DE69637411T2

DE69637411T2 - Antikörper gegen den menschlichen gastrinfreisetzenden Peptidvorläufer und deren Verwendung

Info

Publication number: DE69637411T2
Application number: DE1996637411
Authority: DE
Inventors: Ken 1-1 Tsukiji 5-chome Chuo-ku Yamaguchi; Yoshio 1-1 Tsukiji 5-chome Chuo-ku Miyake
Original assignee: Advanced Life Science Institute Inc
Current assignee: Advanced Life Science Institute Inc
Priority date: 1996-06-03
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2009-01-22
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: EP0811683A1; DE69637411D1; EP0811683B1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen den Vorläufer von menschlichem gastrinfreisetzendem Peptid (GRP–gastrin-releasing peptide) und die Verwendung der Antikörper als ein diagnostisches Mittel für kleinzelligen Lungenkrebs.
2. Technisches Gebiet
Es ist bekannt, dass Krebszellen für die Krebszellen spezifische Substanzen sowie Substanzen, die normalen Zellen und Krebszellen gemeinsam sind, produzieren. Durch Messen der krebsspezifischen Substanzen ist es möglich geworden, die Charakteristika von Krebszellen und Patienten mit Krebs zu diagnostizieren. Zu Substanzen, die speziell von Krebszellen erzeugt werden, gehören onkogene Produkte und Wachstumsfaktoren, die für die Tumorbildung, das Wachstum und die Entwicklung von Zellen verantwortlich sind. Darüber hinaus wird erwogen, dass die Produktion karzinoembryonischer Proteine, Hormone und Enzyme und dergleichen Charakteristika der Tumorbildung sind. Daher wird, wenn eine der Substanzen, die Krebszellen definieren, d. h. sogenannte Tumormarker, mit hoher Empfindlichkeit analysiert werden kann, die Diagnose von Krebsarten möglich.
Seit das Vorliegen neuroendokriner Partikel bei kleinzelligem Lungenkrebs 1968 beobachtet wurde, wurde behauptet, dass kleinzelliger Lungenkrebs von neuroendokrinen Zellen stammt, und zur Zeit, dass er zu Tumoren vom APUD (amin precursor uptake and decarboxylation-Aminvorläufer-Aufnahme und Decarboxylierung)-Typ gehört und sich von anderen nicht kleinzelligen Lungenkrebsarten, die Epitheltumore sind, unterscheidet. Es war bekannt, dass kleinzelliger Lungenkrebs in einer zytobiologischen Studie die charakteristischen Eigenschaften der neuroendokrinen Zellen zeigt, und es wird berichtet, dass er Peptidhormone wie Serotonin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Calcitonin, grastrinfreisetzendes Peptid (GRP) etc. produziert, um hohe L-Dopadecarboxylase (L-DDC)-Aktivität, die für Zellen oder Tumore vom APUD-Typ charakteristisch ist, aufzuweisen, und hohe Aktivitäten neuronspezifischer Enolase (NSE) und Creatinkinase BB (CK-BB), die spezifisch für Neuronzellen sind, aufzuweisen.
Die Analyse eines Oberflächenantigens von kleinzelligem Lungenkrebs auf der Basis verschiedener biologischer Eigenschaften der Zellen als Indikatoren unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers begann mit einem Bericht von Minna, Science 214, 1246–1248, 1981, und wurde durch viele Forscher gut entwickelt. Zu Testsystemen, die bisher als Tumormarker praktisch verwendet wurden, gehören jene, die karzinoembryonische Antigene wie karzinoembryonisches Antigen (CEA), α-Fetoprotein (AFP), Kohlehydrat-Antigen 125 (CA125); Enzyme wie NSE, L-DDC, CK-BB; hormonverwandte Substanzen wie ACHT, Alkohol-Dehydrogenase (ADH) verwenden. Der positive Anteil für Seren von Patienten mit Krebs, der unter Verwendung der obigen Testsysteme erhalten wird, ist jedoch höchstens 50 bis 60%, während Patienten mit Krebs häufig negative Ergebnisse liefern.
Bisher ist GRP als einer der Tumormarker von kleinzelligem Lungenkrebs bekannt. GRP ist ein aus 27 Aminosäuren bestehendes Peptid, das von McDonald 1978 aus dem Magen von Schweinen extrahiert wurde, und besitzt die Aktivität, die Absonderung von Magensäure, von verschiedenen Hormonen, etc. zu stimulieren. Es gibt drei Vorläuferproteine, die aufgrund von alternativem Spleißen von RNA in ihrer C-terminalen Struktur verschieden sind. Kürzlich wurde die Produktion von GRP als ein autokriner Wachstumsfaktor bei kleinzelligem Lungenkrebs gefunden, und es ist als ein Tumormarker interessant.
Bei Patienten mit kleinzelligem Lungenkrebs ergeben etwa 80% der Fälle eine erhöhte Blut-GRP-Konzentration. Darüber hinaus befindet sich die Blut-GRP-Konzentration selbst in den Fällen in einer frühen Phase auf einem erhöhten Niveau, und daher verspricht die Diagnose von Krebs unter Verwendung von GRP als ein Marker hochgradig effektiv zu sein. Konventionelle Untersuchungsverfahren für GRP verwenden jedoch Antikörper gegen ein aktives Peptid, GRP (1-27), und ihre Empfindlichkeit ist zu niedrig, um praktisch verwendet zu werden. Es wird angenommen, dass einer der Hauptgründe für die Schwierigkeit, eine Serum-GRP-Konzentration unter Verwendung eines Antikörpers gegen GRP (1-27) zu messen, die Instabilität von GRP (1-27) im Blut ist.
Holst et al. (J. Clin. Oncol. 7, 1831–1838, (1989)) entwickelten ein Radioimmuntest (RIA)-System, das polyklonale Antikörper gegen ein synthetisches Peptid, das dem Bereich von den Positionen 42 bis 53 des C-terminal flankierenden Peptids des GRP-Vorläufers entspricht, verwendet und zeigten, das das GRP-Vorläuferprotein ein wirkungsvoller diagnostischer Marker für kleinzelligen Lungenkrebs sein kann. Dieses System war jedoch nicht praktikabel, weil es wegen seiner Empfindlichkeit einen unzureichenden positiven Anteil lieferte. Weil das verwendete Antigenprotein ein Teil des GRP-Vorläufers war, war der sich ergebende Antikörper ein Antikörper mit niedriger Empfindlichkeit und Spezifität. Darüber hinaus erforderte die geringe Empfindlichkeit des Testsystems ein Extrahieren des Analytproteins aus einer großen Menge einer Probe, was zu einer Schwierigkeit bei der klinischen Anwendung des Systems führte. Das im Blut vorliegende GRP-Vorläuferprotein ist ein Makromolekül mit einem Molekulargewicht von 8000 bis 13000. Daher sind in einem Testsystem, das Antikörper gegen GRP (43-52), was ein Teil des GRP-Vorläufers ist, verwendet, die Empfindlichkeit und Spezifizität begrenzt.
In normalen Zellen wird ein Protein in dem endoplasmatischen Retikulum mit rauher Oberfläche erzeugt, in dem Golgi-Apparat konzentriert, was zur Bildung von Sekretgranula, in die das Protein verpackt wird, führt, und durch den sogenannten regulierten Weg extrazellulär abgesondert. Da die Sekretgranula proteolytische Enzyme enthalten, kann ein Vorläufer des Proteins passend behandelt werden, wenn er den regulierten Weg durchmacht. Andererseits wird in Krebszellen, da das endoplasmatische Retikulum mit rauher Oberfläche bemer kenswert entwickelt ist, während die Anzahl der Sekretgranula klein ist, dann, wenn GRP produziert und abgesondert wird, der GRP-Vorläufer extrazellulär von dem endoplasmatischen Retikulum mit rauher Oberfläche durch den konstitutiven Weg abgesondert, ohne dass er durch die Einwirkung irgendwelcher proteolytischer Enzyme beeinflusst wird, anstatt den regulierten Weg unter Beteiligung der Sekretionspartikel durchzumachen. Daher enthält das Blut von Patienten mit Krebs GRP-Vorläufer und flankierende Peptide zusätzlich zu einem aktiven Peptid GRP (1-27).
Es wird erwartet, dass im Vergleich zu GRP (1-27) ein von aktiven Stellen freies, flankierendes Peptid des GRP-Vorläufers stabil in einer hohen Konzentration in dem Blut vorliegt.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zum Nachweisen von Fragmenten des GRP-Vorläufers unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen den GRP-Vorläufer (70-90) sowohl als einen ersten als auch einen zweiten Antikörper bereit. Dieses Verfahren ist insbesondere für die Diagnose von kleinzelligem Lungenkrebs geeignet.
Kurze Erläuterung der Zeichnungen
1 repräsentiert eine Nucleotidsequenz von DNA, die für GRP (31-98) kodiert, und von Oligonucleotiden zur Synthese der DNA.
2 repräsentiert ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pAT-TrpE-GRP (31-98) für die Produktion von GRP (31-98).
3 ist eine grafische Darstellung, die zeigt, dass GRP (31-98) in Serum oder Plasma stabiler ist als GRP (1-27).
4 ist eine grafische Darstellung, die die Affinität verschiedener monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung zu proGRP zeigt.
5 ist eine grafische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Konzentration an GRP (31-98) und einer Menge an polyklonalem Antikörper, der an einer festen Phase festgehalten wird, zeigt, wenn das auf der festen Phase immobilisierte Polypeptid GRP (31-98) und verschiedene Konzentrationen des Peptids GRP (31-52) kompetitiv an den polyklonalen anti-GRP (31-98)-Antikörper binden.
6 ist dieselbe grafische Darstellung wie 5, außer dass das immobilisierte Peptid GRP (31-52) ist.
7 ist dieselbe grafische Darstellung wie 5, außer dass das immobilisierte Peptid GRP (44-62) ist.
8 ist dieselbe grafische Darstellung wie 5, außer dass das immobilisierte Peptid GRP (70-90) ist.
9 zeigt eine Eichkurve zum Analysieren von GRP (31-98) durch ELISA, wenn ein Gemisch der monoklonalen Antikörper 2B10 und 3G2 auf einer festen Phase immobilisiert wird und ein Peroxidase-markierter polyklonaler anti-GRP (31-98)-Antikörper als ein zweiter Antikörper verwendet wird.
10 repräsentiert ein Elutionsmuster von Peptiden in einer Serum- oder Urin-Probe bei einer Gelfiltrations-Chromatografie, wobei unter Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern, die für GRP (70-90) spezifisch sind, analysiert wurde.
Bevorzugte Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
(1) Antigen-Protein und Verfahren zu seiner Herstellung
In einem Verfahren zur in vivo-Produktion von GRP werden durch alternatives Spleißen einer mRNA drei GRP-mRNAs erzeugt, und es werden drei Vorläuferproteine gebildet, die bis hin zur Position 98, einschließlich der aktiven Stelle, eine gemeinsame Aminosäure-Sequenz haben, aber verschiedene C-terminale Strukturen haben. Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete GRP-Vorläufer-Antigen ist ein Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz von der 31ten Ser bis zur 98ten Asp des Vorläuferproteins, die unter den drei GRP-Vorläufern gemeinsam ist und keinen aktiven GRP-Bereich enthält. Man beachte, dass die Zahl der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Aminosäuren bestimmt wird, indem man die N-terminale Aminosäure Val des gereifen GRP als die erste Position nimmt. Daher wird das gereifte GRP durch GRP (1-27) repräsentiert, und das vorliegende Antigen-Peptid wird durch GRP (31-98) repräsentiert.
Eine Aminosäure-Sequenz des vorliegenden GRP-Vorläufer-Antigen-GRP (31-98) und ein Beispiel für Nucleotidsequenzen, die dafür kodieren, sind in SEQ ID NO: 1 gezeigt.
Das Antigenpeptid der vorliegenden Erfindung kann durch chemische Synthese oder durch Gentechnologie hergestellt werden. Da die chemische Synthese von Peptiden mit mehr als 40 Aminosäuren schwierig ist, ist die Gentechnologie bevorzugt.
Die Produktion des vorliegenden Antigenpeptids durch Gentechnologie kann durchgeführt werden, indem man einen Wirt wie E. coli mit einem Expressionsvektor, der in der Lage ist, das vorliegende Antigen-Peptid in dem Wirt wie E. coli zu exprimieren, transformiert, die Transformante kultiviert und das Antigen-Peptid aus den kultivierten Bakterienzellen gewinnt.
Der oben angegebene Expressionsvektor kann zwar eine beliebige Nucleotidsequenz, die für das vorliegende Antigen-Polypeptid kodiert, enthalten, aber in dem Fall des Wirts E. coli ist eine Nucleotidsequenz, die Codone aufweist, die in E. coli häufig verwendet werden und die kein Palindrom enthält, bevorzugt.
Als eine Nucleotidseuqenz, die für die Aminosäure-Sequenz von GRP (31-98) kodiert, ist die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz bevorzugt.
Ein Promotor wie der Promotor Tryptophan liegt strom auf von dem kodierenden Bereich für das vorliegende Peptid vor, um die Transkriptionseffizienz in einem verwendeten Wirt wie E. coli zu steigern. Der das Peptid kodierende Bereich kann zwar unmittelbar stromab von dem Promotor vorliegen, aber der kodierende Bereich kann stromab von einem für ein Protein, das von einem Wirt wie E. coli inhärent produziert wird, Protein Trp E, kodierenden Bereich vorliegen, wie hierin nachstehend beschrieben. In dem letzten Fall kann das vorliegende Peptid als ein Fussionprotein erhalten werden.
Ein Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthält, ähnlich wie konventionelle Expressionsvektoren, einen selektiven Marker wie Antibiotika-Resistenz und einen Replikationsstartpunkt zum Replizieren in einem Wirt wie E. coli. Darüber hinaus befindet sich stromab von dem Peptid-Kodierungsbereich ein Translations-Stopkodon. Als ein Ausgangsmaterial für die Konstruktion des Expressionsvektors können beispielsweise pUC9, pBR322 und andere Vektoren, wie im Handel verfügbare Vektoren, verwendet werden.
Der oben angegebene Expressionsvektor kann konstruiert werden durch Synthetisieren des vorliegenden Peptid-Kodierungsbereichs mittels eines bekannten Syntheseverfahrens wie des Phosphoramidit-Verfahrens, und durch Klonieren des kodieren Bereichs in einen Vektor, wie einen bekannten Vektor, der in einem Wirt wie dem Wirt E. coli exprimiert wird. In den hierin nachstehend beschriebenen Beispielen wurde der GRP kodierende Bereich in das Gen TrpE oder das Gen TGF-α eingesetzt (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 63-28908 ), das stromab von dem Tryptophan-Promotor von E. coli vorliegt.
Die Transformation mit einem Expressionsvektor kann nach einem konventionellen Verfahren durchgeführt werden. Die Kulturbedingungen eines Wirts wie E. coli sind ebenfalls konventionell.
Das vorliegende Peptid, das von einem Wirt wie E. coli, der mit einem Vektor transformiert wurde, erzeugt wurde, kann isoliert und gereinigt werden durch, beispielsweise, Sammeln von Zellen, beispielsweise durch Zentrifugieren, Zerreissen der Zellen durch eine wohl bekannte Lysozym-Behandlung und/oder Ultraschallbehandlung, und Anwenden von Gelfiltrationschromatografie oder dergleichen auf die zerrissenen Zellen. Definierte Bedingungen zur Isolierung und Reinigung des Peptids werden hierin nachstehend in Beispielen beschrieben.
(2) Produktion des Antikörpers
Eine Maus wie eine Balb/C-Maus wird periodisch immunisiert durch peritoneale oder subkutane Verabreichung des vorliegenden Antigens alleine oder als ein Antigen, das hergestellt wurde durch Binden des vorliegenden Antigens an ein Hapten wie Rinderserumalbumin (BSA-bovine serum albumin), Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH-keyhole limpet hemocyanin), etc., in einem Gemisch mit Freund'schem vollständigem Adjuvans. Nach dem Anstieg des Antikörper-titers im Blut wird die Maus durch Verabreichung des vorliegenden Antikörpers durch eine Schwanzvene der Maus aktiviert. Danach wird die Milz entfernt, und Milzzellen werden mit passenden myeloischen Zellen wie myeloischen Mäusezellen verschmolzen. Dieses Verfahren kann nach Köhler und Milstein, Nature 256, Seiten 495–497, 1975, durchgeführt werden, um ein Hybridom zu erhalten.
Die so erhaltenen Hybridome werden in einem geeigneten Medium kultiviert, und eine Hybridom-Zelllinie, die einen mit dem vorliegenden Antigen spezifisch reaktiven Antikörper produziert, wird ausgewählt und kloniert. Als nächstes werden die produzierten monoklonalen Antikörper gewonnen, beispielweise durch Säulenchromatografie.
Polyklonale Antikörper können hergestellt werden durch periodisches immunisieren eines Tieres wie eines Meerschweinchens, eines Kaninchens, einer Ziege, eines Schafes, etc., mit dem vorliegenden Antigen alleine oder in der Form eines Konjugats mit Rinderserumalbumin (BSA) oder Schlüsselloch-Napfschne cken-Hämocyanin (KLH), etc., mittels eines Fußballens, intramuskulärer Injektion oder subkutaner Injektion, als ein Gemisch mit Freund'schem vollständigem Adjuvans. Ein Anstieg des Antikörper-Titers in dem Blut wird getestet, das Vollblut wird erhalten, und die polyklonalen Antikörper werden durch Säulenchromatografie oder dergleichen gewonnen.
Die so erhaltenen monoklonalen Antikörper oder polyklonalen Antikörper können verwendet werden, um ELISA oder andere Immuntests wie IRMA, RIA, FIA, CIA, etc., durchzuführen, um den GRP-Vorläufer in einer Probe von Blut, Urin und biologischen Fluiden zu messen.
(3) Charakterisierung und Verwendung der monoklonalen Antikörper
Die vorliegenden monoklonalen Antikörper wie jene, die von den vorliegenden Hybridom-Zelllinien wie proGRP-1E2, proGRP-2B10, proGRP-20D2, proGRP-3H1, proGRP3D6, proGRP-3G2 und proGRP-4C9 produziert werden, reagieren mit dem Peptid GRP (31-98) und anderen Fragmenten des Vorläufers des menschlichen Gastrin freisetzenden Peptids und können daher zum Nachweis von Fragmenten des Vorläufers von menschlichem Gastrin freisetzendem Peptid, das ein Indikator für Lungenkrebs, insbesondere für kleinzelligen Lungenkrebs, ist, verwendet werden.
Nach einer weiteren Charakterisierung reagieren monoklonale Antikörper, die von den Hybridomen 2B10, 1E2, 20D2, 3G2 und 3H1 produziert wurden, spezifisch mit GRP (70-90), während der monoklonale Antikörper, der von dem Hybridom 3D6 produziert wurde, mit GRP (44-62) reagiert, und der monoklonale Antikörper, der von dem Hybridom 4C9 produziert wurde, mit GRP (31-52) reagiert.
Andererseits wurde durch eine Analyse von Peptiden in einer Serum-Probe und einer Urin-Probe gefunden, dass die Serum-Probe Peptide mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 12.000 enthält, während die Urin-Probe kürzere Peptide mit einem Molekulargewicht von 2.500 bis 7.000, die hauptsächlich GRP (70-90) aufweisen, enthält. Daher ist man der Ansicht, dass der Vorläufer von menschlichem Gastrin freisetzendem Peptid im Blut während des Kreis laufs abgebaut wird, wobei ein kurzes Fragment GRP (70-90) stabil beibehalten wird, und das Fragment in den Urin ausgeschieden wird.
Zusätzlich wurde bestätigt, dass Fragmente des Vorläufers von menschlichem Gastrin freisetzenden Peptid in einer Urin-Probe durch Verwendung eines Immuntests wie ELISA nachgewiesen und analysiert werden können, wobei monoklonale Antikörper, die mit Fragmenten des Vorläufers von menschlichem Gastrin freisetzendem Peptid reaktiv sind, verwendet werden, indem man sie sowohl als einen ersten Antikörper als auch als einen zweiten Antikörper verwendet, während das Fragment in Urin durch einen Immuntest, der eine Kombination von einem monoklonalem Antikörper und einem polyklonalem Antikörper gegen die Fragmente des Vorläufers von menschlichem Gastrin freisetzendem Peptid verwendet, nicht nachgewiesen werden kann.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von kleinzelligem Lungenkrebs durch Nachweisen eines Fragments des Vorläufers von menschlichem Gastrin freisetzendem Peptid durch einen Immuntest bereit, das durch Verwendung monoklonaler Antikörper gegen den Vorläufer des menschlichen Gastrin freisetzenden Peptids sowohl als ein erster Antikörper als auch als ein zweiter Antikörper gekennzeichnet ist.
Der Immuntest kann ELISA, EIA, FIA, RIA, Agglutinationsverfahren, Immunfärbungstest sein, und ist bevorzugt ELISA. In dem Immuntest kann ein monoklonaler Antikörper als ein erster Antikörper und ein monoklonaler Antikörper als ein zweiter Antikörper verwendet werden. Zusätzlich kann als der erste Antikörper oder der zweite Antikörper ein Gemisch von mehr als einem unterschiedlichem monoklonalen Antikörper verwendet werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, ist aber in keiner Weise darauf beschränkt.
Beispiel 1. Herstellung von GRP (31-98)
(1) Konstruktion des Klonierungsvektors
Wie in 1 gezeigt, ist das GRP-Gen in DNA-Fragmente von etwa 60 Basen unterteilt, und jedes DNA-Fragment wurde durch das Phosphoramidit-Verfahren synthetisiert. Tabelle 1

Fragment SEQ ID NO Fragment SEQ ID NO

H1 2 L1 6

H2 3 L2 7

H3 4 L3 8

H4 5 L4 9
Die synthetisierten DNA-Fragmente wurden durch Flüssigkeits-Chromatografie mit umgekehrten Phasen gereinigt und durch T4 DNA-Ligase ligiert, um das GRP-Gen zu erhalten.
Das so erhaltene Gen mit einer Restriktionsenzym-EcoRI-Stelle und einer SalI-Stelle am 5'- bzw. am 3'-Ende wurde in einen EcoRI/SalI-verdauten Klonierungsvektor pUC9 eingesetzt. Das Ligationsprodukt wurde verwendet, um E. coli JM107 zu transformieren, das dann über Nacht in L-Medium in Anwesenheit von 40 μg/ml Ampicillin, Isopropyl-thiogalactosid (IPTG) und X-Gal kultiviert wurde, um einen Kandidatenstamm zu erhalten.
Das Plasmid wurde aus dem Kandidatenstamm extrahiert, und die Nucleotidsequenz des eingesetzten Gens wurde nach dem Sanger-Verfahren getestet, um zu bestätigen, dass das eingesetzte Gen die erwartete Nucleotidsequenz hatte.
E. coli, das einen Klonierungsvektor enthielt, der ein gewünschtes GRP-Gen aufwies, wurde als pUC-GRP (31-98)/JM107 bezeichnet, und der Klonierungsvektor wurde als pUC-GRP (31-98) bezeichnet.
(2) Konstruktion des Expressionsvektors (2)
Der Vektor pUC-GRP (31-98) wurde mit EcoRI und SalI verdaut, und ein GRP-Genfragment von etwa 220 Basenpaaren wurde extrahiert. Andererseits wurde ein Expressionsvektor pAT-TrpE-TGF-α mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SalI verdaut, um ein größeres Fragment zu erhalten, das dann unter Verwendung von DNA-Ligase T4 mit dem GPR-Genfragment ligiert wurde. Das Ligationsprodukt wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, das dann über Nacht in L-Medium in Anwesenheit von 40 μg/ml Ampicillin kultiviert wurde, um einen Kandidatenstamm zu erhalten. Der Kandidatenstamm wurde als pAT-TrpE-GRP (31-98)/HB101 bezeichnet, und der so erhaltene Expressionsvektor wurde als pAT-TrpE-GRP (31-98) bezeichnet.
(3) Reinigung des exprimierten Polypeptids
Der oben konstruierte Stamm, der den Expressionsvektor enthielt, pAT-TrpE-GRP (31-98)/HB101, wurde kultiviert, und die Expression von rekombinantem Protein wurde getestet. Der Stamm pAT-TrpE-GRP (31-98)/HB101 wurde nämlich über Nacht in 32 ml LB-Medium, das 40 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert, und die sich ergebende Kultur wurde in 3,2 L M9-Medium, das 0,5% Casaminosäure enthielt, eingeimpft, und das Kultivieren wurde bei 37°C durchgeführt. Als die Extinktion bei 600 nm 0,4 erreichte, wurde Indolacrylsäure (IAA-indolacrylic acid) zu der Kultur bis zu einer Endkonzentration von 30 μg/ml zugegeben, und das Kultivieren wurde weitere 20 Stunden lang fortgesetzt. Die Kultur wurde zentrifugiert, um 10 g Zellen zu sammeln. Die gesammelten Zellen wurden in einem 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)-Puffer, der 2 mg/ml Lysozym und 2 mM EDTA enthielt, suspendiert, und die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 0°C stehen gelassen. Die Suspension wurde außerdem ultraschallbehandelt und zentrifugiert, um eine unlösliche Fraktion als einen Bodenkörper zu erhalten.
Die so erhaltene unlösliche Fraktion wurde durch die Zugabe von 8M Harnstoff solubilisiert und zentrifugiert, um einen Überstand zu sammeln. Der Überstand wurde der Säulenchromatografie unter Verwendung von DEAE Toyopeal (TOSO Co.) (Eluat: A = 20 mM Tris-HCl/6M Harnstoff (pH 8,0); B = 0,5M NaCl/Eluat A (pH 8,0); Konzentrationsgradient: von A zu B mit linearem Gradienten/300 Minuten; Säulendurchmesser 1,6 × 40 cm; Strömungsgeschwindigkeit 1 ml/min) unterzogen, um das gewünschte Protein zu isolieren und zu reinigen. Die eluierten Fraktionen wurden gesammelt, dialysiert und gefriergetrocknet. Das Protein wurde mit Bromcyan gespalten, um die TrpE-Baueinheit zu entfernen. Die Bromcyan-Spaltung wurde durchgeführt, indem das Protein zu einer 70%igen Ameisensäure-Lösung bis zu einer Protein-Konzentration von 1% zugegeben wurde, 100 Äquivalente Bromcyan zugegeben wurden, und das sich ergebende Reaktionsgemisch 24 Stunden lang bei 37°C stehen gelassen wurde. Das Gemisch wurde dialysiert, gefriergetrocknet und einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie mit umgekehrten Phasen (Eluat: = 0,1% Trifluoressigsäure/Wasser, B = 60% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure/Wasser) unterzogen, um 30 mg GRP-Protein zu reinigen und zu erhalten. Die Reinheit des Proteins war homogen, wie durch Säulenchromatografie mit umgekehrten Phasen und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass das Protein die Aminosäure-Sequenz von GRP hatte, wie durch einen Peptid-Sequenzanalysator bestimmt wurde.
Beispiel 2. Herstellung von polyklonalem Antikörper
Das so hergestellte Produkt GRP (31-98) wurde mit KLH als ein Trägerprotein konjugiert, und 150 μg des Konjugats wurden zuerst einem NZW-Kaninchen injiziert, und es wurden weitere Injektionen von 100 μg nach zwei Wochen, 100 μg nach zwei Wochen, 85 μg nach 6 Tagen, 80 μg nach 12 Tagen und 60 μg nach 12 Tagen gemacht. Nachdem eine Erhöhung des Antikörper-Titers bestätigt wurde, wurde das Vollblut erhalten.
Beispiel 3. Herstellung von monoklonalem Antikörper
GRP (31-98) wurde mit KLH als Trägerprotein konjugiert, und das Konjugat wurde zuerst einer Balb/c-Maus injiziert, und es wurden weitere Injektionen von 50 μg nach 3 Wochen, 50 μg nach 3 Wochen, 50 μg nach 4 Wochen und 30 μg nach 4 Wochen gemacht.
Milz-Zellen (1 × 10⁸ Zellen/ml) von der immunisierten Maus wurden mit vorher kultivierten Myelomzellen P3U1 (1 × 10⁷ Zellen/ml) mit einem Zellmengen-Mischungsverhältnis von 10:1 gemischt, und das Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
Als nächstes wurden zu dem Gemisch 50% Polyethylenglycol 1500, gefolgt von RPMI 1640-Medium, zugegeben. Nach einem Zentrifugieren wurde HAT-Medium, das 20% FCS enthielt, dazu zugegeben, und nach dem Einstellen der Zell-Konzentration auf 10⁵ Zellen/ml wurde die Zellsuspension auf Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 100 μl/Vertiefung verteilt. Als nächstes wurde 10 bis 14 Tage lang ein Kultivieren bei 37°C ausgeführt.
Zu einer mit 100 ng/ml GRP (31-98) beschichteten ELISA-Platte wurden 100 μl des oben erhaltenen Kultur-Überstands zugegeben und 2 Stunden lang reagieren lassen. Nach Reaktion mit Peroxidase-markiertem Anti-Maus-Immunoglobulin G-Antikörper für 1,5 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit einer 33', 55'-Tetramethylbenzidin (TMBZ)-Lösung entwickelt. Die Extinktion bei 450 nm wurde gemessen, und Klone, die eine Extinktion von mindestens 0,3 lieferten, wurden als positiv, um Hybridom, das einen gewünschten monoklonalen Antikörper produziert, zu erhalten, betrachtet. Die Hybridomzellen wurden Mäusen, die mit Pristan behandelt worden waren, intraperitoneal eingeimpft, und der im Aszites produzierte monoklonale Antikörper wurde gewonnen. Alternativ wurden die Hybridomzellen in vitro in einem Medium kultiviert, und der monoklonale Antikörper wurde aus dem Kultur-Überstand erhalten.
Der monoklonale Antikörper wurde nach einem konventionellen Verfahren durch Ammoniumsulfat-Ausfällung, Dialyse mit einem Phosphat-Puffer und Reinigung durch eine Protein A-gekoppelte Sepharase-säule gereinigt, um eine IgG-Fraktion zu erhalten.
Die Affinität des so hergestellten monoklonalen Antikörpers zu dem GRP (31-98)-Antigen wurde wie folgt bestimmt. Das GRP (31-98)-Antigen wurde bis zur Sättigung an einer Mikrotiterplatte immobilisiert, und zu der Platte wurden 20 μl einer Lösung, die 0 bis 0,3 pg/ml monoklonalen Antikörper zu dem GRP (31-98), hergestellt durch Verdünnen des monoklonalen Antikörpers auf (10 μg/ml), enthielt, zugegeben und reagieren lassen. Der an das immobilisierte GRP (31-98) gebundene Antikörper wurde unter Verwendung eines Enzym-markierten Anti-Maus-IgG gemessen.
Die Menge des gebundenen Antikörpers [B] wurde aus der Beziehung zwischen den Werten der gemessenen Extinktion und den Mengen des zugegebenen Antikörpers erhalten, und die Menge an freiem Antikörper (F) wurde durch Subtrahieren einer Menge des gebundenen Antikörpers von einer Menge des zugegebenen Antikörpers erhalten. Die Menge des gebundenen Antikörpers [B] wurde unter der Annahme eines Molekulargewichts des Antikörpers von 150.000 Dalton in eine molare Konzentration umgerechnet, und gegen die erhaltenen molekularen Konzentrationen wurden die B/F-Werte als Scatchard-Diagramm aufgetragen. Aus der Steigung der Scatchard-Auftragung wurde eine Assoziationskonstante Ka = 3 × 10⁸ ~ 2 × 10¹⁰/M erhalten.
Beispiel 4. Vergleich der Stabilität von GRPs im Blut (3)
Die Stabilitäten von GRP (1-27) und GRP (31-98) im Blut wurden unter Verwendung von Antikörpern gegen das oben hergestellte GRP (31-98) und Antikörpern gegen das konventionelle GRP (1-27) verglichen.
Eine kleine Menge an GRP (1-27) oder GRP (31-98) wurde zu Serum, Plasma oder Aprotinin enthaltendem Plasma zugegeben, und die Restkonzentration von GRP (1-27) und GRP (31-98) wurde bei 0,1 und 6 Stunden nach der Zugabe bestimmt, und die Prozentsätze der Restkonzentration wurden erhalten, wobei die Konzentration des Ausgangspunkts (0 Stunden) als 100% genommen wurde. Wie aus 3 ersichtlich, war das Peptid GRP (31-98) in dem Serum oder Plasma für eine lange Zeit stabil, obwohl das aktive Peptid GRP (1-27) in Anwesenheit von Serum oder Plasma abgebaut wurde und verschwand.
Beispiel 5. Herstellung von monoklonalem Antikörper
Das GRP (31-98), das wie oben beschrieben hergestellt worden war, wurde an ein Trägerprotein, Thyreoglobulin, konjugiert, das Konjugat wurde in einem Phosphat-Puffer (pH 7,4) (PBS(–)) bis zu einer Konzentration von 1,0 mg/ml gelöst, und die Lösung wurde mit einem gleichen Volumen an Freund'schem vollständigem Adjuvans gemischt, um eine Suspension zu bilden. Eine Menge der so hergestellten Suspension, die 0,01–0,05 mg GRP (31-98) enthielt, wurde einer 4 bis 6 Wochen alten BALB/C-Maus intraperitoneal verabreicht. Nach etwa 12 Wochen wurde dem immunisierten Tier dieselbe Konzentration an GRP (31-98)-Lösung in PBS (–1), die etwa 0,01 bis 0,03 mg GRP (31-98) enthielt, durch eine Schwanzvene verabreicht. 3 Tage nach der Verabreichung wurde die Milz aseptisch aus dem immunisierten Tier entfernt.
Als nächstes wurde die Milz durch ein Gitter in einzelne Zellen zerrissen, und die Zellen wurden dreimal mit RPMI-1640-Medium gewaschen. Maus-Myelomzellen p3 × 63 Ag 8 (Nature, 256, 495–497, 1975) in der logarithmischen Wachstumsphase wurden für wenige Tage in Anwesenheit von 8-Azaguanin kultiviert, um Rückmutanten vollständig zu entfernen, und wie oben beschrieben gewaschen. 1,1 × 10 Zellen der Maus-Myelomzelllinie und 1,4 × 10⁸ Milzzellen, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, wurden gemischt. Nach Zentrifugieren bei 200 × g für 5 Minuten wurde der Überstand zur Zellverschmelzung durch 1 ml auf 37°C aufgewärmtes RPMI-1640-Medium, das 50% PEG 4000 (Merck) enthielt, ersetzt.
Die der Zellverschmelzung unterzogenen Zellen wurden zur Entfernung von PEG zentrifugiert und 1 bis 2 Wochen lang in RPMI-1640-Medium, das Hypoxanthin, Aminopurin und Thymidin (hierin im folgenden als HAT abgekürzt) sowie 15% fetales Kälberserum (FCS) enthielt, kultiviert, um ausschließlich dem Hybridom ein Wachstum zu erlauben. Als nächstes wurden die Hybridom-Zellen etwa 2 Wochen lang in einem HAT-freien Medium wachsen lassen, und durch ELISA wurden Klone wie unten beschrieben ausgelesen, um ein Hybridom zu erhalten, das einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, der eine gewünschte Reaktionsspezifität zeigt, produziert.
Der ELISA wurde wie folgt ausgeführt. GRP (31-98) wurde in Phosphat-Puffer (pH 7,4) (PBS) in einer Konzentration von 1 μg/ml gelöst, und 50 μl der Lösung wurden auf jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt, und die Platte wurde zur Adsorption bei 4°C über Nacht oder bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Nach der Adsorption wurden die Vertiefungen dreimal mit 0,05% Tween-20 enthaltendem PBS (–) (abgekürzt als T-PBS) gewaschen, und es wurden 200 μl/Vertiefung von 1% BSA-enthaltendem PBS (–) verteilt, und die Platte wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert. Das 1% BSA enthaltende PBS (–) wurde entfernt, und es wurden 50 μl/Vertiefung Hybridom-Kulturüberstand, roher monoklonaler Antikörper oder gereinigter monokonaler Antikörper zugegeben, gefolgt von Reaktion bei Raumtemperatur für eine Stunde. Nach der Reaktion wurden die Vertiefungen dreimal mit T-PBS gewaschen, und es wurden 50 μl/Vertiefung eines Ezym-markierten Maus-IgG+M-Antikörpers (Jackson), der 5000-fach mit PBS(–), enthaltend 1% BSA, 1% Polyvinylpyrrolidon und 0,05% Tween-20, verdünnt war, zugegeben, und bei Raumtemperatur wurde 30 Minuten lang eine Reaktion durchgeführt. Antikörper, der nicht reagiert hatte, wurde durch 4 Wäschen mit T-PBS beseitigt, und 50 μl/Vertiefung Orthophenylendiamin (OPD)-Lösung (Wako Pure Chemicals) wurden zur Reaktion zugegeben. Nach 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit 2N Schwefelsäure beendet, und die Extinktion bei 492 nm wurde gemessen.
Die so erhaltenen Hybridome wurden bezeichnet als proGRP-1E2, proGRP-2B10, proGRP-20D2, pro-GRP-3H1, pro-GRP-3D6, proGRP-3G2 und proGRP-4C9, und unter ihnen wurden die Hybridome proGRP-2B10 und proGPP-3G2 bei dem Fermentations-Forschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie (FRI – Formentation Research Institute) am 9. Dezember 1992 nach dem Budapester Vertrag als FERM BP-4110 bzw. FERR BP-4109 hinterlegt. Darüber hinaus wurde das Hybridom proGRP-20D2 als "monoklonalen AntiproGRP-Antikörper produzierendes Hybridom (20D2) bezeichnet und am 10 Februar 1993 als FERM BP-4184 nach dem Budapester Vertrag beim FRI hinterlegt.
Nach einer doppelten Immundiffusion unter Verwendung von Antikörpern vom Kaninchen-Anti-Maus Ig-Isotyp (Zymed) wurden die Isotypen der von dem oben angegebenen Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper wie folgt bestimmt. Die monoklonalen Antikörper GRP-1E2, GRP-2B10 und GRP-3G2, die von den Hybridomen proGRP-1E2, proGRP-2B10 bzw. proGRP-3G2 produziert wurden, waren IgG1; die monoklonalen Antikörper GRP-20D2 und GRP-3D6, die von den Hybridomen proGRP-20D2 und proGRP-3D6 produziert wurden, waren IgG2; und der monoklonale Antikörper GRP-3H1, der von dem Hybridom proGRP-3H1 produziert wurde, war IgM.
Man beachte, dass "proGRP" GRP-Vorläufer bedeutet.
Beispiel 6. ELISA unter Verwendung monoklonaler Antikörper
Die Hybridome proGRP-2B10, proGRP-1E2, proGRP-20D2, proGRP-3D6, pro-GRP-3H1 und proGRP-4C9 wurden intraperitoneal in Mäuse eingeimpft, und aus den Aszites wurden die entsprechenden monoklonalen Antikörper GRP-2B10, GRP-1E2, GRP-20D2, GRP-3D6, GRP-3H1 und GRP-4C9 mit mindestens 90%iger Reinheit erhalten, wobei eine Protein-A-Säule, eine Gelfiltrations-Säule oder eine Protein-G-Säule verwendet wurde.
ELISA wurde wie folgt durchgeführt. GRP (31-98) wurde in einem Phosphat-Puffer (pH 7,3) (PBS) in einer Konzentration von 1 μg/ml gelöst, und 50 μl der Lösung wurden auf jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen verteilt, und die Platte wurde zur Adsorption bei 4°C über Nacht oder bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Nach der Adsorption wurden die Vertiefungen dreimal mit 0,05% Tween-20 enthaltendem PBS (–) (abgekürzt als T-PBS) gewaschen, und es wurden 200 μl/Vertiefung von 1% BSA enthaltendem PBS (–) verteilt, und die Platte wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert. Das 1% BSA enthaltende PBS (–) wurde entfernt, und es wurden 50 μl/Vertiefung Hybridom-Kulturüberstand, roher monoklonaler Antikörper oder gereinigter monoklonaler Antikörper zugegeben, gefolgt von einer Reaktion bei Raumtemperatur für eine Stunde. Nach der Reaktion wurden die Vertiefungen dreimal mit T-PBS gewaschen, und es wurden 50 μl/Vertiefung eines Enzymmarkierten Maus-IgG+M-Antikörpers (Jackson), der 5000-fach mit PBS (–), enthaltend 1% BSA, 1% Polyvinylpyrrolidon und 0,05% Tween-20, verdünnt war, zugegeben, und es wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur eine Reaktion durchgeführt. Antikörper, der nicht reagiert hatte, wurde durch vier Wäschen mit T-PBS beseitigt, und es wurden 50 μl/Vertiefung Orthophenylendiamin (OPD)-Lösung (Wako Pure Chemicals) zur Reaktion zugegeben. Nach 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit 2N Schwefelsäure beendet, und es wurde die Extinktion bei 492 nm gemessen. Das Ergebnis ist in 4 gezeigt. Wie aus 4 ersichtlich ist, ist der monoklonale Antikörper, der mit proGRP (GRP-Vorläufer) am reaktivsten ist, GRP-3G2, gefolgt von GRP-2B10, GRP-1E2, GRP-20D2, GRP-3H1 und GRP-4C9, in dieser Reihenfolge.
Beispiel 7. Produktion von polyklonalem Antikörper
Das Polypeptid GRP (31-98), das wie oben beschrieben hergestellt worden war, wurde an ein Trägerprotein, Thyreoglobulin, konjugiert, das Konjugat wurde in einem Phosphat-Puffer (pH 7,4) (PBS (–)) in einer Konzentration von 1,0 mg/ml gelöst, und die Lösung wurde mit einem gleichen Volumen an Freund'schem vollständigem Adjuvans gemischt, um eine Suspension zu bilden. Eine Menge der so erhaltenen Suspension, die 0,1 mg GRP (31-98) enthielt, wurde 8 Wochen alten Kaninchen KbI:JW von 1,5–2,0 kg Gewicht subkutan verabreicht, gefolgt von 6 wiederholten Verabreichungen von 0,07 mg GRP (31-98) in zehn Tage-Intervallen. Das Blut von Kaninchen, das einen hohen Titer lieferte, wurde erhalten, um einen polyklonalen Antikörper herzustellen.
Beispiel 8. Identifizieren der Antigenizität in Serum und Urin
Zur Identifizierung des Immunität erzeugenden Fragments von proGRP in Serum-Proben und Harnstoff-Proben wurde das folgende Experiment durchgeführt. Verschiedene Peptide, d. h. GRP (31-98) (SEQ ID NO: 1), GRP (31-52) (SEQ ID NO: 10), GRP (44-62) (SEQ ID NO: 11), und GRP (70-90) (SEQ ID NO: 12), wurden kovalent an Vertiefungen einer Mikroplatte immobilisiert, und zu den Vertiefungen wurden von neun Serum-Proben, einer Urin-Probe und Eichpeptid (GRP (31-98))-Lösungen jeweils 50 μl zugegeben. Unmittelbar nach der Zugabe der Probe oder der Eichsubstanz wurden zu jeder Vertiefung 150 μl Anti-GRP (31-98)-Antiserum, verdünnt mit einem Reaktionspuffer (1% BSA, 0,05% Tween 20, 0,15 M NaCl, 0,1 M Phosphat pH 7,0) zugegeben, und die Platte wurde bei 4°C über Nacht inkubiert. Während dieser Inkubation konkurrieren das auf der Platte immobilisierte Peptid und das in der Probe oder der Eichsubstanz enthaltene Peptid gegen das Anti-GRP (31-98)-Antiserum, und als ein Ergebnis reagiert das Antiserum, wenn das in der Probe enthaltene Peptid antigen ist, bevorzugt mit dem Peptid in der Probe, aber nicht mit dem auf der Platte immobilisierten Peptid, und daher ist die Menge des Antiserums, das an das an der Platte immobilisierte Peptid bindet, klein.
Als nächstes wurde die Platte fünfmal mit einer Waschlösung gewaschen, ein Peroxidase-markiertes Anti-Kaninchen-IgG wurde zu jeder Vertiefung zugegeben, und eine Inkubation wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem die Platte fünfmal mit einer Waschlösung gewaschen worden war, wurde ein Orthophenylendiamin-Substrat zu jeder Vertiefung zugegeben, eine Inkubation wurde eine Stunde lang durchgeführt, und die Reaktion wurde durch Zugabe von Schwefelsäure beendet.
Die Extinktion bei 492 nm wurde gemessen, und eine Eichkurve für jedes Peptid wurde angefertigt. Danach wurde die Pro-GRP-Antigenizitätsaktivität in jeder Probe unter Verwendung der Eichkurve bestimmt.

Eine Eichkurve für jedes Peptid ist in den 5 bis 8 gezeigt. Die Ergebnisse der Messung der Proben sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Antigenizität eines ProGRP-Fragments in Serum oder Urin

Probe Nr.	31-98 ng/ml	31-52 ng/ml % von (31-98)		44-62 ng/ml % von (31-98)		70-90 ng/ml % von (31-98)
Serum 1	5,4	8,4	155,6	3,6	66,7	13,5	250,0
Serum 2	47,0	36,0	76,6	40,0	85,1	47,5	101,0
Serum 3	10,0	17,5	175,0	5,8	58,0	21,8	218,0
Serum 4	11,4	14,0	122,8	8,6	75,4	19,5	171,1
Serum 5	23,5	22,0	93,6	24,5	104,3	44,0	187,2
Serum 6	138,0	54,0	39,1	90,0	65,2	108,0	78,3
Serum 7	295,0	30,0	10,2	140,0	47,5	198,0	67,1
Serum 8	225,0	22,5	10,0	230,0	102,2	265,0	117,8
Serum 9	12,0	28,0	233,3	12,0	100,0	5,7	47,5
Mittel			101,8		78,3		137,6
Urin 1	75,0	3,8	5,1	1,8	2,4	140,0	186,7
Gesamtmittel			93,0		71,4		142,0

Für Serum 2 ist die Antigenizität der drei Peptide nahezu gleich und nicht wesentlich verschieden von derjenigen von GRP (31-98). Für die Seren 4 und 5 war die Antigenizität von GRP (31-52) und GRP (44-62) nahezu die gleiche wie diejenige von GRP (31-98), während die Antigenizität von GRP (70-90) das zweifache derjenigen von GRP (31-98) beträgt. Für die Seren 6, 7 und 8 ist die Antigenizität von GRP (31-52) niedrig, die Antigenizität von GRP (44-62) und GRP (70-90) werden relativ beibehalten. Für Serum 9 wird die Antigenizität von GRP (70-90) im Vergleich mit derjenigen von GRP (31-62) beibehalten, und beträgt etwa 138% von GRP (31-98).
Für die Urin-Probe ist die Antigenizität von GRP (70-90) sehr hoch, während die Antigenizität von GRP (31-52) und GRP (44-62) fehlt. Insbesondere für die Seren 7 und 8 und den Urin beträgt die Antigenizität von GRP (31-52) etwa 10% oder weniger derjenigen von GRP (31-98), was deutlich macht, dass ein Antikörper gegen einen anderen Bereich als 31-52 von ProGRP zum Nachweis von Pro-GRP-Immunaktivität bevorzugt ist.
Aufgrund der oben angegebenen Ergebnisse ist man der Meinung, dass Pro-GRP nach dem Sezernieren ins Blut während des Kreislaufs abgebaut und mo difiziert wird, und dass ein Bereich, der den Bereich 70-90 enthält, verglichen mit anderen Peptiden stabil beibehalten wird und von der Niere ausgeschieden wird, während die N-terminale Seite von ProGRP abgebaut und nicht von der Niere ausgeschieden wird. Dementsprechend wurde gefunden, dass zur Untersuchung von ProGRP-Fragmenten in einer Serum- oder Urin-Probe ein Antikörper oder ein Rezeptor, der in der Lage ist, an den Bereich 63-98 von ProGRP, der den Bereich 70-90 enthält, zu binden, wichtig ist.
Beispiel 9. Analyse des Epitops von monoklonalen Antikörpern
Verschiedene Peptide, d. h. GRP (31-52), GRP (44-62), GRP (70-90) und GRP (31-98), wurden an Vertiefungen einer Mikrotiterplate immobilisiert. Für eine Kontrolle wurde kein Peptid immobilisiert. Zu der Platte wurden verschiedene Mengen verschiedener monoklonaler Antikörper, die getestet werden sollten, zugegeben, um die Reaktion jedes der Peptide und jedes der monoklonalen Antikörper zu erlauben. Nach dem Waschen der Platte wurde ein Peroxidasekonjugiertes Anti-Maus-Ig(G + M) zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platte wurde inkubiert. Nach dem Waschen wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur eine enzymatische Reaktion zugelassen, wobei Orthophenylendiamin als ein Substrat verwendet wurde, und die Reaktion wurde durch Zugabe von Schwefelsäure beendet. Unmittelbar nach der Zugabe von Schwefelsäure wurde die Extinktion bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3A gezeigt. Wenn monoklonaler Antikörper mit einem Peptid reagiert, ergibt sich ein höheres Signal, während sich, wenn der monoklonale Antikörper nicht mit einem Peptid reagiert, ein niedrigeres Signal ergibt. Wie man aus Tabelle 3A sehen kann, erkennen die monoklonalen Antikörper 2B10, 1E2, 20D2, 3G2 und 3H1 das Peptid GRP (70-90); erkennt der monoklonale Antikörper 3D6 das Peptid GRP (44-62); und erkennt der monoklonale Antikörper 4C9 das Peptid GRP (31-52).
Zur Bestätigung des oben angegebenen Ergebnisses wurde der folgende Peptid-Hemmtest durchgeführt. Es wurden nämlich unterschiedliche Mengen verschiedener monoklonaler Antikörper, die getestet werden sollten, und 5 μg/ml der verschiedenen Peptide vereinigt und bei Raumtemperatur zwei Stunden lang inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Mikrotiterplatte, an der das Peptid GRP (31-98) immobilisiert worden war, zugegeben, und die Mikrotiterplatte wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert, um eine kompetitive Reaktion des monoklonalen Antikörpers mit dem Peptid in der Lösung und dem an der Platte immobiliserten Peptid GRP (31-98) zu erlauben. Nach dem Waschen der Platte wurde Peroxidase-konjugiertes Anti-Maus-Ig(G + M) darauf gegeben, und die Platte wurde inkubiert, um eine Reaktion des markierten Ig(G + M) mit dem monoklonalen Antikörper, der an das immobilisierte Peptid GRP (31-98) gebunden hatte, zu erlauben.
Nach dem Waschen der Platte wurde Orthophenylendiamin als ein Substrat zu der Platte zugegeben, und es wurde eine enzymatische Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt und durch Zugabe von Schwefelsäure beendet. Unmittelbar nach der Beendigung der Reaktion wurde die Extinktion bei 492 nm gemessen. Für jeden monoklonalen Antikörper wurde ein Ergebnis, das von Vertiefungen erhalten wurde, an denen kein Peptid immobilisiert worden war, als eine Kontrolle hergenommen. Wenn ein monoklonaler Antikörper mit einem Peptid in der Lösung reagiert, ergibt sich ein niedrigeres Signal; während, wenn ein monoklonaler Antikörper nicht mit einem Peptid in der Lösung reagiert, der monoklonale Antikörper mit dem immobilisierten Peptid GRP (31-98) reagiert, was zu einem höheren Signal führt.

Wie man aus Tabelle 4B sehen kann, wurde die Reaktion der monoklonalen Antikörper 2B10, 1E2, 20D2, 3G2 und 3H1 mit dem immobilisierten Peptid GRP (31-98) mit dem Peptid GRP (70-90) gehemmt, was deutlich macht, dass diese monoklonalen Antikörper ein in dem GRP (70-90) vorliegendes Epitop erkennen. Die Reaktion des monoklonalen Antikörpers 4C9 mit dem immobilisierten Peptid GRP (31-98) wurde nur durch das Peptid GRP (31-52) signifikant gehemmt, aber nicht durch das Peptid GRP (44-62), was eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass der monoklonale Antikörper 4C9 eine N-terminale Stelle des Peptids GRP (31-52) erkennt, verdeutlicht. Tabelle 3 Identifizierung des Epitops für monoklonale Antikörper

A. Peptid-Direkttest
Peptide	Monoklonale Antikörper
Peptide	2B10	3G2	1E2	3H1	3D6	20D2	4C9
GRP (31-52)	0,002	0,001	0,017	0,019	0,002	0,000	0,161
GRP (44-62)	0,004	0,001	0,015	0,032	0,168	0,000	0,004
GRP (70-90)	1,059	0,741	0,803	1,086	0,003	1,202	0,004
GRP (31-98)	1,058	2,075	2,726	0,949	0,085	1,042	1,409
Keines	0,000	0,002	0,006	0,000	0,003	0,000	0,003
B. Peptid-Kompetetivtest (% der Kontrolle)
Vergleichs-Peptide		Monoklonale Antikörper
Vergleichs-Peptide		2B10	3G2	1E2	3H1	20D2	4C9
GRP (31-52)		102,1	112,2	82,8	81,5	111,0	1,8
GRP (44-62)		104,6	102,6	105,0	106,7	99,3	100,3
GRP (70-90)		0,9	0,3	1,5	3,3	18,8	106,9
GRP (31-98)		19,5	10,1	11,8	12,0	28,2	76,0

Durch Tabelle 3 wurde bestätigt, dass die monoklonalen Antikörper 2B10, 1E2, 20D2, 3G2 und 3H1 ein Epitop in dem Peptid GRP (70-90) erkennen.
Beispiel 10. Nachweis (1) von ProGRP in einer Urin- oder Serum-Probe
Ein Gemisch der monoklonalen Antikörper 2B10 und 3G2 wur an jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte adorbiert, und nach Zugabe von 100 μl/Vertiefung eines Reaktionspuffers (1% BSA, 0,05% Tween 20, 0,5 M NaCl, 0,1 M Phosphat pH 7,0) wurden jeweils 50 μl der Serum-Probe oder einer Eichlösung, die eine bekannte Konzentration des Peptids GRP (31-98) enthielt, zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde bei 37°C 60 Minuten lang inkubiert. Jede Vertie fung wurde fünfmal mit etwa 350 μl einer Waschlösung (0,01 M Phosphat, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,3) gewaschen. Dann wurden zu jeder Vertiefung 100 μl einer Lösung eines Peroxidase-markierten anti-ProGRP-KaninchenlgG zugegeben, und die Platte wurde bei Raumtemperatur (20–30°C) 30 Minuten lang inkubiert. Jede Vertiefung wurde fünfmal mit etwa 350 μl einer Waschlösung gewaschen, und es wurden 100 μl einer Substratlösung von Orthophenylendiamin zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunklen stehen gelassen, und es wurden 100 μl eines Reaktionsbeendigungsreagens zugegeben.

Unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts wurde die Extinktion bei 492 nm, oder im Fall von zwei Wellenlängen, bei 492 nm und 600–700 nm (als Referenz), gemessen, wobei eine Leervertiefung als eine Kontrolle hergenommen wurde. Eine Eichkurve, die von den Eichsubstanzen erhalten wurde, ist in 9 gezeigt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

	Anzahl von Proben (n)	Anzahl an positiven Proben	Anteil an positiven Proben (%)	Konzentration des Peptids (ng/L) Mittel ± SD
Seren von gesundem Individuum	247	1	0,4	12,6 ± 6,9
Seren von Patienten mit gutartigen Lungenerkrankungen	20	0	0,0	15,2 ± 6,7
Seren von Patienten mit Lungenkrebs nicht-SCLC	20	1	5,0	16,6 ± 12,0
SCLC lokalisierte Erkrankungen	12	8	66,7	861,9 ± 1203,3
ausgedehnte Erkrankungen	13	10	76,9	1645,0 ± 1490,6

SD = Standardabweichung
SCLC = kleinzelliger Lungenkrebs

Die von denselben Individuen oder Patienten erhaltenen Harnstoff-Proben wurden durch das oben angegebene Verfahren analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

Harnstoff-Probe von ProGRP (pg/ml)

Gesundem Individuum 1 < 3

2 < 3

3 < 3

Patienten mit kleinzelligem Lungenkrebs 1 < 3

2 < 3

3 < 3

4 88,8
Wie man aus den Tabellen 4 und 5 sehen kann, ergaben, wenn verschiedene Serum-Proben und Harnstoff-Proben gemessen wurden, in dem Fall, in dem zwei monoklonale Antikörper als ein erster Antikörper verwendet wurden, und ein polyklonaler Antikörper als ein zweiter Antikörper verwendet wurde, Serum-Proben von Patienten mit kleinzelligem Lungenkrebs höhere Werte, und Serum-Proben von gesunden Individuen ergaben niedrigere Werte. Andererseits konnte bei demselben Testverfahren eine Harstoff-Probe nicht gemessen werden.
Beispiel 11: Nachweis (2) von ProGRP in Urin- oder Serum-Probe
Monoklonaler Antikörper 3G2 wurde an Vertiefungen einer Mikrotiterplatte absorbiert, und nach Zugabe von 100 μl/Vertiefung eines Raktionsmediums (1% BSA, 0,05% Tween 20, 0,15 M NaCl, 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0), wurden jeweils 100 μl einer Harnstoff-Probe oder einer Eichlösung, die eine bekannte Konzentration des Peptids GRP (31-98) enthielt, zu jeder Vertiefung zugegeben.
Eine Inkubation wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt.

Jede Vertiefung wurde fünfmal mit etwa 350 μl einer Waschlösung (0,01 M Phosphat, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,3) gewaschen. 200 μl einer Lö sung von Peroxidase-markiertem monoklonalem Antikörper 2B10 wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur (20°C bis 30°C) 60 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Jede Vertiefung wurde fünfmal mit etwa 350 μl einer Waschlösung gewaschen. 200 μl einer Substratlösung von Orthophenylendiamin wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, und nachdem sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen gelassen worden war, wurden 50 μl eines Reaktionsbeendigungsreagens (2N Schwefelsäure) zu jeder Vertiefung zugegeben. Unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts wurde die Extinktion bei 492 nm, oder im Falle von zwei Wellenlängen, bei 492 nm und 600 bis 700 nm (als Referenz), gemessen, wobei eine Leervertiefung als eine Kontrolle hergenommen wurde. Unter Verwendung einer Eichkurve, die von den Eichsubstanzen von GRP (31-98) erhalten wurde, wurde die Konzentration an ProGRP (pg/ml) für jede Probe erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 und 7 gezeigt. Tabelle 6

Harnstoff-Probe von		ProGRP (pg/ml)
Gesundem Individuum	1	6,5
	2	5,1
	3	5,2
Patienten mit kleinzelligem Lungenkrebs	1	282
	2	171
	3	283
	4	17233

Tabelle 7

Serum-Proben von			ProGRP (pg/ml)
Gesundem Individuum	1	20,2
	2	35,2
	3	15,2
	4	24,0
	5	22,3
	6	16,5
	7	38,5
	8	21,6
Patienten mit kleinzelligem Lungenkrebs	1	400,9
	2	415,5
	3	550,9
	4	186,4
	5	1874,2

Wie man aus Tabelle 6 sehen kann, kann die ProGRP-Immunaktivität in einer Harnstoff-Probe unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die das Peptid GRP (70-90) erkennen, sowohl als erster als auch. als zweiter Antikörper, gemessen werden. Zusätzlich wurde bestätigt, dass in einer Harnstoff-Probe von einem Patienten mit kleinzelligem Lungenkrebs eine höhere ProGRP-Immunaktivität vorliegt als in einer Harnstoff-Probe von einem gesunden Individuum.
Unter Verwendung dieses ELISA wurden 8 Seren von gesunden Individuen und 5 Seren von Patienten mit kleinzelligem Lungenkrebs getestet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt, wobei ein Ergebnis erhalten wurde, das dem in Tabelle 4 in Beispiel 10 ähnlich ist.
Beispiel 12. Gelpermeationschromatographie-Analyse der ProGRP-Antigenizität in Serum und Urin
100 μm einer Serum-Probe oder einer Urin-Probe wurden auf eine Superde × 30 pg (1 × 50)-Säule, die mit einem Carbonatpuffer (pH 8,0) gequollen war, aufgebracht, und die Immunaktivität eluierter Fraktionen wurde nach dem in Beispiel 11 beschriebenen Testverfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Durch die Ergebnisse wurde bestätigt, dass die Immunaktivität der Serum-Probe ein Hauptmaximum bei den Fraktionen Nr. 21 bis 22 und ein Nebenmaximum bei einer niedermolekularen Seite des Hauptmaximums hat, wobei vermutet wird, dass das Nebenmaximum ein Abbauprodukt des Peptids, das dem Hauptmaximum entspricht, darstellt. Für die Urin-Probe wurde bei den Fraktionen Nr. 21 bis 22 kein Maximum beobachtet, sondern es wurde nur ein Maximum bei den Fraktionen Nr. 25 bis 26, das dem Maximum entspricht, von dem bei der Serum-Probe vermutet wurde, dass es ein Abbau-Produkt ist, be obachtet. Durch dieses Ergebnis wurde vermutet, dass im Serum hauptsächlich Protein mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 12.000 vorliegt, und dass während des Kreislaufs im Körper die Proteine abgebaut werden und das Abbau-Produkt schnell in den Urin ausgeschieden wird, und dass als ein Ergebnis Urin Peptide mit einem Molekulargewicht von 2.500 bis 7.000, wozu hauptsächlich das Peptid GRP (70-90) gehört, enthält.
Die im Sequenzprotokoll (Sequence Listing) verwendeten englischen Begriffe haben folgende deutsche Bedeutung:

SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zum Nachweisen oder Untersuchen der Fragmente des GRP-Vorläufers (ProGRP) in einer Urinprobe durch Verwenden von monoklonalen Antikörpern, die an den Bereich 70-90 des ProGRP binden, als einen ersten Antikörper und einen zweiten Antikörper.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Diagnose von kleinzelligem Lungenkrebs.