DE19813788A1 - Nachweisverfahren für Tumorzellen - Google Patents
Nachweisverfahren für TumorzellenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen in einer Körperprobe, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: DOLLAR A (a) Entnahme und Aufbereitung einer Körperprobe, DOLLAR A (b) Isolierung von mRNA aus der Körperprobe von (a), DOLLAR A (c) Übersetzung der mRNA von (b) in cDNA, DOLLAR A (d) Amplifikation der cDNA von (c) durch eine PCR-Reaktion mit für PreproGRP cDNA spezifischen Primern, und DOLLAR A (e) Nachweis der amplifizierten cDNA von (d).
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen,
in dem PreproGRP mRNA bestimmt wird, und seine Verwendung.
Bei der Krebsvorsorge und der Therapiekontrolle nach aufgetretenen Krebs
erkrankungen geht es um den Nachweis von Tumorzellen. Bis jetzt wurde dies
mit zytologischen, radiologischen oder serologischen Methoden durchgeführt.
Diese Methoden haben aber allgemein den Nachteil, daß die Proben, die auf
Tumorzellen getestet werden sollen, oft nur schwer zu erhalten sind und die
Ergebnisse wegen geringer Sensitivität und Spezifität des Verfahrens nur bei
Proben mit vielen Tumorzellen verläßlich sind. Dies ist aber ein deutlicher Nach
teil, wenn es um den Nachweis geringster Mengen von Tumorzellen geht.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
bereitzustellen, mit dem auch geringste Mengen von Tumorzellen im Rahmen der
Krebsvorsorge und/oder Therapiekontrolle bei Krebserkrankungen nachweisbar
sind.
Erfindungsgemäß wird dies durch ein Verfahren erreicht, mit dem PreproGRP
mRNA in Körperproben nachgewiesen wird. Ein solches Verfahren umfaßt
folgende Verfahrensschritte:
- (a) Entnahme und Aufbereitung einer Körperprobe,
- (b) Isolierung von mRNA aus der Körperprobe von (a),
- (c) Übersetzung der mRNA von (b) in cDNA,
- (d) Amplifikation der cDNA von (c) durch eine PCR-Reaktion mit für PreproGRP cDNA spezifischen Primern, und
- (e) Nachweis der amplifizierten cDNA von (d).
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß
die Expression von PreproGRP mRNA spezifisch für viele Tumoren, z. B. Bron
chialkarzinom, Mammakarzinom, Kolorektal Karzinom, Prostatakarzinom, C-Zell-
Karzinom oder andere neuroendokrin differenzierte Tumoren, ist. Mit PreproGRP
mRNA wird eine mRNA bezeichnet, die nach Translation und Prozessierung zu
einem mit GRP "gastrin-releasing peptide" bezeichneten Wachstumsfaktor führt.
Dieser Wachstumsfaktor gehört in die Gruppe der Bombesine. Ferner hat der
Anmelder erkannt, daß mit dem Nachweis von PreproGRP mRNA Tumorzellen in
kleinsten Mengen, sowohl in Geweben wie auch in Körperflüssigkeiten identifi
ziert werden können. Für den Nachweis kann dabei die PreproGRP mRNA in
cDNA übersetzt und diese durch eine PCR-Reaktion mit für PreproGRP cDNA
spezifischen Primern amplifiziert und durch Southernblot-Hybridisierung nach
gewiesen werden.
Eine Körperprobe, in der PreproGRP mRNA nachgewiesen werden soll, wird dem
Patienten entnommen. Geeignet sind hierzu u. a. Blut, Sputum, Urin Stuhl,
Knochenmark, Lymphknoten, Liquor, Galle, gastrointestinale Sekrete, Biopsien
bzw. Organpunktate und Lymphflüssigkeit, wobei Blut und Sputum bevorzugt
sind.
Für eine Blutprobe wird vorzugsweise ca. 10 ml Blut, aus der Armvene des
Patienten entnommen. Dieses Blut wird in mit gerinnungshemmenden Agentien
versehene Blutröhrchen gegeben und kann bis zur Gewinnung der PBL/Tumorzel
len kurz, maximal 4-7 h bei 4°C gelagert werden. Die Extraktion der PBL/Tumor
zellen kann nach bekannten Verfahren erfolgen, vorzugsweise durch Dichtegradi
entenzentrifugation mit Ficoll-Paque (Pharmacia) gemäß einem Standardprotokoll
für Lymphozytenextraktion. Anschließend wird das Zellpellet in flüssigem Stick
stoff schockgefroren und bei -70°C aufbewahrt.
Für eine Sputumprobe wird der Patient 15 bis 30 min einer Inhalation mit ver
nebelter, physiologischer Kochsalzlösung, z. B. 0,9% NaCl-Lösung, ausgesetzt,
bevor ca. 5 ml Sputumprobe abgenommen werden. Diese kann bis zu ihrer
Aufarbeitung kurz, maximal 4-7 h, bei 4°C gelagert werden. Für die Aufarbei
tung wird die Sputumprobe mit einem gleichen Volumen Sputolysin (Calbio
chem, San Diego, USA) etwa 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann
erfolgt eine Zentrifugation der Sputumprobe ca. 30 min bei 300 xg und 4°C.
Das gewonnene Zellpellet wird in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei
-70°C aufgewahrt.
Aus vorstehenden Zellpellets wird Gesamt-RNA isoliert, wobei mRNA besonders
angereichert wird. Hierzu können übliche Verfahren verwendet werden. Günstig
ist es, die käuflichen Guanidinium-Isothiocyanat-Extraktionskits TRIZOL, Glass-
Max, Gibco BRL zu verwenden. Ebenso ist es günstig, kontaminierende DNA
durch einen DNAse-Verdau, z. B. 15 min bei 25°C mit DNASE I, zu entfernen.
Die angereicherte mRNA wird einer reversen Transkription unterzogen. Diese
kann unspezifisch sein, wobei übliche Primer, vorzugsweise Hexanukleotide (z. B.
von Boehringer Mannheim) und eine MMLV-reverse Transkriptase (z. B. SUPERSKRIPT
II, Gibco BRL) verwendet werden. Ein geeigneter Reaktionsansatz mit
Hexanukleotiden wird 10 min bei 65°C und 60 min bei 37°C inkubiert. Es wird
cDNA erhalten, die auch PreproGRP cDNA umfaßt. Günstig ist es, eine spezifi
sche reverse Transkription durchzuführen. Ein geeigneter Reaktionsansatz
umfaßt einen für PreproGRP mRNA spezifischen Primer, insbesondere einen
solchen mit der Sequenz CTC TTT TCG ACA ATT GTT CAG (Primer 704.rev.).
Diese Sequenz kann auch ein oder mehrere Nukleotidaustausche umfassen mit
der Maßgabe, daß die Sequenz spezifisch an PreproGRP mRNA bindet. Der
Reaktionsansatz wird 10 min bei 65°C und 60 min bei 37°C inkubiert. Beim
letzteren Inkubationsschritt liegt auch eine reverse Transkriptase (z. B. Super
script PLUS, Gibco BRL) vor. Es wird PreproGRP cDNA erhalten.
Die vorstehende cDNA wird einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR-Reaktion)
unterzogen, wobei eine Taq-Polymerase (z. B. von Gibco BRL) verwendet wird.
Als Primer werden Oligonukleotide verwendet, deren Sequenzen eine Amplifika
tion von PreproGRP cDNA erlauben. Günstig ist es, wenn zwei PCR-Reaktionen
durchgeführt werden, wobei die zweite PCR-Reaktion eine "nested"-PCR-Reak
tion ist. Besonders günstig ist es, wenn für die zwei PCR-Reaktionen die nach
stehenden Primer-Paare verwendet werden. Die Primer-Paare können jeweils
auch ein oder mehrere Nukleotidaustausche aufweisen mit der Maßgabe, daß sie
spezifisch an PreproGRP cDNA binden:
PCR-Reaktion:
Primer-Paare:
Erst-PCR-Reaktion:
223.forward: GGA GTC TTC TTC TGT TTC TGA G
704.reverse: CTC TTT TCG ACA ATT GTT CAG
"nested"-PCR-Reaktion
335.forward: AGA AAC CAC CAG CCA CCT CAA CCC
668.reverse: ACC AGA AGA TGC TCG TTG AAA ATC ACG A
PCR-Reaktion:
Primer-Paare:
Erst-PCR-Reaktion:
223.forward: GGA GTC TTC TTC TGT TTC TGA G
704.reverse: CTC TTT TCG ACA ATT GTT CAG
"nested"-PCR-Reaktion
335.forward: AGA AAC CAC CAG CCA CCT CAA CCC
668.reverse: ACC AGA AGA TGC TCG TTG AAA ATC ACG A
Die Bedingungen für die PCR-Reaktionen entsprechen üblichen Standardbedin
gungen. Insbesondere werden die PCR-Reaktionen wie folgt durchgeführt:
Erst-PCR-Reaktion:
Pro Gesamtansatz von 50 µl:
10 × Reaktionspuffer
2 mM dNTP
50 mM MgCl2
RNase-freies Wasser
2.5 U Taq-Polymerase
je 12,5 pmol der entsprechenden Primer
90 sec, 93°C, 45 Zyklen
30 sec, 93°C
30 sec, 54°C
30 sec, 72°C,
6 min, 72°C
"nested" PCR-Reaktion:
pro Gesamtansatz von 50 µl:
10 × Reaktionspuffer
2 mM dNTP
50 mM MgCl2
RNAse-freies Wasser
2,5 U Taq-Polymerase
je 12,5 pmol der entsprechenden Primer
2,5 µl der Erst-PCR-Reaktion
90 sec, 93°C, 45 Zyklen
30 sec, 93°C
30 sec, 71°C
20 sec, 72°C
6 min, 72°C
Erst-PCR-Reaktion:
Pro Gesamtansatz von 50 µl:
10 × Reaktionspuffer
2 mM dNTP
50 mM MgCl2
RNase-freies Wasser
2.5 U Taq-Polymerase
je 12,5 pmol der entsprechenden Primer
90 sec, 93°C, 45 Zyklen
30 sec, 93°C
30 sec, 54°C
30 sec, 72°C,
6 min, 72°C
"nested" PCR-Reaktion:
pro Gesamtansatz von 50 µl:
10 × Reaktionspuffer
2 mM dNTP
50 mM MgCl2
RNAse-freies Wasser
2,5 U Taq-Polymerase
je 12,5 pmol der entsprechenden Primer
2,5 µl der Erst-PCR-Reaktion
90 sec, 93°C, 45 Zyklen
30 sec, 93°C
30 sec, 71°C
20 sec, 72°C
6 min, 72°C
Zur Kontrolle vorstehender Anreicherung von mRNA und deren Übersetzung in
cDNA empfiehlt es sich, eine GAPDH-RT-PCR-Reaktion durchzuführen. Für die
reverse Transkription wird auf die vorstehenden Ausführungen hinsichtlich einer
unspezifischen reversen Transkription verwiesen. Für die PCR-Reaktion können
folgende Primer verwendet werden:
Primer für GAPDH:
gapdh1forward: CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA
gapdh2reverse: GGA TGA CCT TGC CCA CAG CCT
Primer für GAPDH:
gapdh1forward: CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA
gapdh2reverse: GGA TGA CCT TGC CCA CAG CCT
Die Bedingungen für die PCR-Reaktion entsprechen üblichen Standardbedingun
gen. Insbesondere wird die PCR-Reaktion wie folgt durchgeführt:
1,5 U Taq-Polymerase pro Ansatz;
1,5 min, 93°C;
35 × 30 sec, 93°C;
30 sec, 54°C;
30 sec, 72°C;
6 min, 72°C
1,5 U Taq-Polymerase pro Ansatz;
1,5 min, 93°C;
35 × 30 sec, 93°C;
30 sec, 54°C;
30 sec, 72°C;
6 min, 72°C
Die vorstehende amplifizierte cDNA wird in üblicher Weise nachgewiesen.
Günstig ist es, sie auf einem Agarosegel, vorzugsweise 1-1,5%, aufzutrennen,
mit Ethidiumbromid anzufärben und einer Southern Blot-Hybridisierung zu unter
ziehen. Hierzu wird die DNA auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und mit
einem markierten Oligonukleotid hybridisiert, wobei das Oligonukleotid spezifisch
für PreproGRP cDNA bzw. GAPDH cDNA ist. Günstig ist es, wenn das Oligonu
kleotid mit Fluorescein markiert ist und mittels eines mit Peroxidase konjugierten
Anti-Fluorescein-Antikörpers über Chemoilluminiszenz auf einem Röntgenfilm
sichtbar gemacht wird. Das erhaltene Ergebnis gibt Aufschluß darüber, ob die
Körperprobe Tumorzellen aufweist.
Als Hybridisierungs-Oligonukleotide eignen sich
für PreproGRP cDNA: 466forward: ACG TGA AGG AAG GAA CCC CCA GC
und für GAPDH cDNA: CTC TCC AGA ACA TCA TCC CTG
für PreproGRP cDNA: 466forward: ACG TGA AGG AAG GAA CCC CCA GC
und für GAPDH cDNA: CTC TCC AGA ACA TCA TCC CTG
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß der Nachweis
von geringsten Mengen an Tumorzellen auf sehr einfache Weise spezifisch und
sensitiv gelingt. Beispielsweise kann eine Tumorzelle unter 106 Zellen identifiziert
werden. Die Tumorzelle kann dabei in Geweben wie auch in Körperflüssigkeiten
vorliegen. Ferner kann sie von verschiedenen Tumoren, z. B. Bronchialkarzinom,
Mammakarzinom, Kolorektal Karzinom, Prostatakarzinom oder C-Zell-Karzinom
stammen. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel bereit, das sowohl in
der Krebsvorsorge wie auch der Therapiekontrolle bei Krebserkrankungen be
stens eingesetzt werden kann.
Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.
Von einer an Bronchialkarzinom erkrankten Person wurde nach 30 min Inhalation
mit 0,9% NaCl-Lösung eine Sputumprobe von 5 ml entnommen. Diese wurde
mit dem gleichen Volumen Sputolysin 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Dann wurde die Sputumprobe 30 min bei 300 xg und 4°C zentrifugiert. Das
Zellpellet wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C aufbe
wahrt.
Aus dem Zellpellet wurde Gesamt-RNA isoliert, wobei mRNA angereichert
wurde. Hierzu wurde der käufliche Guanidinium-Isocyanat-Extraktionskit TRIZOL
verwendet. Kontaminierende DNA wurde innerhalb von 15 min bei 25°C mit
DNASEI verdaut.
Die angereicherte mRNA wurde einer spezifischen, reversen Transkription
unterzogen, wobei ein Primer mit der Sequenz CTC TTT TCG ACA ATT GTT CAG
und die reverse Transkriptase Superscript PLUS verwendet wurden. Der
Reaktionsansatz wurde 10 min bei 65°C und 60 min bei 37°C inkubiert. Es
wurde cDNA erhalten.
Die cDNA wurde zwei PCR-Reaktionen unterzogen. Die zweite PCR-Reaktion war
eine "nested"-PCR-Reaktion. Es wurden eine Taq-Polymerase und folgende
Primer-Paare verwendet:
Erst-PCR-Reaktion:
223.forward: GGA GTC TTC TTC TGT TTC TGAG
704.reverse: CTC TTT TCG ACA ATT GTT CAG
"nested"-PCR-Reaktion:
325.forward: AGA AAC CAC CAG CCA CCT CAA CCC
668.reverse: ACC AGA AGA TGC TCG TTG AAA ATC ACG A
Erst-PCR-Reaktion:
223.forward: GGA GTC TTC TTC TGT TTC TGAG
704.reverse: CTC TTT TCG ACA ATT GTT CAG
"nested"-PCR-Reaktion:
325.forward: AGA AAC CAC CAG CCA CCT CAA CCC
668.reverse: ACC AGA AGA TGC TCG TTG AAA ATC ACG A
Die PCR-Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt:
Erst-PCR-Reaktion
Pro Gesamtansatz von 50 µl:
10 × Reaktionspuffer
2 mM dNTP
50 mM MgCl2
RNase-freies Wasser
2.5 U Taq-Polymerase
je 12,5 pmol der entsprechenden Primer
90 sec, 93°C, 45 Zyklen
30 sec, 93°C
30 sec, 54°C
30 sec, 72°C,
6 min, 72°C
"nested" PCR-Reaktion:
pro Gesamtansatz von 50 µl:
10 × Reaktionspuffer
2 mM dNTP
50 mM MgCl2
RNAse-freies Wasser
2,5 U Taq-Polymerase
je 12,5 pmol der entsprechenden Primer
2,5 µl der Erst-PCR-Reaktion
90 sec, 93°C, 45 Zyklen
30 sec, 93°C
30 sec, 71°C
20 sec, 72°C
6 min, 72°C
Erst-PCR-Reaktion
Pro Gesamtansatz von 50 µl:
10 × Reaktionspuffer
2 mM dNTP
50 mM MgCl2
RNase-freies Wasser
2.5 U Taq-Polymerase
je 12,5 pmol der entsprechenden Primer
90 sec, 93°C, 45 Zyklen
30 sec, 93°C
30 sec, 54°C
30 sec, 72°C,
6 min, 72°C
"nested" PCR-Reaktion:
pro Gesamtansatz von 50 µl:
10 × Reaktionspuffer
2 mM dNTP
50 mM MgCl2
RNAse-freies Wasser
2,5 U Taq-Polymerase
je 12,5 pmol der entsprechenden Primer
2,5 µl der Erst-PCR-Reaktion
90 sec, 93°C, 45 Zyklen
30 sec, 93°C
30 sec, 71°C
20 sec, 72°C
6 min, 72°C
Zur Kontrolle vorstehender Anreicherung von mRNA und deren Übersetzung in
cDNA wurde auch eine GAPDH-RT-PCR-Reaktion durchgeführt. Die Bedingungen
waren wie vorstehend angegeben. Als Primer für die PCR-Reaktion wurden
verwendet:
Primer für GAPDH:
gapdh1forward: CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA
gapdh2reverse: GGA TGA CCT TGC CCA CAG CCT
gapdh1forward: CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA
gapdh2reverse: GGA TGA CCT TGC CCA CAG CCT
Die vorstehende amplifizierte cDNA wurde auf einem 1% Agarosegel aufge
trennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die cDNA wurde dann auf eine Nitro
zellulosemembran (Hybond Nt, Amersham) übertragen und mit folgenden mit
Fluorescein markierten Oligonukleotiden getrennt hybridisiert. Die Hybridisie
rungstemperatur lag jeweils 5°C unter der Schmelztemperatur des verwendeten
Oligonukleotids.
Folgende Oligonukleotide wurden verwendet:
für PreproGRP cDNA:
466forward: ACG TGA AGG AAG GAA CCC CCA GC
für GAPDH cDNA: CTC TCC AGA ACA TCA TCC CTG.
für PreproGRP cDNA:
466forward: ACG TGA AGG AAG GAA CCC CCA GC
für GAPDH cDNA: CTC TCC AGA ACA TCA TCC CTG.
Mit den verwendeten Oligonukleotiden konnte jeweils eine amplifizierte cDNA
nachgewiesen werden.
Claims (7)
1. Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen in einer Körperprobe, umfas
send die folgenden Verfahrensschritte:
- (a) Entnahme und Aufbereitung einer Körperprobe,
- (b) Isolierung von mRNA aus der Körperprobe von (a),
- (c) Übersetzung der mRNA von (b) in cDNA,
- (d) Amplifikation der cDNA von (c) durch eine PCR-Reaktion mit für PreproGRP cDNA spezifischen Primern, und
- (e) Nachweis der amplifizierten cDNA von (d).
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Körperprobe Blut, Sputum, Urin,
Stuhl, Liquor, Galle, gastrointestinale Sekrete, Organpunktate bzw. Biop
sien und/oder Lymphflüssigkeit ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Verfahrensschritt (c) eine
spezifische reverse Transkription ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der verwendete Primer die Sequenz
CTC TTT TCG ACA ATT GTT CAG oder eine hiervon durch ein oder
mehrere Nukleotidaustausche unterschiedliche Sequenz aufweist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei der Verfahrensschritt
(d) eine Erst-PCR- und eine "nested"-PCR-Reaktion umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die verwendeten Primer die nachfol
genden Sequenzen oder hiervon durch ein oder mehrere Nukleotidaustau
sche unterschiedliche Sequenzen aufweisen:
Erst-PCR-Reaktion:
223.forward: GGA GTC TTC TTC TGT TTC TGA G
704.reverse: CTC TTT TCG ACA ATT GTT CAG
"nested"-PCR-Reaktion:
335.forward: AGA AAC CAC CAG CCA CCT CAA CCC
668.reverse: ACC AGA AGA TGC TCG TTG AAA ATC ACG A
Erst-PCR-Reaktion:
223.forward: GGA GTC TTC TTC TGT TTC TGA G
704.reverse: CTC TTT TCG ACA ATT GTT CAG
"nested"-PCR-Reaktion:
335.forward: AGA AAC CAC CAG CCA CCT CAA CCC
668.reverse: ACC AGA AGA TGC TCG TTG AAA ATC ACG A
7. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-6 zur
Tumor- bzw. Metastasensuche in der Krebsvorsorge und -Nachsorge.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1998113788 DE19813788A1 (de) | 1998-03-27 | 1998-03-27 | Nachweisverfahren für Tumorzellen |
PCT/DE1999/000995 WO1999050445A2 (de) | 1998-03-27 | 1999-03-25 | Nachweisverfahren für tumorzellen |
AU41319/99A AU4131999A (en) | 1998-03-27 | 1999-03-25 | Detection method for tumor cells |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1998113788 DE19813788A1 (de) | 1998-03-27 | 1998-03-27 | Nachweisverfahren für Tumorzellen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19813788A1 true DE19813788A1 (de) | 1999-10-07 |
Family
ID=7862696
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1998113788 Ceased DE19813788A1 (de) | 1998-03-27 | 1998-03-27 | Nachweisverfahren für Tumorzellen |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
AU (1) | AU4131999A (de) |
DE (1) | DE19813788A1 (de) |
WO (1) | WO1999050445A2 (de) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4431174A1 (de) * | 1994-09-01 | 1996-03-07 | Deutsches Krebsforsch | Nachweisverfahren für tumorspezifische mRNA |
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AU662906B2 (en) * | 1991-06-26 | 1995-09-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for detection of carcinoma metastases by nucleic acid amplification |
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1998
- 1998-03-27 DE DE1998113788 patent/DE19813788A1/de not_active Ceased
-
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- 1999-03-25 WO PCT/DE1999/000995 patent/WO1999050445A2/de active Application Filing
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DE4431174A1 (de) * | 1994-09-01 | 1996-03-07 | Deutsches Krebsforsch | Nachweisverfahren für tumorspezifische mRNA |
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Publication number | Publication date |
---|---|
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WO1999050445A3 (de) | 2000-01-20 |
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