbekannt ist, welche funktionelle Rolle diese für den Neuritenauswuchs spielen. Zu diesen Proteasen zählen ein urokinaseähnlicher Plasminogen-Aktivator sowie eine calciumabhängige Metalloprotease, die von sympathischen und sensorischen Ratten-Neuronen freigesetzt wird (Pittman, 1985, Dev. Biol. 110: 911-101). Die Metalloprotease, so hat man festgestellt, besitzt ein Molekulargewicht von 62 kD, erfordert 1 mM Ca²&spplus; für Calciumaktivität und baut natives und denaturiertes Collagen leichter ab als Casein, Albumin oder Fibronectin. Der Plasminogen-Aktivator besitzt, wie man festgestellt hat, ein Molekulargewicht von 51 kD und wurde durch gegen Human-Urokinase gebildetes Kaninchen-Antiserum ausgefällt. Er läßt sich in seine aktive Form von 32 kD umformen.
    • 2.3 Neuroblastom
  • Ein Neuroblastom entsteht aus dem Neuroektoderm und enthält anaplastische sympathische Ganglionzellen (behandelt in Pinkel und Howarth, 1985, in: Medical Oncology, Calabrese, P., Rosenberg, S.A., und Schein, P.S., Hrsg., MacMillan, NY, S. 1226-1257). Ein interessanter Aspekt in Verbindung mit Neuroblastomen ist der, daß diese eine der höchsten Raten spontaner Regression unter den beim Menschen auftretenden Tumoren aufweisen (Everson, 1964, Ann. NY Acad. Sci. 114: 721-735), und es besteht ein Zusammenhang zwischen dieser Regression und der Reifung gutartiger Ganglionneurome (Bolande, 1977, Am. J. Dis. Child. 122: 12-14). Neuroblastomzellen, so hat man festgestellt, behalten ihre Fähigkeit zur morphologischen Reifung in der Kultur bei. Die Tumore können überall entlang des Grenzstranges auftreten, wobei 50% dieser Tumore ihren Ursprung im Nebennierenmark haben.
  • Neuroblastome betreffen in erster Linie Kinder im Vorschulalter und sind mit einem Anteil von 6,5% an allen pädiatrischen Neoplasmen die häufigsten außerhalb des Schädels auftretenden soliden Tumore. Die Hälfte der Betroffenen ist zum Zeitpunkt der Diagnose jünger als 2 Jahre. Metastasen zeigen sich bei 60% der Patienten zum Zeitpunkt der Vorstellung und beziehen meist die Knochen, das Knochenmark, die Leber oder die Haut mit ein. Die auftretenden Symptome können in Verbindung stehen mit dem Primärtumor (Rückenmarks-Kompression, abdominale Anhäufung), mit Tochtergeschwulsten (Knochenschmerzen) oder metabolischen Auswirkungen von von dem Tumor ausgeschiedenen Substanzen wie Katecholaminen oder gefäßaktiven Polypeptiden (z. B. Hypertonie, Diarrhoe).
  • Experimentelle Belege zeigen, daß mit Neuroblastomen eine geänderte Reaktion auf den Neuritenwachstumsfaktor NGF einhergeht (Sonnenfeld und Ishii, 1982, J. Neurosci. Res. 8: 375-391). NGF stimulierte den Neuritenauswuchs in 50% der untersuchten Neublastomzellinien; die andere Hälfte der Zellinien sprach nicht darauf an. Jedoch konnte durch NGF in keiner der Neuroblastomzellinien die Wachstumsgeschwindigkeit reduziert oder das Weiterbestehen gefördert werden.
  • Derzeitige Therapien bei Neuroblastomen beinhalten chirurgische Eingriffe und/oder eine Chemotherapie. Eine Strahlentherapie kommt bei unvollständigen Tumorreaktionen auf eine chemotherapeutische Behandlung zur Anwendung. Die Überlebensrate bei Patienten mit örtlich begrenzten Tumoren liegt bei 70-100%, jedoch nur bei 20% im Falle von Patienten mit Tochtergeschwulsten, und dies selbst bei einer Vielstoff-Chemotherapie. Es hat den Anschein, daß die Prognosen für Patienten unter einem Jahr günstiger sind (70%) als für ältere Kinder.
    • 2.4 Glioblastom
  • Ein Glioblastom ist ein sehr bösartige Astrozyten-Tumor, der gewöhnlich in der Großhirnhemisphäre angesiedelt ist. Astrozyten scheinen ein förderliches Gewebe für Neuronen zu sein und umfassen die große Mehrheit der intraparenchymalen Hirnzellen (behandelt in Cutler, 1987, in: Scientific American Medicine V. 2, Rubenstein und Federman, Hrsg., Scientific American, Inc. NY, S. 1-7). Eine von dem National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke durchgeführte Umfrage ergab, daß in den Vereinigten Staaten die Häufigkeit primärer Hirntumore bei ungefähr 8 pro 100.000 liegt, wobei es sich bei 20% davon um Glioblastome handelt. Diese Tumore treten festgestelltermaßen im allgemeinen bei Personen zwischen 45 und 55 Jahren auf. Diese Tumore können auch mehrere Lappen betreffen und können in das Ventrikelsystem einbrechen oder sich über den Balken bis zu der gegenüberliegenden Hirnhälfte ausdehnen. Aufgrund des resultierenden Druckanstiegs im Inneren des Schädels gehören zu den mit dem Tumorwachstum einhergehenden Symptomen Kopfschmerzen, Übelkeit und Erbrechen, Wechsel des Geisteszustandes sowie Bewußtseinsstörungen. Wegen ihrer hochgradig invasiven Eigenschaften fallen die Prognosen für Glioblastome ungünstig aus. Chemotherapeutische Wirkstoffe oder Strahlentherapien können Anwendung finden. Im allgemeinen jedoch beträgt der Überlebenszeitraum der Patienten auch bei Anwendung dieser Therapien nicht länger als zwei Jahre.
    • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Gene und die von diesen codierten, das Wachstum von Neuriten steuernden Proteine sowie die therapeutischen und diagnostischen Einsatzmöglichkeiten dieser Proteine. Diese Proteine werden in der vorliegenden Unterlage Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren genannt. Zu den Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren dieser Erfindung zählen, in einer Verkörperung, mit dem Zentralnervensystem-Myelin in Verbindung stehende Proteine, die den Neuritenauswuchs hemmen und die in dieser Unterlage Neuritenwachstum-Inhibitorfaktoren bezeichnet werden. Eine andere Verkörperung dieser Erfindung betrifft Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren, bei denen es sich um Metalloproteasen handelt, die mit bösartigen Tumoren in Verbindung stehen, insbesondere mit solchen Tumoren, die im Gehirn Tochtergeschwulste bilden. Diese Metalloproteasen versetzen die bösartigen Zellen in die Lage, die hemmende ZNS-Umgebung zu überwinden und in große Bereiche des Hirns und des Rückenmarks einzudringen.
  • Die ZNS-Myelin-assoziierten Proteine hemmen den Neuritenauswuchs in Nervenzellen und Neuroblastomzellen und hemmen zudem die Ausbreitung von Fibroblasten und Melanomzellen. Diese inhibitorischen Proteine umfassen, ohne sich jedoch darauf zu beschränken, Proteine mit einem Molekulargewicht von 35.000 Dalton und 250.000 Dalton sowie Analoge, Derivate und Fragmente derselben. Die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine können im Rahmen der Behandlung von Patienten mit bösartigen Tumoren, so u. a. Melanomen und Nervengewebstumoren (z. B. Neuroblastom) eingesetzt werden. Das Fehlen der mylein-assoziierten Inhibitorproteine kann ein Anzeichen für das Vorhandensein eines bösartigen Tumors wie z. B. eines ins Gehirn metastasierenden Tumors (z. B. Glioblastom) sein. Die hier beschriebene Erfindung setzt ferner Antagonisten der ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine ein - einschließlich, ohne sich jedoch darauf zu beschränken, Antikörper, d. h. die Antikörper IN-1 oder IN-2. Diese Antikörper können zur Neutralisierung der das Neuritenwachstum hemmenden Faktoren eingesetzt werden zum Zwecke einer regenerativen Instandsetzung nach einem Trauma, nach Degeneration oder nach einer Entzündung. In einer weiteren spezifischen Verkörperung kann der monoklonale Antikörper IN-1 eingesetzt werden, um die Regeneration von Nervenfasern über lange Strecken nach einer Rückenmarksschädigung zu fördern.
  • Diese Erfindung betrifft desweiteren Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Rezeptoren und Fragmente derselben sowie die für diese Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Rezeptoren und Fragmente codierenden Nukleinsäuresequenzen und deren Einsatzmöglichkeiten zu therapeutischen und diagnostischen Zwecken. Auch Substanzen, die entweder als Agonisten oder Antagonisten in bezug auf Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Rezeptoren fungieren, sind vorstellbar und sind in dem Umfang der hier beschriebenen Erfindung enthalten.
  • Die Metalloproteasen dieser Erfindung können in Verbindung mit bösartigen Tumoren auftreten, insbesondere mit solchen, die zur Metastasierung ins Gehirn fähig sind. In einer speziellen Verkörperung steht die Metalloprotease mit Membranen von Glioblastomzellen in Verbindung. Die Metalloproteasen sowie Analoge, Derivate und Fragmente derselben, können im Rahmen der Behandlung einer Nervenschädigung infolge eines Traumas, eines Schlags, degenerativer Störungen des zentralen Nervensystems usw. von Bedeutung sein. In einer anderen Verkörperung dieser Erfindung kann die Metalloprotease in Kombination mit Antikörpern gegen die das Neuritenwachstum hemmenden Faktoren zur Behandlung von Nervenschäden eingesetzt werden.
  • Die hier beschriebene Erfindung betrifft ferner Inhibitoren von und/oder Antikörper gegen die Metalloproteasen dieser Erfindung. Derartige Inhibitoren und/oder Antikörper können zur Diagnose und/oder Behandlung von bösartigen Tumoren eingesetzt werden, so z. B. von solchen Tumoren, die ins Gehirn metastasieren können, einschießlich
  • - jedoch nicht ausschließlich - Glioblastomen. Alternativ können die Metalloprotease-Inhibitoren in Kombination mit ZNS-Myelin-assoziiertem Inhibitorprotein oder Analogen, Derivaten oder Fragmenten desselben zur Behandlung und/oder Diagnose von bösartigen Tumoren eingesetzt werden, so u. a. von Glioblastomen, Neuroblastomen und Melanomen.
    • 3.1 Definitionen
  • In dieser Unterlage haben die nachstehenden Begriffe die nachgenannte Bedeutung:
  • BSA Rinderserumalbumin ("bovine serum albumin")
  • cbz-tyr-tyr Carbobenzoxy-tyrosin-tyrosin
  • cbz-gly-phe-NH&sub2; Carbobenzoxy-glycin-phenylalanin-amid
  • cbz-ala-phe-NH&sub2; Carbobenzoxy-alanin-phenylalanin-amid
  • cbz-phe-phe-NH&sub2; Carbobenzoxy-phenylalanin-phenylalaninamid
  • cbz-gly-phe-phe-NH&sub2; Carbobenzoxy-phenylalanin-phenylalaninamid
  • ZNS Zentralnervensystem
  • CST Corticospinaltrakt
  • DMEM "Dulbecco's Modified Minimum Essential Media" (Dulbeccos modifizierte essentielle Mindestmedien)
  • EDTA Ethylendiamin-tetracetat
  • EGTA Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetracetat
  • FCS Kälberfötus-Serum ("fetal calf serum")
  • FITC Fluorescein-isothiocyanat
  • GdNPF von der Glia abgeleiteter Neurit-Beschleunigungsfaktor ("glial-derived neurite promoting factor")
  • GFAP gliales fibrilläres saures Protein ("glial fibrillary acid protein")
  • HBO stark verästelter Oligodendrozyt ("highly branched oligodendrocyte")
  • Hepes N-²-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
  • IN-1 ein monoklonaler Antikörper gegen gelgereinigtes ZNS-Myelin-assoziiertes 250-kD-Inhibitorprotein
  • IN-2 ein monoklonaler Antikörper gegen gelgereinigtes ZNS-Myelin-assoziiertes 35-kD-Inhibitorprotein
  • J1 ein Zelladhäsionsmolekül mit einem Molekulargewicht von 160-180 kD
  • kD Kilodalton
  • mAk monoklonaler Antikörper
  • MW Molekulargewicht
  • N-CAM Nervenzellenadhäsionsmolekül
  • NGF Nervenwachstumsfaktor ("nerve growth factor")
  • Neuritenwachstum-Regulatorfaktor ZNS-Myelin-assoziierte 35-kD- und 250-kD-Inhibitorproteine sowie eine glioblastomzellmembran-assoziierte Metalloprotease
  • PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung ("phosphate buffered saline")
  • PLYS Poly-D-lysin
  • PNS peripheres Nervensystem
  • PORN Polyornithin
  • SCG Ganglion cervicale superius ("superior cervical ganglion")
  • SDS-PAGE Natrium-dodecylsulfat-
  • Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
    • 4. BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN ABBILDUNG 1
  • Neuronen sympathischer Zellen (a-d) oder Neuronen von Retinazellen (e), plattiert auf Kulturen von Sehnerven-Gliazellen, zeigen eine nichtpermissive Substratwirkung von stark verästelten Oligodendrozyten und das Fehlen einer solchen Wirkung in unreifen Oligodendrozyten. Die Abbildungen 1a, c, e, g zeigen Phasenkontrastbilder. Die Abbildungen 1b, d, f zeigen Immunofluoreszenz mit Antikörper O&sub4;. Die Abbildung 1h zeigt Immunofluoreszenz mit Antikörper O&sub1;.
  • Die Abbildungen 1a und 1b zeigen "Fenster" (neuritenfreie Bereiche), die durch stark verästelte Oligodendrozyten (10 Tage alte Sehnerven, 18 Tage im Reagenzglas) in dem Neuritenplexus von Sympathikus-Neuronen gebildet werden (a: 8 Tage im Reagenzglas; b: 4 Tage im Reagenzglas). Vergrößerung: x 120. In Abbildung 1b ist ein seine Richtung ändernder Neurit zu sehen (Pfeilspitze). Auch Schwann-Zellen meiden den Oligodendrozyten.
  • Die Abbildungen 1c und 1d zeigen Antikörper-O&sub4;-positive Oligodendrozyten (aus 10 Tage alten Sehnerven, 7 Tage im Reagenzglas), umgeben von einem Geflecht von Neuriten sympathischer Zellen (5 Tage im Reagenzglas). Vergrößerung: x 220. Neuriten "umschlingen" typischerweise die Oligodendrozyten. Das gelegentliche Überspannen nichtpermissiver Oligodendrozyten durch Neuritenbündel tritt als Folgeereignis auf.
  • Die Abbildungen 1e und 1f zeigen, daß Antikörper-O&sub4;-positive Zellen mit der typischen Morphologie von unreifen Oligodendrozyten permissiv wirken für Neuriten von sympathischen Zellen (Pfeilspitzen) (5 Tage im Reagenzglas). Vergrößerung: x 380.
  • Die Abbildungen 1g und 1h zeigen, daß E-20-Ratten-Retinazellen (2 Tage im Reagenzglas) keine Neuriten an stark verästelten Antikörper-O&sub4;positiven Oligodendrozyten anheften oder wachsen lassen. Vergrößerung: x200.
    • ABBILDUNG 2. A, B
  • Histogramme, die die Häufigkeit der Wechselwirkungen/Überlappung von sympathischen Neuriten und Schwann-Zellen mit stark verästelten (A) oder unreifen (B) Oligodendrozyten zeigen. Gliazellen aus 8 bis 10 Tage alten Sehnerven (2 Tage im Reagenzglas) wurden zusammen mit zerlegten Neuronen des Ganglion cervicale superius für weitere 2 Tage kultiviert und anschließend mit Antikörper O&sub4; gefärbt. Oligodendrozyten wurden nach ihrer Morphologie auf codierten Fluoreszenzbildern klassifiziert. In Phasenkontrastbildern wurde die mit Neuriten und Schwann-Zellen in Kontakt befindliche Teilfläche bestimmt und einer von 3 Kategorien zugeordnet: bis zu 20%, 20 bis 80% oder über 80% mit Neuriten oder Schwann-Zellen bedeckte Oligodendrozyten-Fläche. Die angegebenen Werte stehen für die Häufigkeit von Zellen in 3 Kategorien Standardabweichung des Mittelwertes (4 Kulturen; 70 bis 130 systematisch als Probe entnommene Zellen pro Kultur).
    • C, D
  • Histogramme, die die Wechselwirkung von Retinazellen mit stark verästelten (C) oder unreifen (D) Oligodendrozyten zeigen. Gliakulturen aus Sehnerven von ausgewachsenen Ratten (6-11 Tage im Reagenzglas) wurden 1 bis 5 Tage lang zusammen mit Retinazellen von Rattenembryonen kultiviert. Mit Antikörper O&sub4; gefärbte Oligodendrozyten wurden morphologisch klassifiziert, und die von jedem Oligodendrozyten belegte Gesamtfläche sowie die von Retinazellen belegte Teilfläche wurden durch Messung mit Hilfe eines Graphiktabletts bestimmt. n = 109.
    • ABBILDUNG 3
  • Astrozyten stellen ein adhäsives Substrat für Neuronen und Neuriten dar.
  • Die Abbildungen 3a und 3b zeigen Neuriten sympathischer Zellen (13 Tage im Reagenzglas), die auf reaktivem protoplasmatischem Astrozyten wachsen (Pfeil in a); GFAP-positiv (b): aus 10 Tage altem Ratten-Sehnerv; 23 Tage im Reagenzglas. Vergrößerung: x 220.
  • Die Abbildungen 3c und 3d zeigen Retinazellen (von E17-Retinazellen, 2 Tage im Reagenzglas), die an Astrozyten anhaften (GFAP-positiv, Abbildung 3d; von 10 Tage altem Sehnerv, 9 Tage im Reagenzglas) mit langen und mit kurzen (Pfeil) Fortsätzen. Vergrößerung: x 400.
    • ABBILDUNG 4. a, b
  • Stark verästelte Oligodendrozyten (O&sub4;-positiv) wirken nicht permissiv für eine Anheftung und einen Faserauswuchs von NB-2A-Neuroblastomzellen. NB-2A-Zellen wurden 24 Stunden lang auf Sehnerven-Gliazellen (6 Tage alte Ratten-Sehnerven, 3 Tage in Kultur) kultiviert und mittels GdNPF für Neuritenauswuchs stimuliert (Guenther u. a., 1985, EMBO J. 4 1963-1966). An Oligodendrozyten angrenzende NB-2A-Zellen (kurze Pfeile) zeigen einen asymmetrischen Auswuchs; entfernte Zellen (lange Pfeile) zeigen einen Auswuchs in Zufallsausrichtung. Vergrößerung: x 260.
    • c-f
  • 3T3-Fibroblasten, ausgestrichen in hoher Zelldichte auf Sehnerven-Gliakulturen, zeigen eine nichtpermissive Substratwirkung von stark verästelten Oligodendrozyten (c, e). Der Oligodendrocyt in den Abbildungen 4c und d weist große Membranbereiche auf, die sein Fortsatzgeflecht verbinden. Ein unreifer Oligodendrozyt (e, f: Pfeil; O&sub4;-positiv, unregelmäßige Morphologie) ist von sich ausbreitenden Fibroblasten überwuchert. 10 Tage (c, d) und 12 Tage (e, f) alte Sehnerven, 2 Tage im Reagenzglas; 3T3 waren seit 3 Stunden hinzugefügt. d, f: O&sub4;-Färbung. c, d: 300fache Vergrößerung; e, f: 250fache Vergrößerung.
    • ABBILDUNG 5
  • Ausrichtung eines Neuroblastomfortsatz-Auswuchses im Verhältnis zu stark verästelten Oligodendrozyten. Sehnerven-Gliazellen (2 oder 6 Tage im Reagenzglas) wurden zusammen mit NB-2A-Zellen 24 Stunden lang in Gegenwart von GdNPF oder Dibutyryl-cAMP kultiviert. Es wurden regelmäßig Proben von Antikörper-O&sub4;-positiven stark verästelten Oligodendrozyten entnommen, und benachbarte Neuroblastomzellen wurden als angrenzend klassifiziert, wenn sich die Entfernung zwischen dem Rand des Oligondendrozytenfortsatz-Netzwerks und dem Neuroblastomzellkörper auf weniger als der zweifache Zellkörperdurchmesser belief. In größerem Abstand gelegene Neuroblastomzellen wurden als entfernt klassifiziert. Neuroblastomfortsätze wurden vier Sektoren zugeordnet (1-4) in Abhängigkeit von ihrer Ausrichtung in bezug auf den nächsten Oligodendrozyten, wie dargestellt. Die in Tabelle IA (Abschnitt 6.2.3.3) angegebenen Werte entsprechen dem Durchschnittswert der Standardabweichung des Mittelwertes aus 3 Experimenten (60-100 Neuriten aus 3 Kulturen je Experiment). * p < 0,05; *** p < 0,001.
    • ABBILDUNG 6
  • Histogramme, die die Überlappung von 3T3-Zellen mit stark verästelten (A) oder unreifen (B) Oligodendrozyten zeigen. 3T3-Zellen wurden 3 bis 4 Stunden lang zusammen kultiviert auf Sehnerven-Gliazellen in hoher Zelldichte, und die Kulturen wurden fixiert und mit Antikörper O&sub4; gefärbt. Es wurden systematisch Proben von Oligodendrozyten entnommen, Einstufungen in stark verästelte und unreife Oligodendrozyten vorgenommen, und die Überlappung der Oligodendrozyten mit 3T3-Zellen unter Berücksichtigung der drei angegebenen Kategorien bestimmt. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert der Standardabweichung des Mittelwerts aus vier Experimenten (70-170 Zellen).
    • ABBILDUNG 7
  • Hemmung des Neuritenauswuchses durch Verwendung von ZNS-Myelin als Substrat. Neuronen sympathischer Zellen (aus 1 Tag alten Ganglion cervicale superius von der Ratte), 26 Stunden lang kultiviert in Gegenwart von 100 ng/ml NGF in einer mit Poly-D-lysin (PLYS) überzogenen Kulturschale, in deren Mitte Punkte von ZNS- oder PNS-Myelin aufgebracht waren. ZNS-Myelin (a, c) hemmt den Neuritenauswuchs in starkem Maße; PNS-Myelin (b, d) ist ein permissives Substrat. In den Abbildungen c und d ist die Grenzlinie einer Myelininsel auf der PLYS-Schicht dargestellt. Vergrößerung: x 75.
    • ABBILDUNG 8
  • Nichtpermissive Substratwirkungen von ZNS-Myelin, nicht jedoch von PNS-Myelin, für den Neuritenauswuchs aus Neuroblastomzellen (A) und für 3T3-Zell-Vermehrung (B).
  • Die Abbildung 8A zeigt Neuroblastomzellen, die 5 Stunden lang in Gegenwart von 2 mM Dibutyryl-cyclo-AMP auf PLYS (einfarbige Felder), mit ZNS-Myelin bedecktem PLYS (schraffierte Felder) oder mit PNS-Myelin überdecktem PLYS (leere Felder) kultiviert worden waren. Die Zellen wurden klassifiziert in runde Zellen, feine Füßchen oder einen kurzen Fortsatz tragende Zellen oder Zellen mit Fortsätzen mit einer Länge von über einem Zelldurchmesser. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert der Standardabweichung des Mittelwerts aus 3 Kulturen (250-450 Zellen pro Kultur).
  • Die Abbildung 8B zeigt 3T3-Zellen, kultiviert für die Dauer von 1 Stunde auf PLYS, mit ZNS-Myelin bedecktem PLYS oder mit PNS-Myelin bedecktem PLYS. Die Zellen wurden in runde Zellen, feine Füßchen oder kurze Fortsätze tragende Zellen oder große flache Zellen eingeteilt. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert der Standardabweichung des Mittelwerts aus 3 Kulturen (300-400 Zellen pro Kultur).
    • ABBILDUNG 9
  • C6-Zellen, nicht jedoch 3T3-Zellen, infiltrieren Sehnerven-Explantate. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von 10 um starken Gefrierschnitten von Ratten-Sehnerven-Explantaten (a, b) bzw. Ratten-Ischiasnerven-Explantaten (c, d) nach 2-wöchiger Inkubation mit C6-Zellen (A, b) oder 3T3-Zellen (b, d). Die Zellen wurden einer Spitze der Explantate hinzugefügt. Infiltrierte Zellen sind nach Färbung mit Cresylviolett in beiden Ischiasnerven (c, d), im Falle der C6-Zellen jedoch nur in dem Sehnerv (a) zu sehen. Pfeile in (b) verweisen auf wenige an Blutgefäße angrenzende 3T3-Zellen. Streifen, 0,2 mm.
    • ABBILDUNG 10
  • C6-Zellen, nicht jedoch 3T3- oder B16-Zellen, koppeln an der weißen Gehirnsubstanz des ZNS von Gefrierschnitten von Ratten-Kleinhirnen an und breiten sich auf dieser aus. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von gefrorenen Ratten-Kleinhirnschnitten (25 um), auf denen C6-Zellen (a, b), 3T3-Zellen (c, d) oder B16-Zellen (e) 2 Tage lang kultiviert worden waren. Ein klarer Unterschied auf der weißen Substanz (wm - "white matter") zeigt sich für 3T3- und B16-Zellen im Vergleich zu C6-Zellen. gl - granuläre Schicht ("granular layer"); ml: molekulare Schicht ("molecular layer"). Graue Substanz setzt sich aus granulärer Schicht und molekularer Schicht zusammen. Streifen, 0,3 mm.
    • ABBILDUNG 11
  • C6-Zellen überwinden die inhibitorischen Substrateigenschaften von ZNS-Myelin. Ausbreitung von C6-Zellen (a), 3T3-Zellen (b) und B16-Zellen (c) auf PLYS oder ZNS-Myelin. Die Ausbreitung wird berechnet wie in Abschnitt 9.1.3 beschrieben anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen. 0% Ausbreitung: runde Zellen; 100-%ige Ausbreitung wurde als der Mittelwert nach 300 Minuten angesetzt.
    • ABBILDUNG 12
  • 1,10-Phenantrolin hemmt die Ausbreitung von C6-Zellen speziell auf ZNS-Mydin. C6-Zellen wurden 3 Stunden lang auf den angegebenen Substraten in Gegenwart von steigenden Dosen von 1,10-Phenanthrolin kultiviert. Die Ausbreitung wurde durch geringe Dosen ausschließlich auf ZNS-Myelin gehemmt. 1,10-Phenanthrolin- Konzentrationen über 0,5 mM üben eine allgemein toxische Wirkung auf alle Substrate aus. Die Quantifizierung der Ausbreitung erfolgte wie in Abbildung 11 angegeben.
    • ABBILDUNG 13
  • Der Abbau von inhibitorischem ZNS-Substrat durch C6-Plasmamembranen spricht auf 1,10-Phenanthrolin an. Die Ausbreitung von 3T3-Zellen auf ZNS-Myelin wurde durch Vorbehandlung von Myelin mit C6-Plasmamembranen induziert. 1,10-Phenanthrolin hob diese Wirkung auf. Gezeigt werden Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von 3T3-Zellen auf Polylysin (PLYS) (a), auf ZNS-Myelin (b), auf ZNS-Myelin nach Vorbehandlung mit C6-Plasmamembranen und auf ZNS-Myelin nach Vorbehandlung mit C6-Plasmamembranen (C6-PM) in Gegenwart von 1,10-Phenanthrolin.
    • ABBILDUNG 14
  • C6-Zellanheftung und -Zellausbreitung auf weißer Gehirnsubstanz des ZNS von Gefrierschnitten von Ratten-Kleinhirn werden mit Metalloprotease-Blockern unterbunden. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von C6-Zellen auf gefrorenen Ratten-Kleinhirnschnitten, kultiviert in Gegenwart von entweder 0,1 mM cbz-ala-phe (Aa) oder 0,1 mM cbz-tyr-tyr (b). Die Hemmung der Anheftung und Ausbreitung ist besonders augenscheinlich in der Mitte der weißen Substanz (Sternchen), jedoch ebenso erkennbar in den Hauptästen der weißen Substanz (Pfeile).
    • ABBILDUNG 15
  • Die Infiltration von ZNS-Explantaten durch C6-Zellen wird durch cbz-tyr-tyr unterbunden. Zellen wurden einer Spitze von Sehnerven-Explantaten hinzugefügt (Raumkulturen); in Gegenwart des Metalloprotease-Inhibitors cbz-tyr-tyr oder des Steuerungspeptids cbz-ala-phe wurden 14 Tage alte Kulturen quantifiziert. Infiltrierte Zellen wurden in den ersten 1,3 mm der Explantate ausgezählt. Jede Spalte steht für eine Zahl infiltrierter Zellen je 0,1 mm. Nur der genau in der Mitte liegende Teil der Explantate wurde betrachtet (0,25 mm). Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert der Standardabweichung des Mittelwerts aus zwei Versuchsreihen bei insgesamt 8 Explantaten.
    • ABBILDUNG 16
  • Tumor von Antikörper ausscheidenden IN-1-Hybridomzellen von der Maus im Cortex einer 8 Tage alten Ratte. 1 Mio. Zellen (in 2 ul) wurden zwei Tage nach der Geburt (P2) injiziert; (a) ein Cresylviolett-gefärbter Gefrierschnitt (15 ul) zeigt einen gut begrenzten, kompakten Tumor (Pfeil); (b) Antikörperproduktion, dargestellt durch Immunofluorszenz mit Anti-Maus-Ig-FITC. Tumor- und umgebendes Gewebe bis zum Seitenventrikel (kleiner Pfeil) sind stark gefärbt (an a angrenzender Schnitt). Die Ratte wurde fixiert durch Perfusion mit 4% Formaldehyd in Phosphatpuffer. Vergrößerung: x 6,4.
    • ABBILDUNG 17
  • Markierte Corticospinaltrakt-(CST-)Fasern zeigen sich weit entfernt von Rückenmarksläsionen in 4 mit In-1 behandelten Ratten (oben), nicht jedoch in 4 mit Anti-HRP behandelten Kontrolltieren (unten). Zeichenprisma-Zeichnungen von Rückenmarks-Längsschnitten (75 u Gesamtdicke, 3 überlagerte 25-u-Schnitte) zeigen Markierungsmuster von CST-Fasern, markiert durch anterograden Transport von WGA-HRP. Eine Elongation von Regenerations-CST-Fasern über eine weite Strecke liegt in den mit IN-1 behandelten Ratten vor. Der Pfeil verweist auf Läsionsstellen, die manchmal kleine Kavernen umfassen, die mit dem Zentralkanal verbunden sind. r: rostral (zum vorderen Ende hin gelegen); c: caudal (zum hinteren Ende hin gelegen).
  • ABBILDUNG 18. Dunkelfeldmikroskopische Aufnahmen von Rückenmark-Längsschnitten einer IN-behandelten (a-d) und einer Anti-HRP-behandelten Ratte (e-g). Stark vergrößerte mikroskopische Aufnahmen zeigen den dicht markierten Corticospinaltrakt mit einer breiten "aussprießenden" Zone zum vorderen Ende der Läsion hin gelegen (bund f). Eine spezifische Markierung mit hoher Auflösung (Pfeile) ist unmittelbar zum hinteren Ende der Läsion hin bei beiden Tieren zu sehen (b, f). Eine Markierung kommt auch weiter entfernt (ca. 7 mm) in dem IN-behandelten Rückenmark vor (c, d). Demgegenüber war eine solche Markierung nicht erkennbar in der mit Anti-HRP behandelten Ratte (g.). Große weiße Punkte (Kristalle) in allen Schnitten stellen Reaktionsprodukt in Blutgefäßen dar, immer vorherrschend in Material, das nach diesem hochsensiblen Verfahren behandelt worden ist. c: caudal; L: Läsion; r: rostral.
  • Vergrößerung: a, e: x 14; b, f, g: x 70; c, d: x 140.
    • 5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Gene und die von diesen codierten Proteine, die den Neuritenauswuchs regulieren, sowie die diagnostischen und therapeutischen Verwendungsmöglichkeiten dieser Proteine. Zu den Proteinen dieser Erfindung (hier "Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren" genannt) zählen mit dem Zentralnervensystem-Myelin in Verbindung stehende Proteine mit starken nichtpermissiven Substrateigenschaften, hier "Neuritenwachstum-Inhibitorfaktoren" genannt. Die Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren umfassen auch Metalloproteasen, die in Verbindung mit bösartigen Tumoren vorzufinden sind, insbesondere mit solchen Tumoren, die ins Gehirn metastasieren.
  • Die ZNS-Myelin-assoziierten Proteine dieser Erfindung hemmen den Neuritenauswuchs in Nervenzellen oder Neuroblastomzellen. Das Protein kann ebenso die Fibroblastenvermehrung und -wanderung hemmen. Diese Inhibitorproteine sind aktive Kreuz-Spezies ("crossspecies") und können im Rahmen der Behandlung von Patienten mit bösartigen Tumoren einschließlich - ohne sich jedoch darauf zu beschränken - Melanomem und Tumoren des Nervengewebes (z. B. Neuroblastomen) eingesetzt werden. In einer speziellen Verkörperung dieser Erfindung werden ein ZNS-Myelin-assoziiertes 35-Kilodalton-Protein und ein ZNS-Myelin-assoziiertes 250-Kilodalton-Protein beschrieben.
  • Diese Erfindung betrifft ferner gegen die ZNS-Myelin-assoziierten Proteine gerichtete Antikörper sowie deren therapeutische und diagnostische Einsatzmöglichkeiten. Diese Antikörper können im Rahmen der Behandlung von Nervenschäden infolge z. B. eines Traumas (z. B. Rückenmarksverletzungen), eines Schlags, von degenerativen Störungen des zentralen Nervensystems, usw. eingesetzt werden. Antikörper, die gegen die ZNS-Myelin-assoziierten Proteine gerichtet sind, können insbesondere zur Förderung der Regeneration von Nervenfasern eingesetzt werden. In einer speziellen Verkörperung dieser Erfindung kann der monoklonale Antikörper IN-1 eingesetzt werden, um die Regeneration von Nervenfasern über lange Strecken nach einer Rückenmarksschädigung zu fördern.
  • Diese Erfindung betrifft desweiteren Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Rezeptoren und Peptidfragmente derselben sowie die für Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Rezeptoren und Peptidfragmente derselben codierenden Nucleinsäuresequenzen sowie deren therapeutische und diagnostische Einsatzmöglichkeiten. Ebenso ins Auge gefaßt sind gegen Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Rezeptoren gerichtete Antikörper, die somit Teil des Umfangs dieser Erfindung sind.
  • Diese Erfindung betrifft außerdem mit bösartigen Tumoren, insbesondere mit solchen, die ins Gehirn metastasieren, assoziierte Metalloproteasen. In einer speziellen Verkörperung steht die Metalloprotease in Verbindung mit Glioblastomzellen. Die Metalloproteasen dieser Erfindung sehen in Verbindung mit der ZNS-Infiltrationsaktivität maligner Zellen und können die inhibitorischen Substrateigenschaften der ZNS-Myelin-assoziierten Proteine neutralisieren. Die Metalloproteasen können im Rahmen der Behandlung von Nervenschäden wie z. B. solchen, die als Folge einer traumatischen Verletzung (z. B. Rückenmarksschädigungen), eines Schlags, degenerativer Störungen des zentralen Nervensystems, usw. eintreten, von therapeutischem Nutzen sein. Alternativ kann die Metalloprotease in Kombination mit Antikörpern gegen myelinassoziierte Inhibitorproteine zur Behandlung von Nervenschäden eingesetzt werden.
  • Diese Erfindung betrifft desweiteren Inhibitoren dieser Metalloproteasen. Solche Inhibitoren können die Ausbreitung und Infiltration von bösartigen Zellen unterbinden und können im Rahmen der Behandlung von bösartigen Tumoren (z. B. Glioblastomen) eingesetzt werden. In einer spezifischen Verkörperung dieser Erfindung können die Metalloprotease-Inhibitorproteine in Kombination mit ZNS-Myelin-assoziierten Proteinen wie z. B. dem mit einem Molekulargewicht von 35.000 Dalton und/oder dem mit einem Molekulargewicht von 250.000 Dalton oder humanen funktionellen Äquivalenten derselben zur Diagnose und/oder Behandlung von bösartigen Tumoren eingesetzt werden, so u. a. von Glioblastomen, Neuroblastomen und Melanomen.
  • Das Verfahren dieser Erfindung kann - einzig zu Zwecken der Beschreibung - in die nachgenannten Schritte unterteilt werden: (1) Isolierung und Reinigung (Purifikation) von Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren; (2) Charakterisierung von Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren; (3) molekulare Klonierung von Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren codierenden Genen oder Genfragmenten; (4) Produktion von gegen Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren gerichteten Antikörpern; und (5) Erzeugung von mit Neuritenwachstum-Regulatorfaktor zusammenhängenden Derivaten, Analogen und Peptiden. Das Verfahren umfaßt außerdem die Einsatzmöglichkeiten von Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren und gegen diese gerichteten Antikörpern zu therapeutischen und diagnostischen Zwecken.
    • 5.1 Isolierung und Reinigung von Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren
  • Diese Erfindung betrifft ZNS-Myelin-assoziierte Inhibitorproteine von Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren, Rezeptoren von ZNS-Myelinassoziierten Inhibitorproteinen von Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren sowie Metalloproteasen wie z. B. diejenige, die mit Membranen von Glioblastomzellen in Verbindung stehen. Die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine dieser Erfindung können isoliert werden durch Isolierung von Myelin und anschließender Reinigung daraus. Gleichermaßen kann die Metalloprotease durch Isolierung aus Säuger-Glioblastomzellen gewonnen werden. Anwendbare Isolierungsverfahren werden in den nachfolgenden Abschnitten noch ausführlich beschrieben. Alternativ ist es möglich, die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine oder die Metalloprotease aus einem rekombinanten Expressionssystem zu gewinnen (siehe Abschnitt 5.3). Verfahren zur Isolierung und Reinigung (Purifikation) von Rezeptoren für die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine sind in Abschnitt 5.1.2 beschrieben.
    • 5.1.1 Isolierung und Reinigung von ZNS-assoziierten Inhibitorproteinen
  • ZNS-Myelin-assoziierte Inhibitorproteine können aus dem ZNS-Myelin höherer Vertebraten einschließlich - ohne sich jedoch darauf zu beschränken - Vögeln und Säugern, gewonnen werden. Myelin kann aus dem Sehnerv oder aus dem Zentralnervensystemgewebe, das u. a. das Rückenmark sowie Hirnstämme umfaßt, gewonnen werden. Das Gewebe kann anhand von Verfahren homogenisiert werden, die in diesem Wissenszweig beschrieben (Colman u. a., 1982, J. Cell Biol. 95: 598-608). Die Myelinfraktion kann anschließend ebenso anhand von beschriebenen Verfahren isoliert werden (Colman u. a., 1982, a.a.O.).
  • In einer Ausführungsart dieser Erfindung können die ZNS-Myelinassoziierten Inhibitorproteine in einem Detergens solubilisiert werden (z. B. in Nonidet P-40TM, Natriumdeoxycholat). Die solubilisierten Proteine können anschließend anhand verschiedener auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren gereinigt werden, so u. a. durch Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Klassierchromatographie), Zentrifugation, Elektrophorese-Verfahren, Differential-Löslichkeit oder anhand einer anderen Standardtechnik zur Reinigung von Proteinen (siehe z. B. Caroni und Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106: 1281).
  • Alternativ können die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine unter Anwendung von immunologischen Verfahren isoliert und gereinigt werden. So können beispielsweise in einer Verkörperung dieser Erfindung die Proteine zunächst mit einem Detergens (z. B. Nonidet P-40TM, Natriumdeoxycholat) gelöst werden. Anschließend können die Proteine durch Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen das 35-Kilodaltonund/oder 250-Kilodalton-Protein isoliert werden. Alternativ können die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine mit Hilfe der Immunaffinitätschromatographie isoliert werden, bei der die Proteine in gelöster Form durch eine Antikörper-Säule geschickt werden.
    • 5.1.2 Isolierung und Reinigung von Rezeptoren für die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine
  • Rezeptoren für die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine können aus Zellen isoliert werden, deren Anheftung, Verbreitung, Wachstum und/oder Beweglichkeit durch die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine gehemmt werden. Zu diesen Zellen zählen u. a. Fibroblasten und Neuronen. In einer bevorzugten Ausführungsart werden Fibroblasten als Quelle für die Isolierung und Reinigung der Rezeptoren verwendet.
  • In einer Verkörperung können Rezeptoren für ZNS-Myelinassoziierte Inhibitorproteine mittels Affinitätschromatographie von Fibroblastenzellextrakten isoliert werden, in denen ein Myelin-assoziiertes Inhibitorprotein oder ein Peptidfragment eines solchen auf einem festen Träger immobilisiert ist.
    • 5.1.3 Isolierung und Reinigung von mit bösartigen Tumoren verbundenen Metalloproteasen
  • Die Metalloproteasen dieser Erfindung können aus Zellen bösartiger Tumore isoliert werden, insbesondere von solchen Tumoren, die ins Gehirn metastasieren können. In einer bevorzugten Ausführungsart kann eine Metalloprotease aus Säuger-Glioblastomzellen isoliert werden. In einem bevorzugten Verfahren wird die Metalloprotease aus der Plasmamembranfraktion solcher Zellen isoliert. Die Zellen können durch Aufspaltung und Homogenisierung von Tumoren anhand von auf diesem Fachgebiet bekannten Verfahren oder aus Tumorzellinien gewonnen werden. Plasmamembranfraktionen können anhand von Verfahren, die auf diesem Gebiet bekannt sind, gewonnen werden, z. B. mittels Gradienten-Zentrifugation (Quigley, 1976, J. Cell Biol. 71: 472-486). Die Metalloprotease kann aus den Membranen durch Auflösung mit einem leicht ionischen oder nicht-ionischen Detergens (z. B. Deoxycholat, Nonidet P-40TM, TritonTM, Br&ijlig;TM) anhand von einschlägig beschriebenen Verfahren (abgehandelt in Cooper, 1977, in: Tools of Biochemistry, John Wiley & Sons, NY, S. 355-406) isoliert werden.
  • Die Reinigung der Metalloprotease kann anhand von bekannten Verfahren durchgeführt werden, so u. a. mittels chromatographischer Verfahren (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts-, Klassiersäulenchromatographie), Zentrifugation, Elektrophoreseverfahren, Differential-Löslichkeit oder anhand eines anderen Standardverfahrens zur Proteinreinigung.
    • 5.2 Charakterisierung von Proteinen
  • Die Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren dieser Erfindung können anhand von Tests ausgehend von ihren physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften analysiert werden. Die Halbwertszeit der Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren in kultivierten Zellen kann beispielsweise untersucht werden durch Einsatz von Cycloheximid, einem Proteinsynthese-Inhibitor (Vasquez, 1974, FEBS Lett. 40: 563-584). In anderen Experimenten könnte ein physiologischer Rezeptor für einen Neuritenwachstum-Regulatorfaktor anhand von Tests identifiziert werden, die eine Komplexbildung mit einem Neuritenwachstum-Regulatorfaktor nachweisen, z. B. mittels einer Säulenchromagraphie mit immobilisiertem Neuritenwachstum-Regulatorfaktor, Ankopplung an einen markierten Neuritenwachstum-Regulatorfaktor mit anschließender Quervernetzung und Immunpräzipitation, usw.
  • Elektrophoreseverfahren wie z. B. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und zweidimensionale Elektrophorese können angewandt werden, um die Proteinstruktur zu untersuchen. Andere anwendbaren Verfahren sind u. a. Peptidkartierung, isoelektrische Fokussierung und chromatographische Verfahren.
  • Die Aminosäuresequenzen von primären myelin-assoziierten Inhibitoren oder der Metalloprotease können durch Ableitung aus der DNA-Sequenz, soweit verfügbar, gewonnen werden, oder alternativ durch direkte DNA-Sequenzanalyse des Proteins, z. B. mit Hilfe eines automatisierten Aminosäuresequenzanalysegeräts. Die Proteinsequenzen können weiter bestimmt werden durch eine Hydrophilität-Analyse (Hopp und Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828). Ein Hydrophilitätsprofil kann herangezogen werden, um die hydrophoben und hydrophilen Bereiche des Proteins (und der entsprechenden Regionen der Gensequenz, soweit verfügbar, die für diese Bereiche codiert) zu identifizieren.
  • Sekundäre Strukturanalysen (Chou und Fasman, 1974, Biochemistry 13: 222) können ebenso durchgeführt werden, um Bereiche der ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitor- oder Glioblastom-Metalloproteasesequenz zu identifizieren, die bestimmte Sekundärstrukturen annehmen. Andere Strukuranalyseverfahren können ebenso angewandt werden. Hierzu zählen u. a. Röntgenstrahl-Kristallographie (Engstom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13) und Rechner-Modellieren ("Computer modeling") (Fletterick, R, und Zoller, M. (Hrsg.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling" in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
    • 5.3 Molekulares Klonieren von für Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren codierenden Genen oder Genfragmenten 5.3.1 Isolieren und Klonieren der Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Gene
  • Jede Säugerzelle ist potentiell in der Lage, als Nucleinsäurequelle für das molekulare Klonieren der Gene zu dienen, die für die ZNS-Myelinassoziierten Inhibitorproteine einschließlich der in Caroni und Schwab (1988, Neuron 1: 85-96) beschriebenen myelin-assoziierten 35-kD- und/oder 250-kD-Proteine oder der glioblastom-assoziierten Metalloprotease kodieren, im folgenden Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gene bezeichnet.
  • Die DNA kann anhand von auf dem Fachgebiet bekannter Standardverfahren aus klonierter DNA (z. B. einer DNA-Bibliothek) gewonnen werden, so durch chemische Synthese, durch das Klonieren von cDNA oder durch das Klonieren von genomischer DNA, oder Fragmente derselben, gereinigt aus der gewünschten Säugerzelle. (Siehe beispielsweise Maniatis u. a., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K., Vol. I, II.). Aus genomischer DNA abgeleitete Klone können Regulator- und Intron-DNA-Regionen neben Codierungsregionen umfassen; von cDNA abgeleitete Klone umfassen nur Exon-Sequenzen. Unabhängig von der verwendeten Quelle sollte ein bekanntes Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen molekular in einem geeigneten Vektor zur Vermehrung des Gens kloniert werden.
  • Bei dem molekularen Klonieren eines Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gens aus genomischer DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige für das gewünschte Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen codieren. Die DNA kann an bestimmen Stellen unter Einsatz von verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in Gegenwart von Mangan verwenden, um die DNA zu schneiden, oder man kann die DNA physikalisch aufspalten, z. B. durch Beschallung. Die linearen DNA-Fragmente können dann mittels Standardtechniken nach Größe getrennt werden, z. B. durch Agarose- und Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Säulenchromatographie.
  • Sind die DNA-Fragmente erstmal erzeugt, kann die Identifizierung des spezifischen DNA-Fragments, das ein Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen umfaßt, auf verschiedene Art und Weise vorgenommen werden. Beispielsweise können, wenn eine Menge eines Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gens oder dessen spezifische RNA oder ein Fragment davon verfügbar ist und gereinigt und markiert werden kann, die erzeugten DNA-Fragmente durch Nucleinsäure-Hybridisierung mit der markierten Sonde herausgefiltert werden (Benton und Davis, 1977, Science 196: 180; Grunstein und Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961-3965). In einer bevorzugten Verkörperung beispielsweise kann ein Fragment einer Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Aminosäuresequenz verwendet werden, um die DNA-Sequenz herzuleiten, die dann als ein Oligonucleotid zur Verwendung als Hybridisierungssonde synthetisiert werden kann. Alternativ können, wenn eine Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Sonde nicht verfügbar ist, an Neuritenwachstum-Regulatorfaktor angereicherte Nucleinsäurefraktionen als Sonde verwendet werden, als ein erstes Selektionsverfahren.
  • Es ist ebenso möglich, ein geeignetes Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-codierendes Fragment durch Restriktionsenzymaufschluß (Restriktionsenzymaufschlüsse) und Vergleich der Fragmentgrößen mit den gemäß einer bekannten Restriktionskarte, sofern eine solche verfügbar ist, erwarteten Größen zu identifizieren. Eine weitere Selektion auf der Grundlage der Eigenschaften des Gens oder der physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produkts, wie oben beschrieben, kann nach der ersten Selektion erfolgen.
  • Ein Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen kann auch durch mRNA-Selektion identifiziert werden anhand von Nucleinsäure-Hydridisierung mit anschließender In-vitro-Translation oder Translation in Xenopus oocytes. In einem Beispiel für das letztgenannte Verfahren werden werden den Eizellen komplette oder nach Größen fraktionierte ZNS-mRNA-Populationen injiziert und werden die membran-assoziierten Translationsprodukte in einem Funktionstest (3T3-Zellenausbreitung) ausgesondert. Eine Preadsorption der RNA mit Pools von komplementärer DNA (cDNA), resultierend in einem Mangel an exprimierten Inhibitorfaktoren, zeigt die Gegenwart der gewünschten cDNA an. Eine Reduktion der Poolgröße wird letztlich zur Isolierung eines einzigen cDNA-Klons führen. In einem alternativen Ansatz können DNA-Fragmente zur Isolierung von komplementären RNAs durch Hybridisierung eingesetzt werden. Solche DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-DNA oder an Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Sequenzen angereicherte DNA darstellen. Immunpräzipitationsanalysen oder Funktionsprüfungen der In-vitro-Translationsprodukte der isolierten mRNAs identifizieren die mRNA und somit die cDNA-Fragmente, die Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Sequenzen enthalten. Ein Beispiel für eine solche Funktionsprüfung impliziert eine Analyse auf Nichtpermissivität, in der die Wirkung der verschiedenen Translationsprodukte auf die Ausbreitung von 3T3-Zellen in einer polylysin-beschichteten Gewebekulturschale beobachtet wird (siehe Caroni und Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106: 1281). Zusätzlich können spezielle mRNAs ausgewählt werden durch Adsorption von aus Zellen isolierten Polysomen an immobilisierte Antikörper, die speziell gegen ein Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Protein gerichtet sind. Eine radioaktiv markierte Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-cDNA kann unter Verwendung der ausgewählen mRNA (aus den adsorbierten Polysomen) als Matrize synthetisiert werden. Die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA kann dann als Sonde zur Identifizierung der Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-DNA-Fragmente unter anderen genomischen DNA-Fragmenten eingesetzt werden.
  • Alternativen zur Isolierung der genomischen Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-DNA sind u. a. die chemische Synthese der Gensequenz als solcher aus einer bekannten Sequenz oder die Umwandlung der cDNA in die mRNA, die für das Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen codiert. Andere Verfahren sind möglich und in dem Umfang dieser Erfindung enthalten.
  • Das identifizierte und isolierte Gen oder die identifizierte und isolierte cDNA kann sodann in einen geeigneten Klonierungsvektor inseriert werden. Eine große Anzahl von auf diesem Fachgebiet bekannten Vektor/Wirt-Systemen kann eingesetzt werden. Mögliche Vektoren sind, ohne sich jedoch darauf zu beschränken, Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren, jedoch muß das Vektorsystem mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Zu solchen Vektoren zählen u. a. Bakteriophagen wie z. B. Lambda-Abkömmlinge, oder Plasmide wie z. B. pBR322 oder Abkömmlinge des Plasmids pUC. Rekombinante Moleküle können in die Wirtszelle auf dem Wege der Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation, usw. eingeschleust werden.
  • In einer alternativen Verkörperung kann das Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Gen identifiziert und isoliert werden nach Insertion in einen geeigneten Klonierungsvektor entsprechend dem "Schrotschuß"-Ansatz ("shot gun approach"). Eine Anreicherung an einem bestimmten Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen, beispielsweise durch Größenfraktionierung oder Subtraktion von für schwache Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Produzenten spezifischer cDNA, kann vor der Insertion in den Klonierungsvektor erfolgen. In einer anderen Verkörperung kann die DNA in ein Expressionsvektorsystem inseriert werden und kann der ein Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen enthaltende rekombinante Expressionsvektor anschließend durch Funktionsanalysen auf das Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Protein hin nachgewiesen werden.
  • Das Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen wird in einen Klonierungsvektor inseriert, der verwendet werden kann, um geeignete Wirtszellen zu transformieren, zu transfizieren oder zu infizieren, so daß viele Kopien der Gensequenzen generiert werden. Dies kann durch Ligasierung des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor geschehen, der komplementäre "klebrige" Enden aufweist. Wenn die zur Fragmentierung der DNA verwendeten komplementären Restriktionsstellen nicht in dem Klonierungsvektor vorliegen, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann jede gewünschte Stelle durch Ligasierung von Nucleotidsequenzen (Linker) an die DNA-Enden erzeugt werden; diese ligasierten Linker können chemisch synthetisierte Oligonucleotide enthalten, die für Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen codieren. In einem alternativen Ansatz können der gespaltene Vektor und das Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen durch homopolymeren Schwanzzuschnitt ("tailing") modifiziert werden.
  • Die Identifizierung des klonierten Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Gens kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen ausgehend von den Eigenschaften der DNA als solcher, oder alternativ von den physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften des von ihr codierten Proteins. Die DNA als solche kann beispielsweise durch Plaques oder Kolonie-Nucleinsäurehybribrisierung mit markierten Sonden nachgewiesen werden (Benton, W., und Davis, R., 1977, Science 196: 180; Grundstein, M., und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961). Alternativ kann die Gegenwart eines Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gens anhand von Analysen nachgewiesen werden, die auf den Eigenschaften des von ihm exprimierten Produkts basieren. So können beispielsweise cDNA-Klone - oder DNA-Klone, die die richtigen mRNAs hybrid-selektieren - ausgewählt werden, die ein Protein produzieren, das Neuritenauswuchs im Reagenzglas hemmt. Ist ein gegen einen Neuritenwachstum-Regulatorfaktor gerichteter Antikörper verfügbar, dann kann ein Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Protein identifiziert werden durch Kopplung des markierten Antikörpers an die vermeintlichen Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-synthetisierenden Klone in einem Verfahren vom ELISA-Typ ("Enzyme-linked immunosorbent assay").
  • In bestimmten Verkörperungen ermöglicht die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die ein isoliertes Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen, eine cDNA oder eine synthetisierte DNA-Sequenz enthalten, die Erzeugung einer Vielzahl von Kopien des Gens. Das Gen kann somit in großen Mengen durch Züchten von Transformanten, Isolieren der rekombinanten DNA-Moleküle von den Transformanten und, wenn erforderlich, Rückgewinnung des inserierten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA gewonnen werden.
  • Besteht das Ziel letztlich darin, das Gen in Virusexpressionsvektoren wie z. B. Vacciniavirus oder Adenovirus zu inserieren, dann kann das rekombinante DNA-Molekül, das ein Neuritenwachstum-Regulatorfaktor- Gen enthält, so modifiziert werden, daß das Gen von Virussequenzen flankiert wird, die eine genetische Rekombination in mit dem Virus infizierten Zellen gestatten, so daß das Gen in das virale Genom eingebaut werden kann.
  • Nach der Identifizierung, Züchtung und Ernte des die Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-DNA enthaltenden Klons kann dessen DNA-Insertionssequenz wie in Abschnitt 5.3.4 beschrieben charakterisiert werden. Ist die genetische Struktur eines Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gens bekannt, dann ist es möglich, diese Struktur im Hinblick auf optimalen Nutzen in der hier beschriebenen Erfindung zurechtzustutzen. So kann beispielsweise Promotor-DNA 5' einer Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Codierungssequenz zusätzlich zu oder im Austausch mit dem nativen Promotor ligasiert werden, um für eine verstärkte Expression des Proteins zu sorgen. Eine Vielzahl von Maßnahmen sind möglich und im Umfang dieser Erfindung enthalten.
    • 5.3.2 Exprimierung der Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Gene
  • Die Nucleotidsequenz, die für ein Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Protein oder einen Teil eines solchen codiert, kann in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden, d. h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der inserierten protein-codierenden Sequenz enthält. Die erforderlichen Transkriptions- und Translationssignale können ebenso durch das native Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen und/oder der es flankierenden Regionen geliefert werden. Eine Vielzahl von Wirt/Vektor-Systemen läßt sich einsetzen, um die protein-codierende Sequenz zu exprimieren. Hierzu zählen u. a. mit Virus (z. B. Vacciniavirus, Adenovirus, usw.) infizierte Säugerzellsysteme; mit Virus infizierte (z. B. Baculovirus) Insektenzellsysteme; Microorganismen wie Hefe, die Hefevektoren enthalten; oder mit Bacteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformierte Bakterien. Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in ihrer Stärke und ihren Spezifitäten. Je nach Art des eingesetzten Wirts-Vektorsystems kann jedes aus einer Vielzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.
  • Jedes der zuvor für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor beschriebenen Verfahren kann zur Konstruktion von ein chimärisches Gen enthaltenden Expressionsvektoren bestehend aus geeigneten Transkriptions-/Translations-Steuerungselementen und den proteincodierenden Sequenzen angewandt werden. Diese Verfahren können sowohl in vitro durchgeführte rekombinante DNA-Techniken und synthetische Verfahren als auch In-vivo-Rekombinationen (genetische Rekombination) beinhalten.
  • Expressionsvektoren, die Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen-Insertionssequenzen enthalten, können auf dreierlei Art und Weise identifiziert werden. (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von "Marker"-Gen-Funktionen und (c) Expression von inserierten Sequenzen. Im Falle des ersten Ansatzes kann das Vorhandensein eines in einem Expressionsvektor eingebauten fremden Gens nachgewiesen werden durch DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, die mit einem inserierten Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen homolog sind. Bei dem zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirt-System identifiziert und ausgewählt werden ausgehend von dem Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von bestimmten "Marker"-Gen-Funktionen (z. B. Thymidin-Kinase-Aktivität, Resistenz gegenüber Antikörpern, Transformations-Phänotyp, Einschlußkörperbildung in Baculovirus, usw.) als Ergebnis der Insertion von Fremd-Genen in den Vektor. Beispielsweise können, wenn ein bestimmtes Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen innerhalb der Marker-Gen-Sequenz des Vektors inseriert worden ist, die die Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Insertionssequenz enthaltenden Rekombinanten auf Grund des Nichtvorhandenseins der Marker-Gen-Funktion identifiziert werden. Im Falle des dritten Ansatzes können rekombinante Expressionsvektoren identifiziert werden durch Analysieren des von dem Rekombinanten exprimierten Fremdgen-Produkts. Solche Analysen können von den physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften eines bestimmten Regulatorfaktorgen-Produkts ausgehen.
  • Ist ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül erst einmal identifiziert und isoliert, dann können verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren angewandt werden, um es zu vermehren. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und geeignete Wachstumsbedingungen geschaffen sind, können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und in großer Zahl hergestellt werden. Wie zuvor bereits erläutert, zählen zu den einsetzbaren Expressionsvektoren u. a. die nachgenannten Vektoren oder Abkömmlinge derselben: Viren vom Menschen oder Tier, so z. B. das Vacciniavirus oder Adenovirus; Insekten-Viren wie z. B. das Baculovirus; Hefe-Vektoren; Bacteriophagen-Vektoren (z. B. Lambda) sowie Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige wenige zu nennen.
  • Darüber hinaus kann ein Wirtszellenstamm ausgewählt werden, der die Expression der inserierten Sequenzen moduliert oder der das Genprodukt in der gewünschten Art und Weise modifiziert und verarbeitet. Die Expression von bestimmten Promotoren kann in Gegenwart von bestimmten Induktoren verstärkt werden; somit kann die Expression von gentechnisch konstruiertem Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Protein gesteuert werden. Desweiteren besitzen verschiedene Wirtszellen Eigenschaften und bestimmte Mechanismen für die translationelle und posttranslationelle Verarbeitung ("processing") und Modifikation (z. B. Glycosylierung, Spaltung) von Proteinen. Geeignete Zellinien und Wirtssysteme können ausgewählt werden, um die gewünschte Modifikation und Verarbeitung ("processing") des exprimierten Fremd-Proteins sicherzustellen. Beispielsweise kann die Expression in einem bakteriellen System dazu genutzt werden, ein unglycolysiertes Kern-Proteinprodukt hervorzubringen. Eine Expression in Hefe wird ein glycolysiertes Produkt hervorbringen. Eine Expression in Säugerzellen (z. B. COS-Zellen) kann dazu verwendet werden, eine "native" Glycolysierung des heterologen Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Proteins sicherzustellen. Ferner können verschiedene Vektor/Wirt-Expressionssysteme Verarbeitungsreaktionen wie z. B. proteolytische Spaltungen in unterschiedlichen Umfängen beeinflussen.
    • 5.3.3 Identifizierung und Reinigung von exprimiertem Genprodukt
  • Sobald eine Rekombinante, die ein bestimmtes Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen exprimiert, identifiziert ist, kann das Genprodukt wie in Abschnitt 5.1 beschrieben gereinigt und wie in Abschnitt 5.2 beschrieben analysiert werden.
  • Die Aminosäuresequenz eines bestimmten Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Proteins kann aus der Nucleotidsequenz des klonierten Gens hergeleitet werden, was es ermöglicht, das Protein oder Fragment desselben anhand von auf diesem Fachgebiet bekannten chemischen Standardverfahren zu synthetisieren (z. B. siehe Hunkapiller u. a., 1984, Nature 310: 105-111).
  • In bestimmten Ausführungsarten dieser Erfindung zählen zu diesen anhand von rekombinanten DNA-Techniken oder von chemischen Syntheseverfahren hergestellten Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Proteinen u. a. solche Proteine, die geänderte Sequenzen enthalten, in denen funktionell äquivalente Aminosäurereste durch Reste innerhalb der Sequenz ersetzt werden, was eine stille Änderung zur Folge hat. So können z. B. ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure gleicher Polarität substituiert werden, die als ein funktionelles Äquivalent agiert, was in einer stillen Änderung mündet. Substituenten für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse, der die Aminosäure angehört, ausgewählt werden. So umfassen beispielsweise die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Zu den polaren neutralen Aminosäuren zählen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Zyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Ebenso in dem Umfang dieser Erfindung enthalten sind Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Proteine, die während oder nach einer Translation auf unterschiedliche Weise modifiziert werden, so z. B. durch Glycolysierung, proteolytische Spaltung, usw.
    • 5.3.4 Charakterisierung der Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Gene
  • Die Struktur eines bestimmten Neuritenwachstum-ReguIatorfaktor-Gens kann anhand von verschiedenen auf diesem Fachgebiet bekannten Verfahren analysiert werden.
  • Die einem bestimmten Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen entsprechende klonierte DNA oder cDNA kann anhand von Verfahren analysiert werden wie z. B. Southern-Hybridisierung (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-517), Northern-Hybridisierung (Alwine u. a., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5350-5354; Wahl u. a., 1987, Meth. Enzymol. 152: 572-581), Restriktionsendonuclease-Kartierung (Maniatis u. a., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) und DNA-Sequenzanalyse.
  • Eine DNA-Sequenzanalyse kann anhand eines jeden auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrens durchgeführt werden, so u. a. nach der Methode von Maxam und Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65: 499-560), dem Dideoxy-Verfahren nach Sanger (Sanger u. a., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467), oder durch Einsatz eines automatisierten DNA-Sequenzanalysegeräts (z. B. Applied Biosystems, Foster City, CA).
    • 5.4 Produktion von Antikörpern gegen Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren
  • Es können Antikörper produziert werden, die Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren oder zugehörige Proteine erkennen. Derartige Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein.
  • Verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Produktion von gegen Epitope eines bekannten Neuritenwachstum-Regulatorfaktor gerichteten polyklonalen Antikörpern angewandt werden. Zur Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere immunisiert werden durch Injizierung eines Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Proteins oder eines synthetischen Proteins oder eines Fragments davon, so u. a. Kaninchen, Mäuse, Ratten, usw. Verschiedene Adjuvantien können zur Steigerung der immunologischen Antwort verwendet werden, je nach Art der Wirtsspezies, einschließlich, ohne sich jedoch darauf zu beschränken, Freund-Adjuvantien (komplette und inkomplette), Mineralgele wie z. B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie z. B. Lysolecithin, Pluronpolyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen, "Keyhole limpet" Hämocyanine, Dinitrophenol und potentiell nützliche humane Adjuvantien wie z. B. BCG (Bacillus Calmette- Gu rin) und Corynebacterium parvum.
  • Ein monoklonaler Antikörper zu einem Epitop eines Neuritenwachstum-Regulatorfaktors kann hergestellt werden durch Anwendung einer Technik, die für die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur sorgt. Hierzu zählen u. a. die Hybridomtechnik, wie ursprünglich von Kohler und Milstein beschrieben (1975, Nature 256: 495-497) sowie die neueste Human-B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor u. a., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole u. a., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77-96). In einer speziellen Verkörperung kann das in Abschnitt 8.1 beschriebene Verfahren angewandt werden, um monoklonale Antikörper von der Maus zu erlangen, die die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitor-Proteine mit 35 kD und 250 kD erkennen.
  • Die monoklonalen Antikörper zur Anwendung in der Therapie können monoklonale Antikörper vom Menschen oder chimärische monoklonale Antikörper vom Menschen/von der Maus (oder einer anderen Spezies) sein. Monoklonale Antikörper vom Menschen können anhand eines von zahlreichen Verfahren, die auf diesem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden (z. B. Teng u. a., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 7308-7312; Kozbor u. a., 1983, Immunology Today 4: 72-79; Olsson u. a., 1982, Meth. Enzymol. 92: 3-16). Chimärische Antikörpermoleküle können hergestellt werden, die eine Antigen-Bindungsstelle von der Maus zusammen mit konstanten Regionen vom Menschen beinhalten (Morrison u. a., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851, Takeda u. a., 1985, Nature 314: 452).
  • Ein molekularer Klon eines Antikörpers gegen ein Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Epitop kann anhand von verschiedenen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Die rekombinante DNA-Technik (siehe z. B. Maniatis u. a., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) kann eingesetzt werden, um Nucleinsäuresequenzen zu konstruieren, die für ein monoklonales Antikörpermolekül oder eine Antigenbindungsstelle eines solchen codieren.
  • Antikörpermoleküle können anhand von bekannten Verfahren gereinigt werden, so z. B. durch Immunoabsorption oder Immunoaffinitätschromatographie, chromatographische Methoden wie zum Beispiel Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) oder eine Kombination daraus usw.
  • Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können anhand von bekannten Verfahren generiert werden. Diese Fragmente umfassen u. a. folgendes: das F(ab')&sub2;-Fragment, das durch Pepsinaufschluß des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die F(ab')&sub2;-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')&sub2;-Fragments generiert werden können; und die Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können.
    • 5.5 Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-verbundene Abkömmlinge, Analoge und Peptide
  • Die Produktion und Verwendung von mit einem bestimmten Neuritenwachstum-Regulatorfaktor in Verbindung stehenden Abkömmlingen, Analogen und Peptiden werden ebenso ins Auge gefaßt und sind somit Teil des Umfangs dieser Erfindung; sie umfassen Moleküle, die gegenüber Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren antagonistisch sind (beispielsweise, ohne sich jedoch hierauf zu beschränken, Anti-Idiotyp- Antikörper). Solche Derivate, Analoge oder Peptide, die über die gewünschte inhibitorische Aktivität verfügen, können z. B. im Rahmen der Behandlung von Neuroblastomen (siehe Abschnitt 5.6) eingesetzt werden. Derivate, Analoge oder Peptide, die mit einem Neuritenwachstum-Regulatorfaktor in Verbindung stehen, können auf die gewünschte Aktivität hin durch Untersuchungen auf nichtpermissive Substratwirkungen hin getestet werden. Beispielsweise durch Verfahren wie die Untersuchung auf Nichtpermissivität, in der die Wirkung verschiedener Translationsprodukte auf die Ausbreitung von 3T3-Zellen in einer mit Polylysin beschichteten Gewebekulturschale beobachtet wird (siehe Caroni und Schwab, 198. J. Cell Biol. 106: 1281).
  • Die Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-verbundenen Derivate, Analoge und Peptide dieser Erfindung können anhand von verschiedenen auf diesem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Maßnahmen, die zu deren Produktion führen, können direkt an dem Gen oder auf Proteinebene ansetzen. Ein kloniertes Neuritenwachstum- Regulatorfaktor-Gen kann nach einer von zahlreichen auf diesem Fachgebiet bekannten Strategien modifiziert werden (Maniatis u. a., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Eine gegebene Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Sequenz kann an geeigneten Stellen mit Restriktionsendonuclease(n) geschnitten werden, soweit gewünscht enzymatischen Modifikationen unterzogen werden, isoliert und ligasiert werden - in vitro. Bei der Produktion eines Gens, das für ein mit einem Neuritenwachstum-Regulatorfaktor verbundenes Derivat, Analog oder Peptid codiert, sollte darauf geachtet werden, daß sichergestellt ist, daß das modifizierte Gen innerhalb desselben translationellen Leserahmens wie der Neuritenwachstum-Regulatorfaktor verbleibt, ohne Unterbrechung durch translationelle Stoppsignale, in der Genregion, in der der Code für die gewünschte Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-spezifische Aktivität vorliegt.
  • Außerdem kann ein bekanntes Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gen in vitro sowie in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen aufzubauen oder zu zerstören oder um Variationen in Codierungsregionen zu kreieren, um neue Restriktionsendonuclease-Stellen zu bilden oder bereits bestehende zu zerstören, um die In-vitrc-Modifikation weiter zu vereinfachen. Jede in dem Fachbereich bekannte Technik zur Mutagenese kann eingesetzt werden, so u. a. die ortsspezifische In-vitro-Mutagenese (Hutchinson u. a., 1978, J. Biol. Chem, 253: 6551, die Verwendung von TAB-Linkermolekülen (Pharmacia), usw.
    • 5.6 Einsatzmöglichkeiten für Neuritenwachstum-Regulatorfaktoren 5.6.1 Diagnostische Einsatzmöglichkeiten 5.6.1.1 ZNS-Myelin-assoziierte Inhibitorproteine
  • ZNS-Myelin-assoziierte Inhibitorproteine, Analoge, Derivate und Untersequenzen derselben sowie Anti-Inhibitorprotein-Antikörper sind für die Diagnostik von Nutzen. Diese Moleküle können in Tests wie z. B. Immunoassays eingesetzt werden zum Nachweis, zur Prognose, Diagnose oder Überwachung von verschiedenen Zuständen, Krankheiten und Störungen, die das Wachstum, die Extension, Invasion und Regeneration von Neuriten beeinflussen. In einer Verkörperung dieser Erfindung können diese Moleküle zur Diagnose von Malignität verwendet werden. Alternativ können die ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine, Analoge, Derivate und Untersequenzen derselben eingesetzt werden, um Therapien für Krankheiten und Zustände zu überwachen, die letztlich zu Nervenschäden führen; zu solchen Krankheiten und Zustände zählen u. a. ZNS-Trauma (z. B. Rückenmarksverletzungen), Infarkt, Infekte, Bösartigkeit, Belastung durch toxische Mittel, Mangeldiät, paraneoplastische Syndrome sowie degenerative Nervenkrankheiten (einschließlich - jedoch nicht ausschließlich - der Alzheimer Krankheit, der Parkinsonschen Krankheit, Huntington-Chorea, amyotrophische Lateralsklerose und progressive supranucleare Lähmung). In einer spezifischen Verkörperung können diese Moleküle eingesetzt werden zum Nachweis eines Anstiegs im Neuritenwachstum als ein Anzeichen für eine ZNS-Faser-Regeneration.
  • So kann beispielsweise in einer spezifischen Verkörperung das Nichtvorhandensein der ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteine in einer ZNS-Myelin-haltigen Patientenprobe ein diagnostischer Marker für das Vorliegen einer Malignität sein einschließlich eines Glioblastoms, Neuroblastoms und Melanoms, oder eines Zustands, der Nervenwachstum, Ausstreuung oder Regeneration in einem Patienten impliziert. In einer speziellen Verkörperung kann das Nichtvorhandensein der Inhibitorproteine nachgewiesen werden mit Hilfe eines Immunoassays, bei dem das Ausbleiben jeglicher Bindung an Anti-Inhibitorprotein-Antikörper (z. B. IN-1, IN-2) beobachtet wird.
  • Zu den anwendbaren Immunoassays zählen u. a. kompetitive und nicht-kompetitive Testsysteme, bei denen Verfahren zum Einsatz kommen wie Radioimmunoassays, ELISA ("enzyme-linked immunosorbent assay"), "Sandwich"-Immunoassays, Präzipitationsreaktionen, Geldiffusions-Präzipitationsreaktionen, Immundiffusionstests, Komplementbindungsreaktionen, Immunradiometrische Tests, Fluoreszenz-Immuntests, Protein-A-Immuntests, Immunelektrophorese-Tests und Immunohistochemie an Gewebsschnitten, um nur einige wenige zu nennen.
  • In einer spezifischen Verkörperung können Liganden, die sich an ein ZNS-Myelin-assoziiertes Inhibitorprotein binden, in Abbildungsverfahren eingesetzt werden. Kleine Peptide (z. B. Inhibitorproteinrezeptor-Fragmente), beispielsweise, die sich mit den Inhibitorproteinen verbinden und die in der Lage sind, die Blut-Gehirn-Barriere zu überwinden, können, wenn in geeigneter Weise markiert, in Darstellungsverfahren wie z. B. PET-(Positron-Emissions-Tomographie-)Diagnose oder Scintigraphie- Detektion unter für den Patienten nicht invasiven Bedingungen eingesetzt werden.
  • Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Gene, -DNA, -cDNA und -RNA sowie verbundene Nucleinsäuresequenzen und Untersequenzen einschließlich komplementärer Sequenzen können ebenso in Hybridisierungstests verwendet werden. Die Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Nucleinsäuresequenzen oder Untersequenzen davon mit ungefähr mindestens 15 Nucleotiden können als Hybridisierungssonden eingesetzt werden. Hybridisierungstests können zur Detektion, Prognose, Diagnose oder Überwachung von Zuständen, Störungen oder Krankheitszuständen in Verbindung mit Änderungen in der Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-Expression wie oben beschrieben eingesetzt werden. Komplette RNA in Myelin, z. B. auf Biopsie-Gewebsschnitten, von einem Patienten kann auf das Vorhandensein von Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-mRNA getestet werden, wobei die Menge an Neuritenwachstum-Regulatorfaktor-mRNA ein Hinweis auf das Ausmaß der Hemmung der Neuritenauswuchs-Aktivität in einem bestimmten Patienten ist.
    • 5.6.1.2 ZNS-Myelin-assoziierte Inhibitorprotein-Rezeptoren
  • ZNS-Myelin-assoziierte Inhibitorprotein-Rezeptoren sowie Analoge, Abkömmlinge und Untersequenzen derselben, sowie Anti-Rezeptor-Antikörper finden Einsatzmöglichkeiten in der Diagnose. Diese Moleküle der hier beschriebenen Erfindung können in Tests eingesetzt werden wie z. B. Immuntests oder Bindungstests zum Nachweis, zur Prognose, Diagnose oder Überwachung von verschiedenen Zuständen, Krankheiten und Störungen, die Einfluß haben auf Neuritenwachstum, -extension, -invasion und -regeneration. So ist es beispielsweise möglich, daß ein niedrigerer Grad der Expression dieser Rezeptoren bei verschiedenen Störungen in Verbindung mit fortgeschrittener Neuriteninvasivität oder -regeneration nachgewiesen werden kann, so z. B. bei solchen, die Nervenschäden, einen Infarkt, degenerative Nervenkrankheiten oder Malignitäten implizieren. Die ZNA-Mylein-assoziierte Inhibitorprotein-Rezeptoren, Analoge, Abkömmlinge und Untersequenzen derselben können ebenso zur Überwachung von Therapien im Falle von Krankheiten und Störungen, die letztlich in einer Nervenschädigung münden, wie z. B. ein ZNS-Trauma (z. B. Rückenmarksverletzungen), Schlag, degenerative Nervenkrankheiten, sowie im Falle von Malignitäten eingesetzt werden.
  • Zu den anwendbaren Tests gehören u. a. die in Abschnitt 5.6.1.1 beschriebenen Tests.
  • Neuritenwachstum-Regulatorfaktorrezeptor-Gene und verbundene Nucleinsäuresequenzen und -untersequenzen einschließlich komplementärer Sequenzen können ebenso in Hybridisierungstests zum Nachweis, zur Prognose, zur Diagnose oder zur Überwachung von Zuständen, Störungen oder Krankheitszuständen eingesetzt werden, die mit Änderungen in der Neuritenwachstum-Regulatorfaktorrezeptor-Expression in Verbindung stehen.
    • 5.6.1.3 Metalloproteasen und deren Inhibitoren
  • Die Metalloproteasen dieser Erfindung sowie deren Analoge, Abkömmlinge und Fragmente derselben, ebenso wie Inhibitoren und Anti-Metalloprotease-Antikörper können zu diagnostischen Zwecken eingesetzt werden. Diese Moleküle der hier beschriebenen Erfindung können in Tests wie z. B. Immuntests oder Tests vom Inhibitionstyp verwendet werden zum Nachweis, zur Prognose, zur Diagnose und zur Überwachung verschiedener Zustände, Krankheiten und Störungen, die sich auf Neuritenwachstum, -ausdehnung, -invasivität oder -regeneration auswirken. In einer spezifischen Verkörperung können die Moleküle dieser Erfindung zur Diagnose von bösartigen Tumoren, insbesondere von solchen Tumoren, die zur Metastasierung ins Gehirn fähig sind (z. B. Glioblastom), eingesetzt werden, indem sie das Vorliegen oder eine Steigerung von Metalloproteasespiegeln nachweisen. Alternativ können die Moleküle dieser Erfindung verwendet werden, um Therapien für bösartige Tumore wie z. B. Glioblastome zu überwachen, indem sie Änderungen in Metalloproteasespiegeln erkennen. In dieser letztgenannten Verkörperung sollte kann (? im Original: "should can"; Anm. d. Übers.) ein Absinken oder das Verschwinden von Metalloproteasespiegeln ein Hinweis für den Wirkungsgrad der Therapie sein.
  • Zu den Tests, die angewandt werden können, zählen u. a. die Tests, die in Abschnitt 5.6.1.1 beschrieben sind.
  • Metalloprotease-Gene und zugehörige Nucleinsäuresequenzen und -untersequenzen einschließlich komplementärer Sequenzen können ebenso in Hybridisierungstests zum Nachweis, zur Prognose, zur Diagnose oder zur Überwachung von Zuständen, Störungen oder Krankheitszuständen eingesetzt werden, die mit Änderungen in der Metalloprotease-Expression wie oben beschrieben in Verbindung stehen.
  • Beispielsweise kann die komplette RNA in einer Patientenprobe (z. B. Glialzellen) auf das Vorhandensein von Metalloprotease-mRNA analysiert werden, wobei das Vorhandensein von oder die Menge an Metalloprotease-mRNA ein Hinweis auf die Bösartigkeit des Tumors im Patienten ist. Insbesondere kann eine zur Metastasierung ins Gehirn fähige Malignität (z. B.: Glioblastom) festgestellt werden.
    • 5.6.2 Therapeutische Einsatzmöglichkeiten 5.6.2.1 ZNS-Myelin-assoziierte Inhibitorproteine
  • ZNS-Myelin-assoziierte Inhibitorproteine dieser Erfindung können von therapeutischem Nutzen bei der Behandlung von Patienten mit bösartigen Tumoren einschließlich - jedoch nicht ausschließlich - Melanom oder Tumoren des Nervengewebes (z. B. Neuroblastom). In einer Verkörperung können Patienten mit einem Neuroblastom mit den 35-kD- und/oder 250-kD-Proteinen oder Analogen, Derivaten oder Untersequenzen derselben sowie mit den humanen funktionellen Äquivalenten derselben behandelt werden, die die Neuritverlängerung (Extension) hemmen. In einer anderen Verkörperung kann dem Patienten zu therapeutischen Zwecken sowohl ein ZNS-Myelin-assoziiertes Inhibitorprotein als auch ein Metalloproteaseinhibitor verabreicht werden.
  • In einer alternativen Verkörperung können Abkömmlinge, Analoge oder Untersequenzen von ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteinen, die die native Inhibitorprotein-Funktion hemmen, in Diäten eingesetzt werden, wo eine Steigerung der Neuritverlängerung, des Neuritwachstums oder der Neuritregeneration gewünscht wird, so z. B. bei Patienten mit Nervenschäden. Patienten, die an traumatischen Störungen (einschließlich - jedoch nicht ausschließlich - Rückenmarkverletzungen, Rückenmarkläsionen oder andere ZNS-Bahn-Läsionen), an chirurgischen Nervenläsionen, an Schäden als Folge eines Infarktes, von Infektionen, einer Exposition gegenüber toxischen Mitteln, an Malignität, paraneoplastischen Syndromen leiden oder Patienten mit verschiedenen Arten von degenerativen Störungen des Zentralnervensystems (Cutler, 1987, in: Scientific American Medicines V. 2, Scientific American Inc., NY, S. 11-1-11-13) können mit solchen Inhibitorprotein-Antagonisten behandelt werden. Beispiele für solche Störungen sind u. a. die Alzheimer Krankheit, die Parkinsonsche Krankheit, Huntington-Chorea, amyotrophische Lateralsklerose oder progressive supranukleare Lähmung. Solche Antagonisten können zur Förderung der Regeneration von ZNS-Bahnen, - Fasersystemen und -Trakten eingesetzt werden. Die Verabreichung von Antikörpern gegen ein Epitop von ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitorproteinen wie den 35-kD- und/oder 250-kD-Proteinen (oder dem Bindungsteil desselben, oder von Zellen, die solche als Antikörper ausscheiden) kann auch zur Hemmung der 35-kD- und/oder 250-kD-Protein-Funktion in Patienten eingesetzt werden. In einer speziellen Verkörperung dieser Erfindung können Antikörper gegen das myelin-assoziierte 35-kD- und/oder 250-kD-Inhibitorprotein zur Förderung der Regeneration von Nervenfasern über lange Strecken nach einer Rückenmarksschädigung eingesetzt werden; in einer speziellen Verkörperung kann der monoklonale Antikörper IN-1 verwendet werden.
  • Verschiedene Transportsysteme sind bekannt und können zur Zuführung von ZNS-Myelin-Inhibitorproteinen, verbundenen Molekülen oder dagegen gerichtete Antikörper benutzt werden, so z. B. Einkaspelung in Liposomen oder semipermeable Membranen, Expression durch Bakterien, usw. Die Ankopplung an Liganden wie z. B. Antikörper kann genutzt werden, um mit myelin-assoziierten Proteinen verbundene Moleküle in vivo genau an therapeutisch wünschenswerte Orte zu bringen. Zu den Verabreichungsverfahren zählen u. a. die Zuführung auf intradermalem, intramuskulärem, intraperitonealem, intravenösem, subcutanem, oralem und intranasalem Wege sowie die Infusion in Ventrikel oder an eine Stelle eines entfernten Tumors. Ebenso können Zellen, die ZNS-Myelin-Inhibitorprotein-Antagonisten-Aktivität aussondern, z. B. - jedoch nicht einschränkend - Hybridomzellen, eingekapselt in eine geeignete Membrane, in einen Patienten implantiert werden, so daß eine beständige Quelle für Anti-ZNS-Myelin-Inhibitorprotein-Antikörper vorgesehen ist.
  • Darüber hinaus kann jede Methode, die zu einer geringeren Synthese von Myelin-Inhibitorproteinen führt, angewandt werden, um deren biologische Funktion zu verringern. Hilfsmittel mit Toxizität für Zellen, die ZNS-Myelin-Inhibitorproteine synthetisieren (z. B. Oligodendrozyten), können beispielsweise dazu eingesetzt werden, die Inhibitorprotein-Konzentration zwecks Förderung der Neuronenregeneration zu verringern.
    • 5.6.2.2 ZNS-Myelin-assoziierte Inhibitorprotein-Rezeptoren
  • ZNS-Myelin-assoziierte Inhibitorprotein-Rezeptoren oder Fragmente derselben sowie dagegen gerichtete Antikörper können von therapeutischem Nutzen sein bei der Behandlung von Patienten mit Nervenschäden einschließlich solcher Schäden, die als Folge eines ZNS-Traumas (z. B. Rückenmarkverletzungen), eines Infarktes auftreten, oder mit degenerativen Störungen des Zentralnervensystems wie u. a. die Alzheimer Krankheit, die Parkinsonsche Krankheit, Huntington-Chorea, amyotrophische Lateralsklerose oder progressive supranukleare Lähmung. In einer Verkörperung, beispielsweise, können ZNS-Myelinassoziierte Inhibitorprotein-Rezeptoren oder Untersequenzen oder Analoge derselben, die die Inhibitorprotein-Bindungsstelle enthalten, einem Patienten verabreicht werden, um die Ankopplung der Inhibitorproteine an ihre natürlichen Rezeptoren "auszuschalten" und somit das Nervenwachstum oder die Regeneration im Patienten zu fördern. In einer alternativen Verkörperung können gegen den Inhibitorprotein-Rezeptor (oder den Bindungsabschnitt davon oder Zellen, die Antikörper ausscheiden, die an den Rezeptor ankoppeln) einem Patienten verabreicht werden, um die Rezeptorfunktion zu unterbinden und somit das Nervenwachstum oder die Regeneration im Patienten zu fördern. Patienten, bei denen eine solche Therapie wünschenswert wäre, sind u. a. Patienten mit einer Nervenschädigung, einem Schlag oder degenerativen Störungen des Zentralnervensystems wie oben beschrieben.
  • Verschiedene Transportsysteme sind bekannt und können zur Zuführung von ZNS-Myelin-Inhibitorproteinen-Rezeptoren, verbundenen Molekülen oder dagegen gerichtete Antikörper benutzt werden, so z. B. Einkapselung in Liposomen, Expression durch Bakterien, usw. Die Ankopplung an Liganden wie z. B. Antikörper kann genutzt werden, um mit myelin-assoziierten Proteinrezeptoren verbundene Moleküle in vivo genau an therapeutisch wünschenswerte Orte zu bringen. Zu den Verabreichungsverfahren zählen u. a. die Zuführung auf intradermalem, intramuskulärem, intraperitonealem, intravenösem, subcutanem, oralem und intranasalem Wege sowie die Infusion in Ventrikel oder an eine Stelle eines entfernten Tumors.
    • 5.6.2.3 Metalloproteasen und deren Inhibitoren
  • Die Metallopreoteasen dieser Erfindung können von therapeutischem Nutzen sein bei der Behandlung von verschiedenen Arten von Nervenschäden oder degenerativen Störungen des zentralen Nervensystems (wie z. B. solchen wie in Abschnitt 5.6.2.2 beschrieben). In einer Verkörperung können Patienten, die an Nervenschäden infolge eines Traumas, Schlags oder neurodegenerativen Störungen leiden, mit der Metalloprotease oder proteolytisch aktiven Analogen, Derivaten oder Untersequenzen derselben, die die Neuritenverlängerung oder Regeneration der ZNS-Faser stimulieren, behandelt werden.
  • In einer alternativen Verkörperung können Derivate, Analoge oder Untersequenzen der Metalloproteasen, die der Metalloprotease-Funktion entgegenstehen oder dieser Hemmen, oder chemische Inhibitoren der Metalloprotease-Aktivität in Diäten eingesetzt werden, bei denen eine Hemmung der invasiven Migration und Ausbreitung in dem ZNS gewünscht wird. Zu diesen Inhibitoren zählen u. a. 1,10-Phenanthrolin, EDTA, AGTA., cbz-tyr-tyr, cbz-gly-phe-NH&sub2;, cbz-phe-phe-NH&sub2; und cbz-gly-phe-phe-NH&sub2;. 1,10-Phenanthrolin, EDTA und EGTA können von gewerblichen Quellen bezogen werden (z. B. Sigma Chemical Co.). Cbz-tyr-tyr, cbz-gly-phe-NH&sub2;, cbz-phe-phe-NH&sub2; und cbz-gly-phe-phe-NH&sub2; können ebenso über kommerzielle Quellen bezogen werden (z. B. Vega Biotechnologies) oder chemisch synthetisiert werden. In einer speziellen Verkörperung können Patienten mit verschiedenen Typen von bösartigen Tumoren, insbesondere solchen, die ins Gehirn metastasieren können, mit diesen Inhibitoren behandelt werden. In einer bevorzugten Verkörperung kann ein Patient mit einem Glioblastom mit solchen Inhibitoren behandelt werden. In einer anderen speziellen Verkörperung können Antikörper gegen ein Epitop der Metalloprotease eingesetzt werden, um die Metalloprotease-Funktion im Patienten zu hemmen. In noch einer anderen speziellen Verkörperung dieser Erfindung können sowohl Metalloproteaseinhibitoren sowie ein ZNS-Myelin-assoziiertes Inhibitorprotein sowohl einem Patienten zur Behandlung eines bösartigen Tumors wie z. B. eines Glioblastoms, Neuroblastom oder eines Melanoms verabreicht werden.
  • Verschiedene Transportsysteme sind bekannt und können zur Zuführung von Metalloproteasen und verbundenen Molekülen benutzt werden, so z. B. Einkapselung in Liposomen oder semipermeablen Membranen, Expression durch Bakterien, usw. Die Ankopplung an Liganden wie z. B. Antikörper kann genutzt werden, um mit myelinassoziierten Proteinrezeptoren verbundene Moleküle in vivo genau an therapeutisch wünschenswerte Orte zu bringen. Zu den Verabreichungsverfahren zählen u. a. die Zuführung auf intradermalem, intramuskulärem, intraperitonealem, intravenösem, subcutanem, oralem und intranasalem Wege sowie die Infusion in Ventrikel oder an eine Stelle eines entfernten Tumors.
    • 6. OLIGODENDROZYTEN UND ZNS-MYELIN SIND NICHTPERMISSIVE SUBSTRATE FÜR NEURITWACHSTUM UND FIBROBLASTEN- FORTPFLANZUNG IN VITRO
  • Zum Zwecke einer Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Neuronen und Zentralnervensystem-(ZNS-)Gliazellen wurden zerlegte Zellen des sympathischen oder sensorischen Ganglions oder fötale Retinazellen auf Kulturen zerlegter Sehnerven-Gliazellen von jungen Ratten plattiert. Während Astrozyten eine Neuronenadhäsion und einen Neuritauswuchs begünstigten, unterschieden sich Oligodendrozyten deutlich hinsichtlich ihrer Eigenschaften als neuronale Substrate. Unreife (O&sub4;&spplus;, A&sub2;B&sub5;&spplus;, Galc&supmin;) Oligodendrozyten wurden häufig von Neuronen und Neuriten kontaktiert. Demgegenüber stellten differenzierte Oligodendrozyten (O&sub4;&spplus;, A&sub2;B&sub5;&spplus;, Galc&supmin;) ein nichtpermissives Substrat für neuronale Adhäsion und Neuritenauswuchs dar. In den Fällen, wo Neuroblastomzellen oder 3T3-Fibroblasten auf Sehnerven-Gliakulturen ausgestrichen wurden, wurden dieselben Unterschiede festgestellt; differenzierte Oligodendrozyten zeigten nichtpermissive Wirkung für Zelladhäsion, Neuritenauswuchs oder Fibroblastenausbreitung. Diese nichtpermissiven Oligodendrozyten waren durch ein radiales, stark verästeltes Fortsatznetzwerk gekennzeichnet, enthielten oftmals ein auf Myelin basierendes Protein (MBP) und können daher Zellen entsprechen, die aktiv an der Produktion von myelin-ähnlichen Membranen beteiligt sind.
  • Isoliertes Myelin aus dem Rückenmark ausgewachsener Ratten wurde an polylysin-beschichteten Kulturschalen adsorbiert und als Substrat für periphere Neuronen, Neuroblastomzellen oder 3T3-Zellen getestet. Allgemeine physico-chemikalische Eigenschaften von Myelin waren für diese Wirkung nicht verantwortlich, da Myelin von Ischiasnerven von der Ratte die Neuronenadhäsion und einen Neuritenauswuchs sowie ein Auswachsen von 3T3-Zellen begünstigten. Diese Ergebnisse zeigen, daß differenzierte Oligodendrozyten nichtpermissive Substrateigenschaften exprimieren, die für die ZNS-Entwicklung oder -Regeneration von Bedeutung sein können.
    • 6.1 Material und Verfahren 6.1.1 Gliazellkulturen
  • Sehnerven wurden aus 7-12 Tage alten oder jungen (180-220 g) Wistar-Ratten heraus geschnitten und in Plattierungsmedium (luftgepuffertem angereichertem L&sub1;&sub5; mit 5% Rattenserum; Mains und Patterson, 1973, J. Cell Biol. 59: 329-345). Die Hirnhäute und Blutgefäße wurden sorgfältig unter einem Mikroskop entfernt, und die Nerven wurden in kleine Stücke geschnitten. Die Zerlegung von 10 Tage alten Nerven erfolgte in zwei Stufen je 25 Minuten in 0,25% Trypsin (Sigma) und 0,02% Collagenase (Worthington) (Raff u. a., 1979, Brain Res. 174: 283-318) in CMF-PBS (Ca&spplus;&spplus;/Mg&spplus;&spplus;-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung) bei 37ºC. Die Aufspaltung von Sehnerven ausgewachsener Tiere erfolgte durch 1-stündigen Aufenthalt in 0,1% Trypsin, 0,1% Collagenase bei 37ºC und anschließendem 10-minütigen Aufenthalt in 0,5% Trypsin. Nach dem Waschen und Zerlegen durch Pulverisierung (Trituration) mit einer Pasteur-Pipette wurden die Zellen in die Vertiefungen von jeweils vier innere Vertiefungen aufweisenden 35-mm-Gewebskulturschalen in einer Dichte von 20.000 bis 30.000 Zellen pro Vertiefung ausgestrichen (Fläche der Vertiefung: 95 mm²). Für 7-10 Tage alte Sehnerven betrug die Ausbeute der Zerlegung ungefähr 10.000 Zellen pro Nerv. Das Kultursubstrat bei den meisten Experimenten war Polyornithin (PORN, Sigma, 0,5 mg/ml in Boratpuffer, inkubiert über Nacht) oder Polylysin (PLYS, Sigma, 50 ng/ml in Wasser); bei einigen Experimenten wurden eine getrocknete Collagenfolie (Kalbshaut-Collagen, inkubiert über Nacht mit steriler Lösung), lamininbeschichtetem PORN [gereinigtes EHS-Tumor-Laninin von der Maus (5 ng/ml, inkubiert für 3 Stunden in zuvor mit PORN beschichteten Schalen)] oder reiner Gewebskultur-Kunststoff verwendet. Bei dem Kulturmedium handelte es sich um ein angereichertes L&sub1;&sub5;-Medium mit 5% Rattenserum, Penicillin (100 Einh./ml) und Streptomycin (100 ng/ml) (Mains und Patterson, 1973, J. Cell Biol. 59: 329-345). Bei einigen Versuchen wurde 10% Kälberfötusserum anstelle des Rattenserums hinzugegeben.
  • Sehnerven von E13- oder E17-Hühnerembryonen wurden durch kurze Behandlung mit Trypsin/Collagenase zerlegt und 2-7 Tage lang in L&sub1;&sub5; mit 5% Kälberfötusserum in PORN-beschichteten Kulturschalen kultiviert.
    • 6.1.2 Gemeinsame Kulturen von Gliazellen und Nervenzellen
  • Es wurden drei verschiedene Arten von Nervenzellen zusammen mit Gliazellen kultiviert: sympathische Neuronen aus dem Ganglion cervicale superius (oberes Halsganglion) neugeborener Ratten, sensorische Neuronen aus den Ganglien der dorsalen Rückenmarkswurzel neugeborener Ratten sowie Zellen aus der Retina von E17-E18-Rattenembryonen. Die oberen Halsganglien sowie die Rückenmarkswurzelganglien wurden heraus geschnitten und in einzelne Zellen zerlegt wie beschrieben (Mains und Patterson, 1973, J. Cell Biol, 59: 329-245; Schwab und Thoenen, 1985, J.
  • Neurosci. 5: 2415-2423). Die Retinas wurden aus den Embryonen herausgeschnitten, von zugehörigen Blutgefäßen gereinigt und für 10 Minuten bei 37ºC in 0,03% Trypsin, 0,03% DNase inkubiert, durch Zentrifugation in serumhaltigem Medium gewaschen und durch Pulverisierung (Trituration) zerlegt.
  • Die Neuronen wurden zu 2-10 Tage alten Gliazellkulturen in demselben Medium hinzugefügt unter Zugabe von NGF (2,5 S NGF, 50 oder 100 ng/ml) im Falle von sensorischen und sympathischen Neuronen oder von Gehirn abgeleitetem neurotropem Faktor im Falle der Retinazellen (Johnson, J.E., u. a., 1986, J. Neurosci. 6: 3031-3038). Um das Wachstum von zusammen mit den peripheren Neuronen hinzugegebenen Schwann-Zellen zu unterdrücken, wurden zweimal Cytosinarabinosid-Stöße (Ara C, 10&supmin;&sup5; M) für 24 Stunden am 2. und am 5. Tage der gemeinsamen Kultivierung erteilt. Die Kulturen wurden zur Antikörper-Färbung nach 1 bis 5 Tagen der gemeinsamen Kultivierung im Falle von Retinazellen bzw. nach 2 Tagen bis 3 Wochen im Falle von Zellen des peripheren Ganglions verarbeitet.
  • Neuroblastomzellen von der Maus (Linie NB-2A), kultiviert in DMEM/10% FCS, wurden aus dem Kulturkolben gelöst durch eine kurze, durch die Zugabe von DMEM/FCS beendete Behandlung mit 0,1% Trypsin in CMF-Hank-Lösung. Nach dem Waschen wurden die Zellen zu Gliazellkulturen (40.000 oder 20.000 Zellen pro Vertiefung) in DMEM/FCS mit entweder 2 mM Dibutyryl-cyclo-AMP oder von Gliazellen abgeleitetem Neuritpromotorfaktor (GdNPF; Guenther u. a., 1986, EMBO J. 4: 1963-1966) hinzugegeben.
  • NIH-3T3-Zellen von der Maus, die identisch wie die Neuroblastomzellen behandelt worden waren, wurden zu 2-3 Tage alten Kulturen von Sehnerven von 7 Tage alten oder neugeborenen Ratten gegebenen in einer Konzentration von 20.000 oder 40.000 Zellen pro Vertiefung in DMEM mit einem 10%igen Gehalt an Kälberfötusserum oder in MEM, zugeführt mit Insulin (20 ng/ml) und Transferrin (50 ng/ml). Die Kulturen wurden für 2 bis 4 Stunden in den Inkubator zurückgestellt und dann mit warmem 4%igem Formalin in Phosphatpuffer fixiert und zweimal mit den O&sub1;- und O&sub4;-Antikörpern gefärbt.
    • 6.1.3 Immunofluoreszenz
  • Es wurden die nachgenannten Antikörper als Marker für Oligodendrozyten, Astrozyten, Neuronen oder Fibroblasten eingesetzt: Oligodendrozyten: monoklonaler Antikörper O&sub4; von der Maus (Sommer und Schachner, 1981, Dev. Biol. 83: 311-327); monoklonaler Antikörper O&sub1; von der Maus (Sommer und Schachner, 1981, Dev. Biol. 83: 311-327); mit Spezifität in bezug auf Galactozerebrozid (GalC, Singh und Pfeiffer, 1985, J. Neurochem. 45: 1371-1381); Antiserum von der Ziege gegen auf Myelin basierendem Protein vom Kaninchen (Omlin, u. a., 1982, J. Cell Biol. 95: 242-248). Vorstufenzellen: monoklonaler Antikörper A&sub2;B&sub5; von der Maus (Sera-Lab, Crawley Down, GB). Astrozyten: Antiserum vom Kaninchen gegen gliales fibrilläres Säureprotein (GFAP; Dahl und Bignami, 1976, Brain Res. 116: 150-157). Neuronen: monoklonaler Antikörper von der Maus gegen Neurofilamente vom Meerschweinchen oder Kaninchen (Willard und Sinon, 1981, J. Cell Biol. 89: 198-205). Fibroblasten: monoklonaler Antikörper Ox7 von der Maus gegen Thy-1.1 (Sera-Lab); Antiserum von der Ziege gegen humanes Fibronectin (LETS-Protein; Cappel, NC).
  • Die spezifischen Antikörper wurden sichtbar gemacht durch die entsprechenden Anti-Maus-, Anti-Kaninchen- oder Anti-Ziegen-Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) oder Rhodaminisothiocyanat- (RITC-)gekoppelte sekundäre Antikörper (Cappel, NC). Vor dem Färben wurden die Kulturen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzösung, der 5% Sucrose und 0,1% Rinderserumalbumin zugesetzt waren, gewaschen. Die Antikörper O&sub1;, O&sub4; und A&sub2;B&sub5; waren gerichtet gegen Oberflächenantigene und wurden somit auf lebenden Kulturen bei Raumtemperatur für 30 Minuten in einer Verdünnung von 1: 20 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung/Sucrose/Rinderserumalbumin inkubiert. Antikörper gegen Thy-1 wurden 1 : 10 verdünnt, Anti-Fibronectin 1: 20. Die Kulturen wurden sodann zweimal gespült, für 10 Minuten mit 4% Formalin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung fixiert, erneut gespült, eine Stunde lang mit markierten sekundären Antikörpern inkubiert (Verdünnung 1 : 30 bis 1 : 100), gewaschen und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung:Glycerol (1 : 1) fixiert. Zur Sichtbarmachung von auf Myelin basierendem Protein (MBP) wurden die Kulturen kurz in 4% Formalin fixiert, dann mit Ethanol/Essigsäure behandelt und schließlich 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Anti-MBP-Antiserum inkubiert (Verdünnung 1: 500). Die Fixierung mit Ethanol/Essigsäure wurden ebenso angewandt zur Sichtbarmachung von Neurofilamenten. Für Experimente der zweifachen Markierung der Antikörper A&sub2;B&sub5; oder O&sub1; mit dem Antikörper O&sub4; wurden lebende Kulturen zunächst mit Antikörpern A&sub2;B&sub5; oder O&sub1;, dann mit Anti-Maus-FITC und schließlich mit Antikörper-O&sub4;-Antigen inkubiert; diese Reihenfolge wurde in einigen Versuchen umgekehrt. Das Färben von GFAP (gliales fibrilläres Säureprotein) erfolgte in Kulturen, die zuvor 30 Minuten lang bei 4ºC in 95% Ethanol/5% Essigsäure fixiert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung rehydriert worden waren. Im Falle der O&sub4;/GFAP-Doppelmarkierungs-Experimente erfolgte das Färben zunächst mit dem Antikörper O&sub4; auf lebenden Kulturen mit anschließender Fixierung in 4% Formalin und darauffolgender Ethanol /Essigsäure-Behandlung und GFAP-Färbung. Zur Sichtbarmachung von MBP wurden die Kulturen kurz in 4% Formalin fixiert, dann mit Ethanol/Essigsäure behandelt und schließlich mit Anti-MBP-Antiserum (1: 500) eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Ethanol/Essigsäure-Fixierung wurde ebenso zur Sichtbarmachung von Neurofilamenten angewandt.
  • Doppelt-markierte Kulturen wurden durch systematisches Untersuchen mit dem Fluoreszenzmikroskop auf das Vorhandensein eines Antigens (gewöhnlich O&sub4;) beurteilt, und jede markierte Zelle wurden auf das Vorhandensein des anderen Antigens, z. B. A&sub2;B&sub5;, O&sub1; oder GFAP geprüft.
    • 6.1.4 Bewertung von gemeinsamen Kulturen mit Nervenzellen, Neuroblastomzellen oder 3T3-Zellen
  • Antikörper-markierte Kulturen wurden systematisch mit dem Fluoreszenzmikroskop untersucht und alle O&sub4;-markierten Zellen wurden photographiert. Dieselben Felder wurden unter Phasenkontrast-Beleuchtung fotografiert. Die Oberfläche von Oligodendrozyten, die von Neuronen, Neuriten, Ganglion-Schwann-Zellen oder 3T3-Zellen besetzt war oder berührt wurde, würde geschätzt und die Oligodendrozyten wurden in 3 Kategorien eingeteilt: Zellen, deren Oberfläche bis zu 20%, zu 20-80% oder über 80% mit Neuronen, Neuriten oder 3T3-Zellen bedeckt war. Einzelne dünne Fortsätze, insbesondere von unreifen Zellen, blieben bei der Bewertung aus Gründen der Vergleichbarkeit mit dem dichten Netz aus Fortsätzen stark verästelter Oligodendrozyten oftmals unberücksichtigt. In Versuchen mit Retinazellen wurden der gesamte Oligodendrozytenbereich und die von Retinazellen überlappten Bereiche mit einem Digitalisiergerät von Hewlett-Packard gemessen. Die Oligodendrozyten-Unterarten wurden auf den entsprechenden fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen identifiziert. Die zur Identifizierung herangezogenen Kriterien waren Zellmorphologie und Antigen-Eigenschaften (O&sub4;/O&sub1;). Eine A&sub2;B&sub5;-Färbung konnte bei unreifen Zellen nicht als Marker eingesetzt werden, da dieses Antigen schnell verloren ging (ohne eine begleitende Änderung in der Zellmorphologie); nach gemeinsamer Kultivierung mit Neuronen. Die unterscheidenden morphologischen Kriterien waren: Gestalt und Größe des Zellkörpers, Anzahl der primären Fortsätze, Verzweigungsmuster von Fortsätzen und das Vorkommen von Anastomosen und Membranschichten innerhalb des Fortsatz-Netzwerks. Anhand dieser Kriterien konnten stark verästelte Oligodendrozyten und unreife Oligodendrozyten reproduzierbar unterschieden werden. Die meisten (jedoch nicht alle) der stark verästelten Zellen waren positiv in bezug auf das O&sub1;-Antigen; unreife Zellen waren beständig negativ.
  • Eine Quantifizierung der Richtung des Neuroblastomfortsatzauswuchses in bezug auf stark verästelte Oligodendrozyten erfolgte wie in Abbildung 5 dargestellt. Es wurden regelmäßig Proben stark verästelter Oligodendrozyten genommen, und benachbarte Neuroblastomzellen wurden als "angrenzend" eingestuft, wenn der Abstand zwischen dem Rand des Oligodendrozytenfortsatz-Netzwerkes und der NB-2A-Zelle kleiner als 2 Zellkörperdurchmesser war. Weiter entfernte Zellen wurden als "entfernt" eingestuft (Abb. 4, 5). Ein Kreis mit 8 Ausschnitten (4 Klassen) wurde über das Zentrum einer jeden Neuroblastomzelle gelegt, zu dem nächstgelegenen Oligodendrozyten-Zellkörper ausgerichtet, und es wurden die Neuroblastorn-Fortsätze in jedem Kreisausschnitt ausgezählt (Abb. 5).
    • 6.1.5 Darstellung von Myelin
  • Aus 200 g schweren Ratten wurde das Rückenmark herausgeschnitten, sorgfältig von zugehörigen dorsalen Rückenmarkswurzeln und ventralen Wurzeln gesäubert und homogenisiert (Polyton, 30 Sekunden mit halber Maximaldrehzahl). Die Ischiasnerven wurden herausgeschnitten, zerhackt und homogenisiert. Myelinfraktionen wurden durch Flotation von Überständen geringer Drehzahl auf Sucrose-Dichtegradienten isoliert (Colman u. a., 1982, J. Cell Biol. 95: 598-608). In einigen Versuchen wurde zur Entfernung möglicher eingeschlossener Schmutzpartikel die Rohmembranfraktion nach einem hypotonischen Schock gewaschen. Eine Sedimentation in hypotonischem Medium wurde bei 10.000 x g über 5 Minuten erreicht. Membranfraktionen in Sucroselösungen, die nicht megr als 50 mM Ionenarten enthielten, wurden für mehrere Stunden an den Vertiefungen von PLYS-beschichteten Gewebskulturschalen adsorbiert (ca. 0,1 mg Protein pro cm² Gewebskulturschale). Nichtgebundene Membranen wurden durch drei Waschgänge mit CMF-Hank-Lösung entfernt. Beschichtete Schalen wurden sodann unverzüglich in Versuchen zur Substratprüfung eingesetzt. In den Versuchen mit sympathischen und sensorischen Neuronen wurden kleine Tröpfchen von zentralem oder peripherem Myelin in festgelegten Mustern auf die 35-mm-Kulturschale aufgebracht.
  • Sympathische oder sensorische Neuronen, die wie oben beschrieben kultiviert worden waren, wurden nach 12 Stunden bis 4 Tagen, Neuroblastomzellen nach 5-24 Stunden und 3T3-Zellen nach 1-4 Stunden untersucht. Zur Quantifizierung wurden Neuroblastomzellen klassifiziert in runde Zellen, kleine Füßchen oder kurze Fortsätze tragende Zellen oder Zellen mit Fortsätzen, die länger als ein Zellkörperdurchmesser sind. 3T3-Zellen wurden klassifiziert in runde Zellen, kleine Füßchen oder kurze Fortsätze tragende Zellen oder große flache Zellen. Es wurden je Untersuchungsgegenstand drei bis vier Fotos pro Kultur nach dem Zufallsprinzip aus 3 Kulturen geschossen.
    • 6.2 Ergebnisse 6.2.1 Kulturen von aus jungen oder ausgewachsenen Ratten herausgeschnittenen Sehnerven
  • GFAP-positive Astrozyten machten ungefähr 30% der Zellen in herausgeschnittenen Sehnerven von 10 Tage alten Ratten aus. Ungefähr 50% der Zellen waren positiv in bezug auf das O&sub4;-Antigen, ein Marker für differenzierte (GalC-positive) und unreife (A&sub2;B&sub5;-positive) Oligodendrozyten. Es war bei der Markierung keine Überlappung zwischen O&sub4; und GFAP oder O&sub4; und Thy-1 festzustellen, was die Spezifität des O&sub4;-Antikörpers als ein Marker für die Familie der Oligodendrozyten bestätigt (Sommer und Schachner, 1981, Dev. Biol. 83: 311-327). Thy-1-positive Fibroblasten mit großen flachen Morphologien machten ungefähr 20% der Zellen in Sehnerven junger Ratten aus.
    • 6.2.2 Unterarten von Oligodendrozyten
  • In Kulturen von 7-10 Tage alten Ratten waren 50% der O&sub4;-positiven Zellen A&sub2;B&sub5;-markierte Zellen. Diese Zellen waren O&sub1;-negativ (Tabelle I) und wiesen unterschiedliche Morphologien auf, einschließlich Zellen mit unregelmäßigen Fortsätzen aus polygonalen Zellkörpern, flachen Zellen mit peripheren Fortsätzen, bipolaren Zellen oder mit feinen Füßchen versehenen Zellen. Ausgehend von diesem Marker-Profil (A&sub2;B&sub5;&spplus;, O&sub4;&spplus;, O&sub1;&supmin;) und in Übereinstimmung mit Schnitzer und Schachner (1982, Cell Tissue Res. 2245: 625-636) verstehen wir dies so, daß diese Zellen Vorstufen und unreife Oligodendrozyten sind, und wir geben ihnen die Sammelbezeichnung "unreife Oligodendrozyten": Diese Zellgruppe ist wahrscheinlich heterogen, wie es auch die verschiedenen Morphologien vermuten lassen. Feine Füßchen tragende Zellen können die am weitesten entwickelten sein (Tabelle I). TABELLE I A: UNTERPOLUPATIONEN VON OLIGODENDRO- ZYTEN (7 TAGE ALTE SEHNERVEN, 2 TAGE IN KULTUR) UNTERSCHEIDEN SICH IN IHRER MARKIERUNG MIT DEM AN-KÖRPER A&sub2;B&sub5;
  • Stark verästelte Oligodendrozyten
  • Zellen mit unregelmäßiger oder polygonaler Gestalt:
  • - flache membrantragende Zellen
  • - fortsatztragende Zellen
  • - Zellen mit feinen Füßchen B: UNTERPOLUPATIONEN VON OLIGODENDROZYTEN (7-10 TAGE ALTE SEHNERVEN, 2 TAGE IN KULTUR) GEKENNZEICHNET DURCH DIE ANTIKÖRPER O&sub1; (GalC) und A&sub2;B&sub5;*
  • Stark verästelte Oligodendrozyten
  • Zellen mit unregelmäßiger oder polygonaler Gestalt:
  • - flache membrantragende Zellen
  • - fortsatztragende Zellen
  • - Zellen mit einen Füßchen
  • * Sehnervenzellen, herausgeschnitten aus 7-10 Tage alten Ratten, wurden 2 Tage lang auf PORN kultiviert und entweder zuerst mit Antikörper A&sub2;B&sub5; (nachgewiesen durch Anti-Maus-FITC) und dann durch O&sub4; oder O&sub1; (nachgewiesen durch Anti-Maus-RITC) oder umgekehrt markiert. Der Anteil der doppeltmarkierten Zellen wurde aus den Werten berechnet, die für das Verhältnis zwischen A&sub2;B&sub5;&spplus;/O4/1&supmin;-Zellen und A&sub2;B&sub5;&spplus;/O4/1&supmin;-Zellen erzielt worden waren. Die Werte entsprechen dem Mittelwert der Standardabweichung von 4 bis 6 Kulturen (120-200 Zellen/Kultur) aus zwei getrennten Versuchen.
  • a) Diese Population von A&sub2;B&sub5;&spplus;/O4/1&supmin;-Zellen enthält Astrozyten vom Typ II sowie Vorstufenzellen, die keinen Oligodendrozyten-Marker exprimieren.
  • b) Variable, schwache, granuläre Färbung
  • Ungefähr 50% der O&sub4;-positiven Zellen waren nach 2-tägiger Kultivierung unter unseren Kulturbedingungen A&sub2;B&sub5;-negativ und O&sub1;-positiv. Die meisten dieser Zellen zeigten ein typisches stark verästeltes, radiales Fortsatz-Netzwerk. Wegen dieser charakteristischen Morphologie bezeichneten wir diese Zellen stark verästelte Oligodendrozyten (Tabelle I). Nach 2-tägiger Kultivierung waren die meisten der stark verästelten Oligodendrozyten aus Sehnerven von 10 Tage alten Ratten mit einem Antiserum gegen auf Myelin basierendem Protein (MBP) gefärbt. Nach unserem Verständnis sind diese Zellen daher myelinbildende Oligodendrozyten. Ihr charakteristisches Fortsatz-Netzwerk kann somit das Ergebnis einer instabilen, teilweise zusammengefallenen Myelinmembran sein, die gelegentliche flache Membranflächen aufweist. Die Gesamtausbeute an Zellen aus Nerven von ausgewachsenen Tieren war sehr gering. In Gewebskulturen von Gewebe ausgewachsener Tiere lagen sowohl differenzierte O&sub1;-positive stark verästelte Oligodendrozyten als auch unreife A&sub2;B&sub5;-positive Oligodendrozyten vor.
    • 6.2.3 Reaktion verschiedener Zelltypen auf stark verästelte Oligodendrozyten 6.2.3.1 Gemeinsame Kultivierung mit sympathischen oder sensorischen Neuronen
  • Zerlegte Zellen aus dem oberen Halsganglion und dem dorsalen Wurzelganglion neugeborener Ratten wurden zu Gliazellen nach 2-10 Tagen in Kultur zugegeben. Zu den Ganglien gehörige Schwann-Zellen und Fibroblasten wurden in einigen Versuchen durch Stöße von Ara C eliminiert. NGF (50 bis 100 ng/ml) wurde zu dem Kulturmedium hinzugefügt, was zu einem schnellen Faserauswuchs und zur Bildung dichter Neurit-Netzwerke innerhalb weniger Tage führte. NGF alleine hatte keine Auswirkung auf das Auftreten und die Morphologie von Oligodendrozyten. Gliazelltypen wurden durch Antikörper-Färbung am Ende der Experimente identifiziert (gemeinsame Kultivierung für die Dauer von 2 Tagen bis 2 Wochen).
  • In Kulturen mit einem dichten Neurit-Plexus war die überraschendste Feststellung das Vorkommen von neuritfreien "Fenstern", in deren Mitte Zellen mit radialen, stark verästelten Vorsätzen beobachtet werden konnten (Abb. 1). Eine Antikörper-Färbung identifizierte diese Zellen als stark verästelte Oligodendrozyten. Eine Quantifizierung der Wechselwirkung zwischen diesen Oligodendrozyten und Zellen des sympathischen Ganglions ist in den Abbildungen 2a und 2b dargestellt. An Oligodendrozyten angrenzende Astrozyten waren in diesen Kulturen rar, da die allgemeine Gliazelldichte sehr gering war; eine bevorzugte Vereinigung mit Astrozyten konnte daher nicht für dieses Ergebnis verantwortlich sein. Stark verästelte Oligodendrozyten schlossen Neuronen aus ihrem Bereich aus ungeachtet des verwendeten Kultursubstrats. Dieselben "Fenster" wurden auf reinen Kunststoff-, Collagen-, PORN- oder lamininbeschichteten Kulturschalen gebildet. Es war kein Unterschied zwischen sympathischen und sensorischen Neuronen festzustellen; beide wurden aus dem Bereich der stark verästelten Oligodendrozyten ausgeschlossen. Auch die Schwann-Zellen, sofern vorkommend, drangen weder in die Oligodendrozytenfortsatz-Netzwerke ein noch überwucherten sie diese (Abb. 1b). Im Gegenteil, unreife Oligodendrozyten, gekennzeichnet durch ihre unregelmäßigen Formen und das Fehlen von O&sub2;-Antigen, erlaubten das Neuritwachstum auf ihren Fortsätzen und Zellkörpern (Abbildungen 1b, 1e, 1f). A&sub2;B&sub5; konnte im Falle von unreifen Oligodendrozyten in gemeinsamer Kultur mit Neuronen nicht als Marker eingesetzt werden, da dieses Antigen nach Zugabe der Neuronen schnell verloren ging. Jüngste direkte Beobachtungen des Zusammentreffens von Wachstumskegeln und Oligodendrozyten zeigte, daß die Wachstumskegel-Bewegung nach Zustandekommen des Kontakts mit den feinen Füßchen aufhörte. Normale Wachstumskegel-Aktivität wurde während des Kontakts und der Überquerung von unreifen Zellen beobachtet. Diese Feststellungen schließen auch die Möglichkeit aus, daß diese "Fenster" sekundär in dem Neurit-Plexus gebildet worden waren. Astrozyten in denselben Kulturen wurden von einzelnen Neuriten oder Neuritenbündeln überwuchert (Abbildungen 3a, 3b). Dies galt für beide morphologische Typen, den flachen wie den sternförmigen Zellen.
    • 6.2.3.2 Gemeinsame Kultivierung mit Retinazellen von Rattenföten
  • Nach dem Ausstreichen von Retinazellen in Monolayer-Dichte auf 5 Tage alte Kulturen von nichtneuronalen Sehnervenzellen konnte eine typische Umordnung der Retinazellen beobachtet werden; während Oligodendrozyt-Vorstufenzellen häufig von Retinazellen kontaktiert wurden, waren die stark verästelten Oligodendrozyten weitgehend frei von ihnen (Abbildungen 1g, 1h, 3c, 3d). Auch hier wurden Astrozyten als Substrat vor PORN bevorzugt.
    • 6.2.3.3 Reaktion von anderen Zelltypen auf stark verästelte Oligodendrozyten
  • Neuroblastomzellen (Linie NB-2A) wurden in hoher Zelldichte auf zerlegte Sehnervenzellkulturen plattiert und durch 2 mM Dibutyryl- Zyclo-AMP oder GdNPF zur Faserproduktion angeregt. Sieben, 24 oder 28 Stunden später wurden die Kulturen fixiert und und eine Identifizierung von Oligodendrozyten durch Antikörper O&sub4; und O&sub1; vorgenommen. Auch hier waren die Bereiche der stark verästelten Oligodendrozyten ganz klar von Neuroblastomzellen ausgespart geblieben (Abbildungen 4a, 4b). Die von in der Nähe von Oligodendrozyten befindlichen Neuroblastzellen erzeugten Fortsätze zeigten weg von den Oligodendrozyten (Abbildungen 4A, 4b; Abbildung 5 und Tabelle IA). TABELLE IA AUSRICHTUNG VON NEUROBLASTOMZELLEN IN BEZUG AUF STARK VERÄSTELTE OLIGODENDROZYTEN % der Fortsätze je Sektor Angrenzende Neuroblastomzellen Entfernte Neuroblastomzellen Dargestellt in Abbildung 5
  • Primärkultur-Fibroblasten und Astrozyten in den Sehnerven-Präparaten sowie 3T3-Zellen von der Maus zeigten ein drastisches "Umgehungs-Verhalten" gegenüber stark verästelten Oligodendrozyten. In hoher Zelldichte in Sehnerv-Gliazellkulturen plattierte 3T3-Zellen koppelten an und dehnten sich aus auf dem PORN-Substrat innerhalb von 30 Minuten und 3 Stunden. In diesen sich bildenden Monolayers zeigten sich charakteristische "Fenster" entsprechend den Bereichen stark verästelter Oligodendrozyten (Abbildungen 4c, 4d). An den Berührungspunkten bildeten 3T3-Zellen einen sichelförmigen Zytoplasmawulst. Lamellipodia fehlten in diesem Bereich. Von Bedeutung ist, daß Fibroblasten, die direkt auf stark verästelten Oligodendrozyten landeten, eine Ausbreitung vollkommen unterließen. Was die Neuronen anbelangt, so wurden unreife Oligodendrozyten von 3T3-Zellen nicht erkennbar gemieden (3T3-Zellen).
    • 6.2.4 Fehlen von Gattungsspezifität
  • Weder die spezifische Morphologie noch die ungünstige Substrateigenschaft von Oligodendrozyten waren gattungsspezifisch. Zerlegte nicht-neuronale E13- und E14-Hühner-Sehnervenzellen neben O&sub4;-positiv /A&sub2;B&sub5;-negativ/O&sub1;-positiv stark verästelte Oligodendrozyten. Auf nichtneuronale Zellen vom Huhn ausgestrichene 3T3-Zellen bildeten das charakteristische "Fenster" um diese Hühner-Oligodendrozyten herum.
    • 6.2.5 Myelin als Substrat
  • Die Eigenschaften von Myelin als ein Substrat für Neuronen oder Fibroblasten wurden ebenso getestet, da Myelin aus spiralförmig gewickelten Oligodendrozyten-Membranen besteht. Rohe Myelin-Fraktionen aus dem Rückenmark oder Ischiasnerv von ausgewachsenen Ratten wurden durch Flotation auf einem Sucrose-Gradienten präpariert. Das Myelin wurde auf PLYS-beschichteten Gewebskulturschalen absorbiert und auf seine Substrateigenschaften für Zellen des Ganglion cervicale superius, Zellen des dorsalen Wurzelganglions, Neuroblastomzellen und 3T3-Zellen hin untersucht. Alle vier Zelltypen koppelten schlecht an ZNS-Myelin an und zeigten markante Schwierigkeiten in ihrem Fortsatzauswuchs. Sympathische und sensorische Neuronen auf ZNS-Myelin blieben rund und brachten kurze, abortive Fasern anstelle hervor trotz der Gegenwart von NGF (50 ng/ml oder 100 ng/ml) (Abbildungen 7a, 17c). Im Gegenteil, es wurden lange Fasern produziert auf Inseln von Ischiasnerv-Myelin in denselben Kulturschalen (Abbildungen 7b, 17d). Kleine ZNS-Myelin-Inseln auf PLYS tauchten als "Fenster" auf, die von ausgeschlossenen Neuriten hervorgehoben wurden, während PNS-Myelin-PLYS-Grenzen offensichtlich nicht von wachsenden Neuriten entdeckt worden waren.
  • Der Auswuchs von Fortsätzen von Neuroblastomzellen (Linie NB-2A) in der Gegenwart von Dibutyryl-Zyklo-AMP wurde durch ZNS-Myelin erheblich reduziert (Abb. 8a).
  • Das Auswachsen von 3T3-Fibroblasten wurde durch ZNS-Myelin stark gehemmt. 3T3-Zellen blieben rund oder brachten spindelförmige oder polygonale Morphologien mit einer minimalen Zell-Substrat-Wechselwirkung hervor. Demgegenüber wurden große flache Membranen innerhalb von 20 bis 30 Minuten auf Polylysin gebildet und, in einer etwas kürzeren Zeit, ebenso auf Myelin aus dem peripheren Nervensystem (Abb. 8B). Nichtpermissivität war - zumindest zum großen Teil - mit Myelin-Membranen verbunden, da die Sedimentation bei 10.000 x g über 5 Minuten unter hypotonen Bedingungen (siehe Abschnitt 6.1.5) genügte, um die meisten nichtpermissiven Membranen zu pelletieren. Unter diesen Bedingungen würde von den meisten Oberflächenmembranbestandteile, die in geringeren Dichten als die von 0,85 M Sucrose ausschwimmen, nicht erwartet werden, daß sie sedimentieren.
  • ZNS-Myelin-Nichtpermissivität ist nicht Astrozytemembranen zuzuschreiben, da ein Zellmembranpräparat aus ZNS-Gewebe, das minimale Mengen von weißer Substanz enthält (oberflächliche corticale Schichten), ein permissives Substrat für ein Auswachsen von Fibroblasten war.
  • Diese Experimente zeigen, daß parallel zu den Wirkungen von lebenden, stark verästelten Oligodendrozyten, Myelin aus der ZNS ebenso ein stark nichtpermissives Substrat für Primärkultur-Neuronen, Neuroblastomzellen und 3T3-Fibroblasten ist. Myelin von dem peripheren Nervensystem zeigt keine vergleichbare nichtpermissive Substratwirkung.
    • 6.3 Erörterung
  • In dieser Studie stellten wir fest, daß myelin-bildende Oligodendrozyten und isoliertes ZNS-Myelin eine nichtpermissive Substratwirkung auf auswachsende Neuriten von sympathischen und sensorischen Neuronen und Neuroblastomzellen sowie für die Kopplung von Retinazellen und das Auswachsen von Fibroblasten ausüben.
  • Verschiedene Klassen von Zellen lagen in Kurzzeit-Kulturen von zerlegten Ratten-Sehnerven vor: Oligodendrozyten, Astrozyten (GFAP-positiv), Fibroblasten (Thy-1, Fibronectin-positiv) und verschiedene Typen von Vorstufenzellen. Innerhalb der Oligodendrozyten-Familie (O&sub4;-positiv; Sommer und Schachnerm 1981, Dev. Biol. 83: 311-327), zeichnete sich eine Unterart von Zellen aus durch das Fehlen von O&sub1;-Antigen (GalC) und von MBP, zwei Komponenten, die für Myelin besonders charakteristisch sind (Mirsky u. a., 1980, J. Cell Biol. 84: 483-494), und das Vorhandensein von Bindungsstellen für den Antikörper A&sub2;B&sub5;. Es wurde aufgezeigt, daß A&sub2;B&sub5; ein Marker für Oligodendrozyten/Typ-II-Astrozyt-Vorstufen, Typ-II-Astrozytenen und Neuronen ist (Schachner und Schachner, 1982, Cell Tissue Res. 2234: 625-636; Abney, E.R., u. a., 1981, Dev. Biol. 100 : 166-171; Raff u. a., 1983, Nature 303: 390-396). Daher stuften wir diese Zellklasse als unreife Oligodendrozyten ein, wahrscheinlich einschließlich Vorstufen wie diejenigen, die beschrieben worden sind von Dubois-Dalcq (1986, Soc. Neusci. Abstr. 12: 767) sowie Sommer und Noble (1986, Soc. Neurosci. Abstr. 12: 1585). Das Vorkommen von O&sub4; unterscheidet diese Zellen von den O2A-Vorstufen Raff, M.C., u. a., 1983, Nature 303: 390-396). Diese unreifen Zellen zeigten unregelmäßige und veränderliche Morphologien mit bipolaren Formen oder polygonalen Zellkörpern und unregelmäßigen Fortsätzen, oftmals besetzt mit feinen Füßchen. Die Zellklasse ist wahrscheinlich heterogen; es konnte eine Zellteilung beobachtet werden. Die zweite wichtige Oligodendrozyten-Unterklasse bestand aus A&sub2;B&sub5;-negativen, O&sub1;-positiven Zellen, die ein radiales, stark verzweigtes und pendelndes Fortsatz-Netzwerk besaßen. Die meisten dieser stark verästelten Oligodendrozyten in einer 2 Tage alten Kultur von 10 Tage alten Ratten-Sehnerven waren MBP-positiv unter unseren Kulturbedingungen. Wir verstehen diesen Zelltyp also so, daß er Oligodendrozyten darstellt, die aktiv bei der Synthese von Myelinmembranen, die flach auf dem Kultursubstrat bei Nichtvorhandensein von Axonen ausgewachsen waren. Diese Membranen sind instabil und fallen zusammen, um das charakteristische, pendelnde Fortsatz-Netzwerk zu bilden. Dieser Zelltyp ist als "haarige Augapfel-Zelle" ("hairy eyeball cell" (Sommer und Schachnerm 1981, Dev. Biol. 83: 311-327) beschrieben worden, und die Bildung von Windungen aus kompaktem Myelin durch solche Zellen ist nach längerer Kultivierungszeit beobachtet worden (Rome u. a., 1986, J. Neurose. Res. 15: 49-65; Yim u. a., 1986, J. Biol. Chem. 261: 11808-11815).
  • Sowohl unreife als auch myelinbildende Oligodendrozyten wurden festgestellt in Kulturen von Sehnerven von 7 bis 10 Tage alten Ratten oder ausgewachsenen Ratten ebenso wie in Kulturen von Sehnerven von 1 Tag alten Ratten, Rückenmark von neugeborenen Ratten oder Gehirnbalken (Corpus callosum) ausgewachsener Ratten sowie in Kulturen von Rückenmark und Sehnerven von E13- oder E17-Hühnerembryonen. Unreife Zellen waren ganz klar vorherrschend unter den aufgetrennten Einheiten jüngerer Stufen, jedoch schloß ein starker Abfall in der Zellausbeute nach Zerlegung mit zunehmendem Alter jegliche quantitative Populationsanalyse von vorneherein aus. Wie dem auch sei, unreife Oligodendrozyten konnten ebenso fortwährend gewonnen werden aus Gewebe der weißen Substanz von ausgewachsenen Ratten, was frühere Beobachtungen von French-Constant und Raff (1986, Nature 319: 499-502) bestätigte.
  • Die Zugabe von Neuronen zu eingerichteten Gliazellkulturen zeigte dramatische Unterschiede in den Substrateigenschaften für neuronale Ankopplung und Faserauswuchs unter den verschiedenen Arten von nicht-neuronalen Zellen. Astrozyten, insbesondere die flachen reaktiven protoplasmischen Astrozyten, hafteten an und begünstigten neuronale Ankopplung und Auswuchs, ganz in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen (Foucaud u. a., 1982, Cell Res. 137: 285-294; Hatten u. a., 1984, J. Cell. Biol. 98: 193-204; Noble u. a., 1984, J. Neurosci. 4 : 1982-1903; Fallon, 1985, J. Cell Biol. 100: 198-207). Unreife Oligodendrozyten wurden auch häufig von Neuriten oder Nervenzellkörpern kontaktiert. Dieses Verhalten könnte von starker physiologischer Relevanz sein. Während der Entwicklung wandern Oligodendrozyt-Vorstufen in die bereits gebildeten axonalen Bündel und bilden Fortsätze aus, um eine gewisse Anzahl von Axomen zu kontaktieren. Diese Fortsätze beginnen sodann sich aufzuwickeln und um die Axone herumzuwickeln, wobei sie die Struktur namens Myelin bilden (Wood und Bunge, 1984, W. T. Norton, Hrsg., 1-46).
  • In scharfem Kontrast zu Astrozyten und Oligodendrozyt-Vorstufen stellten wir fest, daß myelin-bildende Oligodendrozyten stark nichtpermissive Substrateigenschaften bezüglich neuronaler Anheftung und Faserauswuchs sowie bezüglich Fibroblast-Anheftung und -Ausbreitung aufzeigen. Diese Wirkung war selbst auf laminin-beschichteten Kulturschalen stark und pronunziert, die ansonsten ein ausgezeichnetes Substrat für Neuritwachstum darstellen (Manthorpe u. a., 1983, J. Cell Biol. 97: 1882-1980; Rogers u. a., 1983, Dev. Biol. 98: 212-220). Diese Wirkung konnte durch hohen Dosen von NGF in Kulturen sympathischer und sensorischer Neuronen oder von GdNPF oder Dibutyryl-cyclo-AMP in Kulturen von Neuroblastomzellen nicht überwunden werden. Eine ähnliche oder identische nichtpermissive Substrateigenschaft zeigte sich in Verbindung mit Ratten-ZNS-Myelin, nicht jedoch mit Myelin aus peripheren Nerven. Diese Wirkung war streng kontaktabhängig, da Nervenzellen oder Fibroblasten gut gediehen und sich frei in der unmittelbaren Umgebung dieser Oligodendrozyten oder ZNS-Myelin-Inseln bewegen konnten. 3T3-Zellen von der Maus wurden auch durch Hühner-Oligodendrozyten gehemmt, was zeigte, daß es sich hierbei nicht um eine gattungsspezifische Wirkung handelt.
  • Im Falle des Ratten-Sehnervs wird die Spitzenanzahl von Axonen am 20. embryonalen Tag erreicht gefolgt von einem dramatischen Rückgang der Axonen (Crespo u. a., 1985, Dev. Brain. Res. 19: 129-134). Oligodendrozyt-Vorstufen tauchen ab E17 auf (Raff u. a., 1985, Cell 42: 61-69) und exprimieren GalC um den Zeitpunkt der Geburt herum (Miller u. a., 1985, Dev. Biol. 111: 35-41). Das erste elektronenmikroskopisch nachweisbare Myelin zeigt sich am 6. Tage nach der Geburt (Hildebrand und Wayman, 1984, J. Comp. Neurol. 224: 25-37). Diese klar gezogene zeitliche Trennlinie zwischen axonalem Wachstum und Myelinbildung liegt auch im Falle von Hühner-Sehnerven vor (Rager, 1980, Cell Biol. 63: 1-92) und, wenngleich auch weniger gut erforscht, in vielen Trakten der weißen Substanz des ZNS (Matthews und Duncan, 1971, J. Comp. Neurol. 142: 1-22; Looney und Elberger, 1986, J. Comp. Neurol. 248: 336-347). Während der normalen Entwicklung treffen wachsende Axone daher wahrscheinlich nie auf Myelin oder myelinbildende Oligodendrozyten innerhalb ihrer Bündel, sondern treten vielmehr in Wechselwirkung mit Vorstufen und unreifen Oligodendrozyten. Der für In-vitro-Myelinbildung beobachtete extrem langsame Zeitverlauf (Wood u. a., 1980, Brain Res. 196: 247-252; Wood und Williams, 1984, Dev. Brain Res. 12: 225-241) könnte mit einer Situation in Einklang stehen, wo undifferenzierte Oligodendrozyten zunächst mit Axonen zusammenwirken und dann dazu stimuliert werden, sich zu differenzieren und Myelin zu bilden.
  • Im Gegensatz zur Entwicklungsphase treffen axonale Wachstumskegel oder -sprosse während der ZNS-Regeneration auf reife Oligodendrozyten und Myelin. Substrateigenschaften des ZNS-Gewebes, insbesondere das Fehlen leistungsfähiger neuritfördernder Substrate wie Laminin in dem differenzierten ZNS höherer Vertebraten, sind wichtige Aspekte im Zusammenhang mit ZNS-Regeneration (Liesi, 1985, EMBO J. 4: 2505-2511; Carbonetto u. a., 1987, J. Neurosci. 7: 610-620). Da Myelin und Oligodendrozyten jedoch für eine lange Zeit in denervierten ZNS-Trakten bestehen bleiben (Fulcrand und Privat, 1977, J. Comp. Neur. 176: 189-224; Bignami u. a., 1981, J. Neuropath, Exp. Neurol. 40: 537-550), könnte das Ausbleiben jeglicher Faserregeneration in Bereichen der weißen Substanz im Gegensatz zu peripheren Nerven und PNS/ZNS-Transplantaten mit diesen nichtpermissiven Substratfaktoren zusammenhängen.
  • Unter normalen Bedingungen sind das Blockieren bestimmter Zonen für ein späteres Wachsen axonaler Populationen während der Entwicklung, der Antagonismus zwischen günstigen und nichtpermissiven Substratmolekülen während der Entwicklung von ZNS-Projektionsmustern oder die räumliche Begrenzung der Sprossung in dem differenzierten Zentralnervensystem mögliche Funktionen für diese oligodendrozyt-assoziierte nichtpermissive Substrateigenschaft.
    • 7. BETEILIGUNG EINER METALLOPROTEASE AN DER GLIOBLASTOM-INFILTRATION IN DAS ZENTRALNERVENSYSTEM IN VITRO
  • In den hier detailliert ausgeführten Beispielen beschreiben wir eine membran-assoziierte Metalloprotease, die eine zentrale Rolle spielt bei der Infiltration des ZNS-Gewebes durch einen bösartigen Tumor in vitro am Beispiel der Ratten-Glioblastomzellinie C6.
  • Wir haben herausgefunden, daß die Infiltration von ZNS-Gewebe durch eine bösartigen Tumor in vitro durch die Glioblastomzellinie C6 eine plasmamembran-gebundene metallabhängige abbauende Aktivität erfordert. C6-Zellen dringen ein in Sehnerven-Explantate, heften sich an weißer und grauer Substanz Gefrierkleinhirnschnitten oder an ZNS-Myelin an und wachsen darauf aus. Der Metallionen-Chelatbildner 1,10-Phenantrolin und das Dipeptid cbz-tyr-tyr, nicht jedoch Inhibitoren für drei andere Klassen von Proteasen, blockierten bis zu 67% das Auswachsen von C6-Zellen auf ZNS-Myelin. Eine metallabhängige Aktivität, die die inhibitorischen Substrateigenschaft von ZNS-Myelin gegenüber 3T3-Zellen neutralisiert, ist mit einer C6-Plasmanmembran- Fraktion verbunden. Dieselben Metalloprotease-Inhibitoren beeinträchtigten auch die Infiltration von ZNS-Nerven-Explantaten und das Auswachsen auf der weißen Substanz des ZNS von Gefrierkleinhirnschnitten.
    • 7.1 Material und Verfahren 7.1.1 Zellkulturen
  • C6-Zellen von der Ratte, NIH-3T3-Zellen von der Maus und B16-Zellen von der Maus wurden in DMEM (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium), ergänzt mit 10% Kälberfötusserum, kultiviert, üblicherweise bis zu einer Konfluenz von maximal 70-80%. Die Zellernte erfolgte durch eine kurze Trypsin-Behandlung (0,1% in Ca²&spplus;/Mg²&spplus;-freiem Hank-Medium für 90 Sekunden), die durch Zugabe von FCS im Überschuß beendet wurde, und Sammlung durch Zentrifugation. Die Zellen wurden resuspendiert entweder in DMEM/FCS oder einem definierten serumfreien Medium (MEM) und für Experimente verwendet. Aufgespaltene Ratten-ZNS-Gliazellen wurden präpariert ausgehend von Sehnerven von 6 bis 7 Tage alten Lewis-Ratten, wie in Abschnitt 6.1.1 beschrieben, und in mit Poly-D-Lysin (PLYS) beschichtete Vertiefungen (100 mm², 100 ul Medium) in einer Dichte von 20.000 Zellen pro Vertiefung aufgebracht. Bei dem Kulturmedium handelte es sich um ein angereichertes L15-Medium mit 5% Rattenserum, Penicillin und Streptomycin. C6-Zellen, 3T3-Zellen und B16-Zellen wurden zu 2 Tage alten Kulturen in einer Konzentration von 30.000 Zellen je Vertiefung hinzugegeben, zwei Stunden lang inkubiert und mit warmem 4% Formalin in Phosphatpuffer fixiert. Inhibitorische Oligodendrozyten wurden durch zweifache Markierung unter Verwendung der spezifischen Antikörper O&sub1; und O&sub4; identifiziert (siehe Abschnitt 6.1.3).
    • 7.1.2 Präparierung von Nerven-Explantaten für Infiltrationstests
  • Explantate von Sehnerven und Ischiasnerven wurden wie beschrieben präpariert (Schwab und Thoenen, 1985, J. Neurosci. 5: 2415-2423). Kurz gesagt, die Nerven wurden schnell aus ungefähr acht Wochen alten männlichen Ratten herausgeschnitten, von den Hirnhäuten gereinigt, 3 Frost/Tau-Wechseln unter Verwendung von flüssigem Stickstoff unterzogen und unter einen Teflon-Ring (Durchmesser 13 mm, Stärke 1 mm) plaziert, der mit Siliconfett dicht mit einer Kulturschale verbunden war. Auf diese Weise erhielt man zwei nur durch die Explantate verbundenen Kammern. 300.000 C6-, 3T3- oder B16-Zellen wurden in die innere Kammer in DMEM/FCS plattiert und für 5 bis 20 Tage inkubiert. Das Medium wurde alle zwei Tage gewechselt. Die Kulturen wurden über Nacht mit 4% Formalin fixiert. Die Nerven-Explantate wurden mit Tissue-Tek fixiert, dann wurden in einem Kryostaten 10 bis 15 um Schnitte angefertigt und auf mit Gelatine beschichtetem Deckglas gesammelt. Nach dem Trocknen bei Raumtemperatur über Nacht wurden die Schnitte in 0,75%igem Cresylviolett gefärbt und beurteilt. Die infiltrierten Zellen wurden ausgezählt für jeweils 0,1 mm der Explantate, beginnend an der Spitze, wo Zellen hinzugegeben wurden. Aufgrund der 15-tägigen Inkubation wiesen die Explantate häufig unterschiedliche Durchmesser auf. Daher wurde nur der zentrale Teil der Nerven (0,25 mm) betrachtet, da nur dieser Teil der Explantate eine gute histologische Qualität zeigten. Inhibitionsversuche wurden mit Nerven-Explantaten durchgeführt, in die zuvor von beiden Seiten aus 2 ul 3 mM cbz-tyr-tyr- oder cbz-ala-phe-Lösung injiziert worden waren.
    • 7.1.3 ZNS-Gefrierschnitte und Myelin als Substrate
  • Es wurden Gefrierkleinhirnschnitte von ausgewachsenen Ratten präpariert und auf Deckglas getrocknet. 70.000 C6-, 3T3- oder B16-Zellen in 100 ul wurden zu jeder Vertiefung, die Scheiben enthielten, die zuvor mit kaltem DMEM/FCS gespült worden waren, gegeben. Die Kulturen wurden 2 Tage lang bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen fixiert und mit Cresylviolett gefärbt. Drei bis vier Kleinhirnscheiben wurden pro Punkt pro Versuch verbraucht, wobei jeder Versuch mindestens zweimal wiederholt wurde.
  • Aus dem Rückenmark (ZNS) oder Ischiasnerv (PNS) von der Ratte stammendes Myelin, gereinigt über einem kontinuierlichen Sucrose-Gradienten wie in Abschnitt 6.1.5 beschrieben, wurde über Nacht auf PLYS-beschichteten Vertiefungen (20 ug Protein/Vertiefung mit 100 mm² Fläche) getrocknet. Nicht gebundene Membranen wurden durch drei Waschvorgänge mit Ca²+/Mg²&spplus;-freier Hank-Lösung entfernt. Mit Myelin überzogene Vertiefungen wurden sofort in Substratuntersuchungstests durch die Zugabe von 9.000 Zellen (C6, 3T3 oder B16) je cm² verwendet. Alternativ setzten wir extrahiertes ZNS-Myelin-Protein oder mit SDS-PAGE gereinigte, in Liposomen rekonstrutierte 35-kD- und 250-kD-Inhibitorproteine ein (siehe Caroni und Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106: 1281-1288). Die Experimente wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops, das mit einer Photokamera ausgestattet war, bewertet. Quantifizierungen erfolgten anhand eines Oberflächenintegrationsprogramms; drei willkürlich gewählte Felder wurden je Vertiefung mit 80facher Vergrößerung aufgenommen und es wurden mindestens 25 Zellen pro Bild vermessen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von mindestens 3 Vertiefungen der Standardabweichung des Mittelwerts dar. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als u² projizierter Zelloberfläche oder in Grad, berechnet durch Subtraktion des Oberflächenwerts einer komplett kugelförmigen Zelle von dem Wert der projizierten Oberfläche einer sich auswachsenden Zelle.
    • 7.1.4 C6-Plasrnamembranen und konditionierte Mediumpräparate
  • C6-Zellen, die bis zu einer Konfluenz von 80% gezüchtet worden waren, wurden zweimal mit Hank-Medium gewaschen und in 20 ml 8,5% Sucrose, 50 nM NaCl, 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, unter Verwendung einer Gummilippe ("rubber policeman") geerntet. Nach mechanischer Homogenisierung durch eine Reihe von Nadeln unterschiedlicher Größe wurde eine Plasmamembranfraktion mit einem geringen Reinheitsgrad durch Zentrifugation (5 Minuten mit 3.000 x g, 10 Minuten mit 8.000 x g, schließlich 2 Stunden mit 100.000 x g) gewonnen. Eine Fraktion höherer Reinheit wurde isoliert durch Aufbringen des Materials auf einen kontinuierlichen Sucrose-Gradienten, der 50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4, enthielt (Quigley, 1976, J. Cell Biol. 71: 472-486). 20-40% Sucrose-Interphase (Fraktion der C6-Plasmamembranen) und 40-60% Sucrose-Interphase (Fraktion der C6-Mitochondrien) wurden gesammelt, in Hank-Medium gewaschen und in MEM resuspendiert.
  • Konditionierte Medien wurden gewonnen durch Kultivieren von C6- Zellkulturen für einen Tag in MEM bis zu einer Konfluenz von 80%. Das Medium wurde sodann gesammelt und 10 Minuten lang mit 3.000 x g zentrifugiert. Bei einigen Versuchen wurde das konditionierte Medium unter Verwendung von Centricon Tubes 10mal konzentriert.
    • 7.1.5 Behandlung von ZNS-Myelin mit C6-Plasmamembranen
  • ZNS-Myelin-beschichtete PLYS-Vertiefungen wurden wie in dem vorausgehenden Abschnitt beschrieben vorbereitet, jedoch wurden sie, anstatt einem sofortigen Test als Substrat unterzogen zu werden, zunächst mit 50 ul C6-Plasmamembranen (mit einem Gehalt an 0,8 mg Protein/ml MEM) 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Dann wurden die Schalen zweimal mit Hank-Medium gewaschen und sofort als Substrate für 3T3-Zellen eingesetzt. Bei einigen Versuchen wurden Protease-Blocker zu den Membranen unter Verwendung von l0fach konzentrierten Lösungen hinzugegeben.
    • 7.2 Ergebnisse 7.2.1 C6-Glioblastome, nicht jedoch 3T3-Fibroblasten oder B16-Melanome, dringen in vitro in Sehnerven und weiße Substanz des ZNS ein
  • Gefrorene Sehnerven- und Ischiasnerven-Explantate wurden unter einen Teflonring plaziert und mit Siliconfett abgedichtet (Schwab und Thoenen, 1985, J. Neurosci. 5: 2415-2423). C6- oder 3T3-Zellen wurden in dem Ring aufgetragen, so daß sie ein Ende der Nervenexplantate berührten. Das Kulturmedium wurde jeden zweiten Tag gewechselt, und nach 5- bis 20tägiger Inkubationszeit wurden die Nerven fixiert und mit einem Kryotom in Stücke geschnitten. Infiltrierte Zellen wurden durch Färbung mit Cresylviolett erkannt. PNS-Explantate unterstützten eine diffuse Infiltration sowohl von C6-Zellen als auch von 3T3-Zellen (Abbildungen 9c, d). C6-Zellen waren in den Explantaten in hoher Dichte vorhanden. In den Sehnerven-Explantaten zeigte sich ein anderes Bild (Abbildungen 9a, 9b); 3T3-Zellen waren nicht in die Nerven eingedrungen, abgesehen von sehr wenigen Zellen, die entlang von Blutgefäßen gewandert waren (Abb. 9b, Pfeil). Demgegenüber waren C6-Zellen tief in die Sehnerven in einem diffusen Muster eingedrungen und hatten innerhalb von 14 Tagen eine Strecke von maximal 3 mm ab dem Eintrittspunkt zurückgelegt (Wanderungsgeschwindigkeit: ca. 0,2 mm/Tag).
  • Als alternatives Modell wurden Gefrierschnitte vom Kleinhirn ausgewachsener Ratten als Kultursubstrat für C6-, B16- oder 3T3-Zellen eingesetzt. Die stark metastatischen B16-Melanomzellen, so war festzustellen, unterschieden ganz klar zwischen den Substrateigenschaften der grauen und der weißen Substanz in bezug auf Zellanheftung, -fortpflanzung und -migration. So zeigte sich, daß B6-Zellen nur in Zonen grauer Substanz hafteten und auswuchsen und daß sie selbst bei Aufbringung in hohen Zelldichten nicht auf Zonen weißer Substanz dieser Schnitte hafteten oder auswuchsen (Abb. 10e). Dasselbe Bild zeigte sich für 3T3-Zellen, die dichte Monolayers auf grauer Substanz bildeten, nicht jedoch auf weißer Substanz (Abbildungen 10c, 10d). Im Gegensatz zu B16- und 3T3-Zellen fanden sich C6-Zellen häufig auf weißer Substanz sowie auf grauer Substanz (Abbildungen 10a, 10b). In einigen Fällen stellten wir fest, daß die C6-Zellen auf der weißen Substanz dichter als auf der Molekularschicht der grauen Substanz vorkamen, wo sie oftmals kleine Klümpchen bildeten, die unter Schwierigkeiten auswuchsen.
    • 7.2.2 Glioblastomzellen werden durch ZNS-Myelin nicht am Auswachsen gehemmt
  • Das Fortpflanzungsverhalten von C6-Glioblastomen auf an PLYS-beschichteten Vertiefungen adsorbiertem ZNS-Myelin wurde verglichen mit dem von B16-Melanomen und 3T3-Fibroblasten. Die B16-Melanom- Reaktion gegenüber ZNS-Myelin-Substrat ähnelte stark dem von 3T3-Fibroblasten: das Auswachsen von 3T3- oder B16-Zellen auf ZNS-Myelin wurde stark beeinträchtigt, wohingegen das Auswachsen von C6-Zellen am Anfang (90 Minuten) geringfügig herabgesetzt war; jedoch zeigten sich zu späteren Zeitpunkten keine nennenswerten Unterschiede (Abb. 11). Die Unterschiede zwischen Zellen auf ZNS-Myelin einerseits und Zellen auf PLYS andererseits blieben auch bei verlängerten Inkubationszeiten (bis zu 1 Tag) bestehen.
  • C6-Zellen wurden mit den SDS-PAGE-gereinigten, in Liposomen rekonstituierten Inhibitoren (35 kD und 250 kD) ebenso wie mit lebenden, kultivierten Oligodendrozyten konfrontiert. Wieder hemmten die 35-kD- und 250-kD-Liposome in starkem Maße das Auswachsen von 3T3-Zellen, jedoch beeinträchtigten sie nicht die Fortpflanzung von C6-Zellen; C6-Zellen hafteten fest und nahmen auch auf diesen rekonstituierten ZNS-Myelin-Fraktionen schnell das für ein gutes Auswachsen charakteristische "Spiegelei"-Aussehen an.
    • 7.2.3 Spezifische Metalloprotease-Blocker hemmen das Auswachsen von C6-Zellen auf ZNS-Myelin
  • Der Einfluß von Proteasen auf das Verhalten von C6-Zellen wurde untersucht durch Ermittlung der Auswirkung von Metalloprotease-Inhibitoren auf das Auswachsen von C6-Zellen auf ZNS-Myelin und auf PLYS. Cys-, Ser- und Asp-Protease-Blocker in den geeigneten Konzentrationen zeigten keine erkennbare Auswirkung auf das Fortpflanzungsverhalten von C6-Zellen auf ZNS-Myelin (Tabelle II). TABELLE II AUSWIRKUNG VON VERSCHIEDENEN PROTEASE-INHIBITOREN AUF DAS AUSWACHSEN VON C6-ZELLEN AUF PLYS UND AUF ZNS-MYELIN-* Proteaseklasse keine, Kontrolle Serin Cystein asparaginsauer Metalloprotease allgemein Protease-Inhibitor Auswachsen auf: PLYS ZNS (% Kontrolle auf PLYS) Inhibition auf ZNS 6 Amino-capronat Hirudin Trasylol Leupeptin Pepstatin 1,10-Phenanthrolin Bestatin Phosphoramidon 2-Macroglubulin Cocktail
  • * Zellen wurden auf PLYS- oder ZNS-Myelin-beschichtete Kulturschalen ausgestrichen. Die Fortpflanzung wurde nach 150 Minuten wie in oben Kapitel "Material und Verfahren" beschrieben bestimmt. Inhibitionswerte wurden berechnet durch Subtraktion der für die Fortpflanzung auf ZNS-Myelin ermittelten Werte von den für die Fortpflanzung auf PLYS ermittelten Werten.
  • PMSF: Phenyl-methyl-sulfonyl-fluorid
  • TIMP: Gewebsinhibitor von Metalloproteasen ("Tissue inhibitor of metalloproteases")
  • Cocktail -: Trasylol 200 Einh./ml; Leuptin 0,3 mM; Pepstatin 0,3 mM
  • Cocktail +: wie Cocktail -, jedoch mit 0,3 mM 1,10-Phenanthrolin
  • nq: nicht quantifiziert, nur qualitativ
  • Demgegenüber bewirkte der spezifische Metalloprotease-Blocker 1,10-Phenanthrolin eine starke Hemmung des Auswachsens von C6-Zellen insbesondere auf ZNS-Myelin: 1,10-Phenanthrolin hemmte das Auswachsen von C6-Zellen auf Myelin bis zu 67% nach 2 Stunden in Kultur (Tabelle II). Keiner der getesteten Blocker zeigte eine bedeutende Wirkung auf das Auswachsen von C6-Zellen auf PLYS. 1,10-Phenanthrolin ist ein allgemeiner Metalloprotease-Inhibitor aufgrund seiner Eigenschaft als Metallion-Chelatbildung. Jedoch reicht die Hemmung durch diese Substanz nicht aus, um eine proteolytische Aktivität zu definieren, da andere metallabhängige Enzyme ebenso gehemmt werden. Viele andere Inhibitoren von Metalloproteasen sind gefunden worden, jedoch erwiesen sie sich üblicherweise als nicht so allgemein wie 1,10-Phenanthrolin. Phosphoramidon (Komiyama u. a., 1975, Biochem. Biophys. Res. Comm. 65: 352-357), Bestatin (Umezawa u. a., 1976, J. Antibiot. 29: 857-859) und der Metalloprotease-Gewebsinhibitor (TIMP; Cawston u. a., 1987, Biochem. J. 195: 159-165) beeinträchtigten nicht das Auswachsen von C6-Zellen (Tabelle II).
  • TIMP hemmt auch nicht eine zur Hirnhaut gehörige Metalloprotease am Abbau von Enkephalin. Carboxymethyl-phe-leu (Fournie-Zaluski, M.C., u. a., 1983, J. Med. Chem. 26: 60-65), ein modifiziertes Peptid mit starker Affinität für Enkephalinase (Almenoff, J., und M. Orlowski, 1983, Biochemistry 22: 590-599), hemmte nicht das Auswachsen von C6-Zellen (Tabelle II). Demgegenüber stellten wir fest, daß die Dipeptide cbz-gly-phe-NH&sub2; und cbz-tyr-tyr eine 55%ige Hemmung der C6-Zellfortpflanzung auf ZNS-Myelin bewirkten, nicht jedoch auf PLYS, PNS-Myelin oder Glas. Diese Peptide sind Substratpeptide mit Metalloprotease-Spezifität (Almenoff und Orlowski, a.a.O.; Baxter u. a., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4174-4178; Couch und Strittmatter, 1983, Cell 32: 257-265; Chen und Chen, 1987, Cell 48: 193-203; Lelkes und Pollard, 1987, J. Biol. Chem. 262: 15496-14505).
  • Um eine mögliche allgemeine Förderung der Fortpflanzung der C6- Zellen auf nichtpermissiven Substraten auszuschließen, prüften wir das metalloprotease-abhängige Auswachsen von C6-Zellen auf zwei weiteren Substraten neben PLYS und ZNS-Myelin (Abb. 12): PNS-Myelin und Glas. PNS-Myelin wurde als Kontroll-Substrat für die allgemeinen Eigenschaften einer Myelinmembran-Fraktion ausgewählt (z. B. hoher Gehalt an Lipiden), und Glas wurde ausgewählt wegen seiner bekanntermaßen schlechten Substratqualitäten. Eine halbe Maximalinhibition der Fortpflanzung auf ZNS-Myelin wurde mit 200 mM 1,10-Phenanthrolin erreicht. Auf PLYS, Glas und PNS-Myelin (Abb. 12) beeinträchtigte 1,1 0- Phenanthrolin das Auswachsen von C6-Zellen in Konzentrationen von bis zu 0,5 mM nicht (Abb. 12).
  • Eine Adsorption von ZNS-Myelin mit einem gegen ZNS-Myelin-inhibitorische Bestandteile gerichteten monoklonalen Antikörper (IN-1) (siehe Caroni und Schwab, 1988, Neuron 1: 85-96) kehrte die 1,10-Phenanthrolin-abhängige Inhibition des Auswachsens von C6-Zellen auf ZNS-Myelin-Liposomen weitgehend um (Tabelle III). Außerdem bewirkte IN-1 eine fast vollständige Neutralisierung der inhibitorischen Substrateigenschaft von ZNS-Myelin-Protein-Liposomen für 3T3-Zellen (Tabelle III). TABELLE III DIE INHIBITION DER C6-ZELLFORTPFLANZUNG DURCH 1,10-PHENANTHROLIN AUF ZNS-MYELIN WIRD DURCH AN-KÖRPER IN-1 NEUTRALISIERT-* Zellen-Antikörper 1,10-Phenanthrolin Fortpflanzung Wert auf ZNS-Lipos. PLYS % Inhibition auf ZNS.Lipos Maus-IgM
  • * ZNS-Myelin-Protein-Liposome wurden als Substrate eingesetzt und wurden vorab mit monoklonalem Antikörper IN-1 gegen die myelin-inhibitorischen Substratbestandteile adsorbiert (siehe Caroni und Schwab, 1988, Neuron 1: 85-96) oder mit IgM von der Maus. Das Auswachsen wurde nach 150 Minuten berechnet und ist ausgedrückt als !m² 10³.% Inhibition bezieht sich auf die für das Auswachsen auf PLYS ermittelten Werte.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß die Metalloprotease(n) eine wichtige Rolle spielt (spielen) bei der Überwindung von ZNS-Myelin-inhibitorischen Substrate durch Neutralisierung von IN-1-inhibitorischen Eigenschaften.
    • 7.2.4 Eine C6-Plasmamembran-assoziierte Aktivität neutralisiert die inhibitorische Substrateigenschaft von ZNS-Myelin
  • ZNS-Myelin-beschichtete Kultur-Vertiefungen wurden mit C6-konditioniertem Medium oder C6-Plasmamembranen inkubiert und anschließend auf ihre inhibitorischen Substrateigenschaft bei Auswachsen von 3T3-Zellen hin geprüft. Wir stellten fest, daß C6-Plasmamembranen eine Aktivität aufwiesen, die die ZNS-Myelin-inhibitorische Aktivität stark herabsetzte (Abb. 13, Tabelle IV). Dieselbe Behandlung führte ebenso zu einer Abschwächung der inhibitorischen Wirkung von ZNS-Myelin-Protein-Liposomen oder SDS-PAGE-gereinigten, rekonstituierten inhibitorischen 35-kD- und 250-kD-Komponenten. Die Abschwächung der ZNS-Myelin-inhibitorischen Aktivität hinsichtlich 3T3-Zelladhäsion und -fortpflanzung wurde quantifiziert durch Messung der Fortpflanzungswerte und DNA-Synthese (Tabelle IV). TABELLE IV C6-PLASMAMEMBRANEN SCHWÄCHEN DIE ZNS-MYELIN- INHIBITORISCHE SUBSTRATEIGENSCHAFT FÜR 3T3-ZELLEN AB Substrate 3T3-Zellfortpflanzung ³H-Thymidin-Inkorporierung PLYS ZNS-Myelin ZNS-Myelin, C6 PM ZNS-Myelin, C6 PM, phen.-behandelt ZNS-Myelin, C6 PM. EDTA-behandelt
  • * 3T3-Zellen wurden auf PLYS oder ZNS-Myelin ausgestrichen. Nach 150 Minuten wurde das Auswachsen beurteilt. ZNS-Myelin wurde inkubiert mit einer C6-Zellplasmamembran-Fraktion (C6 PM) bei Nichtvorhandensein oder Vorhandensein von Metalloprotease-Inhibitoren wie angegeben. ³H-Thymidin wurde hinzu gegeben, als die 3T3-Zellen ausgestrichen waren, und die Inkorporation wurde nach 20 Stunden bestimmt.
  • nb: nicht bestimmt
  • 1,10-Phenanthrolin, EDTA und das Dipeptid cbz-gly-phe-NH&sub2; blockierten vollkommen die C6-Plasmamembranwirkung. Trasylol, Leupeptin und Pepstatin hemmten diese Wirkung nicht. C6-konditioniertes Medium, eingesetzt in der vorliegenden Form oder in 10facher Konzentration, wies keine degradierende Aktivität auf, die die ZNS-Myelin-inhibitorischen Substrateigenschaften zu neutralisieren vermochte.
    • 7.2.5 Inhibitoren von Metalloproteasen beeinträchtigen das Auswachsen von C6-Zellen auf weißer Substanz des ZNS und das Eindringen von C6-Zellen in ZNS-Explantate
  • Zum Zwecke einer Untersuchung der Bedeutung der C6-Plasmamembran-Metalloproteaseaktivität nicht nur in bezug auf die Anheftung und das Auswachsen von C6-Zellen, sondern auch in bezug auf die Migration und das Eindringen von C6-Zellen, wurden C6-Zellen auf Gefrierkleinhirnschnitten plattiert oder zu Sehnerven-Explantaten hinzugegeben in Gegenwart von zwei Metalloprotease-Inhibitoren (1,10-Phenanthrolin und cbz-tyr-tyr). Parallelkulturen enthielten Inhibitoren für die drei anderen Proteaseklassen (Leupeptin, Pepstatin oder Trasylol) oder ein Kontroll-Dipeptid (cbz-ala-phe).
  • Die Gegenwart von 1,10-Phenanthrolin in unterschiedlichen Konzentrationen (50, 100, 200 und 300 mM) oder des Dipeptids cbz-tyr-tyr (100 mM) änderten die Verteilung und das Verhalten von C6-Zellen auf den Zonen weißer Substanz auf dramatische Weise bei Einsatz von Gefrierschnitten vom Kleinhirn als Kultursubstrate (Abb. 14). C6-Zellen hafteten auch in großen Mengen an der grauen Substanz an und breiteten sich extensiv darauf aus (Abb. 14).
  • In Ratten-Sehnerven wurden 4 ml 3-mM-Lösungen von entweder cbz-ala-phe oder cbz-tyr-tyr injiziert. Die Zellen wurden inkubiert mit Medium, das 0,5 mM Peptid enthielt. In der äußeren, zellfreien Kammer betrug die Peptid-Konzentration 1 mM. Nach 14 Tagen zeigten sich große Unterschiede hinsichtlich des Einwanderns von C6-Zellen in die Explantate (Abb. 15). Nerven, in die cbz-ala-phe injiziert worden war, enthielten mehr Zellen, und die C6-Zellinfiltration blieb unberührt im Vergleich zu Explantaten, in die nur Kulturmedium injiziert worden war. Demgegenüber hemmte cbz-tyr-tyr das Eindringen von C6-Zellen in alle 8 untersuchten Nerven (2 Versuche). C6-Zellen wurden hauptsächlich an den Schnittenden dieser Nervenexplantate vorgefunden und eine Tiefeninfiltration, die in Kontroll-Explantaten massiv auftrat, wurde durch cbz-tyr-tyr stark herabgesetzt.
    • 7.3 Erörterung
  • Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß C6-Glioblastomzellen im Vergleich zu Neuronen, Fibroblasten und B16-Melanomzellen nicht in ihrer Migration in Sehnerven-Explantate oder einer Anheftung und Fortpflanzung auf weißer Substanz des ZNS, auf isoliertem ZNS-Myelin oder lebenden Oligodendrozyten gestört wurden. Die Tatsache, daß sich das Verhalten von C6-Zellen in charakteristischer Weise von dem Verhalten verschiedener Zellarten in all den untersuchten Testsystemen unterschied, läßt gemeinsame zugrundeliegende zellbiologische Mechanismen sowohl für die Fortpflanzung von C6-Zellen auf einem inhibitorischen Substrat als auch für die Motilität von C6-Zellen in einer Umgebung (Sehnerv) vermuten, die nicht permissiv für Fibroblasten-, Schwann-Zellen- oder Melanomzellen-Migration sowie für das Einwachsen regenerierender Nervenfasern ist. Dieses Verhalten von C6-Zellen war nicht auf "Unempfindlichkeit" gegenüber den inhibitorischen Komponenten zurückzuführen, da die Motilität der C6-Zellen auf ZNS-Myelin oder weißer Substanz in Gegenwart von spezifischen Protease-Blockern in drastischer Weise gehemmt wurde, und diese Wirkung wurde umgekehrt durch selektive Neutralisation von myelin-assoziierten Inhibitorproteinen mit einem monoklonalen Antikörper (IN-1).
  • Eine Inaktivierung von myelin-assoziierten inhibitorischen Bestandteilen erfolgte durch lebende C6-Zellen sowie durch C6-Plasmamembranen. Unser Experiment, bei dem eine Reihe von Protease-Blockern mit unterschiedlichen bekannten Spezifitäten Einsatz fanden, zeigte, daß diese C6-assoziierte Aktivität zu der Familie der Metalloenzyme gehört. Die enge Parallelität, die zwischen der Verhinderung einer Fortpflanzung von C6-Zellen auf ZNS-Myelin und einer Verhinderung der Inaktivierung von myelin-assoziierten Inhibitorproteinen festgestellt wurde, läßt stark vermuten, daß eine Änderung der inhibitorischen Substratkomponenten durch eine Metalloprotease der Mechanismus sein könnte, der C6-Zellen befähigt, auf Myelin, auf weißer Substanz auszuwachsen und in Sehnerven-Explantate einzudringen.
  • Metalloproteasen bilden eine zahlenmäßig zunehmende Gruppe, deren Mitglieder sich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Blockern unterscheiden. Der allgemeinste Blocker ist 1,1 0-Phenanthrolin, durch das das Auswachsen von C6-Zellen auf ZNS-Myelin bis zu 67% beeinträchtigt wurde, wohingegen die meisten Inhibitoren anderer Proteaseklassen keine erkennbaren Wirkungen zeigten. In der frühen Phase (90 Minuten), nicht jedoch in der späteren Phase (300 Minuten) der C6-Zellfortpflanzung auf Myelin wurde außerdem eine Wirkung von trypsinähnlichen Serin-Proteaseinhibitoren festgestellt. Die Wirkung von 1,10-Phenanthrolin war dosisabhängig, bei einem IC&sub5;&sub0; von 200 mM. Diese Wirkung war spezifisch für das als Substrat eingesetzte ZNS-Myelin, da ein normales, schnelles Auswachsen von C6-Zellen auf anderen Substraten wie z. B. auf grauer Substanz des ZNS, PNS-Myelin, Glas oder PLYS in Gegenwart von 1,10-Phenanthrolin festgestellt worden war. Andere bekannte Metalloprotease-Blocker wie Bestatin (Inhibitor von Aminopeptidasen; Umezawa u. a., 1976, J. Antibiot. 29: 857-859), Phosphoramidon (Inhibitor von thermolysin-ähnlichen Metalloproteasen; Komiyama u. a., 1975, Biochem. Biophys. Res. Commun. 65: 352-357) und TIMP (Inhibitor von ECM-abbauenden Metalloproteasen; Cawston u. a., 1981, 195: 159-165) hatten keine Hemmung des Auswachsens von C6-Zellen auf ZNS-Myelin zur Folge. Da Metalloproteasen im allgemeinen eine hydrolytische Spaltung von Peptidbindungen bewirken, denen sich große aliphatische oder neutrale aromatische Aminosäuren anschließen, untersuchten wir die Wirkung von Dipeptid-Substrat-Analogen, die solche Reste enthielten. Cbz-gly-phe-NH&sub2; (1 mM) oder cbz-tyr-tyr (0,3 mM) hemmten die C6-Zellfortpflanzung spezifisch auf ZNS-Myelin. Cbz-gly-phe-NH&sub2; hemmte festgestelltermaßen andere 1,1 0-Phenanthrolinempfindliche Enzymaktivitäten mit relativ hoher Spezifität (Almenoff und Orlowski, 1983, Biochemistry 22: 590-599; Baxter u. a., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4174-4178; Couch und Strittmatter, 1983, Cell 32: 257-265; Chen, J.M., und Chen, W.T., 1987, Cell 48: 193-203; Lelkes und Pollard, 1987, J. Biol. Chem. 262: 15496-14505).
  • Inaktivität von C6-konditioniertem Medium und Zellfraktionierungs-Experimente zeigten, daß die myelin-gerichtete proteolytische Aktivität mit C6-Plasmamembranen in Verbindung steht. Über die Isolierung und Charakterisierung einer plasmamembrangebundenen Metalloprotease (Endopeptidase 24.11, Enkephalinase), die ebenso durch 1,10-Phenanthrolin, nicht jedoch durch TIMP gehemmt wird, ist von Almenoff und Orlowski (1983, a.a.O.) berichtet worden. Jedoch handelt es sich bei der hierin beschriebenen Metalloprotease wahrscheinlich nicht um eine Enkephalinase, da Carboxymethyl-phe-leu, ein Peptid mit starker Affinität in bezug auf Enkephalinase (Fournie-Zaluski u. a., 1983, J. Med. Chem. 26: 60-65), die C6-Fortpflanzung auf Myelin nicht beeinflußte. Eine von durch Rous-Sarkom-Virus transformierte Hühnerembryo-Fibroblasten exprimierte und an Adhäsionsstellen und auf "Invadopodia" ("Eindringfüßchen") lokalisierte Metalloprotease ist von Chen und Chen (1987, a.a.O.) beschrieben worden. Dieses Enzym wird auch von 1,10-Phenanthrolin und cbz-gly-phe-NH&sub2; gehemmt, nicht jedoch von Phosphoramidon, wie es bei der hier beschriebenen Metalloprotease der Fall ist. Im Unterschied zu dem von Chen und Chen beschriebenen Enzym konnten wir jedoch keine fibronectin-abbauende Wirkung an C6-Zellen feststellen.
  • Die stark metastatischen B16-Melanom-Zellen von der Maus wurden in allen mit C6-Zellen angewandten Tests untersucht. Interessanterweise wanderten die B16-Zellen nicht in die Sehnerven-Explantate, sondern reagierten auf die myelin-assoziierten Inhibitoren in einer der Reaktion von 3T3-Zellen oder Neuronen sehr ähnlichen Weise. Ganz im Einklang mit diesem In-vitro-Verhalten bilden B16-Zellen nach intraventrikulärer Injektion hauptsächlich Meningiome oder intraventrikuläre Tumore ohne bedeutende Infiltration des Gehirnparenchyms. Somit sind die Mechanismen, die B16-Zellen in der Peripherie ein metastatisches Verhalten geben, abweichend von denen, die C6-Zellen in dem ZNS-Gewebe starke Mobilität verleihen.
  • Die Inhibition von C6-assoziierten Metalloproteasen hemmte nicht nur die C6-Fortpflanzung auf ZNS-Myelin, sondern unterband auch die C6-Zellanheftung, -fortpflanzung und -migration auf weißer Substanz des ZNS, und das Dipeptid cbz-tyr-tyr beeinträchtigte stark die Migration von C6-Zellen in Sehnerven-Explantate. Diese Metalloprotease-Aktivität(en) kann (können) daher entscheidend an dem infiltrativen Verhalten von C6- Glioblastomzellen in ZNS-Gewebe beteiligt sein, auch in vivo.
    • 8. REGENERATION VON NERVENBAHNEN ÜBER LANGE STRECKEN IN LÄDIERTEM KNOCHENMARK VON RATTEN DURCH EINEN GEGEN MYELIN-ASSOZIIERTE NEURIT- WACHSTUMSINHIBITOREN GERICHTETEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPER
  • Der monoklonale Antikörper IN-1, der die inhibitorische Substratwirkung der myelin-assoziierten 35-kD- und 250-kD-Proteine und der ZNS-Gewebe-Explantate neutralisiert (Caroni und Schwab, 1988, Neuron 1: 85-96), wurde jungen Ratten intrazerebral verabreicht durch das Implantieren von antikörperbildenden Tumoren in den Neokortex. Auf das komplette Durchtrennen (Querschnitte) der corticospinalen Komponente der Pyramidenbahn (CST - Corticospinaltrakt) im Alter von 2 bis 4 Wochen folgte ein massives Aussprossen um die Läsion herum und bei mit IN-1 behandelten Ratten eine Elongation feiner Axone und Faszikel bis zu 8-11 mm von der Läsion entfernt innerhalb von 2 Wochen. In Kontroll-Ratten überschritt die maximale Strecke der festgestellten Elongation kaum 1 mm. Diese Ergebnisse zeigen das induzierte Regenerationsvermögen der ZNS-Bahn eines wichtigen motorischen Nervs innerhalb von differenziertem ZNS-Gewebe und verweist auf die klinische Bedeutung von ZNS-Neuritwachstumsinhibitoren und deren Antagonisten.
    • 8.1 Material und Verfahren 8.1.1 Präoperative Vorbereitung von Tieren einschließlich Implantation von Hybridomzellen
  • Jungen Lewis-Ratten (P2-11) wurde einseitig unter Äthernarkose 1 Mio. Hybridomzellen in 1 oder 2 ul in den dorsalen frontalen Kortex injiziert. Kontroll-Ratten wurde dieselbe Anzahl von Zellen einer Hybridomzellinie, die Antikörper gegen Meerrettichperoxidase produziert, injiziert. Ebenso wurden nichtgeimpfte Kontroll-Tiere eingesetzt. Hybridomzellen: IN-1-ausscheidende Zellen wurden gewonnen durch Fusion von P3U-Myelom-Zellen mit Milzzellen einer BALB/c-Maus, die gegen die PAGE-gereinigte 250-kD-Inhibitorprotein- Fraktion aus Ratten-Rückenmarkmyelin immunisiert worden war, wie von Caroni und Schwab (1988, Neuron 1: 85-96) beschrieben; Anti-Meerrettichperoxidase-ausscheidende Zellen wurden von Herrn Dr. P. Streit, Zürich, nach dem Protokoll von Semenenko u. a. (1985, Histochem. 83: 405-408) unter Einsatz derselben Myelom-Zellinie (P3U) wie für IN-1 gewonnen. Bei allen mit Hybridomzellen geimpften Ratten bildeten sich innerhalb weniger Tage Tumore zu soliden, gut abgegrenzten Tumoren aus, die oftmals die gesamte Stärke des Neokortex überspannten und die lateralen Ventrikel berührten (Abb. 16). Cyclosporin-A-Injektionen (15 mg/g Körpergewicht, 2 Injektionen im Abstand von 3 Tagen) halfen, eine Tumorresorption zu verhindern, die andernfalls nach 2 bis 3 Wochen einträte. Die massive Produktion von Antikörpern konnte nachgewiesen werden durch Anfärben von Gehirnschnitten mit Anti-Maus-Ig-FITC (FITC-konjugiertem Immunglobulin) (Abb. 16 b) sowie durch das Vorhandensein von IN-1-Antikörpern im Serum (ohne Angaben).
    • 8.1.2 Beibringung einer Rückenmarksverletzung - Verfahren
  • Rückenmarksverletzungen wurden im Alter von 2 bis 4 Wochen (Tabelle V) in Thoraxhöhe T&sub5;&submin;&sub7; durch geringfügiges Trennen zweier Wirbel und Durchtrennen der dorsalen zwei Drittel des Rückenmarks mit einer Iridektomieschere zugefügt. Die Läsion durchtrennte vollständig die Corticospinaltrakte auf beiden Seiten einschließlich der lateralen Projektionen in die dorsale graue Substanz sowie auch den Zentralkanal. Ventrale und laterale weiße Substanz blieb unberührt, was den Ratten ein scheinbar normales Verhalten ermöglichte. Die Läsionen wurden im Alter von 15 bis 29 Tagen zugefügt, d. h. 5-20 Tage nach Beendigung des Axonwachstums im Corticospinaltrakt (Tabelle V). Ein U-förmiger Draht aus rostfreiem Stahl wurde anschließend in die Läsionsstelle eingepflanzt, um eine vollständige Durchtrennung beider Corticospinaltrakte sicherzustellen und um die Läsionsstelle zu markieren. (Der Draht wurde vor dem Einbetten der fixierten Rückenmarksstränge zum Microtomieren entfernt). TABELLE V REGENERATION VON CORTICOSPINALTRAKT-AXONEN NACH LÄSIONEN IN THORAXHÖHE BEI KONTROLL-RATTEN UND BEI MIT ANTIKÖRPER IN-1 BEHANDELTEN RATTEN Tumortyp Tag der Läsion Weiterlebenszeitraum Max. Strecke des regenerierten CST-Axonen kaudal zur Läsion keiner Tage
  • Verfahren wie in Abb. 17 beschrieben. Nur Ratten mit regenerativen CST-Aussprossungen kaudal zur Läsion wurden bei dieser Analyse berücksichtigt. Die Distanzen regenerierender Fasern werden ausgehend von dem kaudalen Rand der Läsionskaverne gemessen. * Mindestdistanz, da regenerierende Fasern bis zum kaudalen Ende des Gewebeblocks reichen.
    • 8.1.3 Auswertung nach Läsion
  • Nach einem Weiterleben für 14 bis 28 Tage (Tabelle V) wurde in den frontalen und parietalen Kortex dem Tumor gegenüberliegend eine 5%ige WGA-HRP-Lösung (1 ul) injiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Ratten durch das Herz 10 Minuten lang mit 1,25% Glutaraldehyd und 1% Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer durchspült. Die herausgeschnittenen Rückenmarksstränge (10-15 mm) wurden in demselben Fixiermittel 1 Stunde lang nachfixiert, gründlich gewaschen und für das Microtomieren im Kryostaten eingebettet. Komplette Längsschnittfolgen wurden auf mit Gelatine beschichtete Objektträger aufgebracht und auf HRP zur Reaktion gebracht unter Verwendung von TMB als Substrat (Mesulam, 1978, J. Histochem. & Cytochem. 26: 106-117). Die Schnitte wurden unter Dunkelfeldbeleuchtung in polarisiertem Licht betrachtet. Nur Ratten mit vollständigen bilateralen CST-Läsionen und mit sich zeigenden Aussprossungen auf der kaudalen Seite der Läsion wurden bei der Auswertung berücksichtigt.
    • 8.2 Ergebnisse: Regeneration von Corticospinaltrakt-(CST-)Fasern über lange Strecken in IN-1-ausscheidende Tumore tragenden Ratten
  • Zwei Wochen nach den Läsionen im Alter von 1 Monat oder darüber wurde der Corticospinaltrakt durch anterograden Transport von WGA-HRP von dem frontalen und parietalen Kortex markiert. Die histologischen Untersuchungen der Läsionsstelle in Längs- und Querschnitten zeigte ein sehr ähnliches Bild bei allen Tieren: üblicherweise gab es einige kleine Kavernen, die mit dem Zentralkanal kommunizierten, ein Merkmal, das den örtlichen Zugang und das Eindringen der von der Zerebrospinalflüssigkeit herunterbeförderten Antikörper wahrscheinlich in großem Maße förderte. Das Gewebe war lokal verändert, jedoch lagen keine dichten Glia-Narben vor. Markierte CST-Fasern näherten sich der Läsion als ein dichtes und kompaktes Bündel an, aus dem eine massive Aussprossung in 0,5-1 mm Nähe zur Läsion erfolgte. Bei den meisten Tieren, Kontrolltieren oder mit IN-1 geimpften Tieren, waren Faserplexus und Faserbündel in und über der Läsionsfläche zu sehen, die in den meisten Fällen ventral oder lateral die Läsionskavernen umgingen, jedoch gelegentlich auch durch Gewebebrücken wuchsen, die sich in dem Draht-Trakt neugebildet hatten. Aus der Läsionsstelle heraustretende und in einer kaudalen Richtung wandernde Fasern konnten oft festgestellt werden. Bei Tieren ohne Tumore sowie in Ratten mit Anti-HRP-produzierenden Tumoren lagen die zurückgelegten Strecken gemessen an Längsschnitten von dem entfernten Rand der Läsion aus in den meisten Fällen unter 1 mm (Tabelle V, Abbildungen 17, 18). Selbst relativ dicke Faszikel schienen abrupt zu enden. Ganz im Gegensatz dazu zeigten Tiere, die IN-1 ausscheidende Tumore trugen, durchgehend markierte Faszikel und Fasern in weit größerem Entfernungen kaudal zu der Läsion (Abbildungen 17, 18). Bei den meisten Tieren wurden 2,5 bis 5 mm gemessen, bei 2 Ratten wurden 8 bzw. 11 mm festgestellt (Tabelle V). Anatomisch gesehen fanden sich diese über lange Strecken regenerierenden CST-Fasern oftmals in der Nähe von oder an der ursprünglichen CST-Stelle, wobei einige Fasern auch in der grauen Substanz und einige wenige Fasern in eher dorsalen, den sensorischen Trakten entsprechenden Regionen vorkamen.
    • 8.3 Erörterung
  • Bei Ratten weiß man, daß der CST während der ersten 10 auf die Geburt folgenden ("postnatalen") Tage das Rückenmark hinunterwächst, wobei die letzten Axone an den postnatalen Tagen P9-P10 hinzugefügt werden (Joosten u. a., 1987, Dev. Brain Res. 36: 121-139; Scheyer und Jones, 1988, Dev. Brain Res. 38: 103-119). Läsionen des Trakts bis zum 4.-5. Tag nach der Geburt (P4-P5) haben eine Umgehung der Läsionsstelle sowie ein sich über große Strecken vollziehendes, oftmals ektopisches Wachstum von CST-Fasern zur Folge (Schreyer und Jones, 1983, Neurosci. 9: 31-40; Bernstein und Stelzner, 1983, J. Comp. Neurol. 221: 382-400). Nach dem 6. Tage nach der Geburt (P6) ist keine Regeneration in dem CST festgestellt worden. Eine sehr ähnliche Reaktion auf eine Läsion wurde bei Hamstern und Katzen beobachtet (Kalil und Reh, 1982, J. Comp. Neurol. 211: 265- 275; Tolbert und Der, 1987, J. Comp. Neurol. 260: 299-311). Im Falle von Katzen war aufgezeigt worden, daß es sich bei diesen Fasern meist um spät eintreffende, neuwachsende Axone und weniger um sich regenerierende Axone handelt (Tolbert und Der, 1987. J. Comp. Neurol. 211: 265-275). Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß zumindest ein kleiner Teil der CST-Neuriten im Alter von 2 bis 3 Wochen dazu gebracht werden kann, sich zu regenerieren und über weite Strecken innerhalb des Rückenmarks auszudehnen. Die maximale Elongationsgeschwindigkeit liegt in dem Bereich von 0,5-1 mm/Tag.
  • Differenziertes ZNS-Gewebe von Säugetieren ist ein nichtpermissives Substrat für Neuritwachstum über eine Sproßlänge zwischen 0,2 mm und 1 mm hinaus (Cajal, 1959, in "Degeneration and Regeneration of the Nervous System", Hrsg. Hafner, New York, S. 1928; David, 1981, Science 214: 931-933; und Vidal-Sanz u. a., 1987, J. Neurosci. 7: 2894-2909). Diese Eigenschaft wird weit stärker durch weiße Substanz des ZNS als durch graue Substanz des ZNS exprimiert, wie anhand von Kultur-Versuchen und Transplantations-Untersuchungen aufgezeigt (Schwab und Thoenen, 1985, J. Neurosci. 5: 2415-2423; Carbonetto u. a., 1987, J. Neurosci. 7: 610-620). Transplantationen von fötalen adrenergischen oder serotoninergischen Neuronen von bestimmten fötalen Altersstufen in Rückenmarksstränge oder den Hippocampus von Erwachsenen stellen bislang die einzigen anderen Experimente dar, bei denen eine Elongation von Axonen in ZNS-Gewebe von Erwachsenen auf einer anatomischen Stufe beobachtet worden ist (Nornes u. a., 1983, Cell Tissues Res. 230: 15-35, Foster u. a., 1985, Exp. Brain. Res. 60: 427-444 und Bjorklund u. a., 1979, Brain Res. 170: 409-426). Diese sich verlängernden Axone waren fast ausschließlich auf die Bereiche grauer Substanz begrenzt.
  • Zwei zu Oligodendrozyten und Myelin gehörige Membranproteine, NI-35 (kD 35) und NI-250 (250 kD), mit möglichen inhibitorischen Wirkungen für das Neuritwachstum, wurden durch In-vitro- und biochemische Untersuchungen identifiziert (Schwab und Caroni, 1988, J. Neurosci. 8: 2381-2393; Caroni und Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106: 1281- 1288). Der monoklonale Antikörper IN-1, der die Aktivität dieser Bestandteile in verschiedenen In-vitro-Systemen einschließlich Sehnerven-Explantaten von ausgewachsenen Ratten neutralisiert (Caroni und Schwab, 1988, Neuron 1: 85-96), führt in dieser Darstellung zu einer tatsächlichen Regeneration von corticospinalen Axonen in jungen Ratten über Strecken von bis zu 5-11 mm weg von der Rückenmarksläsion innerhalb von 2 Wochen. Die ständige Versorgung mit Antikörpern in großen Mengen auf dem Wege der Zerebrospinalflüssigkeit durch einen Antikörper ausscheidenden Tumor in dem Kortex sowie die örtlichen Bedingungen der Läsion unterstützten wahrscheinlich das Eindringen der Antikörper in das Gewebe. Das Ausbleiben einer Axonverlängerung distal zur Läsionsstelle anstelle einer massiven Aussprossung um die Läsionsstelle herum bei Tieren, die Kontroll-Antikörper-Tumore trugen, bestätigt die Spezifität der festgestellten Wirkung. Diese Ergebnisse zeigen ganz klar die Fähigkeit von gegen das myelin-assoziierte Neuritwachstumsinhibitorprotein gerichteten Antikörpern zur Herbeiführung einer Neuronfaserregeneration über lange Strecken sowie die entscheidende Rolle der myelin-assoziierten Neuritwachtsumsinhibitoren für das unter normalen Bedingungen beobachtete Ausbleiben einer Regeneration lädierter ZNS-Fasertrakte auf.
    • 9. HINTERLEGUNG VON MICROORGANISMEN
  • Die nachgenannten, die angegebenen monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridome sind in der Europäischen Sammlung von tierischen Zellkulturen ("European Collection of Animal Cell Cultures"- ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury. Wiltshire, UK, unter den nachstehenden Zugangsnummern hinterlegt worden: Hybridom Antikörper Zugangsnummer Zellinie IN-1 Zellinie IN-2
  • Die hier beschriebene Erfindung ist in ihrem Umfang nicht begrenzt durch die hinterlegten Zellinien oder die in den Beispielen offenbarten Verkörperungen, die zur Veranschaulichung einiger weniger Aspekte dieser Erfindung gedacht sind.

Claims (53)

1. Ein das Neuritwachstum regulierender Faktor bestehend aus einem Molekül oder einem Derivat oder einem Fragment eines Moleküls, gekennzeichnet durch die nachgenannten Eigenschaften:
(a) Metalloprotease-Aktivität;
(b) Isolierbarkeit aus Glioblastomzellen; und
(c) Fähigkeit zur Neutralisierung der Hemmstoffeigenschaft von Zentralnervensystem-(ZNS-)Myelin eines höheren Wirbeltieres, wobei die Neutralisierung erfaßt wird durch Beobachten der Fähigkeit des ZNS-Myelins, in Gegenwart des Faktors Neuritauswuchs oder Fibroblastenausbreitung In v1tro zu fördern.
2. Der Faktor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Glioblastomzellen um Ratten-Glioblastom-C6-Zellen handelt.
3. Ein Verfahren zur Diagnose eines bösartigen Tumors bei einem Patienten, umfassend den Nachweis, daß in einer dem Patienten entnommenen Zentralnervensystem-Myelin-Probe ein das Neuntwachstum hemmender Faktor fehlt, wobei der das Neuritwachstum hemmender Faktor ein Protein beinhaltet, oder ein Derivat oder ein Fragment eines Proteins, gekennzeichnet durch die nachgenannten Eigenschaften:
(a) eine nicht-permissive Stoffeigenschaft, nachgewiesen durch die Fähigkeit, Neuritauswuchs oder Fibroblastenausbreitung in vitro zu hemmen; und
(b) Isolierbarkeit aus Zentralnervensystem-Myelin eines höheren Säugetiers.
4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der das Neuritwachstum hemmende Faktor ein Molekulargewicht von ca. 35.000 Dalton hat, bestimmt durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
5. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der das Neuritwachstum hemmende Faktor ein Molekulargewicht von ca. 250.000 Dalton hat, bestimmt durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
6. Ein Verfahren zur Diagnose eines bösartigen Tumors bei einem Patienten, umfassend den Nachweis, daß in einer dem Patienten entnommenen Zentralnervensystem-Myelin-Probe ein das Neuritwachstum hemmender Faktor fehlt, wobei der das Neuritwachstum hemmende Faktor ein Protein oder ein Derivat oder ein Fragment eines Proteins beinhaltet, gekennzeichnet durch die nachgenannten Eigenschaften:
(a) eine nicht-permissive Stoffeigenschaft, nachgewiesen durch die Fähigkeit, Neuritauswuchs oder Fibroblastenausbreitung in vitro zu hemmen; und
(b) die Fähigkeit, durch monoklonalen Antikörper IN-2, wie bei der ECACC unter der Zugangsnummer 88102802 hinterlegt, spezifisch gebunden zu werden.
7. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem bösartigen Tumor um ein Glioblastom handelt.
8. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem bösartigen Tumor um ein Glioblastom handelt.
9. Das Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem bösartigen Tumor um ein Glioblastom handelt.
10. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem bösartigen Tumor um ein Glioblastom handelt.
11. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Fehlen des hemmenden Faktors nachgewiesen wird durch Beobachten des Ausbleibens der Bindung jeglicher Komponenten in der Probe an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der bzw. das zur Reaktion mit dem hemmenden Faktor in der Lage ist.
12. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Fehlen des hemmenden Faktors nachgewiesen wird durch Beobachten des Ausbleibens der Bindung jeglicher Komponenten in der Probe an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der bzw. das zur Reaktion mit dem hemmenden Faktor in der Lage ist.
13. Das Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus monoklonalem Antikörper IN-1, wie bei der ECACC unter der Zugangsnummer 88102801 hinterlegt, und monok1onalem Antikörper IN-2, wie bei der ECACC unter der Zugangsnummer 88102802 hinterlegt.
14. Ein Verfahren zur Diagnose eines bösartigen Tumors bei einem Patienten, umfassend den Nachweis des Vorhandenseins eines das Neuritwachstum regulierenden Faktors gemäß Anspruch 1 in einer dem Patienten entnommenen Probe.
15. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem bösartigen Tumor um ein Glioblastom handelt.
16. Die Verwendung einer Zusammensetzung bestehend aus einer zur Behandlung eines Patienten mit einem bösartigen Tumor wirksamen Menge eines Metalloprotease-Inhibitors in einem geeigneten pharmakologischen Träger zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten mit einem bösartigen Tumor.
17. Die Verwendung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem bösartigen Tumor um ein Glioblastom handelt.
18. Die Verwendung einer Zusammensetzung bestehend aus einer zur Behandlung eines Patienten mit einem bösartigen Tumor wirksamen Menge einer die Metalloprotease-Aktivität des Faktors nach Anspruch 1 hemmenden Verbindung in einem geeigneten pharmakologischen Träger zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten mit einem bösartigen Tumor.
19. Die Verwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem bösartigen Tumor um ein Glioblastom handelt.
20. Die Verwendung gemäJ3 Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Metalloprotease-Inhibitor ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 1, 10-Phenanthrolin, Ethylendiamintetraacetat, Ethylenglycol-bis(&beta;-aminoethylether)-N,N,N'-N'-tetraacetat, Carbobenzoxy-tyrosin-tyrosin, Carbobenzoxy-glycinphenylalanin-amid, Carbobenzoxy-phenylalanin-tyrosin-amid, Carbobenzoxy-phenylalanin-phenylalanin-amid und Carbobenzoxy-glycin-phenylalanin-phenylalanin-amid.
21. Die Verwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthrolin, Ethylendiamintetraacetat, Ethylenglycol-bis(&beta;-aminoethylether)-N,N,N'-N'-tetraacetat, Carbobenzoxy-tyrosin-tyrosin, Carbobenzoxy-glycin-phenylalanin-amid, Carbobenzoxy-phenylalanin-tyrosin-amid, Carbobenzoxyphenylalanin-phenylalanln-amid und Carbobenzoxy-glycinphenylalahin-phenylalanin-amid.
22. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten mit einer Schädigung des Zentralnervensystems, umfassend eine zur Behandlung eines Patienten mit einer Schädigung des Zentralnervensystems wirksamen Menge einer der Wirkung eines Neuritwachstums-Inhibitors entgegenwirkenden Substanz in einem geeigneten pharmakologischen Träger, wobei der das Neuritwachstum hemmende Faktor ein Protein oder ein Derivat oder ein Fragment eines Proteins beinhaltet, gekennzeichnet durch die nachgenannten Eigenschaften:
(a) eine nicht-permissive Stoffeigenschaft, nachgewiesen durch die Fähigkeit, Neuritauswuchs oder Fibroblastenausbreitung in vitro zu hemmen; und
(b) Isolierbarkeit aus Zentralnervensystem-Myelin eines höheren Säugetiers.
23. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der das Neuritwachstum hemmende Faktor ein Molekulargewicht von ca. 35.000 Dalton hat, bestimmt durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
24. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der das Neuritwachstum hemmende Faktor ein Molekulargewicht von ca. 250.000 Dalton hat, bestimmt durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
25. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der das Neuritwachstum hemmende Faktor spezifisch gebunden wird durch monoklonalen Antikörper IN-2, wie bei der ECACC unter der Zugangsnummer 88102802 hinterlegt.
26. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der antagonistisch wirkenden Substanz um einen Antikörper oder eine Bindungsregion eines solchen handelt.
27. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der antagonistisch wirkenden Substanz um einen Antikörper oder eine Bindungsregion eines solchen handelt.
28. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der antagonistisch wirkenden Substanz um einen Antikörper oder eine Bindungsregion eines solchen handelt.
29. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der antagonistisch wirkenden Substanz um einen Antikörper oder eine Bindungsregion eines solchen handelt.
30. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper monoklonalen Antikörper IN-1 beinhaltet, wie von der Zellinie IN-1, wie bei der ECACC unter der Zugangsnummer 88102801 hinterlegt, erzeugt.
31. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper monoklonalen Antikörper IN-2 beinhaltet, wie von der Zellinie IN-2, wie bei der ECACC unter der Zugangsnummer 88102802 hinterlegt, erzeugt.
32. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Schädigung auf einen Infarkt, eine traumatische Schädigung, eine chirurgische Verletzung oder eine degenerative Störung des zentralen Nervensystems zurückzuführen ist.
33. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Schädigung am Rückenmark eingetreten ist.
34. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 26, 28, 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper durch die Einbringung einer antikörper-ausscheidenden Zelle in den Patienten verabreicht wird.
35. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten mit einem bösartigen Tumor, umfassend eine zur Behandlung eines Patienten mit einem bösartigen Tumor wirksamen Menge eines Neuritwachstums-Inhibitors in einem geeigneten pharmakologischen Träger, wobei der das Neuritwachstum hemmende Faktor ein Protein oder ein Derivat oder ein Fragment eines Proteins beinhaltet, gekennzeichnet durch die nachgenannten Eigenschaften:
(a) eine nicht-permissive Stoffeigenschaft, nachgewiesen durch die Fähigkeit, Neuritauswuchs oder Fibroblastenausbreitung in vitro zu hemmen; und
(b) Isolierbarkeit aus Zentralnervensystem-Myelin eines höheren Säugetiers.
36. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten mit einem bösartigen Tumor, umfassend eine zur Behandlung eines Patienten mit einem bösartigen Tumor wirksamen Menge eines Neuritwachstums-Inhibitors in einem geeigneten pharmakologischen Träger, wobei der das Neuritwachstum hemmende Faktor folgendes beinhaltet:
(a) eine nicht-permissive Stoffeigenschaft, nachgewiesen durch die Fähigkeit, Neuritauswuchs oder Fibroblastenausbreitung in vitro zu hemmen; und
(b) die Fähigkeit, durch monoklonalen Antikörper IN-2 wie bei der ECACC unter der Zugangsnummer 88102802 hinterlegt, spezifisch gebunden zu werden.
37. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß der das Neuritwachstum hemmende Faktor ein Molekulargewicht von ca. 35.000 Dalton hat, bestimmt durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
38. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß der das Neuritwachstum hemmende Faktor ein Molekulargewicht von ca. 250.000 Dalton hat, bestimmt durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
39. Die pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 35, 36, 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem bösartigen Tumor um einen Tumor aus der Gruppe bestehend aus einem Melanom und einem Nervengewebetumor handelt.
40. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten mit einer Schädigung des zentralen Nervensystems, umfassend eine wirksame Menge des Faktors nach Anspruch 1 in einem geeigneten pharmakologischen Träger.
41. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten mit einer Schädigung des zentralen Nervensystems, umfassend eine wirksame Menge des Faktors nach Anspruch 2 in einem geeigneten pharmakologischen Träger.
42. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 40 oder 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Schädigung auf einen Schlaganfall, eine traumatische Schädigung oder eine degenerative Störung des zentralen Nervensystems zurückzuführen ist.
43. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß sie desweiteren einen Metalloprotease-Inhibitor beinhaltet.
44. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß sie desweiteren einen Metalloprotease-Inhibitor beinhaltet.
45. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß sie desweiteren einen Metalloprotease-Inhibitor beinhaltet.
46. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß sie desweiteren einen Metalloprotease-Inhibit0r beinhaltet.
47. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 43, 44, 45 oder 46, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem bösartigen Tumor um einen Tumor aus der Gruppe bestehend aus einem Melanom und einem Nervengewebetumor handelt.
48. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 43, 44, 45 oder 46, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem bösartigen Tumor um ein Glioblastom handelt.
49. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 43, 44, 45 oder 46, dadurch gekennzeichnet, daß der Metalloprotease-Inhibitor ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 1,10-Phenanthrolin, Etylendiamintetraacetat Ethylenglycol-bis(&beta;aminoethylether)-N,N,N'-N'-tetraacetat, Carbobenzoxytyrosin-tyrosin, Carbobenzoxy-glycin-phenylalanin-amid, Carbobenzoxy-phenylalanin-tyrosin-amid, Carbobenzoxy-phenylalaninphenylalanin-amid und Carbobenzoxy-glycin-phenylalaninphenylalanin-amid.
50. Verwendung eines Metalloprotease-Inhibitors zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung eines bösartigen Tumors.
51. Verwendung einer die Metalloprotease-Aktivität des Faktors nach Anspruch 1 hemmenden Verbindung zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung eines bösartigen Tumors.
52. Verwendung einer der Funktion eines aus einem Protein oder einem Derivat oder einem Fragment eines Proteins bestehenden, das Neuritwachstum hemmenden Faktors entgegenwirkenden Substanz, gekennzeichnet durch die nachgenannten Eigenschaften:
(a) eine nicht-permissive Stoffeigenschaft, nachgewiesen durch die Fähigkeit, Neuritauswuchs oder Fibroblastenausbreitung in vitro zu hemmen; und
(b) Isolierbarkeit aus Zentralnervensystem-Myelin eines höheren Säugetiers,
zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung einer Schädigung des zentralen Nervensystems.
53. Verwendung eines aus einem Protein oder einem Derivat oder einem Fragment eines Proteins bestehenden, das Neuritwachstum hemmenden Faktors, gekennzeichnet durch die nachgenannten Eigenschaften:
(a) eine nicht-permissive Stoffeigenschaft, nachgewiesen durch die Fähigkeit, Neuritauswuchs oder Fibroblastenausbreitung in vitro zu hemmen; und
(b) Isolierbarkeit aus Zentralnervensystem-Myelin eines höheren Säugetiers,
zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung eines bösartigen Tumors.
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