DE69328091T2 - Bindungspeptide zur interaktion mit wachstumsfaktoren als liganden des rezeptors des epidermiswachstumsfactor und des erbb-2-rezeptor - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft das Gebiet der Blockierungspeptide, die mit Rezeptoren von als Liganden wirkenden Wachstumsfaktoren wechselwirken.
• Insbesondere sind die Blockierungspeptide der Erfindung in der Lage, an Liganden des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors und des erbB-2-Rezeptors zu binden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung solcher Blockierungspeptide in Assays zum Nachweis der Anwesenheit von als Liganden wirkenden Wachstumsfaktoren. Verfahren zur Verwendung der Blockierungspeptide der Erfindung als Mittel zur Hemmung des Wachstums von Adenokarzinomzellen und zum Diagnostizieren von Krebs werden ebenfalls offenbart.
Stand der Technik
• Transformierende Wachstumsfaktorliganden gehören zu einer Familie von wärme- und säurestabilen Polypeptiden, die es Zellen ermöglichen, eine transformierte Morphologie anzunehmen und in verankerungsunabhängigen Wachstumsassays immer stärker wachsende Kolonien zu bilden (DeLarco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 4001-4005 (1978); Moses et al., Cancer Res., 41 : 2842-2848 (1981); Ozanne, et al., J. Cell. Physiol., 105 : 163-180 (1980); Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3494-3498 (1980)). Der Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR) und seine physiologischen Liganden, der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der transformierende Wachstumsfaktor α (TGFα), spielen eine herausragende Rolle bei der Wachstumsregulierung vieler normaler und maligner Zelltypen (Carpenter, G., Annu. Rev. Biochem., 56 : 881-914 (1987)).
• Eine Rolle, die das EGF-Rezeptorsystem möglicherweise im onkogenen Wachstum von Zellen spielt, betrifft das autokrin stimulierte Wachstum. Wenn Zellen den EGFR exprimieren und EGF und/oder TGFα sezernieren, dann könnten solche Zellen ihr eigenes Wachstum stimulieren. Da manche Human-Brustkrebs-Zelllinien und Tumore EGFR exprimieren (Osborne et al., J. Clin. Endo. Metab., 55 : 86-93 (1982); Fitzpatrick et al., Cancer Res., 44 : 3442-3447 (1984); Fifmus et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 128 : 898-905 (1985); Davidson et al., Mol. Endocrinol., 1: 216-223 (1987); Sainsbury et al., Lancet, 1 : 1398-1402 (1987); Perez et al., Cancer Res. Treat., 4 : 189-193 (1984)) und TGFα sezernieren (Bates et al., Cancer Res., 46 : 1707-1713 (1986); Bates et al., Mol. Endocrinol., 2 : 543-555 (1988)), wurde eine autokrin wachstumsstimulierter Mechanismus für Brustkrebs vorgeschlagen (Lippman et al., Breast Cancer Res. Treat., 7 : 59-70 (1986)).
• Ein autokrin wachstumsstimulierter Mechanismus analog dem für den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors und seine Liganden vorgeschlagenen kann auch von einer wachsenden Liste onkogencodierter Transmembranproteine eingesetzt werden, deren Struktur an die von Wachstumsfaktorrezeptoren erinnert. Diese Liste umfasst die Protoonkogene neu und sein humanes Äquivalent erbB-2 oder HER2 (Bargmann et al., Nature, 319 : 226-229 (1986); Coussens et al., Science, 230 : 1131- 1139 (1985); Yamamoto et al., Nature, 319 : 230-234 (1986)), c-kit (Yarden et al., EMBO J., 6 : 341-3351 (1987)), ros (Neckameyer et al., Mol. Cell. Biol., 6 : 1478-1486 (1986)), met (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 6379-6383 (1987)), trk (Martin-Zanca et al., Nature, 319: 743-748 (1986)) und ret (Takahashi et al., Mol. Cell. Biol., 1378-1385 (1987)). Die Protoonkogene erbB-2 und c-kit codieren Faktoren, die strukturelle Homologie mit EGFR aufweisen (Yarden et al., Annu. Rev. Biochem., 57 : 443-478 (1988). Obwohl erbB-2 und das mit ihm verwandte Onkogen neu mit EGFR verwandt sind, sind diese Proteine verschieden. Zum Beispiel binden bekannte EGFR-Liganden, wie EGF und TGFα, nicht an den erbB-2-Rezeptor (King et al., EMBO J., 7 : 1647 (1988); und Stern et al., EMBO J., 7 : 995 (1988)).
• Eine Amplifikation oder Überexpression oder beides wurden für das cerbB-2-Gen bei einer Reihe von Human-Adenomen beschrieben (Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 6497 (1985); Van de Vijver et al., Mol. Cell. Biol., 7 : 2019 (1987); Yokota et al., Oncogene, 2 : 283 (1988); Slamon et al., Science 244 : 707 (1989); Aasland et al., Br. J. Cancer, 57: 358 (1991); Cline et al., Cancer, 60 : 2669 (1991)). Überexpression korreliert statistisch mit einem kurzfristigen Rückfall bei Brustkrebs (Slamon et al., Science, 235 : 177 (1987); Walker et al., Br. J. Cancer, 60 : 426 (1991); Wright et al., Cancer Res.; 49 : 2087 (1991)), Eierstockkrebs (Berchuck et al., Cancer Res. 50 : 4087 (1990)) und Magenkrebs (Yonomura et al., 10c. cit., 51 : 1034 (1991)). Außerdem wurde die Überexpression von p185erbB-2, dem Produkt des erbB-2-Onkogens, mit der Resistenz von Tumorzellen gegen mehrere cytotoxische Mechanismen in Zusammenhang gebracht; dazu gehören Wirkungen des Tumornekrosefaktors auf NIH-3T3-, Brust- oder Eierstockkrebszellen (Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5102 (1988); Lichtenstein et al., Cancer Res., 50: 7364 (1990)) und solche von natürlichen Killerzellen (Wiltshle et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 32 : 202 (1991)) oder Tamoxifen (Benz et al., loc. cit.: 211) bei Brustkrebszellen. Daher kann das p185erB-2-Onkoprotein eine zentrale Rolle sowohl bei der Entwicklung als auch beim Wachstum von humanen Tumoren spielen und bildet einen bevorzugten therapeutischen Angriffspunkt bei Neoplasien, wenn es überexprimiert ist und klinisch mit einer schlechten Prognose in Zusammenhang steht.
• klinisch mit einer schlechten Prognose in Zusammenhang steht.
• Auf der Basis seiner strukturellen Ähnlichkeit mit der extrazellulären Domäne (ECD) des EGFR wurde vermutet, dass die p185erbB-2-ECD eine Funktion bei der Bindung des Wachstumsfaktors erfüllt. Bisher wurden zwei in Frage kommende Liganden für p185erbB-2 gereinigt: (i) ein 30-kDa- Glycoprotein (gp30), das von den humanen Brustkrebszellen MDA-MB- 231 sezerniert wird und das sowohl EGFR als auch p185erbB-2 bindet und phosphoryliert (Lupu et al., Science, 249 : 1552 (1991), und US- Anmeldung Serial No. 07/528,438, eingereicht am 25. Mai 1990 und veröffentlicht als US-A-5,578,842); und (ii) ein 75-kDa-Protein (p75), das von den humanen Brustkrebszellen SK-Br-3 sezerniert wird und das p185erbB-2 spezifisch bindet und phosphoryliert (Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 2287 (1992), und US-Patentanmeldung Serial No. 07/640,497, eingereicht am 14. Januar 1991 und veröffentlicht als US-A- 5,578,482). Die weitere Fähigkeit dieser zwei Proteine im Sinne einer Wirkung auf die Proliferation von p185erbB-2-überexprimierenden humanen Brustkrebszellen unterstreicht die Rolle von gp30 und p75 als Wachstumsfaktoren bei Mammaneoplasien. Da EGF und TGFα nicht an p185erbB-2 binden (Schecter et al., Science, 229 : 976 (1985); King et al., EMBO J., 7 : 164 (1988); und Stern et al., EMBO J., 7 : 995 (1988)), scheinen p185erbB-2- und EGFR-ECDs sowohl mit gewöhnlichen als auch mit spezifischen Liganden zu wechselwirken. Wie bei EGFR und seinen Liganden sind also die Liganden für den erbB-2-Rezeptor an der Wachstumsregulierung von malignen Zellen beteiligt.
• Gemäß dem autokrin wachstumsstimulierten Mechanismus sind maligne Zellen in der Lage, in vivo einen starken Tumorwachstumsfaktor zu sezernieren. Der Wachstumsfaktorligand kann also ganz ähnlich wie Human-Chorion-Gonadotropin oder α-Fetoprotein in Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden und könnte als Tumormarker und prognostische Variable verwendet werden. Untersuchungen lassen vermuten, dass TGFα-Aktivität in Körperflüssigkeiten von Krebspatienten nachgewiesen werden kann und dass ihre Anwesenheit wichtige Informationen über die Biologie des Tumors eines Patienten liefern kann (Stromberg et al., J. Cell. Biochem., 32 : 247-259 (1986); Twardzick et al., J. Natl. Cancer Inst., 69 : 793-798 (1982); Sherwin et al., Cancer Res., 43 : 403-407 (1983)).
Kurzbeschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Blockierungspeptide, die die Liganden des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors oder des erbß-2-Rezeptors binden oder mit diesen wechselwirken. Die für den erbB-2-Rezeptor spezifischen Blockierungspeptide wechselwirken jedoch nicht wesentlich mit EGF oder TGFα. Eine solche Wechselwirkung oder Bindung durch die Blockierungspeptide der Erfindung verhindert oder hemmt die Wechselwirkung zwischen den Rezeptormolekülen und ihren entsprechenden Liganden.
• Da solche Liganden an der Proliferation von Adenokarzinomzellen beteiligt sind, können die Blockierungspeptide der vorliegenden Erfindung als Behandlung für Krebs dienen. Insbesondere können die Blockierungspeptide der Erfindung in einem Verfahren zur Behandlung einer Reihe von Krebserkrankungen verwendet werden, die mit einer Überexpression des erbB-2-Transmembranproteins in Zusammenhang stehen; dazu gehören unter anderem Brust-, Eierstock-, Magen-, Lungen-, Prostata-, Speicheldrüsen- und Schilddrüsenkrebs.
• Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung der Blockierungspeptide der Erfindung zum Nachweis von Zellen, die das p185erbB-2- Transmembranprotein oder das EGFR-Transmembranprotein exprimieren. Die Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Gewinnung der gereinigten Blockierungspeptide der Erfindung aus Zellen, die solche Peptide erzeugen, oder mittels automatischer Proteinsynthese.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
• Aminosäuresequenzinformationen können hier durch die numerische Position innerhalb des erbß-2-Rezeptors oder EGFR bezeichnet werden. Die hier verwendete Nummerierung der Aminosäuresequenz ist diejenige, die in Bargmann et al., Nature, 319 : 226-230 (1986), und Yamamoto et al., Nature, 319 : 230-234 (1986), beschrieben ist; auf beide wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
• Fig. 1 zeigt die Peptide der p185erbB-2-ECD, die in Bioassays auf Human- Brustkrebs-Zelllinien verwendet wird. Unterdomänen in der p185erbB-2-ECD sind durch kursiv gedruckte Zahlen angezeigt, die die synthetischen Peptide P1, P2, P3, P4, RL1 und RL2 bezeichnen. Die prozentuale Homologie dieser Peptide zum Bereich von EGFR ist ebenfalls gezeigt. Die synthetischen Peptide RL1 und RL2 wurden von der Peptide Synthesis Core Facility, Lombardi Cancer Center, Georgetown University Medical Center, erhalten.
• Fig. 2 zeigt kompetitive p185erbB-2-Assays mit SK-Br-3-Zellen in Gegenwart von p185erbB-2-homologen Peptiden. SK-Br-3-Zellen wurden in 48- Napf-Platten (Costar®) in 5% fetales Kälberserum (FCS), IMEM (Biofluids), gebracht. Die Zellen wurden gewaschen und 30 Minuten lang bei 37ºC mit Bindungspuffer [1 mg/ml BSA, 10 mM Hepes, 20 mM Glutamin, DMEM-F12, pH 7,4] inkubiert. Bindungsuntersuchungen wurden 3 Stunden lang bei 4ºC durchgeführt. Mit SK-Br-3-Zellen wurde 1 nM iodiertes 4D5 mit verschiedenen Konzentrationen von P1 ( ), P2 ( ), P3 (Δ), P4 ( ), RL1 ( ) und RL2 ( ), nicht markierten Peptiden (A) oder mit nicht markiertem 4D5 (B) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit Bindungspuffer gewaschen und mit 1% SDS solubilisiert. Die unspezifische Bindung von iodiertem 4D5 wurde mit einem Überschuss (100 nM) an nicht markiertem 4D5 bestimmt. Für jede Gruppe wurden drei Bestimmungen durchgeführt. Die Experimente wurden dreimal durchgeführt und lieferten jeweils ähnliche Ergebnisse.
• Fig. 3 zeigt Werte der Autophosphorylierungsaktivität bei MDA-MB-453- und MDA-MB-468-Zellen, die mit gp30- und RL1- oder RL2-Peptiden behandelt wurden. Die Zellen wurden in 24-Napf-Platten (Costar®) in 5%-FCS- IMEM bis zu 70% Konfluenz gezüchtet, und 24 Stunden vor den Assays wurde ihnen das Serum vorenthalten. Die Zellen wurden dann 20 Minuten lang bei 37ºC mit und ohne gp30 (in den unten angegebenen Konzentrationen), wie es bei den Abbildungen der Figur angegeben ist, mit RL1 oder RL2 behandelt, einmal mit serumfreiem IMEM gewaschen und 10 Minuten lang bei 4ºC mit einem Lysepuffer, der SDS enthielt (Emprotech), lysiert. Die Gesamtzellproteine wurden einer 4-20%-SDS-PAGE unterzogen und auf Hybond-ECL®-Membranen (Amersham) abgeklatscht. Die Membranen wurden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung [5% BSA, 0,5% Tween® 20] blockiert und mit 1 ug/ml monoklonalem Phosphotyrosin-Antikörper (UBI) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung [0,5% BSA, 0,5% Tween 20] sondiert. Immunkomplexe wurden unter Verwendung des ECL-Western-Blotting-Kit (Amersham) nach den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Densitometrische Analysen wurden unter Verwendung eines SAMBA®-4000- Systems (Dynatech Laboratories) durchgeführt. Die erhaltenen Werte wurden einer Hintergrundkorrektur unterzogen und als Kontrollprozentwer te ausgedrückt. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn Effekte von mehr als 10% gegenüber den Kontrollen auftraten.
• Die oberen Abbildungen entsprechen MDA-MB-453-Zellen. Ein weiteres Sondieren derselben Membranen mit einem monoklonalen p185erbB-2-Antikörper (Oncogene Science) zeigte identische Werte für die p185erbB-2- Expression bei jedem Blot. Die unteren Abbildungen entsprechen MDA-MB- 468-Zellen. Ein weiteres Sondieren derselben Membranen mit einem monoklonalen EGFR-Antikörper (Oncogene Science) zeigte identische Werte für die EGFR-Expression bei jedem Blot. gp30 wurde in einer Konzentration von 50 pM verwendet. Die Bahnen 1 bis 4 entsprechen steigenden Konzentrationen von RL2- (linke Abbildungen) oder RL1-Peptid (rechte Abbildungen). 1 : 0,06 uM; 2 : 0,6 uM; 3 : 6 uM; 4 : 60 uM. Die Experimente wurden viermal wiederholt und lieferten jeweils ähnliche Ergebnisse.
• Fig. 4 zeigt eine Phosphoaminosäureanalyse von 185-kDa-Phosphoproteinen in MDA-MB-453-Zellen, die mit gp30 und RL2-Peptid (p185erbB-2- homolog) behandelt wurden. MDA-MB-453-Zellen wurden in 35-mm- Schalen (Costar) in 5%-FCS-IMEM bis zu 70% Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal mit PO&sub4;-freiem DMEM (Gibco) gewaschen und dann 3 Stunden lang bei 37ºC mit [³²P]-Orthophosphat (Amersham; 1.0 mCi/ml in jeder Schale) inkubiert. Dann wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 37ºC mit Proben behandelt: Kontrolle, 60 uM RL2, 50 · 10&supmin;¹² M gp30 oder 50 · 10&supmin;¹² M gp30 plus 60 uM RL2. Alle Proben wurden 30 Minuten lang bei 37ºC vorinkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und 10 Minuten lang bei 4ºC mit einem Lysepuffer, der 1% Triton® X-100 sowie Kinase-, Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthielt, lysiert (gemäß Frackelton et al., J. Biol. Chem., 259 : 7909 (1984)). Nach 15 Minuten Zentrifugation bei 4ºC mit 10 000 · g wurden Tyrosin-phosphorylierte Proteine durch Mikrobad-Affinitätschromatographie auf dem monoklonalen Phosphotyrosin-Antikörper 1G2 (zur Verfügung gestellt von Dr. A. R. Frackelton) aus Überständen isoliert, wie es bereits beschrieben wurde (Frackelton et al., J. Biol. Chem., 259 : 7909 (1984); und Beitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 2021 (1991)), mit 1 mM Phenylphosphat in PBS, pH 7,4, eluiert und durch Immunfällung mit monoklonalem p185erbB-2 Antikörper Ab-3 (Oncogene Science), der auf Protein-A-Sepharoseº adsorbiert war, aufgereinigt. Tyrosin-phosphorylierte p185erbB-2 Proteine wurden in 50 ul Probenbeladungspuffer [50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% Glycerin, 0,1% Bromphenolblau, 5% β-Mercaptoethanol] resuspendiert, 5 Minuten bei 95ºC erhitzt und auf einer 7,5%-SDS-PAGE aufgetrennt. Banden, die dem 185-kDa-erbB-2-Protein entsprachen, wurden aus dem Gel herausgeschnitten und einer partiellen sauren Hydrolyse und einer zweidimensionalen Dünnschichtelektrophorese unter Verwendung von HTLE-7000 (CBS Scientific Co.) unterzogen, wie es bereits beschrieben wurde (Cooper et al., Method. Enzymol., 99 : 387 (1983); Frackelton et al., Mol. Cell. Biol., 3 : 1343 (1983)). Densitometrische Analysen wurden durchgeführt, wie es oben beschrieben ist. Die Experimente wurden viermal wiederholt und lieferten jeweils ähnliche Ergebnisse.
• Fig. 5 zeigt eine Weichagar-Koloniebildung von MDA-MB-453-Zellen, die mit homologen p185erB-2-Peptiden behandelt wurden, und von SK-Br-3- Zellen, die mit RL2, gp30 und p75 behandelt wurden. MDA-MB-453- (A) oder SK-Br-3-Zellen (B) wurden in 35-mm-Gewebekulturschalen (Costa r) ausgestrichen. Eine untere Schicht von 1 ml IMEM, das 0,6% Bacto-Agar® (Difco), 2 mM Glutamin und 10% FCS enthielt, wurde hergestellt. Die oberen Schichten enthielten 2 · 10&sup4; Zellen sowie Proben in 0,4% Bacto- Agar®, 10%-FCS-IMEM. Die Proben wurden vor dem Ausstreichen durch Filtration unter Verwendung von 0,22 uM-Millex-CU-Millipore-Filter sterilisiert. Die Legende der Peptidsymbole in A ist derjenigen in Fig. 2 identisch. Die folgenden Konzentrationen wurden in B verwendet: 5 · 10&supmin;¹² M gp30, 2 · 10&supmin;¹² M p75, 60 uM RL2 und 127 nM extrazelluläre Domäne (ECD) von p185erbB-2 als positive Kontrolle. Experimente wurden in FCS durchgeführt, das auf optimale Klonierungseffizienz getestet worden war. Zellen wurden 7-9 Tage lang in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; bei 37ºC inkubiert. Kolonien, die größer als 60 um waren, wurden unter Verwendung eines Baush and Lomb Stern Cell Colony Counter (Artex Systems Corp.) gezählt. Für jede Gruppe wurden drei Bestimmungen durchgeführt. Die Experimente wurden dreimal durchgeführt.
• Fig. 6A und B: Blockierung des EGF-Signals durch RL2-K, vermittelt durch das EGFR in MDA-MB-468-Zellen.
• Fig. 6A: Kompetitive EGFR-Bindungsassays wurden mit MDA-MB-468- Zellen durchgeführt. In Kürze: 150 000 Zellen/Napf wurden in einer 24- Napf-Platte ausgestrichen. Die Bindungsassays wurden so durchgeführt, wie es von Lonardo et al., Mol. Cell. Biol., 2 : 992 (1990), beschrieben wurde. In Kürze: 1 nM iodiertes EGF (Amersham) wurde mit steigenden Konzentrationen von RL2 oder RL2-K (0,6, 6 bzw. 60 uM) inkubiert. Steigende Konzentrationen an nicht markiertem EGF wurden als Kontrolle verwendet, wie es in dem kleineren Bild gezeigt ist. Für jede Gruppe wurden drei Bestimmungen durchgeführt. Die Werte stammen aus drei Experimenten und sind als mittleres prozentuales Verhältnis zu Kontrollfällen angegeben. Die Standardabweichung der Werte überschritt 10% nicht.
• Fig. 6B: EGFR-Tyrosin-Phosphorylierungs-Assays wurden unter Verwendung von MDA-MB-468-Zellen durchgeführt, wie es für Fig. 3 beschrieben ist. Zellen wurden in An- oder Abwesenheit von steigenden Konzentrationen von RL2-K oder RL2, Bahnen 1-3 (0,6, 6 bzw. 60 uM), mit EGF (1,68 nM) [RL2-K (obere Abbildung) und RL2 (untere Abbildung)] behandelt. Die Membranen wurden dann gestreift und mit einem monoklonalen Anti-EGFR- Antikörper (Oncogene Science) erneut sondiert, der ein vergleichbares Ausmaß an Proteinexpression für jeden Blot anzeigte.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
• In der folgenden Beschreibung wird eine Reihe von Ausdrücken, die auf dem Gebiet der Wechselwirkungen zwischen als Ligand wirkendem Wachstumsfaktor und Rezeptor und der DNA-Rekombinationstechnik verwendet werden, in großem Umfang gebraucht. Um ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche einschließlich des Bedeutungsumfangs, der diesen Ausdrücken beizumessen ist, zu ermöglichen, werden die folgenden Definitionen angegeben:
• Blockierungspeptid. Der Ausdruck "Blockierungspeptid" soll sich auf die Peptide RL2 und RL2-K beziehen, die in der Lage sind, an einen Liganden des erbB-2-Transmembranproteins oder einen Liganden des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors zu binden oder in irgendeiner Weise mit diesen zu wechselwirken. Peptide mit der Aminosäuresequenz, die man im erbB-2-Rezeptor findet, binden jedoch möglicherweise nicht wesentlich an den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder den transformierenden Wachstumsfaktor α (TGFα). In ähnlicher Weise binden Peptide mit einer Sequenz, die man im EGFR findet, möglicherweise nicht an erbB-2- Liganden. Die Bindung oder Wechselwirkung eines Blockierungspeptids der Erfindung mit dem entsprechenden Wachstumsfaktor oder Liganden führt zur Verhinderung oder Hemmung der Wechselwirkung zwischen einem Liganden und dem entsprechenden Rezeptor.
• Mutante. Der hier verwendete Ausdruck "Mutante" soll Derivate eines Blockierungspeptids umfassen, bei dem die Aminosäuresequenz des Peptids in einer Weise modifiziert wurde, die sich durch die Addition, Substitution, Insertion oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren ergibt. Eine "biologisch aktive Mutante" eines Blockierungspeptids bedeutet eine Mutante des Blockierungspeptids, die noch die gesamte oder einen Teil der biologischen Aktivität des Blockierungspeptids besitzt, insbesondere der Ligandbindungsaktivität. Der Ausdruck "Mutation" kann auch als allgemeiner Ausdruck verwendet werden, der die Modifikation irgendeiner DNA- oder RNA-Sequenz durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Nucleotide innerhalb einer bestimmten Sequenz bezeichnet.
• Funktionelles Derivat. Ein "funktionelles Derivat" des Blockierungspeptids der Erfindung bedeutet ein Peptid, das eine biologische Aktivität besitzt, die im wesentlichen der des Blockierungspeptids entspricht, von dem das Derivat abgeleitet ist. "Im wesentlichen entsprechend" bedeutet eine biologische Aktivität, die quantitativ ähnlich, aber qualitativ verschieden von der Aktivität des ursprünglichen Blockierungspeptids ist. Der Ausdruck "eine qualitativ ähnliche biologische Aktivität" bedeutet ein Peptid, das noch mehr oder weniger die biologische Aktivität des ursprünglichen Blockierungspeptids besitzt. Zum Beispiel besitzt ein funktionelles Derivat des ursprünglichen Blockierungspeptids noch die Fähigkeit, mit Liganden des p185erB-2- Rezeptors oder EGFR zu wechselwirken oder diese zu binden. Der Ausdruck "funktionelles Derivat" soll biologisch aktive "Mutanten" und "Varianten" der ursprünglichen Blockierungspeptide dieser Erfindung mit umfassen. Beispiele für funktionelle Derivate des ursprünglichen Peptids, die bei dieser Erfindung in Betracht gezogen werden, sind unter anderem Aminosäuresubstitutionen, Aminosäurekohäsionen sowie die Mutation und Zirkularisierung des Peptids durch Addition von Cys-Resten an beide Enden des Moleküls.
• Variante. Eine "Variante" des Blockierungspeptids der Erfindung soll sich auf ein Peptid beziehen, das eine im wesentlichen ähnliche Struktur und biologische Aktivität wie eines der beiden Blockierungspeptide aufweist. Eine Variante ist nicht notwendigerweise von dem ursprünglichen Peptid abgeleitet und kann von einer Vielzahl von Rezeptoren erhalten werden, die dem EGFR- oder erbB-2-Rezeptor ähnlich oder von diesen verschieden sind.
• Im wesentlichen rein. Der Ausdruck "im wesentlichen rein" oder "im wesentlichen gereinigt" soll ein Peptid beschreiben, das im wesentlichen frei von allen Verbindungen ist, die normalerweise mit einem Peptid im natürlichen Zustand vergesellschaftet sind, d. h. im wesentlichen frei von kontaminierenden Protein- und Kohlenhydratkomponenten. Der Ausdruck soll jedoch künstliche oder synthetische Gemische des Peptids nicht ausschließen. Der Ausdruck soll auch nicht die Anwesenheit geringfügiger Verunreinigungen ausschließen, die die biologische Aktivität des Peptids nicht stören und die zum Beispiel aufgrund einer unvollständigen Reinigung vorhanden sein können.
A. Liganden des erbB-2-Transmembranproteins und/oder des Rezeptorproteins des epidermalen Wachstumsfaktors
• Lupu et al., Science, 249 : 1552-1555 (1991), beschrieben die Identifizierung und Reinigung eines ungefähr 30 Kilodalton (kDa) großen Wachstumsfaktors, der von MDA-MB-231-Human-Brustkrebszellen sezerniert wird. Dieses Glycoprotein (gp30) wurde durch sequentielle Heparin-Sepharose- Chromatographie mit geringer Affinität und durch Umkehrphasenchromatographie bis zur anscheinenden Homogenität gereinigt. Der gp30-Ligand ist auch in der US-Anmeldung Serial No. 07/528,438, eingereicht am 25. Mai 1990 und veröffentlicht als US-A-5,578,842, beschrieben. Das gp30- Glycoprotein bindet an den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR) und weist einige mit TGFα zusammenhängende Eigenschaften auf. Außerdem stimulierte gereinigtes gp30 die Phosphorylierung von p185erbB-2 in Zellen, die erbß-2 überexprimieren, im Gegensatz zu TGFα und EGF, die nicht mit p185erbB-2 wechselwirken. Überraschenderweise hemmte gp30 das Zellwachstum bei allen Zellen, die erbB-2 überexprimierten (Lupu et al., Science, 249 : 1552 (1990)). Ein monoklonaler Antikörper (4D5) gegen die extrazelluläre Domäne von p185erbB-2 (Hudziak et al., Molec. Cell. Biol., 9 : 1165 (1989)) war in der Lage, mit gp30 um die Bindung an p185erbB-2 zu konkurrieren, was darauf hinweist, dass der gp30-Ligand die 4D5-Bindungsstelle erkannte und daran band.
• Ein zweiter erbB-2-Ligand, p75, erkennt EGFR, einen Rezeptor, der p185erbB-2 hochgradig homolog ist, nicht und bindet auch nicht daran. Der p75-Ligand ist in der US-Anmeldung Serial No. 07/640,497, eingereicht am 14. Januar 1991 und veröffentlicht als US-A-5,578,482, offenbart.
• Der p75-erbB-2-Ligand ist ein 75-Kilodalton-Protein (p75). Im wesentlichen gereinigter p75-Ligand konkurriert mit 4D5 (Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., 9 : 1165 (1989)) und M0193-Antikörpern um die p185erB-2 Bindung und induziert die Phosphorylierung von p185erbB-2. In Zellwachstumsassays wurden die Zellproliferation und die Koloniebildung von Zelllinien, die erbB-2 überexprimierten, mit p75 gehemmt. Weiterhin kann p75 die antiproliferative Wirkung von löslicher extrazellulärer Domäne von erbB-2 wieder umkehren.
• Die Identifizierung von erbB-2-Liganden kann gemäß US-Anmeldung Serial No. 07/640,497, eingereicht am 14. Januar 1991 und veröffentlicht als US-A-5,578,482, erfolgen.
B. Herstellung des Blockierungspeptids
• Blockierungspeptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, spezifisch mit einem Molekül oder Liganden zu reagieren, oder haben zu diesem Affinität, so dass das Blockierungspeptid in einer Weise (kovalent oder nichtkovalent) an das Ligandenmolekül bindet, dass eine biologische Aktivität des Ligandenmoleküls blockiert (gehemmt oder quantitativ reduziert) wird. Vorzugsweise können Peptidfragmente der extrazellulären Domäne von p185erbB-2 verwendet werden, die an den erbB-2-Liganden binden, obwohl die Sequenz von Rezeptoren, die mit dem erbB-2-Transmembranrezeptor verwandt sind, ebenfalls verwendet werden kann, um Blockierungspeptide gemäß der Erfindung herzustellen. Zu diesen verwandten Rezeptoren können zum Beispiel neu, c-kit, met oder jede Transmembran-Tyrosin-Kinase gehören, die eine Struktur haben, die an Wachstumsfaktorrezeptoren erinnert. Sequenzvergleiche für EGFR, erbB-2- Rezeptor und neu-Rezeptor sind beschrieben (Bargmann et al., Nature, 319 : 226-230 (1986); und Yamamoto et al., Nature, 319 : 320-234 (1986)).
• Die Blockierungspeptide der Erfindung bestehen aus der Aminosäuresequenz des Leu&sup4;&sup5;³-bis-Glu&sup4;&sup6;&sup0;-Bereichs des erbB-2-Rezeptors. Man wird sich jedoch darüber im klaren sein, dass auch homologe Bereiche von verwandten Rezeptoren Blockierungspeptide gemäß dieser Erfindung umfassen können. Zum Beispiel kann der Leu&sup4;&sup4;&sup8;-bis-Glu&sup4;&sup5;&sup5;-Bereich von EGFR, der dem Leu&sup4;&sup5;³-bis-Glu&sup4;&sup6;&sup0;-Bereichs des erbB-2-Rezeptors entspricht, ein Blockierungspeptid der Erfindung umfassen. Die 8-Aminosäure-Sequenz des Leu453-bis-Glu&sup4;&sup6;&sup0;-Bereichs des erbB-2-Rezeptors (im folgenden RL2 oder RL2-R genannt) lautet:
• Leu-Gly-Leu-Arg-Ser-Leu-Arg-Glu,
• während die 8-Aminosäuresequenz des Leu&sup4;&sup4;&sup8;-bis-Glu&sup4;&sup5;&sup5;-Bereichs des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors (im folgenden RL2-K genannt) wie folgt lautet:
• Leu-Gly-Leu-Arg-Ser-Leu-Lys-Glu.
• Aminosäuresubstitutionen können in dem Blockierungspeptid der Erfindung vorgenommen werden, solange das Blockierungspeptid seine biologische Aktivität beibehält, z. B. spezifisch mit Liganden des EGFR oder des erbB-2- Rezeptors zu reagieren oder Affinität zu diesen aufzuweisen. Weitere Mutationen (Substitutionen, Deletionen und Additionen) der oben beschriebenen Sequenzen können mit wohlbekannten Techniken erreicht und auf biologische Aktivität getestet werden, z. B. auf Bindung an einen Liganden, wie es hier beschrieben ist.
• Die Blockierungspeptide der vorliegenden Erfindung können nach mehreren wohlbekannten Techniken hergestellt werden. Synthetische Peptide können unter Verwendung automatischer Proteinsynthesizer aufgebaut werden. Alternativ dazu können die Blockierungspeptide der Erfindung auch durch DNA-Rekombinationstechniken erzeugt werden. Zum Beispiel kann ein DNA-Molekül, das die gewünschte Peptidsequenz codiert, operabel mit einem Promotor und anderen regulatorischen Sequenzen verknüpft werden, so dass eine Expression des Peptids in einem transformierten Wirt erhalten werden kann.
• Ein gewünschtes Blockierungspeptid kann auch aus Zellen hergestellt werden, die das Rezeptormolekül aufweisen. SK-Br-3-Zellen werden verwendet, um die extrazelluläre Domäne von p185erbB-2 zu reinigen (Alper et al., Cell Growth and Differentiation, 1 : 591-599, 1990). Yamamoto et al., Nature, 319 : 230-234 (1986), beschreiben die Klonierung und Expression des p185erbB-2-Gens in voller Länge. Ein Plasmid, das das erbB-2-Rezeptor- Gen enthält, kann von der American Type Culture Collection, Rockville, MD (Zugriffs-Nr. ATCC 57584), erhalten werden. Plasmide, die kürzere Sequenzen codieren, welche den oben offenbarten Bereich aus acht Aminosäuren noch enthalten, können aus diesem Plasmid unter Verwendung von Standardverfahren aufgebaut werden. Ähnliche Plasmide, die das EGFR-Gen enthalten, sind ebenfalls leicht verfügbar, und sie können in ähnlicher Weise beim Aufbau von Plasmiden, die Blockierungspeptide codieren, verwendet werden.
• Unter Verwendung wohlbekannter Rekombinationstechniken oder automatischer Techniken können mehrere funktionelle Derivate (einschließlich biologisch aktiver Mutanten, Fragmente und Varianten) hergestellt werden. Kurz gesagt, ein DNA-Molekül, das das gewünschte Peptid codiert, kann durch herkömmliche ortsspezifische Mutagenese von klonierter DNA mutiert werden (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)). Ungezielte chemische Mutagenese kann ebenfalls verwendet werden. Außerdem können Peptide mit zufälligen oder ortsspezifischen Änderungen (Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen) in der Aminosäuresequenz unter Verwendung wohlbekannter automatischer Synthesizer hergestellt werden.
• Es ist offensichtlich, dass Derivate der Blockierungspeptide, sobald sie hergestellt worden sind, leicht auf Bindungsaktivität an die Liganden von Rezeptoren wie EGFR oder dem erbB-2-Rezeptor analysiert werden können. Wie in den Beispielen ausführlicher beschrieben ist, können kompetitive Bindungsassays, Tyrosin-Phosphorylierungs-Inhibitionsassays, Zellproliferationsinhibitionsassays oder Tierversuche unter Verwendung Nackter Mäuse verwendet werden, um zusätzliche Peptide zu analysieren, die die Aktivität oder eine im wesentlichen ähnliche Aktivität wie die Blockierungspeptide der Erfindung aufweisen.
• Der Fachmann wird sich auch darüber im klaren sein, dass das Blockierungspeptid der vorliegenden Erfindung mit in der Technik wohlbekannten Standardtechniken nachweisbar markiert oder mit therapeutischen Mitteln konjugiert werden kann. Beispiele für nachweisbare Markierungen sind unten beschrieben; sie können verwendet werden, um die Blockierungspeptide der vorliegenden Erfindung nachweisbar zu markieren.
• Der hier verwendete Ausdruck "therapeutisches Mittel" soll irgendein Molekül, eine chemische Verbindung, ein Protein usw. bedeuten, das, in enge Verbindung mit einer Zelle gebracht, in der Lage ist, die Zelle abzutöten, zu zerstören, ihr Wachstum oder ihre Reproduktion zu hemmen oder in anderer Weise in deren normale Physiologie oder ihren Stoffwechsel einzugreifen, und zwar in einer Weise, die dem Überleben oder der Reproduktion der Zelle nicht förderlich ist. Beispiele für geeignete therapeutische Mittel sind cytotoxische Wirkstoffe, Toxine, Isotope, endokrine Therapeutika und dergleichen. Zu den spezifischen cytotoxischen Wirkstoffen, die verwendet werden können, gehören Adriamycyn®, Cyclophosphamid®, 5-Fluoruracil®, Methotrexat®, Cisplatin®, Carboplatin®, Vincristin®, VP-16®, Bleomycin®, Mitomycin® C, Nicotinamid® usw. Toxine können Ricin A, Diphtherietoxin und Pseudomonas-Toxin sein. Beispiele für Elemente, aus denen geeignete Isotope hergestellt werden können, sind Phosphat, Indium, Yttrium und Iod. Beispiele für geeignete endokrine Therapien beinhalten Diethylstilbestrol (DES), Tamoxifen®, LHRH-antagonisierende Wirkstoffe, Progestine, Anti-Progestine usw.
C. Assays zum Nachweis von erbß-2-Ligand
• Die Blockierungspeptide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Anwesenheit des erbB-2-Liganden nachzuweisen. Die Blockierungspeptide der Erfindung können also in der Histologie und Biopsie eingesetzt werden, um die Expression von erbB-2-Liganden bei einem Patienten nachzuweisen, der an Brust-, Leber-, Eierstock-, Lungen-, Kolonkarzinomen und dergleichen leidet. Dieser Nachweis kann mit Hilfe einer Vielzahl von Assays bewerkstelligt werden. Zum Beispiel ist es durch radioaktives Markieren der Blockierungspeptide möglich, den erbB-2-Liganden durch die Verwendung von Bindungsassays nachzuweisen. Eine beliebige Zahl von Assays kann entwickelt werden, ganz wie der bekannte Immunoassay, außer dass ein Blockierungspeptid der Erfindung anstelle eines Antikörpers verwendet wird. Fluoreszenz-, Enzym- oder andere geeignete Marker können bei solchen Assays ebenfalls verwendet werden.
• Alternativ dazu kann der Nachweis von erbB-2-Ligand auch durch in-vivo- Bildgebungstechniken bewerkstelligt werden, bei denen einem Patienten die markierten Blockierungspeptide verabreicht werden und die Anwesenheit des Brust-, Eierstock-, Leber-, Lungen- oder Kolonkarzinoms, das erbß-2- Ligand exprimiert, nachgewiesen wird, ohne zuerst eine Gewebeprobe zu entnehmen. Solche in-vivo-Nachweisverfahren haben den Vorteil, dass sie weniger invasiv sind als andere Nachweisverfahren und außerdem in der Lage sind, die Anwesenheit von ligandexprimierenden Zellen in Gewebe nachzuweisen, das nicht leicht aus dem Patienten entnommen werden kann.
• Im Einklang mit den oben diskutierten Assays können Blockierungspeptide unter Verwendung einer Vielzahl von Markern und Markierungsmethoden markiert werden. Beispiele für Typen von Markern, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind unter anderem Enzymmarker, Radioisotopenmarker, nichtradioaktive Isotopenmarker, Fluoreszenzmarker, Toxinmarker und Chemilumineszenzmarker. Beispiele für geeignete Enzymmarker sind Malat-Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuclease, Δ5-Steroid- Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, α-Glycerinphosphat-Dehydrogenase, Triosephosphat-Isomerase, Peroxidase, Alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucose-Oxidase, β-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholin- Esterase usw.
• Beispiele für geeignete Radioisotopenmarker werden dem Fachmann ohne weiteres einfallen. Geeignete nichtradioaktive Isotopenmarker zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann ebenfalls bekannt sein. Beispiele für geeignete Fluoreszenzmarker sind ein Fluorescein-Marker, ein Isothiocyanat-Marker, ein Rhodamin-Marker, ein Phycoerythrin-Marker, ein Phycocyanin-Marker, ein Allophycocyanin-Marker, ein o-Phthalaldehyd-Marker, ein Fluorescamin-Marker usw.
• Beispiele für geeignete Toxinmarker sind Diphtherie-Toxin, Ricin und Cholera-Toxin. Beispiele für Chemilumineszenzmarker sind ein Luminal- Marker, ein Isoluminal-Marker, eine Marker in Form eines aromatischen Acridiniumesters, ein Imidazol-Marker, ein Acridiniumsalz-Marker, ein Oxalsäureester-Marker, ein Luciferin-Marker, ein Luciferase-Marker, ein Aequorin-Marker usw.
• Der Fachmann wird noch weitere geeignete Marker kennen, die im Einklang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Die Bindung dieser Marker an die Blockierungspeptide der Erfindung kann unter Verwendung von Standardtechniken bewerkstelligt werden, die dem Fachmann üblicherweise bekannt sind. Typische Techniken sind beschrieben in Kennedy et al., Clin. Chim. Acta, 70 : 1-31 (1976), und Schurs et al., Clin. Chim. Acta, 81 : 1-40 (1977). Kupplungstechniken, die in der letzteren Literaturstelle genannt sind, sind das Glutaraldehyd-Verfahren, das Periodat-Verfahren, das Dimaleinimid-Verfahren und das m-Maleinimidobenzyl-Nhydroxysuccinimidester-Verfahren; auf alle diese Verfahren wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
• Der Nachweis von Blockierungspeptiden kann durch die Verwendung von Trägern verbessert werden. Zu den wohlbekannten Trägern gehören Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Der Träger kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung seiner Natur nach entweder in gewissem Ausmaß löslich oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch jede mögliche strukturelle Konfiguration haben, solange das gekoppelte Molekül in der Lage ist, an einen Liganden zu binden. Die Trägerkonfiguration kann also sphärisch sein, wie bei einem Kügelchen, oder zylindrisch, wie bei der Innenfläche eines Reagenzglases oder der Außenfläche eines Stabes. Alternativ dazu kann die Oberfläche auch flach sein, wie bei einer Folie, einem Prüfstreifen usw. Dem Fachmann werden noch viele andere geeignete Träger für die Bindung von Blockierungspeptiden einfallen, oder er wird welche durch Routineexperimente herausfinden können.
• Die Bindungsmoleküle (Blockierungspeptide) der vorliegenden Erfindung können auch für die Verwendung in Assays des immunometrischen Typs angepasst sein, die auch als "zweiseitige" oder "Sandwichassays" bekannt sind. Bei einem typischen immunometrischen Assay wird eine Menge nicht markiertes Blockierungspeptid an einen festen Träger gebunden, der in der getesteten Flüssigkeit (z. B. Blut, Lymphe, verflüssigtem Stuhl, Gewebehomogenisat usw.) unlöslich ist, und eine Menge nachweisbar markiertes lösliches Blockierungspeptid wird hinzugefügt, um den Nachweis und/oder die Quantifizierung des ternären Komplexes zu ermöglichen, der zwischen dem in fester Phase vorliegenden Blockierungspeptid, dem Liganden und dem markierten Blockierungspeptid entsteht. Der Fachmann wird sich darüber im klaren sein, dass in den immunometrischen Assays gemäß der Erfindung auch Antikörper anstelle von oder in Kombination mit Blockierungspeptiden verwendet werden können.
• Zu den typischen immunometrischen Assays gehören "Vorwärts"-Assays, bei denen das an die feste Phase gebundene Blockierungspeptid zuerst mit der getesteten Probe in Kontakt gebracht wird, um das Antigen durch Bildung eines binären Festphasensystems Blockierungspeptid/Ligand aus der Probe zu extrahieren. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um die Reste der Flüssigkeitsprobe einschließlich nicht umgesetztem Liganden, falls vorhanden, zu entfernen, und dann mit der Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge markiertes Blockierungspeptid (das als "Reportermolekül" fungiert) enthält. Nach einer zweiten Inkubationszeit, damit das markierte Molekül einen Komplex mit dem über das unmarkierte Blockierungspeptid an den festen Träger gebundenen Liganden bilden kann, wird der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um das nicht umgesetzte markierte Blockierungspeptid zu entfernen. Dieser Typ des Vorwärts-Sandwich-Assays kann ein einfacher "ja/nein"- Assay sein, um zu bestimmen, ob erbB-2-Ligand vorhanden ist, oder er kann quantitativ gestaltet werden, indem man die Messung des markierten Blockierungspeptids mit derjenigen vergleicht, die man bei einer Standardprobe erhält, die bekannte Mengen an Ligand enthält. Solche "zweiseitigen" oder "Sandwichassays" werden beschrieben von Wide auf Seite 199-206 von Radioimmune Assay Method, Hrsg. Kirkbam und Hunter, E. & S. Livingstone, Edinburgh, 1970, außer dass man den Antikörper durch ein Blockierungspeptid ersetzen würde. Kombinationen von Antikörpern und Blockierungspeptiden können ebenfalls verwendet werden.
• In einem anderen Typ von "Sandwichassay", der ebenfalls geeignet sein kann, um den erbB-2-Liganden nachzuweisen, werden der sogenannte "simultane" und der "umgekehrte" Assay verwendet. Ein simultaner Assay beinhaltet einen einzigen Inkubationsschritt, da das an den festen Träger gebundene Blockierungspeptid und das markierte Blockierungspeptid beide gleichzeitig zu der getesteten Probe gegeben werden. Nachdem die Inkubation beendet ist, wird der feste Träger gewaschen, um die Reste der Flüssigkeitsprobe und des nicht komplexierten markierten Peptids zu entfernen. Dann wird die Anwesenheit von markiertem Blockierungspeptid, das an den festen Träger gebunden ist, wie beim herkömmlichen "Vorwärts"-Sandwichassay bestimmt.
• Im "umgekehrten" Assay folgt auf eine schrittweise Zugabe einer Lösung von markiertem Blockierungspeptid zu der Flüssigkeitsprobe nach Ablauf einer geeigneten Inkubationszeit die Zugabe von nicht markiertem Blockierungspeptid, das an einen festen Träger gebunden ist. Nach einer zweiten Inkubation wird die feste Phase in herkömmlicher Weise gewaschen, um sie von den Resten der getesteten Probe und der Lösung des nicht umgesetzten Blockierungspeptids zu befreien. Die Bestimmung des markierten Blockierungspeptids, das an einen festen Träger gebunden ist, erfolgt dann wie im "simultanen" und im "Vorwärts"-Assay.
• Wie oben erklärt, erfordern die immunometrischen Assays auf erbB-2- Ligand, dass das besondere Bindungsmolekül mit einem "Reportermolekül" markiert ist. Diese oben identifizierten Reportermoleküle oder Marker sind üblich und in der Technik wohlbekannt. Kein einzelnes Enzym ist zur Verwendung als Marker bei jedem vorstellbaren immunometrischen Assay ideal. Stattdessen muss man bestimmen, welches Enzym für ein bestimmtes Assaysystem geeignet ist. Kriterien, die für die Auswahl von Enzymen wichtig sind, sind die Wechselzahl des reinen Enzyms (die Zahl der Substratmoleküle, die pro aktives Zentrum des Enzyms pro Zeiteinheit in das Produkt umgewandelt werden), die Reinheit des Enzympräparats, die Empfindlichkeit des Nachweises seines Produkts, die Leichtigkeit und Geschwindigkeit des Nachweises der Enzymreaktion, das Fehlen von Störfaktoren oder von enzymartiger Aktivität in der Testflüssigkeit, die Stabilität des Enzyms und seines Konjugats, die Verfügbarkeit und die Kosten des Enzyms und seines Konjugats und dergleichen. Zu den Enzymen, die als bevorzugte Marker in den immunometrischen Assays der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gehören Peroxidase, Alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Urease, Glucose-Oxidase, Glycoamylase, Malat-Dehydrogenase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase.
• Außerdem sind die Materialien zur Verwendung in den Assays der Erfindung idealerweise zur Herstellung eines Kits geeignet. Ein solcher Kit kann eine Trägereinrichtung umfassen, die kompartimentiert ist, um auf engstem Raum einen oder mehrere Behälter, wie Ampullen, Reagenzgläser und dergleichen, aufzunehmen. Jeder dieser Behälter umfasst eines der getrennten Elemente, die bei dem Verfahren verwendet werden sollen.
• Zum Beispiel kann einer der Behälter ein gebundenes Blockierungspeptid umfassen. Ein solches Peptid kann an eine getrennte feste Phase oder direkt an die Innenwände eines Behälters gebunden sein. Ein zweiter Behälter kann nachweisbar markierten Antikörper oder nachweisbar markiertes Blockierungspeptid in lyophilisierter Form oder in Lösung umfassen.
• Der Träger kann zusätzlich auch noch mehrere Behälter enthalten, die jeweils verschiedene vorbestimmte und bekannte Mengen an Ligand umfassen. Diese letzteren Behälter können dann verwendet werden, um eine Standardkurve zu erstellen, anhand derer die Ergebnisse, die man von der Probe erhält, die die unbekannte Menge des Liganden enthält, interpoliert werden können.
D. Anwendungen von Blockierungspeptiden
• Die Blockierungspeptide der vorliegenden Erfindung haben eine Vielzahl von therapeutischen und diagnostischen Anwendungen. Zum Beispiel können therapeutische Anwendungen die Krebstherapie bei einem Patienten beinhalten, von dem man vermutet, dass er an Krebs oder anderen verwandten Krankheiten leidet. Insbesondere kann das Blockierungspeptid der vorliegenden Erfindung, das die 8-Aminosäure-Sequenz von RL2 enthält, verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die Adenokarzinomzellen aufweisen, die den erbB-2-Liganden erzeugen und/oder die erbß-2- Rezeptorproteine überexprimieren. In ähnlicher Weise kann ein Blockierungspeptid, das die 8-Aminosäure-Sequenz von RL2-K aufweist, verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die Adenokarzinomzellen aufweisen, die den EGF-Liganden erzeugen und/oder EGFR überexprimieren.
• Ein Typ der Behandlung kann die Verwendung des Blockierungspeptids beinhalten, das an ein therapeutisches Mittel gekoppelt ist. Durch Verabreichen einer effektiven Menge des Blockierungspeptids, das die 8-Aminosäure-Sequenz von RL2-R aufweist und mit dem therapeutischen Mittel gekoppelt ist, an einen Patienten können die Adenokarzinomzellen in dem Patienten, die erbB-2-Ligand exprimieren, im Wachstum gehemmt oder abgetötet werden, so dass man eine Behandlung für Krebs erhält.
• Gemäß dem Verfahren der Krebsbehandlung der Erfindung ist das konjugierte Blockierungspeptid in der Lage, Karzinomzellen aufgrund ihrer Assoziation mit dem erbß-2-Liganden zu erkennen und an diese zu binden. Ohne die Erfindung einschränken zu wollen, kann der Mechanismus der Bindung an die Krebszelle die Erkennung von erbB-2 oder des an der Zelloberfläche lokalisierten Liganden beinhalten, oder die Binding kann aufgrund der Expression und/oder Sekretion des Liganden erfolgen.
• Sobald das konjugierte Blockierungspeptid durch Wechselwirkung mit dem Liganden an die Adenokarzinomzelle gebunden ist oder in enger Verbindung mit dieser steht, ist das therapeutische Mittel in der Lage, diese Zelle zu hemmen oder zu töten. In dieser Weise ist die Therapie der vorliegenden Erfindung hinsichtlich eines bestimmten Angriffspunkts selektiv, z. B. für Krebszellen, die mit dem erbB-2-Liganden assoziiert sind.
• Normale Zellen und andere Zellen, die nicht mit dem erbß-2-Liganden assoziiert sind (Zellen, die erbB-2-Ligand nicht exprimieren oder binden), können größtenteils nicht durch die Therapie mit dem Blockierungspeptid, das die 8-Aminosäure-Sequenz von RL2-R enthält, beeinflusst werden.
• Alternativ dazu kann das Blockierungspeptid der vorliegenden Erfindung auch dazu verwendet werden, die Induktion der Proliferation von Adenokarzinomzellen zu verhindern oder zu hemmen. Zum Beispiel wird bei Krebszellen, die den p185erbB-2-Rezeptor enthalten, in Gegenwart niedriger Konzentrationen des erbß-2-Liganden eine Proliferation induziert. Zu verhindern, dass der als erbB-2-Ligand fungierende Wachstumsfaktor mit seinem Rezeptor wechselwirkt, könnte eine Methode sein, um einen Krebspatienten zu behandeln.
• Gemäß dem Verfahren der Hemmung oder Verhinderung der Zellproliferation der vorliegenden Erfindung ist das Blockierungspeptid in der Lage, an den erbß-2-Liganden zu binden. Die Bindung des sezernierten erbß-2- Liganden in vivo bildet einen Komplex zwischen Ligand und Blockierungspeptid und kann daher die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung entweder sterisch oder in anderer Weise verhindern. Die vorliegende Erfindung stellt also eine Behandlung bereit, um die Proliferation von Adenokarzinomzellen bei einem Patienten zu verhindern oder zu hemmen, indem man einem solchen Patienten eine wirksame Menge eines Blockierungspeptids verabreicht.
• Man wird sich darüber im klaren sein, dass man noch mehrere andere therapeutische Verwendungen der Blockierungspeptide der vorliegenden Erfindung ins Auge fassen kann. Solche Therapien können die Verwendung anderer bekannter Behandlungstechniken in Kombination mit den Blockierungspeptiden der Erfindung beinhalten. Die vorliegende Erfindung soll nicht auf die beschriebene therapeutische Behandlung eingeschränkt sein, die also nur zur Veranschaulichung angegeben wird.
• Weiterhin kann die Verabreichung einer Menge der Blockierungspeptide der vorliegenden Erfindung, die ausreicht, um eine Adenokarzinomzelle zu hemmen oder zu töten, in Abhängigkeit von mehreren Faktoren variieren; dazu gehören der Typ der malignen Zelle, das Körpergewicht des Patienten, der Typ des verwendeten therapeutischen Mittels und dergleichen. Der Fachmann wird sich darüber im klaren sein, dass die zum Hemmen oder Töten einer bestimmten malignen Zelle in vitro oder in vivo notwendige Menge leicht mit einem minimalen Aufwand an Routineversuchen bestimmt werden kann. Eine effektive Menge solcher Blockierungspeptide kann parenteral, subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal oder oral verabreicht werden, Außerdem können pharmazeutische Präparate hergestellt werden, die geeignete Arzneimittelträger, Hilfsstoffe oder Verbindungen, die die Verarbeitung der Blockierungspeptide der Erfindung als pharmazeutische Mittel erleichtern oder ihre Stabilität erhöhen, enthalten. Zu den möglichen diagnostischen Verwendungen der Blockierungspeptide der vorliegenden Erfindung (aufgrund ihrer Bindungsaktivität an Liganden) gehören zum Beispiel der Nachweis von erbß-2-Ligand in einer Probe, die von einem Patienten erhalten wurde. Bei diesen Proben kann es sich um Körpergewebe, Körperflüssigkeiten (wie Blut, Urin, Tränen, Speichel, Serum und Cerebrospinalflüssigkeit), Faeces, Zellextrakte und dergleichen handeln.
• Gemäß dem Verfahren zum Nachweis von erbß-2-Liganden werden die erbB-2-Liganden in vitro in Zellkulturmedium sezerniert. Ein weiterer Wachstumsfaktor, TGFα, der ebenfalls in vitro sezerniert wird, wurde in Körperflüssigkeiten von Krebspatienten identifiziert. Folglich kann der Wachstumsfaktor (erbß-2-Ligand) in Körperflüssigkeiten, Stuhl usw. eines Krebspatienten nachgewiesen werden und somit unter Verwendung der Assays der Erfindung nachweisbar sein.
• Durch Testen auf erbß-2-Ligand gemäß der Erfindung in einer Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, kann man also ein Verfahren zum Diagnostizieren von Krebs erhalten. Das heißt, der Nachweis von erbB-2- Ligand in einer Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, zeigt die Anwesenheit von erbß-2-Ligand exprimierenden Zellen in einem Patienten an. Da das Blockierungspeptid weiterhin für erbB-2-Ligand spezifisch ist, kann der Assay Informationen über die Biologie des Tumors eines Patienten liefern. Zum Beispiel ist bekannt, dass Krebspatienten mit Adenokarzinomzellen, die den erbß-2-Rezeptor überexprimieren, eine viel kürzere krankheitsfreie Zeit und eine insgesamt schlechtere Überlebenschance haben als Krebspatienten, die keine erbB-2-Überexpression zeigen. Der Nachweis von als erbB-2-Ligand fungierendem Wachstumsfaktor kann also als prognostischer Test dienen, der es dem Arzt erlaubt, eine wirkungsvollere Therapie zur Behandlung des Patienten zu wählen. Ähnliche Assays können verwendet werden, um EGFR-Liganden (EGF und TGFα) aufgrund der Bindung an EGFR-Blockierungspeptide nachzuweisen.
Beispiele Beispiel 1
• Auswahl eines kleinen Peptids, das Liganden bindet Ein Vier-Domänen-Modell für die Organisation von EGFR-ECD wurde vorgeschlagen, bei dem die Unterdomäne III die meisten Determinanten beisteuert, die an der Wechselwirkung mit Liganden und an der Signalübermittlung beteiligt sind, wobei die cysteinreichen flankierenden Unterdomänen II und IV miteinander in Kontakt stehen und sich nahe bei der Plasmamembran befinden (Ullrich et al., Cell, 61 : 203 (1990); Lax et al., EMBO J., 8 : 421 (1989)). Die p185erbB-2- und die EGFR-ECD-Sequenz sind divergiert, was zu einer Gesamthomologie von 44% führte (Yamamoto et al., Nature, 319 : 230 (1986)). Überraschenderweise haben wir gefunden, dass die extrazelluläre Unterdomäne III von p185erB-2 eine kurze hydrophile Peptidsequenz, L453-E460, mit 87,5% Homologie mit ihrem EGFR- Gegenstück (eine Aminosäure Unterschied bei K459) aufweist. Wir waren der Ansicht, diese hochgradig konservierte Peptidsequenz könnte eine Hauptdeterminante für die Wechselwirkung von gp30-Protein mit entweder EGFR oder p185erbB-2 oder EGFR-bindenden Molekülen wie monoklonalen Antikörpern oder Wachstumsfaktoren bilden. Zusammen mit dem Peptid, das dem Lokus L453-E460 entspricht (RL2), wurden zwei Peptide, die den Bereichen abnehmender Homologie in der Unterdomäne III entsprechen, und drei Peptide, die Sequenzen in der Unterdomäne II entsprechen, ebenfalls als Kontrollen getestet (Fig. 1).
• Diese Peptide wurden in bezug auf Wirkungen auf die durch p185erbB-2 oder EGFR ausgelöste mitogene Signalübermittlung in MDA-MB-453- bzw. MDA- MB-468-Human-Brustkrebszellen bewertet; alternativ dazu wurden auch SK-Br-3-Humanbrustkrebszellen verwendet. SK-Br-3- (ATCC HTB30), MDA- MB-453- (ATCC HTB131) und MDA-MB-468-Zellen (ATCC HTB132) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) erhalten. Wie bereits zuvor bestimmt (Lupu et al., Science, 249 : 1552 (1991)), exprimieren SK-Br-3-Zellen große Mengen an p185erbB-2 und mäßige Mengen an EGFR; MDA-MB-453-Zellen exprimieren große Mengen an p185erbB-2 und nachweisbare Mengen an EGFR; umgekehrt exprimieren MDA-MB-468-Zellen große Mengen an EGFR und keine nachweisbaren Mengen an p185erbB-2.
• Um zu untersuchen, ob das RL2-Peptid spezifisch entweder eine extrazelluläre p185erB-2- oder eine extrazelluläre EGFR-Bindungsstelle darstellen könnte, testeten wir die oben genannten Peptide in kompetitiven p185erbB-2- oder EGFR-Bindungsassays. Da iodiertes gp30 nicht zur Verfügung stand, wurden die kompetitiven p185erB-2- und EGFR-Assays unter Verwendung von iodiertem monoklonalem Antikörper 4D5 bzw. iodiertem EGF durchgeführt. Die monoklonalen p185erbB-2-Antikörper 4D5 und 7C2 wurden von Genentech, Inc., South San Francisco, CA, bereitgestellt. Es wurde gezeigt, dass 4D5 die Tyrosin-Phosphoryfierung von p185erbB-2 in SK-Br-3-Human- Brustkrebszellen und die Wachstumshemmung von p185erbB-2 überexprimierenden Zellen induziert (Hudziak et al., Molec. Cell. Biol., 9 : 1165 (1989); Kumar et al., Mol. Cell. Biol., 11 : 979 (1991), während 7C2 (Fendly et al., Cancer Res., 50 : 1550 (1990)) keine biologische Reaktion induziert. Es wurde gezeigt, dass das gp30-Protein mit 4D5 um die Bindung an p185erbB-2 und mit EGF um die Bindung an EGFR konkurriert und ähnliche biologische Reaktionen induziert wie diejenigen, die entweder vom 4D5-Antikörper in Zellen mit p185erbB-2-Überexpression oder von EGF in Zellen mit EGFR-Überexpression induziert werden (Lupu et al., Science, 249 : 1552 (1991); Lupu et al., Biochemistry, im Druck; Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 2287-2291 (1992)).
• Von den getesteten Peptiden verdrängte nur RL2 in dosisabhängiger Weise (B/T 50 : 8 uM) die Bindung von iodiertem 4D5 an SK-Br-3 (Fig. 2). Keines der im Bereich von 2-40 uM getesteten Peptide beeinflusste entweder die Bindung von 1 nM iodiertem 7C2-Kontrollantikörper oder die Bindung von 1 nM iodiertem EGF an MDA-MB-468-Zellen wesentlich (nicht gezeigt).
• Es wurde weiter gezeigt, dass iodiertes RL2 spezifisch an eine 4D5-Affinitätssäule bindet. Zuerst wurde RL2-Peptid mit Iodogen iodiert und mit HPLC (high-pressure liquid chromatography) gereinigt; die spezifische Aktivität betrug 26 000 cpm pro ug Peptid. Eine Fällung mit Trichloressigsäure (TCA) zeigte eine Ausbeute von 98,8%. 3 · 10&sup6; cpm iodiertes RL2 wurden auf eine Protein-A-Sepharose-Säule geladen, die mit 4D5 gekoppelt war (prozentuale Kopplung: 98,5%). Elutionen wurden mit steigenden Konzentrationen von MgCl&sub2; von 1 bis 5 M durchgeführt (siehe Tabelle 1). Die spezifische Elution, die in Tabelle 1 mit * markiert ist, wurde mit 2 M MgCl&sub2; erhalten. Der Durchfluss enthielt nur Radioaktivität auf dem Untergrundniveau.
• Tabelle 1. Bindung von Peptid an eine 4D5-Affinitätssäule
• * = spezifische Elution von iodiertem RL2.
• Als Peptidsequenz, die von 4D5 erkannt wird, erschien L453-E460 also als mögliche bedeutsamere Determinante für die gp30-Bindung an p~18SerbB-2 Das Fehlen einer nennenswerten Hemmung bei der EGF-Bindung an den EGFR deutete auf keine oder geringfügigere Implikationen bei der gp30- Bindung an den EGFR hin.
Beispiel 2 Wirkungen des Blockierungspeptids auf die Phosphorylierung
• Um RL2-Blockierungswirkungen näher zu charakterisieren, analysierten wir die homologen Peptide auf ihre Fähigkeit, die durch gp30 entweder in p185erbB-2 oder EGFR oder beiden induzierte Tyrosin-Phosphorylierung zu verhindern. Diese Untersuchung wurde zuerst unter Verwendung von invitro-Tyrosin-Phosphorylierungsassays für umfassende Fälle durchgeführt. In MDA-MB-453-Zellen hemmte 0,06 bis 60 uM RL2 sowohl das Grundniveau als auch gp30-stimulierte Niveaus von p185erbB-2 Tyrosin-Phosphorylierung stark um 70 bis 96% bzw. 80%. (Densitometrische Analysen von Autoradiogrammen wurden unter Verwendung eines SAMBA-4000-Systems (Dynatech Laboratories) durchgeführt. Die erhaltenen Werte wurden einer Hintergrundkorrektur unterzogen und als prozentuales Verhältnis zur Kontrolle angegeben. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn Effekte von mehr als 10% gegenüber den Kontrollen auftraten.)
• Bei MDA-MB-468-Zellen hemmte 60 uM RL2 nur das Grundniveau der EGFR-Tyrosin-Phosphorylierung auf ein geringeres Maß (71%), nicht aber das gp30-stimulierte Niveau. In ähnlicher Weise zeigte RL2 keine Wirkung von EGFR auf die EGF-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung bei MDA-MB- 468-Zellen. Obwohl RL1 einer Peptidsequenz entsprach, die nahe bei L453- E460 lag und möglicherweise mit dieser kooperierte, induzierte RL1 keine wesentliche Hemmung, wenn es bei ähnlichen Konzentrationen getestet wurde (Fig. 3). Die Peptide P1, P2, P3 und P4 (30 uM) zeigten keine Wirkung (nicht gezeigt). Die Spezifität von RL2-Blockierungswirkungen auf die p185erbB-2 Tyrosin-Phosphorylierung wurde durch in-vivo-Phosphorylierungsassays und anschließende Phosphoaminosäure-Analyse bestätigt. Die p185erbB-2 Tyrosin-Niveaus der Phosphorylierung nahmen sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit einer gp30-Stimulierung um 50 bzw. 26% ab (Fig. 4).
• Die obigen Ergebnisse zeigen, dass RL2 ausschließlich in die gp30-induzierte Aktivierung von p185erbB-2 eingreift, ohne an der gp30-induzierten Aktivierung des EGFR beteiligt zu sein. Weiterhin lässt die Beobachtung von hemmenden Wirkungen von RL2 bei Alleinverwendung auf MDA-MB-453- und MDA-MB-468-Zellen ein Grundniveau von zu sezernierenden vermutlichen Wachstumsfaktoren vermuten, und die Wirkung auf die p185erbB-2- oder EGFR-Phosphorylierung erfolgt über entweder vollständige oder partielle Wechselwirkungen mit der L453-E460-Determinante.
Beispiel 3
• Wirkungen des Blockierungspeptids auf die Proliferation Um zu testen, ob RL2-Interferenzen auf der Ebene der p185erbB-2 Aktivierung zu Hemmungen der Proliferation von p185erbB-2 überexprimierenden Zellen führen könnte, bewerteten wir die Wirkungerfvon p185erbB-2-homologen Peptiden auf das verankerungsunabhängige Wachstum von MDA-MB- 453-Zellen. Angesichts der zuvor beobachteten RL2-Wirkungen auf das Grundniveau der EGFR-Tyrosin-Phosphoryfierung bei MDA-MB-468-Zellen wurde diese Zeltlinie auch auf die Möglichkeit weiterer RL2-Wirkungen auf die mitogene Signalübermittlung von EGFR getestet. Das verankerungsunabhängige Wachstum von MDA-MB-453-Zellen wurde in Gegenwart von 6- 60 uM RL2-Peptid um 72% gehemmt, während P1, P2, P3, P4 und RL1 keine wesentliche Wirkung zeigten, als sie in ähnlichen Konzentrationen getestet wurden (Fig. 5A). MDA-MB-468-Zellen zeigten auf keines der Peptide eine Reaktion, reagierten jedoch auf 10 nM EGF, das als positive Kontrolle verwendet wurde (nicht gezeigt). Zusammen mit dem Fehlen einer RL2-Wirkung sowohl auf die EGF-Bindungsverdrängung als auch auf die gp30-stimulierte EGFR-Tyrosin-Phosphorylierung schließt dies die Implikation der L453-E460-Determinante bei der mitogenen Signalübermittlung von EGFR aus.
• Um antiproliferative Wirkungen von RL2 als Blockierundswirkung auf die durch p185erbB-2 Ligand vermittelten Effekte zu veranschaulichen, testeten wir die Wirkung dieses Peptids und der ECD von p185erbB-2 auf das verankerungsunabhängige Wachstum von SK-Br3-Zellen in Gegenwart von stimulierenden Konzentrationen von entweder gp30- oder p75-Protein, wobei von dem letzteren bekannt ist, dass es ausschließlich mit p185erbB-2 wechselwirkt (Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 2287-91 (1992)). Die hemmenden Wirkungen von RL2 und p185erbB-2-ECD wurden sowohl durch gp30 als auch durch p75 vollständig rückgängig gemacht. Die Tatsache, dass gp30 die Wirkung von RL2 rückgängig machte, bestätigte die Implikation der L453-E460-Determinante bei der Proliferationsinduktion von gp30. Angesichts der Tatsache, dass p75 durch SK-Br3-Zellen sezerniert wird und mit monoklonalem 4D5-Antikörper um die Bindung an p185erbB-2 konkurriert (Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 2287-91 (1992)), zeigt die Aufhebung der Wirkung durch p75 an, dass RL2 ein störendes Agens bei der autokrinen Regulation der Proliferation von p185erbB-2 überexprimierenden Zellen ist (Fig. 5B).
Beispiel 4 Blockierungspeptid für EGF
• RL2 und RL2-K unterscheiden sich nur um eine Aminosäure in Position 459- EGFR/454-erbB-2 (Lys/Arg). Das Fehlen einer Wirkung von RL2 auf die EGF-Bindung an EGFR bei MDA-MB-468-Zellen zeigte, dass die von p185erbB-2 abgeleitete 8-mer-Sequenz keine Wirkung auf die mitogene Signalübermittlung von EGFR hat. Das folgende Experiment testete, ob ein synthetisches Peptid, das von der L448-E455-Sequenz des EGFR abgeleitet war (RL2-K) die Signalübermittlung von EGFR spezifisch hemmen könnte.
• Die Wirkungen der Peptide in MDA-MB-468-Zellen wurden hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die EGF-Bindung, die EGFR-Tyrosin-Phosphorylierung und die Koloniebildung untersucht (Fig. 6). Im Unterschied zu RL2 blockierte RL2-K die Bindung von iodiertem EGF an den EGFR in dosisabhängiger Weise (Fig. 6A). In-vitro-Assays zeigten, dass 6-60 uM RL2-K bis zu 85% der EGF-Stimulierung der EGFR-Tyrosin-Phosphorylierung hemmte, während RL2 keine Wirkung hatte (Fig. 6B). Dagegen zeigte RL2-K keine wesentliche Wirkung, als es in bezug auf die Koloniebildung von MDA-MB- 453-Zellen getestet wurde (Tabelle 2). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass RL2-K die Signalübermittlung von EGFR spezifisch blockiert und keine Wirkung auf die p185erbB-2-Aktivität zeigt. Tabelle 2. RL2- und RL2-K-Wirkuncien auf das verankerungsunabhängiicie Wachstum von MDA-MB-453-Zellen
• * Die Zellen wurden so behandelt, wie es angegeben ist. Der monoklonale Antikörper 4D5 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Genentech, CA) und das RL2-Peptid wurden als positive Kontrollen verwendet. Weichagar-Klonierungsassays wurden so durchgeführt, wie es schon früher beschrieben wurde (Lupu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 2287-91, 1992). Kolonien, die größer als 60 um waren, wurden unter Verwendung eines Baush & Lomb Stern Cell Colony Counter (Artex Systems Corp.) gezählt. Für jede Gruppe wurden drei Bestimmungen durchgeführt. Die Experimente wurden dreimal durchgeführt und lieferten jeweils ähnliche Ergebnisse.
• Diese Untersuchungen lassen vermuten, dass die Unterdomäne III der extrazellulären Domänen von p185erbB-2 bzw. EGFR an der Bindung von Wachstumsfaktoren beteiligt ist und dass die Spezifität der Bindung der Wachstumsfaktoren an einen der beiden Rezeptoren einem einzigen Aminosäureunterschied auf Position 459/454 zuzuschreiben ist. Arg in p185erbB-2 und Lys im EGFR sind beides positiv geladene Aminosäuren, die häufig an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind. Eine Vielzahl von Verbindungen, bei denen die Sekundärstruktur dieser Determinanten nachgebildet ist, kann verbesserte Konformationsstabilitäten und höhere biologische Aktivitäten aufweisen. Auf p185erbB-2 gerichtete Therapien wurden entwickelt, wie etwa gegen seine extrazelluläre Domäne gerichtete monoklonale Antikörper. Die Charakterisierung von synthetischen Peptiden, die der Bindungsstelle für Wachstumsfaktoren in p185erbB-2 und dem EGFR entsprechen, stellt eine alternative Strategie für die Behandlung humaner maligner Erkrankungen dar, und zwar auf der Grundlage des Entwerfens neuer Moleküle, die autokrine/parakrine Schleifen durchbrechen, die durch solche überexprimierten Rezeptoren und ihre Liganden definiert sind.
• Die biologische Bedeutung einer p185erbB-2 Überexpression, die zu geringen Überlebenschancen bei Brust-, Eierstock- oder Magenkrebs beiträgt, ist schwer fassbar geblieben. Die konstitutive Kinase- und transformierende Wirkung von p185erbB-2, wenn es in NIH-3T3-Zellen überexprimiert wird (Lonardo et al., Mol. Cell. Biol., 2 : 992 (1990)), legt eine konstitutive Aktivierung von p185erbB-2 infolge einer Überexpression und die anschließende Wachstumsstimulierung von Tumorzellen ohne entgegenwirkende Faktoren als mögliche Erklärung nahe. Die Sekretion von p185erbB-2- Liganden mit mitogenen Eigenschaften durch humane Brustkrebs-Zelllinien spricht jedoch dafür, dass p185erbB-2 vollständig an der autokrinen Regulierung des Wachstums von Brusttumoren beteiligt ist. In dieser Hinsicht weisen die hier offenbarten Daten darauf hin, dass die L453-E460- Determinante an der Vermittlung der Bindung von gp30 und p75 an p185erbB-2 beteiligt ist. Blockierungspeptide wie das RL2-Peptid erscheinen also als neue Kandidaten, um die autokrine Schleife, an der das erbB-2- Produkt beteiligt ist, zu unterbrechen.
Sequenzprotokoll (1) Allgemeine Angaben:
• (i) Anmelder:
• Lupu, Ruth
• Lippman, Marc E
• (ii) Titel der Erfindung: Bindungspeptide, die mit Wachstumsfaktoren wechselwirken, die als Liganden des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors und des erbB-2-Rezeptors wirken
• (iii) Zahl der Sequenzen: 2
• (iv) Korrespondenzadresse:
• (A) Adressat: Banner, Birch, McKie & Beckett:
• (B) Straße: 1001 G Street, N. W.
• (C) Stadt: Washington
• (D) Bundesstaat: DC
• (E) Land: USA
• (F) ZIP: 20005-4597
• (v) computerlesbare Form:
• (A) Typ des Mediums: Diskette
• (B) Computer: IBM-PC-kompatibel
• (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
• (D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
• (vi) Daten zur aktuellen Anmeldung:
• (A) Anmeldungsnummer: WO
• (B) Tag der Einreichung: 29. April 1993
• (C) Klassifikation:
• (vii) Daten zu früheren Anmeldungen:
• (A) Anmeldungsnummer: US 07/875,788
• (B) Tag der Einreichung: 29. April 1992
• (viii) Abgaben zum Vertreter:
• (A) Name: Hoscheit, Dale H
• (B) Registriernummer: 19,090
• (C) Internes Zeichen: 2899.43167
• (ix) Telekommunikationsangaben:
• (A) Telefon: 202-508-9100
• (B) Telefax: 202-508-9299
• (2) Informationen für SEQ ID NO : 1:
• (i) Sequenzeigenschaften:
• (A) Länge: 8 Aminosäuren
• (B) Typ: Aminosäure
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: Peptid
• (v) Fragmenttyp: intern
• (vi) ursprüngliche Herkunft:
• (A) Organismus: Homo sapiens
• (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID N0 : 1:
• Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu
• 1 5
(2) Informationen für SEQ ID NO : 2:
• (1) Sequenzeigenschaften:
• (A) Länge: 8 Aminosäuren
• (B) Typ: Aminosäure
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: Peptid
• (v) Fragmenttyp: intern
• (vi) ursprüngliche Herkunft:
• (A) Organismus: Homo sapiens
• (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO : 2:
• Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 15

Claims (11)

1. Im wesentlichen reines Blockierungspeptid mit der Aminosäuresequenz Leu-Gly-Leu-Arg-Ser-Leu-Lys-Glu.

2. Im wesentliches reines Blockierungspeptid mit der Aminosäuresequenz Leu-Gly-Leu-Arg-Ser-Leu-Arg-Glu.

3. Verwendung eines im wesentlichen reinen Blockierungspeptids nach einem der Ansprüche 1 oder 2, das dazu fähig ist, einen Liganden des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors oder des erbB-2- Rezeptors zu binden, zur Herstellung eines Medikaments, das in einer Menge zu verabreichen ist, die ausreichend ist, um das Wachstum von Adenokarzinomzellen zu hemmen.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei es sich bei den Zellen um Brust-, Lungen-, Eierstock-, Magen-, Schilddrüsen-, Prostata- oder Speicheldrüsen-Adenokarzinomzellen handelt.

5. Verfahren zur In-vitro-Hemmung des Wachstums von Adenokarzinomzellen, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einem im wesentlichen reinen Blockierungspeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, das dazu fähig ist, einen Liganden des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors oder des erbB-2-Rezeptors zu bin den, in einer Menge, die ausreichend ist, um das Wachstum der Zellen zu hemmen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei den Zellen um Brust-, Lungen-, Eierstock-, Magen-, Schilddrüsen-, Prostata- oder Speicheldrüsen-Adenokarzinomzellen handelt.

7. Verfahren zum Nachweisen von Zellen, die einen Liganden für den erbß-2-Rezeptor in einem Patienten exprimieren, umfassend das:

a) In-Kontakt-Bringen einer von dem Patienten erhaltenen Probe mit einem nachweisbar markierten, im wesentlichen reinen Blockierungspeptid nach Anspruch 1 oder 2, das dazu fähig ist, einen Liganden des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors oder des erbB-2-Rezeptors zu binden, wodurch die Wechselwirkung zwischen dem Liganden und einem der Rezeptoren gehemmt wird, und das

b) Bestimmen des Vorhandenseins eines Liganden in der Probe.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Probe aus der Gruppe bestehend aus Körpergewebe, Blut, Urin, Speichel, Tränen, Serum, Cerebrospinalflüssigkeit und Fäkalien ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei den Zellen um Brust-, Lungen-, Eierstock-, Magen-, Schilddrüsen-, Prostata- oder Speicheldrüsen-Adenokarzinomzellen handelt.

10. Verwendung eines nachweisbar markierten, im wesentlichen reinen Blockierungspeptids nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments, das Zellen in einem Patienten zu verabreichen ist, die einen Liganden für den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF-Rezeptor) exprimieren, wobei

a) das Peptid dazu fähig ist, einen Liganden des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors oder des erbB-2-Rezeptors zu binden, wodurch die Wechselwirkung zwischen dem Liganden und einem der Rezeptoren gehemmt wird, und

b) das Vorhandensein des Liganden durch eine In-vivo-Ganzkörper-Bilderzeugung nachzuweisen ist.

11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei es sich bei den Zellen um Brust-, Lungen-, Eierstock-, Magen-, Schilddrüsen-, Prostata- oder Speicheldrüsen-Adenokarzinomzellen handelt.