KR100196540B1 - 축색성장 조절인자 - Google Patents

Abstract

내용 없슴.

Description

[발명의 명칭]

축색 성장 조절인자

[도면의 간단한 설명]

제1도는 가지가 많은 핍지신경교의 무허용적 기질효과와 미성숙 핍지신경교에서의 이러한 효과의 결핍을 보여주는 안구 신경교 세포 배양물속에 있는 교감(a-d) 혹은 망막(e) 뉴우런을 나타낸다.

제2도(a)와 2도(b)는 가지가 많은(A) 또는 미성숙(B) 핍지신경교가 있는 Schwann세포와 교감 축색의 상호반응/중복빈도를 보여주는 막대그래프이다.

제2도(c)와 2도(d)는 가지가 많은(C) 또는 미성숙(D) 핍지신경교가 있는 망막세포의 상호반응을 보여주는 막대그래프이다.

제3도는 뉴우런 및 축색에 대한 흡착성기질을 나타내는 성상세포를 보여준다.

제4도(a)와 4도(b)는 가지많은 핍지신경교(O₄-양성)가 접착 및 NB-2A 신경아세포종 세포의 섬유 생장을 허용치 않는 것을 보여준다.

제5도는 가지많은 핍지신경교와 관계한 신경아세포종 처리 생성의 방향을 보여준다.

제6도는 3T3 세포가 가지많은(A) 또는 미성숙(B)한 핍지신경교가 겹쳐지는 것을 보여주는 막대그래프이다.

제7도는 기질로써 CNS 미엘린 이용한 축색생장을 억제시키는 것을 보여준다.

제8도는 신경아세포종 세포(A)에서 나온 축색생장과 3T3 세포확산(B)에 대한 CNS 미엘린의 무허용성 기질 효과와 그렇지 않은 PNS 미엘린의 영향을 보여준다.

제9도는 C6 안구신경 체외이식조직을 침투하고, 3T3 세포는 침투하지 않는다는 것을 보여준다.

제10도는 C6는 쥐의 소뇌 냉동부의 CNS 백질에 흡착하고 확산되며, 3T3과 B16 세포는 흡착 및 확산되지 않는다는 것을 보여준다.

제11도는 CNS 미엘린의 저해성 기질 특성을 극복하는 C6 세포를 보여준다.

제12도는 특별히 CNS 미엘린에서 확산하는 C6을 억제하는 1,10-페난트롤린을 보여준다.

제13도는 C6 혈장막에 의한 CNS 저해성 기질의 분해는 1,10-페난트롤린에 대해 민감하다는 것을 보여준다.

제14도는 쥐의 소뇌 냉동편의 CNS 백질에서의 C6 세포접착과 확산이 금속결합된 단백질분해 효소 차단인자에 의해 손상된 것을 보여준다.

제15도는 CNS 체외이식 조직속으로의 C6 세포 침입이 cnz-tyr-tyr에 의해 손상되는 것을 보여준다.

제16도는 8일된 쥐의 피질속에 있는 항체-분비 마우스 IN-1 하이브리도마 세포의 종양을 보여준다.

제17도는 4 IN-1 처리된 쥐(상부)의, 척수 병변으로부터 라벨 피질 척수관 섬유가 상당히 떨어진 곳에 있음을 보여주는데 그러나 4 조절 항-HRP 처리된 동물(하부)에서는 없었다.

제18도는 IN-1 처리된 쥐(a-d)와 항-HRP-처리된 쥐(e-g)의 척수 세로단편의 어두운 부분을 나타내는 현미경 사진이다.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 유전자와 또한 축색 성장을 조절하는 인코드된 단백질, 이것의 항체 및 이와 같은 단백질과 항체를 치료 및 진단에 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 중추신경계 미엘린 연관된 억제 단백질과 악성종양 특히 교아종과 뇌에 전이하여 확산할 수 있는 다른 종양 등의 주요 뇌종양과 관련된 금속결합 단백질분해 효소를 포함한다. 중추신경계 미엘린과 연관된 억제단백질은 축색생성과 섬유아세포 확산을 억제하여 악성종양 치료에 요긴하게 사용할 수 있다. 이러한 억제단백질에 대한 항체를 사용하여 악성종양을 진단하고 중추신경계 손상과 퇴행성 신경질환을 치료할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 축색 성장억제제에 대한 항체를 이용하여 척수손상에 따른 장기간에 걸친 신경재생을 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 금속결합 단백질분해 효소는 교아종의 침투성 성장과 중추신경 조직에서 축색생장을 도와준다. 이는 중추신경계 손상과 또한 퇴행성 신경질환의 치료에 중요하게 사용된다. 악성종양 치료에 있어 금속결합 단백질 분해 효소를 저해하는 것이 치료학적으로 이용할 수 있다.

[발명의 배경]

[2.1.중추신경계의 축색성장에 영향을 주는 인자]

세포접착, 세포확산, 세포이동성 특히 축색 생장은 세포-기질 상호작용에 따라 상당히 달라진다(Sanes, 1983, Ann, Rev. Physiol. 45:581-600; Carbonetto et al., 1987, J. Neurosci. 7:610-620). 중추 및 말초조직에서 신경교세포 이동이나 축색 생장에 적합한 기질분자가 상당수 발견되었다(Cornbrooks et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3850-3854; Edelman, 1984, Exp. Cell Res. 161:1-16; Liesi, 1985, EMBO J. 4:1163-1170; Chiu, A.Y. et al., 1986, J. Cell Biol. 103:1383-1398; Fischer et al., 1986, J. Neurosci. 6:605-612; Lindner et al., 1986, Brain Res. 377:298-304; Mirsky et al., 1986, J. Neurocytol. 15:799-815; Stallcup et al., 1986, J. Neurosci. 5:1090-1101; Carbonetto et al., 1987, J. Neurosci. 7:610-620). 이러한 인자의 출현은 특히 발생단계와 연관이 있으며 특히 말초 신경계(PNS)에서는 신경지배 제거작용과 관계있다(Edelman, 1984, Exp. Cell Res. 161:1-16; Siesi, 1985, EMBO J. 4:1163-1170; Stallcup et al., 1985, J. Neurosci. 5:1090-1101; Daniloff et al., 1986, J. Cell Biol. 103:929-945; Carbonetto et al., 1987, J. Neurosci. 7:610-620). 세포외 매트릭스 단백질 테나신(tenascin)은 비허용적인 기질특성을 갖는 것으로 나타난다(Chiquet-Ehrismann et al., 1986, Cell 47:131-139).

축색 생장에 적합한 가용성 인자의 하나는 신경성장인자(NGF)이다.

NGF는 생체 및 시험관내에서 태아감각 및 교감신경절로부터의 신경섬유생장과 축색생장을 촉진한다(reviewed in Thoenen et al., 1982, in:RRepair and Regeneration of the Nervous System, J.G. Nicholls, ed., Springer-Verlag, NY, pp. 173-185). NGF는 이러한 축색생장의 방향을 인도한다. 세가지 다른 분자형의 NGF가 확인되었다. 한 종류는 두개 비공유적 결합으로 연결된 동일한 폴리펩티드 사슬로된 이량체(분자량은 26,000)이다. 두번째 형태는 중성 pH에서 안정하며, 세가지 다른 폴리펩티드 사슬 즉 α, β, γ(분자량은 140,000)를 포함한다. β사슬은 생물학적 활성 사슬이며 NGF의 제1형과 동일하다. 세번째 형태는 주로 쥐의 L세포에서 분리되었으며(U.S. Patent No. 4,230,691, by Young, issued October 28, 1980참조), 분자량은 약 160,000이나 중성 pH에서는 불안정하다. NGF는 생쥐의 하악선, 마우스 L 세포 또한 기니아피그와 황소의 전립선에서 분리한다(reviewed in Thoenen et al., 1982, 상기참조). 쥐, 기니아피그 또한 황소 NGF의 생물학적 작용에는 차이점이 없다. 덧붙여서, 생쥐에서 분리된 NGF는 인간의 NGF 수용체와 결합하는 것으로 밝혀졌다(Johnson et al., 1986, Cell 47:545-554).

고등척추동물의 분화된 중추신경계(CNS)는 장애후 제한적으로만 축색 재생 성장이 가능하다. 장애후 제한적인 재생을 망막에서 볼 수 있으며(McConnell and Berry, 1982, Brain Res. 241:362-365) 화학적인 병변후의 아민성 비유수섬유관(Bjorklund and Stenevi, 1979, Physial. Rev. 59:62-95)에서 볼 수 있으나 기계적인 병변 후의 아민성 비유수 섬유관에서는 발견되지 않는다(Bregman, 1987, Dev. Brain Res. 34:265-279). 어른쥐의 CNS에 이식된 태아 CNS에서 축색성장은 어떤 경우는 회백질 영역속에서 14㎜에 달하며 반면에 백질영역에서는 1㎜를 넘지 않는 것으로 나타났다(Nornes et al., 1983, Cell Tissue Res. 230:15-35; Bjorklund and Stenevi, 1979, Physiol. Rev. 59:62-95; Commission, 1984, Neuroscience 12:839-853). 한편, 하등 척추동물의 CNS에서 그리고 인간을 포함한 모든 척추동물의 말초신경계에서 상당한 재생성장을 관찰할 수 있다. 이식 실험 결과에 따르면 CNS 뉴우런은 이식된 말초신경 조직속으로 쉽게 퍼지기 때문에 재생 부족현상은 CNS 뉴우런의 고유특성이 아닌 것으로 밝혀졌다(Benfey and Aguayo, 1982, Nature (London) 296:150-152; Richardson et al., 1984, J. Neurocytol. 13:165-182 and So and Aguayo, 1985, Brain Res. 328:349-354). 그러나 PNS 뉴우런은 CNS 조직속으로 확장하는데 실패하는 데 이는 두 조직사이의 근본적 차이가 있다는 것을 가리킨다(Aguayo et al., 1978, Neurosci Lett 9:97-104; Weinberg and Spencer, 1979, Brain Res. 12:273-279).

PNS와 CNS 조직간의 한 가지 주요 상이점은 세포외 매트릭스 성분 라미닌(laminin)을 촉진하는 축색성장의 차등 분포이다(Liesi, 1985, EMBO J. 4:25 05-2511; Carbonetto et al., 1987, J. Neurosci. 7:610-620). 다른 인자도 관계한다. 시험관내에서 좌골 및 안구신경 조직의 특성을 뒷받침하는 축색성장은 두 이식조직에서 라미닌 면역반응성이 있음에도 불구하고 큰 차이를 나타내었다. 이와 같은 실험은 적정량의 신경영양 인자가 있는 곳에서 실시하며 동결상태의 실험용 기질에서도 상이점이 그대로 존재하였다.

분화된 CNS는 발생과정에서 축색성장에 도움을 주는 세포 혹은 기질성분이 부족하며(Liesi, 1985, EMBO J. 4:2505-2511; and Carbonetto et al., 1987, J. Neurosci. 7:610-620) 또는 신경섬유 재생을 허용치 않거나 억제하는 성분을 함유하는 것으로 알려졌다(Schwab and Thoenen, 1985, J. Neurosci. 5:2415-2423).

최근에는 쥐의 신경아세포종 세포의 성장(세포증식) 억제인자를 태아쥐 교아세포 배양배지와 C6 쥐 교종세포로부터 부분적으로 정제하여 특성을 밝혔다(Sakazaki et al., 1983, Brain Res. 262:125-135). BioGel P-20으로 겔여과하여 인자의 분자량이 약 75,000임을 측정하였고 등전점은 5.8 이었다. 이 인자는 신경교세포(C6)나 섬유아세포(3T3)의 성장속도 혹은 형태를 변형시키지 않는다. 덧붙여서, 신경아세포종 세포(Neuro La, NS-20Y와 NIE-115)나 클론된 섬유아세포(3T3)에 대하여 중대한 신경 성장억제인자 활성을 관측하지 못하였다.

Caroni와 Schwab은 (1988, J. Cell Biol. 106:1281-1288) 시험관내에서 축색성장 및 섬유아세포 확산을 허용하지 않는 강력한 기질이 있는 35kD 및 250kD 미엘린 막-결합 단백질을 발표하였다. Caroni와 Schwab(March 1988, Neuron 1:85-96)은 저해성 기질 단백질에 대한 단클론 항체(IN-1과 In-2로 칭함)가 분리된 미엘린 막성분과 배양된 가지가 많은 핍지신경교의 35kD와 250kD 억제제와 성숙한 쥐 안구신경 체외이식 조직의 무허용성을 크게 축소시키거나 또는 중성화시킨다고 발표하였다.

[2.2. 단백효소와 그 억제인자]

과거에는 종양발생 세포주에서(Matrisian et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9413-9417; Mignatti et al., 1986, Cell 47:487-498), 초기 종양 체외이식 조직에서(Mullins and Rohrlich, 1983, Biochem. Biophys. Acta 695:177-214) 또는 형질전환된 세포에서(Quigley, 1976, J. Cell Biol. 71:472-486; Mahdavi and Hynes, 1979, Biochem. Biophys. Acta 583:167-178; Chen et al., 1984, J. Cell Biol. 98:1546-1555; Wilhelm et al., 1987, Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A. 84:6725-6729) 다양한 단백질 분해활성이 증가하는 것으로 나타났다. 단백효소중 하나인 금속결합 단백질분해 효소는 근원세포 융합을 포함한 여러가지 막과 연관된 사건과(Couch and Stritmatter, 1983, Cell 32:256-265) 비반세포의 엑소사이토시스(exocytosis)에 관계하는 것으로 나타난다(Mundy and Stritmatter, 1985, Cell 40:645-656).

혈장막에 결합된 금속결합 단백질분해 효소의 분리 및 특징의 조사가(endopeptidase24.11, enkephalinase)(Almenoff and Orlowski, 1983 Biochemistry 22:590-599)에 의해 이루어졌다. 루이스 육종 바이러스에 의해 형질변환된 병아리 태아 섬유아세포에 의해 발현된 금속결합 단백질분해 효소는 피브로넥틴을 감성하고 유착위치에 위치하고 인바도포디아(invadopodia)는 Chen and Chen, 1987, Cell 48:193-203 이 발표하였다.

연구결과에 따르면 단백효소와 그 억제인자가 신경아세포종 세포에서(Monard et al., 1983, Prog. Brain Res. 58:359-363) 그리고 배양된 신생쥐 지각 신경절에서(Hawkins and Seeds, 1986, Brain Res. 398:63-70) 축색확장에 영향을 줄 수 있다. 배양된 신경교 세포와 신경아세포종 세포는 43kD 단백질인 신경교 유발의 축색 촉진인자(GdNPF)를 방출하는 것으로 밝혀졌는데(Monard, et al., 1983 상기참조) 이는 축색생성을 유도하나 세포이동은 억제하였다. GdnPF는 세포표면에 결합된 세린 단백효소의 활성을 매우 효과적으로 억제하는 인자이다. 세린 단백효소, 억제인자, 난백속의 유점액질 트립신 억제인자, 로이펩틴, 콩 트립신 억제인자 또는 트롬빈을 첨가하면 정상 쥐의 지각 신경절에서의 축색생장이 강화될 수 있다(Hawkins and Seeds, 1986 상기참조).

축색생장에서의 기능적인 역할을 통해 특징이 조사된 다른 단백효소는 아직 밝혀지지 않았다. 여기에는 유로키나아제-형 플라스미노겐 활성인자와 교감 및 지각 뉴우런에 의해 방출된 칼슘의존성 금속결합 단백질분해 효소를 포함한다(Pittman, 1985, Dev. Biol. 110:911-101). 금속결합 단백질분해 효소의 분자량은 62kD이고, 칼슘활성을 위해서는 1mM Ca²⁺를 요구하며 카제인, 알부민, 또는 피브로낵틴 보다 자연 및 변성 콜라겐을 감성시킨다. 플라스미노겐 활성인자의 분자량은 51kD이고, 인간 유로키나아제에 대항하여 생긴 토끼 항혈청에 의해서 침전된다. 또한 32kD의 활성형으로 전환될 수 있다.

[2.3. 신경아세포종]

신경아세포종은 신경외배엽에서 발생되며 이식성 교감 신경절 세포를 포함한다(reviewed in Pinkel and Howarth, 1985, In: Medical Oncology, Calabrese, P., Rosenberg, S.A., and Schein, P.S., eds., MacMillan, NY, pp. 1226-1257). 신경아세포종의 한 측면은 이것이 인체 종양중에서 자발적 퇴화속도가 가장 빠른것중 하나이며(Everson, 1964, Ann. NY Acad. Sci. 114:721-735) 양성 신경절 신경종의 퇴화 및 성숙에 있어서 상관관계있다는 것이다(Bolande, 1977, Am. J. Dis. Child. 122:12-14). 신경아세포종 세포는 배양중 형태학적으로 성숙할 수 있는 능력을 보유한다고 알려졌다. 종양은 교감사슬을 따라 어느 곳에서나 발생하며 그중 50%는 부신수질에서 생긴 것이다.

신경아세포종은 일반적으로 취학기전 년령의 아이들에게 많이 발생하고 소아 신생물의 6.5%를 포함하는 유년기의 가장 일반적인 심장외 충실성 종양이다. 진단에 의하면 2세보다 1세반일 때 더 적게 발생한다. 환자의 60%가 골, 골수, 간장 혹은 피부에서 분명한 전이현상을 나타낸다. 나타나는 증세는 1차종양(척수 압박증, 복부종창), 전이성 종양(골진통) 또는 종양에서 분비되는 카테콜라민이나 혈관활성 폴리펩티드 같은 물질의 대사효과(e.g. 고혈압증, 설사)와 관계한다.

실험결과에 따르면 NGF에 대한 반응의 변화는 신경아세포종과 연관이 있다(Sonnenfeld and Ishii, 1982, J. Neurosci. Res. 8:375-391). NGF는 테스트한 신경아세포종 세포주 절반에서 축색 생장을 자극하였고; 나머지 절반은 영향을 받지 않았다. 그러나, NGF는 어떤 신경아세포종 세포주의 성장속도로 늦추지 않으며 또한 생존력도 강화시키지 않았다.

현재 신경아세포종 치료법으로 외과술 또는 화학요법이 포함된다. 방사선 치료는 화학요법에 대한 종양의 반응이 불완전할 때 이용한다. 국소 종양에 걸린 환자 개인은 생존율이 70 내지 100%인 반면에 다작용적 화학요법을 쓴다고 해도 전이성 질환에 걸린 환자는 생존율이 20%에 지나지 않는다. 1세미만의 환자가 이보다 나이가 많은 어린이 보다 더 우수한 예후를 보인다(70%).

[2.4. 교아종]

교아종은 보통 대뇌반구에 있는 악성이 강한 성상세포종이다. 성상세포는 뉴우런을 지지하는 조직으로서 뇌의 대다수의 내부 실질세포를 포함한다(reviewed in Cutler, 1987, In: Scientific American Medicine V. 2, Rubenstein and Federman, eds., Scientific American, Inc., NY, pp. 1-7). National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke에서 시행된 조사결과에 따르면 미국에서 초기 뇌종양 발생빈도는 100,000명당 8명꼴이며 종양중 20%는 교아종이라는 것이다. 이 종양들은 대체로 45세 내지 55세의 개인에게서 발견된다. 또한 이 종양은 다중엽을 수반하며 뇌실계속에서 파열하고 혹은 반대편의 뇌반구쪽으로 콜로섬(collosum)체를 거쳐 확장한다. 두개(intracranial) 압력이 증가하기 때문에 종양성장에 따른 증세에는 두통, 메스꺼움과 구토, 정신상태의 변화 및 의식장애 등을 포함한다. 침투성이 크기 때문에, 교아종은 예후하기 어렵다. 화학치료제나 방사선치료를 이용할 수도 있다. 그러나, 환자는 일반적으로 이러한 치료를 받아도 2년이상 생존하지 못한다.

[발명의 요약]

본 발명은 축색성장을 조절하는 유전자와 이것을 인코드한 단백질 및 이러한 단백질을 사용하여 진단 및 치료하는 방법과 관계한다. 여기에서 단백질은 축색성장 조절인자를 지칭한다. 본 발명의 축색성장 조절인자는 한 구체예에서 축색 생장을 억제하는 중추신경계 미엘린 결합단백질을 포함하고 이 단백질이 축색 성장 억제인자인 것이다. 본 발명의 또다른 구체예는 특별히 뇌에 전이되는 악성 종양과 관련된 금속결합 단백질분해 효소인 축색성장 조절인자에 대한 것이다. 이 금속결합 단백질분해 효소에 의해 악성세포는 억제성 CNS 환경을 극복하고 뇌와 척수의 넓은 부위에 침범한다.

CNS 미엘린 결합단백질은 신경세포와 신경아세포종 세포에 있는 축색생장을 억제하고 섬유아세포와 흑색종 세포의 확산을 억제한다. 이러한 억제 단백질에는 35,000달톤과 250,000달톤 분자량 단백질과 그 유사체, 유도체 또한 그 단편들이 포함하나 이에 국한시키지 않는다. CNS 미엘린 결합된 억제단백질은 흑색종과 신경조직 종양을 포함한(즉, 신경아세포종) 악성종양에 걸린 환자치료에 사용할 수 있다. 미엘린 결합된 억제단백질의 결핍은 뇌에 전이되는 악성종양(즉, 교아종)의 존재여부를 진단하는 데 도움이 된다. 본 발명은 또한 CNS 미엘린 결합된 억제 단백질의 길항질에 관계하는데 예를 들면 항체 즉, 항체 IN-1 혹은 IN-2를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 항체를 이용하여 외상, 변성 또는 감염후 재생회복을 위하여 축색성장 억제인자를 중성화할 수 있다. 또다른 구체예에서, 단클론 항체 IN-1를 사용하여 척수 손상에 따른 신경섬유를 장기간에 걸쳐 재생을 촉진한다.

본 발명은 또한 축색성장 조절인자 수용체와 그 단편, 또한 이러한 축색성장 조절인자 수용체와 그 단편을 코딩하기 위한 핵산배열과 이들을 치료학적으로 또한 진단학적으로 사용하는 방법에 관한 것이다. 축색성장 조절인자 수용체에 대한 길항근이나 길항질 작용을 하는 물질도 또한 생각할 수 있으며 역시 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명의 금속결합 단백질분해 효소는 특별히 뇌에 전이할 수 있는 악성종양과 관계하는 것으로 밝혀졌다. 구체예에서, 금속결합 단백질분해 효소는 교아종 세포의 막에 결합되어 있다. 금속결합 단백질분해 효소 동족체, 유도체 및 그 성분은 모두 외상, 발작, 중추신경계 퇴행성질환의 결과로 생긴 신경손상을 치료하는 데 가치가 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 금속결합 단백질분해 효소는 축색성장 조절인자에 대한 항체와 결합하여 신경손상을 치료하는데 이용한다.

본 발명은 또한 본 발명의 금속결합 단백질분해 효소에 대항하는 항체 또는 억제인자에 대한 것이다. 이 억제인자 또는 항체는 뇌로 전이할 수 있는 신경아세포종과 같은 악성 종양의 진단 및 치료에 이용할 수 있으나 이에 국한시키는 것은 아니다. 별도로, CNS 미엘린 결합된 억제 단백질이나 동족체, 유도체 혹은 그 성분과 결합한 형태의 금속결합 단백질분해 효소 억제인자를 이용하여 신경아세포종, 교아종 또는 흑색종 등을 포함한 악성종양을 치료하고 진단할 수 있으나 이에 국한시키는 것은 아니다.

[정의]

여기에서는 다음의 용어를 다음과 같은 뜻으로 사용한다:

[도면의 간단한 설명]

제1도(a, c, e, g)는 상 비교도를 나타낸다. 제1도(b, d, f)는 항체 O₄과 함께 면역형광성을 보여준다. 제1도(h)는 항체 O₁과 함께 면역 형광성을 보여준다.

제1도(a, b)는 교감뉴우런의 축색 망상조직에서(a: 시험관내의 8일째; b: 시험관내의 4일째) 가지많은 핍지신경교(10일된 안구신경, 시험관내에서 18일째)에 의해 형성된 윈도우 (축색이 없는 지역)를 보여준다. 배율:x120. 제1도(b)에서 a 축색의 방향이 변하였음을 알 수 있다(화살표머리). 샨(schwann)세포 또한 핍지신경교를 피하고 있다.

제1도(c, d)는 교감 축색의 망상조직(시험관내에서 5일째)으로 둘러싸인 항체 O₄-양성 핍지신경교(10일된 안구신경, 시험관내에서 7일째)를 볼 수 있다. 배율:x220. 축색은 특이적으로 핍지신경교를 고리를 만들고있다. 2차적인 현상으로서 비-허용 핍지신경교 전체에 대해 축색다발이 걸쳐져 있는 경우가 있다.

제1도(e, f)는 전형적인 형태의 미숙한 핍지신경교가 있는 항체 O₄-양성세포가 교감 축색(화살표머리)(시험관내에서 5일째)을 허용한다는 것을 보여준다. 배율:x380.

제1도(g, h)는 E 20 쥐의 망막세포(시험관에서 2일째)는 가지많은 항체 O1-양성 핍지신경교상에서 축색이 성장되지 않는다는 것을 보여준다. 배율:x200.

제2도에서, 8 내지 10일된 안구신경이 신경교세포(시험관내에서 2일째)를 경부 신경절에서 나온 분리된 뉴우런과 함께 다시 2일간 공동배양하고 항체 O₄로 착색한다. 핍지신경교 세포는 코드된 형광사진에서 형태학적으로 분류한다. 상비교도에서, 축색과 샨세포의 부분적인 접촉영역을 측정하여 3개의 카테고리로 분류한다: 축색이나 샨세포로 덮인 핍지신경교 영역의 20% 미만, 20 내지 80%, 또는 80%이상으로 나눈다. 그 값은 3카테고리에서 세포수 ±SEM(평균치의 표준오차)로 나타낸다(4개 배양물; 배양물당 70 내지 130 계통적 표본세포).

어른쥐 안구신경(시험관내에서 6 내지 11일째)에서 나온 신경교 배양물을 태아쥐 망막세포와 함께 1-5일간 공동배양한다. 항체 O₄로 착색된 핍지신경교를 형태학적으로 분류하고 각 핍지신경교가 퍼진 전체영역과 망막세포가 점령한 부분을 각각 도표상에서 측정하여 알아낸다. n=109.

제3도(a, b)는 반응이 있는 원형질 성상세포(a의 화살표)에서 성장하는 교감신경축색(시험관내에서의 13일째)을 보여준다; GFAP-양성(b): (10일된 쥐의 안구신경, 시험관내에서의 23일째). 배율:x220.

제3도(c, d)는 성상세포(GFAP-양성, 제3도(d))에 흡착할 망막세포(E17망막, 시험관내에서 2일째)를 보여준다; 긴 돌기와 짧은 돌기(화살표)를 가지는 10일된 안구신경(시험관내에서 9일째)이다. 배율:x400.

제4도에서, NB-2B 세포를 안구신경절 세포에서 (6일된 쥐의 안구신경, 3일간 배양) 24시간동안 배양하고 축색생성을 위해 GdNPF로 자극하였다(Guenther et al., 1985, EMBO J. 4:1963-1966). 핍지신경교에 인접한 NB-2A 세포는(짧은 화살표) 비대칭적인 생성을 보여주고; 멀리 떨어진 세포(긴 화살표)는 일정치 않은 방향으로 생성한다. 배율:x260. 제4도(c) 내지 4도(f)에서 안구 신경교 배양물속에 있는 고밀도의 3T3 섬유아세포가 가지많은 핍지신경교의 비-허용적 기질효과를 보여준다(c, e). c/d에서 핍지신경교는 돌기 네트워크에 연결한 대형 막 영역을 포함하고 있다. 미성숙 핍지신경교(e,f:화살표; O₄-양성, 비정상형태)는 섬유아세포 확산에 의해 과다성장한다. 10-(c,)와 12-(e,f)일된 안구신경, 시험관내에서 2일째; 3시간동안 3T3첨가. d,f: O₄-착색. c,d:배율은 x300이다. e,f':배율은 x250이다.

제5도에서, 안구 신경교세포(시험관내에서 2 또는 6일간)를 GdNPF나 디부틸일 cAMP 존재하에서 NB-2A 세포와 함께 24시간동안 공동-배양한다. 항체 O₄-양성 가지많은 핍지신경교는 계통적으로 표본을 모우고 이웃한 신경아세포종 세포를 핍지신경교 돌기 네트워크 모서리와 신경아세포종 세포체 사이의 거리가 세포체 2개의 직경보다 작을 때 인접한 것으로 분류한다. 이보다 더 멀리 떨어진 거리에 있는 신경아세포종 세포는 먼 것으로 분류한다. 신경아세포종 처리는 가장 가까운 핍지신경교에 대한 방향에 따라 4부분(1-4)으로 정한다. 표 1a에서의 값(섹션 6. 2. 3. 3, 하기참조)은 3가지 실험의 평균치 ±SEM로 표시한다(실험당 3 배양물에서 나온 60-100축색). *p0.05; *** p0.001.

제6도에서 3T3 세포를 안구신경교 세포상에서 3-4시간동안 공동-배양하였고 배양물을 고정시켜서 항체 O₄로 착색한다. 핍지신경교를 계통적으로 표본화하고 가지많은 혹은 미성숙 핍지신경교로 분류하고 3T3 세포와 겹쳐지는 것은 지적한 것과 같은 3개의 카테고리에서 측정하였다. 이 값은 4회 실험에서의 평균치 ±SEM(표준오차)로 나타낸다.

제7도에서, 교감뉴우런(1일된 쥐의 상경부 신경절에 있는)을 CNS 촛점이나 PNS 미엘린이 들어있는 폴리-D-리신(PLYS)-코팅된 배양접시에서 26시간동안 100ng/㎖존재하에 배양한다. CNS 미엘린(a, c)은 축색 생장을 크게 억제하고 PNS 미엘린(b, d)은 허용성 기질이다. c와 d에서, PLYS 위에 있는 미엘린 섬다발을 볼 수 있다. 배율:x75.

제8도(a)는 PLYS(검은 막대), CNS 미엘린으로 덮인 PLYS(빗금친 막대) 또는 PNS 미엘린으로 덮인 PLYS(흰막대)에서의 2mM 디부티릴시클릭 AMP존재하에서 5시간동안 배양한 신경아세포종 세포를 보여준다. 세포는 둥근세포, 사상위족(filopodia) 혹은 짧은 돌기를 가지는 세포, 또는 세포 1개 직경보다 긴 돌기가 있는 세포로 분류한다. 값은 3배양물의 평균치 ±SEM으로 표시한다(배양물당 250-450세포).

제8도(b)는 PLYS, CNS 미엘린 피복된 PLYS 또는 PNS 미엘린 피복된 PLYS상에서 1시간동안 배양된 3T3 세포를 보여준다. 세포를 둥근세포, 사상위족이 있는 또는 짧은 돌기를 가진 세포, 또는 큰 편평한 세포등으로 분류한다. 값은 3 배양물의 평균치 ±SEM으로 표시한다(배양물당 300-400세포).

제9도에서, 쥐의 안구(a, b)나 좌골(c, d) 신경 체외이식조직을 C6(a, c)나 3T3(b, d)세포와 함께 2주동안 배양한 후 냉동시킨 10㎛ 단편에 대한 상-비교 현미경 사진을 보여준다. 세포를 한 조각의 체외이식조직에 더한다. 침투된 세포는 안구신경(a)의 C6 세포에 대해서만 볼 수 있고 두 좌골신경(c, d)에서 크레실 바이올렛 착색후에 관찰가능하다. (b)의 화살표는 혈관에 인접한 3T3 세포가 적은 것을 지적한다. 막대, 0.2㎜.

제10도에서, C6(a, b), 3T3(c, d) 또는 B16(e) 세포가 2일간 배양된 쥐의 소뇌 냉동부분(25㎛)의 상비교 현미경 사진을 볼 수 있다. C6 세포와 비교하여 3T3과 B16 세포에 대해 나타나는 백질(Wm)에서의 뚜렷한 차이점이 있다. gl:입자층, ml:분자층. 회백질은 입자 및 분자층으로 구성된다. 막대 0.3㎜.

제11도에서 PLYS나 CNS 미엘린에서의 C6(a), 3T3 (b)와 B16(c) 세포의 확산을 보여준다. 확산도는 전자 현미경을 사용하여 섹션 9.1.3(하기참조)에서 설명한 것같이 계산한다. 0% 확산 : 둥근 세포; 100% 확산은 300분에서 평균치로 정했다.

제12도에서, C6 세포는 1,10-페난트롤린의 양을 증가시키면서 지적된 기질상에서 3시간동안 배양하였다. 확산현상은 CNS 미엘린에서 상당히 낮은 양으로도 억제된다. 0.5mM 이상의 농도로된 1,10-페난트롤린은 모든 기질상에서 통상적인 독성효과를 나타낸다. 확산효과를 제11도에서 지적한 바와 같이 정량화하였다.

제13도에서, CNS 미엘린사의 3T3 세포확산은 C6 플라스마막으로 미엘린을 사전처리하여 유발시킨다. 1,10-페난트롤린은 이와 같은 효과를 없애준다. 폴리리신(PLYS)(a), CNS 미엘린(b), C6 플라스마막으로 사전처리한 CNS 미엘린 (C6-PM)상에서 3T3세포의 상비교 현미경사진을 보여준다.

제14도에서, 0.1mM cbz-ala-phe(a) 또는 0.1mM cbz-tyr-tyr(b)의 존재하에서 배양된 쥐의 소뇌 냉동편에서의 C6 세포의 상비교 현미경 사진을 보여준다. 흡착 및 확산의 억제현상은 백질중심에서 뚜렷하며 주요 백질분기(화살표)에서도 볼 수 있다.

제15도에서, 세포를 금속결합 단백질분해 효소 억제인자 cbz-tyr-tyr이나 조절 펩티드 cbz-ala-phe(14일된 배양물)의 존재하에서 안구신경 체외이식 조직편에 세포를 첨가하고 정량화한다. 1.3㎜의 체외이식조직에서 침투된 세포수를 측정한다. 각 컬럼은 0.1㎜당 침투된 세포수를 나타낸다. 이식조직의 가장 중심인 부분만 고찰한다(0.25㎜). 값은 총 8개 이식조직에 대한 두 종류의 실험에서의 평균치 ±SEM으로 표시한다.

제16도에서, 1 mio 세포(2㎕)를 P2에 주입한다. (a) 크레실 바이올렛 착색된 냉동편(15㎕)에서 제한된 밀집종양(화살표)을 볼 수 있고, (b)항체 생성은 항-마우스-Ig-FITC에 의한 면역형광성으로 볼 수 있다. 종양과 측실까지의 주변영역(소형 화살표)을 많이 착색한다(인접면에서 a까지). 쥐를 인산 완충액속의 4% 포름알데히드로 적셔서 고정한다. 배율:6.4x.

제17도에서, 척수의 세로단편(75㎕총두께, 3겹 25㎕단편)의 카메라 투영도에서 WGA-HRP의 전방 수송으로 라벨화한 CST섬유의 라벨링 패턴을 보여준다. 재생 CST섬유의 장거리 신장은 IN-1 처리된 쥐에서 나타난다. 화살표는 중심관과 통하는 소형 공동을 포함한 병변의 위치를 가리킨다. r:두부, C:말비부.

제18도에서, 고배율의 현미경 사진은 병변의 앞부분인 넓은 발육지역에서 라벨화한 고밀도의 CST를 보여준다(b와 f). 미세립 특이성 라벨(화살표)은 두 동물(b, f) 모두의 병변 말미에서 볼 수 있다. 또한 라벨은 IN-처리된 척수(c, d)에서 상당이 떨어진(약 7 ㎜) 곳에서도 볼 수 있다. 대조적으로 항-HRP-처리된 쥐(g)에서는 아무런 레벨도 볼 수 없다. 모든 지역에 있는 크고 하얀점(결정)이 혈관에서의 반응 생성물을 나타내고 고감도 방법으로 실행한 물질에게서 현저하다. c=말미; L=병변, r=두부. 배율: a,e=14x; b,f,g:70x; c,d=140x.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 축색성장을 조절하는 유전자와 이것이 인코드된 단백질과 또한 이 단백질을 사용하는 진단법 및 치료법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질(여기서는 축색 성장 조절인자)은 무허용 기질특성이 큰 중추신경계와 결합한 단백질을 포함하며 이를 축색 성장 억제인자라고 한다. 축색성장 조절인자는 악성종양 특히, 뇌로 전이하는 종양과 결합하여 발견되는 금속결합 단백질분해 효소도 포함한다.

본 발명의 CNS 미엘린 결합단백질은 신경세포 또는 신경아세포종 세포에서의 축색생장을 억제한다. 또한 단백질은 섬유아세포 확산과 이동을 억제할 수 있다. 이 저해성단백질은 종간에도 활성이 있으며 흑색종과 신경조직의 종양(즉 신경아세포종)같은 악성종양에 걸린 환자의 치료에 이용할 수 있으나 이에 국한시키지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 35kD와 250kD CNS 미엘린 결합 단백질을 설명한다.

본 발명은 또한 CNS 미엘린 결합단백질에 대한 항체와 또한 이것을 사용한 치료 및 진단법에 대한 것이다. 항체를 사용하여 예컨대 외상(즉, 척수손상), 발작, 중추신경계의 퇴행성 질환 등에 의한 신경손상을 치료한다. 특히, CNS 미엘린 결합 단백질에 대한 항체는 신경섬유의 재생을 촉진한다. 본 발명의 구체예에서, 단클론항체 IN-1은 장기간에 걸친 척수손상의 신경섬유 재생을 촉진한다.

본 발명은 또한 축색 성장 조절인자 수용체와 그들의 펩티드 단편 및 이러한 축색성장 조절인자 수용체와 단편을 코딩하는 핵산배열에 관계하며 또한 이것을 이용한 치료 및 진단법과 관계한다. 축색성장 조절인자 수용체에 대한 항체 또한 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명은 또한 악성종양 특히, 뇌로 전이되는 종양과 관계있는 금속결합 단백질분해 효소에 대한 것이다. 한 구체예에서, 금속결합 단백질분해 효소는 교아종 세포와 결합한다. 본 발명의 금속결합 단백질분해 효소는 악성세포의 CNS 침입 활성도와 관계있으며 CNS 미엘린-결합 단백질의 저해성 기질 특성을 중화시킬 수 있다. 금속결합 단백질분해 효소는 외상(척수손상), 발작, 중추신경계의 퇴행성 질환등의 결과로 생긴 신경손상을 치료하는 효과가 있다. 별도로, 금속결합 단백질분해 효소는 미엘린 결합된 억제 단백질에 대항하는 항체와 함께 사용하여 신경손상을 치료하기도 한다.

본 발명은 또한 금속결합 단백질분해 효소의 억제인자와 관계한다. 이러한 억제인자는 악성세포 확산 및 침입을 저해하고 또한 악성종양(즉, 교아종) 치료에 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 35,000달톤 또한/또는 250,000달톤 분자량의 단백질 혹은 이의 기능적 등가물 같은 CNS 미엘린 결합된 억제 단백질과 함께인 금속결합 단백질분해 효소를 이용하여 교아종, 신경아세포종, 흑색종 같은 악성종양의 진단 및 치료하는데 이에 국한시키지는 않는다.

본 발명 방법은 다음과 같은 단계로 설명한다: (1) 축색 성장 조절인자의 분리와 정제; (2) 축색 성장 조절인자의 특성; (3) 축색 성장 조절인자를 인코드하는 유전자 혹은 유전자 성분의 분자클로닝; (4) 축색 성장 조절인자에 대한 항체의 제조; (5) 축색 성장 조절인자와 연관된 유도체, 동족체 또한 펩티드의 생성. 이 방법에는 축색성장 조절인자와 그 항체를 사용하는 진단 및 치료법도 포함한다.

[5.1. 축색 성장 조절인자의 분리와 정제]

본 발명은 축색 성장의 CNS 미엘린 결합된 억제 단백질, 축색성장의 CNS 미엘린 결합된 억제단백질의 수용체 및 교아종 세포의 막과 결합한 것과 같은 금속결합 단백질분해 효소에 관계한다. 본 발명의 CNS 미엘린 결합된 억제 단백질은 먼저 미엘린을 유리한 후 정제하여 분리시킨다. 유사하게, 금속결합 단백질분해 효소는 포유동물의 교아종세포에서 분리하여 수득할 수 있다. 사용된 분리방법은 다음의 섹션에서 더 상세히 설명한다. 별도로, CNS 미엘린 결합된 억제단백질이나 금속결합 단백질분해 효소는 재조합 발현계로부터 얻을 수 있다(하기참조). CNS 미엘린 결합된 억제단백질의 수용체를 분리 및 정제하는 방법은 다음 섹션에서 설명한다(하기 참조).

[5.1.1. CNS 미엘린 결합된 억제 단백질의 분리와 정제]

CNS 미엘린 결합된 억제 단백질은 새나 포유류등의 고등동물의 CNS 미엘린에서 분리할 수 있으나 이에 국한되지는 않는다. 미엘린은 척수나 뇌계통의 중추신경계 조직 혹은 안구신경에서 얻을 수 있으나 이에 국한되지는 않는다. 이 조직을 공지된 방법으로 균질화한다(Colman et al., 1982, J. Cell Biol. 95:598-608). 또한 다른 방법으로 미엘린 성분을 분리할 수 있다(Colman et al., 1982, 상기참조).

본 발명의 한 구체예에서, CNS 미엘린 결합된 억제단백질을 세제에 용해시킨다(즉, Nonidet P-40^TM, 데옥시콜린사 나트륨). 용해된 단백질은 다시 크로마토그래피(즉, 이온교한나, 친화성 또한 크기분리 크로마토그래피) 원심분리, 전기영동법, 감별용해도 및 다른 단백질 표준 정제법등으로 정제할 수 있으나 이에 국한되지는 않는다(Caroni and Schwab, 1988, J.Cell Biol. 106:1281).

별도로, CNS 미엘린 결합된 억제단백질은 면역학적 방법으로 분리 정제할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 한 구체예에서 단백질을 먼저 세제로 용해한다(Nonidet P-40^TM, 데옥시콜린산 나트륨). 그후 35kD 또는 250kD 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역침전시켜서 단백질을 분리한다. 별도로, CNS 미엘린 결합된 억제단백질은 단백질이 항체컬럼에 용해된 형태로 흡착되는 면역친화력 크로마트그래피를 사용하여 분리할 수도 있다.

[5.1.2. CNS 미엘린 결합된 억제단백질 수용체의 분리와 정제]

CNS 미엘린 결합된 억제단백질에 의해 흡착, 확산, 성장 또는 이동성이 억제된 세포로부터 CNS 결합의 억제단백질 수용체를 분리할 수 있다. 이러한 세포는 섬유아세포와 뉴우런등이 있으나 이에 국한되지는 않는다. 바람직한 구체예에서, 섬유아세포는 수용체의 분리와 정제를 위한 원료로 이용된다.

한 구체예에서, CNS 미엘린에 연합된 억제단백질에 대한 수용체는 섬유아세포 추출물의 친화력 크로마토그래피로 분리할 수 있으며, 이때 미엘린 결합된 억제단백질이나 이의 펩티드 성분을 고형 서포트에 고정시킨다.

[5.1.3.악성종양과 결합한 금속결합 단백질분해 효소의 분리와 정제]

본 발명의 금속결합 단백질분해 효소는 악성종양 특히, 뇌로 전이할 수 있는 종양 세포로부터 분리할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 금속결합 단백질분해 효소는 이런한 세포의 혈장 막성분으로부터 분리된다. 공지방법으로 종양을 분해 및 균질화하거나 또는 종양 세포주로부터 세포를 얻을 수 있다. 혈장 막성분은 경사 원심 분리법 같은 공지방법으로 수득한다(Quigley, 1976, J. Cell. Biol. 71:472-486). 공지방법에 따라(Cooper, 1977, In Tools of Biochemistry, John Wiley Sons, NY, pp. 355-405) 약이온성 또는 무이온 세제(e.g. 데옥시콜린산 Nonidet P-40^TMTriton, Brij^TM)로 용해시켜서 금속결합 단백질분해 효소를 막으로부터 분리한다.

금속결합 단백질분해 효소 정제는 크로마토그래피(즉, 이온교환, 친화력, 크기분리 칼럼 크로마토그래피), 원심분리 전기영동법, 감별용해도 또는 그외의 단백질을 분리하는 표준방법으로 실행하는데 이에 국한되지는 않는다.

[5.2. 단백질 특성]

본 발명의 축색성장 조절인자를 물리적, 면역학적 또는 기능적 특성을 기초로한 분석법에 따라 분석하였다. 배양된 세포속에 있는 축색성장 조절인자의 반감기는 단백질 합성의 억제인자인 시클로헥시미드를 사용하여 조사할 수 있다(Vasquez, 1974, FEBS Lett. 40:563-584). 다른 실험에서, 축색성장 조절인자의 생리학적 수용체는 축색성장 조절인자로 복합체 형성을 탐지하는 분석법 즉, 라벨화된 축색성장 조절인자에 결합되는 고정된 축색성장 조절인자에 대한 친화력 크로마토그래피와 교차결합 및 면역침전법등을 이용하여 확인할 수 있다.

SDS-폴리아크릴아미드 겔전기영동법과 2차원 전기영동법 같은 전기영동기술을 사용하여 단백질 구조를 조사한다. 다른 기술로는 펩티드 매핑, 등전접속, 또한 크로마트그래피 기술등이 있으나 이에 국한시키지는 않는다.

초기 미엘린 결합억제인자나 금속결합 단백질분해 효소의 아미노산 배열은 이용 가능한 DNA 서열에서 나오거나 단백질의 직접 서열로 즉, 자동 아미노산 서열기에 의해 유도될 수 있다. 또한 단백질 서열은 친수성도 분석에 의해 특징을 조사한다(Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828). 단백질의 소수성 및 친수성 영역을 확인하는데에 친수성도 프로파일을 이용한다(또한 이용할 수 있다면, 이 영역을 인코드하는 유전자 서열의 상응하는 영역).

2차 구조분석(Chou and Fasman, 1974, Biochemisty 13:222)을 실행하여 특이한 2차적 구조를 가지는 것으로 추측되는 CNS 미엘린 결합된 억제인자나 교아종 금속결합 단백질분해 효소 서열의 영역을 확인한다. 다른 구조분석법도 사용할 수 있다. 여기에는 X-선 결정학(Engstom, 1974, Biochem, Exp. Biol. 11:7-13)과 컴퓨터 모델링이 포함된다(Fletterick, R. and Zoller, M.(eds), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

[5.3. 축색 성장 조절인자를 인코드하는 유전자나 유전자 성분의 분자 클로닝]

[5.3.1. 축색 성장 조절인자 유전자의 분리와 클로닝]

포유동물 세포는 Caroni and Schwab에서 설명된 35kD 또한/또는 250kD 미엘린 결합단백질(1988, Neuron 1:85-96), 및 축색 성장 조절인자 유전자라고 정의한 교아종 결합된 금속결합 단백질분해 효소를 포함한 CNS 미엘린 결합된 억제 단백질을 인코드하는 유전자의 분자클로닝용 핵산 공급원 역할을 할 수 있다.

클론화된 DNA라이브러리로부터 화학적 합성, cDNA 클로닝 또는 적절한 포유동물 세포로부터 정제된 게놈 DNA나 그 성분의 클로닝과 같은 공지 방법에 의해 DNA를 얻는다(예: Maniatis et al., 1982, 분자클로닝: A Laboratory Manual, Cold. Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II). 게놈 DNA에서 유도된 클론은 코딩 영역과 조절 및 인트론 DNA 영역을 포함하며, cDNA로부터 유도의 클론에는 엑손 배열만 포함한다.

공급물질에 관계없이, 주어진 축색 성장 조절인자는 유전자 증식을 위한 적절한 벡터속에 분자 클론되어야 한다.

게놈 DNA에서 나온 축색 성장 조절인자의 분자클로닝에서, DNA 단편이 생기며 이들중에는 원하는 축색 성장 조절인자 유전자를 인코드하는 것도 있다. DNA는 각종 제한효소에 의해 특정위치에서 분할되기도 한다. 또는, 망간 존재하에 DNA 효소를 사용할 수 있거나 초음파파쇄로 DNA를 물리적 분해할 수 있다. 선형 DNA 단편을 아가로스 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법과 컬럼 크로마토그래피 같은 표준방법에 따라 크기별로 분리할 수 있으나 이에 국한시키지는 않는다.

일단, DNA 단편이 생기면, 축색 성장 조절인자 유전자를 포함하는 특이 DNA 단편은 여러가지 방법으로 확인할 수 있다. 예컨대, 축색 성장 조절인자 유전자나 이의 특정 RNA 또는 그 단편을 사용할 수 있고, 정제 및 라벨화할 수 있을 경우, 생성된 DNA 단편은 라벨된 프로브에 핵산 하이브리드 반응에 따라 선별할 수 있다(Benton and Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961-3965). 한 바람직한 구체예에서, 축색 성장 조절인자 아미노산 서열의 일부를 이용하여 DNA 서열은 올리고누클레오티드로 합성하여 하이브리드 프로브로 사용할 수 있다. 정제된 축색성장 조절인자 프로브를 이용할 수 없을 경우는, 초기선별방법으로서, 축색 성장 조절인자에 풍부하게 들어있는 핵산 성분을 프로브로 이용하기도 한다.

또한, 제한효소 절단작용과 공지의 제한효소 지도를 참고로 하여 예상되는 크기의 단면과 비교함으로써 적절한 축색 성장 조절인자-인코드 단편을 확인할 수 있다. 이와 달리, 유전자의 특성을 기초하여 또는 이것이 발현된 생성물의 물리적, 화학적 또는 면역학적 특성을 기초하여 1차 선별후 다시 선별할 수 있다.

또한 핵산 하이브리드를 이용한 mRNA 선별과 제노푸스 난모세포에서 해독하여 축색 성장 조절인자 유전자를 확인할 수 있다. 후자의 방법은 전체 또는 크기 분류된 CNS mRNA 집단에 난모세포를 주입하고 기능분석법에 따라 막-결합된 해독생성물을 스크린한다(3T3 세포확산). 발현된 억제인자의 결핍원인이 되는 상보 DNA(cDNA) 푸울(pool)과 RNA를 사전 흡착하면 원하는 cDNA 존재여부를 알 수 있다. 푸울크기를 감소시키면 결과적으로 단일 cDNA 클론이 분리하게 된다. 또다른 방법에서, DNA 단편을 이용하여 하이브리드에 의해 상보적인 mRNA를 분리할 수 있다. DNA 단편은 유용한 정제된 축색 성장 조절인자 DNA나 또는 축색 성장 조절인자 서열이 풍부한 DNA를 나타낸다. 분리된 mRNA의 시험관내에서의 해독생성물에 대한 면역침전분석 혹은 기능분석으로 mRNA와 축색 성장 조절인자 서열이 들어있는 cDNA 단편을 확인한다. 기능분석의 예로서 비-허용성 검사가 있는데 이는 폴리실린으로 덮인 조직 배양 접시위의 3T3 세포가 확산하는 것에 대한 여러 해독 생성물의 효과를 관찰하는 것이다(Caroni and Schwab, 1988 J. Cell Biol, 106:1281). 덧붙여서, 세포로부터 분리된 폴리좀이 축색 성장 조절인자 단백질에 특이적으로 대항하는 고정된 항체에 흡착함에 따라 특이 mRNA를 선별할 수 있다. 선별된 mRNA(흡착된 폴리좀에서 나온)를 주형으로 사용하여 방사선 라벨화된 축색 성장 조절인자 cDNA를 합성할 수 있다. 방사선 mRNA나 cDNA를 프로브로 사용하여 다른 게놈 DNA 단편 가운데에서 축색 성장 조절인자 DNA 단편을 확인할 수 있다.

축색 성장 조절인자 게놈 DNA 분리를 위한 또다른 방법으로 공지서열에서 유전자 서열자체를 화학적으로 합성하거나 축색 성장 조절인자 유전자를 인코드하는 mRNA에 대한 cDNA를 만드는 방법등이 있다. 본 발명에서 벗어나지 않는 다른 방법도 가능하다.

확인되고 분리된 유전자나 cDNA를 다시 적절한 클로닝 벡터속에 삽입할 수 있다. 공지의 여러 벡터숙주계를 사용하기도 한다. 가능한 벡터로는 코스미드, 플라스미드 또는 변형 바이러스등이 있으며 이 벡터계는 사용된 숙주세포와 잘 조화해야 한다. 이러한 벡터는 람다유도체 같은 박테리오파지 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체 같은 플라스미드가 있으나 이에 국한시키지는 않는다.

또다른 구체예에서, 축색 성장 조절인자 유전자는 Shot gun방법으로 적절한 클로닝 벡터에 삽입시킨 후 확인 및 분리한다. 예컨대, 축색 성장 조절인자 생산자에 대한 특이성이 있는 cDNA의 크기분류나 제거에 따라서 주어진 축색 성장 조절인자 유전자를 모우고 클로닝 벡터속에 삽입한다. 또다른 구체예에서, DNA를 발현 벡터계속에 삽입하고, 축색 성장 조절인자 유전자를 함유한 재조합 발현 벡터는 축색 성장 조절인자 단백질에 대한 기능적 분석에 따라 탐지할 수 있다.

축색 성장 조절인자 유전자를 클로닝 벡터속에 삽입하고 이를 이용하여 적절한 숙주세포를 형질전환, 형질감염 또는 감염시켜서 유전자 서열을 많이 복제한다. 이것은 상보적인 돌출 말단부가 있는 클로닝 벡터속으로 DNA 단편을 결찰시켜 만든다. 그러나, DNA를 절단할 수 있는 상보적인 제한 효소 부위가 클로닝 벡터속에 없을 경우, DNA 분자단부는 효소학적으로 변형시킨다. 또는 누클레오티드 서열(링커)을 DNA 단부에 결찰하여 원하는 부위를 만들 수 있다. 이 결찰된 링커는 제한 엔도 누클레아제가 인지하는 서열을 인코드하는 특정 화학적으로 합성된 올리고누클레오티드를 포함한다. 또다른 방법에서, 절단된 벡터와 축색 성장 조절인자 유전자를 동중합꼬리(tailing)를 사용하여 변형시키기도 한다.

DNA 자체의 특성 또는 별도로 이것이 인코드된 단백질의 물리적, 면역학적 또는 기능적특성을 기초로한 여러 방법에 따라 클론된 축색 성장 조절인자 유전자를 확인할 수 있다. 예컨대 DNA 자체는 플락 또는 라벨된 프로브에 대한 콜로니핵산 하이브리드에 따라 탐지된다(Benton, W. and Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. and Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). 별도로 발현된 생성물의 특성을 기초로 하여 축색 성장 조절인자 유전자의 존재를 탐지할 수 있다. 예컨대, cDNA 클론 또는 적절한 mRNA를 잡종 선택하는 DNA 클론을 선택하여 시험관내에서 축색생성을 방해하는 단백질을 만들 수 있다. 축색 성장 조절인자에 대한 항체를 사용할 경우, 축색 성장 조절인자 단백질은 ELISA(효소-결합 면역분석)형 방법에서 추측한 축색 성장 조절인자 합성 클론에 라벨화된 항체의 결합으로 확인할 수 있다.

구체적인 예에서, 분리된 축색 성장 조절인자 유전자 cDNA 또는 합성된 DNA 서열이 결합된 재조합 DNA 분자로 숙주세포를 형질변환시켜 유전자의 다중 복제물을 만들 수 있다. 따라서, 형질변환 물질을 성장시키고 이 물질로부터의 재조합 DNA 분자를 분리시키고 필요에 따라서, 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써 유전자를 다량 수득할 수 있다.

궁극적인 목적이 우두 바이러스나 아데노바이러스 같은 바이러스 발현 벡터속으로 삽입하는 것이라면, 바이러스 게놈내에 유전자를 삽입시키기 위해 바이러스에 감염된 세포에서 유전적 재조합을 할 수 있는 바이러스 서열에 유전자가 인접하도록 축색 성장 조절인자 유전자를 함유하는 재조합 DNA 분자를 변형시킨다.

축색 성장 조절인자 DNA-함유한 클론을 확인하여 성장시키고 수득한 후 DNA 삽입물은 다음의 섹션에서 기술한 것과 같이 특징을 조사한다. 축색 성장 조절인자 유전자의 유전자 구조를 알고 있으면, 본 발명에서 사용하기에 적합한 구조로 조작하는 것이 가능하다. 예컨대, 프로모터 DNA는 다량의 단백질 발현을 제공하기 위해 자연 프로모터와 함께 또는 그 대신 축색 성장 조절인자 코딩배열의 5' 위치에 결찰될 수 있다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 조작이 가능하다.

[5.3.2. 클론화된 축색성장 조절인자 유전자의 발현]

축색성장 조절인자 단백질이나 그 성분을 코딩하는 누클레오티드 서열을 적절한 발현벡터 즉, 삽입된 단백질-코딩 배열의 전사와 해독에 필요한 성분을 함유한 벡터속에 삽입할 수 있다. 자연 축색성장 조절인자 유전자 또는 그 인접부위에서 필요한 전사 및 해독 시그날이 공급될 수 있다. 다양한 숙주-벡터계를 이용하여 단백질-코딩 서열을 발현할 수도 있다. 바이러스(즉 우두바이러스, 아데노바이러스등) 감염된 포유동물 세포계; 바이러스(바쿠로바이러스) 감염된 곤충세포계; 또는 이스트 벡터를 함유한 이스트나 박테리오 파지 DNA, 혹은 코스미드 DNA로 형질변환된 박테리아 같은 미생물이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 벡터의 발현성분은 그 효과와 특이성에 따라 다양하다. 이용되는 숙주-벡터계에 따라서, 적절한 전사 및 해독 성분의 하나를 사용한다.

벡터에 DNA 단편을 삽입하는 전술한 방법을 사용하여 적절한 전사/해독 조절 시그날과 단백질 코딩 배열로된 가상의 유전자를 포함한 발현벡터를 구성할 수 있다. 이 방법에는 시험관 내에서의 재조합 DNA와 합성기술 또한 생체내에서의 재조합(유전자 재조합) 등도 포함된다.

축색성장 조절인자 유전자 삽입편을 포함하는 발현벡터는 일반적으로 세가지 방법으로 확인할 수 있다; (a) DNA-DNA 교배, (b) 표식자 유전자의 유무 및 (c) 삽입된 배열의 발현. 첫번째 방법에서 발현벡터에 삽입된 외부 유전자의 존재는 삽입된 축색성장 조절인자 유전자와 동일한 서열로된 프로브를 이용한 DNA-DNA 하이브리드에 의해 탐지할 수 있다. 두번째 방법으로는 벡터에 외부 유전자를 삽입함으로써 특정 표식자 유전자 작용(즉, 티미딘 키나아제 활성, 항생제에 대한 내성, 형질변환 표현형, 바쿠로바이러스속의 흡장체 형성)의 존재여부에 따라 재조합 벡터/숙주계를 확인 및 선별할 수 있다. 예컨대, 주어진 축색성장 조절인자 유전자를 유전자의 표식자 유전자 배열속에 삽입할 경우, 축색성장 조절인자 삽입편을 함유한 재조합 물질은 표식자 유전자 작용이 사라진 것으로 확인할 수 있다. 세번째 방법으로, 재조합 물질에 의해 발현된 외부유전자 생성물을 분석하면 재조합 발현벡터를 확인할 수 있다. 이러한 분석법은 주어진 축색성장 조절인자 유전자 생성물의 물리적, 면역학적 또는 기능적 특성을 기초한 것이다.

특정 재조합 DNA 분자를 확인 및 분리한 후 여러가지의 공지방법으로 이를 증식시킬 수 있다. 적절한 숙주계와 성장조건이 만들어지면, 재조합 발현벡터를 다량으로 번식 및 제조할 수 있다. 전술한 것처럼, 사용가능한 발현벡터는 다음과 같은 벡터 또는 그 유도체를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다; 우두바이러스나 아데노바이러스 같은 인간 혹은 동물의 바이러스; 바쿠로바이러스 같은 곤충바이러스; 이스트벡터; 박테리오파지벡터(즉, 람다) 또한 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터등이 있다.

덧붙여서, 삽입된 배열의 발현을 조절하거나 또는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 처리하는 숙주세포 균주를 선택하기도 한다. 특정 유도인자의 존재하에서 특정 프로모터의 발현이 증가할 수 있다; 따라서 유전 공학적으로 처리된 축색성장 조절인자 단백질의 발현을 조정할 수 있다. 더욱이, 여러가지의 숙주세포는 단백질 변형(즉, 글리코실화, 분할)과 번역 및 해독-후 처리과정에 있어서 특징적인 메카니즘을 갖고 있다. 발현된 외부단백질의 변형과 처리가 가능한 적합한 세포주 혹은 숙주계를 선택할 수 있다. 예컨대, 박테리아계에서의 발현으로 글리코실화 되지 않은 핵(core) 단백질 생성물을 만들 수도 있다. 이스트에서의 발현으로 글리코실화된 생성물을 만든다. 포유동물(즉, COS)세포에서의 발현은 이중구조의 축색성장 조절인자 단백질의 자연 글리코실화 작용을 확인해 준다. 더욱이, 여러 벡터/숙주 발현계는 정도의 차이는 있으나 단백질 분해와 같은 작용을 처리할 수 있다.

[5.3.3. 발현된 유전자 생성물의 확인과 정제]

특정 축색 성장조절 인자 유전자를 발현하는 재조합 물질을 확인한 센션 5.1.의 설명처럼 정제하고(상기참조) 섹션 5.2(상기참조) 분석할 수 있다.

공지의 방법에 의해 단백질 또는 그 단편을 합성할 수 있는 클론된 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 주어진 축색성장 조절인자 단백질의 아미노산 서열은 유추할 수 있다.(e.g. Hunkapiller, et al., 1984, Nature 310:105-111).

본 발명의 특정한 구체예에서, 재조합 DNA법 또는 화학 합성법에 따라 만들어진 축색성장 조절인자 단백질은 서열속에서 기능적으로 동등한 아미노산 잔기로 치환되어 침묵 돌연변이를 가지는 변형서열을 갖춘 단백질을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 예컨대, 배열속에 들어있는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 기능적으로 동등하게 작용하는 또다른 유사극성의 아미노산으로 대신할 수 있고 그 결과 침묵 돌연변이가 일어난다. 서열속에 있는 아미노산의 치환물은 아미노산이 들어있는 다른 부류의 부분에서 선택하기도 한다. 예컨대, 무극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린, 프롤린, 페닐아라닌, 트립토판, 또한 메티오닌등을 포함한다. 극성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 또한 글루타민 등을 포함한다. 양전하(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 또한 히스티딘을 포함한다. 음전하(산성) 아미노산은 아스파트산과 글루탐산을 포함한다. 또한 해독과정이나 그후 예컨대 글리코실화, 단백질분해작용등으로 특정하게 변형된 축색성장 조절인자 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다.

[5.3.4. 축색성장 조절인자 유전자의 특성]

다양한 공지 방법으로 주어진 축색성장 조절인자 유전자의 구조를 분석할 수 있다.

축색성장 조절인자 유전자에 상응하는 클론화된 DNA나 cDNA을 서던하이브리드(Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), 노던 하이브리드(Alwine, et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5350-5354; Wahl. et al., 1987, Meth. Enzymol. 152:572-581), 제한 엔도 누클레아제매핑(Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) 또는 DNA 배열분석 등의 방법을 통해 분석할 수 있다.

또한 다른 방법으로서 Maxam and Gilbert(1980, Meth. Enzymol. 65:499-560) Samger의 디데옥시법(Sanger, et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467) 또는 자동 DNA 서열기의 이용(e.g. Applied Biosystems, Foster City, CA) 등을 포함한 방법에 따라 DNA 배열을 분석할 수 있다.

[5.4. 축색성장 조절인자에 대한 항체 제조]

축색성장 조절인자나 관련된 단백질을 인지하는 항체를 생성할 수 있다. 이러한 항체는 다중클론성 또는 단클론성이다.

다양한 공지방법으로 특정 축색성장 조절인자의 에피토프에 대한 다중클론 항체를 제조할 수 있다. 항체 제조를 위해 축색성장 조절인자 단백질 또는 합성 단백질이나 그 성분을 주입하여 토끼, 생쥐, 래트등의 다양한 숙주동물을 면역화시킨다. 여러가지 보조제를 사용하면 숙주종류에 따라 면역반응을 증가시킬 수 있는데 수산화알루미늄 같은 Freund's(완전 및 불완전) 수산화 알루미늄과 같은 미네랄겔, 리소레시틴 같은 표면 활성물질, 플루온 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키이홀 림핏 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 사용 가능성이 있는 BCG(바실러스 칼멧-구어린)과 코리네박테리움 파르붐 같은 인체 보조제등이 있다.

축색성장 조절인자의 에피토프에 대한 단클론 항체는 배양물의 세포 주로 항체 분자를 제조하는 기술에 따라 만들 수 있다. Kohler and Milstein(1975, Nature 256:495-497)의 하이브리도마 기술과 최근의 인체 b세포 하이브리도마법(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72)과 EBV-하이브리도마법(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96)등이 있다. 특정한 구체예에서, 섹션 8.1에서 설명하는 방법(하기 참조)은 35kD와 250kD CNS 미엘린 결합된 억제 단백질을 인지하는 쥐의 단클론 항체를 얻기 위한 것이다.

치료를 위해 사용하는 단클론 항체는 인체 단클론 항체나 가상의 인체-쥐(또는 다른 종류) 단클론 항체이다. 인체 단클론 항체는 여러가지의 공지 방법으로 만든다(e.g., Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). 가상의 항체 분자는 인체의 일정부위와 함께 쥐의 항원-결합 영역을 포함하는 것으로 만든다(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, Takeda et al., 1985, Nature 314:452).

축색성장 조절인자 에피토프에 대한 항체의 분자클론은 공지방법으로 만들 수 있다. 재조합 DNA 방법(e.g. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)을 이용하여 단클론 항체 분자 또는 항원 결합부위를 인코드하는 핵산 배열을 만들 수 있다.

항체분자는 공지방법 즉, 면역흡착이나 면역친화력 크로마토그래피, HPLC(high performance liquid chromatography) 같은 크로마토그래피법 또는 그 혼합방법으로 정제할 수 있다.

특이형 분자를 포함하는 항체성분은 공지방법으로 생성한다. 예컨대, 항체분자의 펩신처리에 의해 만들어진 F(ab')₂성분; F(ab')₂성분의 이황화가교를 환원하여 만들 수 있는 Fab'성분; 또한 항체분자를 파파인과 환원제로 처리하여 생성할 수 있는 2 Fab 또는 Fab 성분등이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.

[5.5. 축색성장 조절인자-관련 유도체, 동족체 및 펩티드]

축색성장 조절인자와 관련된 유도체, 동족체 및 펩티드의 제조와 사용법도 본 발명의 범위에 속하며 축색성장 조절인자에 길항인 분자를(예컨대, 항-특이형 항체등)도 포함한다. 이러한 유도체, 동족체 및 펩티드는 필요한 억제활성을 소유하고 있으며 예컨대, 신경아세포종의 치료에 사용할 수 있다(하기참조, 섹션 5.6). 축색성장 조절인자와 관련된 유도체, 동족체 및 펩티드의 활성도를 비허용성 기질효과 분석으로 검사할 수 있다. 예컨대, 폴리리신으로 피복된 조직배양 접시위에서 3T3 세포확산에 대한 각종 번역 조성물의 영향을 관측할 수 있는 비허용성에 대한 분석 방법이 있다(Caroni and Schwab, 1988, J. Cell. Biol. 106:1281).

본 발명의 축색성장 조절인자-관련된 유도체, 동족체 또한 펩티드를 다양한 공지방법으로 제조할 수 있다. 유전자 또는 단백질 수준에서 조작하여 생산할 수 있다. 예컨대, 다수의 공지방법에 따라 클론된 축색성장 조절인자 유전자를 변형시킨다(Maniatis, et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). 축색성장 조절인자 서열을 제한 엔도누클레아제로 적절한 위치에서 분해하고, 필요하면 효소적으로 변형시키고, 분리하고 또한 시험관내에서 결찰시킨다. 축색성장 조절인자와 관계된 유도체, 동족체 및 펩티드를 인코드하는 유전자의 제조에서 해독 정지신호에 의해 방해를 받지 않는 축색성장 조절인자가 원하는 축색성장 조절인자-특이활성을 인코드하는 유전자 부위에 있는 것과 같이 동일한 해독구조내에 변형된 유전자가 남아있음을 확인해야 하는 주의가 필요하다.

덧붙여서, 주어진 축색성장 조절인자 유전자는 시험관내에서 또는 생체내에서 돌연변이시켜서 해독, 개시 또는 종료 서열을 만들거나 파괴시키고 코딩영역에서 변성물을 생성하거나 또는 새로운 제한 누클레아제 위치를 형성하거나 이미 존재하는 것을 파괴하여 시험관 내에서의 또다른 변형을 촉진한다. 또다른 공지의 돌연변이 기술도 사용할 수 있고 시험관내에서의 부위-특이적 돌연변이(Hutchinson, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), TAB링커의 이용의 포함된다.

[5.6. 축색성장 조절인자의 사용법]

[5.6.1. 진단사용법]

[5.6.1.1. CNS 미엘린 결합된 억제 단백질]

CNS 미엘린 결합된 억제단백질, 동족체, 유도체 또한 그 후속물질과 항-억제 단백질 항체를 진단에 이용한다. 축색성장 연장, 침투성 및 재생에 영향을 주는 각종 질병을 감지하고, 예측하고, 진단하고, 모니터하기위한 면역검사와 같은 검사에 이러한 분자들을 이용한다. 본 발명의 한 구체예에서, 악성질환의 진단에 상기의 분자를 사용한다. 별도로, CNS 미엘린 결합된 억제 단백질, 동족체, 유도체 또한 그 후속물질을 사용하여 궁극적으로 신경손상을 일으키는 질병에 대한 치료요법을 모니터한다; 이러한 질병과 상태는 CNS외상(즉 척수손상), 침해, 감염, 악성질환, 독성물질에 대한 노출, 영양결핍, 부신생물증세 및 퇴행성 신경질환(예컨대 알제마이어질환, 파킨슨병, 헌팅톤 콜레라, 아미노트로픽 측면 경화증 및 진행성 초-핵 중풍)등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 한 구체예에서, 이러한 분자를 이용하여 CNS 섬유 재생의 지시자로서 축색생장에서 증가를 감지한다.

예컨대, 구체예에서 CNS 미엘린이 들어있는 환자의 피검물에서 CNS 미엘린 결합된 억제단백질이 없는 것은 악성질환 즉 교아종, 신경아세포종 또한 흑색종 또는 신경생장, 침투성 또는 재생과 연관된 질환이 존재한다는 진단 표식자가 될 수 있다. 한 구체예에서, 억제 단백질의 부재는 면역분석법으로 검사할 수 있는데 이때 항-억제 단백질 항체(In-1, In-2)에 대한 결합의 결핍이 관찰된다.

사용하는 면역분석법은 방사성-면역분석, ELISA(효소결합 면역흡수분석), 샌드위치 면역분석, 침전반응, 겔확산 침전반응, 면역확산 분석, 응집분석, 보조고착 분석, 면역방사선 분석, 형광 면역분석, 비타민A 면역분석, 면역전기영동 분석, 또한 조직단편에 대한 면역 조직화학 등이 포함된다.

한 구체예에서, CNS 미엘린 결합된 억제 단백질에 결합하는 리간드는 영상기술에 이용된다. 예컨대, 억제단백질에 결합하고, 혈-뇌 장벽을 통해 침투할 수 있는 작은 펩티드(예를들면 억제 단백질 수용체 단편)를 적절히 라벨하면 PET(양전자 투사 단층촬영장치) 진단이나 섬광계수법 검사와 같은 영상법에 환자에 대한 침범없는 상태에서 사용할 수 있다.

축색성장 억제인자 유전자, DNA, cDNA 또한 RNA와 또한 관계된 핵산 배열과 보조배열을 포함한 후속배열을 면역확산 분석, 응집분석, 보조고착분석, 면역방사선 분석, 형광 면역분석, 비타민A 면역분석, 면역전기영동분석, 또한 조직단편에 대한 면역 조직화학 등이 포함된다.

축색성장 억제인자 핵산배열 또는 약 15 누클레오티드로 구성된 하위서열을 하이브리드 프로브로 사용한다. 하이브리드분석법은 축색성장 억제인자 발현의 변화와 연관된 질병, 질환상태를 검사, 예측, 진단 또는 관측하기 위한 것이다(상기 참조). 예컨대, 환자에게서 취한 생검조직편의 미엘린에 있는 전체 RNA을 축색성장 억제인자 mRNA의 존재를 감지하는데 이때, mRNA의 양이 환자의 축색생장 활성의 억제수준을 나타낸다.

[5.6.1.2. CNS 미엘린 결합된 억제 단백질 수용체]

CNS 미엘린 결합된 억제 단백질 수용체와 동족체, 유도체, 또한 그것의 하위 서열 또한 항-수용체 항체는 진단용으로 사용한다. 본 발명의 이 분자들을 이용하여 각종 질병, 신경성장, 확장, 침투 및 재생에 영향을 주는 질병을 감지, 예측, 진단 혹은 관찰하는 면역분석이나 결합분석을 한다. 예컨대 신경손상, 경색, 퇴행성 신경질환 혹은 종양등과 같은 강화된 신경침투나 재생과 관계된 각종 질병에서 이와 같은 수용체의 발현이 낮아진다는 것을 볼 수 있다. CNS 미엘린 결합된 억제단백질 수용체, 동족체, 유도체 또한 그 하위 서열은 궁극적으로 신경손상을 일으키는 질병 및 질환으로 CNS 외상(즉 척수손상), 발작, 퇴행성 신경질환등과 악성종양을 치료하기위한 것으로 사용한다.

분석법은 섹션 5.6.1.1. 에서 설명하였으나 이에 국한되는 것은 아니다(상기 참조).

신경성장 억제인자 수용체 유전자와 관련된 핵산 배열 및 상보서열을 포함한 하위 서열은 축색성장 억제인자 수용체 발현의 변화와 연관된 질병 또는 질환상태를 감지, 예측, 진단 또는 관찰하기 위한 하이브리드 분석법에 사용할 수 있다.

[5.6.1.3. 금속결합 단백질분해 효소와 그 억제인자]

본 발명의 금속결합 단백질분해 효소와 그 동족체, 유도체 또한 그 성분과 억제인자와 항-금속결합 단백질분해 효소 항체는 진단목적으로 사용한다. 본 발명의 분자는 축생성장 확대, 침투성 또는 재생에 영향을 미치는 질환, 질병 및 각종 조건을 탐지, 예측, 진단 혹은 관찰하기 위한 면역분석 혹은 억제형 분석 같은 분석법에서 사용할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 분자를 사용하여 악성종양, 특히 뇌로 전이할 수 있는 종양(즉 교아종)을 진단할 수 있으며 금속결합 단백질분해 효소의 존재여부나 그 양의 증가를 탐지하는 방법을 쓴다. 별도로, 본 발명의 분자를 사용하여 금속결합 단백질분해 효소 레벨변화의 탐지에 따라 교아종 같은 악성종양에 대한 치료를 관찰할 수 있다. 이 구체예에서, 금속결합 단백질분해 효소 레벨의 감소나 부재는 치료효과를 나타내준다.

분석법에 대하여 섹션 5.6.1.1. 에서 설명한 것과 같으나 이에 국한시키지는 않는다(상기 참조).

금속결합 단백질분해 효소 유전자와 관계 핵산배열 또한 상보 서열을 포함한 하위 서열을 금속결합 단백질분해 효소에서의 변화와 관련된 질병 또는 질환상태를 탐지, 예측, 진단 또는 관찰하는 교배분석법에서 사용할 수도 있다(상기참조). 예컨대 환자에게서 취한 피검물(즉, 신경교세포)의 종 RNA는 금속결합 단백질분해 효소 mRNA의 존재에 대해 분석할 수 있는데 금속결합 단백질분해 효소 mRNA 존재여부나 그 양은 환자에서 악성종양의 존재를 나타낸다. 특히 뇌로 전이할 수 있는(교아종) 악성종양을 탐지한다.

[5.6.2. 치료학적 용도]

[5.6.2.1. CNS 미엘린 결합된 억제 단백질]

본 발명의 CNS 미엘린 결합된 억제 단백질은 흑색종이나 신경조직의 종양(즉 신경아세포종) 같은 악성종양에 걸린 환자의 치료를 위해 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 신경아세포종에 걸린 환자를 축색확장을 억제하는 억제인자로서 35kD 또는 250kD 단백질이나 동족체, 유도체 또는 그 하위서열 및 이의 기능적 등가물로 치료한다. 또다른 구체예에서, CNS 미엘린-결합 억제 단백질과 금속결합 단백질분해 효소를 환자에게 치료학적으로 투여한다.

또다른 구체예에서, 고유 억제 단백질 기능을 억제하는 CNS 미엘린 억제 단백질의 유도체, 동족체, 또는 하위 서열은 신경손상 입은 환자에게 축색확장, 성장 또는 재생을 증가시킬 필요가 있는 양생법에 사용할 수 있다. 외상으로(척수손상, 척수병소 또는 다른 CNS 경로 병소 등을 포함하나 이에 국한되는 것은 아닌) 또는 외과적 신경병소, 경색에 대한 2차적인 손상, 감염, 독성 물질에 노출, 악성종양, 부신생물 증상 또는 중추신경계의 각종 퇴행성질환으로 고통받는 환자를 이러한 억제 단백질 길항제로 치료할 수 있다(Cutler, 1987, In: Scientific American Medicines v. 2, Scientific American Inc., NY, pp 11-1-11-13). 이러한 질환의 예를 들면 알츠마이어 병, 파킨슨씨병, 헌팅톤 콜레라, 절위축성 측소경화 또는 점진적 핵상마비등이 있다. 이러한 길항제를 이용하여 CNS 경로, 섬유계 및 다발의 재생을 촉진한다. 35kD 또는 250kD 단백질 같은 CNS 미엘린 결합된 억제 단백질의 에피토프에 대한 항체(또는 그 결합성분이나, 항체를 분비하는 세포)를 투여하여 환자에서 35kD 또는 250kD 단백질 작용을 억제할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 35kD 또는 250kD 미엘린 결합된 억제 단백질과 관련된 항체는 오랜 기간에 걸쳐 척수손상에 이르게 되는 신경섬유의 재생을 촉진한다; 특별한 실시예에서는 단클론 항체 IN-1을 사용한다.

각종 전달계가 공지되었고 박테리아에 의해 발현되는 CNS 미엘린 억제 단백질, 관계분자 또는 그 항체를 리포좀이나 반투막에 캡슐화하여 전달하는데 이용될 수 있다. 항체 같은 리간드에 결합시켜 대한 미엘린 결합단백질-관련된 분자를 생체내의 치료학적으로 필요한 부위에 가도록 한다. 내실이나 종양제거부위로의 유입방법은 피하내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구 및 비강내의 경로를 통해 주입하는 방법등을 포함하나 이에 국한시키지 않는다. CNS 미엘린 억제 단백질 길항활성을 가진 세포 즉, 적절한 생물학적인 막에 캡술화한 하이브리도마 세포를 환자에게 이식하면 항-CNS 미엘린 억제 단백질 항체를 계속적으로 공급할 수 있다.

덧붙여서, CNS 미엘린 억제 단백질의 합성을 감소시키는 방법을 이용하여 그 생물학적 기능을 축소한다. 예컨대, CNS 미엘린 억제 단백질을 합성하는 세포(즉, 핍지신경교)에 대한 독성물질을 이용하여 억제 단백질 농도를 감소시켜 뉴우런의 재생을 촉진한다.

[5.6.2.2. CNS 미엘린 결합된 억제단백질 수용체]

CNS 미엘린 결합된 억제단백질 수용체나 그 성분 및 이에 대한 항체는 CNS 외상(즉, 척수손상), 경색 및 알츠마이어병, 파킨슨씨병, 헌팅톤 콜레라, 절위축성 측소경화 또는 점진적 핵상마비등과 같은 중추신경계의 퇴행성질환 등을 포함한 신경손상을 입은 환자의 치료에 사용할 수 있다. 예컨대 한 구체예에서, CNS 미엘린 결합된 억제단백질 수용체 및 하위 서열이나 억제단백질 결합부위가 있는 그 동족체를 환자에게 투여하여 결과적으로 억제단백질을 자연수용체에 결합을 경쟁시켜 환자에게 몸속에 성장하거나 재생하는 것을 촉진한다. 또다른 구체예에서, 억제 단백질 수용체에 대한 항체(또는 2결합 부분이나 수용체에 결합할 항체를 분비하는 세포)를 환자에게 투여하여 결과적으로 수용체 기능을 방해하고 따라서 환자의 신경성장이나 재생을 촉진시킨다. 이러한 치료법이 필요한 환자는 상술한 것과 같이 중추신경계의 신경손상, 발작 또는 퇴행성질환에 걸린 환자 등이 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다.

여러가지의 전달계가 공지되었고, 박테리아등에서 발현시킨 CNS 미엘린 결합된 억제단백질 수용체, 관련분자 및 그들의 항체를 예컨대 리포좀속에 캡슐화하여 전달할 수 있다. 항체와 같은 리간드에 결합시켜 생체내의 치료가 요구되는 부위에 미엘린 결합된 단백질 수용체-관련분자를 제공할 수 있다. 삽입방법으로서 피하내, 근육내, 복강내, 피하내, 경구, 비강내의 경로를 통하며 뇌실이나 종양제거 부위속으로 주입할 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.

[5.6.2.3. 금속결합 단백질분해 효소와 그 억제인자]

본 발명의 금속결합 단백질분해 효소는 중추신경계의 퇴행성질환이나 각종 신경손상의 치료에 사용할 수 있다(상기참조, 섹션 5.6.2.2.). 한 구체예에서, 외상, 발작 또는 신경퇴행성 질환으로 인한 신경손상을 입은 환자는 금속결합 단백질분해 효소나 단백질 분해할성 동족체, 유도체 또는 축색확장이나 CNS 섬유의 재생을 자극하는 이들의 하위 서열로 치료할 수 있다.

한 구체예에서 침투성 이동과 CNS에서의 확산을 억제할 필요가 있을 경우, 길항 작용을 하거나 금속결합 단백질분해 효소 작용을 억제하는 금속결합 단백질분해 효소의 유도체, 동족체 또는 하위 서열 또는 금속결합 단백질분해 효소 활성의 화학적 억제인자를 양생법에 사용한다. 이러한 억제인자로는 1,10 페난트롤린, EDTA, EGTA, cbz-tyr-tyr, cbz-gly-phe-NH₂, cbz-phe-phe-NH₂또한 cbz-gly-phe-phe-NH₂등이 있으나 이에 국한시키는 것은 아니다. 통상적인 시판회사(즉, 시그마 케미칼 Co.)로부터 1,10 페난트롤린, EDTA 또한 EGTA를 구입할 수 있고 cbz-tyr-tyr, cbz-gly-phe-NH₂, 또한 cbz-gly-phe-phe-NH₂는 역시 시판회사(e.g. Vega Biotechnologies)에서 구입하거나 화학적으로 합성할 수 있다. 특정한 구체예에서, 각종 악성종양 특히 뇌로 전이 가능한 종양에 걸린 환자는 억제인자로 치료한다. 한 바람직한 구체예에서, 교아종에 걸린 환자는 억제인자로 치료가능하다. 또 다른 구체예에서, 금속결합 단백질분해 효소의 에피토프에 대한 항체를 투여하여도 역시 환자내의 금속결합 단백질분해 효소기능을 억제할 수 있다. 그외의 다른 구체예에서, 금속결합 단백질분해 효소 억제인자와 CNS 미엘린 결합된 억제 단백질을 모두 교아종, 신경아세포종 또는 흑색종과 같은 악성종양에 걸린 환자에게 투여하여 치료할 수도 있다.

다양한 전달계가 공지되었고 박테리아에 의해 발현된 금속결합 단백질분해 효소와 관련분자를 리포좀이나 반투과성막에 캡슐화하여 전달할 수 있다. 항체같은 리간드에 대한 결합으로 생체내의 원하는 부위로 분자를 제공할 수 있다. 삽입방법으로서 근육내, 복강내, 정맥내, 피하의, 경구 또한 비강 경로등을 통하여 또한 뇌실이나 종양 제거 부위속으로 주입하는 것등이 포함된다.

[6. 시험관 내에서의 세포성장 및 섬유아세포 확산에 대한 비허용성 기질인 핍지신경교와 CNS 미엘린]

중추신경계(CNS) 신경교세포와 뉴우런의 상호작용을 연구하기 위하여 분리된 교감 혹은 지각 신경절세포 또는 태내 망막세포를 어린쥐의 분리된 안구신경교 세포의 배양물에 포함시킨다, 성상세포가 뉴우런 흡착 및 축색생장을 돕는 반면에, 핍지신경교는 뉴우런 기질과는 특성에 있어서 현저히 다르다. 미성숙(O4⁺, A₂B₅ ⁺, GalC^-) 핍지신경교는 뉴우런과 축색에 의해 접촉된다. 대조적으로, 분화된 핍지신경교(O4⁺, A₂B₅ ^-, GalC⁺)는 뉴우런 흡착과 축색성장에 대한 비허용적 기질을 나타낸다. 신경아세포종 세포난 3T3 섬유아세포 안구신경교 배양물속에 넣었을 때 동일한 차이점이 관측된다; 분화된 핍지신경교는 세포흡착, 축색성장 또는 섬유아세포 확산등에 대하여 비허용적이다. 이와 같은 비허용성 핍지신경교는 방사상의, 가지가 많은 돌기 네트워크를 특징으로 하며 보통 미엘린 기초단백질(MBP)을 포함하고 그 결과 미엘린-형 막 생성에 관련된 활성을 가지는 세포와 대응한다.

성숙한 쥐의 척수로부터 분리된 미엘린은 폴리리신 피복된 배양접시에 흡착되고 이것을 말초 뉴우런, 교아종세포 또는 3T3 세포에 대한 기질로서 시험하였다. 또 다시, 세포흡착, 축색성장, 또한 섬유아세포 확산등이 크게 손상되었다. 미엘린의 일반적인 물리-화학적 특성은 이 효과에 반응이 없는데 그 이유는 쥐의 뇌실 신경에서 나온 미엘린이 뉴우런 흡착과 축색성장 및 3T3 세포의 확산을 돕기 때문이다. 그 결과 분화된 핍지신경교는 비-허용적 기질특성을 나타내는데 CNS 발육이나 재생에 중요하다.

[6.1. 물질과 방법]

[6.1.1. 신경교세포 배양]

7-12일된 또는 어린(180-220g) Wistar쥐로부터 안구신경을 해부하고 편평한 배지에 모은다(air-buffered enriched L with 5% rat Serum; Mains and Patterson, 1973, J. Cell Biol. 59:329-345). 뇌막과 혈관을 현미경 아래에서 조심스럽게 분리하고 신경을 소단편으로 절단한다. 10일된 신경분리작업은 37℃ CMF-PBS(Ca⁺⁺/Mg⁺⁺-유리인산 완충염수)에 있는 0.25% 트립신(시그마제품)과 0.02% 콜라겐효소(Worthington)속에서 25분간 2회 실시한다(Raff et al., 1979, Brain Res. 174:283-318). 어른의 안구신경은 37℃에서 1시간동안 0.1% 트립신, 0.1% 콜라겐-효소에서 분리하고 다시 0.5% 트립신으로 10분간 분리한다. 세척후 파스퇴르 피펫을 사용하여 분쇄해서 분리하고, 다시 세포를 4개의 웰이 담긴 35㎜ 조직 배양접시의 각 웰속에 20,000 내지 30,000 세포수의 밀도로 담는다(웰의 표면적:95㎟). 7-10일된 안구신경에 대해 분리 수득량은 각 신경당 약 10,000세포였다. 대부분의 실험에서 배양기질은 폴리오르니틴(PORN, Sigma, 0.5ng/㎖ in borate buffer, 하룻밤동안 배양) 또는 폴리리신(PLYS, Sigma, 50ng/㎖ in Water)이고; 일부 실험에서는 건조 콜라겐 필름(소피부 콜라겐, 멸균용액에서 하룻밤동안 배양), 라미닌-피복된 PORN(정제된 쥐의 EHS), 종양 라미닌(5ng/㎖ 먼저 PORN으로 피복된 접시에서 3시간동안 배양) 또는 평조직 배양 플라스틱을 사용한다. 배양배지는 5% 쥐혈청, 페니실린(100U/㎖) 또한 스트렙토마이신(100ng/㎖)이 들어있는 농축 L₁₅배지이다(Main and Patterson, 1973, J. Cell Biol. 59:329-345). 일부 실험에서는 쥐의 혈청 대신 10% 태아소 혈청(FCS)을 첨가하기도 한다.

E13 또는 E17 병아리 배의 안구신경은 트립신/콜라겐효소 처리로 간단히 분리하고 PORN-피복된 배양접시 위에서 5% FCS가 들어있는 L₁₅에 2 내지 7일간 배양한다.

[6.1.2. 신경교-신경세포 공동배양]

3가지 종류의 신경세포를 신경교세포와 함께 공동배양한다: 신생쥐의 상위경부 신경절에서 나온 교감 뉴우런과 신생쥐의 배근 신경절에서 나온 지각 뉴우런 및 E17-E18 태내쥐의 망막에서 취한 세포등이 있다. 상위경부 및 배근 신경절을 해부하여 단일세포로 분리한다(Mains and Patterson, 1973, J. Cell Biol. 59:329-345; Schwab and Thoenen, 1985, J. Neurosci. 5:2415-2423). 태아에게서 망막을 떼어내고, 혈관을 제거한후 37℃ 0.03% 트립신, 0.03% DNA 분해효소로 10분간 배양하고, 혈청이 들어있는 배지에서 원심분리하여 세척하고, 분쇄하여 분리한다.

동일한 배지에 있는 2 내지 10일된 신경교 배양물에 뉴우런을 첨가하고 지각 및 교감 뉴우런에 대한 NGF(2.5S NGF, 50 내지 100ng/㎖)이나 망막세포를 위한 뇌에 유도한 신경향성 인자를 첨가한다(Johnson, J.E. et al., 1986, J. Neurosci. 6:3031-3038). 말초 뉴우런과 함께 첨가된 샨세포 성장 억제를 위해, 사이토신 아라비노시드 펄스(Ara C, 10^-5M)를 공동-배양 2일째와 5일째 24시간동안 2회 제공한다. 망막세포의 경우 공동-배양 1 내지 5일후에 또는 말초신경절 세포의 경우 2일 내지 3주후 배양물은 항체 착색처리한다.

CMF-Hank's 용액속의 0.1% 트립신의 단순처리하고 DMEM/FCS 첨가하여 종료시켜 배양플라스크로부터 DMEM/10% FCS에서 배양된 쥐 교아종 세포를(라인 NB-2A) 분리한다. 세척후 2mM 디부티 릴-사이클릭 AMP나 신경교에서 유도된 축색 촉진인자가 있는 DMEM/FCS에서 있는 신경교 배양물(각 웰당 40,000 또는 20,000세포)에 이 세포를 첨가한다(Guenther et al., 1986, EMBO J. 4: 963-1966).

10% 태아소 혈청이 함유된 DMEM 또는 인슐린(20ng/㎖)과 트란스페린(50ng/㎖)이 들어있는 MEM속에 있는 7일된 혹은 신생의 쥐 안구신경의 2-3일된 배양물에 교아종 세포와 동일하게 처리된 쥐의 NIH 3T3 세포를 각 웰당 20,000 내지 40,000 세포농도로 첨가한다. 2 내지 4시간동안 배양기속에 배양물을 다시 넣고 인산완충액속의 따뜻한 4% 포르말린으로 고정시킨후 O₁과 O₄항체로 이중 염색한다.

[6.1.3. 면역형광성]

다음의 항체를 핍지신경교, 성상세포, 뉴우런 또는 섬유아세포에 대한 표식자로 사용한다: 쥐 단클론항체(mAB) O₄(Sommer and Schachner, 1981, Dev. Biol. 83:311-327); 쥐의 mAB O₁(Sommer and Schachner, 1981, Dev. Biol. 83:311-327); 갈락토세레브로시드에 대한 특이성(GalC; Singh and Pfeiffer, 1985, J. Neurochem. 45:1371-1381); 토끼의 미엘린 기초 단백질에 대항하는 염소 항혈청(Omlin, et al., 1982, J. Cell Biol. 95:242-248); 전구물질세포: 쥐의 mAB A₂B₅(Sera-Lab, Crawley Down, GB); 성상세포: 신경교 원섬유성 단백질(GFAP)(Dahl and Bignami, 1976, Brain Res. 116:150-157); 뉴우런: 기니아픽이나 토끼 신경필라멘드에 대항하는 쥐의 mAB(Willard and Simon, 1981, J. Cell Biol. 89:198-205); 섬유아세포: Thy-1.1에 대항하는 쥐의 mAB Ox7; 인간의 피브로넥틴에 대항하는 염소 항-혈청(LETS 단백질; Cappel, NC).

특이 항체는 상응하는 항-쥐, 항-토끼, 또는 항-염소 플루 오리신 이소티오시아네이트(FITC)나 2차 항체에 결합된 로다민 이소티오시아네이트(RITC)에 의해 가시화된다. 염색하기전에, 배양물을 5% 자당 및 0.1% 소혈청 알부민(BSA)이 들어있는 PBS로 2회 세척한다. 항체 O₁, O₄와 A₂B₅는 표면항원에 대항하며 따라서 PBS/자당/BSA속에 1:20의 희석액으로서 30분동안 실온의 상태인 생체 배양물에서 배양하였다. Thy-1에 대한 항체는 1:10으로,ㅡ 항-피브로넥틴은 1:20으로 희석한다. 배양물을 2회 세정하고 PBS속의 4% 포르말린으로 10분간 고정시킨 후 다시 세정하고, 라벨화된 2차항체와 함께 1시간동안 배양하고(1:30 내지 1:100희석액) 세척한 후 PBS:글리세롤(1:1)속에 넣는다. 미엘린 기초 단백질(MBP)을 보기 위해, 배양물은 4% 포르말린 속에 간단히 고정시키고 에탄올/아세트산으로 처리한 후 마직막으로 실온에서 1시간동안 항-MBP 항혈청(1:500희석액)과 함께 배양한다. 에탄올/아세트산 고정작업은 또한 신경필라멘트의 가시화에도 이용한다. A₂B₅나 O₁항체와 O₄항체의 2중 라벨화 실험에 있어서, 먼저 살아있는 배양물을 항체 A₂B₅나 O₁와 다시 항-쥐-FITC와 함께 배양하고 다시 항체 O₄항원과 함께 배양한다; 일부 실험에서는 순서를 뒤바꾸기도 한다. GFAP 염색은 미리 4℃에서 30분간 95% 에탄올/5% 아세트산속에 고정시킨 후 PBS에서 다시 수화된 배양물에 대해 실행한다. O₄/GFAP 2중-라벨화 실험의 경우, 염색은 살아있는 배양물상에서 O₄항체로 1차 실행하고 다시 4% 포르말린 속에서 10분간 고정시킨 후 에탄올/아세트산 처리 및 GFAP-염색을 실행한다. MBP를 보기 위해서, 배양물을 4% 포르말린 속에 간단히 고정시킨 후 에탄올/아세트산으로 처리하고 마직막으로 실온에서 1시간동안 항-MBP 항-MBP 항혈청(1:500)과 함께 배양한다. 에탄올/아세트산 고정작업은 신경필라메트를 보기 위해서도 사용할 수 있다.

형광 현미경에서 한 항원(보통 O₄)의 존재에 대해 계통적으로 스크리닝하여 2중-라벨화된 배양물을 평가하고 또한 모든 라벨화된 세포를 다른 항원의 존재 즉, A₂B₅, O₅또는 GFAP의 존재에 대해 실험한다.

[6.1.4. 신경세포, 교아종세포 또는 3T3 세포와 함께 공동 배양물의 평가]

항체-라벨된 배양물을 형광 현미경에서 계통적으로 스크린하고 모든 O₄-라벨된 세포의 사진을 찍는다. 위상차 조명으로 동일 부분의 사진을 찍는다. 핍지신경교 표면지역은 뉴우런, 축색, 신경절 샨세포 및 3T3 세포와 접촉하는데 이를 측정하여 핍지신경교는 뉴우런, 축색 또는 3T3 세포로 덮인 영역의 20% 이하인 세포, 20% 내지 80%인 세포 또는 80% 이상인 세포로 세가지 카테고리로 나눈다: 단일의 얇은 미성숙 세포돌기는 가지많은 핍지신경교의 밀집 돌기 네트워크와 비교할 목적으로 실행하는 평가에서 제외된다. 망막세포와의 실험에서 전체 핍지신경교 범위와 망막 세포로 덮인 지역을 Hewlett-Packard digitizer로 측정한다. 핍지신경교 서브타입은 상응하는 형광 현미경사진으로 확인할 수 있다. 확인과정에 사용하는 기준은 세포 형태와 항원 특성(O₄/O₁)이다. A₂B₅-염색법은 뉴우런과의 공동배양후 이 항원이 신속이 손실되므로(세포형태학상의 부수적인 변화없이) 미성숙 세포의 표식자로 이용할 수가 없다. 구별하는 형태학적 기준은 돌기 네트워크속에서의 접합 및 막 사이트의 발생과 처리된 가지형성 패턴, 1차돌기의 수, 세포체의 형태와 크기등이 있다. 이러한 기준에서, 가지많은 핍지신경교와 미성숙 핍지신경교를 반복적으로 구별할 수 있다. 가지많은 세포의 대부분(전부는 아니지만)은 O₁항원에 대해 양성이며 미성숙 세포는 음성이다.

가지많은 핍지신경교에 대하여 신경아세포종 돌기 생성방향의 정량화는 표 5에서 보는 바와 같다. 가지많은 핍지신경교를 계통적으로 단순화시키고 이웃한 신경아세포종 세포는 핍지신경교 돌기 네트워크 모서리와 NB-2A 세포 사이의 거리가 2개 세포체 직경보다 작을 경우 인접한 것으로 분류한다. 다른 세포는 먼것으로 분류한다(제4도와 제5도). 8개의 부채꼴형으로 나눈 원형(4종류)이 인접한 핍지신경교 세포체 방향을 향하는 각 신경아세포종 세포의 중심으로 겹쳐지며 각 부채꼴에서 신경아세포종의 돌기 수를 센다(제5도).

[6.1.5. 미엘린 제조]

200g의 쥐에게서 척수를 해부하고 여기에서 접착 배근 및 복근을 제거하고 균질화한다(폴리톤, 중간 최대속도에서 30초). 좌골 신경을 해부하여 잘게 찢어서 균질화시킨다. 슈크로스 농도차에서 저속 상청액을 부유시켜 미엘린 성분을 분리한다(Colman et al., 1982, J. Cell Biol. 95:598-608). 특정 실시예에서, 원래의 막성분을 세척한 후 열장(hypotonoic) 쇼크를 주어 가능한한 오염물질을 제거한다. 열장 배지속에서 10,000xg 으로 5분간 침전시킨다. 50mM을 넘지 않는 이온성 물질이 들어있는 자당용액속의 막성분은 PLYS-피복된 조직 배양접시(조직배양접시 ㎠당 약 0.1㎎의 단백질이 들어있는) 위에서 수시간동안 흡착한다. 결합되지 않은 막은 CMF-Hank's 용액으로 3회 세척하여 제거한다. 피복된 접시를 기질검사 실험에 바로 이용한다. 교감 또는 지각 뉴우런을 이용한 실험에서 중추 혹은 말초 미엘린 몇방울을 일정형태로 35㎜ 배양접시 위에 뿌린다.

상술한 것처럼 배양된 교감 또는 지각 뉴우런은 12시간 내지 4일후 신경아세포종 세포는 5 내지 24시간 후 또는 3T3 세포는 1 내지 4시간 후에 실험한다. 정량화에 있어서, 신경아세포종 세포는 둥근세포, 사상위족이나 소형돌기가 있는 세포 또는 하나의 세포체 직경보다 긴 돌기가 있는 세포등으로 분류한다. 3T3 세포는 둥근세포, 사상위족이나 소형돌기가 있는 세포, 또는 큰 편평한 세포등으로 분류한다. 각 실험에 대해 3개의 배양물에서 배양물당 3∼4개의 현미경 사진을 임의로 택한다.

[6.2. 결과]

[6.2.1. 분리된 어린 또는 성숙한 쥐의 안구 신경의 배양]

세포의 GFAP 양성 성상세포는 세포의 약 30% 이다. 세포의 약 50%는 분화된(GalC-양성) 및 미성숙(A2B5-양성) 핍지신경교에 대해 표식인 O₄항원에 대해 양성이다. O₄내지 GFAP 또는 O₄내지 Thy-1 사이의 라벨화에서 아무런 중첩현상도 발견되지 않으며 그 결과 핍지신경교 종류에 대힌 표식자인 O₄항체의 특이성을 확인할 수 있다(Sommer and Schachner, 1981, Dev. Biol. 83:311-327). 큰 편평 형태로된 Thy-1-양성 섬유아세포는 어린쥐의 안구신경에서 약 20% 세포를 차지한다.

[6.2.2. 핍지신경교의 서브타입]

7 내지 10일된 쥐의 배양에서 O4-양성 세포의 약 50%가 A₂B₅-라벨화된 세포이다. 이 세포는 O₁-음성(표 1)이며 다각형 세포체로부터 나온 무전형 돌기가 있는 세포, 말초돌기가 있는 편평한 세포, 양극성세포 및 사상위족이 있는 세포 등을 포함하여 여러가지 형태로 되어있다. 이 표식지 프로파일 (A₂B₅ ⁺, O₄ ⁺, O₁ ^-)의 기초와 Schnitzer와 Schachner(1982, Cell Tissue Res. 2245:625-636)에 따르면 이러한 세포는 선구물질 및 미성숙 핍지신경교로 해석하고 총괄적으로 미성숙 핍지신경교로 부른다. 여러 형태로 되어있기 때문에 이 세포군은 이질성이다. 사상위족-함유세포가 가장 진보적인 것이다(표 1).

* 분리된 7-10일생 쥐의 안구신경세포를 2일간 PORN 위에서 배양하였고 1차로 항체 AB(항-쥐 FITC에 의해 탐지됨)와 다시 O나 O으로 라벨시키거나 이와 반대순서로(항-쥐 RITC에 의해 탐지됨) 라벨화시켰다. 2중-라벨화된 세포의 비율을 AB /O 와 AB /O 세포에 대해 수득한 값으로 부터 계산하였다. 이값은 2가지 분리된 실험에서 나온 4-6배양물의 평균치 ±SEM(120-200세포/배양물)으로 표시한다.

a) AB /O세포의 비율은 어떤 핍지신경교 표식자도 나타내지 않는 Ⅱ형 성상세포와 선구물질 세포를 포함한다.

b) 다양한, 약한, 입자형 염색.

O-양성 세포의 약 50%는 배양조건하에서 2일간 배양한 후 AB 음성 또는 O-양성으로 타난다. 대부분의 세포는 전형적인 가지많은 방사형 돌기 네트워크를 가지는 것으로 나타난다. 이와 같은 특이적형태 때문에 이 세포를 가지많은 핍지신경교라고 부른다(표 Ⅰ). 2일간 배양 후 10일생 쥐의 안구신경에서 나온 가지많은 핍지신경교는 대부분 미엘린 기초 단백질(MBP)에 대한 항혈청으로 염색하였다. 따라서 우리는 이 세포들을 미엘린 형성 핍지신경교라고 해석한다. 이들의 특징적인 돌기네트워크는 부적절한 부분적으로 붕고된 임의의 편평막 영역을 포함한 미엘린 막의 결과이다. 성숙한 신경에서 나온 총세포 수득량은 매우 적다. 분화된 O-양성의 가지많은 핍지신경교와 또한 미성숙 AB-양성 핍지신경교 역시 성숙한 조직의 배양에서 나타난다.

[6.2.3. 신경교에 대한 각종 세포종류의 반응]

[6.2.3.1. 뉴우런과의 공동배양]

신생쥐 상위경부 신경절 또는 배근 신경절에서 분리된 세포를 배양 2일 내지 10일 후 신경교 세포에 첨가하였다. 신경절 샨세포와 섬유아세포는 어떤 실험에서 Ara C의 펄스에 의해 제거된다. NGF(50 혹은 100ng/㎖)를 배양배지에 첨가하면 섬유생성이 신속해지고 또한 2-3일내에 조밀한 축색네트워크를 형성하게 된다. NGF 단독으로는 핍지신경교의 발생과 형태에 아무런 영향을 주지 않는다. 실험 종료시 항체염색으로 신경교 세포종류를 확인한다(2일 내지 2주간의 공동-배양).

조밀한 축색 망상조직과의 배양에서, 방사형 가지많은 돌기를 갖춘 세포가 관찰되는 중심부에서 윈도우가 없는 축색의 발생이 뚜렷하게 발견되었다(제1도). 항체 염색으로서 가지많은 핍지신경교인 세포를 확인한다. 교감신경절 세포가 있는 핍지신경교 상호작용의 정량화가 제2도(a)와 2도(b)에 나타난다. 전체 신경교세포 밀도가 낮을때 배양물 속에는 핍지신경교와 인접한 성상세포는 거의 없다; 따라서 성상세포와의 선택적인 결합은 이 결과로서 알기 힘들다. 가지많은 핍지신경교는 사용된 배양기질에 관계없이 이들 지역에서 뉴우런이 제외된다. 동일한 윈도우가 편평한 플라스틱, 콜라겐, PORN-또는 라미닌-피복된 배양접시 상에 형성되었다. 교감 및 지각 뉴우런 사이에는 아무런 차이도 없었다; 양쪽 모두 가지많은 핍지신경교의 범위에서 벗어나 있다. 유사하게, 샨세포가 존재할 경우 이것은 핍지신경교 돌기 네트워크를 침해하거나 이에 성장하지 않는다(제1도(b)). 대조적으로, 무정형의 또한 O-항원 결핍을 특징으로 하는 미성숙 핍지신경교는 그 돌기와 세포체상에서 축색성장을 허가한다(제1도(b), 1도(e), 1도(f)). AB는 뉴우런 첨가후 재빨리 손실되는 항원이므로 공동-배양에서 미성숙 핍지신경교에 대한 표식자로 사용할 수가 없다. 최근의 핍지신경교와 성장원추체(cone)의 결합에서 성장원추체의 움직임이 사상위족 접촉후에 억제되는 것을 발견하였다. 정상의 성장원추체 활성은 미성숙 세포의 접촉 및 이종교배 과정에서 나타난다. 이 관찰 결과는 윈도우가 축색 망상조직에서 2차적으로 형성될 가능성을 배제한다. 동일한 배양물 속에 있는 성상세포는 단일축색 또는 축색다발에 의해 만연하게 된다(제3도(a), 3도(b)). 이것은 편평하고 또한 방사형태의 세포 양쪽 모든종류에 있어서 사실이다.

[6.2.3.2. 의 공동-배양]

안구신경 비-뉴우런 세포의 5일 배양물 상부에서 망막세포가 단층밀도로 나타난 후 망막세포의 전형적인 재배열을 관찰할 수 있다; 핍지신경교 선구물질 세포가 망막세포에 의해 자주 접촉하는 반면에, 가지많은 핍지신경교는 대부분 그렇지 못하다(제1도(g), 1도(h), 3도(c), 3도(d)). 성상세포는 PORN 이상으로 적합한 기질이다.

[6.2.3.3. 교에 대한 다른 세포형의 반응]

분리된 안구신경 배양물속에 고밀도의 신경아세포종 세포(라인 NB-2A)를 넣고 2mM 디부티릴-시클릭-AMP나 또는 GdNPF로 자극하여 섬유를 형성한다. 7, 24 또는 48시간 후 배양물을 고정시키고 항체 O와 O로 핍지신경교를 확인한다. 가지많은 핍지신경교의 영역을 신경아세포종 세포에 의해 분명하게 떨어져 있다(제4도(a), 4도(b). 핍지신경교에 가까운 신경아세포종 세포에 의해 만들어진 돌기는 핍지신경교로부터 벗어나 있다(제4도(a), 4도(b); 제5도와 표 Ⅰa).

†제5도 참조

* p0.0.05

*** p0.001

안구신경 조합물내의 1차 배양 섬유아세포, 성상세포 및 쥐의 3T3 세포는 가지많은 핍지신경교에 대한 현저한 회피행동을 보여준다. 안구신경교 배양물에 고밀도로 함유된 3T3 세포는 30분 내지 3시간 사이에 PORN 기질위에 흡착하거나 편평하게 깔리게 된다. 형성된 단일층에서, 가지많은 핍지신경교의 영역에 상응하여 특이적 윈도우가 생긴다(제4도(c), 4도(d)). 접촉부위에서 3T3 세포는 초생달-형 세포형질 다발을 만든다. 이 지역에서 라멜리포디아가 결핍되어 있다. 중요한 것은 가지많은 핍지신경교에 직접 내린 섬유아세포가 확장하지 못하는 점이다. 뉴우런에서, 미성숙 핍지신경교를 3T3 세포에 의해 가시적으로 회피할 수가 없다(제6도).

[6.2.4. 종 특이성의 결핍]

핍지신경교의 특이형태나 바람직하지 않은 기질특성은 종 특이성이 아니다. E13과 E17 병아리 안구신경에서 나온 분리된 비-신경성 세포는 부수적으로 O-양성/AB-음성/O-양성의 가지많은 핍지신경교를 포함한다. 닭의 비-신경세포의 상부에 있는 3T3 세포는 이 병아리 핍지신경교 주변에 특이적인 윈도우를 형성한다.

[6.2.5. 기질로써의 미켈린]

미엘린이 나선형으로 싸여있는 핍지신경교 막으로 구성되어 있기 때문에 뉴우런이나 섬유아세포용 기질로써 미엘린의 특성을 검사한다. 어른쥐 척수나 좌골신경에서 나온 최초 미엘린 성분을 슈크로즈 농도차에서 부양시켜 준비한다. 미엘린을 PLYS-피복된 조직 배양접시에 흡착시키고 상경부 신경절세포, 배근 신경절세로, 신경아세포종 세포 및 3T3 세포에 그 기질특성을 검사한다. 4가지 종류의 세포는 CNS 미엘린에 잘 흡착되지 않으며 돌기형성이 상당히 어려운 것을 보여준다. CNS 미엘린에서 교감 및 지각 뉴우런이 주위에 남았고 NGF(50ng/㎖ 또는 100ng/㎖) 대신에 짧은 미발육 섬유를 만든다(제7도(a), 제7도(c)). 대조적으로, 같은 배양접시에 담긴 좌골신경 미엘린의 조세포(islet)상에서 긴섬유가 생성된다(제7도(b), 제17도). 외부 축색으로 경계진 윈도우로서 나타난 PLYS상의 소형 CNS 미엘린 조세포와 반대로, PNS 미엘린-PLYS 경계는 축색성장으로 확실하게 탐지할 수가 없다.

디부티릴-시클린 AMP 존재하에서 신경아세포종 세포에서 나온 돌기 성장은 CNS 미엘린에 의해 축소된다(제8도(a)).

CNS 미엘린으로 3T3 섬유아세포의 확산을 CNS 미엘린으로 크게 억제시킬 수 있다(제8도(b)). 3T3 세포는 주위에 남아있고, 최소세포 기질 상호작용으로서 방추형 혹은 다각형으로 만들어진다. 대조적으로, 큰 편평막은 다소 느린 시간-경과동안 폴리실린상에서 20 내지 30분이내에 생성된다. 또한 말초 신경계에서 나온 미엘린에서도 생성된다(제8도(b)). 열장조건에서 10,000xg으로 5분간 침전시키면(섹션 6.1.5. 참조) 대부분의 비허용성막을 충분히 펠릿화할 수 있기 때문에, 비허용도는 적어도 큰 부분의 미엘린막과 관계가 있다. 이 조건하에서 0.85M 자당보다 더 작은 밀도로 떠있는 대부분의 표면막 성분은 침전하지 않는다고 예상되지 않는다.

CNS 미엘린 비허용성은 소량 백질을 포함하는 CNS 조직이 섬유아세포 확산에 대해 허용성 기질이기 때문에 CNS 미엘린 비허용성이 성상세포 막때문이 아니다.

이 실험에서 살아있는 가지많은 핍지신경교의 효과와 동등하게 CNS에서 나온 미엘린은 역시 초기 배양 뉴우런, 신경아세포종 세포, 또한 3T3 섬유아세포에 대하여 강한 비허용적 기질이 된다. 말초 신경계의 미엘린은 비교할만한 정도의 비허용성 기질효과를 나타내지 않는다.

[6.3. 논의]

본 연구에서 미엘린 형성 핍지신경교와 분리된 CNS 미엘린은 교감 및 지각 뉴우런과 신경아세포종 세포의 축색을 생성하고 망막세포의 부착과 섬유아세포의 확산에 대한 비허용성 기질효과를 나타내는 것으로 관찰하였다.

분리된 쥐의 안구신경의 단기 배양물에 여러 세포종류가 존재한다:

핍지신경교, 성상세포(GFAP-양성) 섬유아세포(Thy-1, 피브로넥틴-양성) 및 다수의 선구물질 세포종류가 있다 핍지신경교 종류에서(O-양성; Sommer and Schachner, 1981, Dev. Biol. 83:311-327), 한가지의 중요한 세포 서브타입은 O항원 (GalC)과 MBP, 미엘린 특성이 큰 이 두성분(Mirsky, et al., 1980, J. Cell Biol. 84:483-494)의 결핍과 항체 AB에 대한 결합부위의 존재를 특징으로 한다. AB는 핍지신경교/Ⅱ형 성상세포 선구물질, Ⅱ형 성상세포 및 뉴우런에 대한 표식자로 나타난다(Schnitzer and Schachner, 1982, Cell Tissue Res. 224:625-636; Abney, E.R. et al., 1981, Dev. Biol. 100:166-171; Raff, et al., 1983, Nature 303:390-396). 따라서 이 세포종류는 선구물질을 포함하여 미성숙 핍지신경교를 나타낸다고 간주한다(Dubois-Dalcq. Dubois Soc. Neurosci. Abstr. 12:767)(Sommer and Nobel, 1986, Sco. Neurosci. Abstr. 12:1585). O의 존재로 O2A 선구물질로부터 이 세포를 구별해낸다(Raff, M.C. et al., 1983, Nature 303:390-396). 미성숙 세포는 대개 사상위족이 함께 있는 무정형이고 이극성형 또는 다각형의 다양한 형태의 세포체와 무정형 돌기를 보여준다. 이 세포종류는 이종형일 수도 있다; 세포분할을 관측할 수 있다. 2차 주요 핍지신경교 아강은 방사형의 가지많은 접합 돌기 네트워크가 돌출한 AB-음성 및 O-양성세포를 포함한다. 10일생 쥐의 안구신경이 2일간의 배양물에 있는 대부분의 가지많은 핍지신경교는 배양조건하에서 MBP에 대해 양성이다. 그러므로 이와 같은 세포는 축색돌기가 없는 배양기질 상에서 편평하게 깔린 미엘린막의 합성과정에서 관련하는 핍지신경교로 간주한다. 이 막은 불안정하며 특징적인 접합 돌기 네트워크를 형성하지 못한다. 이 세포종류를 털로 덮인 안구세포 라고 표시하고(Sommer and Schachner, 1981, Dev. Biol. 83:311-327) 이 세포에 의한 조밀한 미엘린의 나선형 모양이 장시간에 배양 후 관찰된다(Rome et al., 1986 J. Neurosci. Res. 15:49-65; Yim et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:11808-11815).

7 내지 10일된 또는 어른쥐 안구신경 배양에서 또한 1일생 쥐의 안구신경, 신생쥐 척수 혹은 어른쥐 칼로섬체의 배양에서, 또한 E13이나 E17 닭 배지의 척수와 안구신경의 배양에서 핍지신경교를 형성하는 미성숙 미엘린을 볼 수 있다. 어린 단계일수록 미성숙 세포를 분리해내는 것이 유리하고, 성장함에 따라 수득할 수 있는 세포는 크게 줄어들고 정량적 분석이 어렵다. 그러나 어른쥐의 백질조직에서 미성숙 핍지신경교를 다량 얻을 수 있음이 확인되었다(French-Constant and Raff, 1986, Nature 319:499-502).

만들어진 신경교 배양물에 대한 뉴우런 첨가하면 다양한 종류의 비-신경성 세포에서 신경흡착과 섬유 성장에 대한 기질 특성에 있어서 현저한 차이점을 보인다. 성상세포, 특히 편평한 반응성 원형질 성상세포는 초기의 관찰에서와 같이 흡착성이고 신경 접착 및 성장을 선호하였다(Founcaud et al., 1982, Cell Res. 137:285-294; Hatten, et al., 1984, J. Cell Biol. 98:193-204; Noble, et al., 1984, J. Neurosci, 4:1982-1903; Fallon, 1985, J. Cell Biol. 100:198-207). 또한 미성숙 핍지신경교 역시 축색이나 신경세포체와 충분히 흡착한다. 이와 같은 작용은 생리학적으로 큰 관련성이 있다. 발육과정에서, 핍지신경교는 이미 형성된 축색돌기 다발속으로 이동하고 돌기를 확장시켜 다수의 축색돌기와 접촉하게 된다. 그후 이 돌기는 축색돌기 주위를 나선형으로 둘러싸며 미엘린 구조를 형성한다(Wood and Bunge, 1984, W.T. Norton, ed. 1-46).

성상세포와 핍지신경교 선구물질의 대조적인 형태에서 미엘린 형성 핍지신경교는 신경접착 및 섬유생성과 섬유아세포 흡착과 확산에 대하여 비허용성이 큰 기질특성을 보여준다. 이 효과는 강하고 라미닌-피복된 배양접시에서도 나타나며 한편 축색성장에 대한 우수한 기질임을 보여준다(Manthorpe, et al., 1983, J. Cell Biol. 97:1882-1980; Rogers, et al., 1983, Dev. Biol. 98:212-220). 이 효과는 또한 교감 및 지각 뉴우런의 배양중 다량의 NGF나 신경아세포종 세포 배양중의 GdNPF나 디부티릴-시클릭 AMP에 의해서 억제되지 않는다. 유사한 혹은 동일한 비허용성 기질 특서이 쥐 CNS 미엘린과 관계있으며 반대로 말초신경의 미엘린과는 관계없다. 신경섬유 또는 섬유아세포가 잘 자라고 핍지신경교나 CNS 미엘린 조세포의 주변으로 자유롭게 이동하기 때문에, 이 효과는 접촉-의존형이다. 닭의 핍지신경교에 의해 쥐의 3T3 세포를 억제할 수 있어 이 효과는 종-특이성이 아니다.

쥐의 안구신경에서, 축색돌기는 배 발생 20일에 정점에 달하며 그후 현저히 줄어든다(Crespo, et al., 1985, Dev. Brain Res. 19:129-134). 핍지신경교 선구물질은 E17으로부터 전방에 나타나며(Raff, et al., Cell 42:61-69 또한 발생시에 GlaC를 발현한다(Miller, et al., 1985, Dev. Biol. 111:35-41). 첫 번째 미엘린은 전자현미경으로 관찰할 수 있으며 생후 6일째 나타난다(Hildebrand and Waxman, 1984, J. Comp. Neurol. 224:25-37). 병아리의 안구 신경에서 축색돌기 형성과 미엘린 형성간의 선명한 분리현상이 나타나나(Rager, 1980, Cell Biol. 63:1-92) CNS의 많은 백질관에서는 별로 조사되지 않았다(Matthews and Duncan, 1971, J. Comp. Nuerol. 142:1-22; Looney and Elberger, 1986, J comp. Neurol. 248:336-347). 따라서 정상적인 발육 과정에서, 성장한 축색돌기는 섬유속에서 미엘린 또느 미엘린화 핍지신경교와 대항하지 않으며 오히려 선구물질 및 미성숙 핍지신경교와 상호작용한다. 시험관내의 미엘린화에서 관찰되는 극히 느린 시간-과정은(Wood et al., 1980, Brain Res. 196:247-252; Wood and Willians, 1984, Dev. Brain Res. 12:225-241) 분화되지 않은 핍지신경교가 1차적으로 축색돌기와 상호작용하고 다시 분화 유도되어 미엘린을 형성하는 과정과 관계가 있다.

발육과 대조적으로 CNS 재생과정에서, 축색돌기 성장코온이나 발아는 성숙 핍지신경교와 미엘린에 대항한다. CNS 조직의 기질특성, 특히 고등동물의 분화된 CNS속에 있는 라미닌 같은 기질을 촉진하는 효능있는 축색의 결핍은 CNS 재생의 관계에서 중요한 측면이 된다(Liesi, 1985, EMBO J. 4:2505-2511; Carbonetto, et al., 1987, J. Neurosci. :610-620). 그러나, 미엘린과 핍지신경교는 신경지배 제거된 CNS 관속에서 오랜동안 지속하므로(Fulcrand and Privat, 1977, J. Comp. Neur, 176:189-224; Bignami, et al., 1981, J. Neuropath, Exp. Neurol. 40:537-550), 말초신경과 PNS/CNS 이식편에 대조적으로 백질지역에 있는 섬유재생의 부재는 이러한 비허용성 기질인자와 관계할 수 있다.

정상 조건에서, 발생 동안 후기에 축색돌기 집다의 성장을 위한 지역을 차단하거나 CNS 돌출 패던의 발생 동안 허용성 내지 비허용적인 기질분자 사이의 대항 및 분화된 CNS 에서의 발아에 대한 공간적인 제한성등은 핍지신경교에 관계한 비허용성 기질특성에 대해 있을 수 있는 기능이다.

[7. 내에서의 중추신경계에 대한 교아종 침윤에서 금속결합 단백질분해 효소의 연관]

이 실험에 있어서 시험관내에서 쥐의 교아종 세포주 C6으로 시행한 CNS 조직의 악성종양 침윤에 대해 중대한 역할을 하는 막-결합 금속결합 단백질분해 효소를 설명한다.

쥐의 교아종 세포주 C6으로 시행된 시험관 내에서의 CNS 조직에 대한 악성종양 침윤에서 혈장 막에 결합된 금속 의존성 침식 활성을 요구된다. C6 세포는 안구신경 체외이식 조직에 침투하고, 흡착하고, 소뇌 냉동편의 백질 및 회백질에 또는 CNS 미엘린에 확산한다. 금속 이온 킬레이터 1,10-페난트롤린과 2펩티드 cbz-try-try는 CNS 미엘린에 확산하는 C6 세포의 67%까지 차단하며 반면에 3가지 다른 단백효소에 대한 억제인자는 그렇지 않다. 3T3 세포에 대한 CNS 미엘린 억제 기질특성을 중화하는 금속의존 활성도는 C6 혈장 막성분과 관계있다. 금속결합 단백질분해 효소의 동일한 억제인자는 CNS 신경 체외이식 조직의 침입과 소뇌 냉동편의 CNS 백질에서의 확산을 침해한다.

[7.1. 물질과 방법]

[7.1.1. 세포배양]

쥐 C6, 마우스 NIH 3T3와 B6 세포는 10% 태아 송아지 혈청(FCS)을 함유한 Dulbecco's 변형 이글스 배지(DMEM)에서 배양하여 70∼80% 합류배양시켰다. 단시간 트립신 처리(0.1% in Ca /Mg free Hank's medium for 90 seconds)로 세포를 수득하고 FCS를 과량 첨가하여 중지시키고 원심분리한 후 수집한다. DMEM/FCS나 일정한 무혈청 배지(MEM)에서 세포를 재현탁시키고 실험용으로 사용한다. 6-7일생 루이스 쥐의 안구신경(섹션 6.1.1 상기참조)에서 분리된 쥐 CNS 신경교세포를 준비하고 이를 폴리-D-리신(PLYS) 피복된 웰(100㎟, 100㎕ 배지)속에 웰당 20,000 세포수의 밀도로 넣어둔다. 배양배지는 5% 쥐혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한 농축 L15 배지이다. C6, 3T3 및 B16 세포는 웰당 30,000 세포의 농도로 2일간의 배양물에 첨가하고 2시간동안 배양하고 인산완충액내의 따뜻한 4% 포르말린으로 고정시킨다. 특이적 항체 O과 O를 사용하여 이중 라벨화에 따라 억제성 핍지신경교를 확인되었다(섹션 6.1.3. 상기 참조).

[7.1.2. 침투 분석을 위한 신경 체외이식 조직의 제조]

안구신경과 좌골신경 체외이식 조직을 제조한다(Schwab and Thoenen, 1985, J. Neurosci, 5:2415-2423). 신경을 생후 약 8주된 수컷쥐로부터 해부하고, 뇌막을 제거하고, 액화질소를 이용하여 3회 냉동 및 해빙하고, 실리콘 그리이즈를 바른 배양접시에 밀봉된 테프론링(직경 13㎜, 두께 1㎜)아래에 놓는다. 체외이식 조직에만 연결된 두개의 챔버를 이러한 방식으로 수득한다. 3T3 및 B16 세포 300,000개를 DMEM/FCS의 내부 챔버에 넣고 5 내지 20일간 배양하였다. 이틀 간격으로 배지를 교환하였다. 4% 포르말린으로 하룻밤동안 배양물을 고정시킨다. 신경 체외이식 조직은 Tissue-Tek에 놓고, 10 내지 15㎛ 단편을 저온유지 장치속에서 절단한 후 젤라틴 피복된 커버슬릿 위에 수집한다. 실온에서 하룻밤동안 건조시킨 후, 절편을 0.75% 크레실 바이올렛으로 염색한 후 평가한다. 세포가 첨가된 팁에서 출발하여, 0.1㎜의 각 체외이식 조직에서 침입 세포수를 측정한다. 15일 배양하면, 체외이식조직의 직경이 달라진다. 따라서 신경의 중심부(0.25㎜)만 우수한 조직적인 성질을 보이므로 이것만 고려한다. 2㎕의 3mM cbz-tyr-tyr 또는 cbz-ala-phe 용액과 함께 양측면에서 주입된 신경 체외이식 조직에 대하여 억제실험을 실시한다.

[7.1.3. 기질인 CNS 냉동편과 기질로써 미엘린]

어른쥐의 소뇌 냉동편을 준비하고 유리 커버슬립상에서 건조시킨다. 100㎖에 담기 C6, 3T3 또는 B16 세포 70,000를 차가운 DMEM/FCS로 세정한 박편을 함유한 각 웰에 첨가한다. 배양물을 37℃에서 2일간 배양한다. 그후 배양물을 고정시키고 크레실 바이올렛으로 염색한다. 각 실험당 4개의 소뇌 박편중 3개를 사용하고 각 실험은 최소한 2회 반복한다.

불연속 슈크로즈 농도에서(섹션 6.1.5. 참조) 정제된 쥐의 척수(CNS)나 좌골신경(PNS)로부터 나온 미엘린을 PLYS 피복된 웰상에서 하룻밤동안 건조시킨다(20㎍단백질/100㎟표면적의 웰). 가라앉지 않은 막을 Ca /Mg -free Hank's용액으로 3회 세척하였다. 1㎝당 9,000세포(C6, 3T3 또는 B16)을 첨가하는 기질 검사분석에서 미엘린 피복된 웰을 사용한다. 별개적으로 CNS 미엘린 단백질이나 리포좀속에서 재구성된 SDS-PAGE 정제의 35kD 및 250kD 억제 단백질을 추출한다(Caroni and Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106:1281-1288). 광카메라와 함께 설치된 위상차 현미경을 사용하야 여러 시점에서 실험결과를 기록한다. 표면 집적 프로그램으로 정량화한다; 각 웰에 대해 세곳의 임의적인 구역을 80X 배율에서 사진찍고 사진당 최소한 25개 세포를 측정하였다. 각 점은 최소한 3웰±SEM의 평균치를 나타낸다. 그 결과는 돌출된 세포면의 μ또는 degree로 나타내고 이것은 확산세포의 돌출면값에 완전한 구형세포의 표면값을 감하여 계산한 것이다.

[7.1.4. C6 혈장 막과 조건 배지 제조]

80% 수준으로 합류 성장한 C6 세포를 Hank's 배지에서 2회 세척하고, 20㎖ 8.5% 자당, 50mM NaCl, 10mM 트리스 완충액, pH7.4에서 고무 폴리스맨을 이용하여 수득한다. 크기가 작아지는 바늘다발을 통과시켜 기계적으로 균질화한 후, 원심분리하여 저순도의 혈장 막 성분을 수득한다(3,000xg에서 5분간, 8,000xg에서 10분간, 또한 다시 100,000xg에서 2시간동안). 물질을 50mM NaCl, 10mM 트리스, pH7.4의 조건으로된 불연속 슈크로즈 농도차에 적용시켜 더 높은 순도의 성분을 분리한다(Quigley, 1976, J. Cell Biol. 71:472-486). 20-40% 자당 중간 상(C6 플라즈마 막 성분)과 40-60% 자당 중간상(C6 미톤콘드리아 성분)을 수집하고, Hank's 배지에서 세척한 후 MEM에 재현탁한다.

80% 합류된 C 세포 배양물을 MEM 속에서 1일 동안 배양하여 조건 배지를 수득한다. 다시 배지를 수집하고 3000xg에서 10분간 원심분리한다. 특정 실시예에서 조건배지를 센트리콘 튜브를 사용하여 10배로 농축시켰다.

[7.1.5. C6 혈장 막이 있는 CNS 미엘린의 처리]

CNS 미엘린 피복된 PLYS 웰을 전술한 것처럼 만들고 기질로서 즉시 시험하는 대신 1차로 37℃에서 30분간 50㎕의 C6 혈장 막(0.8㎎ 단백질/㎖ MEM함유)과 함께 배양하였다. 접시는 다시 Hank's 배지로 2회 세정하고 바로 3T3 세포를 위한 기질로서 사용한다. 어떤 실험에서는 10배 농축된 용액을 사용하여 단백효소 차단제를 막에 첨가한다.

[7.2. 결과]

[7.2.1. 3T3 섬유아세포를 제외한 C6 교아종 또는 B16 흑색종의 안구신경과 CNS 백질에 대한 침입]

냉동 안구신경과 좌골신경 체외이식 조직은 테프론 링아래에 놓고 실리콘 그리이즈로 밀봉한다. 이틀 간격으로 배양배지를 교환하고 배양한지 5일 내지 20일 후 신경을 고정시키고 저온 냉동장치속에서 절단한다. 크레실 바이올렛 염색으로 침입된 세포를 인지한다. PNS 체외이식 조직은 C6 및 3T3 세포 모두의 확산 침입을 지지한다(제9도(c) 및 제도9(d)). C6 세포는 고밀도로 체외이식 조직속에 들어있다. 안구신경 체외이식 조직에서, 서로다른 사진이 찍힌다(제9도(a), 제9도(b)); 혈관을 따라 이동한 매우 적은 수의 세포를 제외하고 3T3 세포는 신경에 침입하지 않는다(제9도(b), 화살표). 한편으로는 한가지 확산 패턴으로 C6 세포는 안구 신경속으로 깊이 침투하여 14일째는 삽입점으로부터 약 3㎜의 최대 깊이에 도달한다.

별도의 방식에서 어른쥐 소뇌의 냉동편을 C6, B16 및 3T3 세포에대한 배양물로 사용할 수 있다. 전이성이 큰 B16 흑색종 세포는 세포부착, 확산 및 이동에 있어서 회백질과 백질의 기질 사이에서 큰 차이점을 발견할 수 있다. 사실상, B16 세포는 예외적으로 고세포밀도에서 적용될 경우까지도, 회백질 영역에 흡착되고 확산되며, 이것은 절편의 백질속에 이동하거나 흡착하지 않는다(제10도(e)). 백질이 아닌, 회백질에서 조밀한 단일층을 형성하는 3T3 세포에서 역시 동일한 사진을 볼 수 있다(제10도(c), (d)). B16과 3T3 세포와 대조적으로, C6 세포는 백질 및 회백질에서 모두 충분히 발견된다(제10도(a), (b)). 어떤 경우 C6 세포가 대체로 어려움 없이 확장하는 소형 응집물을 형성할 때 C6 세포는 회백질의 분자층 보다는 백질에서 더 조밀하다.

[7.2.2. 교아종 세포확산은 CNS 미엘린에 의해 억제되지 않는다.]

PLYS 피복된 웰에 대해 흡착한 CNS 미엘린에서 C6 교아종의 확산 작용을 B16 흑색종 및 3T3 섬유아세포와 비교한다.

CNS 미엘린 기질에 대한 B16 흑색종 반응은 3T3 섬유아세포와 유사하다; CNS 미엘린에 대한 3T3이나 B16 세포 확산은 심한 손상을 입는 반면에 C6 세포확산은 초기(90분간)에 다소 감소되고, 그후의 시점에서는 큰 차이가 없다(제11도). CNS 미엘린이나 PLYS에 대한 세포간의 차이점은 장기 배양시간동안 지속한다(최고 1일까지).

C6 세포는 리포좀에서 재구성된 SDS-PAGE으로 정제된 억제인자와 (35kD와 250kD) 마주하고, 살아있는 배양 핍지신경교에 대항한다. 35kD와 250kD 리포좀은 3T3 세포 확장을 크게 억제하고 반면에 C6 세포확산을 침해하지 않는다; C6 세포는 흡착성이며 재구성된 CNS 미엘린 성분에서 잘 퍼지는 계란 후라이 형태로 나타날 것으로 추측한다.

[7.2.3. CNS 미엘린에서의 C6 세포확산을 억제하는 금속결합 단백질분해 효소의 특이한 차단제]

C6 작용에서의 단백효소의 연관은 CNS 미엘린이나 PLYS에서의 C6 세포확산에 대한 단백효소의 억제효과를 측정하여 조사한다. 적절한 농도로 된 cys-, ser- 및 Asp-단백효소 차단제는 CNS 미엘린에서의 C6 확산에대해 아무런 인지효과가 없다(표 2).

다른 한편으로 특이 금속결합 단백질분해 효소 차단제 1,10-페난트롤린은 CNS 미엘린에서의 특이적인 C6 확산에 대한 강한 억제작용을 나타낸다; 미엘린에서 배양 2시간 후 67%까지 확장하는 C6를 1,10-페난트롤린이 억제한다(표 Ⅱ). PLY에서의 C6 세포확산에 대한 중대한 영향을 미치는 차단제는 발견되지 않았다. 1,10-페난트롤린은 금속이온을 킬레이트화하는 특성때문에 일반적으로 사용하는 금속결합 단백질분해 효소 억제인자이다. 그러나, 이 물질에 의한 억제현상은 다른 금속의존적 효소 역시 억제되기 때문에 단백질 분해 활성도를 결정하는 데에는 충분치 않다. 그외의 많은 금속결합 단백질분해 효소 억제인자를 발견하였으나, 1,10-페난트롤린처럼 통용적인 것은 아니었다. 포스포라미돈(Komiyama, et al., 1975, Biochem, Biophys. Res. Comm. 65:352-357), 베스타틴(Umezawa, et al., 1976, J. Antibiot. 29:857-859) 및 금속결합 단백질분해 효소의 조직 억제인자(TIMP; Cawston, et al., 1987, Biochem, J. 195:159-165)는 C6 세포확산을 손상하지 않았다(표 2).

TIMPSMS 엔케팔린을 분해하는 뇌막 결합 금속결합 단백질분해 효소를 억제하지 않는다. 카르복시메틸-phe-leu(Fournie-Zalusaki, M.C. et al., 1983, J. Med. Chem. 26:60-65)는 엔케팔리나아제에 대한 고친화력의 변형 단백질(Almenoff, J. and M. Orlowski, 1983, Biochemistry 22:590-599)이고 C6 세포확산을 억제하지 않는다(표 2). 다른 한편, 디펩티드인 cbz-gly-phe-NH와 cbz-tyr-tyr은 PLYS, PNS 미엘린 또는 유리가 아닌 CNS 미엘린에서의 C6 세포확산을 55%까지 억제하는 것을 발견하였다. 이 펩티드는 금속결합 단백질분해 효소 특이성이 있는 기질 펩티드이다(Almenoff and Orlowski 상기참조; Baxer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4174-4178; Couch and Strittmatter, 1983, Cell 32:257-265; Chen and Chen, 1987, Cell 48:193-203; Lelkes and Pollard, 1987, J. Biol. Chem. 262:15496-14505).

비허용성 기질에서의 C6 세포확산 증가를 피하기 위해서, PLYS과 CNS 미엘린에 부가하여 두 가지의 다른 기질상에서의 금속결합 단백질분해 효소-의존적인 C6 세포확산을 시험하였다(제12도): PNS 미엘린과 유리 PNS 미엘린은 미엘린막 성분(즉, 고함유량의 지질)의 일반적인 특성에 대한 대조표준으로서, 또한 잘 알려진 나쁜 기질성으로 잘 알려진 유리를 선택하였다. CNS 미엘린에서의 최대 확산 억제력의 1/2을 200μM 1,10-페난트롤린에 대하여 수득한다. PLYS, 유리 및 PNS 미엘린에 있어서(제12도), 1,10-페난트롤린은 0.5mM까지의 농도일 경우 C6 세포확산을 침해하지 않는다(제12도).

CNS 미엘린 억제 성분에 대항하여 성장한 단클론항체(IN-1)를 포함한 CNS 미엘린의 흡수력은(Caroni and Schwab, 1988, Neuron 1:85-96) CNS 미엘린 리포좀에서의 C6 세포 확산에 대한 1,10-페난트롤린 의존적 억제력과 반비례한다(표 3). IN-1 역시 3T3 세포에 대한 CNS 미엘린 단백질 리포좀의 억제 기질특성을 거의 완벽하게 중화시킨다(표 3).

이 결과에서 금속결합 단백질분해 효소는 IN-1 억제특성 중화에 의한 INS 미엘린 억제기질을 압도하는 중요한 역할을 하는 것으로 나타난다.

[7.2.4. CNS 미엘린의 억제기질 특성을 중화하는 C6 혈장 막 관계활성도]

CNS 미엘린-피복된 배양웰을 C6 조건 배지나 C6 혈장 막과 함께 배양하고 이어서 3T3 세포확산에 대한 이들의 억제 기질특성을 시험한다. CNS 미엘린 억제활성도를 크게 축소시키는 활성이 C6 혈장막에 포함되는 것으로 발견하였다(표 4, 제13도). 동일한 처리에서 CNS 미엘린 단백질 리포좀이나 SDS-PAGE-정제된 재구성된 35kD와 250kD 억제성분의 억제효과도 감소된다. 3T3 세포접착과 확산에 대한 CNS 미엘린의 감소는 확산치와 DNA 합성을 측정하여 정량화한다(표 4).

1,10-페난트롤린, EDTA 및 디펩티드 cbz-hly-phe-NH는 C6 플라즈마막 영향을 완전차단한다. 트라실올, 로펩틴과 함께 펩스타틴은 이 효과를 억제하지 않는다. C6 조건배지 자체 혹은 10배 농축한 배지는 CNS 미엘린 억제 기질특성을 중화할 수 있는 어떤 감성 활성도 포함하지 않는다.

[7.2.5. 금속결합 단백질분해 효소의 억제인자는 CNS 백질에서의 C6 세포확산과 CNS 체외이식조적의 C6 침입을 손상시킨다.

C6 세포부착과 확산에 대하여 그리고 C6 세포 이동과 침입에 대하여 C6 혈장 막 금속결합 단백질분해 효소 활성의 관계를 조사하기 위하여 C6 세포를 소뇌 냉동편위에 또는 두가지 금속결합 단백질분해 효소 억제인다(1,10-페난트롤린과 cbz-tyr-tyr) 존재하에서 안구신경 체외이식 조직에 넣는다. 동등한 배양물에는 3가지 다른 종류인 단백효소(로펩틴, 펩스타틴, 또는 트라실롤)나 조절 펩티드(cbz-lal-phe)에 대한 억제인자를 포함한다.

상이한 농도(50, 100, 200 또한 300μM)의 1,10-페난트롤린 혹은 디펩티드 cbz-tyr-tyr(100μM)의 존재는 소뇌 냉동편을 배양기질로 사용할 때 백질 영역에서의 C6 세포 분포와 작용을 현저히 변화시킨다(제14도). C6 세포는 다수 흡착하고 회백질에 대해 상당히 확장한다(제14도).

쥐의 안구신경에 cbz-ala-phe나 cbz-tyr-tyr의 4㎕의 3mM 용액을 주입하였다. 세포는 0.5mM 펩티드를 포함한 배지속에서 배양한다. 아무런 세포도 나타나지 않는 또다른 챔버에서 펩티드 농도는 1mM이다. 14일 후, 체외이식 조직에 대한 C6 세포의 이동이 현저히 차이가 난다(제15도).

cbz-ala-phe 주입된 신경이 더 많은 세포를 포함하여 C6 세포 침입은 배양 배지에만 주입된 체외이식 조직과 비교하였을 때 아무런 영향도 없었다.

다른한편, 8개 모든 신경속에서 cbz-tyr-tyr 억제 C6 세포침입을 실험하였다(2실험). C6 세포는 주로 신경 체외이식 한 절단끝에서 발견되고 기준 이식조직에서 대량으로 발생하는 깊은 침투현상은 cbz-tyr-tyr에 의해 크게 축소된다.

[7.3. 논의]

결과적으로 뉴우런 섬유아세포와 B16 흑색종 세포와는 대조적으로 C6 교아종 세포는 안구신경 체외이식 조직속으로의 이동이나 CNS 백질, 분리된 CNS 미엘린 또는 살아있는 핍지신경교에서의 흡착 및 확산에서 전혀 손상되지 않는다는 것을 알게 된다. 모든 분석시스템에서 다수 세포종류와 그 특성이 상이한 C6 세포의 작용때문에 섬유아세포, Schwann 세포 또는 흑색종 세포이동이나 재생성 신경섬유의 내부성장을 허용하지 않는 환경에서의 (안구신경) C6 이동성과 억제기질에서의 C6 확산 모두에 관한 기초가 되는 공통의 세포 생물학적 메카니즘을 제시한다. C6 세포의 작용은 C6 세포 이동성이 특이 단백효소 차단제 존재하에서 CNS 미엘린 혹은 백질에서 크게 억제되지 않기 때문에, 억제성분에 대한 무감도로 인한 것이 아니며 이 효과는 단클론항체(IN-1)와 함께 미엘린-결합된 억제단백질의 선택적 중화작용에 반비례한다.

미엘린-결합된 억제 성분의 비활성은 살아있는 C6 세포와 C6 혈장 막에 의해 발생된다. 여러가지 공지된 특이성이 있는 다수의 단백효소 차단제를 사용할 경우 이 C6 결합 활성은 금속결합 단백질분해 효소 종류에 속한다 CNS 미엘린에서의 C6 세포확산의 예방과 미엘린-결합된 억제단백질의 비활성작용의 방해에 있어서 관찰된 유사 동질성 때문에 금속결합 단백질분해 효소에 의한 억제기질 성분의 변형은 C6 세포가 미엘린이나 백질 위에 확산하고 안구신경 체외이식 조직에 침입할 수 있는 메카니즘이 될 수 있음을 강하게 주장하였다.

금속결합 단백질분해 효소는 그룹을 이루는 그 그룹수는 상당히 증가되는데 이때 그룹의 구성부는 각종 차단제에 대해 상이한 감도를 가진다. 가장 일반적인 차단제는 CNS 미엘린에 대한 C6 세포확산을 67%까지 낮추는 1,10-페난트롤린이며 반면에 다른 종류의 단백효소에 대한 대부분의 억제인자는 감지할 수 있는 아무런 효과도 나타내지 않는다. 초기에는 (90분간) 가능하지만 후기에는 (300분) 불가능한 미엘린에서의 C6 세포확산상에 있어서, 트립신-형 세린-단백효소 억제인자의 효과를 관찰할 수 있다. 1,10-페난트롤린의 효과는 20μM의 IC에서 투여량에 의존한다. CNS 회백질, PNS 미엘린, 유리 혹은 PLYS와 같은 다른 기질상에서 1,10-페난트롤린 존재와 함께 정상적인 C6세포의 빠른 확산을 관측할 수 있으므로 상기의 효과는 기질인 CNS 미엘린에 대해 특이성이 있는 것이다. 베스타틴(아미노 펩티다제의 억제인자; Umezawa, et al., 1976, J. antibiot. 29:857-859), 포스포라미돈(테르모리신-형 금속결합 단백질분해 효소의 억제인자; Komiyama, et al., 1975, Biochem. Biophys. Res. Commun. 65:352-357) 및 TIMP(ECM 저급화 금속결합 단백질분해 효소의 억제인자; Cawston, et al., 1981, 195:159-165)등과 같은 다른 공지의 금속결합 단백질분해 효소 차단제는 CNS 미엘린에 대한 C6 세포확산의 억제작용을 일으키지 않는다. 금속결합 단백질분해 효소는 일반적으로 펩티드 결합과 큰 지방족 혹은 중성 방향족 아미노산을 가수분해하므로, 이러한 잔유물을 포함한 디펩티드 기질동족체의 효과를 시험하였다. cbz-gly-phe-NH(1mM) 또는 cbz-tyr-tyr(0.3mM)는 CNS 미엘린에 대해 특이적인 C6 세포확산을 억제한다. cbz-gly-phe-NH는 비교적 특이성이 높은 다른 1,10-페난트롤린 민감성 효소활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Almenoff and Orlowski, 1983, Biochemistry 22:590-599; Baxter, et al., 1983, Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:417-4178; Couch and Strittmatter, 1983, Cell 32:257-265; Chen, J.M. and Chen. W.T., 1987, Cell 48:193-203; Lelkes and Pollard, 1987, J. Biol. Chem. 262:15496-14505).

C6-조건배지의 비활성과 세포 분류실험에서 미엘린-관계된 단백효소 활성도는 C6 혈장 막과 관계한다. 혈장 막-기초 금속결합 단백질분해 효소(엔도펩티다아제 24,11, 엔케팔리나아제)의 분리와 특성화는 1,10-페난트롤린에 의해서 방해되고 반면에 TIMP에 의해서는 방해되지 않는다고 발표하였다(Almenoff and Orlowski, 1983 상기참조). 그러나 카르복시메틸-phe-leu, 엔케팔리나아제에 대한 고친화성 펩티드(Fournie-Zaluski, et al., 1983, J. Med. Chem. 26:60-65)는 미엘린에 대한 C6 확산에 영향을 미치지 않으므로 여기에서 발표한 금속결합 단백질분해 효소는 엔케팔리나아제는 아닐 것이다. 루이스 사르코다 바이러스 형질변형된 닭 배아 섬유아세포에 의해 발현되고 흡착위치와 인바도포디아에서 국소화한 금속결합 단백질분해 효소를 발표하였다(Chen, and Chen, 1987 상기참조). 이 효소는 또한 여기서 발표한 금속결합 단백질분해 효소와 같이 포스포라미도이 아닌 1,10-페난트롤린과 cbz-gly-phe-NH에 의해 억제된다. 그러나 Chen, and Chen의 효소와 달리 여기에서는 C6 세포상의 다른 피브로넥틴 감성(degradative) 활성을 감지할 수가 없다.

전이성이 큰 B16 쥐의 흑색종세포는 C6 세포를 사용한 모든 분석법에서 사용하였다. 흥미로운 것은 B16 세포가 안구신경 체외이식 조직속으로 이동하지 않고 대신 3T3 세포나 뉴우런과 유사한 방식으로 미엘린-결합된 억제인자에 대해 반응한다. 시험관내에서의 작용을 받고 세포주에서 심실주사한 B16 세포는 주로 뇌심실의 큰 침입없이 수막종이나 심실종양을 만든다. 따라서 말초의 B16 세포에 대한 전이작용을 일으키는 메카니즘은 CNS 조직에 있는 C6 세포에 대한 높은 이동성을 부여하는 그것과는 상이하다.

C6-결합된 금속결합 단백질분해 효소의 억제력은 CNS 미엘린에서의 C6 확산을 억제할뿐 아니라 또한 CNS 백질에서의 C6 세포부착, 확산 및 이동을 차단하고 디펩티드인 cbz-tyr-tyr은 안구신경 체외이식 조직에 대한 C6 세포의 이동을 크게 침해한다. 따라서 금속결합 단백질분해 효소 활성은 생체내에서도 역시 CNS 조직에 있는 C6 교아종 세포의 침입작용에 중요하게 수반된다.

[8. 미엘린-결합된 축색성장 억제인자에 대한 단클론항체에 의해 쥐의 척수 병소에서 상당 길이의 다발 재생]

35kD와 250kD 디엘린-결합된 단백질과 CNS 조직 체외이식편의 억제기질효과를 중화하는 단클론 항체 IN0-1를 신피질속에 종양을 만드는 항체를 이식하므로써 어린쥐의 소뇌 내부에 적용한다. 2 내지 4주된 피라미드형 다발(CST)의 수피-돌기성분의 완전한 횡단면 다음에는 병변 주위의 대량 발아와 IN-1 처리된 주에 있어서, 2주이내에 병변에 대한 8-11㎜ 깊이의 작은 축색돌기와 섬유속이 자라게 된다. 기준 쥐에 있어서, 관측된 성장물질의 최대 길이는 1㎜를 초과한다. 이 결과에서 분화된 CNS 조직내의 주요 모터 CNS관의 유도 재생력을 보여주고 CNS 축색성장 조절인자와 이들의 길항제의 임상적 중요성을 지적한다.

[8.1. 물질과 방법]

[8.1.1. 하이브리도마 세포의 이식조직을 포함하는 동물의 예비 조작물]

어린 루이스쥐(P2-11)를 에테르 마취시키고 1 또는 2㎕의 1×10 하이브리도마 세포를 배 전두 피질속으로 주입하였다. 기준 쥐에 대해 양고추 냉이 페록시다아제(HRP)에 대한 항체를 형성하는 하이브리도마 세포주를 동일한 수의 세포를 주입하였다. 또한 아무것도 주입하지 않은 대조용 기준도 사용한다. 하이브리도마 세포: 쥐의 척수 미엘린에서 나온 PAGE-정제한 250kD 억제 단백질 성분에 대한 면역화된 BALB/c 쥐의 비장세포가 들어있는 P3U 골수종 용해물에서 IN-1 분비세포를 수득한다(Caroni and Schwab, 1988, Neuron 1:85-96); 항-HRP 분비세포는 IN-1와 같이 동일한 골수종(P3U)을 이용하여 Semenenko et al의 프로토콜에서 얻는다(Dr. P. Streit, Zurich)(1985, Histochem, 83:405-408). 하이브리도마-주입된 모든 쥐에 있어서 수일내에 고체형 종양이 형성되고 신피질의 전체 두께를 주사하고 축생 심실에 접근하면 종양을 잘 볼수 있다(제16도). 시클로스 포린A 주사물은(15㎍/g 체중, 3일 간격으로 2회 주사) 종양 흡수를 방해하는 것을 돕는데 그렇지 않을 경우 2-3주후 발생한다. 뇌절편을 항-쥐 Ig-FITC(FITC-접합 면역글로부린)으로 염색하여 항체의 대량생성을 탐지한다(제16도(b)). 또한 혈청속에 있는 IN-1 항체의 존재로 알 수도 있다.

[8.1.2.척수병변 사전 형성 과정]

두개의 척수골을 분리하고 홍채절제 가위로 척수의 2/3를 가로절단하여 흉선 T5-7에 2-4주생 동물의 척수병변을 일으킨다(표 5, 하기참조). 이 병변은 배측 회백질 속에 있는 측생돌출부와 중심관 양측면의 CST을 완전히 가로 절개하였다. 복부와 측생 회백질은 그대로 존속하므로 겉으로 보기에는 쥐의 상태가 정상이다. 15-29일 도면 즉 CST에서의 축색돌기 성장 완료후 5-20일이 지나서 병변이 발생한다. U-형의 스테인리스강 철선을 병변 부위에 삽입하여 양쪽 CST를 완전히 가로절단하고 그 병변위치를 표시한다(고정된 척수를 절단하기 전에 철선을 제거한다).

* 방법은 제17도에서 설명한 것과 같다. 병변 말미에 재생적 CST 발아한 쥐만 분석하였다. 병변 공동의 말미부분에서 재생 섬유의 길이를 측정한다. 재생섬유의 최소길이는 조직블고의 말미부에 도달한 것이다.

[8.1.3. 별변-후 평가]

14-28일의 생존기간 후(표 5), 종양의 대측에 있는 전방 및 벽방향의 피질에 5%의 WGA-HRP(1㎕)을 주사한다. 24시간 후, 0.1M 인산완충액속의 1.25% 글루타르알데히드와 1% 포름알데히드를 10분간 쥐의 심장에 붓는다. 해부한 척수(10-15㎜)를 동일한 고정방법으로 1시간동안 고정시키고 세착한 후 저온 조내에서 절단한다. 젤라틴 피복된 슬라이드 위에 완전한 형태의 세로단편을 올려놓고 기질인 TMB를 사용하여 HRP로 반응시킨다(Mesulam, 1978, J. Histochem. Cytochem. 26:106-117). 편광속의 암상태 조사로 절편에 대해 관찰한다. 양측생 CST 병변과 또한 병변 말미측에 나타나는 발아가 있는 쥐만 평가한다.

[8.2. 결론: IN-1을 분히는 종양에 걸린 쥐에서 먼 거리까지 피질 척수다발(CST) 섬유의 재생]

병변 2주후, 1개월생 이하의 CST는 전방 측생 피질에서 WGA-HRP의 전방 이동으로 라벨화된다. 횡근과 세로단편에 있는 병변주위의 조직검사에서 모든 동물에 대해 매우 유사한 모습이 나타난다: 대체로 다수의 소형공동이 있고 이것이 중심공동과 이어져 있으며, 그 특징은 뇌척수액에 의해 항체의 국소 접근 및 침투가 크게 강화되는 점이다. 조직은 곳에 따라 변형되지만 조밀한 신경교 반흔은 존재하지 않는다. 라벨화된 CST 섬유는 대량 발아가 병변 기부의 0.5-1㎜에서 발생하는 조밀한 다발로서 병변에 접근한다. 대부분의 동물에서 대조부나 IN-1 주입된 섬유총과 다발은 병변부위속에 또는 이것에 걸쳐 볼수 있으며 대부분 복부나 측면의 병변 공동을 에워싸고 있으며, 강철선에서 재구성된 조직 다리를 통해서도 다소 성장한다.

병변 부위에서 따라 말미방향으로 이동하는 섬유를 충분히 관찰할 수 있다.

종양이 없는 동물과 항-HRP-생성 종양에 걸린 쥐에 대하여, 병변 말초부에서 시작하여 세로단편에서 측정되는 이동거리는 대체로 1㎜이하이다(표 5, 제17도, 제18도). 비교적 두꺼운 섬유속은 열상으로 끝난다. 아주 대조적으로, IN-1를 분비하는 종양에 걸린 동물은 병변 말미에서 상당히 먼거리에 있는 라벨화된 섬유소와 섬유를 보여준다(제17도, 제18도). 대부분의 동물에서는 2.5-5㎜로 측정되고 2마리 쥐에서는 8㎜ 및 11㎜로 나타난다(표 5). 해부했을 때, 상당 거리의 재생 CST 섬유는 본래의 CST 위치와 인접하거나 그 안에 있으며 어떤 섬유는 회백질속에 있고 일부 섬유는 지각관에 상응하는 더 후방지역에 있다.

[8.3. 논의]

쥐의 CST는 처음의 생후 10간에 척수를 성장시키고 그후 P9-P10에서 축색돌기가 첨가된다(Joosten et al., 1987, Dev. Brain Res. 36:121-139; Schreyer and Jones, 1988 Dev. Brain. Res. 38:103-119). P4-P5까지의 관의 병변은 병변 위치의 우회를 유도하고 먼거리의 CST섬유의 에피로프 성장으로 인도된다(Schreyer and Jones, 1983, Neurosci. 9:31-40; Bernstein and Stelzner, 1983, J. Comp. Neurol. 221:382-400). P6 이후로는 CST 재생이 관측되지 않는다. 햄스터와 캣에서 매우 유사한 병변 반응을 볼 수 있다(Kalil and Reh, 1982, J. Comp. Neurol. 211:265-275; Tolbert and Der, 1987, J. Comp. Neurol. 260:299-311). 캣(cat)에 있어서, 이 섬유가 대부분 늦게 도달하고, 새로 성장하며 축색돌기를 재생하기도 한다는 것을 발표하였다(Tolbert and Der, 1987, J. Comp. Neurol. 211:265-275). 본 발명의 결과는 2 내지 3주 나이에서 최소한 소량의 CST 축색이 척수내부에서 장기간에 걸쳐 재생 및 증식될 수 있음을 보여준다. 최대 증식속도는 0.5-1㎜/day이다.

포유동물의 분화된 CNS 조직은 0.2-1㎜ 사이의 발아길이 이하로 성장하는 축색에 대한 비허용성 기질이다(Cajal, 1959, in Degeneration and Regeneration of the Nervous System, ed. Hafner, New York, p. 1928; David, 1981, Science 214:931-933; and Vidal-Sanz et al., 1987, J. Neurosci. 7:2894-2909). 이 특성이 나타난다(배양실험과 이식연구에서 보는 바와 같이 CNS 회백질보다 CNS 백질에 의해 더 잘 나타난다)(Schwab and Thoenen, 1985, J. Neurosci. 5:2415-2423; Carbonetto et al., 1987, J. Neurosci. 7:610-620; Savio and Schwab, 1989, in Press). 일정 태내 기간의 태아에서 취한 아르레날린성 혹은 세로토닌성 뉴우런을 어른 척수나 해마에 이식하면 어른 CNS 조직내의 축색돌기 증식이 해부선에서 관찰될 경우의 다른 실험에서만 발견된다(Nornes et al., 1983, Cell Tissues Res. 230:15-35); Foster et al., 1985, Exp. Brain Res. 60:427-444 and Bjorklund et al., 1979 Brain Res. 170:409-426). 이 증식 축색돌기는 거의 예외적으로 회백질 지역에 지엽화된다.

축색 성정 억제효과가 있는 두개의 핍지신경교-및 미엘린-결합 막 단백질인 NI-35(35kD)와 NI-250(250kD)는 시험관내에서 또한 생화학적 연구에서 확인된다(Schwab and Caroni, 1988, J. Neurosci. 8:2381-2393; Caroni, and Schwab, 1988, J. Cell. Biol. 106:1281-1288). 각종 시험관내에서 쥐 안구신경 체외이식 조직을 포함한 이것의 활성도를 중화시키는 단클론 항체 IN-1은 2주일 이내의 척수병변에 대한 5-11㎜ 거리에 걸쳐 어린 쥐에서의 피질-척수 축색돌기를 재생한다고 증명되었다. 피질속의 항체-분비 종양이 뇌척수액을 통해 상당량의 항체를 지속적으로 공급하고 병변의 지역적인 상태가 이 항체들을 조직속에 침투토록 도와준다. 대조용 항체 종양에 걸린 동물의 병변 부위 주변에 발생하는 대량발아에도 불구하고 병변으로부터 멀리 퍼지는 축색돌기 확장의 결핍은 이 효과 특이성을 확인해준다. 장기간에 걸친 뉴우런 섬유 재생을 유도하는 미엘린-결합 축색성장 억제 단백질에 관한 항체의 능력과 정상상태에서 관찰되는 병변 CNS 섬유 속의 재생 결핍에 미엘린-결합된 축색성장 억제인자의 중요역할이 여기에서 분명하게 나타난다.

[9. 미생물 기타]

지적한 단클론 항체를 생산하는 다음의 하이브리도를 European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)에 기탁하였고 수탁번호는 다음과 같다.

하이브리도마 항체 수탁번호 기탁일

세포주 IN-1 IN-1 88102801 1988. 10. 28.

세포주 IN-2 IN-2 88102802 1988. 10. 28.

본 발명은 여기에서 설명한 구체예나 기탁된 세포주에 한정되지 않고 본 발명의 범위에 속하는 기능적인 동등한 구체예도 포함한다.

Claims (52)

1. 축색성장 조절인자에 있어서, (a) 금속결합 단백질분해 효소 활성과; (b) 신경아세포종으로부터 분리될 수 있고; 그리고 (c) 고등 척추동물의 CNS 미엘린의 저해성기질 특성을 중화시킬 수 있고, 이때, 축색조절인자의 존재하에서 시험관내에서 축색 생장이나 섬유아세포 확산을 지지하는 미엘린의 능력을 관찰함으로써 중화작용을 감지하게 되는 것을 특징으로 하는 분자로 구성된 축색성장 조절인자.
2. 제1항에 있어서, 신경아세포종 세포는 쥐의 신경아세포종 C6 세포인 것을 특징으로 하는 축색성장 조절인자.
3. 사람을 제외한 환자에서 악성종양을 진단하는 방법에 있어서, 사람을 제외한 환자에서 취한 중추신경계 미엘린을 포함하는 시료내에 축색성장 억제인자의 부재(不在)를 탐지하고, 이때 축색성장 억제인자는 (a) 시험관내에서 축색생성이나 섬유아세포 확산을 억제하는 능력으로 감지되는 비허용성 기질특성; 및 (b) 고등 척추동물의 중추신경계 미엘린으로부터 분리될 수 있는 성질을 가지는 단백질인 것을 특징으로 하는 악성종양 진단방법.
4. 제3항에 있어서, 폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정했을 때 축색성장 조절인자의 분자량이 약 35,000 달톤인 것으로된 진단방법.
5. 제3항에 있어서, 폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정했을 때 축색성장 조절인자의 분자량이 약 25,000 달톤인 것으로된 진단방법.
6. 사람을 제외한 환자에서 악성종양을 진단하는 방법에 있어서, 사람을 제외한 환자에서 취한 중추신경계 미엘린을 포함하는 시료속에 축색성장 억제인자의 부재(不在)를 탐지하고, 이때의 축색성장 억제인자는 (a) 시험관내에서 축색생성이나 섬유아세포 확산을 억제하는 능력으로 감지되는 비허용성 기질특성; 및 (b) ECACC에 기탁되고 수탁번호가 88102802인 단클론 항체 IN-2에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 단백질인 것을 특징으로 하는 악성종양 진단방법.
7. 제3항에 있어서, 악성종양이 신경아세포종인 것을 특징으로 하는 진단방법.
8. 제4항에 있어서, 악성종양이 신경아세포종인 것을 특징으로 하는 진단방법.
9. 제5항에 있어서, 악성종양이 신경아세포종인 것을 특징으로 하는 진단방법.
10. 제6항에 있어서, 악성종양이 신경아세포종인 것을 특징으로 하는 진단방법.
11. 제3항에 있어서, 사람을 제외한 환자에서 억제인자 부재의 확인은 억제인자에 반응성이 있는 항체에 대한 시료내에 성분의 결합력 부족을 관찰하여 억제인자의 부재(不在)를 감지하는것을 특징으로 하는 진단방법.
12. 제6항에 있어서, 사람을 제외한 환자에서 억제인자 부재의 확인은 억제인자에 반응성이 있는 항체에 대한 시료내에 성분의 결합력 부족을 관찰하여 억제인자의 부재를 감지하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
13. 제10항에 있어서, 항체는 ECACC에 기탁되고 수탁번호가 88102801인 단클론 항체 IN-1과 ECACC에 기탁되고 수탁번호가 88102802인 단클론 항체 N-2중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진단방법.
14. 사람을 제외한 환자에서 악성종양을 진단하는 방법에 있어서, 사람을 제외한 환자에게서 취한 시료속에 있는 제1항에 따른 금속결합 단백질분해 효소의 존재를 탐지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 악성종양 진단방법.
15. 제13항에 있어서, 악성종양이 신경아세포종인 것을 특징으로 하는 진단방법.
16. 악성종양에 걸린 환자를 치료용 제약학적 조성물에 있어서, 제1항에 따른 인자의 금속결합 단백질분해 효소 활성을 억제하는 저해인자로 된 화합물의 효과량과 약제학적 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 악성종양에 걸린 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
17. 제16항에 있어서, 악성종양이 신경아세포종인 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제16항에 있어서, 화합물은 1,10 페난트롤린, 에틸디아민, 테트라아세테이트, 에틸렌글리콜-비스(3-아미노에틸에테르) N,N,N'-N'-테트라아세테이트, 카르보벤조옥시티로신-티로신, 카르보벤조옥시-글리신-페닐알라닌-아미드, 카르보벤조옥시-페닐알라닌-티로신-아미드, 카르보벤조옥시-페닐알라닌-페닐알라닌-아미드 또는 카르보벤조옥시-글리신-페닐알라닌-페닐알라닌-아미드중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 조성물.
19. 중추신경계 손상을 입은 환자 치료용 조성물에 있어서, 축색성장 억제인자의 작용을 중화시키는 길항 물질과 약제학적 담체속에 구성되고, 이때 축색성장 억제인자는 (a) 시험관내에서의 축색생성이나 섬유아세포 확산을 억제하는 능력으로 감지되는 비허용성 기질특성; 및 (b) 고등 척추동물의 중추신경계 미엘린으로부터 분리될 수 있는 성질을 가지는 단백질인 것을 특징으로 하는 중추신경계 손상을 입은 환자의 치료를 위한 제약학적 조성물.
20. 제19항에 있어서, 폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정한 축색성장 억제인자의 분자량이 약 35,000달톤인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
21. 제19항에 있어서, 폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정한 축색성장 억제인자의 분자량이 약 25,000달톤인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
22. 제19항에 있어서, 축색성장 인자는 ECACC에 기탁되고 수탁번호가 88102802인 단클론 항체 IN-2에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
23. 제19항에 있어서, 길항물질은 항체나 이의 결합부위인것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
24. 제20항에 있어서, 길항물질은 항체나 이의 결합부위인것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
25. 제21항에 있어서, 길항물질은 항체나 이의 결합부위인것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
26. 제22항에 있어서, 길항물질은 항체나 이의 결합부위인것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
27. 제23항에 있어서, 항체는 ECACC에 기탁되고 수탁번호가 88102801인 세포주 IN-1에서 만들어진 단클론 항체, IN-1를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
28. 제23항에 있어서, 항체는 ECACC에 기탁되고 수탁번호가 88102802인 세포주 IN-2에서 만들어진 단클론 항체, IN-2를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
29. 제19항에 있어서, 중추신경계 손상은 경색, 외상, 외과적 병변 또는 중추신경계 퇴행성질환 등이 원인이 되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
30. 제19항에 있어서, 신경계 손상은 척수에 손상이 있는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
31. 제23항, 24항, 25항 또는 26항에 있어서, 항체 투여는 항체-분비 세포를 환자에게 삽입하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
32. 악성종양에 걸린 환자 치료용 제약학적 조성물에 있어서, 축색성장 억제인자와 제약학적 담체로 구성되고, 이때 이 억제인자는 (a) 시험관내에서의 축색 생성이나 섬유아세포 확산을 억제하는 능력으로 감지할 수 있는 비허용성 기질특성; 및 (b) 고등 척추동물의 중추신경계 미엘린으로부터 분리가능한 성질을 가지는 단백질인 것을 특징으로 하는 악성종양에 걸린 환자 치료를 위한 제약학적 조성물.
33. 악성종양에 걸린 환자 치료용 제약학적 조성물에 있어서, 축색성장 인자와 제약학적 담체로 구성되고, 이때 이 억제인자는 (a) 시험관내에서의 축색 생성이나 섬유아세포 확산을 억제하는 능력으로 감지할 수 있는 비허용성 기질특성; 및 (b) ECACC에 기탁되고 수탁번호가 88102802인 단클론 항체 IN-2에 특이적으로 결합하는 능력이 있는 단백질인 것을 특징으로 하는 악성종양에 걸린 환자 치료를 위한 제약학적 조성물.
34. 제32항에 있어서, 축색성장 억제인자의 분자량이 폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정했을 때 350,000달톤인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
35. 제32항에 있어서, 축색성장 억제인자의 분자량이 폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 측정했을 때 250,000달톤인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
36. 제32, 34 및 35항에 있어서, 악성종양이 흑색종 및 신경조직의 종양중에서 선택하여된 조성물.
37. 제1항에 따른 인자와 약제학적 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 신경계 손상입은 환자 치료를 위한 약제학적 조성물.
38. 제2항에 따른 인자와 약제학적 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 중추신경계 손상입은 환자 치료를 위한 약제학적 조성물.
39. 제37항에 있어서, 신경계 손상은 발작, 외상 또는 중추신경계 퇴행성질환에 기인하여 생긴 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
40. 제32항에 있어서, 금속결합 단백질분해 효소 억제인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
41. 제33항에 있어서, 금속결합 단백질분해 효소 억제인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
42. 제34항에 있어서, 금속결합 단백질분해 효소 억제인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
43. 제35항에 있어서, 금속결합 단백질분해 효소 억제인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
44. 제40, 41, 42 또는 43항에 있어서, 악성종양을 흑색종 및 신경조직의 종양중에서 선택하여된 조성물.
45. 제40, 41, 42 또는 43항에 있어서, 악성종양이 신경아세포종인 것을 특징으로 하는 조성물.
46. 제40, 41, 42 또는 43항에 있어서, 금속결합 단백질분해 효소 억제인자를 1,10 페난트롤린, 에틸렌디아민 테트라아세테이트, 에틸렌글리콜-비스( -아미노에틸에테르) N,N,N'-N'-테트라아세테이트, 카르보벤조옥시-티로신-티로신, 카르보-벤조옥시-글리신-페닐알라닌-아미드, 카르보벤조옥시-페닐알라닌-티로신-아미드, 카르보벤조옥시-페닐알라닌-페닐알라닌-아미드 또한 카르보벤조옥시-글리신-페닐알라닌-페닐알라닌-아미드중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
47. 제33항에 있어서, 악성종양이 흑색종 및 신경 조적의 종양중에서 선택하여된 조성물.
48. 제38항에 있어서, 신경계 손상은 발작, 외상 또는 중추신경계 퇴행성질환에 기인하여 생긴 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
49. 중추신경계 손상된 환자의 치료용 조성물에 있어서, ECACC에 기탁되고 수탁번호가 88102801인 세포주 IN-1에서 생성된 단클론 항체 IN-1 또는 이의 결합영역을 포함한 성분의 효과량으로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
50. 중추신경계 손상된 환자의 치료용 조성물에 있어서, ECACC에 기탁되고 수탁번호가 88102802인 세포주 IN-2에서 생성된 단클론 항체 IN-2 또는 이의 결합영역을 포함한 성분의 효과량으로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
51. 제32항에 있어서, 축색성장 억제인자가 ECACC에 기탁되고 수탁번호가 8810280인 단클론 항체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
52. 제40, 41, 42 또는 43항에 있어서, 악성종양은 신경아세포종인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.