KR100756423B1

KR100756423B1 - 성선자극호르몬 수용체를 바이오마커로 이용한 마이엘린의탐색방법

Info

Publication number: KR100756423B1
Application number: KR1020050101846A
Authority: KR
Inventors: 권오승; 박은아; 표희수; 허용호
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2005-10-27
Filing date: 2005-10-27
Publication date: 2007-09-07
Also published as: KR20070045497A; US20070099243A1; US7572595B2

Abstract

본 발명은 성선자극호르몬 수용체(GnRH-R)를 바이오마커로 이용한 마이엘린(myelin)의 탐색방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 GnRH-R과 마이엘린이 동일한 영역에서 관찰됨을 이용하여 GnRH-R의 항체로 면역조직화학염색을 실시하여 마이엘린의 분포를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 탐색방법은 탈마이엘린(demyelination)과 관련된 퇴행성 뇌질환의 연구, 마이엘린의 기능 및 마이엘린과 GnRH-R의 관련성을 규명하기 위한 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

성선자극호르몬 수용체, 마이엘린, 면역조직화학염색, 탈마이엘린

Description

성선자극호르몬 수용체를 바이오마커로 이용한 마이엘린의 탐색방법{Method for searching myelin using gonadotropin releasing hormone receptors as a new biomaker}

도 1은 마우스 전뇌 중 뇌량(corpus callosum) 및 대상다발(cingulum)에서의 마이엘린의 분포를 나타낸는 현미경 사진이고,

A, B: GnRH-R 면역조직 염색법 C, D: CNP 면역조직 염색법

E, F: Luxol fast blue(LFB)

배율: A, C, E는 X 100 ; B, D, F는 X 400

Cc: 뇌량(Corpus callosum), Cg: 대상다발(Cingulum), Crt: 회백질(Cortex)

(A 내지 F의 염색방법 및 배율은 이하 동일)

도 2는 마우스 전뇌 중 미상핵(caudate putamen)에서의 마이엘린의 분포를 나타내는 현미경 사진이고,

도 3은 마우스 후뇌 중 뇌량 및 대상다발에서의 마이엘린의 분포를 나타내는 현미경 사진이고,

도 4는 마우스 후뇌 중 시상수질선조(stria medullaris of thalamus)에서의 마이엘린의 분포를 보여주는 현미경 사진이고,

도 5는 마우스 후뇌 중 해마술(fimbria of hippocampus)에서의 마이엘린의 분포를 나타내는 현미경 사진이고,

도 6은 마우스 후뇌 중 내섬유막(internal capsule)에서의 마이엘린의 분포를 나타내는 현미경 사진이고,

도 7은 마우스 후뇌 중 시각로(optic tract)에서의 마이엘린의 분포를 나타내는 현미경 사진이다.

본 발명은 성선자극호르몬 수용체(GnRH-R)를 바이오마커로 이용한 마이엘린(myelin)의 탐색방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 GnRH-R과 마이엘린이 동일한 영역에서 관찰됨을 이용하여 GnRH-R의 항체로 면역조직화학염색을 실시하여 마이엘린의 분포를 측정하는 것에 관한 것이다.

성선자극호르몬(GnRH, gonadotropin-releasing hormone)은 시상하부(hypothamaus)에서부터 분비되어 뇌하수체(pituitary)에 도달되면, 뇌하수체 세포막에 존재하고 있는 특이성의 고 친화성 수용체와 결합하여 상호작용을 나타낸다. GnRH는 시상하부에서 펄스 방식으로 분비되며, 뇌하수체 세포에서 이루어지는 정상적인 생리학적인 합성 및 분비에 관련된 반응은 주로 수용체에 도달하는 펄스의 방 식에 달려있다(Belchetz PE et al., Science 202, 631-633, 1978).

사람의 GnRH 수용체(GnRH-R) 유전자는 3개의 엑손(exon)과 2개의 인트론(intron)으로 구성되어 있으므로(Fan NC et Moll. Cell. Endocrinol. 107, R1-R8, 1995), 다양한 스플라이싱(splicing)이나 여러 가지 변종의 전이가 가능하여 그 기능의 다양성을 암시해준다. GnRH 와 GnRH-R은 둘 다 주요 림프기관이나 림프구를 포함한 면역세포에서 발견되었다(Standaert FE et al., Biol. Reprod., 46, 997-1000, 1992). GnRH-R은 뇌하수체 이외에 고환이나 난소에서도 발견되었으며(Botte MC et al., J. Endocrinol. 159, 179-189, 1998), 또한 성장호르몬, 황체호르몬 또는 갑상선자극호르몬을 분비하는 뇌하수체 선종(pituitary adenoma)에서도 발견되었다(Rosa SL et al., Virchows Arch., 437, 264-269, 2000). 중추신경계의 뇌하수체에서의 생리학적인 기능에 관해서는 잘 알려져 있지만, 이 부위를 제외한 다른 부위에서 발견되는 GnRH-R에 대한 정보는 거의 연구되어 있지 않다.

마이엘린은 신경세포의 축삭(axon)을 둘러싸고 있는 비교적 지방이 풍부한 희돌기아교세포(oligodendrocyte)나 슈반(Schwann) 세포의 확장된 세포막으로서 활동전위에 의한 신경전도(nerve impulse)를 다른 신경세포나 작용근육 접합부에 효과적으로 전달하는 기능을 가지고 있다. 마이엘린을 구성하고 있는 주요 성분의 뚜렷한 특징으로는 단백질에 대한 지방의 비율이 매우 높다는 것이다. 특히 사람이나 설치류의 뇌에 존재하고 있는 마이엘린의 건조시킨 무게 중 단백질은 약 30%이고 나머지 약 70%는 모두 지방이 차지하고 있다. 중추신경계에 존재하는 마이엘린은 28%의 콜리스테롤, 28%의 글라이코리피드, 43%의 포스포리피드로 구성되어 있 으며, 글라이코리피드와 스핑코리피드가 전체지방의 약 35%를 차지한다.

중추신경계의 마이엘린에서는 40 가지 이상의 효소의 활성이 나타나는 것으로 알려져 있어, 마이엘린의 전기적 절연체로서의 기능은 고유한 효소의 활성에 의한 능동적인 대사기능으로 이해할 수 있다. 그 뿐 만 아이라, 마이엘린 막에는 무수카린 수용체(Larocca JN et al., J. Neurosci., 7, 3863-3876, 1987)나 G-단백질과 같은 수용체(Larocca JN et al., J. Neurochem., 57, 30-38, 1991)가 존재하여 신호전달 능력도 지니고 있다.

마이엘린은 주로 중추신경계의 회백질과 백질 중 백질에 존재하는데 Busch 방법, Loyez 방법 및 Luxol fast blue 방법 등의 염료 염색법에 의하여 이를 확인할 수 있다. 또한 면역조직화학 염색법에 의하여 사용되었던 마이엘린의 탐색지표로 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase(CNP), 마이엘린-관련 당단백질(myelin-associated glycoprotein), 마이엘린 염기성 단백질(myelin basic protein), 갈락토세로브로사이드(galactocerobroside), 마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein) 및 단백지질 단백질(proteolipid protein) 등의 마이엘린의 구성성분 단백질을 이용할 수 있다(Trapp BD et al., Cell biology of myelin assembly, In: Myelin biology and Disorders, edited by Lazzarini RA et al., p.29-55, Elsevier Academic Press, Amsterdam, 2004; Sospedra M. and Martin R, Ann. Rev. Immunol., 23, 638-747, 2005).

특정 단백질을 탐색용 마커로 사용한 예로는 대한민국 특허 10-2005-0052754에 기재된 ＰｒｘⅡ 단백질의 혈관 내피세포 탐지용 마커로서의 용도와 PrxII 단백 질에 대한 항체를 포함하는 혈관 내피세포 탐지용 조성물에 관한 내용이 있으나 상기 문헌과 더불어 여타의 문헌에도 GnRH-R이 특정부위 또는 물질 특히, 마이엘린의 탐색용 바이오마커로 사용되었다는 내용은 기재된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 마이엘린이 분포하고 있는 부위의 영역에서 GnRH-R도 존재하는 것을 관찰하여 마이엘린의 새로운 탐색지표로서 GnRH-R의 유용성을 제시함으로써 탈마이엘린 관련 퇴행성 뇌질환 등 마이엘린 관련 질병치료에 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 마이엘린 특수염색법과 면역조직화학법을 사용하여 GnRH-R의 분포가 마이엘린이 분포하는 영역과 동일한 지를 동시에 비교하고, GnRH-R을 마이엘린을 탐색하는 새로운 지표물질로서 활용하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이엘린 탐색을 위한 성선자극호르몬 수용체를 포함하는 바이오마커 및 이를 이용하여 마이엘린을 탐색하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 항 GnRH-R 항체를 포함하는 마이엘린 탐색용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 마이엘린 탐색을 위한 성선자극호르몬 수용체(gonadotropin-releasing hormone receptor, GnRH-R)를 포함하는 바이오마커 및 이를 이용하여 마이엘린을 탐색하는 방법을 제공한다.

본 발명의 GnRH-R을 새로운 바이오마커로 이용한 마이엘린 탐색방법은

1) 조직의 표본을 제작하는 단계;

2) 상기 표본 조직을 항-GnRH-R 항체와 반응시키고 세척하는 단계;

3) 단계 2에서 세척한 조직을 발색 표지체가 접합된 2차 항체와 반응시키고 세척하는 단계;

4) 단계 3의 시료에 발색 표지체와 반응하는 기질을 넣어 발색시키는 단계; 및

5) 완성된 슬라이드를 현미경으로 측정하는 단계를 포함하는 GnRH-R을 새로운 바이오마커로 이용한 마이엘린 탐색방법을 포함한다.

단계 1의 조직의 표본 제작은 업계에서 통상적으로 이용되는 과정, 즉 표본의 채취, 고정, 포매 및 절편 표본의 제작 등의 과정을 통해 제작될 수 있다. 표본 제작을 위해, 본 발명의 실시예에서는 마이엘린이 풍부하게 분포하고 있는 뇌 절편을 사용하였으나 마이엘린을 측정하고자 하는 조직에 특별한 제한이 있는 것은 아니며 측정하기를 원하는 모든 영역의 조직이 사용될 수 있다.

단계 2의 GnRH-R에 대한 항체는 시중에 판매되는 제품을 구입하거나 면역학에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, GnRH-R 단백 질을 인산염 완충 생리식염수에 용해하고, 필요량의 프로인트 완전 어쥬번트(freund's complete Adjuvant)로 혼합하여 유화한 후, 동물에 약 1주간 간격으로 피하 투여하고 수회 면역한다. 항체 역가를 측정하고 최고의 항체 역가에 달한 시점에서 추가 접종하고, 투여 후 적당한 시점에서 채혈을 한다. 수득한 항혈청을 황산암모늄 분획 침전하고, 글로불린 분획을 음이온 교환 크로마토그라피에 의해 정제하거나 또는 항혈청을 결합 완충액으로 희석하고, 그 희석 항혈청을 예를 들면 프로테인 A 또는 프로테인 G 세파로스 컬럼 크로마토그라피에 의해 정제하여 항 GnRH-R 단백질 폴리클론 항체를 얻을 수 있다.

GnRH-R 단백질에 대한 모노클론 항체 역시 면역학 분야의 종사자에게 잘 알려진 일반적인 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 즉, GnRH-R 단백질에 의해 마우스 또는 래트를 면역화시킨 후 면역화된 임파구세포를 골수종 세포주 등과 융합시켜 통상적인 방법에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 생성한다. 이 하이브리도마 배양액에 대하여 고도로 정제된 각각의 항원을 사용하여 고상(solid phase) ELISA에 의해 각각의 항원을 인식하는 항체 생산 하이브리도마를 선택한다. 수득된 하이브리도마를 클로닝하고, 얻은 안정한 항체 생산 하이브리도마를 각각 배양하여 목적으로 하는 항체를 수득한다. 상기 항체의 제조에 사용하기 위한 GnRH-R 단백질은 천연에서 분리된 것을 사용하거나 유전자 재조합 방법에 의하여 제조할 수 있다(Chapter 4. Antibodies: Structure and Function, In Immunology , Edited by R.A. Goldsby et al., W.H. Freeman and Company, Basingstroke, England, 2003).

2차 항체에 접합된 발색 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제인 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), 바이오틴(biotin), FITC(fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine) 등의 형광물질, 효소, 금속 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다.

상기 단계 3의 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, DAB(diaminobenzidine tetrahydrochloride), TMB(3,3',5,5'-tetramethylbezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine), AEC(3-amino-9-ethyl carbazole), 4CN(4-chloro-1-naphthol), 벤지딘 디하이드로 클로라이드(benzidine dihydrochloride), 은 입자(silver particle) 등을 사용할 수 있다.

본 발명자들은 GnRH-R 항체를 사용하는 면역조직화학법, 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase(CNP) 항체를 사용하는 면역조직화학법 및 Luxol fast blue 염색법으로 조직내 마이엘린을 염색하여 분포정도를 조사하고, 이와 본원 발명의 마이엘린 검출방법에 따른 결과를 비교하여 보았다. 이를 바탕으로 마이엘린의 새로운 탐색지표로 GnRH-R의 유용성을 제시하였다. 항-CNP 면역조직 염색법은 Nishizawa et al.의 방법을 일부분 수정하여 사용하였고(Nishizawa Y et al., Neurochemical Research, 10, 1107-1118, 1985) Luxol fast blue 염색법은 Margolis와 Pickett에 의한 방법을 일부 수정하여 실행하였다(Margolis G and Pickett JP, Lab. Invest., 5, 459-474, 1956). 그 결과, GnRH-R을 바이오마커로 사용한 마이엘린 탐색방법은 기존의 염색법으로 염색한 것과 유사한 결과를 나타냄으로써 GnRH-R이 마이엘린 마커로 유용함을 확인하였다. 마이엘린 관련 질병, 특히 탈마이엘린화(demyelination)에 의해 매개되는 상태는 허혈성 탈미엘린화 상태, 염증성 탈미엘린화 상태 및 다양한 병인론에 기인한 피질밑 백색질뇌증이 있으며, 본 발명의 마이엘린 검출방법은 상기 질병의 병리학적 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 키트는 항 GnRH-R 항체외에 면역조직화학염색을 수행하기 위한 상기의 발색 표지체가 결합된 2차 항체 및 기질을 포함하며, 이는 마이엘린 관련 병리학 연구, 병리조직의 진단, 치료방법의 결정 및 예후 판정 등에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 항-CNP 면역조직 염색법

항-CNP 면역조직 염색법은 Nishizawa et al.의 방법을 일부분 수정하여 사용하였다(Nishizawa Y et al., Neurochemical Research, 10, 1107-1118, 1985). 구 체적으로, 마우스(C57/BL6, 암컷, 18-20 g, 6-8 주령)를 4% 클로랄 하이드레이트(10 mL/kg; Sigma)로 마취한 후, 연동펌프(Masterflex^TM, Barnant Co.)를 사용하여 심장으로 4% 파라포름알데하이드/0.1 M 포스페이트 완충용액(pH 7.4)을 관류시켜 뇌를 고정화 시키고, 뇌를 분리하여 24 hr 동안 4℃에서 동일한 용액에 후고정화 시켰다. 그 다음 20% 설탕/0.1 M 포스페이트 용액에 밤새 보관한 후, 바이브라톰(Vibratome 1000 plus, Vibratome)을 사용하여 얇은 절편(40 ㎛)으로 만들어 0.1% 소디움아자이드/0.1 M 포스페이트 완충용액이 들어있는 24-웰 플레이트에 저장하여 사용할 때까지 4℃에 보관하였다.

해당하는 뇌 조직에 해당하는 절편을 50 mM Tris-HCl(pH 7.4)에서 세척하고, 0.5%의 H₂O₂/tris-HCl 용액(pH 7.4)에 30 분 동안 실온에서 방치하였다. 각 5분간 3회씩 tris-HCl 용액(pH 7.4)으로 세척 후, 0.5% triton-X/ 50 mM tris-HCl 용액(pH 7.4)에 25분간 반응시킨 후 상기와 동일하게 세척하였다. 10% 정상 마혈청(normal horse serum, Gibco-BRL)/ 3% 우혈청 알부민 (bovine serum albumin, Sigma)/ 0.1% triton-X in 50 mM tris-HCl 용액(pH 7.4)에 2 hr 동안 배양하였고, Tris-HCl 용액으로 각 5분 동안 3회씩 세척하였다.

여기에 염소 마우스 항-CNP 항체(1:100, Chemicon)를 1.5% 정상 마혈청/0.3% triton-X in 50 mM tris-HCl 용액(pH 7.4)에 1∼4 시간 동안 실온에서 배양시킨 후, 밤새동안 4℃에서 저장하여 반응시켰다. 다시 Tris-HCl 용액으로 각 5분 동안 3회씩 세척한 후, 염소 항-마우스 혈청(1:1000, Chemicon)을 1 시간 동안 실온에서 반응시키고 세척한 후, streptavidin horse-radish peroxidase in tris-HCl(50 mM) 용액(1:100, Silenus)을 첨가하여 1 hr 동안 실온에서 반응시겼다. 세척한 후, 발색 반응을 위하여 DAB 키트(1:10, diaminobenzidine tetrahydrochloride kit, Roche)용액에서 2-5 분 동안 반응시켰다.

<실험예 2> Luxol fast blue 염색법

Margolis와 Pickett에 의한 방법을 일부 수정하여 실행하였다(Margolis G and Pickett JP, Lab. Invest., 5, 459-474, 1956). 구체적으로, 마우스(C57/BL6, 암컷, 18-20 g, 6-8 주령)를 4% 클로랄 하이드레이트(10 mL/kg; Sigma)로 마취한 후, 연동펌프(Masterflex^TM, Barnant Co.)를 사용하여 4% 파라포름알데하이드/0.1 M 포스페이트 완충용액(pH 7.4)를 심장으로 관류시켜 뇌를 고정화 시키고, 뇌를 분리하여 24 hr 동안 4℃에서 같은 용액에 후고정화 시켰다. 그 다음 20% 설탕/0.1 M 포스페이트 용액에 밤새 동안 보관한 다음, 바이브라톰(Vibratome 1000 plus^TM, Vibratome)을 사용하여 얇은 절편(40 ㎛)을 만들어 0.1% 아자이드 나트륨/0.1 M 포스페이트 완충용액이 들어있는 24-웰 플레이트에 저장하여 사용될 때까지 4℃에 보관하였다.

해당하는 뇌 조직에 대응하는 이 절편을 슬라이드 글라스에 올려 건조시킨 후 95% 에탄올에 1 분, 0.1% luxol fast blue 용액(Sigma)에 실온에서 밤새동안 반응시키고, 70℃에서 5 시간 동안 가열 반응시켰다. 95% 에탄올, 증류수에 순서대 로 순간적으로 담가 세척하고, 0.05% 탄산화 리튬용액에 1 분간 접촉 반응시키고, 70% 에탄올에 1 분 동안 방치한 다음 증류수로 세척하였다. 회백질에 푸른색이 사라질 때까지 0.05% 탄산화리튬용액에 1 분간 접촉반응 시키고, 70% 에탄올에 1 분 동안 방치한 다음 증류수로 세척하는 단계를 반복하였다(이 단계는 대략 1 hr 정도 소요). 그 다음, 0.1% cresyl violet(Sigma) 용액에 1 분 동안 반응시키고, 증류수로 30 초 동안 세척한 후, 80%, 90%, 100% 에탄올 순서로 탈수시켜 커버글라스로 덮어 현미경으로 관찰하였다.

<실시예> GnRH-R 조직 염색법

마우스(C57/BL6, 암컷, 18-20 g, 6-8 주령)를 4% 클로랄 하이드레이트(10 mL/kg; Sigma)로 마취한 후, 연동펌프(Masterflex^TM, Barnant Co., Barrington, IL, USA)를 사용하여 4% 파라포름알데하이드/0.1 M 포스페이트 완충용액(pH 7.4)를 심장으로 관류시켜 뇌를 고정화 시키고, 뇌를 분리하여 24 hr 동안 4℃에서 같은 용액에 후고정화 시켰다. 그 다음 20% 설탕/0.1 M 포스페이트 용액에 밤새 동안 보관한 다음, 바이브라톰(Vibratome 1000 plus^TM, Vibratome)을 사용하여 얇은 절편(40 ㎛)을 만들어 0.1% 아자이드 나트륨/0.1 M 포스페이트 완충용액이 들어있는 24-웰 플레이트에 저장하여 사용될 때 까지 4℃에 보관하였다.

해당하는 뇌 조직에 대응하는 이 절편을 50 mM Tris-HCl(pH 7.4)에서 세척하고, 0.5%의 H₂O₂/ tris-HCl 용액(pH 7.4)에 30 분 동안 실온에서 방치하였다. 각 5 분간 3회씩 tris-HCl 용액(pH 7.4)으로 세척 후, 0.5% triton-X/ 50 mM tris-HCl 용액(pH 7.4)에 25 분간 반응시킨 후 위에서와 동일하게 세척하였다. 10% 정상 마혈청/ 3% 우혈청 알부민/ 0.1% triton-X in 50 mM tris-HCl 용액(pH 7.4)에 2 시간 동안 배양하였고, Tris-HCl 용액으로 각 5분 동안 3회씩 세척하였다. 여기에 염소 항-인간 GnRH-R 항체(sc-8682, 1:500, Santa Cruz)를 tris-HCl에 1.0% 우혈청 알부민(bovine serum albumin)이 첨가된 용액으로, 실온에서 배양하는 단계를 생략하고 12 hr 동안 4℃에서 저장하여 반응시켰다. 다시 Tris-HCl 용액으로 각 5 분 동안 3 회씩 세척한 후, 당나귀 항-염소 HRP IgG(donkey anti-goat horse-radish peroxidase IgG)/ tris HCl에 1.0% 우혈청 알부민이 첨가된 용액(1:500, Santa Cruz)을 1 hr 동안 실온에서 반응시겼다. 세척한 후, 발색 반응을 위하여 DAB 키트(1:10, diaminobenzidine tetrahydrochloride kit, Roche) 용액에서 2∼5 분 동안 반응시켰다.

<1> 마우스 전뇌의 뇌량 (corpus callosum)과 대상다발 (cingulum) 영역에서의 마이엘린의 염색

마우스 전뇌 중 GnRH-R의 면역조직 염색방법에 의한 GnRH-R의 분포는 뇌량(Cc)과 대상다발(Cg) 부분에서 뚜렷하게 관찰되었다(도 1). 이 결과는 마이엘린의 또다른 탐색지표로 이미 잘 알려져 있는 CNP의 분포나, 마이엘린의 특수염색방법인 Luxol fast blue에 의해서 나타난 결과와 매우 유사하였다. 대상다발 부분에서 CNP나 LFB 염색법에 의하여 마이엘린의 신경섬유를 포함하는 것과 비교할 때, GnRH-R은 작은 크기의 둥근모양의 구조만을 보여주는 것이 큰 차이점으로 나타났다. 이는 다른 염색법에 비해 GnRH-R이 마이엘린의 분포를 보다 정확하게 나타내고 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에 GnRH-R이 풍부하게 분포하고 있을 것임을 강하게 시사해주고 있다. 한편, LFB에서 보라색으로 나타나는 부분(E, F)은 크레실 바이올렛(cresyl violet)에 의해 신경세포의 세포체가 염색된 결과이다.

<2> 마우스 전뇌의 미상핵(caudate putamen) 영역에서의 마이엘린의 염색

마우스 전뇌 중 미상핵에서의 GnRH-R, CNP 및 LFB 염색 결과를 도 2에 나타내었다. GnRH-R, CNP 및 LFB 염색 모두 미상핵 영역에서 풍부한 마이엘린의 섬유다발(A, C, E)을 보이고, GnRH-R과 CNP는 섬유다발 사이에 둥근모양의 마이엘린 역영(B, D)을 보여주고 있다. GnRH-R은 CNP와 비슷한 형태의 염색결과가 관찰되지만 CNP에 비하여 더 진하고 크기가 큰 모양을 나타낸다. 이는 GnRH-R의 염색감도가 다른 염색법에 비해 높아, 마이엘린을 더 분명히 염색한다는 것을 의미한다.

<3> 마우스 후뇌의 뇌량과 대상다발 영역에서의 마이엘린의 염색(도 3)

도 1에서 같은 부위이지만, 다만 도 1에서보다 뒤쪽에 위치한 뇌의 횡단면(뇌정위지도(Sterotaxic map)에서 플레이트 33-34에 해당함을 보여주고 있다 (Paxinos G and Watson C, The rat brain in stereotaxic coordinates, 4th ed., Academic press, 1998). 이 부위에서 또한 GnRH-R, CNP 및 LFB의 결과는 비슷한 양상을 보여주며, 마이엘린이 풍부하게 존재하고 있는 영역에 걸쳐서 광범위하게 염색되었음을 알 수 있다. 대상다발 부위에서 CNP와 LFB에 의한 마이엘린의 염색과 비교할 때, GnRH-R은 더 넓은 영역으로 분포하고 있으며, 마이엘린 트랙의 띠가 더 넓게 분포하고 있는 것이 특징이다. 또한 대상다발 부위에서 필라멘트와 유사한 섬유모양의 마이엘린이 GnRH-R 염색에서는 뚜렷하게 나타나지 않고, 작은 크기의 둥근 모양으로 널리 퍼져있는 특징을 나타내고 있다. 이 현미경 사진에서도 해마(hippocampus) 부위에서는 마이엘린의 분포가 관찰되지 않음이 확인되었다. GNRH-R의 분포는 LFB 보다는 CNP와 더 유사한 양상을 나타내고 있다.

<4> 마우스 후뇌의 시상수질선조(stria medullaris of thalamus) 영역에서의 마이엘린의 염색(도 4)

제 3 뇌실 부근에 인접하고 있는 시상수질선조 부위에서의 GnRH-R, CNP 및 LFB의 염색 결과를 도 4에 나타내었다. 해마(hippocampus) 영역에서는 3 가지 방법 모두에서 기존에 알려진 바와 같이 마이엘린의 존재가 확인되지 않았고, 회백질 부분에서도 알려진대로 마이엘린이 풍부하게 존재하지 않는 것으로 나타났다.

<5> 마우스 후뇌의 해마술(fimbria of hippocampus) 영역에서의 마이엘린의 염색(도 5)

해마술 부위에서의 GnRH-R, CNP 및 LFB의 결과를 도 5에 나타내었다. 마우스 뇌의 해마술 영역에서는 CNP에 비하여 GnRH-R이나 LFB 염색법으로 마이엘린이 강하게 분포되는 결과를 보여주였다. 해마술은 뇌량이나 시각로(optic tract)과 함께 마이엘린이 풍부하게 분포하고 있는 지역으로 잘 알려져 있다(Schmued LC J. Histochem. Cytochem., 38, 717-720, 1990).

<6> 마우스 후뇌의 내섬유막(internal capsule)영역에서의 마이엘린의 염색(도 6)

내섬유막에서의 GnRH-R, CNP 및 LFB의 결과를 도 6에 나타내었다. GnRH-R의 결과가 CNP에 비하여 더욱 뚜렷하고 조밀하게 염색되어 있음을 볼 수 있다. 특히 GnRH-R의 항체가 CNP보다 더욱 강하게 염색되는 것이 관찰되었다. 이에 비하여 LFB는 마이엘린이 존재하는 전체의 지역을 동일한 밀도로 염색하는 패턴을 나타내었다.

<7> 마우스 후뇌의 시각로(optic tract) 영역에서의 마이엘린의 염색(도 7)

시각로에서의 GnRH-R, CNP 및 LFB의 결과를 도 7에 나타내었다. GnRH-R이 앞에서 보여준 뇌량, 대상다발, 해마술 및 내섬유막에서보다 더 강하게 염색되어 있음을 알 수 있다. 이에 비해 LFB는 상대적으로 시각로의 전체 영역을 염색하는 특징을 보여주고 있으므로 GnRH-R이 다른 2가지 염색법에 비해 마이엘린에 보다 특이적임을 확인하였다.

상기와 같이, 뇌의 각 부위를 기존에 알려진 방법인 CNP와 LFB에 비해 GnRH-R를 탐색용 바이오마커로 이용한 새로운 마이엘린 탐색방법은 뇌 내 마이엘린의 분포를 보다 정확하게 나타내고 염색강도도 강한 효과적인 방법임을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 GnRH-R을 바이오마커로 이용한 새로운 탐색방법은 기존의 염색법이나 탐색표시를 사용하였던 방법에 비해 마이엘린이 분포하고 있는 영역을 보다 정확하게 확인할 수 있으며, 현재까지 마이엘린 부위에서 GnRH-R의 존재가 알려져 있지 않았던 점에 비추어, GnRH-R의 생리학적인 기능을 규명하기 위한 연구, 다발성 경화증과 중금속 오염 등에 의하여 야기될 수 있는 탈수초화 퇴행성 뇌질환 등의 연구 및 신경과학이나 신경독성학 분야에서 마이엘린 관련 연구에 유용하게 사용될 수 있다. 더 나아가 추가연구 등을 통하여 탈수초화 퇴행성 뇌질환의 진단목적 등으로 응용범위의 확장이 가능할 것으로 기대된다.

Claims

성선자극호르몬 수용체(gonadotropin releasing hormone-receptor, GnRH-R)를 포함하는 마이엘린 탐색용 바이오마커.
하기의 단계를 포함하는 GnRH-R을 바이오마커로 이용한 마이엘린 탐색방법;

1) 조직의 표본을 제작하는 단계;

2) 상기 표본 조직을 항-GnRH-R 항체와 반응시키고 세척하는 단계;

3) 단계 2에서 세척한 조직을 발색 표지체가 결합된 2차 항체와 반응시키고 세척하는 단계;

4) 단계 3의 시료에 발색 표지체와 반응하는 기질을 넣어 발색시키는 단계; 및

5) 완성된 슬라이드를 현미경으로 측정하는 단계.
제 2항에 있어서, 조직은 마이엘린이 풍부한 뇌량(corpus callosum), 대상다발(cingulum), 해마술(fimbria of hippocampus), 내섬유막(internal capsule), 시상수질선조(stria medullaris of thalamus) 및 시각로(optic tract)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 마이엘린 탐색방법.
제 2항에 있어서, 단계 3의 발색 표지체는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloid gold), 바이오틴(biotin), FITC(fluorescein isothiocyanate), RITC (rhodamine-B-isothiocyanate), 및 로다민 B(rhodamine B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 마이엘린 탐색방법.
제 2항에 있어서, 단계 4의 기질은 DAB(diaminobenzidine tetrahydrochloride), TMB(3,3',5,5'-tetramethylbezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine), AEC(3-amino-9-ethyl carbazole), 4CN(4-chloro-1-naphthol), 벤지딘 디하이드로 클로라이드(benzidine dihydrochloride), 은 입자(silver particle)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 마이엘린 탐색방법.
항 GnRH-R 항체를 포함하는 마이엘린 탐색용 키트.