PL219845B1

PL219845B1 - Przeciwnowotworowe białko fuzyjne

Info

Publication number: PL219845B1
Application number: PL393578A
Authority: PL
Inventors: Jerzy Szczepan Pieczykolan; Sebastian Dominik Pawlak; Bartłomiej Żerek; Piotr Kamil Rózga
Original assignee: Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Priority date: 2011-01-05
Filing date: 2011-01-05
Publication date: 2015-07-31
Also published as: EP2661496A1; MX2013007872A; PT2661496T; CN103228788A; PL2661496T3; MX339203B; SI2661496T1; JP5797773B2; CN103228788B; HRP20170905T1; RS56095B1; JP2014504868A; BR112013016980A2; BR112013016980B1; DK2661496T3; IL226205A0; LT2661496T; EA201391005A1; UA108778C2; KR101950043B1

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy dziedziny terapeutycznych białek fuzyjnych, zwłaszcza rekombinowanych białek fuzyjnych. Konkretnie, wynalazek dotyczy białek fuzyjnych zawierających fragment sekwencji rozpuszczalnego ludzkiego białka TRAIL w połączeniu z sekwencją krótkiego peptydu o działaniu antyangiogennym, ich zastosowania w terapii, zwłaszcza jako środków przeciwnowotworowych, oraz sekwencji polinukleotydowych kodujących te białka fuzyjne, wektorów ekspresyjnych zawierających te sekwencje polinukleotydowe i komórek gospodarza, zawierających te wektory ekspresyjne.

Należące do rodziny cytokin białko TRAIL (Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis Inducing Ligand), znane także pod nazwą Apo2L (Apo2-Ligand), jest silnym aktywatorem apoptozy w komórkach nowotworowych oraz komórkach zainfekowanych przez wirusy. TRAIL jest naturalnym ligandem występującym w organizmie. Białko TRAIL, jego sekwencję aminokwasową, kodujące sekwencje DNA oraz systemy ekspresji tego białka ujawniono po raz pierwszy w EP0835305A1.

Białko TRAIL działa przeciwnowotworowo poprzez wiązanie się z pro-apoptotycznymi receptorami powierzchniowymi TRAIL 1 i 2 (TRAIL-R1/R2) i aktywowanie tych receptorów. Receptory te, znane także jako DR4 i DR5 (receptor śmierci 4 i receptor śmierci 5), należą do rodziny receptorów TNF i są nadprodukowane przez różne typy komórek nowotworowych. Aktywowanie receptorów może indukować niezależny od genu supresorowego p53 zewnętrzny szlak sygnałowy apoptozy, który poprzez aktywowaną kaspazę-8 prowadzi do aktywacji kaspaz wykonawczych. Uwalniana w wyniku aktywacji przez TRAIL kaspaza-8 może też powodować uwalnianie odciętego białka Bid, które jest translokowane do mitochondrium, gdzie pobudza uwalnianie cytochromu C, w ten sposób pośrednio amplifikując sygnał apoptotyczny z receptorów śmierci.

TRAIL działa selektywnie na komórki nowotworowe, nie wywołując zasadniczo apoptozy w komórkach zdrowych, które wykazują oporność na to białko. W związku z tym dostrzeżono ogromny potencjał białka TRAIL jako środka przeciwnowotworowego działającego na szeroką gamę nowotworów różnych typów, w tym na nowotwory hematologiczne i guzy lite, a przy tym oszczędzającego komórki zdrowe i o potencjalnie relatywnie niewielkich działaniach ubocznych.

Białko TRAIL jest białkiem błonowym typu II o długości 281 aminokwasów, a jego region pozakomórkowy obejmujący aminokwasy 114-281 po rozszczepieniu przez proteazy tworzy rozpuszczalną cząsteczkę sTRAIL (ang. soluble TRAIL), o wielkości 20 kDa, która jest także biologicznie aktywna. Obie formy, TRAIL i sTRAIL, są zdolne do wyzwalania apoptozy poprzez oddziaływanie z receptorami TRAIL obecnymi w komórkach docelowych. Silne działanie przeciwnowotworowe i bardzo niską toksyczność ogólnoustrojową sTRAIL wykazały badania na liniach komórkowych. Również badania kliniczne na ludziach ludzkiego rekombinowanego rozpuszczalnego TRAIL (rhTRAIL, ang. recombinant human TRAIL) o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej aminokwasom 114-281 hTRAIL, znanego pod nazwą INN dulanermin, wykazały jego dobrą tolerancję i brak toksyczności limitującej dawkę. Dotychczas opisywane toksyczne działania rekombinowanych białek TRAIL na komórki wątroby wydają się być związane z obecnością modyfikacji typu znacznika polihistydynowego - TRAIL nieznakowany nie wykazuje toksyczności ogólnoustrojowej.

W trakcie dalszych badań rozwojowych okazało się jednak, że wiele komórek nowotworowych również wykazuje pierwotną lub nabytą oporność na TRAIL (zobacz na przykład WO 2007/022214). Mechanizm oporności na TRAIL nie został dokładnie poznany, uważa się jednak, że może ona przejawiać się na różnych poziomach szlaku apoptozy wywoływanej przez TRAIL, poczynając od poziomu receptorów na powierzchni komórki do kaspaz wykonawczych w obrębie szlaku sygnałowego. Oporność ta ogranicza możliwość stosowania TRAIL jako środka przeciwnowotworowego.

Ponadto, w badaniach klinicznych na pacjentach rzeczywista efektywność TRAIL jako monoterapii okazała się niska. Dla przezwyciężenia tej niskiej efektywności oraz oporności nowotworów na TRAIL zaprojektowano różne terapie kombinowane z radio- i chemioterapeutykami, skutkujące synergistycznym efektem apoptotycznym (WO 2009/002947; A. Almasan, A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348; R.K. Srivastava, Neoplasis, Vol. 3, No 6, 2001, 535-546; J.C. Soria i wsp., J. Clin. Oncology, vol. 28, nr 9 (2010), str. 1527-1533). Stosowanie rhTRAIL w leczeniu raka w kombinacji z wybranymi konwencjonalnymi środkami chemioterapeutycznymi (paklitaksel, karboplatyna) i przeciwciałami monoklonalnymi anty-VEGF opisano w WO 2009/140469. Jednakże kombinacja taka wiąże się nieuchronnie z dobrze znanymi wadami konwencjonalnej chemioterapii lub radioterapii.

PL 219 845 B1

Ponadto, problemem przy terapii białkiem TRAIL okazała się jego niska trwałość i bardzo szybkie usuwanie z organizmu po podaniu.

Jednym z celów branych pod uwagę w leczeniu przeciwnowotworowym jest także hamowanie angiogenezy guza. Angiogeneza (neounaczynienie) guza jest patologicznym, nieograniczonym czasowo procesem rozwoju nowych naczyń, zaopatrujących guza w tlen i składniki odżywcze, warunkującym rozrost i ekspansję guza oraz sprzyjającym jego przerzutowaniu.

Korzystny efekt hamowania angiogenezy guza w terapii przeciwnowotworowej jest znany. Podejmowane są próby kliniczne stosowania substancji hamujących lub regulujących proces angiogenezy zarówno jako terapii przeciwnowotworowej jak i uzupełniającej terapii przeciwnowotworowej.

Znane są inhibitory angiogenezy zarówno naturalnie obecne w organizmie ludzkim, jak i liczne egzogenne substancje antyangiogenne. Wśród nich znane są białkowe inhibitory angiogenezy, w tym proteolityczne fragmenty białek endogennych. Można tu wymienić białkowe inhibitory angiogenezy takie jak angiostatyna (będąca wewnętrznym fragmentem plazminogenu), endostatyna (stanowiąca C-terminalny fragment kolagenu XVIII), fragment kalretikuliny, wazostatyna, fragment prolaktyny, fragment metaloproteazy 2, czy fragment kolagenu IV tumstatyna (Cao Y. Angiogenesis modulates adipogenesis and obesity. J. Clin Invest. 2007; 117(9); 2362-2368, Folkman J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? Nat Rev Drug Discov., 2007; 6:273-286). Przykładowo, tumstatyna jest peptydem o wielkości 28 kDa - fragmentem kolagenu typu IV, wiążącym się z integryną avp3 i zapobiegającym angiogenezie przez zahamowanie proliferacji komórek śródbłonka. Ponadto, w sposób niezależny tumstatyna hamuje aktywację kinazy płytek przylegania (FAK), a także kinazy

3-fosfatydyloinozytolu PI3 i kinazy białkowej PKB/Akt. Substancje antyangiogenne mogą działać także poprzez hamowanie białek proangiogennych, takich jak naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF), działający poprzez receptory zlokalizowane na śródbłonku naczyń i będący głównym stymulatorem neoangiogenezy. W lecznictwie, w tym w terapii nowotworów, znalazły już zastosowanie jako czynniki antyangiogenne pewne substancje skierowane przeciwko VEGF, jak przeciwciała monoklonalne bevacizumab i ranibizumab. Inne substancje proangiogenne to czynniki pobudzające proliferację i migrację śródbłonka niezależnie od receptorów zlokalizowanych na śródbłonku, do których należą np. cytokiny takie jak płytkopochodne czynniki wzrostu PDGF i naskórkowy czynnik wzrostu EGF, TNF i angiopoetyna. W angiogenezie uczestniczy także enzym aminopeptydaza N (APN/CD13), która jest metaloproteazą transmembranową. Wiadomo, iż inhibicja tego enzymu może prowadzić do zahamowania procesów nowotworowych. Znanych jest szereg naturalnych i syntetycznych inhibitorów aminopeptydazy N (Bavouis B., Dauzonne D., Aminopeptidase-N/CD13 (EC 3.4.11.2) inhibitors: chemistry, biological evaluations, and therapeutic prospects. Medical Research Review, 2006, 26, (1), 88-130). Do naturalnych inhibitorów APN/CD13 należą głównie substancje produkowane przez mikroorganizmy. Zaliczyć tu można m.in. bestatynę, kurkuminę oraz apigeninę. Stwierdzono także, że krótki peptyd zawierający motyw CNGRC jest w stanie efektywnie wiązać się z CD13 (Arap i wsp. Science, 279:377-380, 1998).

Wiele z substancji antyangiogennych znajduje się na różnych etapach badań, w tym badań klinicznych. Jednakże znane terapie nakierowane na hamowanie angiogenezy nie są pozbawione wad. Np. kwestionowane są ostatnio korzyści terapeutyczne przeciwciała monoklonalnego bevacizumabu w leczeniu raka sutka. Wiele leków antyangiogennych wykazuje też na przykład zbyt krótki czas półtrwania, niską rozpuszczalność, słabą biodostępność oraz toksyczne efekty uboczne.

Bezpieczeństwo leków antyangiogennych ma szczególne znaczenie ze względu na długotrwałe stosowanie i brak selektywności terapii. Silna potrzeba skutecznego terapeutyku i charakter schorzeń onkologicznych wymuszają uproszczony charakter procedury rejestracyjnej dla leków z tej grupy, z tego względu niemożliwe jest poznanie wszystkich efektów ubocznych i wad leku. Co prawda, przeciwnie do chemio-terapeutyków, które skierowane są do wszystkich szybkoproliferujących komórek, leki antyangiogenne skierowane są do różnych stadiów formowania się naczyń krwionośnych, co skutkuje pewnym zmniejszeniem toksyczności terapii. Jednakże wciąż brak jest terapii przeciwnowotworowej nakierowanej na hamowanie angiogenezy, zapewniającej selektywność względem komórek nowotworowych. Istnieje zatem potrzeba nowych przeciwnowotworowych terapii antyangiogennych o poprawionej charakterystyce toksykologicznej.

Niniejszy wynalazek dostarcza białka fuzyjne o właściwościach antyangiogennych, które zawierają domenę pochodzącą z TRAIL oraz domenę peptydu efektorowego o działaniu antyangiogennym. Białka wg wynalazku są kierowane wybiórczo do komórek nowotworowych, gdzie poszczególne elementy białka wywierają swoje działanie, w szczególności peptydy efektorowe hamują proces angioge4

PL 219 845 B1 nezy nowotworu. Dostarczenie białka wg wynalazku do środowiska guza umożliwi zminimalizowanie toksyczności względem zdrowych komórek organizmu oraz działań ubocznych, a także zmniejszenie częstości podawania leku. Ponadto, terapia celowana z zastosowaniem białek wg wynalazku pozwoli ominąć problem małej efektywności dotychczas znanych niespecyficznych terapii antyangiogennych, spowodowany niską przenikalnością naczyń.

Okazało się, że białka fuzyjne według wynalazku wykazują w wielu przypadkach silniejsze działanie niż rozpuszczalny TRAIL i jego warianty obejmujące fragment sekwencji. Dotychczas, znane peptydy efektorowe zastosowane w białku fuzyjnym według wynalazku nie znalazły zastosowania w lecznictwie jako takie ze względu na niekorzystną kinetykę, szybką degradację przez niespecyficzne proteazy i kumulację w organizmie spowodowaną brakiem odpowiedniej kolejności aktywacji szlaków, niezbędnej do umożliwienia działania peptydu efektorowego w miejscu docelowym. Dzięki włączeniu do białka fuzyjnego możliwe jest ich selektywne dostarczenie do miejsca, gdzie ich działanie jest pożądane. Ponadto, dołączenie peptydu efektorowego powoduje zwiększenie masy białka, co skutkuje wydłużeniem okresu półtrwania oraz zwiększeniem retencji białka w nowotworze i podwyższeniem jego efektywności. Dodatkowo, w wielu przypadkach nowe białka fuzyjne przełamują naturalną bądź wyindukowaną oporność na TRAIL.

Opis Figur rysunku.

Wynalazek zostanie poniżej opisany szczegółowo w odniesieniu do Figur rysunku.

Fig. 1 przedstawia schematycznie strukturę białek fuzyjnych według wynalazku z Prz. 1, Prz. 2,

Prz. 4, Prz. 5 i Prz. 6.

Fig. 2 przedstawia schematycznie strukturę białek fuzyjnych według wynalazku z Prz. 9, Prz. 10 i Prz. 11.

Fig. 3 przedstawia schematycznie strukturę białek fuzyjnych według wynalazku z Prz. 14 i Prz. 15.

Fig. 4 przedstawia widma dichroizmu kołowego dla białek rhTRAIL114-281, i białek fuzyjnych według Prz. 1, Prz. 4, Prz. 5, Prz. 9 i Prz. 14 wyrażone w eliptyczności właściwej.

Fig. 5 przedstawia zmianę objętości guza nowotworowego (% stanu początkowego) u myszy Crl:CD1-Foxn1^nu obarczonych nowotworem jelita grubego HCT116 traktowanych białkami fuzyjnymi według wynalazku z Prz. 1, Prz. 4, Prz. 5 i Prz. 9 w porównaniu z rhTRAIL114-281.

Fig. 6 przedstawia zahamowanie wzrostu guza (%TGI) u myszy Crl:CD1-Foxn1^nu obarczonych nowotworem jelita grubego HCT116 traktowanych białkami fuzyjnymi według wynalazku z Prz. 1, Prz. 4, Prz. 5 i Prz. 9 w porównaniu z rhTRAIL114-281.

Fig. 7 przedstawia zmianę objętości guza nowotworowego (% stanu początkowego) u myszy Crl:CD1-Foxn1^nu obarczonych nowotworem jelita grubego A549 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 1 w porównaniu z rhTRAIL114-281.

Fig. 8 przedstawia zahamowanie wzrostu guza (%TGI) u myszy Crl:CD1 -Foxn1^nu obarczonych nowotworem jelita grubego A549 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 1 w porównaniu z rhTRAIL114-281.

Szczegółowy opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne, zawierające:

- domenę (a) obejmującą funkcjonalny fragment sekwencji rozpuszczalnego białka rhTRAIL rozpoczynający się aminokwasem w pozycji nie niższej niż hTRAIL95, i

- domenę (b) stanowiącą sekwencję peptydu efektorowego o działaniu antyangiogennym, która jest wybrana z grupy składającej się z:

- heptapeptydu pochodzącego z VEGF o Sekw. Nr 17;

- fragmentu białka PDGF o Sekw. Nr 22; i

- fragmentu białka EGF o Sekw. Nr 23;

przy czym hTRAIL jest przedstawione przez Sekw. Nr 16.

Przez funkcjonalny fragment sekwencji rozpuszczalnego hTRAIL należy rozumieć fragment zdolny do indukowania apoptozy w komórkach ssaczych.

Przez peptyd zgodnie z wynalazkiem należy rozumieć cząsteczkę zbudowaną z wielu aminokwasów połączonych wiązaniem peptydowym. Określenie peptyd zgodnie z wynalazkiem obejmuje zatem oligopeptydy, polipeptydy i białka.

Białko fuzyjne według wynalazku może zawierać przynajmniej jedną domenę (b) peptydu efektorowego, przyłączoną do C-końca lub N-końca domeny (a).

W szczególnym wykonaniu, domena (a) jest fragmentem sekwencji hTRAIL, rozpoczynającym się aminokwasem w zakresie od hTRAIL95 do hTRAIL121, włącznie, i kończącym się aminokwasem 281.

PL 219 845 B1

Domena (a) w szczególności może być wybrana z grupy składającej się z sekwencji odpowiadających hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 i hTRAIL121-281. Dla specjalisty w dziedzinie, oczywistym jest, że hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 i hTRAIL121-281 oznaczają fragment ludzkiego białka TRAIL, rozpoczynający się od aminokwasu, odpowiednio, oznaczonego numerem 95, 119, 120, i 121 w znanej sekwencji hTRAIL (Sekw. Nr 16), opublikowanej w bazie danych GenBank pod numerem P50591.

Peptydem efektorowym domeny (b) działającym antyangiogennie może być peptyd będący fragmentem ludzkiego naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu VEGF, który blokuje receptor VEGF kompetycyjnie do naturalnego ligandu i w konsekwencji prowadzi do braku stymulacji tworzenia nowych naczyń krwionośnych i zahamowania rozrostu nowotworu. W szczególności, takim peptydem efektorowym jest peptyd hamujący szlak sygnałowy VEGF, a konkretnie 7-aminokwasowy fragment ludzkiego VEGF, przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez Sekw. Nr 17.

Uważa się, że po włączeniu do białka fuzyjnego według wynalazku peptydu obejmującego sekwencję heptapeptydu VEGF będzie skutecznie eliminował komórki nowotworowe poprzez zahamowanie procesu angiogenezy w ich obrębie.

Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym antyangiogennie może być peptyd stanowiący fragment płytkopochodnego czynnika wzrostu PDGF. W szczególności, takim peptydem efektorowym jest 19-aminokwasowy peptyd - fragment ligandu PDGF, przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez sekwencję Sekw. Nr 22.

Uważa się, że po włączeniu do białka fuzyjnego według wynalazku peptyd stanowiący fragment ligandu płytkopochodnego czynnika wzrostu będzie skutecznie przyczyniał się do niszczenia komórek nowotworowych, poprzez zahamowanie procesu angiogenezy w ich obrębie.

Kolejnym peptydem efektorowym domeny (b) działającym antyangiogennie może być peptyd stanowiący fragment naskórkowego czynnika wzrostu EGF. W szczególności, taki peptyd efektorowy - fragment ligandu EGF - jest przedstawiony w załączonym wykazie sekwencji przez sekwencję Sekw. Nr 23.

Uważa się, że po włączeniu do białka fuzyjnego według wynalazku peptyd stanowiący fragment naskórkowego czynnika wzrostu EGF będzie skutecznie przyczyniał się do niszczenia komórek nowotworowych, poprzez zahamowanie procesu angiogenezy w ich obrębie.

Białko fuzyjne po związaniu się z receptorami TRAIL obecnymi na powierzchni komórki nowotworowej wywierać będzie dwojakie działanie. Domena (a), czyli fragment TRAIL, będzie wywierać swoje znane działanie agonistyczne - wiązania się z receptorami śmierci na powierzchni komórki i aktywowania zewnętrznego szlaku apoptozy. Peptyd efektorowy białka fuzyjnego działający antyangiogennie domena (b) będzie w stanie potencjalnie wywierać swoje działanie zewnątrzkomórkowo równolegle do działania samego TRAIL. W przypadku, gdy sekwencja białka fuzyjnego obejmuje sekwencje cięcia rozpoznawane przez proteazy, peptyd efektorowy może uprzednio zostać odcięty od fragmentu białka TRAIL za pomocą metaloproteaz lub urokinazy naprodukowanych w środowisku nowotworu. W białku fuzyjnym według wynalazku przeciwnowotworowe działanie TRAIL może być potencjalnie wzmożone przez aktywację innych elementów - takich jak na przykład steryczne zablokowanie miejsca wiązania naturalnego ligandu VEGF, PDGF i EGF, inhibicja angiogenezy i neowaskularyzacji, zahamowanie aktywacji kinazy fosfatydyloinozytolowej 3, kinazy białkowej B (PKB/Akt), czy pośrednia stymulacja nadprodukcji TRAIL przez szlak kinazy Akt i NFk.

W jednym z wykonań wynalazku, domena (a) i domena (b) są połączone ze sobą poprzez domenę (c) zawierającą miejsce cięcia proteazy, obecnej w środowisku komórki, zwłaszcza komórki nowotworowej.

Miejsce cięcia proteazy może być korzystnie wybrane spośród:

- sekwencji rozpoznawanej przez metaloproteazę MMP oznaczonej jako Sekw. Nr 24 (Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP) w załączonym wykazie sekwencji,

- sekwencji rozpoznawanej przez urokinazę uPA, oznaczonej jako Sekw. Nr 25 (Arg Val Val Arg/RVVR) lub fragmentu Sekw. Nr 25, który z końcowym aminokwasem sekwencji, do których jest dołączony, tworzy Sekw. Nr 25, oraz ich kombinacji.

W jednym z wykonań, miejsce cięcia proteazy jest kombinacją położonych obok siebie sekwencji rozpoznawanej przez metaloproteazę MMP i sekwencji rozpoznawanej przez urokinazę uPA, w dowolnej kolejności.

PL 219 845 B1

W jednym z wykonań, domena (c) jest kombinacją MMP/uPA Sekw. Nr 24/Sekw. Nr 25, albo kombinacją uPA/MMP Sekw. Nr 25/Sekw. Nr 24.

Metaloproteaza MMP i urokinaza są nadprodukowane w środowisku nowotworów. Obecność sekwencji rozpoznawanej przez proteazę pozwala na odcięcie domeny (a) od domeny (b) białka fuzyjnego wg wynalazku, to jest uwolnienie funkcjonalnej domeny (b), a tym samym przyspieszenie jej aktywacji.

Obecność miejsca cięcia proteazy, pozwalając na szybkie uwolnienie peptydu efektorowego, zwiększa tym samym szanse na dostarczenie peptydu do miejsca jego działania zanim nastąpi przebiegająca w sposób przypadkowy degradacja białka fuzyjnego przez niespecyficzne proteazy.

Poza głównymi elementami funkcjonalnymi białka fuzyjnego i domenami miejsca cięcia, białka fuzyjne według wynalazku mogą zawierać obojętną sekwencję lub sekwencje giętkiego linkera sterycznego glicynowo-cysteinowo-alaninowego. Takie linkery są znane specjalistom, i są opisane w literaturze. Ich włączenie do sekwencji białka fuzyjnego służy ułatwieniu poprawnego fałdowania wytworzonego białka po procesie jego nadprodukcji w komórkach gospodarza.

W szczególności, linker może być wybrany z grupy składającej się z Sekw. Nr 26 i Sekw. Nr 27, będących kombinacją glicyny, cysteiny i alaniny. W innym wykonaniu linker może być wybrany z grupy składającej się z Sekw. Nr 28, Sekw. Nr 29 i Sekw. Nr 30, składających się z reszt glicyny i seryny. Ponadto, linker może stanowić dowolny fragment Sekw. Nr 28, Sekw. Nr 29 i Sekw. Nr 30, spełniający zadanie linkera sterycznego, na przykład fragment Gly Gly Gly /GGG.

Linkerem może być pojedyncza reszta kwasu glutaminowego Glu/E.

Szczególne wykonania białka fuzyjnego według wynalazku stanowią białka fuzyjne zawierające peptyd działający antyangiogennie, wybrane z grupy składającej się z białek przedstawionych przez Sekw. Nr 1, Sekw. Nr 2, Sekw. Nr 3, Sekw. Nr 4, Sekw. Nr 5 i Sekw. Nr 6, zawierające jako peptyd efektorowy heptapeptyd pochodzący z VEGF.

Inne szczególne wykonania białka fuzyjnego według wynalazku stanowią białka fuzyjne zawierające peptyd działający antyangiogennie, wybrane z grupy składającej się z białek przedstawionych przez Sekw. Nr 9, Sekw. Nr 10, i Sekw. Nr 11, zawierające jako peptyd efektorowy fragment czynnika PDGF.

Następne szczególne wykonania białka fuzyjnego według wynalazku stanowią białka fuzyjne zawierające peptyd działający antyangiogennie, wybrane z grupy składającej się z białek przedstawionych przez Sekw. Nr 14 i Sekw. Nr 15, zawierające jako peptyd efektorowy fragment czynnika EGF.

Szczegółowy opis budowy wyżej wymienionych reprezentatywnych białek fuzyjnych przedstawiono na Fig. od 1 do 3 oraz w załączonych przykładach wykonania.

Przez białko fuzyjne zgodnie z wynalazkiem rozumie się pojedynczą cząsteczkę białka, zawierającego dwa lub więcej białek lub ich fragmentów, połączonych kowalencyjnym wiązaniem peptydowym w ramach ich własnych łańcuchów peptydowych, bez udziału dodatkowych łączników chemicznych.

Białko fuzyjne może być także alternatywnie określane jako konstrukt białkowy lub białko chimeryczne. Zgodnie z wynalazkiem, określenia konstrukt lub białko chimeryczne, jeśli są stosowane, należy rozumieć jako odnoszące się do białka fuzyjnego zdefiniowanego powyżej.

Dla specjalisty będzie oczywiste, że tak zdefiniowane białko fuzyjne może być zsyntetyzowane znanymi metodami syntezy peptydów i białek na drodze chemicznej.

Białko fuzyjne może być zsyntetyzowane metodami chemicznej syntezy peptydów, zwłaszcza przy użyciu technik syntezy peptydów w fazie stałej przy użyciu odpowiednich żywic jako nośników. Techniki takie są konwencjonalne i znane fachowcom, i opisane między innymi w monografiach, takich jak na przykład Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York, Stewart i wsp., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company.

Białko fuzyjne może być zsyntetyzowane metodami chemicznej syntezy peptydów jako jedno białko ciągłe. Alternatywnie, poszczególne fragmenty (domeny) białka mogą być syntetyzowane oddzielnie i następnie łączone ze sobą w jeden ciągły peptyd za pomocą wiązania peptydowego, przez kondensację końca aminowego jednego fragmentu peptydowego z końcem karboksylowym drugiego peptydu. Takie techniki kondensacji są konwencjonalne i znane.

Do weryfikacji struktury wytworzonego peptydu mogą być użyte znane metody analizy składu aminokwasowego peptydów, takie jak na przykład technika wysokorozdzielczej spektrometrii masowej

PL 219 845 B1 w celu oznaczenia ciężaru cząsteczkowego peptydu. Do potwierdzenia sekwencji peptydu mogą być także użyte sekwencery białek, które kolejno degradują peptyd i identyfikują kolejność aminokwasów.

Korzystnie jednak, białko fuzyjne według wynalazku jest białkiem rekombinowanym, generowanym metodami genetycznej ekspresji sekwencji polinukleotydowej kodującej to białko fuzyjne w komórkach gospodarza.

W następnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana sekwencja polinukleotydowa, w szczególności sekwencja DNA, kodująca białko fuzyjne takie jak określono powyżej.

Korzystnie, sekwencją polinukleotydową, w szczególności DNA, według wynalazku, kodującą białko fuzyjne takie jak określono powyżej, jest sekwencja zoptymalizowana do ekspresji w E.coli.

W kolejnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny, zawierający sekwencję polinukleotydową, w szczególności sekwencję DNA, według wynalazku określoną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresyjny określony tak jak powyżej.

Korzystną komórką gospodarza do ekspresji białka fuzyjnego według wynalazku jest komórka

E.coli.

Metody generowania białek rekombinowanych, w tym białek fuzyjnych, są dobrze znane. W skrócie technika ta polega na generowaniu cząsteczki polinukleotydowej, na przykład cząsteczki DNA, kodującej sekwencję aminokwasów docelowego białka i kierującej ekspresją tego docelowego białka w organizmie gospodarza. Następnie kodująca docelowe białko cząsteczka polinukleotydowa jest inkorporowana do odpowiedniego wektora ekspresji, zapewniającego dobrą ekspresję polipeptydu. Rekombinacyjny wektor ekspresyjny jest następnie wprowadzany do komórek gospodarza, w celu transfekcji/transformacji, w wyniku czego wytwarzana jest transformowana komórka gospodarza. Następnie prowadzi się hodowlę transformowanych komórek w celu nadekspresji białka docelowego, oczyszcza otrzymane białko i ewentualnie odcina przez trawienie sekwencje pomocnicze, wykorzystywane do ekspresji lub oczyszczania białka.

Odpowiednie techniki ekspresji i oczyszczania opisane są na przykład w monografii Goeddel, Gene Expression Technology; Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oraz w Maniatis i wsp., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).

Jako wektory ekspresyjne do wprowadzania i powielania sekwencji DNA w komórkach gospodarza mogą być stosowane kosmidy, plazmidy lub modyfikowane wirusy. Typowo jako wektory ekspresji stosuje się plazmidy. Odpowiednie plazmidy są znane specjalistom i dostępne w handlu.

Wektor ekspresyjny według wynalazku zawiera cząsteczkę polinukleotydową kodującą białko fuzyjne według wynalazku oraz konieczne sekwencje regulacyjne do transkrypcji i translacji włączonej sekwencji kodującej w odpowiedniej komórce gospodarza. Dobór sekwencji regulacyjnych jest zależny od rodzaju komórki gospodarza i może być łatwo przeprowadzony przez fachowca w tej dziedzinie. Przykładami takich sekwencji regulacyjnych są: promotor i wzmacniacz transkrypcji lub sekwencja wiążąca polimerazę RNA, sekwencja wiązania rybosomu, zawierająca sygnał inicjacji transkrypcji, wstawione przed sekwencją kodującą, oraz sekwencja terminatora transkrypcji, wstawiona za sekwencją kodującą. Ponadto, zależnie od komórki gospodarza i zastosowanego wektora, do wektora ekspresyjnego mogą być włączone inne sekwencje, takie jak początek replikacji, dodatkowe miejsca restrykcyjne DNA, wzmacniacze i sekwencje umożliwiające indukcję transkrypcji.

Wektor ekspresyjny będzie także zawierał sekwencję genu markerowego, nadającą transformowanej komórce określony fenotyp i umożliwiającą selekcję komórek transformowanych. Ponadto, wektor może także zawierać drugą sekwencję markerową, pozwalającą odróżnić komórki transformowane plazmidem rekombinowanym, zawierającym sekwencję kodującą białko docelowe, od takich, które pobrały plazmid bez wstawki. Najczęściej, typowo stosuje się markery oporności na antybiotyk, mogą być jednak użyte dowolne inne geny reporterowe znane w tej dziedzinie, których obecność można łatwo oznaczyć w komórce (in vivo) poprzez wykorzystanie technik autoradiograficznych, spektrofotometrycznych lub bio- i chemiluminescencyjnych. Przykładowo, w zależności od rodzaju komórki gospodarza, mogą być użyte geny reporterowe β-galaktozydazy, β-glukuronidazy, lucyferazy, acetylotransferazy chloramfenikolu lub białka zielonej fluorescencji.

Ponadto, wektor ekspresji może zawierać sekwencję kodującą znacznik, np. HisTag dołączony do N-końca lub GST dołączoną do C-końca, która ułatwia późniejsze oczyszczenie wyprodukowanego białka na zasadzie powinowactwa, poprzez chromatografię powinowactwa na kolumnie niklowej. Mogą być także obecne dodatkowe sekwencje chroniące białko przed degradacją proteolityczną w komórkach gospodarza, a także zwiększające jego rozpuszczalność. Rozwiązania takie są dobrze

PL 219 845 B1 znane specjaliście z dziedziny i opisane np. w podręczniku Maniatis i wsp., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).

Element pomocniczy dołączony do sekwencji docelowego białka może blokować jego aktywność lub być szkodliwy z innego powodu, takiego jak na przykład toksyczność. Taki element powinien zostać usunięty, co można przeprowadzić przez trawienie enzymatyczne lub chemiczne.

W szczególności, powinien zostać usunięty zwłaszcza sześcio-histydynowy znacznik HisTag, dołączony dla umożliwienia oczyszczania białka przez chromatografię powinowactwa, ze względu na jego opisany wpływ na hepatotoksyczność rozpuszczalnego białka TRAIL, lub inny tego typu znacznik.

Mogą być stosowane systemy ekspresji heterologicznej oparte na różnych znanych komórkach gospodarza, w tym komórkach prokariotycznych: bakteryjnych, takich jak na przykład bakterie Escherichia coli lub Bacillus subtilis, komórkach drożdży, takich jak Saccharomyces cervisiae lub Pichia pastoris; oraz liniach komórek eukariotycznych (owadzich, ssaczych, roślinnych).

Korzystnie, ze względu na łatwość hodowli i manipulacji genetycznych oraz dużą ilość powstającego produktu, stosuje się system ekspresji w E.coli. Zgodnie z tym, sekwencja polinukleotydowa zawierająca sekwencję kodującą docelowe białko fuzyjne według wynalazku będzie zoptymalizowana do ekspresji w E.coli, to jest będzie zawierać sekwencję nukleotydową wyselekcjonowaną z możliwych wariantów zgodnie z wiedzą znaną fachowcom. Ponadto, wektor ekspresyjny będzie zawierał dołączone do sekwencji kodującej wyżej opisane elementy odpowiednie dla E.coli.

Zgodnie z tym, w korzystnym wykonaniu, przedmiotem wynalazku jest sekwencja polinukleotydowa, obejmująca sekwencję kodującą białko fuzyjne według wynalazku, zoptymalizowana do ekspresji w E.coli, wybrana z grupy sekwencji polinukleotydowych składającej się z:

Sekw. Nr 31; Sekw. Nr 32; Sekw. Nr 34; Sekw. Nr 35; Sekw. Nr 36; Sekw. Nr 39; Sekw. Nr 40; Sekw. Nr 41; Sekw. Nr 44; i Sekw. Nr 45, które kodują białko fuzyjne mające sekwencję aminokwasów odpowiadającą sekwencjom aminokwasowym wybranym z grupy składającej się z, odpowiednio:

Sekw. Nr 1; Sekw. Nr 2; Sekw. Nr 4; Sekw. Nr 5; Sekw. Nr 6; Sekw. Nr 9; Sekw. Nr 10; Sekw. Nr 11; Sekw. Nr 14 i Sekw. Nr 15.

W korzystnym wykonaniu, przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny odpowiedni do transformacji E.coli, zawierający sekwencję polinukleotydową wybraną z grupy sekwencji polinukleotydowych Sekw. Nr 31; Sekw. Nr 32; Sekw. Nr 34; Sekw. Nr 35; Sekw. Nr 36; Sekw. Nr 39; Sekw. Nr 40; Sekw. Nr 41; Sekw. Nr 44; i Sekw. Nr 45 wskazanej powyżej, oraz komórka E.coli transformowana takim wektorem ekspresyjnym.

Transformację, czyli wprowadzenie sekwencji DNA do komórek gospodarza bakteryjnego, w szczególności E.coli, zwykle przeprowadza się na komórkach kompetentnych, przygotowanych na przyjęcie DNA na przykład przez potraktowanie jonami wapnia w niskiej temperaturze (4°C), a następnie poddanie szokowi cieplnemu (w temp, 37-42°C), albo przez elektroporację. Techniki takie są znane specjalistom i są zwykle określane przez producenta danego systemu ekspresji lub są opisane w literaturze i podręcznikach do pracy laboratoryjnej, jak np. Maniatis i wsp., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).

Procedura nadprodukcji białek fuzyjnych według wynalazku w systemie ekspresji E.coli zostanie bardziej szczegółowo opisana poniżej.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, zawierająca białko fuzyjne według wynalazku zdefiniowane powyżej jako składnik czynny, oraz odpowiedni dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, rozcieńczalnik oraz ewentualne konwencjonalne składniki pomocnicze.

Kompozycja farmaceutyczna będzie zawierać skuteczną ilość białka fuzyjnego według wynalazku, oraz ewentualne dopuszczalne farmaceutycznie składniki pomocnicze rozpuszczone lub zdyspergowane w nośniku lub rozcieńczalniku i korzystnie będzie mieć postać preparatu farmaceutycznego sformułowanego w jednostkowej postaci dawkowania lub preparatu zawierającego wiele dawek.

Zarówno postaci farmaceutyczne jak i sposoby ich formulacji i stosowane składniki pomocnicze, nośniki i rozcieńczalniki są znane specjalistom i opisane w literaturze. Przykładowo, są one opisane w monografii Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA.

Terminy „dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, rozcieńczalnik i składnik pomocniczy” obejmują wszelkie rozpuszczalniki, media dyspergujące, surfaktanty, przeciwutleniacze, stabilizatory, konserwanty (np. środki przeciwbakteryjne, środki przeciwgrzybicze), środki izotonizujące, znane fachowcom.

PL 219 845 B1

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać różne rodzaje nośników, rozcieńczalników i składników pomocniczych, w zależności od wybranej drogi podawania i wymaganej postaci leku, takiej jak ciekłe, stałe i aerozolowe postacie do podawania doustnego, pozajelitowego, wziewnego, miejscowego, i od tego czy dana postać musi być postacią sterylną do podawania drogą taką jak wstrzyknięcia.

Korzystną drogą podawania kompozycji farmaceutycznej według wynalazku będzie droga pozajelitowa, w tym przez wstrzyknięcia drogami dożylną, domięśniową, podskórną, dootrzewnową, doguzową, lub poprzez infuzje (wlewy) dożylne jednorazowe i ciągłe.

W jednym z wykonań, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być podawana drogą doguzową, przez wstrzyknięcia bezpośrednio do miejsca guza. W innym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być podawana dożylnie. W jeszcze innym wykonaniu, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być podawana podskórnie lub dootrzewnowe.

Kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego może stanowić roztwór lub dyspersję w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku wodnym lub niewodnym, w razie potrzeby buforowanym do odpowiedniego pH, oraz izoosmotyczną z płynami fizjologicznymi, które mogą ponadto zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczalne, które nadają kompozycji zgodność z tkankami lub krwią odbiorcy. Inne składniki, które kompozycja może zawierać to na przykład woda; alkohole, takie jak etanol; poliole, takie jak gliceryna, glikol propylenowy, ciekły glikol polietylenowy; lipidy, takie jak triglicerydy, oleje roślinne, liposomy. Właściwą płynność oraz wielkość cząstek substancji mogą zapewniać substancje powlekające, takie jak np. lecytyna, oraz surfaktanty, takie jak np. hydroksypropyloceluloza, polisorbaty, i podobne. Odpowiednie środki izotonizujące do ciekłych kompozycji pozajelitowych stanowią na przykład cukry, jak glukoza, i chlorek sodu, oraz ich kombinacje.

Alternatywnie, kompozycja farmaceutyczna do podawania drogą wstrzyknięć lub wlewów może mieć postać proszku, takiego jak na przykład proszek liofilizowany, do rekonstytucji bezpośrednio przed użyciem w odpowiednim nośniku, takim jak na przykład jałowa woda wolna od pirogenów.

Kompozycja farmaceutyczna do podawania pozajelitowego według wynalazku może mieć także postać do podawania donosowego, w tym roztworów, sprejów lub aerozoli. Korzystnie, postać do podawania donosowego będzie stanowić roztwór wodny i będzie izotoniczna lub buforowana tak aby utrzymywać pH od około 5,5 do około 6,5, tak aby utrzymać charakter podobny do wydzielin nosowych. Ponadto, będzie zawierać konserwanty lub stabilizatory, takie jak w znanych preparatach donosowych.

Kompozycja może zawierać różne przeciwutleniacze, opóźniające utlenianie jednego lub więcej składników. Ponadto, w celu zapobiegania działaniu mikroorganizmów, kompozycja może zawierać różne środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, w tym przykładowo i nieograniczająco, parabeny, chlorobutanol, timerozal, kwas sorbowy, i podobne znane substancje tego typu.

Generalnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać na przykład co najmniej około 0,01% wagowych składnika czynnego. Bardziej szczegółowo, kompozycja może zawierać od 1% do 75% wagowych jednostki kompozycji, lub na przykład od 25% do 60% wagowych, bez ograniczenia do wskazanych wartości liczbowych.

Faktyczna ilość dawki kompozycji według wynalazku podawana pacjentowi, w tym człowiekowi, będzie zdeterminowana przez czynniki fizyczne i fizjologiczne, takie jak waga ciała, ciężkość stanu, rodzaj leczonej choroby, wcześniejsze lub jednoczesne interwencje terapeutyczne, stan pacjenta i droga podawania. Odpowiednią dawkę jednostkową i całkowitą oraz także stężenie składnika czynnego w kompozycji będzie w stanie określić lekarz prowadzący.

Kompozycja może być na przykład podawana w dawce od około 1 mikrograma/kg wagi ciała do około 1000 miligramów/kg wagi ciała pacjenta, przykładowo w zakresie od 5 mg/kg wagi ciała do 100 mg/kg wagi ciała lub w zakresie od 5 mg/kg wagi ciała do 500 mg/kg wagi ciała.

Białko fuzyjne i zawierająca je kompozycja wykazują działanie przeciwnowotworowe i mogą znaleźć zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych.

Przedmiotem wynalazku jest także białko fuzyjne według wynalazku określone jak powyżej lub kompozycja farmaceutyczna określona jak powyżej, do stosowania w sposobie leczenia chorób nowotworowych u ssaków, w tym ludzi.

Białko fuzyjne według wynalazku może znaleźć zastosowanie do leczenia nowotworów hematologicznych, takich jak na przykład białaczki, ziarnica, szpiczaki i inne nowotwory układu krwiotwórczego. Białko fuzyjne może także znaleźć zastosowanie do leczenia nowotworów litych (guzów), takich

PL 219 845 B1 jak na przykład rak piersi, rak płuc, w tym niedrobnokomórkowy rak płuc, rak okrężnicy, rak trzustki, rak jajnika, rak pęcherza, rak prostaty, rak nerek, rak mózgu, i podobne.

Odpowiednią drogą podawania białka fuzyjnego w leczeniu raka będzie w szczególności droga pozajelitowa, polegająca na podawaniu białka fuzyjnego według wynalazku w postaci wstrzyknięć lub wlewów, w odpowiedniej dla takiej drogi podawania kompozycji i postaci.

Wynalazek zostanie szczegółowo opisany w poniższych procedurach ogólnych i przykładach szczególnych białek fuzyjnych.

Procedura ogólna nadprodukcji białka fuzyjnego

Uzyskiwanie plazmidu

Sekwencja aminokwasowa docelowego białka fuzyjnego służyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA, zawierającej kodony optymalne dla wyrażania w Escherichia coli. Zabieg taki umożliwia na dalszym etapie zwiększenie wydajności biosyntezy docelowego białka w komórkach Escherichia coli. Otrzymana sekwencja nukleotydowa została następnie automatycznie zsyntetyzowana. Do otrzymanego genu kodującego białko docelowe dodatkowo dołączano miejsca dla enzymów restrykcyjnych Ndel (na końcu 5' nici wiodącej) i Xhol (na końcu 3' nici wiodącej). Posłużyły one do klonowania tego genu do wektora pET28a (Novagen). Mogą one być wykorzystane do klonowania genu kodującego białko również do innych wektorów. Białko docelowe wyrażane z tego konstruktu posiadało na końcu N znacznik polihistydynowy (6 histydyn) poprzedzony miejscem rozpoznawanym przez trombinę, który służył następnie do jego oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa. Poprawność uzyskanego konstruktu potwierdzano najpierw przez analizę restrykcyjną wyizolowanych plazmidów za pomocą enzymów Ndel i Xhol, a następnie przez automatyczne sekwencjonowanie całej ramki odczytu białka docelowego. Startery wykorzystane do sekwencjonowania były komplementarne do obecnych w wektorze sekwencji promotora T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') i terminatora T7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3').

Uzyskany plazmid służył do nadprodukcji docelowego białka fuzyjnego w handlowym szczepie E.coli, który transformowano zgodnie z zaleceniami producenta. Uzyskane na podłożu selekcjonującym (LB agar, kanamycyna 50 μg/ml, 1% glukoza) kolonie posłużyły do założenia nocnej kultury w podłożu płynnym LB uzupełnionym kanamycyną (50 μg/ml) i 1% glukozą. Po około 15 h hodowli z wytrząsaniem te kultury nocne posłużyły do zaszczepienia właściwej hodowli.

Nadprodukcja i oczyszczanie białka fuzyjnego - procedura ogólna A

Pożywkę LB z kanamycyną (30 μg/ml) i 100 μΜ siarczanem cynku inokulowano nocną kulturą. Hodowle inkubowano w 37°C aż gęstość optyczna (OD) przy 600 nm wyniosła 0,60-0,80. Następnie dodawano IPTG, tak by uzyskać końcowe stężenie w zakresie 0,25-1 mM. Po inkubacji (3,5-20 h) z wytrząsaniem w 25°C hodowle wirowano przez 25 min przy 6,000 g.

Osad bakteryjny zawieszano w buforze zawierającym 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 mM imidazol, pH 7,4. Zawiesinę sonikowano na lodzie przez 8 minut (40% amplituda, 15 sekundowy impuls, 10 s przerwy). Uzyskany ekstrakt klarowano przez wirowanie 40 minut przy 20000 g w 4°C. Przygotowano złoże Ni-Sepharose (GE Healthcare), równoważone buforem, w którym przygotowano ekstrakt z komórek bakteryjnych. Złoże inkubowano z nadsączem po wirowaniu ekstraktu przez noc w 4°C. Następnie upakowano je do kolumny chromatograficznej i przemywano 15-50 objętościami buforu o składzie 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazol pH 7,4. Wytworzone białko wymywano z kolumny gradientem imidazolu w buforze 50 mM KH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4. Uzyskane frakcje analizowano za pomocą SDS-PAGE. Odpowiednie frakcje połączono i dializowano całą noc w 4°C do buforu 50 mM Tris pH 7,2, 150 mM NaCl, 500 mM L-arginina, 0,1 mM ZnSO4, 0,01% Tween 20 i jednocześnie odtrawiano znacznik polihistydynowy trombiną (1:50). Po trawieniu trombinę oddzielano od docelowego białka fuzyjnego za pomocą złoża Benzamidine Sepharose™. Czystość preparatu analizowano za pomocą rozdziału elektroforetycznego SDS-PAGE (Maniatis i wsp., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).

Nadprodukcja i oczyszczanie białka fuzyjnego - procedura ogólna B

Podłoże LB zawierające kanamycynę (30 μg/ml) i 100 μΜ siarczan cynku inokulowano nocną hodowlą. Hodowle inkubowano w 37°C aż gęstość optyczna (OD) przy 600 nm wyniosła 0,6-0,8. Następnie dodawano IPTG, tak by ostateczne stężenie wyniosło 0,5-1 mM. Po 20 godzinie inkubacji z wytrząsaniem w 25°C hodowle wirowano przez 25 min przy 6,000 g.

Komórki po nadprodukcji rozbijano za pomocą prasy French'a w buforze o następującym składzie: 50 mM KH2PO4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, 5 mM beta-merkaptoetanol, 0,5 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu), pH 7,8. Otrzymany ekstrakt klarowano przez wirowanie 50 min przy

PL 219 845 B1

8000 g. Supernatant inkubowano przez noc ze złożem Ni-Chelating Sepharose. Złoże ze związanym białkiem formowano w kolumnie chromatograficznej. W celu wymycia frakcji zawierających białka niewiążące się, kolumnę płukano 15-50 objętościami buforu o następującym składzie 50 mM KH2PO4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, 5 mM beta-merkaptoetanol, 0,5 mM PMSF, pH 7,8. Następnie, aby wymyć jak największą ilość białek wiążących się niespecyficznie ze złożem, kolumnę przepłukiwano buforem zawierającym 50 mM KH2PO4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol, 10% glicerol, 0,5 mM PMSF pH 7,5. Zebrane frakcje analizowano za pomocą rozdziału elektroforetycznego SDS-PAGE (Maniatis i wsp., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).

Frakcje wykazujące obecność docelowego białka fuzyjnego połączono i trawiono trombiną (w stosunku 1U na 4 mg białka przez 8 h w 16°C) w celu usunięcia znacznika polihistydynowego, a następnie dializowano do buforu formulacyjnego (500 mM L-arginina, 50 mM Tris, 2,5 mM ZnSO4, pH 7,4).

P r z y k ł a d 1. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 1

Białko o Sekw. Nr 1 jest to białko fuzyjne o długości 173 aminokwasów i masie 19,8 kDa, w którym do N-końca sekwencji TRAIL 121-281 przyłączony jest jako peptyd efektorowy heptapeptyd pochodzący z VEGF (Sekw. Nr 17). Między sekwencją białka efektorowego a domeną TRAIL włączony został glicynowy giętki linker steryczny (Sekw. Nr 28).

Budowa białka fuzyjnego przedstawiona jest schematycznie na Fig. 1, a jego sekwencję aminokwasową oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 1 i Sekw. Nr 31, pokazane na załączonym wykazie sekwencji.

Sekwencja aminokwasowa Nr 1 zawierająca opisany układ posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 31. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E.coli BL21 (DE3) i Tuner(DE3)pLysS, oba z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 2. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 2

Białko fuzyjne o Sekw. Nr 2 jest to białko o długości 199 aminokwasów i masie 22,8 kDa, w którym do N-końca sekwencji TRAIL 95-281 przyłączony jest jako peptyd efektorowy heptapeptyd pochodzący z VEGF (Sekw. Nr 17). Między sekwencją białka efektorowego a domeną TRAIL włączony jest glicynowy giętki linker steryczny (Sekw. Nr 28).

Budowa białka fuzyjnego przedstawiona jest schematycznie na Fig. 1, a jego sekwencję aminokwasową oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 2 i Sekw. Nr 32, pokazane na załączonym wykazie sekwencji.

Sekwencja aminokwasowa Nr 2 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 32. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisaną powyżej w procedurze ogólnej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczep E.coli BL21 (DE3) z firmy Novagen, Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 4. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 4

Białko o Sekw. Nr 4 jest to białko fuzyjne o długości 187 aminokwasów i masie 21,4 kDa, w którym do N-końca sekwencji TRAIL 121-281 przyłączone są jako peptyd efektorowy dwie sekwencje heptapeptydu pochodzącego z VEGF (Sekw. Nr 17). Między dwiema sekwencjami peptydu efektorowego włączona jest sekwencja rozpoznawana przez metaloproteazę MMP (Sekw. Nr 24), dzięki czemu peptyd efektorowy będzie ulegać odcięciu w środowisku nowotworu. Pomiędzy sekwencją peptydu efektorowego (Sekw. 17) a domeną TRAIL włączona jest sekwencja glicynowego giętkiego linkera sterycznego (Sekw. Nr 28).

Budowa białka fuzyjnego przedstawiona jest schematycznie na Fig. 1, a jego sekwencję aminokwasową oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 4 i Sekw. Nr 34, pokazane na załączonym wykazie sekwencji.

Sekwencja aminokwasowa Nr 4 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 34. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną B, stosując szczep E.coli BL21DE3pLysSRlL z firmy Stratagene i Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.

PL 219 845 B1

P r z y k ł a d 5. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 5

Białko o Sekw. Nr 5 jest to białko fuzyjne o długości 189 aminokwasów i masie 21,8 kDa, w którym do N-końca sekwencji TRAIL 121-281 przyłączone są jako peptyd efektorowy dwie sekwencje heptapeptydu pochodzącego z VEGF (Sekw. Nr 17). Między dwiema sekwencjami peptydu efektorowego włączona jest sekwencja rozpoznawana przez metaloproteazę MMP (Sekw. Nr 24) oraz fragment sekwencji rozpoznawanej przez urokinazę (Sekw. Nr 25), dzięki czemu peptyd efektorowy będzie ulegać odcięciu w środowisku nowotworu.

Budowa białka fuzyjnego przedstawiona jest schematycznie na Fig. 1, a jego sekwencję aminokwasową oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 5 i Sekw. Nr 35, pokazane na załączonym wykazie sekwencji.

Sekwencja aminokwasowa Nr 5 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 35. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczep E.coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 6. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 6

Białko o Sekw. Nr 6 jest to białko fuzyjne o długości 222 aminokwasów i masie 25,3 kDa, w którym do N-końca sekwencji TRAIL 95-281 przyłączone są jako peptyd efektorowy dwie sekwencje heptapeptydu pochodzącego z VEGF (Sekw. Nr 17). Między dwiema sekwencjami peptydu efektorowego włączona jest sekwencja rozpoznawana przez metaloproteazę MMP (Sekw. Nr 24) oraz sekwencja rozpoznawana przez urokinazę (Sekw. Nr 25), dzięki czemu peptyd efektorowy będzie ulegać odcięciu w środowisku nowotworu.

Budowa białka fuzyjnego przedstawiona jest schematycznie na Fig. 1, a jego sekwencję aminokwasową oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 6 i Sekw. Nr 36, pokazane na załączonym wykazie sekwencji.

Sekwencja aminokwasowa Nr 6 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 36. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczep E.coli Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 9. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 9

Białko o Sekw. Nr 9 jest to białko fuzyjne o długości 192 aminokwasów i masie 22,1 kDa, w którym do N-końca sekwencji TRAIL 119-281 przyłączona jest jako peptyd efektorowy sekwencja fragmentu PDGF (Sekw. Nr 22). Między sekwencją peptydu efektorowego a domeną TRAIL włączone są kolejno sekwencja rozpoznawana przez urokinazę uPA (Sekw. Nr 25) i sekwencja rozpoznawana przez metaloproteazę MMP (Sekw. Nr 24), dzięki czemu peptyd efektorowy będzie ulegać odcięciu w środowisku nowotworu.

Budowa białka fuzyjnego przedstawiona jest schematycznie na Fig. 2, a jego sekwencję aminokwasową oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 9 i Sekw. Nr 39 pokazane na załączonym wykazie sekwencji.

Sekwencja aminokwasowa Nr 9 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 39. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczep E.coli Rosetta (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 10. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 10

Białko o Sekw. Nr 10 jest to białko fuzyjne o długości 216 aminokwasów i masie 24,9 kDa, w którym do N-końca sekwencji TRAIL 95-281 przyłączona jest jako peptyd efektorowy fragment PDGF (Sekw. Nr 22). Między sekwencją peptydu efektorowego a domeną TRAIL włączone są kolejno sekwencja rozpoznawana przez metaloproteazę MMP (Sekw. Nr 24) i sekwencja rozpoznawana przez urokinazę uPA (Sekw. Nr 25), dzięki czemu peptyd efektorowy będzie ulegać odcięciu w środowisku nowotworu.

PL 219 845 B1

Budowa białka fuzyjnego przedstawiona jest schematycznie na Fig. 2, a jego sekwencję aminokwasową oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 10 i Sekw. Nr 40, pokazane na załączonym wykazie sekwencji.

Sekwencja aminokwasowa Nr 10 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 40. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E.coli BL21 (DE3) i Tuner(DE3)pLysS, oba z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 11. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 11

Białko o Sekw. Nr 11 jest to białko fuzyjne o długości 226 aminokwasów i masie 25,7 kDa, w którym do N-końca sekwencji TRAIL 95-281 przyłączona jest jako peptyd efektorowy fragment PDGF (Sekw. Nr 22). Między sekwencją peptydu efektorowego a domeną TRAIL włączone są kolejno sekwencja rozpoznawana przez urokinazę uPA (Sekw. Nr 25) i sekwencja rozpoznawana przez metaloproteazę MMP (Sekw. Nr 24), dzięki czemu peptyd efektorowy, będzie ulegać odcięciu w środowisku nowotworu. Między sekwencją TRAIL a sekwencją miejsca cięcia przez metaloproteazę MMP białko zawiera także giętki linker glicynowo-cysteinowo-alaninowy (Sekw. Nr 27).

Budowa białka fuzyjnego przedstawiona jest schematycznie na Fig. 2, a jego sekwencję aminokwasową oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 11 i Sekw. Nr 41, pokazane na załączonym wykazie sekwencji.

Sekwencja aminokwasowa Nr 11 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 41. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną A, stosując szczepy E.coli BL21 (DE3) i Tuner(DE3)pLysS, oba z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 14. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 14

Białko o Sekw. Nr 14 jest to białko fuzyjne o długości 181 aminokwasów i masie 21 kDa, w którym do N-końca sekwencji TRAIL 120-281 przyłączony jest jako peptyd efektorowy fragment EGF (Sekw. Nr 23). Między sekwencją peptydu efektorowego a N-końcem domeny TRAIL włączone są kolejno sekwencja rozpoznawana przez urokinazę uPA (Sekw. Nr 25) i sekwencja rozpoznawana przez metaloproteazę MMP (Sekw. Nr 24), dzięki czemu peptyd efektorowy będzie ulegać odcięciu w środowisku nowotworu.

Budowa białka fuzyjnego przedstawiona jest schematycznie na Fig. 3, a jego sekwencję aminokwasową oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przedstawiają Sekw. Nr 14 i Sekw. Nr 44, pokazane na załączonym wykazie sekwencji.

Sekwencja aminokwasowa Nr 14 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 44. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję prowadzono zgodnie z procedurą ogólną B opisaną w przykładzie 1, stosując szczepy E.coli BL21 (DE3) z firmy Novagen i BL21DE3pLysSRlL z firmy Stratagene. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 15. Białko fuzyjne o Sekw. Nr 15

Białko o Sekw. Nr 15 jest to białko fuzyjne o długości 217 aminokwasów i masie 24,4 kDa, w którym do N-końca sekwencji hTRAIL95-281 przyłączony jest jako peptyd efektorowy fragment EGF (Sekw. Nr 23). Między sekwencją peptydu efektorowego a N-końcem domeny TRAIL włączone są kolejno sekwencja rozpoznawana przez urokinazę uPA (Sekw. Nr 25) i sekwencja rozpoznawana przez metaloproteazę MMP (Sekw. Nr 24), dzięki czemu peptyd efektorowy będzie ulegać odcięciu w środowisku nowotworu. Białko zawiera także między sekwencją miejsca cięcia metaloproteazy a sekwencją TRAIL giętki tinker glicynowo-cysteinowo-alaninowy (Sekw. Nr 27).

Budowa białka fuzyjnego przedstawiona jest schematycznie na Fig. 3, a jego sekwencję aminokwasową oraz kodującą ją sekwencję DNA, zawierającą kodony optymalne dla wyrażania w E.coli przedstawiają odpowiednio Sekw. Nr 15 i Sekw. Nr 45, pokazane na załączonym wykazie sekwencji.

Sekwencja aminokwasowa Nr 15 posłużyła jako matryca do wygenerowania kodującej ją sekwencji DNA Nr 45. Generowano plazmid zawierający kodującą sekwencję DNA oraz prowadzono nadprodukcję białka fuzyjnego zgodnie z procedurami ogólnymi opisanymi powyżej. Nadprodukcję

PL 219 845 B1 prowadzono zgodnie z procedurą ogólną B opisaną w przykładzie 1, stosując szczep E.coli BL21 (DE3) lub Tuner (DE3) z firmy Novagen. Białko poddawano procedurze rozdziału elektroforetycznego zgodnie z ogólną procedurą opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 16. Badanie czynności przeciwnowotworowej białek fuzyjnych

Badanie czynności przeciwnowotworowej białek fuzyjnych przeprowadzano in vitro w teście cytotoksyczności na liniach komórek nowotworowych oraz in vivo na myszach. Do celów porównawczych użyto placebo oraz białka rhTRAIL114-281.

1. Pomiar dichroizmu kołowego: oznaczenie składu struktur drugorzędowych otrzymanych białek

Aby potwierdzić jakość otrzymanych preparatów białkowych na poziomie ich struktury, wykonano pomiary widm dichroizmu kołowego CD dla preparatów białkowych z Prz. 1, Prz. 4, Prz. 5, Prz. 9 i Prz. 14.

Dializa

Próbki białek przeznaczone do analizy widma dichroizmu kołowego przeformułowano do buforu o następującym składzie: 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glicerol, 0,1 mM ZnCl2, 80 mM sacharoza, 5 mM DTT. Były one dializowane w workach dializacyjnych (Sigma-Aldrich) o odcięciu równym 12 kDa. Dializę prowadzono wobec 100 krotnego nadmiaru (v/v) buforu względem preparatów białek, przez kilkanaście godzin w temp. 4°C z ciągłym mieszaniem. Każdy preparat po dializie wirowano (25 000 rcf, 10 min, 4°C), a nadsącze przenoszono do czystych probówek typu eppendorf. Dla tak uzyskanych próbek oznaczano stężenia białek metodą Bradford, dla każdej wykonując trzykrotne powtórzenie.

Oznaczanie stężenia białek metodą Bradford

W oznaczeniach stężenia białek stosowano odczynnik wykonany przez rozpuszczenie 17,5 mg Coomassie G-250 w mieszaninie alkoholu etylowego (4,8% v/v), kwasu fosforowego (V) (5,95% v/v) i wody. Podczas oznaczania stężenia białka dodawano 1-10 μΐ próbki do 800 μΐ odczynnika Bradford. Referencją była próbka zawierająca odczynnik Bradford i odpowiednią objętość buforu, w którym rozpuszczone byto oznaczane białko. Absorbancję odczytywano na spektrofotometrze Cary 300 dla światła o długości 595 nm po co najmniej 5 minutowej inkubacji próbki w temperaturze pokojowej. Stężenie białka obliczano na podstawie krzywej wzorcowej wykonanej dla BSA w zakresie 10 stężeń od 1-10 μg/ml. Wyjściowe stężenie białka uzyskiwano po uwzględnieniu rozcieńczenia podczas sporządzania próbki pomiarowej.

Pomiar dichroizmu kołowego

Pomiar wykonano na spektropolarymetrze Jasco J-710, dla białek o zakresie stężeń 0,1-2,7 mg/ml w kuwecie kwarcowej o drodze optycznej 0,2 mm lub 1 mm. Podczas pomiaru stosowano przepływ azotu 7 l/min, co umożliwiło wykonanie pomiaru w zakresie długości fali od 195 do 250 nm. Parametry pomiaru to: rozdzielczość widma - 1 nm; szerokość połówkowa wiązki światła 1 nm; czułość 20 mdeg; czas uśredniania dla jednej długości fali - 8 s; szybkość skanowania 10 nm/min; uśrednianie 3 pomiarów. Uzyskane wyniki przedstawiono jako średnią 3 pomiarów. Widma dichroizmu kołowego dla białek rhTRAIL114-281 i białek fuzyjnych według przykładów 1, 4, 5, 9 i 14 wyrażone w eliptyczności właściwej przedstawiono na Fig. 4.

Wyliczenie składowych struktury drugorzędowej

Uzyskane widma poddano analizie numerycznej z użyciem pakietu CDPro. Analizowano widma w zakresie 193-250 nm. Pominięto punkty dla których napięcie na fotopowielaczu przekraczało 700 V, ze względu na zbyt niski stosunek sygnału do szumu w tym zakresie długości fali. Otrzymane dane posłużyły do obliczenia za pomocą pakietu programów CDPro udziału poszczególnych struktur drugorzędowych w analizowanych białkach oraz znormalizowanej średniej kwadratowej odchylenia wyznaczającej jakość otrzymanych wyników (Tabela 1).

T a b e l a 1. Zawartość procentowa struktur drugorzędowych w badanych białkach.

Białko	NRMSD (Exp-Cal)	a-helisa	β-kartka	Zwrot	Nieuporządkowane
1	2	3	4	5	6
Prz. 4	0,319	3,7%	39,4%	20,7%	36,2%
Prz. 1	0,093	7,8%	8,6%	63,1%	20,5%
Prz. 5	0,04	41,3%	15,0%	2,5%	41,2%

PL 219 845 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6
Prz. 9	0,112	2,9%	41,0%	20,7%	35,4%
Prz. 14	0,244	0,2%	55,3%	17,1%	27,4%
rhTRAIL*		1,94%	50,97%	7,74%	39,35%
rhTRAIL 114-281	0,389	4,9%	33,7%	23,1%	38,3%

*wartość uzyskana na podstawie struktury krystalicznej 1D4V

Kontrola, czyli cząsteczka rhTRAIL114-281, wykazywało widmo CD charakterystyczne dla białek o przewadze struktur typu β-kartka (wyraźne minimum eliptyczności właściwej przy długości fali 220 nm). Potwierdza to wyliczenie składowych struktury drugorzędowej, które sugeruje marginalną ilość elementów typu α-helisa. Otrzymany wynik jest również zgodny z danymi pochodzącymi ze struktury krystalicznej białka hTRAIL oraz charakterystyczny dla innych białek wg wynalazku (Prz. 4, Prz. 9 i Prz. 14), gdzie elementy beta stanowią powyżej 40% jej składu. We wszystkich przykładach widma dichroizmu charakteryzują się pojedynczym minimum w okolicach 220 nm. Ponieważ dołączone do TRAIL małe peptydy stanowią niewielką część białka i nie muszą tworzyć zdefiniowanej struktury drugorzędowej, analizowane białka nie powinny różnić się znacząco od białka wyjściowego. Istotne różnice, takie jak wysoka zawartość struktur alfa w przypadku białka wg Prz. 5, lub zwrotów takich jak obserwowane dla białka z Prz. 1 są najprawdopodobniej skutkiem ograniczonego zakresu widma CD poddanego analizie, co szczególnie dotyczy okolic 180-200 nm.

2. Testy na liniach komórkowych in vitro

Linie komórkowe

T a b e l a 2. Komórki adherentne

Nazwa	Rodzaj nowotworu	Pożywka	Ilość na dołek w tys.
1	2	3	4
Colo 205 ATCC #CCL-222	ludzki nowotwór jelita grubego	RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	5
HT-29 ATCC # CCL-2	ludzki nowotwór jelita grubego	McCoy's + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	5
DU-145 ATCC # HTB-81	ludzki nowotwór prostaty	RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	3
PC-3 ATCC # CRL-1435	ludzki nowotwór prostaty	RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	4
MCF-7 ATCC # HTB-22	ludzki nowotwór piersi	MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	4,5
MDA-MB-231 ATCC # HTB-26	ludzki nowotwór piersi	DMEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	4,5
UM-UC-3 ATCC # CLR-1749	ludzki nowotwór pęcherza moczowego	MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	3,5
SW780 ATCC #CRL-2169	ludzki nowotwór pęcherza moczowego	DMEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	3
SW620 ATCC #CCL-227	ludzki nowotwór jelita grubego	DMEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	5
BxPC-3 ATCC # CRL-1687	ludzki nowotwór trzustki	RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	4,5
SK-OV-3 ATCC # HTB-77	ludzki nowotwór jajnika	McCoy's + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	4
NIH: OVCAR-3 TCC # HTB-161	ludzki nowotwór jajnika	RPMI + 20% FBS + 0,01 mg/ml insulina + penicylina + streptomycyna	7
HepG2 ATCC # HB-8065	ludzki nowotwór wątroby	MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	7

PL 219 845 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4
293 ATCC # CLR-1573	ludzkie embrionalne komórki nerek	MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	4
ACHN ATCC # CCL-222	ludzki nowotwór nerek	MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	4
CAKI 2 ATCC # HTB-47	ludzki nowotwór nerek	McCoy's + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	3,5
NCI-H69AR ATCC # CRL-11351	ludzki drobnokomórkowy nowotwór płuc	RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	10
HT144 ATCC # HTB-63	ludzki złośliwy nowotwór skóry	McCoy's + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	7
NCI-H460 ATCC # HTB-177	ludzki nowotwór płuc	MEM + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	2,5
LNCaP ATCC # CRL-1740	ludzki nowotwór prostaty	RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	4,5

T a b e l a 3. Komórki nieadherentne

Nazwa	Rodzaj nowotworu	Pożywka	Ilość na dołek w tys.
NCI-H69 ATCC # HTB-119	ludzki drobnokomórkowy nowotwór płuc	RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	22
Jurkat A3 ATCC # CRL-2570	ludzka białaczka	RPMI + 10% FBS + penicylina + streptomycyna	10
HL60 ATCC # CCL-240	ludzka białaczka	RPMI + 20% FBS + penicylina + streptomycyna	10
CCRF-CEM ATCC # CCL-119	ludzka białaczka	RPMI + 20% FBS + penicylina + streptomycyna	10

Test cytotoksyczności MTT

Test MTT jest testem kolorymetrycznym stosowanym do pomiaru proliferacji, żywotności oraz cytotoksyczności komórek. Polega on na rozkładzie żółtej soli tetrazolowej MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu) do nierozpuszczalnego w wodzie purpurowego barwnika formazanu przez obecną w mitochondriach reduktazę bursztynylo-tetrazolową. Redukcja MTT zachodzi jedynie w żywych komórkach. Analiza danych polega na wyznaczeniu stężenia badanego białka IC50 (w ng/ml), przy którym następuje 50% obniżenie ilości komórek w populacji traktowanej związkiem w odniesieniu do komórek kontrolnych. Wyniki analizowano za pomocą programu GraphPad Prism 5.0.

Test wykonano zgodnie z opisami literaturowymi (Celis, J.E., (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition. Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, L.W., Tsai, J-H., (2004),

Involvment of viral and Chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J. Clin Oncol, 34(4) 176-183).

Hodowlę komórkową rozcieńczono pożywką do określonej gęstości (10-10 komórek na 100 lJ). Następnie 100 μl odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny komórkowej naniesiono na płytkę 96-dołkową w trzech powtórzeniach. Tak przygotowane komórki inkubowano przez 24 h w 37°C w 5% lub 10% CO₂ w zależności od użytej pożywki, po czym do komórek (w 100 μl pożywki) dodano kolejne 100 μl pożywki zawierającej różne stężenia testowanego białka. Komórki inkubowano z testowanymi białkami przez kolejne 72 h, co odpowiada 3-4 czasom podziału komórkowego, po czym do pożywki z testowymi białkami dodawano 20 μl roztworu roboczego MTT (5 mg/ml) i inkubowano przez 3 h w 37°C w 5% CO2. Następnie pożywkę z roztworem MTT usunięto, a kryształy formazanu rozpuszczono, dodając 100 μl DMSO. Po wymieszaniu mierzono absorbancję przy długości fali 570 nm (filtr referencyjny 690 nm).

Test cytotoksyczności EZ4U

Do badania działania cytotoksycznego białek na komórki linii nieadherentnych zastosowano test EZ4U (Biomedica). Test ten jest modyfikacją metody MTT, wykorzystującą fakt, że powstały w wyniku redukcji soli tetrazolowej formazan jest rozpuszczalny w wodzie. Badanie żywotności komórek przeprowadzono po ich ciągłej 72-godzinnej inkubacji z białkiem (siedem stężeń białka, każde w tryplikatach). Na tej podstawie, przy wykorzystaniu programu GraphPad Prism 5, wyznaczono wartość

PL 219 845 B1

IC50 (jako średnią z dwóch niezależnych eksperymentów). Komórkom kontrolnym podawano sam rozpuszczalnik.

Wyniki testów cytotoksyczności in vitro przedstawiono w Tabeli 4 i Tabeli 5 w postaci wartości IC50 (ng/ml), co odpowiada wartości stężenia białka, przy którym obserwuje się efekt cytotoksyczny białek fuzyjnych na poziomie 50% w stosunku do komórek kontrolnych. Każdy eksperyment przedstawia średnią wartość z przynajmniej dwóch niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w tryplikatach. Jako kryterium nieaktywności preparatów przyjęto wartość stężenia IC50 na poziomie 2000 ng/ml. Białka fuzyjne, które miały wartość IC50 powyżej 2000, uznawano za nieaktywne.

Komórki do tego testu zostały tak dobrane, aby obejmowały linie komórek nowotworowych naturalnie oporne na białko TRAIL (przyjęte kryterium naturalnej oporności na TRAIL: IC50 dla białka TRAIL >2000), linie komórek nowotworowych wrażliwe na białko TRAIL oraz oporną na doksorubicynę linię MES-SA/Dx5 jako linię nowotworową oporną na klasyczne leki przeciwnowotworowe.

Linię nieróżnicowanych komórek HUVEC zastosowano jako zdrową linię kontrolną w celu oceny oddziaływania/toksyczności białek fuzyjnych na komórki nienowotworowe.

Uzyskane wyniki potwierdzają możliwość przełamania oporności linii komórkowych na TRAIL przez podawanie niektórych białek fuzyjnych według wynalazku do komórek naturalnie opornych na TRAIL. Przy podawaniu białek fuzyjnych według wynalazku do komórek wrażliwych na TRAIL uzyskiwano w niektórych przypadkach wyraźnie obserwowalne, znaczne spotęgowanie siły działania TRAIL, wyrażające się zmniejszeniem wartości IC50 białka fuzyjnego w porównaniu z IC50 dla samego TRAIL. Ponadto, uzyskano działanie cytotoksyczne białka fuzyjnego według wynalazku na komórki oporne na klasyczny lek przeciwnowotworowy doksorubicynę, które w niektórych przypadkach było silniejsze od działania TRAIL.

Wartości IC50 powyżej 2000 dla linii komórek nie-nowotworowych pokazują brak efektu toksycznego związanego ze stosowaniem białek według wynalazku dla komórek zdrowych, co świadczy o potencjalnie niskiej toksyczności ogólnoustrojowej białka.

Analiza aktywności cytotoksycznej wybranych preparatów białkowych wobec rozszerzonego panelu linii nowotworowych

W Tabeli 5 zaprezentowano wyniki badania aktywności cytotoksycznej in vitro dla wybranych białek fuzyjnych według wynalazku wobec szerokiego panelu komórek nowotworowych pochodzących z różnych organów, odpowiadającego szerokiemu spektrum najczęściej występujących nowotworów. Uzyskane wartości IC50 potwierdzają wysoką aktywność cytotoksyczną białek fuzyjnych i tym samym ich potencjalną użyteczność w leczeniu chorób nowotworowych.

PL 219 845 B1

Tabela 4. Aktywność cytotoksyczna białek fuzyjnych według wynalazku

	< o	±SD				77,92		Os Ol
	Ll.
E su	υ S	O m U	>2000	2000	2000	O CO	o 8 OJ Λ	13,01
on
c
fk		o				CO co	oo CO	00
t		(Zł
Γ	o>	-H				oo co	o	o


V)	m
Φ	<	o	Q	o	o	o	in	ΙίΊ
		m		O	O	*s	Λ	O
JC (N		u	OJ Λ	o oi	o Ol	CO in	LTł E	c?

N Φ N U		Q	cn	V—	CO	Ol	m	*r
1 (Zł	±SI	m O?	·> CO		0,1	*— O	CO o
Q-	Ul
E io	5 1 ί	O ΙΠ	OJ	o. Ol	O oo	^r MD	CO Tt	^r in
L.	i	u	OJ	CO	lt?	O	O	O
«Ο
E
o N	\O	±SD	r*i T“ co	26,94	11,34	oo co oj	OO oj	co O OJ
£	i w—
Ό
+-» U «Ϊ	o	O Ul U	m Os	632,05	8,66	CO OJ LT»	Os Ol	co V o?
CL Φ				CO	Ol
l_
CL			O	h-	co	in	in	Ό
(0	m	±SI	OJ	-r	2,8	0,1	1,0	0,0
υ «β	ΙΛ
LU “
3	5 <	o	oj	▼— cc?	Ol Ol	co V	69'	o co
	(Zł	u	o?	co	oo	o.	>O
C		co	o. V	S©	o	co	o
<0
&		o (Zł				Ol Os	co Os	co O
u	< (Zł 1	-H				o	c?	C?
	(Zł
	LlI	O ΙΛ	O o	o o	o o	&	co o.	co O
		UJ	OJ Λ	o	o
			Ol	Ol	o.	V

			CO
			CM
			4


	O		-I
		s	ł—	r-	Y”	5J·	in
			oc.	•		•	*	•
	<0		1-	N	N	N	N	N
			r*	U	U	L-		L_
	CO		h.	o.	CL	o.	CL	CL

PL 219 845 B1

Tabela 5. Analiza aktywności cytotoksycznej wybranych reprezentatywnych białek fuzyjnych według wynalazku wobec szerokiego panelu linii komórkowych

PC 3

O t/l

o 4> X □ Z

O υΊ

CCRF-CEM

O t/l

ki

O

00001

L '1/1

10000

O

ki *tn

10000

LNCaP

SD

456,0

96,66 j

ac < o* X

Q l/l

HL60

Cl t/l

ki '1/1

2052,00

S PM σ»

'«n

10000

ki '1Λ

10000

DU 145

O ΙΛ

s m s

f*> oć < u > O

Q t/ł

T <n co

143,17

JURKAT A3

SD

ki

10000

8928,00

ki '1/1

o 1*1 0»

190,80 I_

'171

10000

MDA-MB-231

SD

ΓΠ Ś 2 (Λ

O 1/1

X X <

Q l/l

ki -in

10000

c 'Irt

10000

ui '1/1

0000 i

0

MCF 7

SD

1642,60

CAKI 2

SD

HT 144

O LO

218,5

t— 'O PM

ki '1Λ

10000

O o σ» m ss

ki ‘ł/l

!

ki -V»

1734

O ΡΠ

SW 620

Cl IZ»

293

c l/ł

O oo Ό O CM

HepG2

SD

808,22

ki

00001

o

ki 'irt

10000

O O CO <*> irt 00

ki •Lrt

0000 L

6153

H X

SD

UM-UC-3

<21 ŁO

o o £

o ΓΟ

PO O Ο- χ co

O L/l

31,81

00 co

ki *vi

10000

o

ki '1/1

o o (M T s

I** PO o ΓΟ

ki -irt

64,71

79,60

COLO 205

O l/l

17,68

00 >c

O s Ϊ 1/1

O t/l

r*> TT s

33,76

NCI-H460

SD

111,0

CM scT h*

ki '1/1

8 'T PM

o> <K~ rn

ki •l/l

120,00

PO rO O

ki 'ł/ł

5889

o co co

linia komórkowa

rhTRAIL 95-281

'M' d o.

linia komórkowa

rhTRAIL 95-281

Prz. 14

linia komórkowa

rhTRAIL 95-281

d o.

PL 219 845 B1

Tabela 5, ciąg dalszy

PC 3	O uo			NCI-H69	O <z>			CCRF-CEM	Q tZl
ii '(/>	o	980,60	'VI	O	O o MD CO	li ΊΟ	- 10000	1357
LNCaP	SD	o •o	4,24		O kO			HL60	SD
li ΜΛ	o CD ci ITJ o CM	254,00	0£ s Ό X	li *Vł	O	1530,00	li '1/1	10000	1339,00
DU 145	SD		co ci CM		o VO	m^- co 00	s o* CM	ΓΑ3	O UO		O ’Τ CM
li 'ΙΛ	10000	co co V	0V-CAR-3	L *«n	o co θ'	5,58	JURKA'	li ΜΛ	o o o o	θ' ir?
MDA-MB-231	Q LO		T ICi O	SK-0V-3	SD		379,0 0		SD 1		8,92
li MO	10000	co oo co CM	*VJ	10000	2116,00	U <	li '1/1	o	71,19
MCF7	SD		329,20	CAKI 2	o ΙΛ		61,50	HT 144	O LZ1	218,5	T—
ii MO	10000	832,20	li -V*	10000 !........	230,50	li '1/1	1734 I	IX
SW620	O ΙΛ		128,70	293	Q l/l		3,80	PM σ o. φ X	SD		89,73
li '1O	10000	365,00	Li *IO	!	O uo m 3	li ΊΛ	10000	O 'O ci CO Ό
θ' CM 1— X	SD		1,06	UM-UC-3	O LO	1367,00	0,13	BxPC3	O	31,81	ro O
ki •W	10000	O >P ci in co	li *Vł	2242,00	CO O hi	li '10	64,71	IX U*» ci
COLO 205	O m	17,68	0,19	SW 780	Q UO	ro ''C ci TT	0,22	O Ό X □ z	SD	111,0	0,09
ii 'iSt	M* CM	0,87	li '1/1	120,00	3,78
*10	5889	hi
linia komórkowa	rhTRAIL 95-281	Prz. 1	linia komórkowa	rhTRAIL 95-281	e Q_ ;	linia komórkowa	rhTRAIL 95-281	Ć O.

PL 219 845 B1 &

Μ

Ίυ

Ό s>

<J νπ

JS ω

_Ω <3

PC3	SD			NCI-H69	Q t/l			CCRF-CEM	l/l
ki '1/1	10000	1056	'VI	10000	1600	'1/1	10000	1600
LNCaP	SD	o -o Ό 'T		H69AR	SD			HL60	σι
ki '1/1	2052,00	1600	ki '«Λ	o	1600	ki 'i/>	10000	1600
DU 145	Q σι		S m <©	m ώ < Ś	Ω t/l	tr M «0	27,93	JURKAT A3	SD		4,00
ii '1/5	o	o o m rs. ’Τ	ti	93,10	79,25	ki '1/1	10000	30,15
MDA-MB-231	Q L/T		11,17	m Ś σι	O </>			Z X u <	^SD		76,37
ki '1/1	oooo r	345,20	ki σι	10000	1600	't/l	10000	510,00
MCF7	SD		17,00	CAKI 2	Ω σι		2,10	H X	SD	218,5	1,89
k·» '</1	g	O ΙΛ 00 Ό	ki 'VI	0000 V	1303	'1/1	1734	57,44
Ο CM £	Q izi			293	Ω σ»			HepG2	Ω 1/Ί		389,62
u '1/5	10000	1600	ui VI	10000	1600	'1/1	10000	1315
ο» <Ν 1— X	SD			UM-UC-3	Ω σι	1367,00	in in O?	BxPC3	SD	31,81	1,41
ki '1/5	10000	!	ki 'ΙΛ	j 2242,00	O 00	'1/1	T 3	93,90
COLO 205	SD	17,68	tn Ό f*l	SW780	Ω σι	ΓΟ V r-T	1,03	O Ό X 1 o z	SD	111,0	28,14
ki 'ΙΛ	g S	12,24	ki 'W1	120,00	Ό 00 ΡΠ
ki '1/1	5889	118,90
linia komórkowa	rhTRAIL 95-281	Prz. 5	linia komórkowa	rhTRAIL 95-281	Prz. 5	linia komórkowa	rhTRAIL 95-281	Prz. 5

PL 219 845 B1

Tab

PL 219 845 B1

3. Efektywność przeciwnowotworowa białek fuzyjnych in vivo na ksenoprzeszczepach

Aktywność przeciwnowotworowa preparatów białkowych badana była na mysim modelu ludzkiego nowotworu jelita grubego HCT116.

Komórki

Komórki HCT116; utrzymywane były w pożywce RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, USA) wymieszanej w stosunku 1:1 z Opti-MEM (Invitrogen, nr kat. 22600-134) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej oraz 2 mM glutaminy. W dniu zaszczepienia myszy, komórki zostały odklejone od podłoża poprzez przemycie komórek trypsyną (Invitrogen), następnie komórki zostały żwirowane przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut, zawieszone w buforze HBSS (Hanks medium) policzone i rozcieńczone do ilości 25 x10⁶ komórek/ml.

Komórki A549 niedrobnokomórkowego raka płuc A549 (ATCC CCL-185 utrzymywano w pożywce RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, USA) suplementowanej 10% cielęcej surowicy płodowej. W dniu zaszczepienia myszy, komórki zostały odklejone od podłoża poprzez przemycie komórek trypsyną (Invitrogen), następnie komórki zostały żwirowane przy 1300 rpm, 4°C, 8 minut, zawieszone w buforze HBSS (Hanks medium) policzone i rozcieńczone do ilości 25x10⁶ komórek/ml.

Myszy

Badanie aktywności przeciwnowotworowej białek prowadzono na 7-9 tygodniowych myszach typu CD- nude (Crl:CD1-Foxn1^nu) otrzymanych z Charles River. Myszy utrzymywano w warunkach wolnych od specyficznych patogenów, posiadały wolny dostęp do karmy oraz demineralizowanej wody (ad libitum). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach prowadzono zgodnie z wytycznymi: „Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education” wydanym przez New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research, oraz zostały zaakceptowane przez IV Lokalną Komisję Etyczną do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach w Warszawie (No 71/2009).

Przebieg i ocena eksperymentu

Model nowotworu jelita grubego

W dniu 0 myszy zostały zaszczepione podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 5x10⁶ komórek HCT116 zawieszonych w 0,2 ml buforu HBSS przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm ₃ (Bogmark). Kiedy guzy nowotworowe osiągnęły wielkość ~90-140 mm³ (dzień 14), myszy zostały ₃ poddane randomizacji tak, aby śr. wielkość guzów w grupie wyniosła ~70 mm³ i przypisane do grup terapeutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparaty białek fuzyjnych według wynalazku oraz rhTRAIL114-281 jako preparat porównawczy. Preparaty podawane były drogą dożylną (i.v.) przez ₃ dziesięć kolejnych dni. Gdy dana grupa terapeutyczna osiągnęła średnią wielkość guza ~1000 mm³myszy poddawane były uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego. Grupa kontrolna otrzymywała rhTRAIL114-281.

Wyniki eksperymentów przedstawiono jako wielkość średnią (śr) ± SD (SD). Wszystkie obliczenia oraz wykresy przygotowane zostały przy pomocy programu GraphPad Prism 5.0.

Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 5, która pokazuje zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli u myszy Crt:CDI-Foxn1^nu obarczonych nowotworem HCT116 traktowanych białkami fuzyjnymi według wynalazku z Prz. 1, Prz. 4, Prz. 5 i Prz. 9 i porównawczo rhTRAIL114-281 oraz na Fig. 6, która pokazuje zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli u myszy Crl:CD1-Foxn1^nu obarczonych nowotworem HCT116 traktowanych białkami fuzyjnymi według wynalazku z Prz. 1, Prz. 4, Prz. 5 i Prz. 9 i porównawczo rhTRAIL114-281.

Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 5 i 6, przez podawanie białek fuzyjnych według wynalazku z Prz. 1, Prz. 4, Prz. 5 i Prz. 9 uzyskano zahamowanie wzrostu guza HCT116, z wartością TGI odpowiednio 67,8; 69,8; 84,4 oraz 66,2% względem kontroli w 28 dniu eksperymentu. Dla użytego jako preparat referencyjny rhTRAIL114-281 uzyskano efekt hamujący wzrost guza nowotworowego względem kontroli, przy TGI na poziomie 44%. Zatem białka fuzyjne według wynalazku wykazują znacznie silniejsze działanie w porównaniu z białkiem rhTRAIL114-281.

Badane białka fuzyjne nie powodowały znaczących efektów ubocznych objawiających się spadkiem masy ciała myszy - odnotowano spadek masy poniżej 10% wartości początkowej masy ciała. Wskazuje to na niską toksyczność ogólnoustrojową stosowanych białek według wynalazku.

Model nowotworu płuc

W dniu 0 myszy zostały zaszczepione podskórnie (s.c.) w prawy bok komórkami w ilości 5x10⁶komórek A549 zawieszonych w 0,2 ml buforu HBSS przy pomocy strzykawki z igłą 0,5 x 25 mm (Bo24

PL 219 845 B1 ₃ gmark). Kiedy guzy nowotworowe osiągnęły wielkość ~80-120 mm³ (dzień 14), myszy zostały podda₃ ne randomizacji tak, aby średnia wielkość guzów w grupie wyniosła ~90 mm³ i przypisane do grup terapeutycznych. W grupach terapeutycznych podawano preparaty białek fuzyjnych według wynalazku oraz rhTRAIL114-281 jako preparat porównawczy. Preparaty podawane były drogą dożylną (i.v.) przez sześć kolejnych podań co drugi dzień. Gdy dana grupa terapeutyczna osiągnęła średnią wiel₃ kość guza ~1000 mm³ myszy poddawane były uśpieniu poprzez przerwanie rdzenia kręgowego. Grupa kontrolna otrzymywała rhTRAIL114-281.

Wielkość guza mierzono przy pomocy suwmiarki elektronicznej, objętość guza liczono według ₂ wzoru: (a² x b)/2, gdzie a = krótsza przekątna guza (mm) oraz b = dłuższa przekątna guza (mm). Zahamowanie wzrostu guza obliczano przy pomocy wzoru:

TGI (%) (tumour growth inhibition) = (WT/WC) x 100-100%, gdzie WT odnosi się do średniej objętości guza w grupie traktowanej, WC odpowiada średniej objętości guza w grupie kontrolnej.

Wyniki eksperymentów przedstawiono na Fig. 7, która pokazuje zmiany objętości guza nowotworowego względem kontroli u myszy Crl:CD1-Foxn1^nu obarczonych nowotworem A549 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 1 i porównawczo rhTRAIL114-281 oraz na Fig. 8, która pokazuje zahamowanie wzrostu guza (%TGI) jako odsetek kontroli u myszy Crl:CD1-Foxn1^nuobarczonych nowotworem A549 traktowanych białkiem fuzyjnym według wynalazku z Prz. 1 i porównawczo rhTRAIL114-281.

Jak wynika z wyników eksperymentów przedstawionych na wykresach na Fig. 7 i 8, przez podawanie białka fuzyjnego według wynalazku z Prz. 1 uzyskano zahamowanie wzrostu guza A549, z wartością TGI 44,8% względem kontroli w 33 dniu eksperymentu. Dla użytego jako preparat referencyjny rhTRAIL114-281 uzyskano efekt hamujący wzrost guza nowotworowego względem kontroli, przy TGI na poziomie 16,5%. Zatem białka fuzyjne według wynalazku wykazują znacznie silniejsze działanie w porównaniu z białkiem rhTRAIL114-281.

PL 219 845 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Adamed Sp. z o.o.

<120> przeciwnowotworowe białko fuzyjne <130> P071/02/PL <160> 45 <170> Patentin wersja 3.5 <210> 1 <211> 173 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> sekwencja białka fuzyjnego <400> 1

Arg

Lys

Arg

Lys

Ser

Arg

Gly

Arg

val

Ala

1

5

10

15

His

He

Thr

Gly

Thr

Arg

Gly

Arg

ser

Asn

Thr

Leu

Ser

ser

pro

Asn

20

25

30

ser

Lys

Asn

Glu

Lys

Ala

Leu

Gly

Arg

Lys

ile

Asn

ser

Trp

Glu

ser

35

40

45

Ser

Arg

Ser

Gly

His

Ser

Phe

Leu

Ser

Asn

Leu

His

Leu

Arg

Asn

Gly

50

55

60

Glu

Leu

val

Ile

His

Glu

Lys

Gly

Phe

Tyr

Ile

Tyr

Ser

Gin

Thr

65

70

75

80

Tyr

Phe

Arg

phe

Gin 85

Glu

ile

Lys

Glu 90

Asn

Thr

Lys

Asn

Asp 95

Lys

Gin

Met

val

Gin 100

Tyr

Ile

Tyr

Lys

Tyr 105

Thr

Ser

Tyr

Pro

Asp 110

pro

Ile

Leu

Met

Lys

Ser

Ala

Arg

Asn

Ser

Cys

Trp

Ser

Lys

Asp

Ala

Glu

115

120

125

Tyr

&

Leu

Tyr

Ser

Ile

Tyr 135

Gin

Gly

Ile

Phe 140

Glu

Leu

Lys

Glu

Asn

ASp

Arg

ile

Phe

vai

Ser

val

Thr

Asn

Glu

His

Leu

ile

ASp

Met

145

150

15S

160

Asp

His

Glu

Ala

Ser

Phe

Gly

Ala

Phe

Leu

val

Gly

165

170

<210> 2 <211> 199 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> sekwencja białka fuzyjnego <400> 2

PL 219 845 B1

Arg 1

Lys

Arg

Lys Lys ser Arg Gly Gly Gly Gly Gly Thr ser Glu

Glu

5

10

15

Thr

ile

ser

Thr

val

Gin

Glu

Lys

Gin

Asn

ile

Ser

pro

Leu

val

20

25

30

Arg

Glu

Arg

Gly

Pro

Gin

Arg

Val

Ala

His

Ile

Thr

Gly

Thr

Arg

35

40

45

Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala 50 55 60

Leu 65

Gly

Arg

Lys

ile

Asn 70

Ser

Trp

Glu

Ser

Ser 75

Arg

Ser

Gly

His

Ser 80

Phe

Leu

Ser

Asn

Leu

His

Leu

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

Val

Ile

His

Glu

90 95

Lys Gly Phe Tyr Tyr ile Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu 100 105 110

Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met val Gin Tyr Ile 115 120 125

Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr pro Asp Pro ile Leu Leu Met Lys Ser Ala 130 135 140

Arg

Asn

ser

Cys

Trp

ser

Lys

Asp

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

ser

Ile

145

150

155

160

Tyr

Gin

Gly

Ile

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Asn

ASP

Arg

Ile

Phe

Val

165

170

175

Ser

va1

Thr

Asn

Glu

H15

Leu

ile

ASP

Met

ASP

His

Glu

Ala

Ser

Phe

180 185 190

Phe Gly Ala Phe Leu va1 Gly 195 <210> 3 <211> 230 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> sekwencja białka fuzyjnego <400> 3

Arg

Lys

Arg

Lys

Ser

Arg

Gly

Gly 10

Gly

Arg

Val

Ala 15

Ala

His

Ile

Thr

Gly 20

Thr

Arg

Gly

Arg

ser 25

Asn

Thr

Leu

ser

Ser 30

pro

Asn

Ser

Lys

Asn

Glu

Lys

Ala

Leu

Gly

Arg

Lys

Ile

Asn

Ser

Trp

Glu

ser

35

40

45

Ser

Arg

Ser

Gly

His

ser

Phe

Leu

Ser

Asn

Leu

His

Leu

Arg

Asn

Gly

50

55

60

PL 219 845 B1

Glu 65

Leu

val

ile

Hi s

Glu 70

Lys Gly Phe

Tyr

Tyr Ile Tyr Ser Gin 75

Thr 80

Tyr

Phe

Arg

Phe

Gin 85

Glu

ile

Lys

Glu 90

Asn

Thr

Lys

Asn

Asp 95

Lys

Gin

Met

Val

Gin

Tyr

Ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

Ser

Tyr

Pro

Asp

Pro

Ile

100

105

110

Leu

Met 115

Lys

Ser

Ala

Arg

Asn 120

Ser

cys

Trp

Ser

Lys 125

Asp

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

ser

Ile

Tyr

Gin

Gly

Ile

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

130

135

140

Asn

Asp Arg

Ile

Phe

Val

Ser

val

Thr

Asn

Glu

His

Leu

Ile

Asp

Met

145

150

155

160

Asp

His

Glu

Ala

Ser

Phe

Gly

Ala

Phe

Leu

val

Gly Gly Gly Gly

165

170

175

Pro

Leu

Gly

Leu

Ala

Gly

Arg

Val

Arg

Thr

Met

Pro

Phe

Leu

Phe

180

185

190

Cys

Asn

Val

Asn

ASP

Val

cys

Asn

Phe

Ala

ser

Arg

Asn

Asp

Tyr

ser

195

200

205

Tyr

Trp 210

Leu

Cys

Asn

Tyr

Tyr 215

Ser

Asn

ser

Tyr

Ser 220

Phe

Trp

Leu

Ala

ser 225

Leu

Asn

pro

GlU

Arg 230

<210>

ł

<2ii> :

L87

<212> 1

PRT

<213> :

Sekwencja sztuczna

<220>

<223> !

sekwencja białka fuzyjnego

<400>

1

Arg

Lys

Arg

Lys

ser

Arg

pro

Leu

Gly

Leu

Ala

Gly

Glu

Arg

Lys

1

5

10

15

Arg

Lys

ser

Arg

Gly Gly Gly Gly Gly

Arg

val

Ala

His

ile

20

25

30

Thr

Gly

Thr

Arg

Gly

Arg

ser

Asn

Thr

Leu

ser

Ser

pro

Asn

ser

Lys

35

40

45

Asn

Glu

Lys

Ala

Leu

Gly

Arg

Lys

Ile

Asn

ser

Trp

Glu

ser

Arg

50

55

60

ser

Gly

His

Ser

Phe

Leu

Ser

Asn

Leu

His

Leu

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

65

70

75

80

PL 219 845 B1

Val

ile

HI s

Glu

Lys 85

Gly Phe Tyr Tyr ile Tyr ser Gin Thr Tyr phe

90

95

Arg

Phe

Gin

Glu 100

Glu

Ile

Lys

Glu

Asn 105

Thr

Lys

Asn

Asp

Lys 110

Gin

Met

Val

Gin

Tyr

ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

ser

Tyr

pro

ASp

pro

ile

Leu

115

120

125

Met

Lys

Ser

Ala

Arg

Asn

Ser

Cys

Trp

Ser

Lys

ASp

Ala

Glu

Tyr

Gly

130

135

140

Leu

Tyr

Ser

ile

Tyr

Gin

Gly Gly

ile

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Asn

Asp

145

150

155

160

Arg

Ile

Phe

val

ser

val

Thr

Asn

Glu

His

Leu

ile

Asp

Met

ASp

His

165

170

175

Glu

Ala

ser

phe

Gly

Ala

phe

Leu

val

Gly

180 185 <210> 5 <21L> 187 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<22 3>

sekwencja białka fuzyjnego

<400>

5

Arg 1

Lys

Arg

Lys

Lys 5

ser

Arg

val

Arg 10

pro

Leu

Gly

Leu

Ala 15

Gly

Glu

Arg

Lys

Arg

Lys

Ser

Arg

Gly Gly

Arg

val

Ala

His

ile

20

25

30

Thr

Gly

Thr

Arg

Gly

Arg

Ser

Asn

Thr

Leu

Ser

Pro

Asn

Ser

Lys

35

40

45

Asn

Glu

Lys

Ala

Leu

Gly

Arg

Lys

Ile

Asn

ser

Trp

Glu

Ser

ser

Arg

50

55

60

Ser

Gly

His

ser

Phe

Leu

Ser

Asn

Leu

His

Leu

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

65

70

75

80

Val

Ile

His

Glu

Lys

Gly

Phe

Tyr

ile

Tyr

Ser

Gin

Thr

Tyr

Phe

85

90

95

Arg

Phe

Gin

Glu

Ile

Lys

Glu

Asn

Thr

Lys

Asn

Asp

Lys

Gin

Met

100

105

110

val

Gin

Tyr

Ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

Ser

Tyr

Pro

Asp

Pro

Ile

Leu

115

120

125

Met

Lys

ser

Ala

Arg

Asn

ser

cys

Trp

Ser

Lys

Asp

Al a

Glu

Tyr

Gly

130

135

140

Leu

Tyr

ser

Ile

Tyr

Gin

Gly Gly

Ile

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Asn

Asp

145

150

155

160

PL 219 845 B1

Arg Ile Phe val ser val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His 165 170 175

Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu val Gly 180 185 <210> 6 <211> 222 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> sekwencji

i białka

fuzyjnego

<400> 1

5

Arg

Lys

Arg

Lys

ser

Arg

val

Arg

Pro

Leu

Gly

ile

Ala

Gly

1

5

10

15

Glu

Arg

Lys

Arg 20

Lys

Ser

Arg

Gly 25

Gly

cys

Ala

Ala 30

Ala

cys

Ala

Cys

Thr

ser

Glu

Thr

Ile

ser

Thr

val

Gin

Glu

Lys

Gin

35

40

45

Gin

Asn 50

Ile

ser

Pro

Leu

Val 55

Arg

Glu

Arg

Gly

Pro 60

Gin

Arg

Val

Ala

His

Ile

Thr

Gly

Thr

Arg

Gly

Arg

Ser

Asn

Thr

Leu

Ser

Pro

65

70

75

80

Asn

ser

Lys

Asn

Glu 85

Lys

Ala

Leu

Gly

Arg 90

Lys

Ile

Asn

Ser

Trp 95

Glu

Ser

Arg

Ser 100

Gly

His

Ser

Phe

Leu 105

Ser

Asn

Leu

His

Leu 110

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

val

Ile

His

Glu

Lys

Gly

Phe

Tyr

Ile

Tyr

Ser

Gin

115

120

125

Thr

Tyr

Phe

Arg

Phe

Gin

Glu

Ile

Lys

Glu

Asn

Thr

Lys

Asn

Asp

130

135

140

Lys 145

Gin

Met

Val

Gin

Tyr 150

Ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr 155

Ser

Tyr

Pro

Asp

Pro 160

Ile

Leu

Met

Lys

Ser

Ala

Arg

Asn

ser

cys

Trp

Ser

Lys

Asp

Ala

165

170

175

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

Ser

Ile

Tyr

Gin

Gly

Ile

Phe

Glu

Leu

Lys

180

18S

190

Glu

Asn

Asp

Arg

Ile

Phe

val

Ser

val

Thr

Asn

Glu

His

Leu

ile

ASP

195

200

205

Met

Asp

His

Glu

Ala

ser

Phe

Gly

Ala

Phe

Leu

val

Gly

210

215

220

PL 219 845 B1 <210> 7 <211> 168 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> sekwencja białka fuzyjnego <400> 7

Cys 1

Asn

Gly

Arg

cys 5

pro Gin Arg val

Ala 10

Ala

Hi s

ile

Thr

Gly 15

Thr

Arg

Gly

Arg

Ser

Asn

Thr

Leu

Ser

ser

Pro

Asn

Ser

Lys

Asn

Glu

Lys

20

25

30

Ala

Leu

Gly

Arg

Lys

Ile

Asn

Ser

Trp

Glu

Ser

Arg

Ser

Gly

Hi s

35

40

45

ser

Phe

Leu

ser

Asn

Leu

His

Leu

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

val

ile

His

50

55

60

Glu

Lys

Gly

Phe

Tyr

ile

Tyr

ser

Gin

Thr

Tyr

Phe

Arg

Phe

Gin

65

70

75

80

Glu

ile

Lys

Glu

Asn

Thr

Lys

Asn

Asp

Lys

Gin

Met

val

Gin

Tyr

85

90

95

ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

Ser

Tyr

Pro

Asp

Pro

Ile

Leu

Met

Lys

Ser

100

105

110

Ala

Arg

Asn

Ser

Cys

Trp

Ser

Lys

Asp

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

Ser

115

120

125

Ile

Tyr

Gin

Gly

Ile

phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Asn

ASp

Arg

ile

Phe

130

135

140

val

Ser

val

Thr

Asn

Gl u

His

Leu

ile

Asp

Met

Asp

His

Glu

Ala

Ser

145

150

155

160

Phe

Gly

Ala

Phe

Leu

val

Gly

165

<210> 8 <211> 201 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> sekwencja białka fuzyjnego <400> 8

Cys Asp Cys Arg Gly ASP Cys Phe Cys Gły Gly Gły Gly Ser Thr Ser 15 10 15

Glu Glu Thr rle Ser Thr val Gin Glu Lys Głn Gin Asn Ile Ser Pro 20 25 30

Leu val Arg Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His ile Thr Gly 35 40 45

PL 219 845 B1

Thr

Arg

Gly

Arg

Ser

Asn

Thr

Leu

Ser

ser

pro

Asn

Ser

Lys

Asn

Glu

50

55

60

Lys

Ala

Leu

Gly

Arg

Lys

ile

Asn

ser

Trp

Glu

ser

Ser

Arg

Ser

Gly

65

70

75

80

His

Ser

Phe

Leu

Ser

Asn

Leu

His

Leu

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

val

Ile

85

90

95

Hi s

Glu

Lys

Gly

Phe

Tyr

ile

Tyr

ser

Gin

Thr

Tyr

phe

Arg

phe

100

105

110

Gin

Glu

Ile

Lys

Glu

Asn

Thr

Lys

Asn

ASp

Lys

Gin

Met

Val

Gin

115

120

125

Tyr

Ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

Ser

Tyr

Pro

ASP

Pro

ile

Leu

Met

Lys

130

135

140

ser

Ala

Arg

Asn

ser

Cys

Trp

Ser

Lys

Asp

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

145

150

155

160

Ser

ile

Tyr

Gin

Gly

Ile

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Asn

Asp

Arg

Ile

165

170

175

Phe

val

Ser

val

Thr

Asn

Glu

His

Leu

Ile

Asp

Met

Asp

His

Glu

Ała

180

185

190

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu val Gly 195 200 <210> 9 <211> 192 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> sekwencja białka fuzyjnego <400> 9

Tyr

Gly

Arg

pro

Arg

Gin

ser

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Lys

Arg

Leu

1

5

10

15

Lys

Pro

Thr

Arg 20

val

Val

Arg

Pro

Leu 25

Gly

Leu

Ała

Gly

pro 30

Gin

Arg

val

Ała

Ala

His

Ile

Thr

Gły

Thr

Arg

Gly

Arg

Ser

Asn

Thr

Leu

ser

35

40

45

ser

pro

Asn

ser

Lys

Asn

Glu

Lys

Ala

Leu

Gly

Arg

Lys

Ile

Asn

ser

50

55

60

Trp

Glu

ser

Arg

ser

Gly

His

Ser

Phe

Leu

ser

Asn

Leu

His

Leu

65

70

75

80

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu 85

val

ile

His

Glu

Lys 90

Gly

phe

Tyr

ile 95

Tyr

Ser

Gin

Thr

Tyr

Phe

Arg

Phe

Gin

Glu

Ile

Lys

Glu

Asn

Thr

Lys

100

105

110

PL 219 845 B1

Α5Π

Asp

Lys

Gin

Met

val

Gin

Tyr

ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

Ser

Tyr

pro

115

120

125

ASP

Pro

ile

Leu

Met

Lys

Ser

Ala

Arg

Α5Π

Ser

Cys

Trp

Ser

Lys

130

135

140

Asp

Ala

Glu

Typ

Gly

Leu

Tyr

Ser

ile

Tyr

Gin

Gly

ile

Phe

Glu

145

150

155

160

Leu

Lys

Glu

Asn

Asp

Arg

Ile

Phe

Val

Ser

val

Thr

Asn

Glu

His

Leu

165

170

175

Ile

A5p

Met

Asp

His

Glu

Ala

Ser

Phe

Gly

Ala

Phe

Leu

val

Gly

180 185 190 <210> 10 <211> 216 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> <400>	sekwencja białka fuzyjnego
10 Arg	Pro	Arg Gin Ser Gly Lys Lys Arg	Lys	Arg	Lys	Arg 15	Leu
Tyr 1	Gly
5	10
Lys	Pro	Thr	Arg 20	Val val Arg	Pro Leu Gly Leu 25	Ala	Gly	Thr 30	Ser	Glu
GlU	Thr	ile 35	ser	Thr val Gin	Glu Lys Gin Gin 40	Asn	ile 4S	ser	Pro	Leu
Val	Arg 50	Glu	Arg	Gly Pro Gin 55	Arg val Ala Ala	Hi s 60	Ile	Thr	Gly	Thr
Arg 65	Gly	Arg	Ser	Asn Thr Leu 70	ser Ser Pro Asn 75	Ser	Lys	Asn	Glu	Lys 80
Ala	Leu	Gly	Arg	Lys Ile Asn 85	Ser Trp Glu Ser 90	Ser	Arg	Ser	Gly 95	His
ser	Phe	Leu	Ser 100	Asn Leu His	Leu Arg Asn Gly 105	Glu	Leu	Val 110	Ile	His
Glu	Lys	Gly 115	Phe	Tyr Tyr Ile	Tyr Ser Gin Thr 120	Tyr	Phe 125	Arg	phe	Gin
Glu	Glu 130	ile	Lys	Glu Asn Thr 135	Lys Asn Asp Lys	Gin 140	Met	Val	Gin	Tyr
ile 145	Tyr	Lys	Tyr	Thr Ser Tyr 150	Pro Asp Pro ile 155	Leu	Leu	Met	Lys	ser 160
Ala	Arg	Asn	Ser	cys Trp ser 165	Lys Asp Ala Glu 170	Tyr	Gly	Leu	Tyr 175	Ser

PL 219 845 B1

Ile Tyr Gin Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe 180 185 190 val Ser val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser 195 200 205

Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 210 215 <210> 11 <211> 226 <212> prt <213> sekwencja sztuczna <22O>

<223> sekwencja białka fuzyjnego

<400> :

11

Tyr

Gly

Arg

Pro

Arg

Gin

ser

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Lys

Arg

Leu

1

5

10

15

Lys

Pro

Thr

Arg 20

val

Arg

ΡΓΟ

Leu 25

cly

Leu

Ala

Gly

Gly 30

Gly

cys

Ala

Cys

Ala

Cys

Thr

Ser

Glu

Thr

Ile

Ser

Thr

val

35

40

45

Gin

Glu

Lys

Gin

Asn

Ile

Ser

Pro

Leu

val

Arg

Glu

Arg

Gly

Pro

50

55

60

Gin

Arg

Val

Ala

His

Ile

Thr

Gly

Thr

Arg

Gly

Arg

Ser

Asn

Thr

65

70

75

80

Leu

ser

Pro

Asn 85

ser

Lys

Asn

Glu

Lys 90

Al a

Leu

Gly

Arg

Lys 95

Ile

Asn

Ser

Trp

Glu

Ser

ser

Arg

ser

Gly

His

Ser

Phe

Leu

Ser

Asn

Leu

100

105

110

His

Leu

Arg 115

Asn

Gly

Glu

Leu

val 120

Ile

His

Gl U

Lys

Gly 125

Phe

Tyr

Ile

Tyr

Ser

Gin

Thr

Tyr

Phe

Arg

Phe

Gin

Gl u

Glu

Ile

Lys

Glu

Asn

130

135

140

Thr

Lys

Asn

Asp

Lys

Gin

Met

val

Gin

Tyr

Ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

Ser

145

150

155

160

Tyr

Pro

Asp

ΡΓΟ

Ile 165

Leu

Met

Lys

Ser 170

Ala

Arg

Asn

Ser

Cys 175

Trp

Ser

Lys

Asp

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

Ser

Ile

Tyr

Gin

Gly

Ile

180

185

190

phe

GlU

Leu

Lys

GlU

Asn

ASp

Arg

ile

Phe

Val

Ser

Val

Thr

Asn

Glu

195

200

205

His

Leu

Ile

Asp

Met

Asp

His

Glu

Ala

Ser

Phe

Gly

Ala

Phe

Leu

210

215

220

PL 219 845 B1 val Gly 225 <210> 12 <211> 217 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

sekwencja białka

fuzyjnego

<400> :

12

Thr

Met

pro

Phe

Leu

Phe

cys

Asn

val

Asn

ASp

val

cys

Asn

Phe

Ala

1

5

10

15

ser

Arg

Asn

Asp 20

Tyr

Ser

Tyr

Trp

Leu 25

Cys

Asn

Tyr

Ser 30

Asn

Ser

Tyr

Ser

Phe

Trp

Leu

Ala

Ser

Leu

Asn

Pro

Glu

Arg

Val

val

Arg

pro

35

40

45

Leu

Gly 50

Leu

Ala

Gly Gly Gly Gly 55

Arg

Val

Ala

Ala 60

His

Ile

Thr

Gly

Thr

Arg

Gly

Arg

Ser

Asn

Thr

Leu

Ser

Pro

Asn

Ser

Lys

Asn

Glu

65

70

75

80

Lys

Ala

Leu

Gly

Arg

Lys

Ile

Asn

Ser

Trp

Glu

Ser

Arg

Ser

Gly

85

90

95

His

Ser

phe

Leu

ser

Asn

Leu

Hi s

Leu

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

val

Ile

100

105

110

His

Glu

Lys 115

Gly

Phe

Tyr

Ile 120

Tyr

Ser

Gin

Thr

Tyr 125

phe

Arg

Phe

Gin

Glu

Ile

Lys

Glu

Asn

Thr

Lys

Asn

Asp

Lys

Gin

Met

Val

Gin

130

135

140

Tyr

Ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

ser

Tyr

pro

Asp

Pro

Ile

Leu

Met

Lys

145

150

15S

160

Ser

Ala

Arg

Asn

ser

cys

Trp

ser

Lys

ASp

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

165

170

175

Ser

ile

Tyr

Gin 180

Gly

ile

Phe

Glu 185

Leu

Lys

Glu

Asn

Asp 190

Arg

ile

Phe

Val

Ser

Val

Thr

Asn

Glu

His

Leu

Ile

ASp

Met

ASp

His

Glu

Ala

195

200

205

Ser

Phe

Gly

Ala

phe

Leu

Val

Gly

210

215

<210> 13 <211> 220 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 219 845 B1 <220>

<223> sekwencja białka fuzyjnego <400> 13

Cys Asn Tyr Tyr ser

Asn

ser

Tyr

ser Phe Trp Leu 10

Ala

ser

Leu 15

Asn

1

5

ΡΓΟ

Glu

Arg

val 20

val

Arg

Pro

Leu

Gly 25

Leu

Ala

Gly

Gly Gly 30

Gly

Arg

val

Ala

His

Ile

Thr

Gly

Thr

Arg

Gly

Arg

ser

Asn

Thr

Leu

ser

35

40

45

ser

pro 50

Asn

Ser

Lys

Asn

Glu 55

Lys

Ala

Leu

Gly

Arg 60

Lys

ile

Asn

ser

Trp

Glu

Ser

Arg

Ser

Gly

His

Ser

Phe

Leu

Ser

Asn

Leu

His

Leu

65

70

75

80

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

val

ile

His

Glu

Lys

Gly

phe

Tyr

Ile

Tyr

85

90

95

Ser

Gin

Thr

Tyr

phe

Arg

Phe

Gin

Glu

ile

Lys

Glu

Asn

Thr

Lys

100

105

110

Asrt

Asp

Lys

Gin

Met

Val

Gin

Tyr

ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

ser

Tyr

Pro

115

120

125

Asp

Pro 130

Ile

Leu

Met

Lys 135

Ser

Ala

Arg

Asn

Ser 140

Cys

Trp

Ser

Lys

Asp

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

ser

ile

Tyr

Gin

Gly Gly

ile

phe

Glu

145

150

155

160

Leu

Lys

Glu

Asn

Asp

Arg

Ile

Phe

val

Ser

val

Thr

Asn

Glu

His

Leu

165

170

175

Ile

Asp

Met

Asp

His

Glu

Ala

ser

phe

Phe

Gly

Ala

Phe

Leu

va1

Gly

180

185

190

Gly Gly

Gly 195

Thr

Met

Pro

Phe

Leu 200

Phe

Cys

Asn

val

Asn 205

Asp

val

Cys

ASn

Phe

Ala

Ser

Arg

Asn

Asp

Tyr

ser

Tyr

Trp

Leu

210

215

220

<210> 14 <211> 181 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna

<220> <223>	sekwencja białka fuzyjnego
<400>	14
Leu Gly	’ Leu Arg ser Leu Arg Glu Arg	val	val Arg Pro Leu Gly Leu
1	5	10	15

PL 219 845 B1

Ala

Gly Pro

Gin 20

Arg Val Ala

Ala His 25

Ile

Thr Gly Thr

Arg 30

Gly

Arg

ser

Asn

Thr

Leu

ser

pro

Asn

Ser

Lys

Asn

Glu

Lys

Ala

Leu

Gly

35

40

45

Arg

Lys

Ile

Asn

Ser

Trp

Glu

ser

Ser

Arg

Ser

Gly

His

Ser

Phe

Leu

50

55

60

Ser

Asn

Leu

His

Leu

Arg

Asn

Gly Glu

Leu

val

Ile

His

Glu

Lys

Gly

65

70

75

80

phe

Tyr

ile

Tyr

ser

Gin

Thr

Tyr

phe

Arg

phe

Gin

Glu

GlU

Ile

85

90

95

Lys

Glu

Asn

Thr 100

Lys

Asn

ASp

Lys

Gin 105

Met

Val

Gin

Tyr

ile 110

Tyr

Lys

Tyr

Thr

Ser

Tyr

Pro

Asp

Pro

Ile

Leu

Met

Lys

Ser

Ala

Arg

ASn

115

120

125

Ser

Trp

ser

Lys

ASP

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

Ser

ile

Tyr

Gin

135

140

Gly Gly

ile

phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Asn

ASP

Arg

Ile

Rhe

val

ser

val

145

150

155

160

Thr Asn

Glu

His

Leu

Ile

ASP

Met

Asp

His

Glu

Ala

Ser

phe

Phe

Gly

165

170

175

Ala Phe

Leu

va1

Gly

180

<210> 15 <211> 217

<212> <213>

PRT Sekwencja sztuczna

<22O> <223>

sekwencja białka fuzyjnego

<400>

15

Leu Gly

Leu Arg ser 5

Leu

Arg

Glu

Arg

val 10

val

Arg

Pro

Leu

Gly 15

Leu

Ala Gly

Pro Gly Gly Gly 20

cys

Ala

Ala 25

Ala

cys

Ala

cys 30

Thr

Ser

Glu Glu

Thr ile ser 35

Thr

val

Gin 40

Glu

Lys

Gin

Asn 45

Ile

Ser

Pro

Leu val 50

Arg Glu Arg

Gly

Pro 55

Gin

Arg

val

Ala

Ala 60

His

Ile

Thr

Gly

Thr Arg 65

Gly Arg Ser

Asn 70

Thr

Leu

Ser

Pro 75

Asn

Ser

Lys

Asn

Glu 80

Lys Ala

Leu Gly Arg 85

Lys

Ile

Asn

ser

Trp 90

GlU

ser

Ser

Arg

ser 95

Gly

PL 219 845 B1

His Ser

Phe

Leu

ser

Asn

Leu

His Leu

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

val

Ile

100

10S

110

His Glu

Lys

Gly

phe

Tyr

ile Tyr

Ser

Gin

Thr

Tyr

Phe

Arg

Phe

115

120

125

Gin Glu

Glu

Ile

Lys

Glu

Asn

Thr Lys

Asn

Asp

Lys

Gin

Met

val

Gin

130

135

140

Tyr Ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

Ser

Tyr pro

Asp

pro

ile

Leu

Met

Lys

145

150

155

160

Ser Ala

Arg

Asn

Ser

Cys

Trp

Ser Lys

Asp

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

165

170

17S

Ser Ile

Tyr

Gin

Gly Gly

ile

Phe Glu

Leu

Lys

Glu

Asn

Asp

Arg

ile

180

185

190

Phe val

ser

val

Thr

Asn

Glu

His Leu

ile

Asp

Met

Asp

His

Glu

Ala

195

200

205

ser Phe

Phe

Gly

Ala

phe

Leu

val Gly

210

215

<2io> :

16

<2ii> ;

281

<212> 1

PRT

<213> l

Homo

sapiens

<300>

<3O8> i

GenBank/R5O591

<309> :

1996-

-10-01

<313>

(1).

.(281)

<400> :

16

Met Ala

Met

Glu

val

Gin

Gly Gly

pro

Ser

Leu

Gly

Gin

Thr

Cys

1

5

10

15

Val Leu

Ile

val

ile

phe

Thr

val Leu

Leu

Gin

ser

Leu

cys

Val

Ala

20

25

30

val Thr

Tyr 35

val

Tyr

Phe

Thr

Asn Glu 40

Leu

Lys

Gin

Met 45

Gin

Asp

Lys

Tyr ser

Lys

ser

Gly

Ile

Ala

cys Phe

Leu

Lys

Glu

Asp

Ser

Tyr

50

55

60

Trp Asp

Pro

Asn

Asp

Glu

Ser Met

Asn

ser

Pro

Cys

Trp

Gin

val

65

70

75

80

Lys Trp

Gin

Leu

Arg

Gin

Leu

val Arg

Lys

Met

Ile

Leu

Arg

Thr

Ser

85

90

95

Glu Glu

Thr

ile

Ser

Thr

Val

Gin Glu

Lys

Gin

Asn

ile

Ser

pro

100

105

110

Leu val

Arg

Glu

Arg

Gly

pro

Gin Arg

va1

Ala

His

ile

Thr

Gly

115

120

125

PL 219 845 B1

Thr Arg Gly 130

Arg Ser Asn

Thr Leu Ser ser Pro Asn

Ser

Lys

Asn

Glu

135

140

Lys

Ala

Leu

Gly

Arg

Lys

ile

Asn

Ser

Trp

Glu

ser

Ser

Arg

Ser

Gly

145

150

155

160

His

ser

phe

Leu

ser

Asn

Leu

His

Leu

Arg

Asn

Gly

Glu

Leu

val

Ile

165

170

175

His

Glu

Lys

Gly

Phe

Tyr

ile

Tyr

Ser

Gin

Thr

Tyr

Phe

Arg

Phe

180

185

190

Gin

Glu

Ile

Lys

Glu

Asn

Thr

Lys

Asn

Asp

Lys

Gin

Met

val

Gin

195

200

205

Tyr

ile

Tyr

Lys

Tyr

Thr

ser

Tyr

Pro

Asp

pro

ile

Leu

Met

Lys

210

215

220

Ser

Ala

Arg

Asn

Ser

cys

Trp

Ser

Lys

Asp

Ala

Glu

Tyr

Gly

Leu

Tyr

225

230

235

240

Ser

ile

Tyr

Gin

Gly

ile

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Asn

Asp

Arg

ile

245

250

255

Phe

Val

Ser

Val

Thr

Asn

Glu

His

Leu

Ile

ASp

Met

Asp

His

Glu

Ala

260

265

270

Ser

Phe

Gly

Ala

phe

Leu

va1

Gly

275

280

<210> <211> <212> <213>	17 7 PRT Homo sapiens
<300> <3O8>	GenBank/AAl72307
<309>	2009-03-16
<313>	(333)..(339)
<400>	17
Arg Lys Arg Lys Lys Ser

5

<210>	18
<211>	25
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<300>
<308>	GenBank/AAF72632.1
<309>	2000-05-30
<313>	(74)..(98)
<400>	18
Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn val Asn Asp val Cys Asn Phe Ala

10 15

Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu 20 25

PL 219 845 B1 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <300>

<308> GenEank/AAF72632.1 <309> 2000-05-30 <313> (197)..(214) <400> 19

Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu Ala ser Leu Asn 15 10 15

Pro Glu <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> peptyd syntetyczny <300>

<301> Arap w., Pasqualini R., Ruoslahti E.

<302> Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature <303> Science (Washington DC) <3O4> 279 <3O5> 5349 <306> 377-380 <307> 1998-01-16 <313> (1)..(5) <400> 20

Cys Asn Gly Arg Cys

5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> konstrukt syntetyczny <300>

<308> PDB/lFUL_A <309> 2009-07-10 <313> (2)..(10) <400> 21

Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys 1 5 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <300>

<301s Khachigian LM, Owensby DA, Chesterman CN.

<302> A tyrosinated peptide representing the alternatively spliced exon of the p1atelet-derived growth factor A-chain binds specifically to cultured cells and interferes with binding of several growth factors.

PL 219 845 B1 <303> Journal of Biological Chemistry <304> 25 <305> 267 <306> 1660-1666 <3O7> 1992-01-25 <300>

<301> Khachigian LM, Field SL, Crouch r, Chesterman CN <302> Platelet-derived growth factor A-chain peptyd syntetyczny inhibits human glioma xenograft proliferation in nudę mice.

<303> Anti cancer Res <304> 15 <305> 2 <306> 337-41 <307> 1995-04-05 <400> 22

Tyr Gly Arg Pro Arg Gin Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu 15 10 15

Lys Pro Thr <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <300>

<308> GenBank/AAl67147.1 <309> 2008-05-05 <313> (453)..(460) <400> 23

Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> protease cutting sequence <400> 24 pro Leu Gly Leu Ala Gly 1 5 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> protease cutting sequence <400> 25

Arg Val Val Arg <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <22O>

PL 219 845 B1 <223> sekwencja sztuczna linkera sterycznego <400> 26

Gly Gly Gly cys Ala Ala Ala cys Ala Ala Cys 15 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> sekwencja sztuczna linkera sterycznego <400> 27

Gly Gly Cys Ala Ala Ala cys Ala Ala Cys 15 10 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> sekwencja sztuczna linkera sterycznego <400> 28

<210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> mus musculus <300>

<308> GenBank/CAA94521.1 <309> 1996-06-13 <313> (122)..(124) <400> 29

Gly Gly Gly Gly 1 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <300>

<308> Gerteank/CAA94521.1 <309> 1996-06-13 <313> (122)..(126) <400> 30

Gly Gly Gly Gly Ser <210> 31 <211> 519 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> konstrukt sztuczny

PL 219 845 B1

<400> 31 cgtaaacgca aaaaaagtcg	tggtggtggt	ggtggccgcg	ttgcggcaca tattacgggt	60
acccgtggcc	gcagcaacac	gctgagctct	ccgaattcga	aaaatgaaaa	agcactgggc	120
cgcaaaatta	actcgtggga	aagcagtcgt	tctggtcaca	gctttctgtc	gaatctgcac	180
ctgcgcaatg	gtgaactggt	gattcatgaa	aaaggctttt	actatatcta	ttctcagacg	240
tattttcgtt	ttcaggaaga	aattaaagaa	aacaccaaaa	atgacaaaca	gatggtgcag	300
tacatttaca	aatacaccag	ttacccggac	ccgattctgc	tgatgaaaag	cgcccgtaac	360
tcatgctgga	gcaaagacgc	tgaatatggc	ctgtattcta	tttatcaggg	tggcatcttc	420
gaactgaaag	aaaacgatcg	tatttttgtt	tcggtgacca	acgaacacct	gattgatatg	480
gatcatgaag	catcgttttt	cggcgcgttt	ctggtcggc			519

<210> 32 <211> 597 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> konstrukt sztuczny <400> 32

cgcaaacgta	aaaaaagccg	tggtggtggc	ggtggcacca	gcgaagaaac	cattagcacc	60
gttcaggaaa	aacagcagaa	tattagtccg	ctggttcgtg	aacgtggtcc	gcagcgtgtt	120
gcagcacata	ttaccggcac	ccgtggtcgt	agcaataccc	tgagcagccc	gaatagcaaa	180
aatgaaaaag	cactgggtcg	caaaattaat	agctgggaaa	gcagccgtag	cggtcatagc	240
tttctgagca	atctgcatct	gcgtaatggt	gaactggtga	ttcatgaaaa	aggcttttat	300
tatatttata	gccagaccta	ttttcgcttt	caggaagaaa	ttaaagaaaa	taccaaaaat	360
gataaacaaa	tggtgcagta	tatctataaa	tacaccagct	atccggatcc	gattctgctg	420
atgaaaagcg	cacgtaatag	ctgttggagc	aaagatgcag	aatatggtct	gtatagcatt	480
tatcagggtg	gcatttttga	actgaaagaa	aatgatcgca	tttttgtgag	cgtgaccaat	540
gaacatctga	ttgatatgga	tcatgaagcc	agcttttttg	gtgcatttct	ggtgggt	597

<210> 33 <211> 690 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> konstrukt sztuczny <400> 33 cgtaaacgta aaaaaagccg tggtggtggt ggcggtcgtg ttgcagcaca tattaccggc 60 acccgtggtc gtagcaatac cctgagcagc ccgaatagca aaaatgaaaa agcactgggt 120 cgcaaaatta atagctggga aagcagccgt agcggtcata gctttctgag caatctgcat 180 ctgcgtaatg gtgaactggt gattcatgaa aaaggctttt attatattta tagccagacc 240 tattttcgct ttcaggaaga aattaaagaa aataccaaaa atgataaaca aatggtgcag 300 tacatttaca aatataccag ctatccggat ccgattctgc tgatgaaaag cgcacgtaat 360 agctgttgga gcaaagatgc agaatatggt ctgtatagca tttatcaggg tggcattttt 420 gaactgaaag aaaatgatcg catttttgtg agcgtgacca atgaacatct gattgatatg 480 gatcatgaag ccagcttttt tggtgcattt ctggttggtg gcggtggtcc gctgggtctg 540

PL 219 845 B1

gcaggtcgtg	ttgttcgtac	catgccgttt	ctgttttgca	atgttaatga	tgtgtgcaat	600
tttgccagcc	gcaatgatta	tagctattgg	ctgtgcaatt	attatagcaa	tagctatagc	660
ttttggctgg	ctagtctgaa	tccggaacgt				690
<210> 34 <211> 561 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna
<220> <223> konstrukt sztuczny
<400> 34 cgcaaacgta	aaaaaagccg	tccgctgggt	attgccggtg	aacgtaaacg	caaaaaatct	60
cgtggtggtg	gtggcggtcg	tgttgcagca	catattaccg	gcacccgtgg	tcgtagcaat	120
accctgagca	gcccgaatag	caaaaatgaa	aaagccctgg	gtcgcaaaat	taatagctgg	180
gaaagcagcc	gtagcggtca	tagctttctg	agcaatctgc	atctgcgtaa	tggtgaactg	240
gtgattcatg	aaaaaggctt	ttattatatt	tatagccaga	cctattttcg	ctttcaggaa	300
gaaattaaag	aaaacaccaa	aaatgataaa	caaatggtgc	agtatatcta	taaatacacc	360
agctatccgg	atccgattct	gctgatgaaa	agcgcacgta	atagctgttg	gagcaaagat	420
gcagaatatg	gcctgtatag	catttatcag	ggtggcattt	ttgaactgaa	agaaaatgat	480
cgcatttttg	tgagcgtgac	caatgaacat	ctgattgata	tggatcatga	agccagcttt	540
tttggtgcat	ttctggtggg	t				561
<210> 35 <211> 561 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> konstrukt sztuczny
<400> 35 cgtaaacgta	aaaaaagccg	tgttgttcgt	ccgctgggta	ttgccggtga	acgtaaacgc	60
aaaaaatcac	gtggtggtcg	tgttgcagca	catattaccg	gcacccgtgg	tcgtagcaat	120
accctgagca	gcccgaatag	caaaaatgaa	aaagcactgg	gtcgcaaaat	taatagctgg	180
gaaagcagcc	gtagcggtca	tagctttctg	agcaatctgc	atctgcgtaa	tggtgaactg	240
gtgattcatg	aaaaaggctt	ttattatatt	tatagccaga	cctattttcg	ctttcaggaa	300
gaaattaaag	aaaataccaa	aaatgataaa	caaatggtgc	agtacattta	caaatatacc	360
agctatccgg	atccgattct	gctgatgaaa	agcgcacgta	atagctgttg	gagcaaagat	420
gcagaatatg	gtctgtatag	catttatcag	ggtggcattt	ttgaactgaa	agaaaatgat	480
cgcatttttg	tgagcgtgac	caatgaacat	ctgattgata	tggatcatga	agccagcttt	540

tttggtgcat ttctggttgg t 561 <210> 36 <211> 666 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> konstrukt sztuczny

PL 219 845 B1 <400> 36

cgtaaacgta	aaaaaagccg	tgttgttcgt	ccgctgggta	ttgcaggtga	acgtaaacgt	60
aaaaaaagcc	gtggtggtgg	ttgtgcagca	gcatgtgcag	catgtaccag	cgaagaaacc	120
attagcaccg	ttcaggaaaa	acagcagaat	attagcccgc	tggttcgtga	acgtggtccg	180
cagcgtgttg	cagcacatat	taccggtacc	cgtggtcgta	gcaataccct	gagcagcccg	240
aatagcaaaa	atgaaaaagc	actgggtcgt	aaaattaata	gctgggaaag	cagccgtagc	300
ggtcatagct	ttctgagcaa	tctgcatctg	cgtaatggtg	aactggttat	tcatgaaaaa	360
ggtttttatt	atatttatag	ccagacctat	tttcgttttc	aggaagaaat	taaagaaaat	420
accaaaaatg	ataaacagat	ggttcagtat	atttataaat	ataccagcta	tccggatccg	480
attctgctga	tgaaaagcgc	acgtaatagc	tgttggagca	aagatgcaga	atatggtctg	540
tatagcattt	atcagggtgg	tatttttgaa	ctgaaagaaa	atgatcgtat	ttttgttagc	600
gttaccaatg	aacatctgat	tgatatggat	catgaagcaa	gcttttttgg	tgcatttctg	660

gttggt 666 <210> 37 <211> 505 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> konstrukt sztuczny

<400> 37 tgtaatggtc gttgtccgca gcgtgttgca	gcacatatta ccggcacccg tggtcgtagc	60
aataccctga gcagcccgaa tagcaaaaat	gaaaaagccc tgggtcgcaa aattaatagc	120
tgggaaagca gccgtagcgg tcatagcttt	ctgagcaatc tgcatctgcg taatggtgaa	180
ctggtgattc atgaaaaagg cttttattat	atttatagcc agacctattt tcgctttcag	240
gaagaaatta aagaaaacac caaaaatgat	aaacaaatgg tgcagtatat ctataaatac	300
accagctatc cggatccgat tctgctgatg	aaaagcgcac gtaatagctg ttggagcaaa	360
gatgcagaat atggcctgta tagcatttat	cagggtggca tttttgaact gaaagaaaat	420
gatcgcattt ttgtgagcgt gaccaatgaa	catctgattg atatggatca tgaaagccag	480
cttttttggt gcatttctgg tgggt		505

<210> 38 <211> 600 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> konstrukt sztuczny <400> 38 tgtgaatgtg gcggtgaatg tttttgtggt ggcggtagca ccagtgaaga aaccattagc 60 accgttcaag aaaaacagca gaatattagt ccgctggttc gtgaacgtgg tccgcagcgt 120 gttgcagcac atattaccgg cacccgtggt cgtagcaata ccctgagcag cccgaatagc 180 aaaaatgaaa aagcactggg tcgcaaaatc aatagctggg aaagcagccg tagcggtcat 240 agctttctga gcaatctgca tctgcgtaat ggtgaactgg tgattcatga aaaaggcttc 300 tactatatct acagccagac ctattttcgc ttccaagaag aaatcaaaga gaacaccaaa 360 aacgacaaac aaatggtgca gtacatctac aaatatacca gctatccgga tccgattctg 420

PL 219 845 B1

ctgatgaaaa gcgcacgtaa tagctgttgg agcaaagatg cagaatatgg tctgtatagc	480
atttatcagg gtggcatctt tgagctgaaa gaaaatgatc gcatctttgt tagcgtgacc	540
aacgaacatc tgatcgatat ggatcatgaa gccagctttt ttggtgcatt tctggtgggt <210> 39 <211> 576 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220> <223> konstrukt sztuczny <400> 39	600
tatggtcgtc cgcgtcagag cggtaaaaaa cgtaaacgta aacgcctgaa accgacccgt	60
gttgttcgtc cgctgggtct ggcaggtccg cagcgtgttg cagcacatat taccggcacc	120
cgtggtcgta gcaataccct gagcagcccg aatagcaaaa atgaaaaagc cctgggtcgt	180
aaaattaata gctgggaaag cagccgtagc ggtcatagct ttctgagcaa tctgcatctg	240
cgtaatggcg aactggtgat tcatgaaaaa ggcttttatt atatttatag ccagacctat	300
tttcgctttc aggaagaaat taaagaaaat accaaaaatg ataaacaaat ggtgcagtat	360
atctataaat ataccagcta tccggatccg attctgctga tgaaaagcgc acgtaatagc	420
tgttggagca aagatgccga atatggtctg tatagcattt atcagggtgg catttttgaa	480
ctgaaagaaa atgatcgcat ttttgtgagc gtgaccaatg aacatctgat tgatatggat catgaagcca gcttttttgg tgcatttctg gttggt	540 576

<210> 40 <211> 648 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <22O>

<223> konstrukt sztuczny <400> 40

tatggtcgtc	cgcgtcagag	cggtaaaaaa	cgtaaacgta	aacgcctgaa	accgacccgt	60
gttgttcgtc	cgctgggtct	ggcaggcacc	agcgaagaaa	ccattagcac	cgttcaggaa	120
aaacagcaga	atattagtcc	gctggttcgt	gaacgtggtc	cgcagcgtgt	tgcagcacat	180
attaccggca	cccgtggtcg	tagcaatacc	ctgagcagcc	cgaatagcaa	aaatgaaaaa	240
gcactgggtc	gcaaaattaa	tagctgggaa	agcagccgta	gcggtcatag	ctttctgagc	300
aatctgcatc	tgcgtaatgg	tgaactggtg	attcatgaaa	aaggctttta	ttatatttat	360
agccagacct	attttcgctt	tcaggaagaa	attaaagaaa	ataccaaaaa	tgataaacaa	420
atggtgcagt	atatctataa	atacaccagc	tatccggatc	cgattctgct	gatgaaaagc	480
gcacgtaata	gctgttggag	caaagatgca	gaatatggtc	tgtatagcat	ttatcagggt	540
ggcatttttg	aactgaaaga	aaatgatcgc	atttttgtga	gcgtgaccaa	tgaacatctg	600
attgatatgg	atcatgaagc	cagctttttt	ggtgcatttc	tggtgggt		648

<210> 41 <211> 678 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <22O>

PL 219 845 B1 <223> konstrukt sztuczny <400> 41 tatggtcgtc cgcgtcagag cggtaaaaaa cgtaaacgta aacgtctgaa accgacccgt 60 gttgttcgtc cgctgggtct ggcaggtggt ggttgtgcag cagcatgtgc agcatgtacc 120 agcgaagaaa ccattagcac cgttcaggaa aaacagcaga atattagccc gctggttcgt 180 gaacgtggtc cgcagcgtgt tgcagcacat attaccggta cccgtggtcg tagcaatacc 240 ctgagcagcc cgaatagcaa aaatgaaaaa gcactgggtc gtaaaattaa tagctgggaa 300 agcagccgta gcggtcatag ctttctgagc aatctgcatc tgcgtaatgg tgaactggtt 360 attcatgaaa aaggttttta ttatatttat agccagacct attttcgttt tcaggaagaa 420 attaaagaaa ataccaaaaa tgataaacag atggttcagt atatttataa atataccagc 480 tatccggatc cgattctgct gatgaaaagc gcacgtaata gctgttggag caaagatgca 540 gaatatggtc tgtatagcat ttatcagggt ggtatttttg aactgaaaga aaatgatcgt 600 atttttgtta gcgttaccaa tgaacatctg attgatatgg atcatgaagc aagctttttt 660 ggtgcatttc tggttggt 678 <210> 42 <21ł> 651 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <2Z0>

<223> konstrukt sztuczny <400> 42 accatgccgt ttctgttttg caatgttaat gatgtgtgca attttgccag ccgcaatgat 60 tatagctatt ggctgtgcaa ttattatagc aatagctata gcttttggct ggcttctctg 120 aatccggaac gtgttgttcg tccgctgggt ctggcaggcg gtggtggtcg tgttgcagca 180 catattaccg gcacccgtgg tcgtagcaat accctgagca gcccgaatag caaaaatgaa 240 aaagcactgg gtcgcaaaat taatagctgg gaaagcagcc gtagcggtca tagctttctg 300 agcaatctgc atctgcgtaa tggtgaactg gtgattcatg aaaaaggctt ttattatatt 360 tatagccaga cctattttcg ctttcaggaa gaaattaaag aaaataccaa aaatgataaa 420 caaatggtgc agtacattta caaatatacc agctatccgg atccgattct gctgatgaaa 480 agcgcacgta atagctgttg gagcaaagat gcagaatatg gtctgtatag catttatcag 540 ggtggcattt ttgaactgaa agaaaatgat cgcatttttg tgagcgtgac caatgaacat 600 ctgattgata tggatcatga agccagcttt tttggtgcat ttctggttgg t 651 <210> 43 <211> 660 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> konstrukt sztuczny <400> 43 tgcaattatt atagcaatag ctatagcttt tggctggcaa gcctgaatcc ggaacgtgtt 60 gttcgtccgc tgggtctggc tgggggtggc ggtcgtgttg cagcacatat taccggcacc 120 cgtggtcgta gcaataccct gagcagcccg aatagcaaaa atgaaaaagc actgggtcgc 180 aaaattaata gctgggaaag cagccgtagc ggtcatagct ttctgagcaa tctgcatctg 240

PL 219 845 B1 cgtaatggtg aactggtgat tcatgaaaaa ggcttttatt atatttatag ccagacctat 300 tttcgctttc aggaagaaat taaagaaaat accaaaaatg ataaacaaat ggtgcagtac 360 atttacaaat ataccagcta tccggatccg attctgctga tgaaaagcgc acgtaatagc 420 tgttggagca aagatgcaga atarggtctg ratagcattt atcagggtgg catttttgaa 480 ctgaaagaaa atgatcgcat ttttgtgagc gtgaccaatg aacatctgat tgatatggat 540 catgaagcca gcttttttgg tgcatttctg gttggtggcg gtggtactat gccgtttctg 600 ttttgcaatg ttaatgatgt gtgcaatttt gccagccgca atgattatag ctattggctg 660 <210> 44 <211? 543 <212> ONA <213> sekwencja sztuczna

<22O> <223> konstrukt sztuczny
<400> 44 ctgggtctgc	gtagcctgcg	tgaacgtgtt	gttcgtccgc	tgggtctggc	aggtccgcag	60
cgtgttgcag	cacatattac	cggcacccgt	ggtcgtagca	ataccctgag	cagcccgaat	120
agcaaaaatg	aaaaagccct	gggtcgtaaa	attaatagct	gggaaagcag	ccgtagcggt	180
catagctttc	tgagcaatct	gcatctgcgt	aatggcgaac	tggtgattca	tgaaaaaggc	240
ttttattata	tttatagcca	gacctatttt	cgctttcagg	aagaaattaa	agaaaatacc	300
aaaaatgaca	aacaaatggt	gcagtatatc	tataaatata	ccagctatcc	ggatccgatt	360

ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgccgaata tggtctgtat 420 agcatttatc agggtggcat ttttgaactg aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg 480 accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 540 ggt 543 <210> 45 <211> 651 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> konstrukt sztuczny

<400> 45
ctgggtctgc	gtagcctgcg	tgaacgtgtt	gttcgtccgc	tgggtctggc	aggtccgggt	60
ggtggttgtg	cagcagcatg	tgcagcatgt	accagcgaag	aaaccattag	caccgttcag	120
gaaaaacagc	agaatattag	cccgctggtt	cgtgaacgtg	gtccgcagcg	tgttgcagca	180
catattaccg	gtacccgtgg	tcgtagcaat	accctgagca	gcccgaatag	caaaaatgaa	240
aaagcactgg	gtcgtaaaat	taatagctgg	gaaagcagcc	gtagcggtca	tagctttctg	300
agcaatctgc	atctgcgtaa	tggtgaactg	gttattcatg	aaaaaggttt	ttattatatt	360
tatagccaga	cctattttcg	ttttcaggaa	gaaattaaag	aaaataccaa	aaatgataaa	420
cagatggttc	agtatattta	taaatatacc	agctatccgg	atccgattct	gctgatgaaa	480
agcgcacgta	atagctgttg	gagcaaagat	gcagaatatg	gtctgtatag	catttatcag	540
ggtggtattt	ttgaactgaa	agaaaatgat	cgtatttttg	ttagcgttac	caatgaacat	600
ctgattgata	tggatcatga	agcaagcttt	tttggtgcat	ttctggttgg	t	651

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Białko fuzyjne, zawierające:

- domenę (a) obejmującą funkcjonalny fragment sekwencji rozpuszczalnego białka hTRAIL rozpoczynający się aminokwasem w pozycji nie niższej niż hTRAIL95; i

- przynajmniej jedną domenę (b) stanowiącą sekwencję peptydu efektorowego o działaniu antyangiogennym, która jest wybrana z grupy składającej się z:

- heptapeptydu pochodzącego z VEGF o Sekw. Nr 17;

- fragmentu białka PDGF o Sekw. Nr 22; i

- fragmentu białka EGF o Sekw. Nr 23;

przy czym hTRAIL jest przedstawione przez Sekw. Nr 16.
2. Białko fuzyjne według zastrz. 1, w którym domena (a) obejmuje fragment sekwencji białka hTRAIL rozpoczynający się aminokwasem w zakresie od hTRAIL95 do hTRAIL121, włącznie, i kończący się aminokwasem 281.
3. Białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 2, w którym domena (a) jest wybrana z grupy składającej się z fragmentów sekwencji białka hTRAIL, rozpoczynających się aminokwasem w pozycji 95, 119, 120 lub 121.
4. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3, które pomiędzy domeną (a) a domeną (b) lub pomiędzy domenami (b) zawiera domenę (c) zawierającą miejsce cięcia proteazy, wybrane spośród sekwencji rozpoznawanej przez metaloproteazę MMP, sekwencji rozpoznawanej przez urokinazę uPA i ich kombinacji.
5. Białko fuzyjne według zastrz. 4, w którym sekwencją rozpoznawaną przez metaloproteazę MMP jest Sekw. Nr 24, a sekwencją rozpoznawaną przez urokinazę uPA jest Sekw. Nr 25.
6. Białko fuzyjne według zastrz. 4 albo 5, w którym domena (c) jest kombinacją położonych obok siebie sekwencji rozpoznawanej przez metaloproteazę MMP i sekwencji rozpoznawanej przez urokinazę uPA.
7. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. od 4 do 6, które pomiędzy domenami (a), (b) i/lub (c) zawiera dodatkowo giętki linker steryczny.
8. Białko fuzyjne według zastrz. 7, w którym tinker steryczny jest wybrany z grupy składającej się z Sekw. Nr 26, Sekw. Nr 27, Sekw. Nr 28, Sekw. Nr 29, Sekw. Nr 30, sekwencji GlyGlyGly oraz reszty kwasu glutaminowego Glu.
9. Białko fuzyjne według zastrz. 1, mające sekwencję aminokwasów odpowiadającą sekwencji wybranej z grupy składającej się z Sekw. Nr 1; Sekw. Nr 2; Sekw. Nr 4; Sekw. Nr 5; Sekw. Nr 6; Sekw. Nr 9; Sekw. Nr 10; Sekw. Nr 11; Sekw. Nr 14 i Sekw. Nr 15.
10. Białko fuzyjne według któregokolwiek z zastrz. poprzedzających, będące białkiem rekombinowanym.
11. Wyizolowana sekwencja polinukleotydowa, kodująca białko fuzyjne zdefiniowane tak jak w którymkolwiek z zastrz. 1 do 9.
12. Sekwencja według zastrz. 11, zoptymalizowana do ekspresji genetycznej w E.coli.
13. Sekwencja według zastrz. 12, wybrana z grupy składającej się z Sekw. Nr 31; Sekw. Nr 32; Sekw. Nr 34; Sekw. Nr 35; Sekw. Nr 36; Sekw. Nr 39; Sekw. Nr 40; Sekw. Nr 41; Sekw. Nr 44; i Sekw.

Nr 45.
14. Wektor ekspresyjny, zawierający sekwencję polinukleotydową według któregokolwiek z zastrz. 11 do 13.
15. Wyizolowana komórka gospodarza, zawierająca wektor ekspresyjny określony w zastrz. 14.
16. Komórka gospodarza według zastrz. 15, którą jest komórka E.coli.
17. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca jako składnik czynny białko fuzyjne zdefiniowane tak jak w którymkolwiek z zastrz. 1 do 10, w połączeniu z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem.
18. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 17, w postaci do podawania pozajelitowego.
19. Zastosowanie białka fuzyjnego zdefiniowanego tak jak w którymkolwiek z zastrz. 1 do 10 do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych u ssaków, w tym ludzi.
20. Białko fuzyjne określone jak w zastrz. 1 do 10 lub kompozycja farmaceutyczna określona jak w zastrz. 17 lub 18 do stosowania w sposobie leczenia chorób nowotworowych u ssaka, w tym człowieka.