JPH10509149A

JPH10509149A - 感覚および運動ニューロンにより誘導される因子（ｓｍｄｆ）

Info

Publication number: JPH10509149A
Application number: JP8516193A
Authority: JP
Inventors: ホ，ウェイ−シェン; オシェロフ，フィリス・エル
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-11-14
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 1998-09-08
Also published as: US5756456A; US5770567A; US5667780A; IL115960A0; US5763213A; MX9703476A; WO1996015244A2; EP0792362A2; CA2204379A1; WO1996015244A3

Abstract

(57)【要約】分離されたＳＭＤＦ、ＳＭＤＦをコードしている分離されたＤＮＡ、およびＳＭＤＦを製造する組換えまたは合成法が開示される。ＳＭＤＦは、β型ＥＧＦ様ドメインおよび現在までに報告されている全てのニューレグリンと異なるＮ末端配列を含む。ＳＭＤＦは、組換え細胞培養中で発現される時、ヒト乳癌細胞のＨＥＲ２／ｎｅｕレセプターのチロシン燐酸化を活性化し、シュワン細胞に対し分裂促進活性を表す。ノーザンブロットおよびインシトゥハイブリダイゼーション分析は、ＳＭＤＦが、神経組織特異的であるという点、および他のニューレグリンと比較してヒトおよびラットの脊髄運動ニューロンおよび感覚ニューロンにおいて極めて高度に発現されるという点で、他のニューレグリンと相違することを示す。

Description

【発明の詳細な説明】感覚および運動ニューロンにより誘導される因子（ＳＭＤＦ）発明の分野この出願は、感覚および運動ニューロンにより誘導される因子（ＳＭＤＦ）、ＳＭＤＦを製造する方法、およびその診断的および治療的用途に関するものである。発明の背景 (i)ｅｒｂＢ癌原遺伝子細胞の増殖および分化を調節するシグナルの変換は、部分的には種々の細胞蛋白の燐酸化によって調節されている。蛋白チロシンキナーゼはこのプロセスを触媒する酵素である。レセプター蛋白チロシンキナーゼは、リガンドにより刺激される細胞内基質のチロシン燐酸化を介して細胞増殖を指令すると信じられている。クラスＩサブファミリーの成長因子レセプター蛋白チロシンキナーゼは、ｅｒｂＢ遺伝子によりコードされている１７０ｋＤａの表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）を包含する。ｅｒｂＢは人間の悪性腫瘍に因果関係がある。特に、乳房、膀胱、肺および胃の悪性度の高い癌腫には、この遺伝子の発現の増大が観察されてきた。ニール等、Lancet、１巻３６６−３６８頁（１９８５）；セインスバリー等、Lancet、１巻１３８９−１４０２頁（１９８７）；ヤスイ等、Int.J.Ca ncer、４１巻２１１−２１７頁（１９８８）；およびヴィール等、Cancer、５５巻５１３−５１６頁（１９８７）を参照されたい。クラスＩサブファミリーの第二の成員、ｐ１８５^neuは、化学処理されたラットの神経芽腫由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として最初に同定された。ｎｅｕ遺伝子（ｅｒｂＢ２およびＨＥＲ２とも呼ばれる）は、１８５ｋＤａのレセプター蛋白チロシンキナーゼをコードしている。ヒトＨＥＲ２遺伝子の増幅および／または過剰発現は、乳房および卵巣癌の予後不良に関連している（スラモン等、Science、２３５巻１７７−１８２頁［１９８７］；およびスラモン等、S cience、２４４巻７０７−７１２頁［１９８９］）。ＨＥＲ２の過剰発現はさらに、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎、結腸および膀胱の癌腫を包含するその他の癌腫とも関連してきた。特に、キング等、Science、２２９巻９７４頁（１９８５）；ヨコタ等、Lancet、１巻７６５−７６７頁（１９８６）；フクシギ等、Mo l.CellBiol.、６巻９５５−９５８頁（１９８６）；スラモン等（１９８７）、上記；ゲウリン等、Oncogene Res．、３巻２１−３１頁（１９８８）；コーエン等、Oncogene、４巻８１−８８頁（１９８９）；ヨネムラ等、Cancer Res．、５１巻１０３４頁（１９９１）；ボースト等、Gynecol.Oncol.、３８巻３６４頁（１９９０）；ワイナー等、Cancer Res．、５０巻４２１−４２５頁（１９９０）；カーン等、Cancer Res．、５０巻５１８４頁（１９９０）；パーク等、Cancer Res．、４９巻６６０５頁（１９８９）；ザウ等、Mol.Carcinog.、３巻３５４ −３５７頁（１９９０）；およびマッカン等、Cancer、６５巻８８−９２頁（１９９０）を参照されたい。従って、米国特許第４９６８６０３号中でスラモン等は、腫瘍細胞中でのＨＥＲ２遺伝子の増幅または発現を測定するための様々な診断検定を記載し特許請求している。スラモン等は、腫瘍細胞におけるＨＥＲ２癌遺伝子の複数コピーの遺伝子の存在が、この疾患が原発腫瘍部位を越えて広がり易い事を示し、そして故にこの疾患が他の診断因子の示すところよりは攻撃的な処置を必要とし得る事を発見した。スラモン等は、リンパ節の状態の決定と共に、ＨＥＲ２遺伝子増幅試験は、極めて改善された予後診断という有用性を提供すると結論付けている。非癌組織でのＨＥＲ２遺伝子の発現もまた研究されている。例えば、コーエン等は、ＨＥＲ２遺伝子が、末梢神経発達およびワラー変性の最中にシュワン細胞によって発現されることを発見した。そこで彼等はｐ１８５^HER2がシュワン細胞の増殖または分化の調節で役割を果たしていると結論付けた。コーエン等、J.Ne uroscience Res.、３１巻６２２−６３４頁（１９９２）。ｅｒｂＢ３またはＨＥＲ３と呼ばれるさらなる関連遺伝子もまた記載されている。米国特許第５１８３８８４号；クラウス等、PNAS、USA、８６巻９１９３− ９１９７頁（１９８９）；ＥＰ特許出願第４４４９６１Ａ１号；およびクラウス等、 PNAS、USA、９０巻２９００−２９０４頁（１９９３）。クラウス等（１９８９）は、或るヒト乳癌セルラインに著しく上昇したレベルのｅｒｂＢ３ｍＲＮＡが存在し、これは、ｅｒｂＢおよびｅｒｂＢ２と同様ｅｒｂＢ３が人間の幾つかの悪性腫瘍で役割を果たしていることを示していることを発見した。また、クラウス等（１９９３）は、キメラＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ３レセプターのｅｒｂＢ３触媒ドメインのＥＧＦ依存的活性化は、トランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞に増殖的反応をもたらすことを示した。さらに、これらの研究者は、幾つかのヒト乳癌セルラインは、定常状態のｅｒｂＢ３チロシン燐酸化の有意な上昇を示し、さらにこの事が、このレセプターが人間の悪性腫瘍で役割を果たしているかも知れないことを示している、と証明した。したがって、ｅｒｂＢ３をコードしている核酸を利用する診断的バイオアッセイが、米国特許第５１８３８８４号中にクラウス等により記載されている。最近、成長因子レセプター蛋白チロシンキナーゼのクラスＩサブファミリーが、ＨＥＲ４／ｐ１８０^erbB4レセプターを包含するよう拡大された。ＥＰ特許出願第５９９２７４号；プローマン等、PNAS、USA、９０巻１７４６−１７５０頁（１９９３）；およびプローマン等、Nature、３６６巻４７３−４７５頁（１９９３）。プローマン等は、ＨＥＲ４発現の増大が、乳腺癌を包含する或る種の上皮起源の癌腫と密接に関連していることを発見した。したがって、ＨＥＲ４発現を評価する人間の新生物状態（特に乳癌）の検出のための診断法が、ＥＰ特許出願第５９９２７４号に記載されている。 (ii)ニューレグリンＨＥＲ２癌遺伝子のアクチベーターの探索は、「ニューレグリン」と総称されるポリペプチドのファミリーの発見につながった。これらの蛋白は、オア−アートレガー等、PNAS、USA、１９５２巻１７４６−１７５０頁（１９９３）によりヒト染色体８の短腕にマッピングされた単一遺伝子の選択的スプライシングから生成するらしく見える。ホルメス等は、ＨＥＲ２レセプターのためのポリペプチドアクチベーターのファミリーを分離およびクローニングし、これらを、ヒレグリン−α（ＨＲＧ−α ）、ヒレグリン−β１（ＨＲＧ−β１）、ヒレグリン−β２（ＨＲＧ−β２）、ヒレグリン−β２様（ＨＲＧ−β２様）およびヒレグリン−β３（ＨＲＧ−β３）と命名した。ホルメス等、Science、２５６巻１２０５−１２１０頁（１９９２）；およびＷＯ９２／２０７９８ならびにホフマン等、Science、２５６巻１１２９頁（１９９２）を参照されたい。４５ｋＤａポリペプチド、ＨＲＧ−αは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌セルラインの条件培地から精製された。これらの研究者は、ＭＣＦ−７乳癌細胞においてＨＥＲ２レセプターのチロシン燐酸化を活性化する精製ヒレグリンポリペプチドの能力を立証した。さらに、ＳＫ−ＢＲ− ３細胞（これは高レベルのＨＥＲ２レセプターを発現する）上でのヒレグリンポリペプチドの分裂促進活性が説明された。ＥＧＦファミリーに属する他の成長因子と同様、可溶性ＨＲＧポリペプチドは膜結合前駆体（プロＨＲＧと呼ばれる）から誘導され、これが蛋白分解的にプロセシングされて４５ｋＤａ可溶性型を放出するようである。これらのプロＨＲＧはＮ末端シグナルペプチドを欠失する。ヒレグリン類は最初の２１３アミノ酸残基が実質上同一であるが、これらは、Ｃ末端部分が相違する二つの変異体ＥＧＦ様ドメインに基づき、二つの主要な型、αおよびβに分類される。にもかかわらず、これらのＥＧＦ様ドメインでは、その中に含まれる６個のシステイン残基の間隔が等しい。ナガタ等は、EMBO.J. 、１３（１５）巻３５１７−３５２３頁（１９９４）で、ＨＲＧ−αのＥＧＦ様ドメインの溶液構造を記載している。アミノ酸配列の比較に基づき、ホルメス等は、ＥＧＦ様ドメイン中の１番目および６番目のシステインの間で、ＨＲＧはヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）と４５％似かよっており、アンフィレグリン（ＡＲ）とは３５％、ＴＧＦ−αとは３２％、そしてＥＧＦとは２７％一致することを発見した。ヒトＨＲＧのラット相当物である４４ｋＤｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）は、ペレス等、Cell、６９巻２０５−２１６頁（１９９２）；およびウェン等、Cell、６９巻５５９−５７２頁（１９９２）により最初に記載された。ＨＲＧポリペプチドと同様ＮＤＦは、免疫グロブリン（Ｉｇ）相同ドメインとこれに続くＥＧＦ様ドメインを持ち、Ｎ末端シグナルペプチドを欠失している。その後ウェン等、 Mol.Cell.Biol.、１４（３）巻１９０９−１９１９頁（１９９４）は、ＮＤＦのファミリーを拡大するため「完全（エグゾースティヴ）クローニング」を実施した。この仕事により、６つの別個の線維芽細胞プロＮＤＦが明らかとなった。ホルメス等の命名法を採用すると、ＮＤＦは、ＥＧＦ様ドメインの配列に基づきα またはβポリペプチドのいずれかに分類される。イソ型１ないし４は、可変ジャスタメンブレン部分（ＥＧＦ様ドメインおよび貫膜ドメインの間）に基づいて特徴付けられる。また、イソ型ａ、ｂおよびｃは、長さの異なる細胞質ドメインを有すると記載されている。これらの研究者は、相異なるＮＤＦイソ型が選択的スプライシングによって生成し、別個の組織特異的機能を遂行していると結論付けている。ＮＤＦに関しては、ＥＰ５０５１４８；およびＷＯ９３／２２４２４をも参照されたい。ＮＤＦの発現が研究されている。特に、部分的Ｉｇ様ドメインを含むマウスＮＤＦプローブを使用したオア−アートレガー、PNAS、USA、９０巻１８６７−１８７１頁（１９９３）は、マウス胚におけるＮＤＦの発現は中枢および末梢神経系［脳の側脳室に沿って並ぶ神経上皮、脊髄の後根神経節および腹側角（微弱ではあるが）ならびに腸、胃および副腎皮質を包含する］で起こることを見いだした。フォールズ等、Cell、７２巻８０１−８１５頁（１９９３）は、彼等がアセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）ポリペプチドと呼ぶニューレグリンファミリーのもう一つの成員を記載している。ニワトリ由来のＡＲＩＡポリペプチドは筋肉のアセチルコリンレセプターの合成を刺激する。ＷＯ９４／０８００７をも参照されたい。ＡＲＩＡはβ型ニューレグリンであり、ＨＲＧα、およびＨＲＧβ１−β３のＩｇ様ドメインとＥＧＦ様ドメインの間に存在する「グリコ」スペーサー（グリコシル化部位に富む）の全体を欠失している。マーチオーニ等、Nature、３６２巻３１２−３１８頁（１９９３）は、牛から誘導される幾つかの蛋白を同定し、これらをグリア増殖因子（ＧＧＦ）と呼んでいる。これらのＧＧＦは、Ｉｇ様ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを、上に記載した他のニューレグリン蛋白と共有しているが、さらにアミノ末端クリングルドメインも持っている。ＧＧＦは一般にＩｇ様ドメインおよびＥＧＦ様ドメインの間の完全な「グリコ」スペーサーを持っていない。ＧＧＦの一つであるＧＧＦII のみがＮ末端シグナルペプチドを有していた。ＧＧＦおよびその用途に言及しているＷＯ９２／１８６２７；ＷＯ９４／００１４０；およびＷＯ９４／０４５６０をも参照されたい。ＧＧＦと類似の分裂促進活性を有するその他のポリペプチドが記載されている。例えば、ベンヴェニスト等、PNAS、USA、８２巻３９３０ −３９３４頁（１９８５）は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で３０ｋＤａ、そして還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１８ｋＤａの見掛け分子量を有するグリア成長促進因子（ＧＧＰＦ）の、ヒトＴリンパ球上清からの分離を記載している。さらに、デイヴィスおよびストローバント、J.Cell Biol.、１１０巻１３５３−１３６０頁（１９９０）は、ＧＧＦ、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２を包含する、ラット坐骨神経シュワン細胞のためのインビトロマイトジェンである様々な成長因子を記載している。 (iii)ニューレグリンドメイン様々なニューレグリンドメインがペレスおよびヤーデンによりBioEssays、１５（１２）巻８１５−８２４頁（１９９３）に総説されている。これらのドメインを下に簡単に記載する。免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン − アミノ酸配列データが得られている同定された全てのニューレグリンはＩｇ様ドメインを持っており、これは、このドメインが本質的機能を有していることを示唆している。ペレスおよびヤーデン、上記、を参照されたい。しかし、近年クオ等は、ヒヨコの脳ｃＤＮＡおよびヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、他のニューレグリンポリペプチドのＩｇ様ドメインを欠く新規なＡＲＩＡスプライス変異体（ｎＡＲＩＡと呼ばれる）を同定した。ノーザンブロット分析により、神経系でのｎＡＲＩＡの発現が位置決定され、これは特に小脳で高レベルが検出された。クオ等、抄録番号４５２．１８、Soc.Neuroscience Abst.、２０巻１０９５頁（１９９４）。ヤング等、抄録番号４５２．１７、Soc.Neuroscience Abst.、２０巻１０９５頁（１９９４）をも参照されたい。グリコシル化スペーサードメイン − ＮおよびＯ結合グリコシル化部位に富むこの「グリコ」ドメインは、Ｉｇ様ドメインをＥＧＦ様ドメインと連結している。グリコサミノグリカン結合のための１個の可能性ある部位がこのスペーサードメインのアミノ末端に存在する。ＡＲＩＡおよびＧＧＦはグリコスペーサーの３４アミノ酸残基を欠いており、これらの分子中のグリコシル化部位の数を減じている。ＥＧＦ様ドメイン − この領域は６個のシステイン残基を取り込んでおり、３個のジスルフィド結合したループを有する構造に折り畳まれると予想されている。上に論じたように、ニューレグリンは、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端部分の配列に基づき、αまたはβ型ニューレグリンのいずれかに分類される。ＥＧＦ様ドメイン単独が高い親和性でレセプターに結合することが示されている。ホルメス等、上記、およびペレス等、EMBO J．、１２巻９６１−９７１頁（１９９３）を参照されたい。αおよびβ型の間の配列の相違はレセプター特異性を変えるようには見受けられない。しかしながら、β型はα型よりも、応答細胞に対して高い親和性で結合するかも知れない。幾つかのニューレグリンのＥＧＦ様ドメインのＣ末端部分は、８個のアミノ酸のつながりが隣接している。このアミノ酸残基のつながりはレセプター結合に影響するようには見えないが、可溶性ポリペプチドを放出する前駆体ニューレグリンの蛋白分解的プロセシングで役割を果たしていると考えられる。ペレスおよびヤーデン、上記、を参照されたい。細胞質尾 − ニューレグリンの貫膜型は４個の異なる親水性細胞質尾を有しており、その最長のものは４１５アミノ酸残基長である。記載されたニューレグリンの幾つかはこの細胞質尾を欠失している（例えばＨＲＧ−β３およびＧＧＦ II）。 (iv)その他の推定ＨＥＲ２アクチベーターＨＥＲ２アクチベーターであると考えられるその他のポリペプチドが記載されている。ルプ等、Science、２４９巻１５５２−１５５５頁（１９９０）およびルプ等、Biochemistry、３１巻７３３０−７３４０頁（１９９２）は、ＴＧＦ− α様性質を有する３０ｋＤａの糖蛋白（ｇｐ３０と命名された）を記載している。ルプ等は、この因子がＥＧＦＲおよびｐ１８５^HER2の両者の燐酸化を刺激することを見いだした。ルプ等は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の条件培地からもう一つの成長因子を分離し、これはｐ１８５^HER2に結合するがＥＧＦＲには結合しないと記載している。ｐ７５と呼ばれるこの因子は、ｐ１８５^HER2結合について抗ＨＥＲ２レセプター抗体４Ｄ５と競合した。ルプ等、抄録番号２９７、Proc.Am.Assoc. Cancer Res.、３２巻（１９９２）。ＷＯ９１／１８９２１；ＷＯ９２／１２１７４；およびＷＯ９３／２２３３９をも参照されたい。ＥＧＦＲおよびｐ１８５^HER2の両者を活性化することのできる糖蛋白についてのもう一つの報告がある。このポリペプチドは３５ｋＤａの分子量を持ち、熱安定性であるが還元には感受性があった。ヤーデンおよびペレス、Biochemistry、３０巻３５４３−３５５０頁（１９９１）を参照されたい。タラコフスキー等は、ｐ１８５^neuのリガンドであると考えられる、活性化マウス腹膜マクロファージにより分泌される２５ｋＤａポリペプチドを記載している。タラコフスキー等、Oncogene、６（１２）巻２１８７−２１９６頁（１９９１）。ファングおよびファングは、牛腎からの２５ｋＤａの蛋白の精製を報告しており、彼等はこれらをｎｅｕ／ｅｒｂＢ２リガンド成長因子（ＮＥＬ−ＧＦ）と名付けた。ＮＥＬ−ＧＦは、ｎｅｕレセプターを発現する無傷のＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてｎｅｕレセプターを燐酸化した。デイヴィス等、Biochem.Biophys.Res.Commun.、１７９（３）巻１５３６−１５４２頁（１９９１）およびドバシ等、PNAS、USA、８８巻８５８２−８５８６頁（１９９１）は、彼等がｎｅｕ蛋白特異性活性化因子（ＮＡＦ）と呼ぶ蛋白を特性決定し、これは約８ないし２４ｋＤａの間の分子量であった。ＮＡＦはｐ１８５^neuを活性化するがＥＧＦＲを活性化しないと言われた。７−１４ｋＤａポリペプチドについて述べているグリーン等のＷＯ９１／１５２３０をも参照されたい。後の報告では、ＮＡＦは１５−１７ｋＤａの分子量を有するとされている。サマンタ等、PNAS、USA、９１巻１７１１−１７１５頁（１９９４）。デ・コルテ等は、近年、ＳＫ−ＢＲ−３細胞においてＨＥＲ２レセプターを活性化するように見える５０ｋＤａ蛋白が、ＣＯＬＯ−１６ヒト癌細胞の条件培地中に存在すると報告した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞において、迅速に伝搬する早い原形質膜ラッフリングの誘発、細胞の形態変化、実効的トランスロケーション、走化性の刺激および成長停止を包含する様々な生物活性が、この因子に帰せられた。デ・コルテ等、J.Cell Science、１０７巻４０５−４１６頁（１９９４）。 (v)ニューレグリンの生物活性種々のニューレグリンポリペプチドに対する様々な生物活性が記載されてきた。ヒレグリンおよびＮＤＦポリペプチドがｐ１８５^HER2/neuを活性化するそれらの能力に基づいて最初に同定された（ホルメス等、上記、を参照されたい）が、ｎｅｕおよびｎｅｕトランスフェクトされた線維芽細胞を発現する或る卵巣細胞は、ＮＤＦと結合または交差反応せず、ＮＤＦと反応してチロシン燐酸化を受けることもないことが発見された［ペレス等、EMBO J．、１２巻９６１−９７１頁（１９９３）］。この事は、完全なニューレグリン応答性を付与するためには別の細胞成分が必要であることを示している。キャラウェイ等はその後、¹²⁵Ｉ− ｒＨＲＧβ１_177-244は牛ｅｒｂＢ３で安定にトランスフェクトされたＮＩＨ− ３Ｔ３線維芽細胞には結合するが、トランスフェクトされていない親細胞には結合しないことを証明した。そこで彼等は、ｅｒｂＢ３はＨＲＧのレセプターであり、内在チロシン残基の燐酸化および両レセプターを発現する細胞でのｐ１８５^erbB2/neu の燐酸化を仲介すると結論付けた。キャラウェイ等、J.Biol.Chem．、２６９（１９）巻１４３０３−１４３０６頁（１９９４）。スリウコフスキー等、J.Biol.Chem.、２６９（２０）巻１４６６１−１４６６５頁（１９９４）は、ＨＥＲ３のみでトランスフェクトされた細胞ではヒレグリンに対し低い親和性を示すが、一方ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の両者でトランスフェクトされた細胞は、より高い親和性を示すことを見いだした。この観察は、かつてコカイ等、Cell、５８巻２８７−２９２頁（１９８９）；スターン等、EMBO J．、７巻９９５−１００１頁（１９８８）；およびキング等、４巻１３−１８頁（１９８９）により記載された「レセプタークロストーキング」と相関している。これらの研究者は、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合がＥＧＦＲキナーゼドメインの活性化とｐ１８５^HER2の交差燐酸化をもたらすことを見いだした。これは、リガンド誘発レセプターヘテロ二量体化および同時に起こるこのヘテロ二量体内でのレセプターの交差燐酸化の結果であると信じられる［ワダ等、Cell、６１巻１３３９−１３４７頁（１９９０）］。プローマンおよびその同僚は、同じようにｐ１８５^HER4／ｐ１８５^HER2活性化を研究した。彼等はヒトＴリンパ球においてｐ１８５^HER2のみ、ｐ１８５^HER4のみ、または両レセプターを共に発現させ、ニューレグリンはｐ１８５^HER4のチロシン燐酸化を刺激できるが、両レセプターを発現する細胞においてはｐ１８５^HE ^R2 燐酸化のみを刺激することを立証した。プローマン等、Nature、３３６巻４７３−４７５頁（１９９３）。このように、ニューレグリンは、幾つかのレセプターと相互作用することのできるＥＧＦ成長因子ファミリーの成員の唯一の既知例である。キャラウェイおよびキャントレイ、Cell、７８巻５−８頁(１９９４)。ニューレグリンの生物学的役割が幾つかのグループによって研究されてきた。例えば、フォールズ等（前記）は、ＡＲＩＡが、筋管の分化で役割を果たしている、即ち運動ニューロンのシナプス後筋細胞における神経伝達物質レセプターの合成および濃度に影響を与えていることを見いだした。コーファスおよびフィッシュバッハは、ＡＲＩＡがさらにヒヨコの筋のナトリウムチャンネルの数を増加させることを立証した。コーファスおよびフィッシュバッハ、J.Neuroscience、１３（５）巻２１１８−２１２５頁（１９９３）。さらに、ＧＧＦIIは、やや密集した休止したヒト筋芽細胞に対して分裂促進性であること、そして、ＧＧＦＩＩの常時存在下でのクローンヒト筋芽細胞の分化は、６日間の分化の後に非常に多くの筋管を生成することが示された（スクラー等、J.Cell Biochem.、抄録Ｗ４６２、１８Ｄ、５４０［１９９４］）。ペレス等（１９９２）、上記、およびウェン等（１９９２）、上記、は、或る種の乳房腫瘍細胞（例えばＡＵ−５６５およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３）をＮＤＦに暴露する時、ＮＤＦが表現型分化（形態学的変化および乳汁成分の合成を包含する）を誘発し、成長停止をもたらすことを見いだした。逆に、ホルメス等、上記、は、ＨＲＧが乳房セルライン（たとえばＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７）に対し分裂促進効果を現すことを見いだした。シュワン細胞に対するＧＧＦの分裂促進活性が報告されている。例えば、ブロックス等、J.Biol.Chem.、２５５（１８）巻８３７４−８３７７頁（１９８０）；レムケおよびブロックス、J.Neurosci.、４巻７５−８３頁（１９８４）；ブロックス等、J.Neuroscience、４（１）巻７５−８３頁（１９８４）；ブロックス等、Ann.Neurol.、２０（３）巻３１７−３２２頁（１９８６）；ブロックス、J.Methods in Enzym.、１４７巻２１７−２２５頁（１９８７）およびマーチオーニ等、上記、を参照されたい。シャー等、は、ＧＧＦはラット神経堤幹細胞のニューロンの分化を抑制するが、グリアの分化を促進または許容することを報告している。シャー等、Cell、７７巻３４９−３６０頁（１９９４）。シュワン細胞は、ニューロンの軸索の周りを覆いそれにより個々の神経線維を形成させるミエリンを提供する重要なグリア細胞を構成する。したがって、シュワン細胞が末梢神経の発達、機能および再生で重要な役割を果たしていることは明白である。治療的立場からのこの事の関係が、レヴィ等、J.Neuroscience、１４（３）巻、１３０９−１３１９頁（１９９４）により扱われている。レヴィ等は、損傷した脊髄の領域に移植することのできるヒトシュワン細胞を含む細胞補綴物の組み立ての可能性を論じている。したがってこれらの研究者は、エクスビボでこれらの細胞の完全な分化をさせるために使用できるシュワン細胞マイトジェンの必要性を概説している。ＷＯ９４／００１４０は、グリア細胞（例えばシュワン細胞）の分裂誘発を刺激するための様々な因子の使用を記載している。ヒレグリンがインビトロでヒトシュワン細胞に対する強力なマイトジェンであると証明した者もいる。レヴィ等、J.Cell Biol.、印刷中。ピンカス−クラマルスキー等は、ＮＤＦが、胚のおよび成体のラット脳のニューロンおよびグリア細胞ならびにラット脳細胞の初代培養中で発現されるようであることを見いだし、これがアストロサイトのための生存および成熟因子として作用しているかも知れないと示唆した（ピンカス−クラマルスキー等、PNAS、US A、９１巻９３８７−９３９１頁［１９９４］）。メイヤーおよびバーチマイアー、 PNAS、USA、９１巻１０６４−１０６８頁（１９９４）は、インシトゥハイブリダイゼーションおよびＲＮアーゼ保護実験を使用して、マウス胚形成中のおよび分娩時動物のニューレグリンの発現を分析した。これらの筆者は、この分子の発現に基づくと、ニューレグリンはインビボで間充織のおよびニューロンの因子としての役割を果たしていると結論付けている。また、これらの発見は、ニューレグリンが上皮の発達において機能していることを意味するものである。同様に、ダニレンコ等、抄録３１０１、FASEB、８（４−５）巻Ａ５３５頁（１９９４）は、ＮＤＦおよびＨＥＲ２レセプターの相互作用は、創傷修復の最中の表皮の遊走および分化の指令において重要であることを見いだした。上の論考から、ニューレグリンが他の成長因子（例えばインターロイキン６およびアンフィレグリン）と同様に、濃度および細胞状況に応じて分化因子としてまたはマイトジェンとして働くことができるということが明らかである。したがって、診断、エクスビボ、および治療用途のための、ＨＥＲ２レセプターの新規なポリペプチドアクチベーターおよび／またはグリア細胞マイトジェンを同定することが、本発明の一つの目的である。このようなポリペプチドをコードしている核酸を提供し、この核酸を用いて組換え細胞培養中でこのポリペプチドを産生することが、もう一つの目的である。アミノ酸配列変異体および共有結合誘導体を包含する、このようなポリペプチドの誘導体および修飾型を提供することが、さらに別の目的である。係るポリペプチドに対する抗体を作製するための免疫原を製造すること、およびそれらを結合することのできる抗体を取得することがさらなる目的である。これらのおよびその他の本発明の目的は、本明細書を全体として考察する時、当業者にとって明らかであろう。発明の要約本発明は、分離されたＳＭＤＦポリペプチドを提供するものである。このＳＭＤＦポリペプチドは、好ましくは実質上均質であり、天然配列ポリペプチド、変異体ポリペプチド、およびキメラポリペプチドより成る群から選ばれ得る。さらに、ＳＭＤＦポリペプチドは、哺乳動物（例えば人間）から分離されたポリペプチド、組換え手段により作成されたポリペプチド、および合成手段により作成されたポリペプチドより成る群から選択することができる。したがって、該ポリペプチドは天然のグリコシル化が付随しておらず、または完全に非グリコシル化されていて良い。さらに、このＳＭＤＦポリペプチドは、人間において非免疫原性であるポリペプチドおよび図１Ａに示されるヒトＳＭＤＦの翻訳されたアミノ酸配列を有するＳＭＤＦより成る群から選ばれてよい。別の態様において、分離されたＳＭＤＦポリペプチドは、図１Ａに示される翻訳化ＳＭＤＦ配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列一致を共有する。さらなる態様において、本発明は、図１Ａに供される核酸配列と、中等度緊縮条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸によりコードされている、分離されたポリペプチドを提供する。好ましくはこのポリペプチドは生物学的に活性である。さらに別の態様において本発明は、生物活性なＳＭＤＦおよび薬学上許容し得る担体を含む、または免疫原性ポリペプチドと融合させたＳＭＤＦを含む、組成物を提供する。本発明はさらに、患者由来の試料または細胞を上記ＳＭＤＦに暴露させ、その試料または細胞に結合するＳＭＤＦの程度を測定することを含む、癌腫（例えば乳房または卵巣癌種）に罹患している患者の予後を決定する検定を提供する。普通、この検定に使用されるＳＭＤＦは標識されるであろう。別の態様において本発明は、インビトロまたはインビボでＨＥＲ２レセプターを活性化することを含み、ここでＨＥＲ２レセプターを発現する細胞はＳＭＤＦポリペプチドに暴露させる。さらに、細胞培養中または哺乳動物(特に人間)患者中に存在するグリア細胞をＳＭＤＦに暴露させることにより、その分裂誘発を刺激することが可能である。さらに別の態様において、本発明は、ＳＭＤＦに結合することのできる分離された抗体、および、抗体をＳＭＤＦの含有が疑われる試料または細胞に接触させ、例えばＥＬＩＳＡにより、結合が起こっているか否かを検出することを含む、インビトロまたはインビボでＳＭＤＦを検出する方法を提供する。また別の態様において本発明は、ＳＭＤＦの混合物を、抗体を結合させたカラムを通過させ、ＳＭＤＦを含有する画分を回収することを含む、ＳＭＤＦの精製法を提供する。別の態様において本発明は、ＳＭＤＦをコードしている分離された核酸分子、該核酸分子を含むベクター、好ましくは該ベクターにより形質転換された宿主細胞により認識される調節配列と機能的に結合している核酸分子を含む発現ベクター、哺乳動物および細菌宿主細胞を包含する、該核酸分子を含む宿主細胞、および、該核酸分子を含む宿主細胞を培養することを含む、ＳＭＤＦの産生を行わせるためにＳＭＤＦをコードしている核酸分子を使用する方法、を含む。好ましくは該宿主細胞はトランスフェクトされてＳＭＤＦ核酸を発現し、そしてこのＳＭＤＦは宿主細胞培養から回収され、そしてもし分泌されるならば、培養基から回収される。分離された核酸分子は、 (a)図１Ａに示されるＳＭＤＦ遺伝子のコード化領域のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ； (b)遺伝子コードの縮重の範囲内で(a)の配列に対応するＤＮＡ；および、 (c)(a)または(b)のＤＮＡに対し相補的な配列とハイブリダイズし、天然配列ＳＭＤＦポリペプチドの生物学的性質を有するポリペプチドをコードしている、ＤＮＡ、より成る群から選択することができる。一つの態様において本発明は、薬学上許容し得る担体中の治療的有効量のＳＭＤＦを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物を処置する方法を提供する。例えばこの哺乳動物は神経変性疾患に罹患していてよい。図面の簡単な説明図１Ａおよび１Ｂは、ＳＭＤＦのｃＤＮＡ配列［配列番号１］およびアミノ酸配列［配列番号２］（図１Ａ）ならびにＳＭＤＦのハイドロパシー分析（図１Ｂ）を示している。図１Ａにおいて、ＥＧＦ様ドメインならびに無極性および非荷電ドメイン（即ち、約４８−６２の残基で構成される「無極性Ｉ」および約７６ − １００の残基で構成される「無極性II」）に下線を付した。ＥＧＦ様ドメイン中、および特異なＮ末端ドメイン内の「システインノット」（「ＮＴＤ−ｃｙｓノット」）中のシステインに囲みを付した。終止コドンは文字「Ｏ」で示す。図２Ａおよび２Ｂはそれぞれ、ＳＭＤＦとＧＧＦII、ＨＲＧ−β１およびＡＲＩＡとの模式的比較（図２Ａ）ならびにＳＭＤＦ［配列番号２］、ＧＧＦII［配列番号３］、ＨＲＧ−β１［配列番号４］およびＡＲＩＡ［配列番号５］のアミノ酸配列比較（図２Ｂ）を示している。図２Ａにおいては、主要な構造上の特徴のみを示す。ＳＭＤＦのＥＧＦ様ドメインは、ヌクレオチドレベルで、ＧＧＦII およびＨＲＧ−βのそれと１００％、そしてＡＲＩＡのそれと８３％が同一である。ＧＧＦIIおよびＨＲＧ−β３と同様、ＳＭＤＦ配列は、ＥＧＦ様ドメインを貫膜ドメイン（ＴＭ）と連結する８−１０のアミノ酸のつながりの後で終わり、そして、ＨＲＧ−β１およびＡＲＩＡには存在する後者および細胞質尾を欠く。ＳＭＤＦのＥＧＦ様ドメインのＮ末端の配列（即ち特異な「ＮＴＤ」）は、既知のいかなるニューレグリンとも一致が無い。それは、既知のニューレグリン全てに特徴的なＩｇ様ドメインを欠失する。それはさらにＧＧＦIIのＮ末端疎水性シグナル配列を欠くが、一つながりの無極性且つ非荷電アミノ酸残基（無極性II）を持っている。図２Ｂにおいて、ホモローガスなＩｇ様、ＥＧＦ様、およびＴＭドメインに囲みを付してある。ＳＭＤＦのＥＧＦ様ドメインはＧＧＦIIおよびＨＲＧ−β１のそれと同一であるが、ＡＲＩＡのそれとは７アミノ酸だけ異なっている（＊で示す）。ＧＧＦIIおよびＨＲＧ−β１は同一のＩｇ様ドメインを持ち、ＡＲＩＡとは、ヌクレオチドおよびアミノ酸（＊で示す）レベルでそれぞれ３０および３５％だけ異なっている。ＳＭＤＦはＩｇ様ドメインを持たない。ＨＲＧ−β１およびＡＲＩＡのＴＭドメインは同一である。好ましい態様の詳細な説明Ｉ．定義一般に、以下の語または句は、説明、実施例、および請求の範囲に使用される場合、示された定義を有する。「ＳＭＤＦ」（または「感覚および運動ニューロンにより誘導される因子」）とは、本明細書中、図１Ａのポリペプチド配列を含む天然配列ＳＭＤＦの少なくとも一つの生物学的性質（下記定義による）を有する任意のポリペプチド配列であると定義される。この定義は、本明細書に記載される人間の脳のような天然のＳＭＤＦ供給源または他の動物種のような別の供給源から分離されたポリペプチドのみならず、組換えまたは合成法により製造されたポリペプチドをも包含する。それはさらに、その機能的誘導体、対立遺伝子、イソ型および類似体を包含する変異体型を包含する。好ましくはＳＭＤＦはニワトリＳＭＤＦではない。時にＳＭＤＦは、哺乳動物から分離された内因性ＳＭＤＦポリペプチドを指す「天然ＳＭＤＦ」である。ＳＭＤＦはさらに、それが天然ＳＭＤＦ（例えば図１Ａに示されるヒトＳＭＤＦ）と同じアミノ酸配列を有する限り、「天然配列ＳＭＤＦ」であってもよい。しかしながら、「天然配列ＳＭＤＦ」は、組換えまたは合成手段により生産されたポリペプチドを包含する。所望により、ＳＭＤＦは天然グリコシル化を伴わない。「天然グリコシル化」とは、その天然ＳＭＤＦが誘導される哺乳動物細胞中で産生される時、天然ＳＭＤＦに共有結合している炭水化物部分を指す。したがって、例えば、非ヒト細胞で産生されたヒトＳＭＤＦは天然グリコシル化を伴わないと記載され得る。時にはＳＭＤＦはグリコシル化を全く伴わない（例えば原核生物中で組換えにより産生された結果として）。図１Ａに示されるＳＭＤＦは、この蛋白をかつて記載されたニューレグリン蛋白と識別する特異なアミノ末端ドメインを有する。これは本明細書中「Ｎ末端ドメイン」または「ＮＴＤ」と称する（即ち、図１Ａの大体残基１から大体残基２２２まで）。しかし、「ＮＴＤ」という表現は図１Ａに示されるＮＴＤの機能的等価物を包含する。このＮＴＤは、大体図１Ａのアミノ酸残基５８から大体残基９１までである、「ＮＴＤ−システインノット」または「ＮＴＤ−ｃｙｓノット」を有する。主に無極性および非荷電アミノ酸残基で構成される二つのドメインもまた存在する。これらのドメインは本明細書中、「無極性Ｉ」（即ち、図１Ａのアミノ酸残基の大体４８−６２）および「無極性II」（即ち、図１Ａのアミノ酸残基の大体７６−１００）と呼称される。「ＳＭＤＦフラグメント」とは、１またはそれ以上のアミノ酸残基または炭水化物単位が除去されている、天然に存在する全長のＳＭＤＦ配列の一部である。この用語は特に、ＥＧＦ様ドメインのみからなるフラグメントを除外する。除去されるアミノ酸残基は、Ｎ末端またはＣ末端または内部を包含する該ポリペプチドのどこにあってもよい。一般に、Ｎ末端ドメインの残基が除去されるであろう。該フラグメントは、ＳＭＤＦに共通する少なくとも一つの生物学的性質を共有するであろう。ＳＭＤＦフラグメントは典型的には、ＳＭＤＦのＮＴＤの少なくとも２０、３０、または４０のアミノ酸残基の連続配列を有するであろう。好ましいフラグメントは、ヒトＳＭＤＦの配列と等しい約３０−１５０残基を有する。他の好ましいＳＭＤＦフラグメントは、精製されたＳＭＤＦの化学的もしくは酵素的加水分解または消化の結果として産生されるものを包含する。フラグメントの例には、無極性および非荷電ドメインの一つ（例えば無極性Ｉ）が除去されたＳＭＤＦ；およびＮＴＤ−ｃｙｓノットが除去されたＳＭＤＦが包含される。本明細書中定義される「ＳＭＤＦ変異体」または「ＳＭＤＦ配列変異体」とは、図１Ａに示される推定アミノ酸配列を有する組換え細胞培養から分離されたＳＭＤＦと１００％未満の配列一致を有する、下記定義による生物活性ＳＭＤＦを意味する。通常、生物活性ＳＭＤＦ変異体は、図１Ａに示されるヒトＳＭＤＦと、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列一致を有するアミノ酸配列を有するであろう。「キメラＳＭＤＦ」とは、第二の蛋白または１もしくはそれ以上のそのフラグメントと融合または結合した、全長のＳＭＤＦまたは１もしくはそれ以上のそのフラグメントを含むポリペプチドである。このキメラは、ＳＭＤＦに共通する少なくとも一つの生物活性を共有するであろう。キメラＳＭＤＦの例には、免疫アドヘシンおよびエピトープ標識されたＳＭＤＦが包含される。「免疫アドヘシン」という語は、「ＳＭＤＦ−免疫グロブリンキメラ」という表現と互換的に使用され、ＳＭＤＦの生物活性部分を免疫グロブリン配列と合したキメラ分子を指す。この免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリン不変ドメインであるが、必ずしもそうでなくともよい。本発明に係るキメラ中の免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから取得することができるが、好ましくはＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３から取得する。本明細書で使用される場合の「エピトープ標識された」という語は、「タグポリペプチド」に融合したＳＭＤＦ全体、またはその一部を含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、それに対する抗体が作製され得るエピトープを提供するに充分な残基を有し、それでいてＳＭＤＦの活性を妨害しないよう、充分短い。タグポリペプチドは好ましくはかなり特異であって、その結果それに対する抗体が実質上他のエピトープと交差反応しない。好適なタグポリペプチドは一般に、少なくとも６アミノ酸残基、そして通常約８−５０の間のアミノ酸残基を有する（好ましくは約９−３０残基の間）。「分離されたＳＭＤＦ」、「高度に精製されたＳＭＤＦ」および「実質上均質なＳＭＤＦ」は互換的に使用され、ＳＭＤＦ供給源から精製され、または組換えもしくは合成法により製造され、そして、（１）スピニングカップシークエネーターまたは入手し得る最高の市販アミノ酸シークエネーターを使用することにより、または本出願の出願日現在公刊されている方法により修飾して、少なくとも１５、好ましくは２０のＮ末端または内部アミノ酸配列のアミノ酸残基を取得するに充分な程、または、（２）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いる非還元または還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性が得られるに十分な程、他のペプチドまたは蛋白を含んでいないＳＭＤＦを意味する。ここでの均質性とは、他の供給源の蛋白による約５％未満の汚染を意味する。「ＳＭＤＦ」または「分離されたＳＭＤＦ」のいずれかに関連して用いられる場合「生物学的性質」とは、ＳＭＤＦ（天然または変性したコンホメーションの如何に拘わらず）により直接的または間接的に惹起または遂行される、インビボエフェクターもしくは抗原機能または活性を有することを意味する。エフェクター機能は、レセプター活性化（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３および／またはＨＥＲ４レセプターの活性化）；１またはそれ以上のこれらのレセプターを有する細胞（例えばＳＫ−ＢＲ−３細胞、シュワン細胞、肝細胞、グリオブラストーマ細胞、表皮細胞、筋細胞、アストロサイトおよび／またはオリゴデンドロサイト）の分化および／または増殖の増強；レセプター結合（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４レセプターへの）；分裂促進活性；細胞膜におけるイオンチャンネル形成の誘導（例えばＮａ⁺チャンネル）；神経筋接合部でのアセチルコリンレセプター合成の誘導；ニューロンと筋、神経または腺細胞の間のシナプス接合部の形成の促進；エストロゲンレセプターのダウンレギュレーション；および細胞のインターナリゼーション（恐らくは核の局在を伴う）を包含する。しかし、エフェクター機能には、天然配列ＳＭＤＦに対して作製された抗体と交差反応することのできるエピトープまたは抗原部位の所有は包含されない。「抗原機能」とは、天然配列ＳＭＤＦに対して作製された抗体と交差反応することのできるエピトープまたは抗原部位の所有を意味する。ＳＭＤＦポリペプチドの主たる抗原機能は、それが天然配列ＳＭＤＦに対して作製された抗体と、少なくとも約１０⁶Ｌ／moleの親和性で結合することである。通常このポリペプチドは少なくとも約１０⁷Ｌ／moleの親和性で結合する。「抗原機能」を定義するために用いられる抗体は、完全フロイントアジュバント中に天然配列ＳＭＤＦを調合し、この調合物を皮下注射し、そして抗ＳＭＤＦ抗体の抗体価がプラトーに達するまでこの調合物を腹腔内注射することにより免疫反応を追加免疫することによって作製される、ウサギポリクローナル抗体である。「ＳＭＤＦ」または「分離されたＳＭＤＦ」のいずれかに関連して使用される場合の「生物学的に活性」とは、天然供給源から分離されもしくは本明細書に記載の組換え細胞培養で産生されたＳＭＤＦのエフェクター機能を示しまたは共有し、そしてさらに抗原機能を有し得る（ただしそうである必要はない）、ＳＭＤＦポリペプチドを意味する。ＳＭＤＦの二つの主要なエフェクター機能は、ＨＥＲ２レセプターを活性化する能力および培養中のシュワン細胞に働く分裂促進活性である。「抗原的に活性な」ＳＭＤＦとは、ＳＭＤＦの抗原機能を有し、そしてさらにエフェクター機能を有し得る（ただしそうである必要はない）ポリペプチドとして定義される。ＳＭＤＦ配列に関する「パーセントアミノ酸配列一致」とは、本明細書中、同類置換は配列一致の一部と考えずに、最大パーセントの配列一致を達成するように配列を並列させ、必要ならば間隙を導入した後に、図１Ａに記載される推定アミノ酸配列を有するＳＭＤＦ配列中の残基と一致する候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。ＳＭＤＦ配列中へのＮ末端、Ｃ末端、または内部伸長、除去または挿入は、いずれも配列一致または相同性に影響するとはみなされない。「疾病の状態を決定」とは、新生物疾患、特に乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎、結腸、および膀胱の癌腫に対する患者の生存および再発時期の見込みを決定する行為を指す。特に、ＳＭＤＦは、癌腫に罹患している患者から採取された癌組織におけるｅｒｂＢレセプター（例えばｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３またはｅｒｂＢ４。しかし普通はｅｒｂＢ２レセプター。）の過剰発現を定量するのに使用することができる。これはまた、「癌に罹患している患者の適切な処置過程を決定」と言うこともできる。例えば、ｅｒｂＢ２過剰発現を特徴とする患者は、他の診断因子によって指示されるよりは攻撃的な処置（例えば化学療法または放射線療法の処置）を必要とするかも知れない。この句は、インシトゥの高度な分泌管癌に罹患している患者の診断を包含する。例えば、ディシス等、Canc er Research、５４巻１６−２０頁（１９９４）を参照されたい。「試料」という語は患者由来の組織、体液、または細胞を指す。通常、組織または細胞は患者から採取されるが、インビボ診断もまた意図される。充実性腫瘍の場合、組織試料は外科的に採取された腫瘍から取得し、常套的技術により試験用に調製することができる。リンパ腫および白血病の場合は、リンパ球、白血病細胞、またはリンパ組織を得、適宜調製することになるであろう。尿、血清、喀痰、細胞抽出物等を包含するその他の患者試料もまた、特定の腫瘍について有用であろう。本明細書で使用される場合の「標識された」という表現は、検出可能な化合物または組成物を用いて直接的または間接的にコンジュゲートされた分子（例えばＳＭＤＦまたは抗ＳＭＤＦ抗体）を指す。標識はそれ自身検出可能である（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）か、または酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒することができる。好ましい標識は非放射性色素試薬の変色を触媒する酵素的標識である。「ＨＥＲ２レセプターを活性化」という句は、ＨＥＲ２レセプターの細胞内キナーゼドメインがチロシン残基を燐酸化するようにさせる行為を指す。普通、チロシン残基は、活性化されるＨＥＲ２レセプターの細胞内ドメインに存在する（即ち自己燐酸化）が、該レセプターが基質の残基を燐酸化することもあり得る（例えば隣接ｅｒｂＢレセプター）。ｅｒｂＢレセプターの自己燐酸化は本明細書に記載のＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡを用いて定量することができる。「グリア細胞の分裂促進を刺激」とは、グリア細胞の増殖をインビトロまたはインビボで亢進させることを意味する。細胞増殖の程度は、本明細書に記載のグリア細胞増殖検定を用いて測定することができる。「グリア細胞」は中枢および末梢神経系から誘導され、オリゴデンドログリア、アストロサイト、上衣細胞、またはミクログリア細胞ならびに神経節の衛星細胞および末梢神経線維周囲の神経線維鞘またはシュワン細胞から選択することができる。「分離されたＳＭＤＦ核酸」は、生物学的に活性なＳＭＤＦまたはそのフラグメントをコードしている１６以上、好ましくは２０またはそれ以上の連続したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡであるか、該ＲＮＡまたはＤＮＡに対し相補的であるか、または中等度ないし緊縮条件下で該ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズし且つ安定に結合し続ける。このＲＮＡまたはＤＮＡは、天然供給源に通常付随する少なくとも一つの汚染源の核酸を含まず、そして好ましくは他のいかなる哺乳動物のＲＮＡまたはＤＮＡをも実質上含まない。「それが通常付随する少なくとも一つの汚染源の核酸を含まない」という句は、その核酸が供給源のまたは天然の細胞内に存在してはいるものの、異なった染色体位置にあるか、またはその他の状態で、供給源の細胞に普通見いだされない核酸配列に隣接している場合を包含する。分離されたＳＭＤＦ核酸の例は、図１Ａに示されるヒトＳＭＤＦと、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％の配列一致を共有する生物学的に活性なＳＭＤＦをコードしているＲＮＡまたはＤＮＡである。発現に言及する場合の「調節配列」とは、特定の宿主生物における機能的に結合したコード化配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に好適な調節配列は、例えば、プロモーター、所望によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、そして恐らくはまだあまり理解されていない他の配列を包含する。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。核酸に言及する場合の「機能的に結合した」とは、当該核酸が別の核酸配列と機能的な関係に位置することを意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に参加するプレ蛋白として発現されるならば、そのポリペプチドのためのＤＮＡと機能的に結合しており；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード化配列の転写に影響するならば、その配列と機能的に結合しており；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置しているならば、コード化配列と機能的に結合している。一般に、「機能的に結合した」とは、結合しているＤＮＡ配列が隣接しており、そして分泌リーダーの場合には、隣接し且つ読み取り相内にある。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。もしそのような部位が存在しない場合、常法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。「緊縮条件」とは、（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば０．０１５ＭＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ₄（ＳＤＳ）を５０℃で使用し、または（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドのような変性剤、例えば、０．１％牛血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを伴う５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）と共に５０％（容量／容量）ホルムアミドを４２℃で使用する条件である。別の例は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中４２℃で洗浄するものである。「中等度の緊縮条件」は、サムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９）に記載されており、上の記載より緊縮性の低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。中等度の緊縮条件の例は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断鮭精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一夜インキュベートし、その後フィルターを１ｘＳＳＣ中約３７−５０℃で洗浄するような条件である。当業者は、プローブの長さ等のような因子に適合させるのに必要な温度、イオン強度等をいかにして調節するかがわかるであろう。「抗体」という語は最も広い意味で使用され、特に、単一の抗ＳＭＤＦモノクローナル抗体および多エピトープ特異性を有する抗ＳＭＤＦ抗体組成物を包含する（中和および非中和抗体を包含する）。本明細書中使用される「モノクローナル抗体」という語は、実質上均質な抗体の集団から得られた抗体、即ち、その集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る天然に存在する可能な突然変異を除いては同一である抗体を指す。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して作製される異なった抗体を含む常套的（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の一つの決定基に対して作製されたものである。本明細書に記載のモノクローナル抗体は、抗ＳＭＤＦ抗体の可変（超可変を包含する）ドメインを不変ドメインと（例えば「ヒト化」抗体）、または軽鎖を重鎖と、または或る種由来の鎖を別の種由来の鎖とスプライシングすることにより、または、起源となる種または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスの指定に拘わらず、ヘテロローガスな蛋白との融合により、および、それらが所望の生物活性を示す限り、抗体フラグメント［例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ)₂、およびＦｖ］との融合により、製造されたハイブリッドおよび組換え抗体を包含する［例えば、米国特許第４８１６５６７号およびメイジおよびラモイ、モノクローナル・アンティボディ・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ、７９−９７頁（マーセル・デッカー、Ｉｎｃ．）、ニューヨーク（１９８７）を参照されたい］。したがって修飾語句「モノクローナル」は、実質上均質な抗体の集団から得られるという抗体の性格を示すものであり、特定の方法によりその抗体を産生することを要求すると解してはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、コーラーおよびミルシュタイン、Nature、２５６巻４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製することができ、または、組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）により作製することができる。「モノクローナル抗体」はまた、例えばマクカファーティ等、Nature、３４８巻５５２−５５４頁（１９９０）に記載の技術を用いて生成されるファージライブラリーから分離することもできる。非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含む、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')₂またはその他の抗体の抗原結合サブ配列）である。大抵は、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒトＦＲ残基に置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはＦＲ配列にも見いだされない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の挙動をさらに洗練および最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質上全てを含み、ここで、全てまたは実質上全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てまたは実質上全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれをも含むであろう。本明細書中に定義される「中和抗体」とは、天然配列ＳＭＤＦのエフェクター機能を遮断または有意に低下させることのできる抗体分子を意味する。例えば、中和抗体は、本明細書に記載のＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡにおいて、ＳＭＤＦがＨＥＲ２レセプターを活性化する能力を阻害または低下させることができる。中和抗体は、この出願に詳説されるグリア細胞増殖検定においてＳＭＤＦの分裂促進活性を遮断することもできる。「人間において非免疫原性」とは、薬学上許容し得る担体中の該ポリペプチドの治療的有効量を人間の適当な組織に接触させ、適当な潜伏期間（例えば８ないし１４日間）後に該ポリペプチドの二度目の投与を行う時、このポリペプチドに対する感受性または耐性の状態が現れないことを意味する。「処置」とは、治療的処置および予防または防止的措置の両者を指す。処置を必要とする者には、既にその疾患に罹患している者およびその疾患に罹患し易い者またはその疾患を防止すべき者が包含される。処置の目的のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を指し、人間、家庭および農場の動物、および動物園、運動、または愛玩動物、例えば羊、犬、馬、猫、牛等を包含する。好ましくは、本明細書における哺乳動物は、人間である。 II ．発明を実施するための方法１．ＳＭＤＦポリペプチドヒト脳からクローニングされたＳＭＤＦは以下の特徴を有する： (a)それはＨＥＲ２レセプターを活性化し；そして、 (b)それはインビトロでラットのシュワン細胞に分裂促進活性を示す。ヒトＳＭＤＦのＤＮＡおよびアミノ酸配列を図１Ａに示す。本明細書に記載の新規なＳＭＤＦは、それらのＤＮＡが、中等度緊縮ないし緊縮条件下で図１Ａの特異なＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）（またはそのフラグメント）中のＤＮＡとハイブリダイズできるという適当な配列一致を有する成長因子の一ファミリーの成員であり得る。したがって、この発明のさらなる態様は、ＳＭＤＦのＮＴＤをコードしているＤＮＡと中等度緊縮ないし緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡを包含する。２．天然配列ＳＭＤＦおよび変異体の製造Ａ．ＳＭＤＦをコードしているＤＮＡの分離ＳＭＤＦをコードしているＤＮＡは、ＳＭＤＦｍＲＮＡを持ち、それを検出し得るレベルで発現すると信じられる組織から調製される任意のｃＤＮＡライブラリーから取得することができる。このｍＲＮＡは、例えばヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリーから好適に調製される。ＳＭＤＦ遺伝子はさらに、完全なヌクレオチドもしくはアミノ酸配列がわかっているとすれば、インビトロオリゴヌクレオチド合成によって、またはゲノムライブラリーから取得することもできる。ライブラリーを、目的とする遺伝子またはそれによりコードされている蛋白を同定するよう設計されたプローブでスクリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライブラリーのためには、好適なプローブは、例えば、ＳＭＤＦを認識し且つこれに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体；同じまたは異なる種由来のＳＭＤＦｃＤＮＡの既知のまたはそれと推定される部分をコードしている長さ約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド；および／または同じもしくは類似遺伝子をコードしている相補的もしくはホモローガスなｃＤＮＡまたはそのフラグメントを包含する。ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための適当なプローブは、同じもしくは類似遺伝子をコードしているオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはそれらのフラグメント、および／またはホモローガスなゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントを包含するが、これらに限定される訳ではない。選ばれたプローブによるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、サムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９）の１０−１２章に記載のような標準法を用いて実施することができる。ＳＭＤＦをコードしている遺伝子を分離する代替手段は、サムブルック等、上記、の１４項に記載のＰＣＲ法を使用することである。この方法は、ＳＭＤＦとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドの選択のための方法を下に述べる。本発明を実施する好ましい方法は、注意深く選択されたオリゴヌクレオチド配列を使用して、様々な組織、好ましくは哺乳動物の神経組織からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。より好ましくは、ヒト神経組織ｃＤＮＡライブラリーをこのオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングする。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、十分な長さがあり、且つ偽陽性を最小とするに十分明確であるべきである。実際のヌクレオチド配列は通常、保存されたまたは高度にホモローガスなヌクレオチド配列（例えばＮＴＤまたはその一部をコードしている）に基づいている。このオリゴヌクレオチドは、１またはそれ以上の位置で縮重していてよい。縮重オリゴヌクレオチドの使用は、或るライブラリーが、優先的コドンの使用が知られていない種からスクリーニングされる場合、特に重要である。このオリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー中のＤＮＡとハイブリダイズする時に検出できるよう、標識されていなければならない。好ましい標識方法は、当分野で良く知られるように、ポリヌクレオチドキナーゼと共に³²P標識されたATPを用いてオリゴヌクレオチドを放射標識することである。しかしながら、ビオチニル化または酵素標識化を包含するその他の方法を用いてオリゴヌクレオチドを標識することもできるが、これらに限定される訳ではない。本明細書に初めて開示された推定アミノ酸配列を使用し、そしてもし必要ならばサムブルック等、上記、の７．７９項に記載の常套的プライマー伸長法を使用して、選択されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、全ての天然ＳＭＤＦコード化配列を有する核酸を取得し、ｃＤＮＡに逆転写されなかったかも知れないｍＲＮＡの前駆体およびプロセシング中間体を検出する。Ｂ．天然配列ＳＭＤＦのアミノ酸配列変異体天然配列ＳＭＤＦのアミノ酸配列変異体は、天然配列ＳＭＤＦＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、または、所望ＳＭＤＦポリペプチドのインビトロ合成により、製造される。係る変異体は、例えば、図１ＡにヒトＳＭＤＦとして示されるアミノ酸配列内の残基からの除去、または挿入もしくは置換を包含する。最終組み立て物が所望の性質を有する限り、最終組み立て物に到達するために除去、挿入、および置換の任意の組み合わせが施される。アミノ酸変化はまた、Ｏ結合グリコシル化部位の数または位置の変更といったような、天然配列ＳＭＤＦの翻訳後処理を変化させ得る。天然配列ＳＭＤＦのアミノ酸配列変異体の設計のためには、突然変異部位の位置および突然変異の性質は、修飾されるべきＳＭＤＦの性格に依存するであろう。突然変異のための部位は、例えば（１）最初に同類アミノ酸選択肢で、次いで、達成される結果に応じて、より過激な選択で置換することにより、（２）標的残基を除去することにより、または、（３）確認された部位に隣接して、同じまたは異なるクラスの残基を挿入することにより、または選択肢１−３の組み合わせにより、個別に、または連続して修飾することができる。突然変異誘発にとって好ましい位置である天然ＳＭＤＦポリペプチドの或る残基または領域を特定する有用な方法は、カニングハムおよびウェルズ、Science 、２４４巻１０８１−１０８５頁（１９８９）に記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、或る残基または標的残基群を特定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕのような荷電残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって置き換え、細胞内外を取り巻く水性環境と該アミノ酸との相互作用に影響を及ぼさせる。次に、この置換に対する機能的感受性を示すドメインを、置換部位にまたは置換部位のためのさらなるまたはその他の変異体を導入することによってさらに改良する。したがって、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決められているが、突然変異自体の性質は予め決めておく必要がない。例えば、与えられた部位での突然変異の挙動を最適化するため、標的コドンまたは領域でアラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を実施し、産生されたＳＭＤＦ変異体を、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングする。アミノ酸配列変異体の組み立てには二つの主要な変数：突然変異部位の位置および突然変異の性質がある。これらは図１Ａの配列からの変異体であり、天然に存在する対立遺伝子（これは天然ＳＭＤＦＤＮＡの操作を必要としないであろう）、または、天然に見いだされない変異体または対立遺伝子に到達するためにＤＮＡを突然変異させることにより作成される前もって決定されている突然変異体型を表し得る。一般に、選ばれた突然変異の位置および性質は、修飾されるべきＳＭＤＦの性格に依存するであろう。アミノ酸配列の除去は一般に約１から３０残基まで、より好ましくは約１ないし１０残基の範囲であり、典型的には隣接している。隣接する除去は、通常偶数の残基に施されるが、１個のまたは奇数の除去もまた本発明の範囲内にある。様々な哺乳動物のＳＭＤＦ間で相同性の低い領域に除去を導入して、ＳＭＤＦの活性を修飾することができる。ＳＭＤＦのＥＧＦ様ドメインでの除去は、ＳＭＤＦの生物活性をより有意に修飾する傾向が高いであろう。連続した除去の数は、影響を受けるドメインにおけるＳＭＤＦの三次構造、例えばβプリーツシートまたはαヘリックスを保存するように選択されるであろう。ＳＭＤＦ除去突然変異体の例は、EGF様ドメイン残基２８６−２９６末端が除去されたＳＭＤＦである。アミノ酸配列の挿入は、長さが１残基から１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合、ならびに単一もしくは複数アミノ酸残基の配列内挿入を包含する。配列内挿入（即ち、成熟ＳＭＤＦ配列内部への挿入）は一般に、約１ないし１０残基、より好ましくは１ないし５、最も好ましくは１ないし３残基の範囲であり得る。挿入は、好ましくは偶数の残基で行われるが、必ずしもそうでなくともよい。末端挿入の例には、組換え細胞培養中でのＳＭＤＦの直接発現の所産である、Ｎ末端メチオニン残基を有するＳＭＤＦが包含される。その他の挿入は、「キメラＳＭＤＦ」と表題のある、下記のＪ項に記載されている。変異体の第三の群はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、天然配列ＳＭＤＦ分子中の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発のための最も興味深い部位は、天然ＳＭＤＦの活性部位として同定される部位、および、既知の類似体中に見いだされるアミノ酸が側鎖のかさ、電荷、または疎水性の点で実質上異なっており、それでいて種々の動物のＳＭＤＦ種の中の選ばれた部位に高度の配列一致もまた存在し、または既知のニューレグリンおよびＳＭＤＦ中に見いだされるアミノ酸が側鎖のかさ、電荷、または疎水性の点で実質上異なっており、それでいて係るニューレグリンの様々な動物類似体の中の選ばれた部位に高度の配列一致もまた存在する部位を包含する。他の興味深い部位は、様々な種から得られるＳＭＤＦの特定の残基が全ＳＭＤＦ中で一致している部位であり、この一致の程度は、これらの蛋白に共通する生物活性の達成における重要性を示唆している。これらの部位、特に、少なくともあと３個、完全に保存されている部位を持つ配列の内部にある部位は、比較的保守的なやり方で置換される。このような同類置換は、第１表で、好ましい置換という項の下に示されている。もしこのような置換が生物活性の変化をもたらすならば、第１表中、例示的置換と称されている、またはアミノ酸クラスに関する下のさらなる記載のような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングする。天然配列ＳＭＤＦの機能または免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチドバックボーンの構造、例えばシートまたはらせんコンホメーションとしての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または、（ｃ）側鎖のかさ、の維持に及ぼすそれらの影響が有意に相違する置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づく群に分けられる： (1)疎水性：ノルロイシン、met、ala、Val、leu、ile； (2)中性親水性：cys、ser、thr； (3)酸性：asp、glu； (4)塩基性：asn、gln、his、lys、arg； (5)鎖の向きに影響する残基：gly、pro；および、 (6)芳香族：trp、tyr、phe。非同類置換は、これらのクラスのうち或るものの成員を別のものに交換することを必要とする。このような置換された残基もまた同類置換部位に導入することができ、または、より好ましくは、残っている（非保存的）部位に導入することができる。本発明の一つの態様において、当該分子に存在する１またはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を不活性化することが望ましい。これらの部位は、例えばトリプシンの場合にはアルギニンまたはリジン残基について、コードされているアミノ酸配列を調べることによって特定される。プロテアーゼ開裂部位が特定されたならば、標的とされる残基を別の残基、好ましくはグルタミンのような塩基性残基またはセリンのような疎水性残基で置換することにより；当該残基を除去することにより；または当該残基の直後にプロリン残基を挿入することにより、それらを蛋白分解的開裂に対して不活性となるようにする。別の態様においては、シグナル配列の開始メチオニン残基以外のメチオニン残基、または係る各メチオニン残基に対するＮまたはＣ末端の約３残基以内に位置する残基を、別の残基（好ましくは第１表に従う）により置換、または除去する。別法として、このような部位に隣接して約１−３の残基を挿入する。天然ＳＭＤＦの適正なコンホメーションの維持に関わっていないシステイン残基もまた、一般にセリンで置換して、当該分子の酸化的安定性を改善し且つ異常な架橋を防止することができる。代表的な置換は、ヒト（即ちｈＳＭＤＦ）ＳＭＤＦ［Ａ₁₂→Ｖ］、ｈＳＭＤＦ［Ｒ₄₇→Ｋ］、ｈＳＭＤＦ［Ｄ₁₀₁→Ｅ］、ｈＳＭＤＦ［Ｓ₁₄₉→Ｙ］、ｈＳＭＤＦ［Ｙ₁₀₆→Ａ］、ｈＳＭＤＦ［Ｖ₁₆₃→Ｌ］、ｈＳＭＤＦ［Ｎ₁₉₇→Ｑ］、ｈＳＭＤＦ［Ｖ₂₀₀→Ｌ］、ｈＳＭＤＦ［Ｖ₂₃₅→Ｔ］、ｈＳＭＤＦ［Ｅ₂₄₁→Ｑ］、ｈＳＭＤＦ［Ｆ₂₅₂→Ｙ］、ｈＳＭＤＦ［Ｋ₂₅₆→Ｒ］、ｈＳＭＤＦ［Ｅ₁₉₉→Ｄ］、ｈＳＭＤＦ［Ｑ₁₅₈→Ｎ］、ｈＳＭＤＦ［Ｔ₂₁₁→Ｓ］、ｈＳＭＤＦ［Ｅ₂→ Ｄ］、ｈＳＭＤＦ［Ａ₁₇₁→Ｖ］、ｈＳＭＤＦ［Ａ₁₈₈→Ｖ］、β型ＥＧＦ様ドメインをα型ＥＧＦ様ドメインに置換したｈＳＭＤＦ、およびβ型ＥＧＦ様ドメインをラットＮＤＦまたはＡＲＩＡのβ型ＥＧＦ様ドメインに置換したヒトＳＭＤＦを包含する。天然配列ＳＭＤＦのアミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は、当分野で知られる様々な方法によって製造される。これらの方法には、天然の供給源からの分離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド仲介（または位置指定）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および、先に製造された天然配列ＳＭＤＦの変異体または非変異体のカセット突然変異誘発による製造が包含されるが、これらに限定される訳ではない。オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発は、天然ＳＭＤＦＤＮＡの置換、除去および挿入変異体の製造のための好ましい方法である。この技術は、アーデルマン等、ＤＮＡ、２巻１８３頁（１９８３）に記載されるように、当分野で良く知られている。簡潔に述べると、天然ＳＭＤＦＤＮＡを、所望の突然変異をコードしているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型に対してハイブリダイズすることによって変化させるのであるが、ここでこの鋳型は、ＳＭＤＦの変化していないまたは天然ＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはバクテリオファージの一本鎖型である。ハイブリダイズの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の第二相補鎖全体を合成し、したがってこれは該オリゴヌクレオチドプライマーを取り込み、選択された変化を天然ＳＭＤＦＤＮＡにコードするであろう。一般に、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを使用する。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードしているヌクレオチドの両側に、鋳型と完全に相補的な１２ないし１５のヌクレオチドを有するであろう。この事により、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子と正しくハイブリダイズすることが保証される。このオリゴヌクレオチドは、クレア等、Proc.Natl.Acad.S ci.USA、７５巻５７６５頁（１９７８）に記載のような当分野で知られる技術を用いて容易に合成される。ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（入手し得る市販のＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが適当である）から誘導されるベクター、またはヴィエラ等、Meth.Enzymol.、１５３巻３頁（１９８７）に記載のような一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって作り出すことができる。即ち、突然変異させようとするＤＮＡをこれらのベクターの一つに挿入して一本鎖鋳型を作成する。一本鎖鋳型の製造は、サムブルック等、上記、の４．２１−４．４１項に記載されている。別法として、一本鎖ＤＮＡ鋳型は、標準技術を用いて二本鎖プラスミド（またはその他の）ＤＮＡを変性させることによって作成することもできる。天然ＤＮＡ配列を変化させるため（例えばアミノ酸配列変異体を作成するために）、オリゴヌクレオチドを適当なハイブリダイゼーション条件の下で一本鎖鋳型とハイブリダイズさせる。次に、ＤＮＡ重合酵素、通常ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを加えて、合成のためのプライマーとして該オリゴヌクレオチドを用いて鋳型の相補鎖を合成する。このようにして、ＤＮＡの一方の鎖はＳＭＤＦの突然変異型をコードし、他の鎖（元の鋳型）は天然の変化していないＳＭＤＦの配列をコードしているようなヘテロ二本鎖分子が形成される。次いでこのヘテロ二本鎖分子を適当な宿主細胞、通常Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０１のような原核生物中に導入する。細胞が増殖した後、これらをアガロース平板上で培養し、³²Ｐで放射標識したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングし、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを同定する。次いで、突然変異している領域を取り、蛋白産生のための適当なベクター、一般に適当な宿主の形質転換のために典型的に使用される型の発現ベクターに入れる。直前に記載した方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異を含む、ホモ二本鎖分子が作り出されるように改変することができる。この改変は以下の通りである：一本鎖オリゴヌクレオチドを上記のように一本鎖鋳型とアニーリングする。３種のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）、およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオ−デオキシリボシトシン（これはアマーシャム・コーポレーションから入手することができる）と合する。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に加える。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加すると、突然変異した塩基の外は鋳型と同一のＤＮＡ鎖が生成する。加えて、この新たなＤＮＡの鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、これは制限エンドヌクレアーゼ消化から防護する役割を有する。ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素で切り目を入れた後、鋳型鎖をＥｘｏ IIIヌクレアーゼまたは他の適当なヌクレアーゼを用いて、突然変異させようとする部位を含む領域を超えて消化することができる。次にこの反応を、分子が部分的にしか一本鎖になっていないまま停止させる。次いで、４種全てのデオキシリボヌクレオチド三燐酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガーゼの存在下にＤＮＡポリメラーゼを用いて、完全な二本鎖のＤＮＡホモ二本鎖を形成させる。次にこのホモ二本鎖分子を、上記のように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０１のような適当な宿主細胞中に導入することができる。１以上のアミノ酸が置換されている天然ＳＭＤＦ突然変異体をコードしているＤＮＡは、幾つかの方法のうち一つで生成させることができる。アミノ酸がポリペプチド鎖中接近して位置している場合は、所望のアミノ酸置換の全てをコードしている一つのオリゴヌクレオチドを用いてこれらを同時に突然変異させることができる。しかしながら、もしそのアミノ酸が互いに幾らかの距離をおいて位置している（約１０アミノ酸以上離れている）と、所望の変化の全てをコードしている１個のオリゴヌクレオチドを作成することは、より困難である。その代わりに、二つの別法のうち一つを利用することができる。第一の方法では、置換しようとする各アミノ酸のための別々のオリゴヌクレオチドを作成する。次いでそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングすると、その鋳型から合成される第二のＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換の全てをコードしているであろう。これに代わる方法は、所望の突然変異を産むための２回またはそれ以上の突然変異誘発を含むものである。第一回目は単一突然変異体について記載された通りである：野生型ＤＮＡを鋳型に使用し、第一の所望アミノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングし、するとヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。第二回目の突然変異誘発は、第一回目の突然変異誘発で作成された突然変異したＤＮＡを鋳型として利用する。即ち、この鋳型は既に１またはそれ以上の突然変異を含んでいる。そこで、さらなる所望のアミノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングし、得られたＤＮＡの鎖はその結果、第一および第二回目両方の突然変異誘発由来の突然変異をコードしていることになる。この得られたＤＮＡは第三回目の突然変異誘発で鋳型として使用することができ、以下同様である。ＰＣＲ突然変異誘発もまた天然配列ＳＭＤＦのアミノ酸変異体の作成に好適である。以下の記述はＤＮＡに関するものであるが、この技術はＲＮＡにも適用されることが理解できる。ＰＣＲ技術は一般に以下の方法を指す（アーリッヒ、上記、Ｒ．ヒグチによる章、６１−７０頁を参照されたい）：少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲでの出発物質として使用する時、鋳型ＤＮＡの対応領域と僅かに異なる配列のプライマーを用いて、そのプライマーが鋳型と相違している位置でのみ鋳型配列と異なっている比較的大量の特異的ＤＮＡフラグメントを生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中に突然変異を導入するためには、一方のプライマーは突然変異の位置に一部重複し且つその突然変異を含むように設計し；他方のプライマーの配列は、プラスミドの反対の鎖の配列一つながりと一致させねばならないが、この配列は該プラスミドＤＮＡのどこに位置してもよい。しかしながら、第二のプライマーの配列は、プライマーにより境界を与えられるＤＮＡの増幅された領域全体が最終的に容易に配列決定されるよう、第一プライマーの配列の２００ヌクレオチド以内に位置させるのが好ましい。今記載したようなプライマー対を用いるＰＣＲ増幅は、プライマーにより特定される突然変異の位置で、そして鋳型の複製は多少誤りが起こり易いのであるいはその他の位置で相違するＤＮＡフラグメントの集団を生成する。生成物に対する鋳型の比が極端に低い場合、生成物のＤＮＡフラグメントの大多数に所望の突然変異（群）が組み込まれる。この生成物は、標準的ＤＮＡ技術を用いて、ＰＣＲ鋳型として働いたプラスミド中の対応領域を置き換えるのに使用される。別々の位置にある突然変異は、突然変異体第二プライマーを使用することにより、または、異なる突然変異体プライマーによる第二のＰＣＲを行い、得られた二つのＰＣＲフラグメントを三部（またはそれ以上の）ライゲーションでベクターフラグメントに同時にライゲーションすることによって同時に導入することができる。ＰＣＲ突然変異誘発の特別な例においては、プラスミドＤＮＡの増幅される領域の外部に特異な認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼで消化することにより、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を線状化する。この物質から１００ｎｇを、４種のデオキシヌクレオチド三燐酸を含有しジーンアンプ（商標）キット（パーキン−エルマー・シータス、ノルウォーク、ＣＴおよびエメリーヴィル、ＣＡ、より入手）に含まれるＰＣＲ緩衝液、および各オリゴヌクレオチドプライマー２５ｐｍｏｌｅを含有するＰＣＲ混合物に加え、最終容量５０μｌとする。この反応混合物を鉱油３５μＬに積層する。反応混合物を１００℃で５分間変性させ、短時間氷上に置き、次いで鉱油層の下にサーマス・アクアティクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ（５単位／μＬ、パーキン−エルマー・シータスより購入）を添加する。次いでこの反応混合物を、以下のようにプログラムしたＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキン−エルマー・シータスより購入）中に入れる：５５℃２分間、７２℃３０秒間、次いで以下を１９サイクル：９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、そして７２℃３０秒間。このプログラムの終了時に反応バイアルをサーマルサイクラーから取り出し、水相を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０容量）で抽出し、そしてエタノール沈澱させ、ＤＮＡを標準法により回収する。この物質を、続いてベクターへの挿入のための適当な処理に付す。変異体を製造するためのもう一つの方法、カセット突然変異誘発は、ウェルズ等、Gene、３４巻３１５頁（１９８５）に記載の技術に基づく。出発物質は、突然変異させようとする天然ＳＭＤＦＤＮＡを含むプラスミド（またはその他のベクター）である。突然変異させる天然ＳＭＤＦＤＮＡ中のコドンを特定する。特定された突然変異部位の両側には特異な制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。このような制限部位が存在しない場合は、それらを天然ＳＭＤＦＤＮＡの適当な位置に導入するための上記オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発法を用いてそれらを作り出すことができる。制限部位がプラスミド中に導入された後、このプラスミドをこれらの部位で切断して線状化する。制限部位間のＤＮＡの配列をコードしており所望の突然変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドを標準法を用いて合成する。２本の鎖を別々に合成し、次いで標準技術を用いてハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと称する。このカセットは、プラスミドに直接ライゲーションできるよう、線状化されたプラスミドの末端と適合する３'および５'末端を有するよう設計される。その結果このプラスミドは突然変異したＳＭＤＦＤＮＡ配列を含むことになる。Ｃ．複製可能なベクターへの核酸の挿入ＳＭＤＦまたはＳＭＤＦ変異体をコードしている核酸（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクター中に挿入する。多くのベクターが利用可能であり、適当なベクターの選択は、１）それがＤＮＡ増幅に使用されるのかまたはＤＮＡ発現に使用されるのか、２）ベクター中に挿入される核酸の大きさ、および、３）ベクターにより形質転換される宿主細胞、に依存するであろう。各々のベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する宿主細胞に応じて様々な構成成分を含んでいる。ベクターの構成成分は一般に、１またはそれ以上の以下のもの：所望によるＮ末端シグナル配列、複製起点、１またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終止配列を含むが、これらに限定される訳ではない。 (i)シグナル配列成分本発明に係るＳＭＤＦは、直接的のみならず、ヘテロローガスなポリペプチド（これは好ましくはシグナル配列、または成熟蛋白もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的開裂部位を有する他のポリペプチドである）との融合ポリペプチドとしても発現され得る。しかし、いかなる一つの理論にも限定はされないが、ＳＭＤＦは内部疎水性シグナル配列を持っているらしいため、Ｎ末端シグナル配列の装備は任意のものである。一般に、シグナル配列はベクターの構成成分であってよく、またはこれは、ベクター中に挿入されるＳＭＤＦＤＮＡの一部であってよい。選ばれたヘテロローガスなシグナル配列は、宿主細胞によって認識され且つプロセシングされる（即ち、シグナルペプチダーゼにより開裂される）ものでなければならない。原核生物宿主細胞のためには、原核生物シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーより成る群から選ばれる。酵母の分泌のためには、酵母インベルターゼリーダー、酵母α因子リーダー（サッカロミセスおよびクルイヴェロミセスα因子リーダー。後者は１９９１年４月２３日登録の米国特許第５０１０１８２号に記載されている）、酵母酸ホスファターゼリーダー、マウス唾液アミラーゼリーダー、カルボキシペプチダーゼリーダー、酵母ＢＡＲ１リーダー、フミコラ・ラヌギノーサリパーゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ３６２１７９）、または１９９０年１１月１５日公開のＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルが利用できる。哺乳動物細胞の発現においては、所望ならばウイルス分泌リーダー（例えば単純ヘルペスｇＤシグナル）を使用することができる。このような前駆体領域のためのＤＮＡは、ＳＭＤＦをコードしているＤＮＡの読み取り枠にライゲーションする。 (ii)複製起点成分発現およびクローニングベクターの両者は、そのベクターを１またはそれ以上の選ばれた宿主細胞で複製できるようにする核酸配列を含んでいる。一般に、クローニングベクターにおいては、この配列は、そのベクターを宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製できるようにする配列であって、複製起点または自立的複製配列を含む。このような配列は様々な細菌、酵母、およびウイルスについて良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は殆どのグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、そして様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物の発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点は、それが初期プロモーターを含むという理由でのみ典型的に使用され得る）。殆どの発現ベクターは「シャトル」ベクターであり、即ちこれらは少なくとも一つのクラスの生物で複製可能であるが、発現のため別の生物中にトランスフェクトすることができる。例えば、或るベクターは大腸菌中でクローニングされ、次いでその同じベクターが、たとえそれが宿主細胞染色体と独立して複製できなくても、発現のため酵母または哺乳動物細胞中にトランスフェクトされる。ＤＮＡは宿主ゲノム中への挿入によって増幅することもできる。これは、バシルス種を宿主に用いて、例えば、バシルスゲノムＤＮＡ中に見いだされる配列に相補的なＤＮＡ配列を該ベクターに含ませることによって容易に達成される。このベクターによるバシルスのトランスフェクションは、ゲノムによるホモローガスな組換えおよびＳＭＤＦＤＮＡの挿入をもたらす。しかしながら、ＳＭＤＦをコードしているゲノムＤＮＡの回収は、ＳＭＤＦＤＮＡの切除に制限酵素消化を必要とするため、外因性複製ベクターの回収より複雑である。 (iii)選択遺伝子成分発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいなければならない。この遺伝子は、選択培養基中で生育する形質転換された宿主細胞の生存または生育に必要な蛋白をコードしている。選択遺伝子を含むベクターにより形質転換されなかった宿主細胞は、その培養基中で生き残らないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メソトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求的欠失を補完し、または（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給する、蛋白をコードしている（例えばバシルスのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子）。選択計画の一例は、宿主細胞の生育を停止させる薬物を利用する。ヘテロローガスな遺伝子によってうまく形質転換されている細胞は、薬物耐性を付与する蛋白を産生し、よって選択処方中で生き残る。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（サザン等、J.Molec.Appl.Genet.、１巻３２７頁［１９８２］）、ミコフェノール酸（ミュリガン等、Science、２０９巻１４２２頁［１９８０］）またはハイグロマイシン（サグデン等、Mol.Cell.Biol.、５巻４１０−４１３頁［１９８５］）を使用する。上に挙げた３つの例は、細菌遺伝子を真核生物の調節の下で使用して、それぞれ適当な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を伝達する。哺乳動物細胞のための好適な選択マーカーのもう一つの例は、ＳＭＤＦ核酸の取り込みに対してコンピテントな細胞の同定を可能にするマーカー、例えばＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼである。哺乳動物細胞形質転換体を、マーカーを取り込んだために形質転換体のみが特異に適合して生き残るという選択圧の下に置く。培地中の選択薬物の濃度を連続的に変化させる条件の下で形質転換体を培養することによって選択圧を課し、それにより選択遺伝子およびＳＭＤＦをコードしているＤＮＡの両者の増幅を導く。増幅は、それによって、生育に必須の蛋白の産生にとって極めて重要な遺伝子が、連続する世代の組換え細胞の染色体内部で縦に反復される工程である。増幅されたＤＮＡから、増加した量のＳＭＤＦが合成される。増幅可能な遺伝子の別の例は、メタロチオネインＩおよびII、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等を包含する。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子により形質転換された細胞を、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメソトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培地中で全形質転換体を培養することによってまず同定する。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適当な宿主細胞は、ウアラウプおよびチェイシン、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻４２１６頁（１９８０）による記載のように製造され増殖される、ＤＨＦＲ活性を欠失するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラインである。次にこの形質転換された細胞を、増強させたレベルのメソトレキサートに暴露する。これにより多数のＤＨＦＲ遺伝子のコピーの合成が導かれ、そして同時に、該発現ベクターを含む他のＤＮＡ、例えばＳＭＤＦをコードしているＤＮＡのコピーが多数合成される。この増幅技術は、例えばＭｔｘに対し高度に耐性な突然変異体ＤＨＦＲ遺伝子が使用されるならば、内因性ＤＨＦＲの存在にも拘わらず、他の点で好適な任意の宿主、例えばＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ６１ＣＨＯ−Ｋ１と共に利用することができる（ＥＰ１１７０６０）。別法として、ＳＭＤＦ、野生型ＤＨＦＲ蛋白、およびアミノグリコシド３−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような他の選択マーカーをコードしているＤＮＡ配列により形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）を、その選択マーカーに対する選択薬剤、例えばアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８を含有する培地中での細胞増殖によって選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照されたい。酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（スティンチコウム等、Nature、２８２巻３９頁［１９７９］；キングズマン等、Gene、７巻１４１頁［１９７９］；またはチェンパー等、 Gene、１０巻１５７頁［１９８０］）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で生育する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供する（ジョーンズ、Genetics、８５巻１２頁［１９７７］）。そうすると、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在が、トリプトファンの不在下で生育させることによる形質転換の検出のための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠失酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。さらに、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１から誘導されるベクターは、クルイヴェロミセス酵母の形質転換に使用することができる。ビアンチ等、Curr.Gen et.、１２巻１８５頁（１９８７）。より近年になって、組換え子牛キモシンの大規模生産のための発現系がＫ．ラクティスについて報告された。ヴァン・デン・バーグ、Bio/Technology、８巻１３５頁（１９９０）。クルイヴェロミセスの工業的菌株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピー発現ベクターもまた開示された。フリーア等、Bio/Technology、９巻９６８−９７５頁（１９９１）。 (iv)プロモーター成分発現およびクローニングベクターは通常、宿主生物により認識され且つＳＭＤＦ核酸と機能的に結合しているプロモーターを含んでいる。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（５'）に位置する（一般に約１００ないし１０００ｂｐ以内）翻訳されない配列であって、それらが機能的に結合している特定の核酸配列、例えばＳＭＤＦ核酸配列の転写および翻訳を調節する。このようなプロモーターは、典型的には二つのクラス、誘導性および構成性に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば或る栄養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答したそれらの調節の下で、ＤＮＡからの増強されたレベルの転写を開始するプロモーターである。現時点において、可能性ある様々な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが良く知られている。これらのプロモーターは、制限酵素消化によりそのプロモーターを供給源のＤＮＡから取り出し、この分離されたプロモーター配列をベクター中に挿入することにより、ＳＭＤＦコード化ＤＮＡと機能的に結合する。天然ＳＭＤＦプロモーター配列および多くのヘテロローガスなプロモーターはいずれもＳＭＤＦＤＮＡの直接的増幅および／または発現に使用することができる。しかしながら、ヘテロローガスなプロモーターは一般に、天然ＳＭＤＦプロモーターと比較して、組換えにより産生されるＳＭＤＦのより大量の転写および高い収量を可能にするため、これが好ましい。原核生物宿主と共に使用するのに好適なプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（チャング等、Nature、２７５巻６１５頁［１９７８］；およびゲッデル等、Nature、２８１巻５４４頁［１９７９］）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゲッデル、Nu cleic Acids Res.、８巻４０５７頁［１９８０］およびＥＰ３６７７６）およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター（デボーア等、Proc.Nat l.Acad.Sci.USA、８０巻２１−２５頁［１９８３］）が包含される。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターもまた好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、それによって当業者は、必要な制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを使用して、それらをＳＭＤＦをコードしているＤＮＡに機能的にライゲーションすることができる（ジーベンリスト等、Cell、２０巻２６９頁［１９８０］）。細菌系に使用するためのプロモーターはさらに、ＳＭＤＦをコードしているＤＮＡに機能的に結合したシャイン−ダルガルノ（S.D.）配列をも含んでいるであろう。真核生物のためのプロモーター配列が知られている。実際全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に位置するＡＴに富む領域を持っている。多くの遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見いだされるもう一つの配列は、ＣＸＣＡＡＴ領域（ここでＸは任意のヌクレオチドであってよい）である。殆どの真核生物遺伝子の３'末端には、コーディング配列の３'末端にポリＡ尾を付加するためのシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクター中に適切に挿入される。酵母宿主と共に使用するための好適なプロモーター配列の例は、３−ホスホグリセラートキナーゼ（ヒッツェマン等、J.Biol.Chem.、２５５巻２０７３頁［１９８０］）またはその他の解糖酵素（ヘス等、J.Adv.Enzyme Reg.、７巻１４９頁［１９６８］；およびホランド、Biochemistry、１７巻４９００頁［１９７８］）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−燐酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース燐酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのためのプロモーターを包含する。増殖条件により転写が調節されるというさらなる利点を有する誘導性プロモーターである、その他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を司る酵素のプロモーター領域である。酵母の発現で用いられる好適なベクターおよびプロモーターは、ヒッツェマン等、ＥＰ７３６５７にさらに記載されている。酵母のエンハンサーもまた酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのＳＭＤＦ転写は、プロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２２１１５０４）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥の肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、ヘテロローガスな哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱衝撃プロモーターから、そしてＳＭＤＦ配列に通常付随するプロモーターから得られるプロモーターによって調節される。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含むＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られる。フィアス等、Natu re、２７３巻１１３頁（１９７８）；ミュリガンおよびバーグ、Science、２０９巻１４２２−１４２７頁（１９８０）；パヴラキス等、Proc.Natl.Acad.Sci.U SA、７８巻７３９８−７４０２頁（１９８１）。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターは、ＨｉｎｄIII Ｅ制限フラグメントとして簡便に得られる。グリーナウェイ等、Gene、１８巻３５５−３６０頁（１９８２）。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１９７８号に記載されている。さらに、サルの細胞での免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡの発現に関するグレイ等、Nature、２９５巻５０３−５０８頁（１９８２）；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現に関するレイエス等、Nature、２９７巻５９８−６０１頁（１９８２）；培養されたマウスおよびウサギの細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現に関するキャナーニおよびバーグ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７９巻５１６６−５１７０頁（１９８２）；ならびに、プロモーターとしてラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列を用いた、ＣＶ−１サル腎臓細胞、鶏の胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現に関するゴーマン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７９巻６７７７ −６７８１頁（１９８２）を参照されたい。 (v)エンハンサー要素成分本発明に係るＳＭＤＦをコードしているＤＮＡの、高等真核生物による転写は、しばしばベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強される。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増強する、通常約１０ないし３００ｂｐの、ｃｉｓ作動要素のＤＮＡである。エンハンサーは相対的に、方向および位置に独立しており、転写ユニットの５'（ライミンズ等、Proc.Natl.A cad.Sci.USA、７８巻９９３頁［１９８１］）および３'（ラスキー等、Mol.Cell Bio.、３巻１１０８頁［１９８３］）、イントロン内部（バネルジ等、Cell、３３巻７２９頁［１９８３］）、ならびにコーディング配列自身の内部（オスボーン等、Mol.Cell Bio.、４巻１２９３頁［１９８４］）に、見いだされている。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインシュリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが包含される。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素についてのヤニヴ、Nature、２９７巻１７−１８頁（１９８２）もまた参照されたい。エンハンサーはＳＭＤＦコード化配列の５'または３'位でベクター中にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから５'部位に位置する。 (vi)転写終止成分真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、人間、または他の多細胞生物由来の有核細胞）に使用される発現ベクターはさらに、転写の終止およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含むであろう。このような配列は普通、真核生物のまたはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５'および時には３'非翻訳領域から取得することができる。これらの領域は、ＳＭＤＦをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含んでいる。 (vii)ベクターの組み立ておよび分析上に列挙された構成成分の１またはそれ以上を含む適当なベクターの組み立てには、標準的ライゲーション技術を使用する。分離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを開裂させ、整え、そして必要なプラスミドの生成のために望まれる型に再ライゲーションする。組み立てられたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＫ１２菌株２９４（ＡＴＣＣＮｏ．３１４４６）を形質転換し、成功した形質転換体を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、そして／またはメシング等、Nuclei c Acids Res.、９巻３０９頁（１９８１）の方法によって、またはマクサム等、 Methods in Enzymology、６５巻４９９頁（１９８０）の方法によって配列決定する。 (viii)一過性発現ベクター哺乳動物細胞においてＳＭＤＦをコードしているＤＮＡの一過性発現を提供する発現ベクターは、本発明の実施において特に有用である。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによりコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効率的に複製できる発現ベクターを使用することを含む。サムブルック等、上記、１６．１７−１６．２２頁。適当な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便な正の同定、および、所望の生物学的または生理学的性質についての係るポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。よって、一過性発現系は、生物学的に活性なＳＭＤＦである天然配列ＳＭＤＦの類似体および変異体を同定する目的のために本発明において特に有用である。 (ix)好適な例示的脊椎動物細胞ベクター組換え脊椎動物細胞培養でのＳＭＤＦの合成に当てはめるのに好適なその他の方法、ベクター、および宿主細胞は、ゲシング等、Nature、２９３巻６２０−６２５頁（１９８１）；マンテイ等、Nature、２８１巻４０−４６頁（１９７９）；ＥＰ１１７０６０；およびＥＰ１１７０５８に記載されている。ＳＭＤＦの哺乳動物細胞培養産生にとって特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ３０７２４７）またはｐＳＶＩ６Ｂ（１９９１年６月１３日公開のＷＯ９１／０８２９１号）である。ｐＲＫ５誘導体ｐＲＫ５Ｂ（ホルメス等、Science、２５３巻１２７８−１２８０頁［１９９１］）は、本発明においてこのような発現にとって特に好適である。Ｄ．宿主細胞の選択および形質転換本明細書に記載のベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、または上記の高等真核生物細胞である。この目的にとって適当な原核生物は、真性細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性菌、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばサルモネラ・ティフィムリウム、セラティア、例えばセラティア・マルセスキャンス、およびシゲラ、ならびにＢ．サブティリスおよびＢ．リチェニフォルミス（例えば１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に開示されるＢ．リチェニフォルミス４１Ｐ）のようなバシリ、Ｐ．アエルギノーサのようなシュードモナス、およびストレブトミセスを包含する。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主はＥ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α、およびＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のようなその他の菌株もまた適当である。これらの例は限定的ではなく例示的なものである。菌株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ産物発酵のための一般的な宿主菌株であるため、これが一つの特に好ましい宿主または親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最少量の蛋白分解酵素を分泌すべきである。例えば、菌株Ｗ３１１０は、宿主にとって内因性の蛋白をコードしている遺伝子に遺伝的突然変異が起こるように修飾することができ、そのような宿主の例には、完全な遺伝子型ｔｏｎＡ△を有するＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０菌株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ △ｐｔｒ３を有するＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０菌株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡ△Ｅ１５ △（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ △ｄｅｇＰ △ｏｍｐＴｋａｎ^rを有するＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０菌株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡ △Ｅ１５ △（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ △ｄｅｇＰ △ｏｍｐＴ △ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎ^rを有するＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０菌株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ除去突然変異を有する菌株３７Ｄ６である、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０菌株４０Ｂ４；および１９９０年８月７日登録の米国特許第４９４６７８３号に開示される、突然変異体ペリプラズムプロテアーゼを有する大腸菌株が包含される。別法として、インビトロのクローニング法、例えばＰＣＲまたはその他の核酸ポリメラーゼ反応もまた好適である。原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物は、ＳＭＤＦをコードしているベクターのための好適なクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアエ、またはパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかしながら、幾つかのその他の属、種、および菌株、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（ビーチおよびナース、Nature、２９０巻１４０頁［１９８１］；１９８５年５月２日公開のＥＰ１３９３８３）、クルイヴェロミセス宿主（米国特許第４９４３５２９号；フリーア等、上記）、例えばＫ．ラクティス（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；ルーヴェンコート等、J.Bacteriol.、７３７頁［１９８３］）、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウィッケラミイ（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ワルティイ（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ドゥロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６９０６；ヴァン・デン・バーグ等、上記）、Ｋ．サーモトレランス、およびＫ．マルクシアヌス；ヤロウィア（ＥＰ４０２２２６）、ピチア・パストリス（ＥＰ１８３０７０；スリークリシュナ等、J.Basic Microbio l.、２８巻２６５−２７８頁［１９８８］）；カンディダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（ケイス等、Proc.Natl. Acad.Sci.USA、７６巻５２５９−５２６３頁［１９７９］）；シュワニオミセス・オクシデンタリスのようなシュワニオミセス（１９９０年１０月３１日公開のＥＰ３９４５３８）；および糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラディウム（１９９１年１月１０日公開のＷＯ９１／００３５７）、およびアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニデュランス（バランス等、Biochem.Biophy s.Res.Commun.、１１２巻２８４−２８９頁［１９８３］；ティルバーン等、Gen e、２６巻２０５−２２１頁［１９８３］；イェルトン等、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、８１巻１４７０−１４７４頁［１９８４］）およびＡ．ニガー（ケリーおよびハインズ、EMBO J.、４巻４７５−４７９頁［１９８５］）もまた一般的に利用でき且つ本発明において有用である。ＳＭＤＦの産生のための好適な宿主細胞が、多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑なプロセシングおよびグリコシル化活動が可能である。原則として、脊椎動物または無脊椎動物培養由来の如何に拘わらず、任意の高等真核生物細胞培養が使用可能である。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が包含される。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびに、スポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蛾）、アエデス・アルボピクトゥス（蛾）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、およびボンビクス・モリのような宿主からの対応する受容可能な昆虫宿主細胞が特定されている。例えば、ラッコウ等、Bio/Technology、６巻４７−５５頁（１９８８）；ミラー等、Genetic Engineering、J.K.セットロウ等編、８巻(プレナム・パブリッシング、１９８６)、２７７−２７９頁；およびマエダ等、Nature 、３１５巻５９２−５９４頁(１９８５)を参照されたい。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ −１変異体およびボンビクス・モリＮＰＶのＢm−５株が広く入手可能であり、このようなウイルスは、本発明に従い本明細書に記載のウイルスとして、特にスポドブテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションに使用することができる。綿花、トウモロコシ、馬鈴薯、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコといった植物細胞培養を宿主として利用できる。典型的には、ＳＭＤＦＤＮＡを含むよう前もって操作しておいた細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの或る菌株と共にインキュベートすることにより、植物細胞をトランスフェクトする。Ａ．トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、この植物細胞宿主がトランスフェクトされるようにＳＭＤＦをコードしているＤＮＡがその植物細胞宿主に移され、そして適当な条件の下でＳＭＤＦＤＮＡを発現する。加えて、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞と適合し得る調節およびシグナル配列が利用できる。デピッカー等、J.Mol.Appl.Gen.、１巻５６１頁（１９８２）。さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化または増強することができる。１９８９年６月２１日公開のＥＰ３２１１９６。しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は、近年常套的手法となっている（ティシュー・カルチャー、アカデミック・プレス、クルースおよびパターソン編［１９７３］）。有用な哺乳動物宿主セルラインの例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１セルライン（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓ライン（２９３または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞。グラハム等、J.Gen Virol.、３６巻５９頁［１９７７］。）；ハムスター乳児腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ウアラウプおよびチェイシン、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻４２１６頁［１９８０］）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、マザー、Biol.Reprod. 、２３巻２４３−２５１頁［１９８０］）；サル腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（マザー等、Annals.N.Y.Acad.S ci.、３８３巻４４−６８頁［１９８２］）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌ライン（ＨｅｐＧ２）である。宿主細胞を本発明に係る上記の発現またはクローニングベクターでトランスフェクトし、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望配列をコードしている遺伝子の増幅のために適宜修飾した常套的栄養培地で培養する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、サムブルック等、上記、の１．８２項に記載される塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、または電気穿孔は、原核生物または実質的な細胞壁障壁を含むその他の細胞に対して一般的に使用される。シャウ等、Gene、２３巻３１５頁（１９８３）および１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されるように、アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、或る植物細胞の形質転換に使用される。さらに、１９９１年１月１０日公開のＷＯ９１／００３５８に記載のように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクトすることができる。このような細胞壁の無い哺乳動物細胞に対しては、グラハムおよびヴァン・デル・エプ、Virology、５２巻４５６−４５７頁（１９７８）の燐酸カルシウム沈澱法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的側面は、アクセルにより１９８３年８月１６日登録の米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母の形質転換は、典型的には、ヴァン・ゾーリンゲン等、J.Bact.、１３０巻９４６頁（１９７７）およびシャオ等、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、７６巻３８２９頁（１９７９）の方法に従って実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入するその他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、電気穿孔、無傷の細胞、またはポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた使用できる。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技術については、ケオウン等、Methods in Enzymology、１８５巻５２７− ５３７頁（１９９０）およびマンサー等、Nature、３３６巻３４８−３５２頁（１９８８）を参照されたい。Ｅ．宿主細胞の培養ＳＭＤＦまたはＳＭＤＦ変異体の産生に使用される原核細胞は、サムブルック等、上記、に一般的に記載される適当な培地で培養される。本発明に係るＳＭＤＦの産生に使用される哺乳動物宿主細胞は様々な培地で培養することができる。ハムのＦ−１０（シグマ）、Ｆ−１２（シグマ）、最少必須培地（［ＭＥＭ］、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、ダルベッコの改良イーグル培地（［Ｄ−ＭＥＭ］、シグマ）、およびＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（ジブコＢＲＬ）のような市販品が入手できる培地が、当該宿主細胞の培養に適している。さらに、例えばハムおよびワレス、Methods in Enzymology、５８巻４４頁（１９７９）；バーンズおよびサトー、Anal.Biochem.、１０２巻２５５頁（１９８０）；米国特許第４７６７７０４号；４６５７８６６号；４９２７７６２号；５１２２４６９号；もしくは４５６０６５５号；米国特許Ｒｅ．第３０９８５号；ＷＯ９０／０３４３０；またはＷＯ８７／００１９５に記載される任意の培地を当該宿主細胞のための培養基として使用することができる。これらの培地はいずれも、ホルモンおよび／またはその他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、アプロチニン、および／または表皮成長因子［ＥＧＦ］）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン（商標）薬）、微量元素（通常最終濃度がマイクロモルの範囲で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を、必要に応じて添加することができる。他に必要な添加物があればそれもまた、当業者により知られる適当な濃度で含有させることができる。温度、ｐＨ等といった培養条件は、発現のために選択された宿主細胞についてかつて用いられた条件であり、当業者には明らかであろう。一般に、インビトロ哺乳動物細胞培養の生産性を最大化するための原則、プロトコル、および実用技術は、ママリアン・セル・バイオテクノロジー：ア・プラクティカル・アプローチ、M.バトラー編（ＩＲＬプレス、１９９１）に見いだすことができる。本明細書中で言及される宿主細胞は、インビトロ培養中の細胞および宿主動物内にある細胞を包含する。Ｆ．遺伝子の増幅／発現の検出遺伝子の増幅および／または発現は、例えば、本明細書中に供される配列に基づき、適当に標識されたプローブを用いて、常套的サザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング（トマス、Proc.Natl.Acad .Sci.USA、７７巻５２０１−５２０５頁［１９８０］）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインシトゥハイブリダイゼーションによって直接試料中で測定することができる。様々な標識、最も一般的には放射性同位元素、特に³² Ｐが使用できる。しかしながら、ポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドの使用といったようなその他の技術を利用することもできる。次いでこのビオチンは、広範囲の標識、例えば放射性核種、蛍光剤、酵素等で標識することのできるアビジンまたは抗体への結合部位として働く。別法として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−蛋白二本鎖を包含する特異的二本鎖を認識できる抗体を使用することもできる。次いで、抗体を標識し、検定を実施することができるが、ここでこの二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在が検出できる。別法として、遺伝子の発現を、組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養または体液の検定といった免疫学的方法により測定して、遺伝子産物の発現を直接定量することもできる。免疫組織化学的染色技術では、典型的には脱水および固定により細胞試料を作成し、その後、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常、酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識等のような視覚的に検出できるものである。本発明における使用に好適な特に鋭敏な染色技術は、シュー等、Am.J.Clin.Path.、７５巻７３４−７３８頁（１９８０）に記載されている。試料液の免疫組織化学的染色および／または検定に有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであってよく、任意の哺乳動物で作製することができる。簡便には、この抗体は、下の第７項にさらに記載されるように、天然配列ＳＭＤＦポリペプチドに対して、または本明細書に供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して作製することができる。Ｇ．ＳＭＤＦポリペプチドの精製ＳＭＤＦは、好ましくは分泌されたポリペプチドとして培養基から回収されるが、宿主細胞溶菌液から回収することもできる。ＳＭＤＦがヒト起源以外の組換え細胞で発現される場合、このＳＭＤＦは、ヒト起源の蛋白またはポリペプチドを全く含んでいない。しかしながら、ＳＭＤＦに関して実質上均質な製品を得るためには、ＳＭＤＦを細胞蛋白またはポリペプチドから精製することが必要である。第一段階として、例えば遠心または限外濾過によって粒状の細胞残屑、宿主細胞または溶菌されたフラグメントを除去する。所望により、市販品を入手し得る蛋白濃縮フィルターで蛋白を濃縮し、その後このＳＭＤＦを、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、免疫親和クロマトグラフィー、イオン交換カラム分画（例えばＤＥＡＥまたはカルボキシメチルもしくはスルホプロピル基を含むマトリックスによる）ブルーセファロース、ＣＭブルーセファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンズマメレクチン−セファロース、ＷＧＡセファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、エーテルトヨパール、ブチルトヨパール、フェニルトヨパール、もしくはプロテインＡセファロース上のクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（例えば脂肪族基を付加させたシリカゲル）、例えばセファデックス分子篩またはサイズ排除クロマトグラフィーを用いるゲル濾過、ＳＭＤＦと選択的に結合するカラム上でのクロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈澱、から選択される１またはそれ以上の工程により、他の不純物から分離する。蛋白分解を阻害するために、プロテアーゼインヒビターを前記工程のいずれかに使用することができ、また、偶発的汚染物質の成長を防止するため、抗生物質を含有させることができる。好適なプロテアーゼインヒビターの例には、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニン、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド−ベスタチン、キモスタチン、およびベンズアミジンが包含される。残基が除去され、挿入され、または置換されたＳＭＤＦ変異体は、その変異により惹起された実質的な性質の変化を考慮に入れて、天然配列ＳＭＤＦと同じ様式で回収される。例えば、タグポリペプチド、例えば細菌またはウイルス抗原とのＳＭＤＦ融合物の製造は、その融合ポリペプチドを吸着する抗原に対する抗体を含む免疫親和カラムを使用する精製を促進する。ウサギポリクローナル抗ＳＭＤＦカラムのような免疫親和カラムを使用して、少なくとも１個の残存している免疫エピトープとＳＭＤＦ変異体を結合させることにより、ＳＭＤＦ変異体を吸収することができる。当業者には、天然配列ＳＭＤＦに好適な精製法は、組換え細胞培養中での産生時のＳＭＤＦまたはその変異体の性質の変化を説明できる修飾が必要となり得るという事が理解できるであろう。Ｈ．ＳＭＤＦポリペプチドの共有結合的修飾ＳＭＤＦポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に包含される。天然配列ＳＭＤＦおよびそのアミノ酸配列変異体の両者は共有結合的に修飾することができる。本発明の範囲内に包含される共有結合的修飾の一つの型は、ＳＭＤＦフラグメントの製造である。約４０までのアミノ酸残基を有するＳＭＤＦフラグメントは、化学合成または全長のもしくは変異体のＳＭＤＦポリペプチドの酵素的または化学的開裂によって簡便に製造することができる。ＳＭＤＦもしくはそのフラグメントの共有結合的修飾の別の型は、ＳＭＤＦもしくはそのフラグメントの標的アミノ酸残基を、選ばれた側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応できる有機誘導体形成試薬と反応させることによって、当該分子中に導入される。システイン残基は、最も一般的にはα−ハロアセタート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾアート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールとの反応により、誘導体化される。ヒスチジン残基はｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボナートとの反応により誘導体化されるが、これは、この試薬がヒスチジン側鎖に対し相対的に特異的であるためである。ｐ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、この反応は好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中ｐＨ６．０で実施する。リジンおよびアミノ末端残基は無水琥珀酸またはその他のカルボン酸無水物と反応する。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リジン残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の好適な試薬は、イミドエステル類、例えばメチルピコリンイミダート、燐酸ピリドキサル、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２,４−ペンタンジオン、およびグリオキシラートを用いたトランスアミナーゼにより触媒される反応を包含する。アルギニン残基は１または数種の常套的試薬との反応により修飾され、それらの中にはフェニルグリオキサル、２,３−ブタンジオン、１,２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫ_aのため、反応をアルカリ条件で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、アルギニンのε−アミノ基と同時にリジンの基とも反応するかも知れない。チロシン残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基へのスペクトル標識の導入に特段の興味を伴って行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体が形成される。チロシン残基は、ラジオイムノアッセイに使用するための標識化蛋白を製造するために¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉを用いてヨウ素化され、上記のクロラミンＴ法が適当である。カルボキシ側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ− Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ'）［式中、ＲおよびＲ'は異なるアルキル基である］、例えば１ −シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４,４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により、選択的に修飾される。さらに、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基はアンモニウムイオンとの反応により、アスパラギンおよびグルタミン残基に変換される。二価の試薬による誘導体形成は、抗ＳＭＤＦ抗体の精製のための方法で使用するための、水不溶性支持体マトリックスまたは表面へのＳＭＤＦの架橋にとって有用であり、逆もまた同様である。一般的に用いられる架橋剤は、例えば１,１ −ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３,３'−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）のようなジスクシンイミジルエステル類を包含するホモ二価イミドエステル類、およびビス−Ｎ− マレイミド−１,８−オクタンのような二価マレイミド類を包含する。メチル− ３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体形成試薬は、光の存在下で架橋を形成することのできる光活性化中間体を生成する。別法として、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性水不溶性マトリックスおよび米国特許第３９６９２８７号；３６９１０１６号；４１９５１２８号；４２４７６４２号；４２２９５３７号；および４３３０４４０号に記載の反応性基質が、蛋白の固定化に使用される。グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば、各々対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基に脱アミド化される。これらの残基は中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化型は本発明の範囲内にある。その他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（T.E.クレイトン、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパティーズ、W.H.フリーマン・アンド・Ｃｏ．、サンフランシスコ、７９−８６頁［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシ基のアミド化が包含される。本発明の範囲に包含されるＳＭＤＦポリペプチドの共有結合的修飾のもう一つの型は、該ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。変更とは、天然配列ＳＭＤＦ中に見いだされる１またはそれ以上の炭水化物部分を除去し、そして／または天然配列ＳＭＤＦに存在しない１またはそれ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはＮ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン［ここでＸは、プロリン以外の任意のアミノ酸である］が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在すると、可能性あるグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合グリコシル化とは、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの一つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに結合することを指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが使われることもある。ＳＭＤＦポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が、上記トリペプチド配列の１またはそれ以上を含むよう、該アミノ酸配列を変化させることにより、簡便に達成される（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。この変化は、天然配列ＳＭＤＦ配列への１またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはそれらによる置換によっても行うことができる（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。容易にするためには、天然ＳＭＤＦアミノ酸配列は、好ましくはＤＮＡレベルでの変化によって、特に、天然配列ＳＭＤＦポリペプチドをコードしているＤＮＡを、所望アミノ酸に翻訳されるようなコドンが生成するように、前もって選択された塩基の位置で突然変異させることによって変化させる。このＤＮＡ突然変異は、上の２Ｂ項に記載された方法を用いて行うことができる。ＳＭＤＦポリペプチド上の炭水化物部分の数を増す、もう一つの手段は、該ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的結合によるものである。これらの方法は、ＮまたはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞中で該ポリペプチドを産生させる必要が無いという点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシ基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシ基、例えばセリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシ基、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０、およびアプリンおよびリストン、CRC Crit.Rev.Biochem .、２５９−３０６頁（１９８１）に記載されている。ＳＭＤＦポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成できる。化学的脱グリコシル化は、該ポリペプチドを、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物に暴露させる必要がある。この処理は、該ポリペプチドを無傷のまま残しつつ、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の殆どまたは全ての糖の開裂をもたらす。化学的脱グリコシル化は、ハキムディン等、Arch.Biochem.Biophys.、２５９巻５２頁（１９８７）およびエッジ等、Anal.Biochem.、１１８巻１３１頁（１９８１）に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、ソタクラ等、Meth.Enzymol.，１３８巻３５０頁（１９８７）に記載のような様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。可能性あるグリコシル化部位でのグリコシル化は、ダスキン等、J.Biol.Chem. 、２５７巻３１０５頁（１９８２）に記載されるように化合物ツニカマイシンの使用によって防止することができる。ツニカマイシンは、蛋白−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。ＳＭＤＦの共有結合的修飾のもう一つの型は、米国特許第４６４０８３５号；４４９６６８９号；４３０１１４４号；４６７０４１７号；４７９１１９２号または４１７９３３７号に開示される方法で、ＳＭＤＦポリペプチドを、様々な非蛋白性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン類のうちの一つに結合させることを含む。ＳＭＤＦはさらに、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって製造されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ［メチルメタクリラート］マイクロカプセル）に、コロイド薬物デリバリー系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに捕捉することができる。このような技術はレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、１６版、A.オスロ編（１９８０）に開示されている。Ｉ．生物活性ＳＭＤＦ変異体のためのスクリーニングアミノ酸配列変異体および共有結合変異体が作成されたならば、生物学的にそして／または抗原的に活性である分子についてスクリーニングするのが常法である。本明細書に開示される競合型イムノアッセイは、その変異体が天然配列ＳＭＤＦ（即ち抗原的に活性なＳＭＤＦ）に対して作製された抗体と交差反応できるか否かを決定するために使用することができる。生物活性ＳＭＤＦ変異体についてスクリーニングするための二つの常套的検定を下に記載する。酸化還元または熱安定性、疎水性、蛋白分解的減成の受け易さ、または担体とのもしくは多量体への凝集傾向といったような蛋白またはポリペプチドの性質のその他の可能性ある修飾は、当分野で良く知られる方法によって検定される。（ｉ）ｅｒｂＢレセプターＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡこの検定は、ＳＭＤＦ変異体がｅｒｂＢレセプターを活性化する能力を定性的および定量的に測定するために有用である。以下の記述はｅｒｂＢレセプターについて言及しているが、ＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡは、容易に改変して、選択されたＳＭＤＦ変異体によるｅｒｂＢ３またはｅｒｂＢ４レセプターの活性化を分析することができる。ポリクローナル抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２分子の細胞外ドメインで免疫したニュージーランドホワイト家兎由来のプールされた免疫血清から分離する（フェンドゥリー等、Journal of Biological Response Modifiers、９巻４４９−４５５頁［１９９０］）。ｒＨＥＲ２ＥＣＤ特異抗体を、アビドゲルＦにコンジュゲートさせたｒＨＥＲ２ＥＣＤから作成した親和カラムで、ＦＰＬＣ（ファルマシア・バイオテク、Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いて親和精製する。燐酸緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中の得られた精製抗体保存液を− ２０℃で保存する。モノクローナル抗ホスホチロシン、クローン４Ｇ１０はアプステイト・バイオロジカルズ、Ｉｎｃ（ＵＢＩ、レイクプラシッド、ＮＹ）より購入し、長腕ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ビオチン−Ｘ−ＮＨＳ、リサーチ・オーガニクス、クリーヴランド、ＯＨ）を用いてビオチニル化することができる。上記のようにＳＭＤＦを製造しそして均質となるまで精製し、例えばトリス／ＨＣｌ、Ｈ７．５中の保存溶液として４℃で保存する。ヒト乳腺癌から分離される関連セルラインＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ２２）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ）から入手できる。ＭＣＦ−７細胞は、測定可能レベルのｐ１８５^HER2、ｐ１８５^HER3およびｐ１８５^HER4を産生することが示されている。この細胞を組織培養フラスコ（コーニング・Ｉｎｃ．、コーニング、ＮＹ）中に維持し、６０％ないし７５％密集の細胞密度の時点で利用する。細胞はＦ１２／ＤＭＥＭ５０：５０（ジブコ／ＢＲＬ、ライフ・テクノロジーズ、グランド・アイランド、ＮＹ）中で生育させることができる。培地中のＭＣＦ−７細胞を、平底９６ウェル培養プレートの各ウェルに加え、５％ＣＯ₂中３７℃で一夜培養する。翌朝ウェルの上清をデカンテーションし、プレートをペーパータオル上で軽く突き固める。次に、培養基（対照）、天然配列ＳＭＤＦまたは変異体ＳＭＤＦのいずれかを含有する培地を各ウェルに加える。この細胞を３７℃で約３０分間刺激し、ウェルの上清をデカンテーションし、そしてプレートを再度ペーパータオル上で軽く突き固める。細胞を溶菌しレセプターを可溶化するため、溶菌緩衝液１００μｌを各ウェルに加える。溶菌緩衝液は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ジブコ）、０．５％トリトン−Ｘ１００（ジブコ）、０．０１％チメロサール、３０ＫＩＵ／ｍｌアプロチニン（ＩＣＮバイオケミカルズ、オーロラ、ＯＨ）、１ｍＭ４−（２ −アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド（ＡＥＢＳＦ；ＩＣＮバイオケミカルズ）、５０μＭロイペプチン（ＩＣＮバイオケミカルズ）、および２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ₃ＶＯ₄、シグマ・ケミカル・Ｃｏ．、セントルイス、ＭＯ）、ｐＨ７．５、を含有する１５０ｍＭＮａＣｌで構成される。次にこのプレートを、室温で６０分間プレート振盪機（ベルコ・インストゥルメンツ、ヴァインランド、ＮＪ）上で穏やかに振盪する。細胞が可溶化される間に、親和精製されたポリクローナル抗ＨＥＲ２ＥＣＤ（炭酸緩衝液中ｐＨ９．６、１００μｌ／ウェル）で４℃で一夜被覆されたＥＬＩＳＡ微量定量プレート（ナンク・マキシソープ、インター・メド、デンマーク）をデカンテーションし、ペーパータオル上で突き固め、ブロック・バッファー［０．５％ＢＳＡ（インタージェン・カンパニー、パーチェス、ＮＹ）および０．０１％チメロサールを含有するＰＢＳ］１５０μｌ／ウェルで、穏やかに振盪しながら室温で６０分間ブロックする。６０分後、抗ＨＥＲ２被覆されたプレートを自動プレート洗浄器（スキャンウォッシャー３００、スキャトロン・インストゥルメンツ、Ｉｎｃ．、スターリング、ＶＡ）を使用し洗浄緩衝液（０．０５％トゥイーン２０および０．０１％チメロサールを含有するＰＢＳ）で６回洗浄する。細胞培養の微量定量プレートからの可溶化ｐ１８５^HER2を含有する溶菌液を、抗ｒＨＥＲ２被覆されブロックされたＥＬＩＳＡウェルに移し（８５μｌ／ウェル）、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートする。洗浄緩衝液で洗浄することにより非結合レセプターを除去し、そして、希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％トゥイーン２０、５ｍＭＥＤＴＡ、および０．０１％チメロサールを含有するＰＢＳ）中のビオチニル化４Ｇ１０（抗ホスホチロシン抗体）１００μｌを各ウェルに加える。室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、そして希釈緩衝液中のＨＲＰＯコンジュゲート化ストレプトアビジン（ザイムド・ラボラトリーズ、Ｓ．サンフランシスコ、ＣＡ）１００μｌを各ウェルに加える。プレートを穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。遊離のアビジンコンジュゲートを洗浄除去し、新たに調製した基質溶液（テトラメチルベンジジン［ＴＭＢ］；２−成分基質キット；カークガード・アンド・ペリー、ガイサーズバーグ、ＭＤ）１００μｌを各ウェルに加える。反応を１０分間進行させ、その後１００μｌ／ウェルの１．０ＭＨ₃ＰＯ₄の添加により発色を停止させる。マッキントッシュ・セントリス６５０（アップル・コンピューターズ、クパティーノ、ＣＡ）およびデルタソフトのソフトウェア（バイオメタリクス、Ｉｎｃ．、プリンストン、ＮＪ）で制御されるｖｍａｘプレート読み取り機（モレキュラー・ディヴァイシズ、パロアルト、ＣＡ）を使用して、４５０ｎｍの吸収を対照波長６５０ｎｍで読み取る（ＡＢＳ_450/650）。このように、変異体ＳＭＤＦにより誘導されるｅｒｂＢレセプターの自己燐酸化の程度を、天然配列ＳＭＤＦおよび対照（恐らくは活性化が無い）により誘導されるそれと比較することができる。したがって、ｅｒｂＢレセプターを活性化する生物学的性質を有する変異体を、常套的に同定することができる。 (ii)グリア細胞増殖検定生物活性な変異体についてスクリーニングするため、以下の検定（所望により上記のＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡと組み合わせる）が利用できる。２日齢ラットの坐骨神経から分離されたラットシュワン細胞を、夾雑する線維芽細胞およびその他の細胞を含まないよう精製し［ブロックス等、Brain Res.、１６５巻１０５−１１８頁（１９７９）］、３ｎＭｒＨＲＧβ１の存在下で増殖させる（ホルメス等、上記）。この細胞を、シュワン細胞表面マーカーＰ７５^NGFR の抗体染色により、シュワン細胞と確認する［ブロックス等、Nature、２６６巻３６４−３６６頁（１９７７）］。密集培養をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、そしてインシュリン、トランスフェリン、および微量元素を添加した無血清トランスフェクション培養基を入れた２４ウェルプレートに３．７ｘ１０⁴細胞／ウェルで蒔く。２個ずつのウェルをＳＭＤＦ変異体、天然配列ＳＭＤＦまたは対照（例えば無血清培地のみ）で処理する。５日後、シュワン細胞の増殖を、密集の程度を顕微鏡で調べることにより定量する。したがって、上記ＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡ検定と同様にして、細胞培養中でグリア細胞の分裂促進を刺激する天然配列ＳＭＤＦの生物活性を共有するＳＭＤＦ変異体を同定することが可能である。Ｊ．キメラＳＭＤＦこの出願は、別のポリペプチドと融合したＳＭＤＦを含むキメラポリペプチドを包含する。キメラＳＭＤＦポリペプチドは、天然配列ＳＭＤＦのＮまたはＣ末端への、免疫原性ポリペプチド、例えばβ−ラクタマーゼまたは大腸菌ｔｒｐ遺伝子座によりコードされている酵素のような細菌ポリペプチド、または酵母蛋白の融合、および、１９８９年４月６日公開のＷＯ８９／０２９２２に記載のようなアルブミン、またはフェリチンのような蛋白とのＣ末端融合を包含する。好ましい態様において、キメラポリペプチドは、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＳＭＤＦ（またはそのフラグメント）との融合を含む。エピトープタグは一般に、ＳＭＤＦのアミノまたはカルボキシ末端にあることが判明している。その存在は、タグポリペプチドに対する標識化抗体を用いて検出できるため、このようなエピトープタグが付けられた形のＳＭＤＦが望ましい。また、エピトープタグの供給は、抗タグ抗体を使用する親和精製によりＳＭＤＦが容易に精製されることを可能にする。抗体を含む親和精製技術および診断検定は、本明細書中、後に記載されている。タグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は当分野で良く知られている。例には、ｆｌｕＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（フィールド等、Mol.Cell.Biol.、８巻２１５９−２１６５頁［１９８８］）；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（エヴァン等、Molecular and Cellular Biology、５（１２）巻３６１０− ３６１６頁［１９８５］）；ならびに単純ヘルペスウイルス糖蛋白Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（パボルスキー等、Protein Engineering、３（６）巻５４７ −５５３頁［１９９０］）が包含される。その他のタグポリペプチドが開示されている。例には、フラッグ−ペプチド（ホップ等、BioTechnology、６巻１２０４−１２１０頁［１９８８］）；ＫＴ３エピトープペプチド（マーティン等、Sc ience、２５５巻１９２−１９４頁［１９９２］）；α−チューブリンエピトープペプチド（スキナー等、J.Biol.Chem.、２６６巻１５１６３−１５１６６頁［１９９１］）；およびＴ７遺伝子１０蛋白ペプチドタグ（ルッツ−フレイヤームス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８７巻６３９３−６３９７頁［１９９０］）が包含される。タグポリペプチドが選択されたならば、それに対する抗体は本明細書に開示される技術を用いて作製することができる。キメラＳＭＤＦはまた、天然ＳＭＤＦよりも長い半減期を有する免疫アドヘシンをも含み得る。ヘテロローガスな免疫グロブリン不変ドメイン配列に連結したポリペプチドから組み立てられる免疫アドヘシンは、当分野で知られている。最も単純且つ最も直接的な免疫アドヘシンの設計は、ＳＭＤＦを免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域およびヒンジと結合させている。通常、本発明に係るＳＭＤＦ −免疫グロブリンキメラを作成する場合、ＳＭＤＦをコードしている核酸またはそのフラグメントを、免疫グロブリン不変ドメイン配列のＮ末端をコードしている核酸にＣ末端的に融合させるが、Ｎ末端融合もまた可能である。典型的にはこのような融合において、コードされているキメラポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリン重鎖の不変領域の機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持しているであろう。融合は、不変ドメインのＦｃ部分のＣ末端に、または重鎖のＣＨ１のＮ末端に直接、もしくは軽鎖の対応領域にも施される。キメラＳＭＤＦの組み立ておよび生成のために好適な一般法は、（天然配列または変異体）ＳＭＤＦに関して上に開示された方法と同じである。キメラＳＭＤＦは、ＳＭＤＦ部分をフレーム内にコードしているｃＤＮＡ配列を、例えばタグポリペプチドまたは免疫グロブリンＤＮＡ配列に融合させ、得られたＤＮＡ融合組み立て物を適当な宿主細胞で発現させることにより、最も簡便に組み立てられる。エピトープタグを付けたＳＭＤＦは、抗タグ抗体を用いる親和クロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。ヒト免疫アドヘシンのためには、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列が好ましい。ＩｇＧ１を使用する主たる利点は、ＩｇＧ１免疫アドヘシンは固定化されたプロテインＡ上で効率的に精製され得ることである。対照的に、ＩｇＧ３の精製は、有意に用途のより少ない媒質であるプロテインＧを必要とする。本発明により包含されるキメラＳＭＤＦのもう一つの型は、次の項に記載されるような毒性ポリペプチドとコンジュゲートさせたＳＭＤＦである。３．ＳＭＤＦの治療用組成物および投与ＳＭＤＦポリペプチドは、神経系に関連する病理学的疾患、通常、神経変性疾患（即ち、患者の神経組織の脱髄、損傷および／または喪失を特徴とする）および特に感覚および運動ニューロンを含む疾患のインビボ処置のための薬物として用途が見いだせると信じられる。したがって、ＳＭＤＦポリペプチドは、神経の再生および／または修復の誘導のために使用することができる。これに代わり、ＳＭＤＦをコードしているｃＤＮＡは、このような状態の遺伝子治療に使用することができる。ＳＭＤＦを使用して処置または緩解され得る感覚ニューロンを含む疾患の例は、感覚ニューロパチー、例えば糖尿病性ニューロパチーおよび薬物誘発感覚ニューロパチー（例えば化学療法に起因する）を包含する。ＳＭＤＦはさらに、運動ニューロンを含む疾病状態、即ち、脊髄の前角細胞、運動脳神経核および錐体路の変性を特徴とする疾病状態の処置にも使用することができる。このような疾病状態の例には、痙縮および反射亢進を伴う筋肉の脱力および萎縮を含む症候群である、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはルー・ゲーリッヒ病が包含される。ＡＬＳは、脊髄、延髄、および皮質の運動ニューロンの変性により惹起される。延髄の運動脳神経核の細胞のみが含まれれるならば、その状態は進行性球麻痺と呼ばれる。ＳＭＤＦはさらに、遺伝的に連鎖した運動ニューロン疾患（例えばパーキンソン病）、非対称性運動ニューロパチー、進行性筋萎縮、およびグリア細胞の脱髄、損傷または喪失を含む状態（例えば多発性硬化症）を包含する運動ニューロンのその他の疾患の処置にも使用できる。ＳＭＤＦはさらに、末梢神経の損傷（例えば、巨大軸索ニューロパチー、遺伝性肥厚性感覚ニューロパチー、および感覚ニューロパチー）、らい性ニューロパチー、ランドリー−ギラン・バレー症候群、および癌腫または毒物により惹起されるニューロパチーの処置に治療的用途が見いだせると信じられている。幾つかの態様において、ｅｒｂＢレセプターの過剰発現を特徴とする癌腫を、細胞毒性物質を癌組織に指向させるＳＭＤＦを用いて処置することが望ましいかも知れない。ＳＭＤＦとコンジュゲートさせることのできる「細胞毒性物質」の例には、細胞毒性薬物および放射性分子が包含される。例えば、細胞毒性物質は、細菌または植物を起源とする酵素的に活性な毒素またはそのフラグメント（例えば、ジフテリアＡ鎖、エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、フィトラッカ・アメリカーナ蛋白、クルシン、クロチン、ゲロニンおよびアブリンＡ鎖）から選択することができる。これに代わり、細胞毒性放射性薬物を、高い線エネルギー付与（ＬＥＴ）で放射するアイソトープ（例えばＹ、Ｐｒ）をＳＭＤＦにコンジュゲートすることによって作成することもできる。ＳＭＤＦの治療用調合物は、所望の純度を有するＳＭＤＦを、所望による生理学上許容し得る担体、賦形剤、または安定剤（レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、１６版、A.オソール編［１９８０］）と混合して凍結乾燥ケークまたは水溶液の形とすることにより、保存用に製造される。薬学上許容し得る担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度において受容者にとって非毒性であり、燐酸、クエン酸、およびその他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を包含する抗酸化剤；低分子量（１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを包含する単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート試薬；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／またはトゥイーン、プルロニクス、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を包含する。インビボ投与に使用されるＳＭＤＦは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に無菌濾過膜で濾過することにより、容易に達成される。ＳＭＤＦは通常凍結乾燥型または溶液で保存されるであろう。治療用ＳＭＤＦ組成物は一般に、無菌取り出し口を有する容器、例えば静脈内溶液バッグまたは皮下注射針が貫通し得る栓を有するバイアル中に入れる。ＳＭＤＦの投与経路は既知の方法、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、もしくは病変内経路による注射または注入、または下記のような持続放出系による方法に従う。ＳＭＤＦは、注入によって持続的にまたはボーラス注射によって投与される。持続放出製剤の好適な例には、蛋白を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが包含され、このマトリックスは、成型された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ランガー等、J.Biomed.Mater.Res.、１５巻１６７−２７７頁［１９８１］およびランガー、Chem.Tech.、１２巻９８−１０５頁［１９８２］により記載されるポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー（シドマン等、Biopolymers、２２巻５４７−５５６頁［１９８３］）、非分解性エチレンビニルアセタート（ランガー等、上記）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばルプロンデポ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドより成る注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８）が包含される。エチレン−ビニルアセタートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは分子を１００日間にわたり放出させることが可能であるが、或る種のヒドロゲル類は蛋白をより短期間放出する。カプセル化された蛋白が体内に長時間とどまる時、それらは３７℃で水分にさらされる結果、変性または凝集して、生物活性の喪失および免疫原性の変化の可能性を招き得る。関係する機構に応じた蛋白安定化のための合理的な方法を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されたならば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分を調節し、適当な添加剤を使用し、そして特異的ポリマーマトリックス組成物を開発することにより、安定化を達成することができる。持続放出ＳＭＤＦ組成物は、リポソームにより捕捉されたＳＭＤＦをも包含する。ＳＭＤＦを含有するリポソームは、自体既知の方法によって製造される：ＤＥ３２１８１２１；エプシュタイン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８２巻３６８８−３６９２頁（１９８５）；ファング等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻４０３０−４０３４頁（１９８０）；ＥＰ５２３２２；ＥＰ３６６７６；ＥＰ８８０４６；ＥＰ１４３９４９；ＥＰ１４２６４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４４８５０４５号および４５４４５４５号；ならびにＥＰ１０２３２４。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０ｍｏｌ％コレステロール以上である、小さな（約２００−８００オングストローム）単層型のものであり、選択される比率は最適なＳＭＤＦ療法のために調節される。治療に使用されるＳＭＤＦの有効量は、例えば治療目的、投与経路、および患者の状態に依存するであろう。したがって治療者は、最適の治療効果の獲得に必要な用量を滴定し投与経路を修飾する必要があるであろう。典型的な日用量は、１日当たり約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）までの範囲またはこれ以上、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日となろう。典型的には、臨床医は、上記疾患の処置のための所望の効果が達成される用量に達するまでＳＭＤＦを投与するであろう。４．ＳＭＤＦのエクスビボ用途ＳＭＤＦポリペプチドは、エクスビボでグリア細胞を生育させるために使用することができる。細胞特異性因子、例えばシュワン細胞特異的マーカーであるＰ７５^NGFRの分離のためには、細胞培養中のグリア細胞の集団を得ることが望ましい。このような因子は診断手段として有用であり、または、Ｐ７５^NGFRの場合、診断用途のための抗体を作製させる抗原として使用することができる。さらに、他のマイトジェンおよびこれらの細胞のための成長阻害物質の特性決定を容易にするためにも、細胞培養内でグリア細胞の安定な集団を得ることは望ましい。また、断続した中枢軸索の再生に影響を及ぼさせるべく、損傷した脊髄の領域に移植するための細胞補綴物質として、末梢神経損傷の修復を助けるために、そして多数の自己移植片の代替物としての使用のために、哺乳動物のシュワン細胞（好ましくはヒトシュワン細胞）の集団を得ることは有益である。レヴィ等（１９９４）、上記、を参照されたい。小さな生検試料から自己移植片の供給源を大量に取得するための細胞培養技術の使用は、広範な火傷を被覆するために人の表皮細胞を提供する事で既に臨床的成功を収めている（ガリコ等、N.Eng.J.Med.、３１１巻３３８−４５１頁［１９８４］）。さらに、ヒト異種移植由来のシュワン細胞が、免疫抑制されたマウス由来の再生しつつある末梢神経軸索の髄鞘を形成させることができることが示された（アグアヨ等、Nature、２６８巻７５３− ７５５頁［１９７７］、およびアグアヨ等、Soc.Neurosci.Symp.、４巻３６１− ３８３頁［１９７９］）。したがって、上記のアプローチは、人間を包含する哺乳動物で成功を収めることが予想される。このようなグリア細胞の集団を作成するため、哺乳動物（例えば人間）の末梢神経をドナーから取得する。この神経は大動脈のクランピングから３０分以内に収穫し、ＲＰＭＩ（ジブコラボラトリーズ、グランドアイランド、ＮＹ）中に４ ℃で２４時間を超えないように保存する。各末梢神経を、モリッセイ等、J.Neur osci.、１１巻２４３３−２４４２頁（１９９１）のプロトコルに従って培養のために調製する。これは、神経をレボヴィッツＬ１５（ジブコ）で３回洗浄し、この神経の神経鞘を剥ぎ、そして残存する神経束内神経鞘から個々の神経束を除去することを含む。神経束を２−４ｍｍ長の外植片に切り、３５ｍｍ培養皿に入れる。調製された神経を５％ＣＯ₂の加湿雰囲気下に保持し、培地は１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；ジブコ）を用いて週に２回交換する。主に線維芽細胞（Ｆｂ）から成る密集性の単層が、成長の結果として生成した後、個々の外植片を新しい皿に移植する。１ないし３回の移植の後、この神経外植体を、プレジャー等、Ann.NY Acad.Sc i.、４８６巻２２７−２４０頁（１９８６）のプロトコルに従って解離させる。簡潔に述べると、複数の外植体をプールし、ＤＭＥＭ中の１．２５Ｕ／ｍｌジスパーゼ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ、ドイツ）、０．０５％コラゲナーゼ（ワーシントン・バイオケミカルズ・Ｃｏｒｐ．、フリーホールド、ＮＪ）および１５％ＦＣＳより成る酵素混合物１−２ｍｌに入れる。外植体を一夜酵素中に放置し、翌朝、個々の外植体がもはや認識できなくなるまで、まっすぐなホウケイ酸ガラスピペットで穏やかに磨砕する。次にこの細胞をＬ１５および１０％ＦＣＳで洗浄し、２００μｍ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ；シグマ、セントルイス、ＭＯ）で被覆した１００ｍｍ培養皿で培養する。翌日、Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含まないハンクス均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ジブコ）で２回洗浄することにより、細胞をＰＬＬ被覆した培養皿から取得し、これらを３７℃で５−１０分間ＨＢＳＳ中のトリプシン（０．０５％）およびＥＤＴＡ（０．０２％）（シグマ）に暴露する。細胞を集め、Ｌ１５および１０％ＦＣＳ中で２回洗浄し、血球計数器上で計数し、次いで計算された容量のＤＭＥＭおよび１０％ＦＣＳ（Ｄ１０）中に希釈する。次に細胞を、アンモニア化コラーゲンで被覆したアクラー（アライド・ファイバー・アンド・プラスティクス、ポッッヴィル、ＰＡ）ミニ皿に蒔き、またはＰＬＬ被覆した培養皿を次いでＰＬＬ被覆した皿に蒔き、そして、ＳＭＤＦ（１０ｎＭ）コレラ毒素（ＣＴ）シグマ、セントルイス、ＭＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびフォルスコリン（１μＭ）シグマを伴うＤ１０を含有する培地に暴露する。培地は週に３回交換し、細胞が密集に達した時、これらを培養皿からトリプシン（０．０５％）／ＥＤＴＡ（０．０２％）溶液で溶解する。このようにして細胞培養中で作成された細胞を、次に外科的に患者に入れる。本発明の別の態様において、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する乳癌セルライン（例えばＳＫ−ＢＲ−３細胞）の生長は、ＳＭＤＦを使用してインビトロで刺激することができる。このセルラインがＨＥＲ２レセプターの供給源であり、このレセプターが分離でき、それに対する抗体が作製でき（本明細書に記載の抗体を産生させる技術を用いて）、そしてこれらの抗体が米国特許４９６８６０３に開示されるようにＨＥＲ２過剰発現を診断する診断手段として使用できる限りにおいて、これは有用である。５．ＳＭＤＦの診断用途ＳＭＤＦは、ｅｒｂＢレセプター（例えばｅｒｂＢ２レセプター）の過剰発現および／または増幅を特徴とする癌の診断に使用することができる。この診断検定は、他の診断／予後評価、例えばリンパ節の状態、原発腫瘍の大きさ、組織学的等級、エストロゲンまたはプロゲステロンの状態、腫瘍ＤＮＡ含量（倍数性）、または細胞増殖（Ｓフレーズ画分）の測定と組み合わせて使用することができる。ムス等、New Eng.J.Med.、３３０（１８）巻１２６０−１２６６頁（１９９４）を参照されたい。ＨＥＲ２過剰発現は、その疾病が原発腫瘍部位を越えて広がり易いことを示唆しており、ＨＥＲ２レセプター過剰発現に関して陽性の評価を得た患者は、通常、腫瘍の外科的除去の後、より速やかに再発するであろう。米国特許第４９６８６０３号を参照されたい。故に、ＨＥＲ２過剰発現が同定されたなら、より攻撃的な処置（例えば化学または照射療法）を選択することができる。また、ＨＥＲ２過剰発現を特徴とする癌は、シェパード等、J.Clin.Immun ol.、１１（３）巻１１７−１２７頁（１９９１）に開示される抗ＨＥＲ２抗体、４Ｄ５による処置の候補対象を構成し得る。本明細書に定義される試料は、例えば患者の原発病巣から組織試料が得られる。ホルマリン固定されパラフィン包埋されたブロックが調製される。ムス等、上記、およびプレス等、Cancer Research、５４巻２７７１−２７７７頁（１９９４）を参照されたい。組織切片（例えば４μＭ）は既知の技術に従って調製される。次いでその組織切片に対するＳＭＤＦの結合の程度が定量される。一般にＳＭＤＦは、検出可能な標識を用いて直接的または間接的に標識される。多数の標識が利用でき、それらは一般に以下の範疇に分類できる（これらの標識は、下に記載されるＳＭＤＦ抗体の標識化にも有用である）：（ａ）放射性同位元素、例えば³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉ、³Ｈ、および¹³¹Ｉ。ＳＭＤＦまたは抗体は、例えばカレント・プロトコルズ・イン・イミュノロジー、コリゲン等編、ウィレイ・パブリッシャーズ、１および２巻に記載の技術を用いて放射性同位元素で標識することができ、放射能はシンチレーションカウンターを用いて測定できる。（ｂ）希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリンおよびテキサスレッドのような蛍光標識が利用できる。蛍光標識は、例えばカレント・プロトコルズ・イン・イミュノロジー、上記、に開示される技術を用いてＳＭＤＦまたは抗体にコンジュゲートさせることができる。蛍光は蛍光光度計（ダイナテク）を用いて定量することができる。（ｃ）様々な酵素−基質標識が利用でき、米国特許第４２７５１４９号は、これらのうち幾つかの総説を提供している。酵素は一般に、様々な技術を用いて測定し得る、色素生成基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は基質の色の変化を触媒することができ、これを分光光度計で測定することができる。これに代わり酵素は基質の蛍光または化学ルミネセンスを変化させるかも知れない。蛍光の変化を定量する技術は上に記載がある。化学ルミネセンス基質は化学反応によって電子的に励起し、次いで測定し得る（例えばダイナテクＭＬ３０００化学ルミネセンス測定器を使用）光を放射するか、または蛍光受容体にエネルギーを提供することができる。酵素的標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば蛍ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２,３−ジヒドロフタラジンジオン類、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）のようなペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が包含される。酵素を蛋白にコンジュゲートさせる技術は、オサリヴァン等、Methods in Enzym.（J.ランゴンおよびH.ヴァン・ヴナキス編）、アカデミック・プレス、ニューヨーク、７３巻１４７−１６６頁（１９８１）の、酵素イムノアッセイでの使用のための酵素−抗体コンジュゲートの製造のための方法、およびCurrent Protocols in Immunology、上記、に記載されている。酵素−基質の組み合わせの例には、例えば、 (i)水素ペルオキシダーゼが色素前駆体（例えばオルトフェニレンジアミン［ＯＰＤ］または３,３',５,５'−テトラメチルベンジジンヒドロクロリド［ＴＭＢ］）を酸化する、基質として水素ペルオキシダーゼを伴う西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、 (ii)色素生成基質として燐酸ｐ−ニトロフェニルを伴うアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、 (iii)色素生成基質（例えばｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光生成基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを伴うβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）、が包含される。その他多くの酵素−基質組み合わせが当業者にとって利用可能である。これらの一般的総説については、米国特許第４２７５１４９号および４３１８９８０号を参照されたい。時には、標識はＳＭＤＦまたは抗体に間接的にコンジュゲートされる。当業者はこれを達成するための様々な技術を知悉しているであろう。例えば、ＳＭＤＦまたは抗体はビオチンとコンジュゲートさせることができ、上に述べた三つの大きな範疇の標識のいずれかをアビジンとコンジュゲートさせることができ、またはその逆を行うことができる。ビオチンはアビジンと選択的に結合し、したがってこの標識は、ＳＭＤＦまたは抗体と間接的にコンジュゲートできる。ビオチン −アビジンコンジュゲーションを含む技術の総説については、カレント・プロトコルズ・イン・イミュノロジー、上記、を参照されたい。別法として、標識とＳＭＤＦまたは抗体との間接的コンジュゲーションを達成するために、ＳＭＤＦまたは抗体を小ハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ、そして上に述べた異なる型の標識の一つを抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）にコンジュゲートさせる。このように、標識とＳＭＤＦまたは抗体との間接的コンジュゲーションが達成できる。本発明の別の態様において、ＳＭＤＦは標識する必要が無く、その存在は、標識された抗ＳＭＤＦ抗体（例えばＨＲＰＯにコンジュゲートさせた）を用いて検出することができる。好ましい態様において、ＳＭＤＦまたは抗体は、基質の色の変化を触媒する酵素的標識で標識する（例えばテトラメチルベンズイミジン［ＴＭＢ］、またはオルタフェニレンジアミン［ＯＰＤ］）。したがって、放射性物質の使用は回避される。試薬の色の変化は適当な波長で分光光度計により測定することができる（例えば、対照波長６５０ｎｍで、ＴＭＢについては４５０ｎｍ、そしてＯＰＤについては４９０ｎｍ。したがって、スライド上の組織切片を標識されたＳＭＤＦに暴露し、この組織切片の染色強度を測定する。インビトロ分析が通常意図されるが、検出可能な原子団にコンジュゲートさせたＳＭＤＦを用いるインビボ診断（例えば画像化のため）もまた実施できる。例えば、米国特許第４９３８９４８号を参照されたい。６．ＳＭＤＦのためのその他の非治療的用途ＳＭＤＦ調製物は、放射性沃素、酵素、発蛍光団、スピン標識等で標識される時、ＳＭＤＦのための検定（例えばラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、またはラジオレセプター検定での標準として使用するためにＳＭＤＦを標識することによる）、親和精製技術（例えばｅｒｂＢ３またはｅｒｂＢ４レセプターのようなｅｒｂＢレセプターのため）、および競合型レセプター結合検定における標準として有用である。ＳＭＤＦポリペプチドは、診断用途のための抗ＳＭＤＦ抗体を作製するための免疫原としても有用である。同様に、ＳＭＤＦをコードしている核酸は、様々な組織中のＳＭＤＦの発現を検出するためのプローブとして有用である。したがってＳＭＤＦ特異的プローブは、インビトロまたはインビボでの組織型決定（例えば、感覚および運動ニューロン組織を同定するため）に有用である。この点において、ＳＭＤＦの特異なＮＴＤまたはそのフラグメント（例えばＮＴＤ−ｃｙｓノット、無極性Ｉまたは無極性IIドメイン）をコードしている核酸は、特に有用な組織特異的マーカーである。ＤＮＡ分析のための技術は良く知られている。例えば米国特許第４９６８６０３号を参照されたい。普通、ＤＮＡ分析は、試料が哺乳動物から誘導されるサザンブロッティングを含むであろう。別法として、ＳＭＤＦ特異的抗体を組織特異的型決定に使用することもできる。７．ＳＭＤＦ抗体の製造Ａ．ポリクローナル抗体ＳＭＤＦポリペプチドまたはＳＭＤＦフラグメントに対するポリクローナル抗体は一般に、ＳＭＤＦまたはＳＭＤＦフラグメントおよびアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することにより、動物において作製される。ＳＭＤＦまたは標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、二価または誘導体形成試薬、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水琥珀酸、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲおよびＲ¹は異なるアルキル基である］を用いて、免疫される種において免疫原性である蛋白、例えばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、牛チログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターとコンジュゲートさせることが有用であるかも知れない。動物は、ペプチドまたはコンジュゲート１ｍｇまたは１μｇ（それぞれウサギまたはマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と合し、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、ＳＭＤＦポリペプチドもしくはＳＭＤＦフラグメント、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、この動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチドまたはコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後、動物を採血し、ＳＭＤＦまたはＳＭＤＦフラグメント抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じＳＭＤＦまたはＳＭＤＦフラグメントのコンジュゲートで、但し異なった蛋白にコンジュゲートさせた、そして／または異なった架橋剤を介してコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまた、蛋白融合として組換え細胞培養中で製造することができる。さらに、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。Ｂ．モノクローナル抗体モノクローナル抗体は、実質上均質な抗体の集団、即ち、その集団を構成する個々の抗体が、少量存在するかも知れない天然に起こる可能性のある突然変異を除いて同一であるような集団から取得される。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、別々の抗体の混合物ではないという、抗体の性格を示している。例えば、本発明に係るＳＭＤＦモノクローナル抗体は、コーラーおよびミルシュタイン、Nature、２５６巻４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）によって作製することができる。ハイブリドーマ法においては、マウスまたはその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫に用いられたＳＭＤＦまたはＳＭＤＦフラグメントと特異的に結合する抗体を産生する、または産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（ゴディング、モノクローナル・アンティボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス、５９−１０３頁［アカデミック・プレス、１９８６］）。このようにして製造されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の生長または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を好ましくは含有する適当な培養基に蒔き、生長させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための培養基は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有し（ＨＡＴ培地）、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の生長を妨げるであろう。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中で好ましい骨髄腫セルラインは、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ− ２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ− ２細胞から誘導されるものである。ハイブリドーマ細胞が生育している培養基を、ＳＭＤＦに対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、マンソンおよびポラード、Anal .Biochem.、１０７巻２２０頁（１９８０）のスキャッチャード分析により測定することができる。ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生すると同定された後、このクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準法により増殖させることができる（ゴディング、上記）。この目的にとって好適な培養基は、例えば、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。加えて、このハイブリドーマ細胞は、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ− セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和クロマトグラフィーのような常套的免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、または血清から好適に分離される。本発明に係るモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に分離および配列決定される。本発明に係るハイブリドーマ細胞は、係るＤＮＡの好ましい供給源として働く。分離されたならば、このＤＮＡは発現ベクター中に入れ、次にこれを、この状況以外では免疫グロブリン蛋白を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードしているＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する総説は、スケラ等、Curr.Opinion in Immunol.、５巻２５６−２６２頁（１９９３）およびプリュックトン、Immunol.Revs.、１３０巻１５１−１８８頁（１９９２）を包含する。このＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖不変ドメインのコード化配列を、ホモローガスなマウス配列の代わりに置換することにより（モリソン等、Pr oc.Nat.Acad.Sci.、８１巻６８５１頁［１９８４］）、または、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の一部または全てを共有結合させることにより、修飾することができる。このようにして、本発明に係る抗ＳＭＤＦモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が製造される。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明に係る抗体の不変ドメインを置換し、または本発明に係る抗体の１個の抗原結合部位の可変ドメインを置換して、ＳＭＤＦに対する特異性を有する１個の抗原結合部位、および異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤を用いる方法を包含する、合成蛋白化学において既知の方法を用いてインビトロで製造することもできる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエステル結合を形成することにより、組み立てることができる。この目的のための好適な試薬の例は、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミダートを包含する。Ｃ．ヒト化抗体非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野で良く知られている。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的にはウィンターおよび共同研究者の方法（ジョーンズ等、Nature、３２１巻５２２−５２５頁［１９８６］；リーチマン等、Nature、３３２巻３２３−３２７頁［１９８８］；およびベルホーエン等、Science、２３９巻１５３４−１５３６頁［１９８８］）に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することにより、実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されている、キメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基およびことによると幾つかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、その齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（シムズ等、J.Immunol.、１５１巻２２９６頁［１９９３］；ならびにチョシアおよびレスク、J.Mol.Biol.、１９６巻９０１頁［１９８７］）。もう一つの方法は、軽鎖および重鎖の特定のサブグループにある、全てのヒト抗体の共通配列から誘導される特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる（カーター等、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８９巻４２８５頁［１９９２］；およびプレスタ等、 J.Immunol.、１５１巻２６２３頁［１９９３］）。さらに、抗体は、抗原に対する高親和性およびその他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい態様によれば、親配列および様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を製造する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における当該残基の可能な役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析、が可能となる。このようにして共通および移入配列からのＦＲ残基を選択しそして、結びつけることができ、その結果、所望の抗体の性格、例えば標的抗原に対する親和性の増大が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、直接且つ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。Ｄ．ヒト抗体ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫セルラインが、例えばコズボア、J.Immunol.、１３３巻３００１頁（１９８４）；ブロデュア等、モノクローナル・アンティボディ・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ、５１−６３頁（マーセル・デッカー、Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７）；およびバーナー等、J.Immunol.、１４７巻８６−９５頁（１９９１）によって記載されている。免疫時に内因性免疫グロブリンの産生無しにヒト抗体の全レパートリーを産生することのできる、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を作ることが現在可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ_H）遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすということが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスでのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、ジャコボヴィッツ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 、９０巻２５５１頁（１９９３）；ジャコボヴィッツ等、Nature、３６２巻２５５−２５８頁（１９９３）；およびブラガーマン等、Year in Immuno.、７巻３３頁（１９９３）を参照されたい。別法として、ファージディスプレー技術（マクカファーティ等、Nature、３４８巻５５２−５５３頁［１９９０］）を使用して、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを産生させることもできる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム内で繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはｆｄのメジャーまたはマイナーコート蛋白のいずれかにクローニングし、このファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントとしてディスプレーする。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能的性質に基づく選択は、それらの性質を表す抗体をコードしている遺伝子の選択をももたらす。このように、このファージはＢ細胞の性質の幾つかに類似している。ファージディスプレーは様々な形式で実施することができ、それらの総説については、例えばケヴィン・Ｓ．ジョンソンおよびデイヴィッド・Ｊ．チスウェル、Cu rrent Opinion in Structural Biology、３巻５６４−５７１頁（１９９３）を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの供給源がファージディスプレーのために使用できる。クラックソン等、Nature、３５２巻６２４−６２８頁（１９９１）は、免疫されたマウスの脾臓から誘導されたＶ遺伝子の小さなランダム組み合わせライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様な列を分離した。免疫されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを組み立てることができ、マークス等、J.Mol.Biol.、２２２巻５８１−５９７頁（１９９１）、またはグリフィス等、EMBO J．、１２巻７２５−７３４頁（１９９３）により記載の技術に本質上従って、抗原の多様な列（自己抗原を含む）に対する抗体を分離することができる。自然の免疫反応において、抗体遺伝子は突然変異を高率で蓄積する（体細胞突然変異）。導入された変化のうち幾らかはより高い親和性を与え、高親和性表面免疫グロブリンをディスプレーするＢ細胞が、後の抗原チャレンジの間に優先的に複製および分化する。この天然の工程は「チェーン・シャフリング」として知られる技術を使用することにより模倣することができる（マークス等、Bio/Tech nol.、１０巻７７９−７８３頁［１９９２］）。この方法では、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する変異体（レパートリー）のレパートリーに連続的に置き換えることにより、ファージディスプレーにより得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技術は、ｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。非常に大きなファージ抗体レパートリーを作成する方法は、ウォーターハウス等、Nucl.Acids Res.、２１巻２２６５−２２６６頁（１９９３）により記載されている。遺伝子シャフリングもまた齧歯類抗体からヒト抗体を誘導するために使用でき、ここでは、ヒト抗体は齧歯類の出発抗体と類似の親和性および特異性を持つ。「エピトープ刷り込み」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレー技術によって得られた齧歯類抗体の重鎖および軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーに置き換えて、齧歯類−ヒトキメラを作り出す。抗原の選択は、機能的抗原結合部位を復元できるヒト可変部の分離をもたらし、即ち、エピトープが相手の選択を支配（刷り込み）する。残りの齧歯類Ｖドメインを置換するためにこの工程を反復すると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。ＣＤＲ移植による常套的な齧歯類抗体のヒト化とは異なり、この技術は、齧歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基を持たない完全なヒト抗体を提供する。Ｅ．二重特異性抗体二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である。本発明においては、一方の結合特異性はＳＭＤＦに対するものであり、他方は他の任意の抗原、好ましくはｅｒｂＢレセプターを活性化する他のポリペプチドに対するものである。例えば、ＳＭＤＦおよびニューレグリンに特異的に結合する二重特異性抗体は本発明の範囲内にある。二重特異性抗体を作製する方法は当分野において既知である。常套的には、二重特異性抗体の組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づいており、ここでこの二つの重鎖は異なる特異性を持っている（ミルシュタインおよびキュエロ、Nature、３０５巻５３７−５３９頁［１９８３］）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ（四部雑種）は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。親和クロマトグラフィー工程により通常行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、そして生成物の収率は低い。同様の方法は、ＷＯ９３／０８８２９号およびトラウネッカー等、EM BO J.、１０巻３６５５−３６５９頁（１９９１）に開示されている。異なったそしてより好ましいアプローチによると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原−抗体結合部位）を、免疫グロブリン不変ドメイン配列と融合させる。この融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖不変ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖不変領域（ＣＨ１）を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、および、所望ならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。この事により、組み立てに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適の収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での産生が高収率をもたらす時、または、その比率が特に重要性を持たない時は、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。このアプローチの好ましい態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖、そして他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）で構成される。その二重特異性分子の半分しか免疫グロブリン軽鎖がないことで容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にするとわかった。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細については、例えばスレッシュ等、Me thods in Enzymology、１２１巻２１０頁（１９８６）を参照されたい。Ｆ．ヘテロコンジュゲート抗体ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合により連結した二つの抗体で構成される。このような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的とするため（米国特許第４６７６９８０号）、そしてＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／００３７３；およびＥＰ０３０８９）に提唱された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。Ｇ．中和抗体中和抗体を製造するために、上に詳述した分子を生成する技術を用いて抗体を作製する。好ましい中和抗体は人間において非免疫原性であり、且つ単一の抗原決定基に対して作製される。抗体のパネルを製造した後、所望の基準（即ち、ＳＭＤＦの生物活性をインビトロまたはインビボのいずれかで中和できる）に合致する分子を同定するため、分子をスクリーニング工程に付す。通常、ＳＭＤＦの試料を抗ＳＭＤＦ抗体のパネルに暴露し、次いで本明細書に記載のｅｒｂＢレセプターＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡおよびグリア細胞増殖検定のいずれかまたは両者に付す。ＨＥＲ２レセプターを活性化するＳＭＤＦの能力および／またはグリア細胞に対するＳＭＤＦの分裂促進活性を遮断する抗体を、中和抗体として選択することができる。８．ＳＭＤＦ抗体の用途ＳＭＤＦ抗体は、ＳＭＤＦのため、例えば特定の細胞、組織、または血清におけるその産生のための診断検定に有用である。例えば、ＳＭＤＦ抗体は組織型決定（例えば感覚および運動ニューロン同定のため）に使用することができる。抗体は、上記のＳＭＤＦと同じやり方で標識し、そして／または不溶性マトリックス上に固定化する。ＳＭＤＦおよびその抗体のための好適な診断検定は自体既知である。ＳＭＤＦまたはその抗体のための分析法は全て以下の試薬の１またはそれ以上を使用する：標識された被検体類似体、固定化された被検体類似体、標識された結合相手、固定化された結合相手、および立体コンジュゲート。標識された試薬は「トレーサー」としても知られる。使用される標識は、被検体およびその結合相手の結合を妨害しない任意の検出可能な官能基である。イムノアッセイのための多数の標識が知られており、上の第５項に記載されている。当業者は、本発明に従って使用できるその他の好適な標識を知悉しているであろう。これらの標識は、当業者に広く知られる標準技術を用いてＳＭＤＦ抗体にコンジュゲートさせることができる。或る種の検定法には試薬の固定化が必要である。固定化は、結合相手と溶液中に遊離で残存する被検体とを分離することを必要とする。これは、例えば共有結合（例えばグルタルアルデヒド架橋を用いて）による水不溶性マトリックスもしくは表面への吸着（ベニッヒ等、米国特許第３７２０７６０号）によって、検定操作の前に結合相手または被検体類似体を不溶化するか、または例えば免疫沈降により、後で相手または類似体を不溶化するか、いずれかにより簡便に達成される。競合的またはサンドイッチ検定として知られるその他の検定法は十分に確立され、商業的診断産業で広く使用されている。競合的検定は、トレーサー類似体が、共通の結合相手上の限られた数の結合部位について、被験試料被検体と競合する能力に依っている。結合相手は一般に、競合の前または後で不溶化し、次いで結合相手と結合したトレーサーおよび被検体が、非結合のトレーサーおよび被検体と分離される。この分離は、デカンテーション（結合相手が前に不溶化された場合）または遠心（結合相手が競合反応の後で沈澱した場合）によって達成される。被験試料被検体の量は、マーカー物質の量により測定される結合したトレーサーの量と逆比例する。既知量の被検体を用いた用量反応曲線を作成し、試験結果と比較して、被験試料中に存在する被検体の量を定量的に決定する。これらの検定は、酵素が検出可能なマーカーとして使用される場合、ＥＬＩＳＡ系と呼ばれる。「均質」検定と呼ばれる競合的検定のもう一つの種類は、相分離を必要としない。ここでは、酵素と被検体とのコンジュゲートを作成し、抗被検体が被検体に結合する時、抗被検体の存在が酵素活性を修飾するように使用する。この場合、ＳＭＤＦまたはその免疫学的に活性なフラグメントを、二重機能性有機架橋により、ペルオキシダーゼのような酵素とコンジュゲートさせる。抗ＳＭＤＦと共に使用するためのコンジュゲートは、抗ＳＭＤＦの結合が標識の酵素活性を阻害または強化するように選択する。この方法自体は、ＥＭＩＴという名称の下に広く実施されている。立体コンジュゲートは、均質検定のための立体障害法に使用される。このコンジュゲートは、ハプテンに対する抗体が、同時に抗被検体としての該コンジュゲートと実質上結合できないように、低分子量ハプテンを小被検体と共有結合させることにより、合成される。この検定法の下では、被験試料中に存在する被検体は抗被検体と結合し、それにより抗ハプテンはコンジュゲートと結合できるようになり、その結果コンジュゲートハプテンの性質の変化、例えばハプテンが発蛍光団である場合、蛍光の変化をもたらす。サンドイッチ検定はＳＭＤＦまたはＳＭＤＦ抗体の測定のために特に有用である。連続的サンドイッチ検定においては、固定化された結合相手を用いて被験試料被検体を吸着し、例えば洗浄によって被験試料を除去し、結合した被検体を用いて標識化結合相手を吸着し、そして次に、結合した物質を残留するトレーサーから分離する。結合したトレーサーの量は被験試料被検体と直接比例する。「同時」サンドイッチ検定においては、標識した結合相手を加える前に被験試料を分離しない。一方の抗体として抗ＳＭＤＦモノクローナル抗体、そして他方の抗体としてポリクローナル抗ＳＭＤＦ抗体を使用する連続サンドイッチ検定は、ＳＭＤＦ活性について試料を試験する際に有用である。ＳＭＤＦ抗体はさらに、組換え細胞培養または天然供給源由来のＳＭＤＦの親和精製にも有用である。中和抗ＳＭＤＦ抗体は、ＳＭＤＦ生物活性をインビボで遮断するために使用することもできる。例えば、この抗体を使用して、レセプターのＳＭＤＦ活性化が関わっている或る種の癌において、ｅｒｂＢレセプター（例えばｅｒｂＢ２レセプター）のＳＭＤＦ活性化を遮断することができる。したがって、中和抗体は或る種のグリア細胞腫瘍の処置または緩解に使用することができる。９．キット本発明は便宜上少なくとも二つの型の診断検定（即ち、ＳＭＤＦを使用する疾病状態の決定または抗体もしくはＤＮＡマーカーを用いるＳＭＤＦの測定のため）を提供することから、これらの検定用の試薬はキット、即ち試験される試料と組み合わせるための、包装された試薬の組み合わせ、で提供され得る。キットの構成成分は通常、前もって定められた割合で提供される。したがって、或るキットは、適当な標識で直接的または間接的に標識された抗体またはＳＭＤＦ（ＤＮＡまたはポリペプチド）を含むかも知れない。検出可能な標識が酵素である場合、このキットは該酵素の必要とする補助因子および基質を含むであろう（例えば、検出可能な発色団または発蛍光団を提供する基質前駆体）。さらに、安定剤、緩衝剤等のようなその他の添加物が含まれるかも知れない。様々な試薬の相対量は、その検定の感度を実質上最適化する溶液中の試薬濃度を提供するよう、広汎に変えることができる。特に、試薬は、溶解時に適当な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常凍結乾燥した乾燥粉末として提供することができる。このキットはさらに、好適には、そのバイオアッセイを実施するための使用説明書を含んでいる。以下の実施例は例示のために供するものであって、限定のためではない。本明細書の全ての引用の内容は説明的に本明細書の一部とされるものである。実施例１ＳＭＤＦｃＤＮＡクローンの単離ニューレグリン遺伝子（Ｍarchionniら、上掲）のＡ）コードセグメント１（n t ７３９−８２５）の一部とＢ）コードセグメント８および９（nt １４５２− １５０７）の一部に相当する２つの同義性オリゴヌクレオチドを、ランダムオリゴヌクレオチドプライミングによりラベルし、２つのヒト脳幹cＤＮＡライブラリー（ＬＭＧ２、ＡＴＣＣ３７４３２、λgt１１中；およびスタラタジーン，λ ＺＡＰ中）およびヒト小脳（Ｃlontech，５'−ストレッチ、λgt１１中）cＤＮＡライブラリーからの５.５×１０⁶プラークをスクリーニングするのに同時に使用した。陽性クローンを反復スクリーニングにより分離した。当初、１３クローンを分離し、３個は両方のプローブにハイブリダイズし、４個はプローブＡだけにハイブリダイズし、６個はプローブＢだけにハイブリダイズした。挿入物のサイズは、純化ファージＤＮＡをＥcoＲＩ消化して見積った。各クローンの挿入物をプラスミドpＢluescript ＳＫ(−)（スタラタジーン）のＥcoＲＩサイトにサブクローンし、ＤＮＡ配列分析した。当初分析の後、全配列分析のために７クローンを選択した。ヌクレオチド配列は、７０７７０配列バージョン２.０ＤＮＡ配列決定キット（ＵＳＢiochemicals）を使って、ジデオキシチェインターミネーション法（Ｓ angerら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７，１９７７）により決定した。挿入物の両鎖の配列を決定した。ヌクレオチド配列は配列分析プログラム（Ｇeneutech Ｓcientific Ｃomputing Ｇroup）を使って分析した。両方のプローブに強くハイブリダイズしたクローンの１つは全長クローン（クローンＢＳ４）であった。プローブＢだけにハイブリダイズしたクローンの内３つは全長クローン（クローンＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ３）であった。プローブＢだけにハイブリダイズしたクローンの内２つ（ＢＳ５、ＢＳ６）と、両方のプローブにハイブリダイズした１つのクローン（ＣＢ２）は不完全クローンであった。完全なクローンの内、ＢＳ４はＭarchionniら（上掲）のヒトＧＧＦ（ＧＧＦＨＢＳ５）の配列と同じであった。ＢＳ１、ＢＳ２、およびＢＳ３は３個の独立したクローンであり、その内の２つ（ＢＳ１、２）は、同じコード配列を示す。ＢＳ３のコード配列は、アミノ酸残基１７１および１８８においてＢＳ１およびＢＳ２と異なっており、いずれもＡlaからＶalへの置換である。５'ポリクローニング部位に隣接した１８ntを除いて、ＢＳ１とＢＳ２は、ほとんどホモローガスな５'非翻訳配列を持っている。ＢＳ３の５'非翻訳配列は１０９nt短いが、それを除けば、ＢＳ１およびＢＳ２の配列と１２ntだけ違っているだけである。図１ＡはＢＳ１cＤＮＡのヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列を示す。nt５０７（ＢＳ１）、２６４（ＢＳ２）、および５２２（ＢＳ３）に於けるＡＴＧで始まり（いずれも長いオープンリーディングフレームを開始させる）、ＢＳ１、ＢＳ２、およびＢＳ３cＤＮＡは、それぞれ２９６アミノ酸のポリペプチドをコードしており、推定分子量（Ｍr）は３１,６８６Ｄaである。２−３のコンセンサスポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡが先行する、ＢＳ１（短鎖）およびＢＳ２（長鎖）のＡ−豊富領域で終わる４７８（ＢＳ１の場合）、３８２（ＢＳ２の場合）、１２０nt（ＢＳ３の場合）の３'非翻訳配列の次にストップコドンがある。ＢＳ３にはポリアデニル化シグナルまたはＡ−豊富領域がない。ＳＭＤＦ、ＧＧＦII、ＨＲＧβ１、およびＡＲＩＡの図解的比較を図２Ａに示す（主要な構造特性のみ示す）。この４つのタンパクのアミノ酸配列の比較を図２Ｂに示す。ＳＭＤＦタンパクは、ＧＧＦII（Ｍarchionniら、上掲）、ＨＲＧ −β１、β２、β３（Ｈolmesら、上掲）、およびヒトＮＤＦ−β１ａ、−β２、−β３（Ｗenら、１９９４、上掲）のそれらと１００％の配列同一性を有し、ある種のラットＮＤＦ（クローン２２、４０、４１、４２ａ）と９２％、ＡＲＩＡと８３％の同一性を有するＥＧＦ様ドメインを持っている。しかし、ＢＬＡＳＴプログラムを使ってジーンバンクヌクレオチドデータベースおよびタンパクデータベースと比較すると、ＳＭＤＦ配列のＥＧＦ様ドメインのＮ−末端配列は新規であり、報告されている他の全てのニューレグリン配列と異なっている。ＨＲＧ、ＮＤＦ、およびＡＲＩＡと同様に、ＳＭＤＦも、膜および分泌タンパクに典型的なＮ−末端シグナルペプチドを欠いている。ある種の変異体（ＨＲＧ−β３やＧＧＦIIを含む）の様に、ＳＭＤＦ配列は、ＥＧＦ様ドメインと貫膜ドメインを連結している８−１０可変アミノ酸鎖の後で終わっており、従って、後者および細胞質テイルを欠いている。ＳＭＤＦとニューレグリンの主要な構造上の違いは、他の全てのニューレグリン類に特徴的なＩg様ドメインのＳＭＤＦを欠いていることである。ニューレグリン類と異なるＳＭＤＦの別の特徴は、Ｎ−結合グリコシル化部位に富む領域を明らかに欠いていることである（Ｏ−結合部位には富んでいる様であるが）。ＳＭＤＦの第３の顕著な特徴は、目だって疎水的性質の、Ｎ末端近くの２つのアミノ酸鎖、残基Ｔ４８−Ｌ６２（即ち、非極性Ｉ）および１７６−Ｖ１００（即ち、非極性II）が存在することである（図１Ｂのヒドロパシ−分析を参照）。なんらかの特定の理論に拘束される訳ではないが、これらの配列、特に１７６−Ｖ１００は、小胞体膜を通過させ得る内部の、非開裂シグナル配列として機能しているのかも知れない（Ｂlobel，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，７７：１４９６−１５００，１９８０：Ｓabatiniら、Ｊ．Ｃell．Ｂiol.，９２：１ −２２，１９８２；ＷicknerおよびＬodish，Ｓcience，２３０：４００−４０７，１９８５；およびvon Ｈeijne，Ｂiochim．Ｂiophys．Ａcta，９４７：３０７−３３３，１９８８）。ＳＭＤＦ中のこの疎水性鎖の上流に正または負に荷電した残基が存在することは、内部の非開裂シグナルペプチドの典型的な特徴にふさわしい。この様な非開裂、内部シグナルの例は、卵アルブミン（Ｍeekら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２５７：１２２４５−１２２５１，１９８２）およびシナプトタグミン（Ｐerinら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２６６：６２３−６２９，１９９１）のＮ末端近くの疎水性シグナル要素である。第４番目の顕著な特徴は、疎水性鎖に散在する８個のシステイン残基の存在である(即ち、“ＮＴＤ−cysノット ”)。実施例２哺乳動物細胞中でのＳＭＤＦの発現クローニングを容易にするために加えられた５'−ＳalＩおよび３'−ＨindIII 制御部位を持った、ヒトＳＭＤＦクローンＢＳ１の全コード配列に相当するcＤＮＡのフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応（９５°,７分；９５°,１分、７０°,１分、７２°,２分で５サイクル；９４°,１分、５６°,１分、７２°,２. ５分で１５サイクル；７２°,５分）で作成し、ＸhoＩおよびＨindIII部位を利用してＥpstein−Ｂarrウイルスに基づく発現ベクターpＥＢonに挿入した。別の構築では、３'末端に平滑末端を有する上記cＤＮＡフラグメントを、まず、エピトープで札をつけたgＤを含んでいるサイトメガロウイルスを基礎とする発現ベクターpＲＫ５にサブクローンした。これには、pＲＫ５中のgＤ−Ｒse構築物（Ｍarkら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２６９：１０７２０−１０７２８，１９９４）から、ＳalＩおよびＥcoＲＶ部位によりＲse配列を削除し、ＳＭＤＦ配列を挿入することにより行った。エピトープで札つけしたgＤ−Ｒseは単純性疱疹ウイルスタイプＩ糖タンパクＤ（Ｍarkら、上掲）のアミノ酸１−５３のコード配列を、ヒトＲse（Ｐaborskyら、Ｐrotein Ｅng.，３：５４７−５５３，１９９０）のアミノ酸４１−８９０をコードしている配列と融合させることにより構築した。得られたgＤ−ＳＭＤＦ挿入物をＨindIII部位によりpＥＢonにサブクローンした。制限配向性は、酵素による消化によって決め、配列決定により確認した。プラスミドＤＮＡをＱiagenカラムで純化した。２９３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）をＳＭＤＦ／pＥＢon およびgＤ−ＳＭＤＦ／pＥＢon発現ベクター、およびベクターpＥBon（対照）により、改良ＣaＰＯ₄仲介トランスフェクションプロトコール（Ｇorman，Ｉn ＤＮＡＣloning：ＡＰractical Ａpproach，Ｖol.II，Ｄ.Ｍ.Ｇlover，ed．ワシントンＤＣ：ＩＲＬプレスpp１４３−１９０，１９８５）を使ってトランスフェクトした。４日後、トランスフェクトした血清不含培養上清を、キナーゼレセプター活性化（ＫＩＲＡ）ＥＬＩＳＡ（後記実施例３参照）で、ＳＭＤＦ発現について分析した。２１日後、陽性Ｇ４１８−耐性クローンを増やし、コンフルエントな培養上清を、ＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにより、レセプターチロシンリン酸化の刺激について分析した。実施例３ erbＢレセプターの活性化 pＥＢonベクター系を使って、２９３細胞で一時的に発現されるＳＭＤＦcＤＮＡの生物活性（実施例２で言及した）を調べた。ＳＭＤＦ中にＥＧＦ様ドメインが存在することから、非濃縮（１×）および１０倍濃縮（１０×）培養上清を、 p１８５^neu/HER2を過剰発現しているＭＣＦ−７ヒト乳癌セルラインのチロシンリン酸化を刺激する能力について、ウエスタンブロットにより分析した。この分析のために、ダルベッコの最少必須培地（５０％）／Ｆ−１２（５０％）／１０％ウシ胎児血清（Ｈyclone）中、２４−ウエルプレート上でコンフルエントになるまで増殖させたＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ２６）を、血清不含培地（分析培地）に２時間で移した。記述した様に、０.１％ＢＳＡ含有分析培地で希釈した、ＳＭＤＦをトランスフェクトした培養上清またはＨＲＧβ_177-244 （rＨＲＧβ１、ＨＲＧβ１の純化ＥＧＦ様ドメイン、残基１７７−２４４、Ｅ.Ｃoli中で発明、Ｈolmesら、上掲）により、細胞を３７°で１５分間刺激した。上清を吸引し、β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳサンプル緩衝液１００μlを加えた。サンプル（１５μl）を加熱し、４−２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｎovex）で電気泳動し、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。膜を、０.０５％Ｔween−２０を含んでいるトリス緩衝液中の５％牛血清アルブミンでブロックし、抗−ホスホチロシンモノクローナル抗体（４Ｇ１０、ＵＢＩ）と共に室温で１時間インキュベートした。結合した抗−ホスホチロシン抗体を、アルカリホスファターゼとコンジュゲートした山羊抗−マウス免疫グロブリンＧ抗体（Ｐromega）と共に３０分間、室温でプローブし、５−ブロモ−４− クロロ−３−インドイル−１−ホスフェートおよびニトロ−ブル−テトラゾリウム（Ｐromega）により可視化した。ウエスタンブロットにより、ＳＭＤＦでトランスフェクトに培養上清とrＨＲＧβ１_177-241（ＨolmeSら、上掲）で処理した細胞中の抗−ホスホチロシンモノクローナル抗体により、刺激を受けたＭＣＦ−７細胞リゼイト中の１８５kＤタンパクを検出した。異なった濃度のrＨＲＧβ１_177-241（１００pＭ、５００pＭ、および１nＭ）および非濃縮および１０×濃縮の、ＳＭＤＦでトランスフェクトした上清に対する応答は、いずれも濃度依存的であった。０.１％ＢＳＡを含有する分析培地、血清不含トランスフェクション培地、または非濃縮および１０倍濃縮したベクタでトランスフェクトした培養上清で処理した細胞は、１８５kＤタンパク（これは、最もerbＢ２／neu／ＨＥＲ２レセプターチロシンキナーゼらしい）を刺激しなかった。上に述べたチロシンリン酸化ウエスタンブロット分析を、ラット骨格筋原細胞系列（ＡＴＣＣＣＲＬ１７６９）を使って行った。ＳＭＤＦでトランスフェクトした培養上清は（非濃縮または１０×濃縮）、その濃度に応じて、１８５kＤバンドのチロシンリン酸化を促進（刺激）することができた。ＳＭＤＦは、rＨＲＧ−β_177-244よりもp１８５^HER2のリン酸化を刺激する点に於いて、より活性が強いと思われる。ＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡのために、ＭＣＦ−７細胞をマイクロタイタープレートに２×１０⁵細胞／１００μl／ウエルでまき、５％ＣＯ₂中３７°で培養した。上清をデカントし、細胞をＳＭＤＦでトランスフェクトした培養上清（ＳＭＤＦまたはgＤ−ＳＭＤＦ）または種々の濃度の（０−３０００pＭ）rＨＲＧ−β１₁ _77-244 （rＨＲＧ−β１）で、３７°、３０分間刺激した。上清をデカントし、１００μlの溶菌緩衝液［５０mＭＨＥＰＥＳ，pＨ７.５，１５０mＭＮaＣl，０.５％トリトンＸ−１００，０．０１％チメロゾール，３０ＫＩＵ／mlのアプロチニン（ＩＣＮ），１mＭの４−（２−アミノエチルノ−ベンゼンスルホニルフルオライドＨＣl（ＡＥＢＳＦ，ＩＣＮ），２mＭのナトリウムオルトバナデート］を各ウエルに加えた。細胞を１時間、室温でゆっくり振りまぜながらインキュベートした。細胞溶解物をウエルに移し（８５μl／ウエル）、１００μl／ウエルのアフィニティーで純化したポリクローナルウサギ抗−ＨＥＲ２細胞外ドメイン抗体（１μg／ml、５０mＭ炭酸ナトリウム中、pＨ９.６）により、４℃で一夜被覆したＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート中、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ中、１５０μlの０.５％ＢＳＡ、０.０１％チメロサールにより室温で６０分間ブロックし、洗浄用緩衝液（０.０５％ツイーンおよび０.０１％チメロサールを含んでいるＰＢＳ）で６回洗浄した。プレートを洗い、希釈緩衝液（０.５％ＢＳＡ、０.０５％ツイーン２０、５mＭＥＤＴＡ、０.０１％チメロサール含有ＰＢＳ）で１：２０００に希釈した１００μlのビオチニル化抗−ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０，ＵＢ１）と共にインキュベートした。プレートを洗い、希釈緩衝液に１：１００００に希釈した、１００μlのワサビ大根ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプタビジン（Ｚymed Ｌaboratories）中、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、調製したこの基質溶液（テトラメチルベンジジン、２成分基質キット、Ｋirkegaard and Ｐerry）を加え、１.０ＭＨ₃ＰＯ₄１００μlを添加する前に、１０分間反応を進行させた。４５０nmに於ける吸光度を、vmaxリーダー（Ｍolecular Ｄevices）を用い、６５０nm（ＡＢＳ_450/6 ₅₀ ）の対照波長と共に測定した。再現性のある標準曲線を、既知濃度のrＨＲＧ β１による平行刺激により得、pＭβ１対平均ＡＢＳ_450/650±ＳＤで表した。分析の結果は、定量的抗−ホスホチロシンウエスタンブロット分析とよく相関していた。サンプル濃度はpＭrＨＲＧβ１活性で表した。ＳＭＤＦでトランスフェクトした細胞上清は、rＨＲＧβ１の活性に対し、２０−１６０pＭの範囲のＫＩＲＡ活性を示す。ＨＲＧβ３およびＧＧＦＨＦＢ１をコードしているそれぞれのcＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から放出されなかったそれらＨＲＧβ３およびＧＧＦＨＦＢ１と違って、２つのＳＭＤＦでトランスフェクトした培養上清による１８５kＤタンパクのチロシンリン酸化の刺激に於いて示唆された様に、ＳＭＤＦは、ＳＭＤＦまたはgＤ−ＳＭＤＦcＤＮＡで一時的にトランスフェクトされた２９３細胞から放出された様である。実施例４ラットＧＧＦクローンの生成ラット脳ポリＡ⁺ＲＮＡから調製したcＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅により、ラットＧＧＦcＤＮＡ（５４３bp、ヒトＧＧＦクローンＢＳ４のnt９６４−１５０８に相当する）の部分配列を生成した。増幅反応は、パーキンエルマーモデル４８０サーモサイクラー中、Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼを使い、９５°１分、８０°２.５分を１０サイクル行い、次いで９５°１分、７２°２.５分を２５サイクル行うことにより実施した。増幅したＤＮＡフラグメントをpＢluescriptＳＫ (−)のＳmaＩ部位にクローンした。組換え体を同定し、配列決定した。部分的ラットＧＧＦ配列は、ヒトＧＧＦ配列と９０.２％が同じである。実施例５ノーザンブロット分析ＳＭＤＦは、他のニューレグリン類とβ−タイプＥＧＦ様ドメインを同じくするので、ＥＧＦ様配列の５'側のヒトＳＭＤＦcＤＮＡに相当する³²Ｐ標識化cＤＮＡフラグメントをノーザンブロット分析に使用した。ＣhomczynskiおよびＳacchi（Ａnal．Ｂiochem.，１６２：１５６−１５９，１９８７）の方法により、組織または細胞から全ＲＮＡを抽出した。業者の指示に従い、オリゴ(dＴ)−セルロースカラム（ＱＩＡＧＥＮ）で、全ＲＮＡからポリＡ⁺ＲＮＡを分離した。エタノール沈澱させたポリＡ⁺ＲＮＡを１×ＭＯＰＳ緩衝液、５０％ホルムアミド、１７.５％ホルムアルデヒドに溶解し、９５°で５分間変性し、１.１％ホルムアルデヒド含有１.２％アガロースゲルで電気泳動した（ＫroczekおよびＳiebert，Ａnal．Ｂiochem.，１８４：９０−９５，１９９０）。分画したポリＡ⁺ＲＮＡをキャピラリーによりナイロン膜（Ｈybond，Ａme rsham）に移した。ＲＮＡブロットをＵＶ固定し、８０°で２時間焼き、５×ＳＳＣ、５×デンハルト、０.１％ＳＤＳ、１００μg／mlサケ精子ＤＮＡと、６５ °で４時間、予備的ハイブリダイズを行った。ヒト胎児組織およびヒト成人組織からのポリＡ⁺ＲＮＡそれぞれ２μgを含んでいるブロットをＣlontechから購入した。以下のcＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅により、ハイブリダイゼーションプローブを作成した：ヒトＳＭＤＦ、クローンＢＳ１のnt５０７−１２１１（７０５bp）；ヒトＧＧＦ、クローンＢＳ４のnt５１９−１０５９（５４１bp）。ＤＮＡプローブは、ヘキサマー（Ｐromega）の混合物を使ったランダムプライミングにより、α−³²Ｐ−dＡＴＰと−dＣＴＰで比活性７.５−１１×１０⁸cpm／ μgにまで標識化した。ＲＮＡブロットを、同じハイブリダイゼーション溶液中、２×１０⁶cpm／mlプローブと６５°で２０時間ハイブリダイズした。ブロットを、室温で、０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで数回洗浄し、最後に同じ溶液で、６５°、１０分間洗浄した。このブロットを強化スクリーンを使い−８０°で５〜７日間ＫodakＸＡＲ−２フィルムに暴露した。ヒト胎児脳からのポリＡ⁺ＲＮＡのノーザンブロットの際、２.５および８.５k bの２の転写体が検出された。ヒト胎児の肺、肝臓、および腎臓からのポリＡ⁺ＲＮＡの同じブロットにはハイブリダイゼーションシグナルは検出されなかった。一方、ヒトＧＧＦcＤＮＡのＩg様ドメイン（これも共通するＥＧＦ様配列の５' 側であった）の一部およびクリンクルに相当する³²Ｐ−標識化プローブを同様のブロットに使用したところ、１.３および４.４kbの２つの転写体が、既述した４つの組織全てに検出された。従って、これらの実験の結果は、ＳＭＤＦとある種の他のニューレグリン変異体との間には、それが神経組織に特異的であるという点で、組織分布の面ではっきりと区別されるということを示している。このことは、他の変異体が種々の組織や細胞に広く分布しているという報告と合致するものである（Ｈolmesら、上掲；Ｗenら、１９９２，上掲；Ｆallsら、上掲；Ｏrr−Ｕrtegerら、上掲；Ｍey er Ｂirchmeier，上掲）。実施例６イン・サイチューハイブリダイゼーションヒト、ラット、およびマウスの胎児、成長したマウス、およびラットの脳および脊髄について、イン・サイチューハイブリダイゼーションを行った。³³Ｐ−標識ＲＮＡプローブはヒトＳＭＤＦおよびヒトおよびラットのＧＧＦのＩg様ドメインの特異なＮ−末端コード配列に相当する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐromega）を用いたインビトロ転写の為の鋳型とし加えられたＴ７プロモーター配列の３'側の以下のcＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅によってハイブリダイゼーションプローブを生成させた：ヒトＳＭＤＦ、ＢＳ１のnt５０７−１１７２（６６６bp）；ヒトＧＧＦ、クローンＢＳ４のnt７８２−１３０６（５２５bp）；ラットＧＧＦ、ラットＧＧＦクローン（実施例４）のnt９６４−１３０６（３４３bp）。インビトロで転写されたアンチセンスおよびセンスＲＮＡを、報告されている方法（Ｍeltonら、Ｎucleic Ａcid Ｒes.，１２：７０３５−７０７０、１９８４）で、γ−³³Ｐ−ＵＴＰ（５０００Ｃi／m mol，Ａmersham）で標識化した。１ＵのＲＮＡase不含ＤＮＡase（Ｐromega）と３７°で１５分間インキュベートすることにより、ＤＮＡ鋳型を除去した。酵母 tＲＮＡ（Ｓigma）をキャリアーとして用いてＲＮＡサンプルをフェノール−クロロホルムで２回抽出し、０.３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下で１００％エタノールで沈澱させ、７０％エタノールで洗い、１０mＭトリス、１mＭＥＤＴＡ、pＨ７.４で〜４×１０⁵cpm／μlの濃度にした。Ｐhillipsら（Ｓcience，２５０：２９０−２９４，１９９０）により改良されたＷilcoxらの方法（Ｊ．Ｃlin．Ｉ nvest.，８２：１１３４−１１４３，１９８８）に従ってハイブリダイゼーションを行った。封をしたスライド箱中の１０μmの厚さの凍結した組織片を室温まであたため、４％パラホルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒドで４°で３０分間固定した。０.５×ＳＳＣで２回洗浄した後、組織片をハイブリダイゼーション緩衝液で覆い（２０mＭトリス−ＨＣl、pＨ８、５mＭＥＤＴＡ、０.１ＭＮaＣl、１×デンハルト、１０％硫酸デキストラン、１０mＭＤＴＴ、５０％ホルムアミド、スライド当たり０.４ml）、４２℃で３時間インキュベートした。キャリアーとしてt−ＲＮＡを含んでいるハイブリダイゼーション緩衝液中の³³ Ｐ−標識ＲＮＡプローブを、直接、スライド上のハイブリダイゼーション緩衝液に、最終濃度が８×１０⁶cpm／mlとなる様に加え、ゆっくりピペッティグして混合し、加湿した、しっかりカバーした箱の中で５５°で一夜インキュベートした。１０mＭ β−メルカプトエタノール、１mＭＥＤＴＡを含有する２×ＳＳＣ溶液で２回洗浄し、組織片をＲＮＡaseＡ溶液（１０mＭトリス−ＨＣl中、２０μg ／ml pＨ８、０.５ＭＮaＣl）により室温で３０分間処理した。２×ＳＳＣ−β −メルカプトエタノール−ＥＤＴＡ溶液で更に２回、室温で洗浄した後、組織片を高ストリンジェント緩衝液（０.１×ＳＳＣ、１０mＭ β−メルカプトエタノール、１mＭＥＤＴＡ）を用い、５５°で２時間洗った。次いで組織片を０.５ ×ＳＳＣにより、室温で２回洗い、０.３Ｍ酢酸アンモニウムを含んでいる５０％、７０％、次いで９０％エタノールで手短に脱水し、風乾し、ＨyperfilmβＭＡＸ（Ａ mersham）およびＮＴＢ２エマルジョン（Ｋodak）に暴露（感光）させた。現像後、エマルジョンに浸したスライドをクレジルバイオレットで対比染色した。ヒトＳＭＤＦプローブを用い、主としてヒト及びＥ１３.５マウスの胎児の脊髄と脳について、ＳＭＤＦmＲＮＡの所在を求めた。脊髄に於いては、mＲＮＡの最高レベルは腹側角運動ニューロンにあり、非常に高いレベルはまた、背側根ガングリオン中の感覚ニューロン中に見られる。運動ニューロンの中では、発現は大きい細胞（後に有髄化する）中に集中している。成熟したマウスの脊髄では、高レベルのＳＭＤＦmＲＮＡは、運動及び感覚ニューロンで維持されている。Ｅ１３.５マウスの脳では、側脳室および小脳に高レベルが観察される。ＳＭＤＦm ＲＮＡが検出される脳のその他の領域は、エントリノ（entorhino）皮質、隣接海馬、視床、および副嗅覚バルブである。舌下舌および顔の運動ニューロンおよび鼻上皮中の感覚ニューロンもＳＭＤＦmＲＮＡを発現している。ヒトＧＧＦプローブを使えば、またヒト及びＥ１３.５マウス胎児の脳および脊髄中にＧＧＦmＲＮＡが見い出される。しかし、Ｅ１３.５マウス脳の側脳室中に中程度の発現があるが、ヒト胎児及びマウス脊髄の腹側運動ニューロンおよび背側根ガングリオン中に見られるハイブリダイゼーションシグナルは、ＳＭＤＦ mＲＮＡシグナルに比べて非常に弱い。ヒト胎児の場合、ＧＧＦシグナルは異常に高い非特異的バックグラウンドから見わけることができない。マウス胎児脳の骨髄およびエントリノ皮質を含む、他の領域でのシグナルは、かろうじてバックグラウンドを上廻るだけである。ＳＭＤＦmＲＮＡについて、成熟マウスの骨髄にも上に挙げた他の領域にも、検出可能なシグナルは存在しない。ラットＧＧＦプローブを使用する場合、中程度のハイブリダイゼーションがＥ１５.５ラット胎児の側脳室および脊髄の背側根ガングリオンに見られる。腹側脊髄運動ニューロン中のシグナルはもっと弱い。これらのデータは、Ｏrr−Ｕrt regerら（上掲）がマウス胎児の脳及び背髄中のマウスＮＤＦの分布を調べる為に、マウスＮＤＦＩgプローブを使って得たものと似ている。ＧＧＦmＲＮＡはまた、他のラット胎児組織（例えば腎臓）中でも検出された。ニューレグリン類についての既に報告されているノーザン分析またはイン・サイチュー分析に於いて、使用されたハイブリダイゼーションプローブにはＳＭＤＦと共通するＥＧＦ様配列が含まれていた（Ｈolmesら、上掲；Ｗenら、１９９２、上掲；Ｍarchionniら、上掲；ＭeyerおよびＢirchmeier、上掲）。従って、ＳＭＤＦmＲＮＡは、これらの実験に於いて他のニューレグリン類と一緒に、位置づけられたであろうし、ある組織や領域で観察されたハイブリダイゼーションシグナルは、実際はＳＭＤＦmＲＮＡを示しており、問題にしている特定のニューレグリンではないという可能性がある。ノーザンブロット分析およびイン・サイチュー分析に於いて、ＳＭＤＦはその全特異的Ｎ−末端配列で表され、一方、他のニューレグリン類は組換えヒトＧＧＦIIのＩg様配列（これは、ヌクレオチドレベルで、ＨＲＧα，βおよびヒトＮＤＦβ２b，β３のＩg様ドメインと１００％同一であり、ラットＮＤＦと８７％、ＡＲＩＡと７０％一致している）で表される様にハイブリダイゼーションプローブを設計すると、組織分布に主要な違いが現れる。他のニューレグリンは、この研究での脳、心臓、肺、肝臓、および腎臓を含むヒト組織、および背髄に広く分布しているが、ＳＭＤＦは脳と脊髄にのみ見られる。それ故、ＳＭＤＦは神経組織に特異的であると思われる。イン・サイチュー研究に於いて、胎児および成熟動物の背髄の腹側背髄運動ニューロンおよび背側根ガングリオンにＳＭＤＦm ＲＮＡの高い発現がみられることは特に興味深い。ラットプローブを用いると、中程度レベルのＧＧＦmＲＮＡがＥ１５.５ラット背側根ガングリオン中に検出されるけれども、そのレベルはＳＭＤＦmＲＮＡのレベルよりずっと低い。一方、腹側背髄運動ニューロン中のＧＧＦmＲＮＡのマーカーはもっと弱い。ラット脳及び脊髄中のラットＧＧＦmＲＮＡのイン・サイチューに於ける分布は、部分的Ｉg様ドメインを含むマウスＮＤＦプローブを使ってＯrr−Ｕrtregerら（上掲）が報告しているものに類似している。同様のＩgプローブを使うと、ＡＲＩＡmＲＮＡはニワトリ胎児腹側角運動ニューロン中に検出されるが、背側根ガングリオン中には検出されない（Ｆallsら、上掲）。ＳＭＤＦmＲＮＡは、その神経組織特異的発現により、その他のニューレグリン類と区別される。なんらかの理論に限定される訳ではないが、他のニューレグリン類と比較して、成長しつつあるヒト、マウス、ラットの背髄中の運動ニューロン及び感覚ニューロン中で、ＳＭＤＦmＲＮＡが明らかに高い発現を示すことは、成長しつつある神経筋肉ジャンクションでの活動、および運動及び感覚ニューロンの成長に役割を果たしている可能性を示唆している。神経筋肉ジャンクションに於いて、３つのタイプの細胞の特異化によってシナプスが形成される。即ち、運動ニューロン（神経末端）、筋肉繊維、シュワン細胞（ＨallおよびＳane sの総説、Ｃell ７２／Ｎeuron １０（追補）：９９−１２１，１９９３）である。ＳＭＤＦは、軸索が有髄化している大きい運動ニューロン中でもっぱら発現され、これは、終末前シュワン細胞（ミエリンを形成する）の増殖に対するＳＭＤＦの作用と合致している。成長したマウス背髄運動ニューロンに於けるＳＭＤＦの発現は、それが、神経損傷に続く、運動ニューロンによる筋肉繊維の再支配を経て、成熟神経筋肉ジャンクションに於いても活動していることを示唆している。実施例７ＳＭＤＦによるシュワン細胞増殖の刺激２日令ラットの坐骨神経から分離したラットシュワン細胞を、夾雑フィブロブラストおよび他の細胞を含まない様に純化し（Ｂrockesら、Ｂrain Ｒes.，１６５：１０５−１１８、１９７９）、３nＭ rＨＲＧβ１_177-241の存在下で増殖させた。シュワン細胞表面マーカーＰ７５^NGFRの抗体染色により、この細胞をシュワン細胞と確認した。コンフルエントな培養をリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、トリプシン処理し、インシュリン、トランスフェリン、および微量元素を追加した血清不含のトランスフェクション培地中、２４ウエルに３.７×１０⁴細胞／ウエルでまいた。複製ウエルを血清不含トランスフェクション培地だけであるいは血清不含培地に１：１で希釈したＳＭＤＦでトランスフェクトした２９３培養上清（１０倍濃度）処理した。５日後、ＳＭＤＦでトランスフェクトした培養上清で処理したシュワン細胞はコンフルエントな状態となったが、血清不含培地だけで処理した細胞は生存しなかった。この様に、ＳＭＤＦはシュワン細胞の増殖を促進することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 5/00 ＥＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．分離されたＳＭＤＦ。２．天然グリコシル化が付随していない請求項１に記載のＳＭＤＦ。３．グリコシル化されていない請求項２に記載のＳＭＤＦ。４．図１Ａに示される翻訳されたＳＭＤＦ配列と少なくとも７５％の配列一致を共有する、請求項１に記載のＳＭＤＦ。５．人間において非免疫原性である、請求項１に記載のＳＭＤＦ。６．天然配列ＳＭＤＦである、請求項１に記載のＳＭＤＦ。７．図１Ａに示される翻訳されたＳＭＤＦ配列を有する、請求項１に記載のＳＭＤＦ。８．請求項１に記載のＳＭＤＦおよび薬学上許容し得る担体を含む組成物。９．患者由来の試料を請求項１に記載のＳＭＤＦと接触させ、試料に結合するＳＭＤＦの程度を測定することを含む、癌腫に罹患している患者の疾病状態を決定するための方法。１０．試料が、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、膵臓、または膀胱から誘導される癌腫細胞を含む、請求項９に記載の方法。１１．ＳＭＤＦが標識されている、請求項９に記載の方法。１２．ＨＥＲ２レセプターを発現する細胞を請求項１に記載のＳＭＤＦと接触させることを含む、ＨＥＲ２レセプターを活性化するための方法。１３．細胞が哺乳動物内に存在する、請求項１２に記載の方法。１４．哺乳動物が人間である、請求項１３に記載の方法。１５．グリア細胞を請求項１に記載のＳＭＤＦと接触させることを含む、グリア細胞の分裂促進を刺激する方法。１６．グリア細胞がシュワン細胞である、請求項１５に記載の方法。１７．グリア細胞が細胞培養内に存在する、請求項１５に記載の方法。１８．グリア細胞が哺乳動物内に存在する、請求項１５に記載の方法。１９．請求項１に記載のＳＭＤＦと結合することのできる、分離された抗体。２０．抗体が中和抗体である、請求項１９に記載の抗体。２１．請求項１９に記載の抗体を、ＳＭＤＦの含有が疑われる試料と接触させ、結合が起こっているか否かを検出することを含む、ＳＭＤＦを検出する方法。２２．ＳＭＤＦを含有する混合物を、請求項１９に記載の抗体が結合しているカラムを通過させ、ＳＭＤＦを含有する画分を回収することを含む、ＳＭＤＦを精製するための方法。２３．ＳＭＤＦをコードしている、分離された核酸分子。２４．（ａ）図１Ａに示されるＳＭＤＦ遺伝子のコード化領域のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）遺伝子コードの縮重の範囲内で（ａ）の配列に対応するＤＮＡ；および、（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡに対し相補的な配列とハイブリダイズし、且つ、天然配列ＳＭＤＦポリペプチドの生物学的性質を有するポリペプチドをコードしている、ＤＮＡ、より成る群から選ばれる、請求項２３に記載の核酸分子。２５．該核酸分子と機能的に結合しているプロモーターをさらに含む、請求項２３に記載の核酸分子。２６．ＤＮＡであり、且つ図１Ａに示される翻訳されたＤＮＡ配列を含む、請求項２３に記載の核酸分子。２７．請求項２３に記載の核酸分子を含むベクター。２８．該ベクターにより形質転換された宿主細胞により認識される調節配列に機能的に結合した、請求項２３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。２９．請求項２３に記載の核酸分子を含む宿主細胞。３０．請求項２９に記載の宿主細胞を培養し、この細胞培養からＳＭＤＦを回収することを含む、ＳＭＤＦの産生をさせるためにＳＭＤＦをコードしている核酸分子を使用する方法。３１．ＳＭＤＦが宿主細胞培養基から回収される、請求項３０に記載の方法。