WO2005085471A2 - Verfahren und mittel zur differentiellen diagnose von schilddrüsentumoren - Google Patents

Verfahren und mittel zur differentiellen diagnose von schilddrüsentumoren Download PDF

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WO2005085471A2
WO2005085471A2 PCT/DE2005/000421 DE2005000421W WO2005085471A2 WO 2005085471 A2 WO2005085471 A2 WO 2005085471A2 DE 2005000421 W DE2005000421 W DE 2005000421W WO 2005085471 A2 WO2005085471 A2 WO 2005085471A2
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benign
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Ralf Paschke
Markus Eszlinger
Knut Krohn
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Universität Leipzig
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the invention relates to methods and means for the differential diagnosis of thyroid tumors, in particular for differentiating benign nodular thyroid changes (so-called hot and cold nodules) from malignant thyroid carcinomas (papillary and follicular carcinoma).
  • the method and the means are used in clinical tumor diagnosis.
  • thyroid nodules The frequency of nodular thyroid changes, hereinafter referred to as thyroid nodules, is around 30 percent of the adult population in iodine-deficient areas, such as Germany (1).
  • the diagnosis of a thyroid nodule is often an incidental finding when the clinical status is ascertained, or a secondary finding in sonographic examinations (2; 3).
  • the IQassification of the thyroid nodules is based on both morphological (4) and functional criteria ("hot” or “cold” nodes). About 85% of all thyroid nodules are shown as “cold” nodules (5). This group is of particular importance in the differential diagnosis of nodular thyroid diseases, since thyroid carcinomas mostly appear as “cold” nodules.
  • the cold node is a node that is functionally inactive, i. H. produces less thyroid hormone than healthy thyroid tissue. If a cold I grade is present, it must be clarified whether it is a benign tumor or suspected thyroid carcinoma. However, the average risk of thyroid carcinoma is very low (1-5% of thyroid glands). The prevalence of thyroid carcinomas is not generally increased even in iodine-deficient areas.
  • the hot nodule is a benign tumor that produces more thyroid hormones than healthy thyroid tissue, which results in a "latent” or "manifest” hyperfunction.
  • this node is not suspected of being carcinoma, it is almost always benign, there may be a single (solitary) autonomic node or many hot nodes interspersed with the thyroid.
  • FNAZ fine needle aspiration cytology
  • the previous preoperative selection procedures lead to a histological carcinoma rate of 5 to a maximum of 30% in thyroid surgery due to thyroid nodules. As a result, over 70% of the operations currently performed for suspected carcinoma in thyroid nodules are actually unnecessary.
  • the invention is based on the object of specifying methods and means for diagnosing nodular thyroid disorders, in particular for the differential diagnosis of benign thyroid nodules (“hot” and “cold” nodules) against malignant thyroid carcinomas, in particular against follicular and papillary thyroid carcinomas.
  • the invention is based on scientific studies on differential gene expression in benign cold and hot thyroid nodules in comparison to the corresponding corresponding, healthy surrounding tissues and the subsequent comparison of these data with the corresponding gene expression data of thyroid carcinomas.
  • the genes differently expressed in benign and malignant thyroid tumors according to the invention are used as markers for the differential diagnosis of thyroid tumors.
  • the invention is based on the object of specifying a method and means for the differential diagnosis of thyroid tumors, in particular for distinguishing benign thyroid nodules from thyroid carcinomas.
  • Malignant tumors that are to be diagnosed with the invention are, in particular, follicular and papillary thyroid carcinomas.
  • the invention is based on scientific studies of differential gene expression in benign cold and hot thyroid nodules in comparison to the corresponding corresponding, healthy surrounding tissues and the subsequent comparison of these data with expression data in papillary and follicular thyroid carcinomas.
  • the differential gene expression of approximately 10,000 genes was examined using high-density gene expression arrays (Affymetrix GeneChips U95Av2, Affymetrix; Santa Clara, CA, USA).
  • Affymetrix GeneChips U95Av2, Affymetrix; Santa Clara, CA, USA high-density gene expression arrays
  • the object is achieved by a method for the differential diagnosis of thyroid tumors to differentiate benign tumors from malignant tumors in which:
  • RNA is isolated from a tissue sample of the thyroid gland
  • RNA transcripts of at least one gene selected from the genes listed in Table 1, Table 2, Table 3 and Table 4 with the gene numbers 1 to 153 is carried out, with a .) an increased amount of transcripts of genes No. 1 to 3, 5 to 8, 11, 13 to 15 and 19 to 22 and genes 23 to 27 and 33 provides an indication of the presence of a benign tumor, b.) a reduced amount of transcripts of genes No. 4, 9, 10, 12, 16 to 18 and of genes 28 to 32, 34 and 35 provides an indication of the presence of a benign tumor, c.) an increased amount of transcripts of gene No.
  • genes No. 133 and 134 provide an indication of the presence of a malignant tumor, d.)
  • a quantitative determination of the mRNA transcripts of at least two, three, four or five genes takes place selected from the genes listed in Table 1, Table 2, Table 3 and Table 4, in further preferred embodiment the mRNA transcripts of at least 10 or at least 15 genes analyzed to further improve the informative value.
  • the genes listed in Tables 1 to 4 are numbered consecutively (gene number).
  • ProbeSet-ID Under "ProbeSet-ID” in the tables is the Affymetrix standardized designation of a group of 16-20 samples, which are immobilized on the Affymetrix chip, with which the respective gene hybridizes and which serve to detect a specific transcript The most common name of the respective gene is also given.
  • Tables 1 to 4 show the SLR values of the genes in the respective tissues (columns “Expression in HK” (hot nodes), “Expression in KK” (cold nodes), “Expression in PTC” (papillary carcinoma), “ Expression listed in FTC “(follicular carcinoma)).
  • a signal log ratio (SLR) value of 1 thus corresponds to a 2-fold higher expression of the gene in the respective tumor tissue in comparison to the normal surrounding tissue
  • a SLR value of 2 corresponds to a 4-fold higher expression in comparison to the surrounding tissue
  • a negative SLR value corresponds to a reduced expression in the respective tumor tissue compared to the normal surrounding tissue.
  • An SLR value of -1 corresponds to an expression which is reduced by half in the tumor tissue compared to normal tissue.
  • An SLR value of -2 corresponds to an expression reduced to a quarter of the expression in normal tissue.
  • the SLR values are shown in FIGS. 1 to 4 in bar diagrams. In FIGS.
  • the mean value of the signal log ratio for hot nodes is given as “mean HK” (HK as tumor tissue, UGHK as surrounding tissue in formula 1).
  • mean HK HK as tumor tissue, UGHK as surrounding tissue in formula 1.
  • values for the benign cold thyroid nodules (KK), papillary thyroid carcinomas (PTC) and follicular thyroid carcinomas (FTC) are given as “mean KK”, “mean PTC” and “mean FTC”.
  • the numbers above and below the bars correspond to the gene numbers from Tables 1 to 4.
  • Table 1 lists the genes whose expression in benign hot thyroid nodules is at least twice as high or at least half as compared to their expression in normal surrounding tissue, compared to their expression in cold nodes and compared to their expression in thyroid carcinomas (papillary and follicular thyroid carcinoma) is reduced.
  • the invention therefore also includes a method for differential diagnosis of thyroid tumors to differentiate benign hot nodules from benign cold nodules, malignant follicular carcinomas and malignant papillary carcinomas, in which:
  • RNA is isolated from a tissue sample of the thyroid gland
  • a quantitative determination of the mRNA transcripts of at least two, three, four or five genes is selected from the genes listed in Table 1, in further preferred embodiments the mRNA transcripts of at least 10 or at least 15 genes analyzed to improve the informative value.
  • Gen No. 2 (type I 5 iodothyronine deiodinase, NMJ300792, sample set ID 31966_at) has an SLR of 2.0 in hot nodes (HK) compared to the normal surrounding tissues of hot nodes, which corresponds to a 4-fold higher expression in the HK compared to the surrounding tissue of hot nodes (UG HK ) - in cold nodes (KK) the SLR is 0.8 compared to the normal surrounding tissues of cold nodes (UG KK ). This corresponds to a 1.2-fold higher expression in the?
  • the SLR is -3.8, which corresponds to a 0.07-fold expression, ie an expression reduced by a factor of 14 in the PTCs compared to their surrounding tissues (UGp T c).
  • the SLR is -0.8 in comparison to the normal surrounding tissues of follicular carcinomas (UG FTC ) - this corresponds to a 0.6-fold expression, ie an expression reduced by a factor of 1.7 in the FTCs compared to their surrounding tissues.
  • gene no. 2 (type 1 5 iodothyronine deiodinase) is specifically overexpressed in hot nodules compared to cold nodules and follicular and papillary thyroid carcinomas and is therefore a specific marker for the diagnosis of hot thyroid nodules.
  • the type I 5 iodothyronine deiodinase is expressed specifically reduced. It therefore represents a specific marker for the diagnosis of thyroid carcinoma, in particular for the diagnosis of papillary thyroid carcinoma, and is listed again in Table 3.
  • Gen No. 4 (single stranded DNA binding protein, NM_012446, sample set ID 32668_at) has an SLR of -0.9 in HK compared to its surrounding tissues (UGH K ), which corresponds to a 0.53-fold expression in the HD, ie expression reduced by a factor of approx. 1.9, in the HK compared to their surrounding tissues (UG HK ) - In cold nodes (KK) the SLR is 0.3 compared to their surrounding tissues, which corresponds to one 1.23-fold expression in the IOC compared to the corresponding surrounding tissues. In comparison of the papillary carcinomas to their surrounding tissues, the SLR is 0.8, which corresponds to a 1.74-fold expression in the PTCs compared to their surrounding tissues. In comparison of the follicular carcinomas to their surrounding tissue, the SLR is 0.0, which corresponds to an unchanged expression.
  • gene No. 4 is expressed in a specifically reduced manner in HK and therefore represents a specific marker for the diagnosis of hot thyroid nodules.
  • Table 2 lists the genes whose expression in benign cold thyroid nodules is at least twice as high or at least half as compared to their expression in normal surrounding tissue, compared to their expression in hot nodes and compared to their expression in thyroid carcinomas (papillary and follicular thyroid carcinoma) is reduced.
  • the invention therefore also includes a method for differential diagnosis of thyroid tumors to differentiate benign cold nodules from benign hot nodules, malignant follicular carcinomas and malignant papillary carcinomas, in which:
  • RNA is isolated from a tissue sample of the thyroid gland
  • an increased amount of transcripts of genes 23 to 27 and 33 and a reduced amount of transcripts of genes 28 to 32, 34 and 35 provide an indication of the presence of a benign cold node.
  • the mRNA transcripts of at least two, three, four or five genes are selected quantitatively, selected from the genes listed in Table 2; in further preferred embodiments, the mRNA transcripts of at least 10 or at least 15 genes are analyzed to improve the informative value.
  • Gene No. 23 (fibroblast growth factor 7, NM_002009, sample set ID 1466_s_at) has an SLR of -1.2 in HD compared to its surrounding tissues, which corresponds to 0.44-fold expression in the HK.
  • the SLR In comparison to cold nodes to their surrounding tissues, the SLR is 1.3, which corresponds to a 2.46-fold expression in the ICK compared to the corresponding surrounding tissues.
  • the SLR In comparison of the papillary carcinomas to their surrounding tissues, the SLR is -0.8, which corresponds to 0.57-fold expression in the PTCs compared to their surrounding tissues.
  • the SLR In comparison of the follicular carcinomas to their surrounding tissues, the SLR is -3.0, which corresponds to 0.125-fold expression in the FTCs compared to their surrounding tissues.
  • gene no. 23 (fibroblast growth factor 7) is specifically overexpressed in KK compared to HK, FTC and PTC and therefore represents a specific marker for the diagnosis of cold thyroid nodules.
  • Gen No. 29 (chromosome 21 open reading frame 5, NM_005128, sample set ID 37827_r_at) has an SLR of 0.5 in HK compared to its surrounding tissues (U HK ), which corresponds to a 1.41-fold expression in the HK.
  • the SLR In comparison to cold nodes to their surrounding tissues, the SLR is -0.9, which corresponds to a 0.54-fold expression in the KK compared to the corresponding surrounding tissues.
  • the SLR is 0.8, which corresponds to a 1.74-fold expression in the PTCs compared to their surrounding tissues.
  • the SLR is -0.1, which corresponds to 0.93-fold expression in the FTCs compared to their surrounding tissues.
  • gene no. 29 chromosome 21 open reading frame 5
  • KK chromosome 21 open reading frame 5
  • FIG. 2 shows the differential expression of genes 23 to 35 from Table 2, which act as specific markers for cold thyroid nodules, in a bar chart. The numbers above and below the bars correspond to the gene numbers from Table 2.
  • Table 3 lists the genes whose expression in malignant papillary thyroid carcinomas on average is at least twice as high or at least around that of their expression in normal surrounding tissue, against their expression in follicular thyroid carcinomas and against their expression in benign thyroid tumors (hot nodules and cold nodules) half is reduced.
  • the invention therefore also includes a method for differential diagnosis of thyroid tumors to differentiate malignant papillary carcinomas from benign hot nodules, benign cold nodules and malignant follicular carcinomas, in which:
  • RNA is isolated from a tissue sample of the thyroid gland
  • the mRNA transcripts of at least two, three, four or five genes are selected quantitatively, selected from the genes listed in Table 3; in further preferred embodiments, the mRNA transcripts of at least 10 or at least 15 genes are analyzed to improve the informative value.
  • Gen No. 36 tissue inhibitor of metalloproteinase 1, NM_003254, sample set ID 1693_s_at
  • SLR tissue inhibitor of metalloproteinase 1, NM_003254, sample set ID 1693_s_at
  • the SLR is 0.0 in HD compared to its surrounding tissues, which corresponds to an unchanged expression in the HK.
  • the SLR is -0.7, which corresponds to a 0.62-fold expression in the KK compared to the corresponding surrounding tissues.
  • the SLR is 2.9, which corresponds to 7.46-fold expression in the PTCs compared to their surrounding tissues.
  • the SLR is 0.0, which corresponds to an unchanged expression in the FTCs compared to their surrounding tissues.
  • gene no. 36 tissue inhibitor of metalloproteinase 1
  • PTC tissue inhibitor of metalloproteinase 1
  • Gen No. 42 (homogeneous 1 2-dioxygenase, NM_000187, sample set ID 31844_at) has an SLR of 1.3 in HD compared to its surrounding tissues, which corresponds to a 2.46-fold expression in the HK.
  • the SLR In comparison to cold nodes to their surrounding tissues, the SLR is 0.8, which corresponds to a 1.74-fold expression in the KK compared to the corresponding surrounding tissues.
  • the SLR In comparison of the papillary carcinomas to their surrounding tissues, the SLR is -3.4, which corresponds to 0.09-fold expression, ie an expression reduced by a factor of 10.5, in the PTCs compared to their surrounding tissues.
  • the SLR is -3.3, which corresponds to a 0.1-fold expression, ie an expression in the FTCs reduced by a factor of approx. 10 compared to their surrounding tissues.
  • gene no. 42 (homogenized 1 2-dioxygenase) in PTC and FTC (see Table 4) is specifically expressed less than HK and KK and therefore represents a specific marker for the diagnosis of thyroid carcinoma.
  • Fig. 3 shows the differential expression of genes 2, 13, 15, 16, 22, 32, 33 and 36 to 132 from Table 3, which act as specific markers for papillary thyroid carcinoma, in a bar chart.
  • the numbers above and below the bars correspond to the gene numbers from Table 3.
  • Table 4 lists the genes whose expression in malignant follicular thyroid carcinomas on average is at least twice as high or at least around that of their expression in normal surrounding tissue, against their expression in papillary thyroid carcinomas and against their expression in benign thyroid tumors (hot nodules and cold nodules) half is reduced.
  • the invention therefore also includes a method for differential diagnosis of thyroid tumors to distinguish malignant follicular carcinomas from benign hot nodules, benign cold nodules and malignant papillary carcinomas, in which:
  • RNA is isolated from a tissue sample of the thyroid gland
  • the mRNA transcripts of at least two, three, four or five genes are selected quantitatively, selected from the genes listed in Table 4; in further preferred embodiments, the mRNA transcripts of at least 10 or at least 15 genes analyzed to improve the informative value.
  • Gene No. 133 (UDP-Gal: betaGlcNAc beta 1,4-galactosyltransferase, NM_001497, sample set ID 40960_at) has an SLR of 0.1 in HK compared to the surrounding tissues, which corresponds to a 1.1 expression in the HK. In comparison to cold nodes to the surrounding tissues, the SLR is -0.3, which corresponds to 0.8 times the expression in the KK compared to the surrounding tissues.
  • the SLR In comparison of the follicular carcinomas to the surrounding tissues, the SLR is 2.0, which corresponds to a 4-fold expression in the FTC compared to the surrounding tissues and in comparison of the papillary carcinomas to the surrounding tissues, the SLR is 0.0, which corresponds to an unchanged expression in the PTC compared to the surrounding tissues.
  • gene number 133 in FTC is specifically overexpressed against HK, KK and PTC and is therefore a specific marker for the diagnosis of follicular thyroid carcinoma.
  • Gene No. 138 (BENE protein, NM_005434, sample set ID 33331_at) has an SLR of 0.7 in HK compared to the surrounding tissues, which corresponds to a 1.62-fold expression in the HK.
  • the SLR In comparison to cold nodes to the surrounding tissues, the SLR is 1.0, which corresponds to a double expression in the KK compared to the surrounding tissues.
  • the SLR In comparison of the follicular carcinomas to the surrounding tissues, the SLR is -1.6, which corresponds to a 0.33-fold expression in the FTC in comparison to the surrounding tissues, and in comparison of the papillary carcinomas to the surrounding tissues, the SLR is 1.3, which corresponds to a 2, 46-fold expression in the PTC compared to the surrounding tissues.
  • gene no. 138 in FTC has a specifically reduced expression compared to HK, KK and PTC and is therefore a specific marker for the diagnosis of follicular thyroid carcinoma.
  • the differentiation between benign tumors and malignant carcinomas is preferably carried out by additionally carrying out a quantitative determination of the transcripts of a reference gene in the isolated RNA.
  • the expression of the reference gene serves as an internal standard.
  • the determined value for the m? RNA expression of the tumor-specific gene is preferably divided by the determined value for the expression of the reference gene. From the height of the quotient obtained in this way, conclusions can be drawn about the degree of malignancy of the tumor.
  • the reference gene is a gene which is expressed at the same level in healthy thyroid tissue and in benign and malignant tumors of the thyroid. Preferred reference genes are given in Table No. 5.
  • the method according to the invention advantageously makes it possible to differentiate benign cold thyroid nodules from malignant thyroid carcinomas by quantifying the above-mentioned genes in an extremely small sample of thyroid tissue, in particular in FNAZ material. By quantifying these genes, the percentage of thyroid punctures that cannot be adequately assessed according to the prior art can be minimized. This way, unnecessary thyroid surgery can be avoided.
  • a quantitative determination of the mRNA transcripts of at least one gene is selected in the isolated RNA from the genes listed in Table 2 (specific genes for benign cold nodes) and at least one gene is selected from the ones in Tables 3 and 4 genes listed, wherein a.) an increased amount of transcripts of genes Nos. 23 to 27 and 33 provides an indication of the presence of a benign tumor, b.) a reduced amount of transcripts of genes Nos.
  • the expression of at least one gene from the group of genes specific for hot nodes from Table 1 and / or further genes from Tables 2, 3 and 4 is additionally measured.
  • the tissue sample is preferably taken by puncturing the thyroid or fine needle aspiration cytology (FNAZ).
  • FNAZ thyroid or fine needle aspiration cytology
  • the quantitative measurement of the mRNA gene expression is preferably carried out by means of quantitative RT-PCR.
  • complementary DNA cDNA
  • RT reverse transcriptase
  • an oligo-dT can be used as a primer for the RT.
  • random hexamer primers for the RT led to a significant increase in sensitivity (at least a factor of 4).
  • the random hexamer oligonucleotide each contains a mixture of A, G, T, C at all six positions and hybrids non-specifically with mRNA sequences.
  • the primers for the PCR preferably have a length of 15 to 30 base pairs and are designed to overlap introns in order to amplify only cDNA if the RNA is contaminated with genomic DNA.
  • the PCR is particularly preferably carried out as real-time PCR.
  • Known real-time PCR methods are e.g. B. the TaqMan®, FRET (fluorescence resonance energy transfer), LightCycler® and Beacon processes.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • LightCycler® and Beacon processes.
  • the PCR product can advantageously be specifically quantified in these methods during the PCR.
  • Pax8 / PPAR ⁇ and / or Ret / PTC rearrangements and / or BRAF mutations are preferably also detected by means of PCR, particularly preferably according to those of Cheung CC et al (17) for the Pax8 / PPAR ⁇ ⁇ and by Nikiforova MN (18) for the Ret / PTC rearrangements and by Salvatore G et al. (19) Methods described for the BRAF mutations.
  • BRAF mutation screening (19) analyzes the base sequence of the BRAF (V600E) (Homo sapiens BRAF) marker mutated in 45% of papillary thyroid carcinomas. A BRAF mutation is therefore an additional diagnostic marker for papillary thyroid carcinoma.
  • the significance of the method according to the invention can be further increased by distinguishing between benign and malignant thyroid tumors.
  • the significance of the method according to the invention can be increased even further by distinguishing between benign and malignant thyroid tumors.
  • a diagnostic kit which contains the following components: 1) for cDNA synthesis: a) random hexamer primer, b) reverse transcriptase; 2) for the PCR: c) at least two primers which hybridize with the cDNA one of the genes selected from the groups of the tumor-specific genes from Tables 1, 2, 3 and 4; d) at least two primers which hybridize with the cDNA of a reference gene, preferably selected from the group of reference genes shown in Table 5, e) a DNA polymerase which is stable at 80 ° C., such as, for. B. taq polymerase; as well as dNTP mix (preferably 10 mM), DDT, RNase inhibitor and corresponding reaction buffer.
  • a DNA polymerase which is stable at 80 ° C., such as, for. B. taq polymerase; as well as dNTP mix (preferably 10 mM), DDT, RNase inhibitor and corresponding reaction buffer.
  • the kit for cDNA synthesis contains oligodT instead of the random hexamer.
  • primer pairs which enable the specific amplification of genes 66 and 67 and 154 to 157 are given in SEQ ID no. 1 to 12.
  • one of the primers from 2) c) (for the tumor-specific gene) and 2) d) (for the reference gene) is fluorescence-labeled.
  • the diagnostic kit for carrying out a real-time PCR preferably contains, as additional components: f) a fluorescence-labeled hybridization probe or a pair of fluorescence-labeled hybridization probes which hybridize specifically with the tumor-specific gene from Table 1, 2, 3 or 4 , and g) a fluorescence-labeled hybridization probe or a pair of fluorescence-labeled hybridization probes that hybridize specifically with the reference gene from Table 5.
  • DNA oligonucleotides with a length of 10 to 30 nucleotides are preferably chosen both as primers and as hybridization probes.
  • the hybridization probe contains, in addition to the fluorescent dye, a further dye which quenches the fluorescence by means of a fluorescence resonance energy transfer (FRET) as long as the sample does not hybridize with the amplified cDNA.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • two hybridization probes are used, each of which is labeled with a dye. Such a pair of probes is selected such that they hybridize on the amplified cDNA at a short distance, preferably at a distance of 1-5 bp.
  • the hybridization brings the fluorescent dyes so close to each other that FRET takes place and the cDNA can be quantified.
  • the probes are then separated from the cDNA (in the extension phase of the PCR) by the exonuclease activity of the polymerase.
  • the first probe at the 3 'end is marked with fluorescein (FL) and the other at its 5' end with LightCycler-Red-640.
  • Fluorescence-labeled hybridization probes are e.g. B. as LightCycler®, TaqMan® or “molecular beacons” on the market and enable quantification during the PCR.
  • hybridization probes which enable the specific recognition of cDNA of genes No. 67, 154, 155 and 157 are given in SEQ ID no. 13 to 20.
  • the sequences according to SEQ ID no 13 and 14, 15 and 16, and 17 and 18 can each be used as a pair of probes, since they hybridize on the amplified cDNA at a short distance, preferably at a distance of 1 to 5 bp.
  • the SEQ ID No. 13, 15 and 17 preferably at the 3 'end with fluorescein (FL) and SEQ ID No. 14, 16 and 18 marked at their 5 'end with LightCycler-Red-640 and enable quantification using the LightCycler® method.
  • the 3 'hydroxyl group of SEQ ID No. 14, 16 and 18 is preferably blocked with a phosphate group against the undesired extension by the polymerase. After the hybridization, there is a distance of one to five bases between the two probes so that the dyes do not collide.
  • the probe for gene no. 67 (COX-2) according to SEQ ID no. 19 and for gene no. 155 ( ⁇ -actin) according to SEQ ID no. 20 is preferably marked at the 5 'end with VIC and at the 3' end with TAMRA-3 'and enables quantification using the TaqMan® method.
  • the fluorescent dyes with which the primers or hybridization probes are labeled differ in their absorption and / or emission spectra. This enables a parallel quantification of the amplified cDNA of the tumor-specific gene and the cDNA of the reference gene.
  • Embodiment 1 is a diagrammatic representation of Embodiment 1:
  • RNA from 15 hot thyroid nodules, their surrounding tissue, 22 cold thyroid nodules, and their surrounding tissue were analyzed using TRIzol reagent (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) Manufacturer information isolated.
  • the total RNA was then purified using RNeasy its (Qiagen, Hilden, Germany) in accordance with the manufacturer's protocol.
  • the quality and quantity of the RNA were determined on an Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) using the RNA 6,000 LabChip Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • Double-stranded cDNA was synthesized from 10 ⁇ g total RNA.
  • the Superscript II reverse transcriptase (Superscript II, Life Technologies, Gaithersburg, MD USA) and an oligo-dT primer with a T7 RNA polymerase promoter sequence (Genset SA, Paris, France) were used.
  • the cDNA was then purified by phenol-chloroform extraction.
  • the cRNA synthesis was then carried out in an in vz ' tro transcription using the ENZO BioArray RNA labeling kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA).
  • the expression data of these 15 hot thyroid nodules, 22 cold thyroid nodules and their normal surrounding tissue were compared with expression data from 8 follicular carcinomas and 8 normal tissues and 8 papillary carcinomas and their surrounding tissues.
  • the data analysis was carried out in a first step using the "Significance analysis of microarrays” (SAM) method.
  • SAM Signal-Assisted Multi-Assemblys
  • This is an algorithm with the aid of which differentially expressed genes with statistically adjusted significance (in relation to the large number of genes calculated in parallel)
  • the settings of the S AM analysis were selected in such a way that a maximum of 1% false-positive genes were detected.
  • the genes whose absolute signal values were greater were identified from the resulting amount of genes in the SAM analysis were more than 200, which guarantees that these genes can be detected by real-time RT-PCR and additionally at least two-fold expression differences between the examined Entities (hot nodes, cold nodes, papillary carcinomas and follicular carcinomas) had, which should ensure that quantitative expression differences can be detected by real time RT-PCR.
  • genes that have a specific expression pattern for hot thyroid nodules were finally classified according to their specificity into genes that have a specific expression pattern for hot thyroid nodules; Genes that have a specific expression pattern for cold thyroid nodules; Genes that have a specific expression pattern for papillary carcinomas and genes that have a specific expression pattern for follicular thyroid carcinomas.
  • a tissue sample is first taken using fine needle aspiration cytology (FNAZ).
  • FNAZ fine needle aspiration cytology
  • Fine needle aspiration takes place on the patient after skin disinfection without local anesthesia using disposable cannulas with an outer diameter of 0.6 to 0.7 mm, if possible under sonographic control.
  • At least two punctures per node should be performed in different node areas in a fan-like manner. Cyst punctures should be centrifuged and heparin should be added when the cyst fluid is shipped. After emptying the cyst, another puncture of solid nodal parts should be attempted.
  • Embodiment 3 is a diagrammatic representation of Embodiment 3
  • the single-use cannulas are rinsed out thoroughly several times with the tissue sample from exemplary embodiment 2 in 1 ml of TRIzol (in 1.5 ml of Eppendorf tubes). The homogenate is then vortexed and incubated for 5 min at room temperature. Then add 200 ⁇ l chloroform. The Eppendorf tube is shaken vigorously for about 15 seconds before incubation again at room temperature (2-3 min). After the incubation step, centrifugation is carried out at 4 ° C. and 15,000 rpm for 15 min. The upper phase is then transferred to a new tube and, after adding 500 ⁇ l of isopropanol, the tube is gently swung and incubated again for 10 min at room temperature.
  • the interphase and the phenolic phase are used to extract the DNA (see exemplary embodiment 8)). This is followed by a new centrifugation for 15 min at 4 ° C and 15,000 rpm. After the supernatant has been removed, the RNA pipette with 150 ⁇ l 70 % ethanol washed and centrifuged again for 5 min at 4 ° C and 15,000 rpm. The supernatant is removed again and the RNA pellet is briefly dried at room temperature. Then it is taken up in 12 ⁇ l of water.
  • the cDNA was synthesized in a reaction mixture consisting of 11.5 ⁇ l RNA (see above), 0.5 ⁇ g random hexamer primer, 5 ⁇ first-strand buffer (250 M Tris-HCl [pH 8.3], 375 mM KC1, 15 mM MgCl 2 ) (GibcoBRL, Karlsrahe, Germany), 0.5 mM dNTPs, 5 mM DTT (GibcoBRL), 15 U Prime RNase Inhibitor (PeqLab, Er Weg, Germany), and 200 U Moloney murine leukemia viras reverse transcriptase (GibcoBRL, Düsseldorf, Germany ) for 1 hour at 37 ° C with a final heat step at 94 ° C for 5 min.
  • the cDNA obtained according to embodiment 3 is analyzed differentially by quantitative PCR as follows on a LightCycler (Röche, Mannheim, Germany):
  • cyclooxygenase-2 Homo sapiens COX-2, gene no. 67 from table 3
  • the expression of the reference gene ⁇ -actin was quantitatively analyzed in a parallel PCR approach.
  • the 20 ⁇ l reaction mixture for the detection of COX-2 is composed as follows:
  • the PCR is carried out with the following temperature profile: 95 ° C 1 min., 40 cycles: 95 ° C 0 sec, 64 ° C 7 sec, 72 ° C 13 sec.
  • the 20 ⁇ l reaction mixture for the detection of the reference gene ß-actin is composed as follows:
  • the PCR is carried out with the following temperature profile:
  • the primers were synthesized by MWG (Ebersberg, Germany).
  • the cDNA obtained according to embodiment 3 is analyzed differentially by quantitative PCR as follows on a LightCycler (Röche, Mannheim, Germany):
  • the 20 ⁇ l reaction mixture for the detection of COX-2 is composed as follows: - 2 ⁇ l LightCycler DNA Master Hybridization Probes,
  • the PCR is carried out with the following temperature profile:
  • the 20 ⁇ l reaction mixture for the detection of the reference gene ß-actin is composed as follows:
  • the PCR is carried out with the following temperature profile:
  • the primers were synthesized by MWG (Ebersberg, Germany).
  • the 5'-VIC and 3 'TAMRA labeled TaqMan probes are available from Applied Biosystems (Darmstadt, Germany).
  • a PCR is carried out in accordance with the conditions specified in Example 4.
  • the additional MgCl 2 added, the annealing temperature and the elongation time depend on this amplifying marker or reference gene and are optimized so that a melting curve with a single maximum value is detected.
  • the amplicons were examined by agarose gel electrophoresis for the correct size of the band.
  • the amplifications are generally carried out with the following temperature profile: 95 ° C. for 1 min., 40 cycles: 95 ° C. for 0 seconds, x ° C. for 7 seconds, 72 ° C. y sec.
  • x corresponds to the optimized annealing temperature for the specific gene
  • y corresponds to the elongation time of the specific amplicon.
  • a kit for performing the method according to the invention by real time PCR contains, for example, the following components for the detection of the gene Homo sapiens cyclooxygenase-2 (COX-2, gene no Reference gene ß-actin (gene No. 155 from table 5):
  • the DNA from the interphase and the organic phase is precipitated using ethanol.
  • 0.3 ml of 100% ethanol is added to the interphase and organic phase and mixed by gentle swirling.
  • the samples are then stored for 2-3 min at 15-30 ° C and then the DNA is centrifuged at 2,000 x g for 5 min at 4 ° C.
  • the DNA is washed with 1 ml of a 0.1M sodium citrate in 10% ethanol solution.
  • the DNA pellet is stored in the solution for 30 min at room temperature and then centrifuged at 2,000 x g for 5 min at 4 ° C.
  • the DNA was stored in 1.5 ml of 75% ethanol for 15-20 min at room temperature and then centrifuged at 2,000 x g for 5 min at 4 ° C. The DNA pellet is air dried and resuspended in 8mM NaOH.
  • Embodiment 9 is a diagrammatic representation of Embodiment 9:
  • a BRAF mutation screening (19) is carried out as follows with the DNA obtained according to embodiment 8:
  • the 25 ⁇ l reaction batch for the amplification of BRAF is composed as follows:
  • the PCR is carried out with the following temperature profile: 94 ° C 5 min., 40 cycles: (94 ° C 30 sec, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 60 sec), 72 ° C 5 min.
  • the PCR product is sequenced using the forward primer using the Big Dye Terminator Kit (Applied Biosystems) an ABI Prism DNA Sequencer.
  • the primers were synthesized by MWG (Ebersberg, Germany).
  • Embodiment 10 is a diagrammatic representation of Embodiment 10:
  • the 30 ⁇ l reaction batch for amplifying the rearrangement is composed as follows:
  • the PCR is carried out with the following temperature profile: 94 ° C 5 min., 40 cycles: (94 ° C 40 sec, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min), 72 ° C 5 min.
  • the PCR product is separated electrophoretically on a 1.5% agarose gel.
  • the cDNA obtained according to embodiment 3 is screened for the Ret-PTC rearrangement (18) as follows:
  • the 30 ⁇ l reaction batch for amplifying the rearrangement is composed as follows:
  • the PCR is carried out with the following temperature profile: 95 ° C 4 min., 40 cycles: (95 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec), 72 ° C 5 min.
  • the PCR product is separated electrophoretically on a 1.5% agarose gel.
  • the following abbreviations are used in the description of the invention:
  • ETS-1 Human erythroblastosis viras oncogene homolog 1
  • RNA Ribonucleic Acid mRNA Messenger RNA rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid
  • TSH thyroid stimulating hormones TSH thyroid stimulating hormones, thyrotropin
  • Salvatore, G. et al. Analysis of BRAF Point Mutation and Ret / PTC Rearrangement Refines the Fine-Needle Aspiration Diagnosis of Papillary Thyroid Carcinoma. J Clin Endocrinol Metab. 2004; 89 (10): 5175-5180.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren, insbesondere zur Unterscheidung von gutartigen Schilddrüsenknoten von Schilddrüsenkarzinomen. Das Verfahren und die Mittel kommen in der klinischen Tumordiagnostik zur Anwendung. Durch die vergleichende Untersuchung der Genexpression in Schilddrüsenkarzinomen und gutartigen Schilddrüsenknoten wurden differentiell exprimierte Gene identifiziert, deren Expression entweder in Schilddrüsenkarzinomen oder in gutartigen Schilddrüsenknoten spezifisch erhöht oder vermindert ist. Durch das erfindungsgemässe Verfahren, bei dem RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert und in der isolierten RNA eine Quantifizierung der Expression mindestens eines der differentiell exprimierten Gene erfolgt, können vorteilhaft gutartige Schilddrüsenknoten von Schilddrüsenkarzinomen unterschieden werden. Damit kann der Prozentsatz der Schilddrüsenpunktionen, bei denen nach dem Stand der Technik keine ausreichende Beurteilung möglich ist, minimiert und somit unnötige Schilddrüsenoperationen vermieden werden.

Description

Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren
Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren, insbesondere zur Unterscheidung von gutartigen nodulären Schilddrüsenveränderungen (sog. heissen und kalten Knoten) von malignen Schilddrusenkarzinomen (papilläres und follikuläres Karzinom). Das Verfahren und die Mittel kommen in der klinischen Tumordiagnostik zur Anwendung.
Die Häufigkeit nodulärer Schilddrüsenveränderungen, im folgenden Text als Schilddrusenknoten bezeichnet, liegt in Iodmangelgebieten, wie Deutschland, bei ca. 30 Prozent der adulten Bevölkerung (1). Die Diagnose eines Schilddrüsenknotens ist oft ein zufälliger Befund bei der Erhebung des klinischen Status, bzw. ein Nebenbefund bei sonographischen Untersuchungen (2;3).
Die IQassifizierung der Schilddrusenknoten beruht sowohl auf morphologischen (4), als auch auf funktioneilen Kriterien („heißer" oder „kalter" Knoten). Etwa 85% aller Schilddrusenknoten stellen sich szintigraphisch als „kalte" Knoten dar (5). Dieser Gruppe kommt in der Differentialdiagnostik nodulärer Schilddrüsenerkrankungen eine besondere Bedeutung zu, da Schilddrüsenkarzinome meist als „kalte" Knoten imponieren. Der kalte Knoten ist ein Knoten, der funktioneil inaktiv ist, d. h. weniger Schilddrüsenhormone produziert als gesundes Schilddrüsengewebe. Liegt ein kalter I noten vor, so muss abgeklärt werden, ob es sich um einen gutartigen Tumor handelt oder ein Verdacht auf ein Schilddrüsenkarzinom besteht. Das durchschnittliche Risiko für ein Schilddrüsenkarzinom ist jedoch sehr gering (1-5 % der Schilddrüsenlαioten). Die Prävalenz von Schilddrusenkarzinomen ist auch in Iodmangelgebieten nicht generell erhöht.
Zirka fünf Prozent aller Schilddrusenknoten stellen sich szintigraphisch als „heiße" Knoten (autonome Schilddrüsenadenome) dar (5). Ursache dafür sind konstitutiv aktivierende Mutationen des TSH-Rezeptors (TSHR), (bis zu 82%) und des Gs Proteins (bis zu 35%). Der heiße Knoten ist ein gutartiger Tumor, der mehr Schilddrüsenhormone produziert als gesundes Schilddrüsengewebe, dadurch entsteht eine "latente" oder "manifeste" Überfunktion. Bei diesem Knoten besteht - im Gegensatz zum kalten Knoten - kein Karzinomverdacht, er ist fast immer gutartig. Es kann ein einzelner (solitärer) autonomer Knoten vorliegen oder die Schilddrüse von vielen heißen Knoten durchsetzt sein. Das wichtigste diagnostische Verfahren zur Differenzierung gutartiger (benigner) und bösartiger (maligner) Schilddrüsenerkrankungen ist die Feinnadelaspirationszytologie (FNAZ). Mittels FNAZ können in der Regel klassische papilläre, anaplastische und medulläre Schilddrüsenkarzinome sowie Metastasen anderer Primärtumoren, gegebenenfalls in Ergänzung mit entsprechenden immunzytologischen Markern, präoperativ diagnostiziert werden (6;7). Qualität beziehungsweise Aussagekraft der FNAZ sind entscheidend von der Erfahrung des Punktierenden und des beurteilenden Zytopathologen abhängig: Bei einem sehr erfahrenen Team können mittels FNAZ eine sehr hohe Präzision (85 bis 100 %), Spezifität (72-100 %) und Sensitivität (55-98 %) bei der Differentialdiagnose von Schilddrusenknoten (noduläre Schilddrüsenerkrankungen) erreicht werden. Allerdings zeigen Ergebnisse der bislang umfangreichsten FNAZrStudie bei 15.000 Patienten, die über einen Zeitraum von 16 Jahren an der Mayo Clinic wegen nodulärer Schilddrüsenerkrankungen behandelt wurden, daß auch bei geübten Untersuchern in bis zu 32 % der punktierten Schilddrusenknoten keine ausreichende zytologische Beurteilung möglich ist (7). Hierfür sind einerseits nicht verwertbare (bis zu 21 %), andererseits „suspekte" Punktate (etwa 10 %) verantwortlich (6- 11). Bei der letzteren Gruppe liegt meist der problematische Befund einer follikulären Neoplasie vor. Unter dieser, derzeit nicht weiter differenzierbaren, zytologischen Gruppendiagnose werden follikuläre Adenome, follikuläre Karzinome sowie die follikuläre und oxyphile Variante des papillären Schilddrüsenkarzinoms zusammengefaßt. In Ermangelung geeigneter differentialdiagnostischer Marker für die follikuläre Neoplasie gilt diese bislang als Indikation zur Knotenresektion, obwohl nur in maximal 20 bis 25 % der Fälle tatsächlich ein Karzinom vorliegt (7).
Bisher sind für differenzierte Schilddrüsenkarzinome folgende molekulare Ursachen bekannt: Ret-Rearrangements werden in ca. 20% der papillären Schilddrüsenkarzinome gefunden (16). PAX8-PPARγ-Rearrangements wurden kürzlich in follikulären Schilddrusenkarzinomen nachgewiesen. Sie treten nicht in papillären Schilddrusenkarzinomen auf, wurden jedoch auch in gutartigen Schilddrüsenadenomen gefunden (12, 18).
Die bisherigen präoperativen Selektions verfahren führen zu einer histologischen Karzinomrate bei Schilddrüsenoperationen wegen Schilddrusenknoten von 5 bis maximal 30 %. Demzufolge sind über 70 % der derzeitig wegen Karzinomverdacht in Schilddrusenknoten durchgeführten Operationen eigentlich unnötig. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Mittel zur Diagnose von nodulären Schilddrüsenerkxankungen anzugeben, insbesondere zur differentiellen Diagnose von gutartigen Schilddrusenknoten („heisse" und „kalte" Knoten) gegenüber malignen Schilddrusenkarzinomen, insbesondere gegenüber den follikulären und papillären S childdrüsenkarzinomen.
Die Erfindung beruht auf wissenschaftlichen Untersuchungen zur differentiellen Genexpression in gutartigen kalten und heißen Schilddrusenknoten im Vergleich zu den jeweiligen korrespondierenden, gesunden Umgebungsgeweben und dem nachfolgenden Vergleich dieser Daten mit den entsprechenden Genexpressionsdaten von Schilddrusenkarzinomen. Die erfindungsgemäß in gutartigen und bösartigen Schilddrüsentumoren unterschiedlich exprimierten Gene werden als Marker zur Differentialdiagnose von Schilddrüsentumoren herangezogen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und Mittel zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren, insbesondere zur Unterscheidung von gutartigen Schilddrusenknoten von Schilddrusenkarzinomen anzugeben. Bösartige Tumore die mit der Erfindung diagnostiziert werden sollen sind insbesondere follikuläre und papilläre Schilddrüsenkarzinome.
Die Erfindung beruht auf wissenschaftlichen Untersuchungen zur differentiellen Genexpression in gutartigen kalten und heißen Schilddrusenknoten im Vergleich zu den jeweiligen korrespondierenden, gesunden Umgebungsgeweben und dem anschliessenden Vergleich dieser Daten mit Expressionsdaten in papillären und follikulären Schilddrusenkarzinomen. Die Untersuchung der differentiellen Genexpression von ca. 10.000 Genen erfolgte mit Hilfe hochdichter Genexpressionsarrays (Affymetrix GeneChips U95Av2, Affymetrix; Santa Clara, CA, USA). Durch den Vergleich der Expressionsdaten in den Schildrüsenknoten bzw. Karzinomen mit den Daten der gesunden Umgebungsgewebe erfolgte eine Normalisierung, die es ermöglichte, Expressionsunterschiede von Genen zwischen den unterschiedlichen Pathologien festzustellen. Die erfindungsgemäß in gutartigen und bösartigen Schilddrüsentumoren unterschiedlich exprimierten Gene werden als Marker zur differentialen Diagnose von Schilddrüsentumoren herangezogen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen Tumoren gegenüber bösartigen Tumoren bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der m?RNA-Trans?kripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 153 erfolgt, wobei a.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 1 bis 3, 5 bis 8, 11, 13 bis 15 und 19 bis 22 sowie der Gene 23 bis 27 und 33 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert, b.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 4, 9, 10, 12, 16 bis 18 sowie der Gene 28 bis 32, 34 und 35 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert, c.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 45, 47 bis 52, 54 bis 62, 64 bis 68, 70, 71, 74, 75, 77 bis 85, 87, 89, 91 bis 94, 101 bis 107, 110, 112 bis 115, 118, 119, 121 bis 125, 130, 131 sowie der Gene Nr. 133 und 134 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert, d.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 2, 13, 15, 22, 33, 42, 46, 53, 63, 69, 72, 73, 76, 86, 88, 90, 95 bis 100, 108, 109, 111, 116, 117, 120, 126 bis 129, 132 sowie der Gene Nr. 8 und 135 bis 153 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert. In bevorzugten Ausfuhrungsformen des Verfahrens erfolgt eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens zwei, drei, vier oder fünf Genen ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen, in weiteren bevorzugten Ausführungsfomien werden die mRNA-Transkripte von mindestens 10 bzw. mindestens 15 Genen analysiert um die Aussagekraft weiter zu verbessern.
Die in den Tabellen 1 bis Tabelle 4 aufgeführten Gene sind fortlaufend nummeriert (Gen- Nummer). Zur eindeutigen Identifizierung der Gene sind jeweils die Veröffentlichungsnummer des zugehörigen Genbank-Eintrags in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene) und die Identifikationsnummer des Affymetrix-Chips (ProbeSet-ID) angeben. Unter „ProbeSet-ID" ist in den Tabellen die von Affymetrix standardisierte Bezeichnung einer Gruppe von 16 - 20 Proben, die auf dem Affymetrix-Chip immobilisiert sind, angegeben, mit der das jeweilige Gen hybridisiert und die zum Nachweis eines spezifischen Transkripts dienen. Der gebräuchlichste Name des jeweiligen Gens ist ebenfalls angegeben.
In den Tabellen 1 bis 4 sind die SLR- Werte der Gene in den jeweiligen Geweben (Spalten „Expression in HK" (heißen Knoten), „Expression in KK" (kalten Knoten), „Expression in PTC" (papilläres Karzinom), „Expression in FTC" (follikuläres Karzinom)) aufgeführt. Der SLR (signal log ratio) wurde folgendermassen aus den der Erfindung zugrundeliegenden Expressionsdaten bestimmt: „ . signaUTumorgewebe) _ signallogratw = log2 - — , (Formel 1) signal(Umgebungsgewebe)
Ein Signal log ratio (SLR)- Wert von 1 entspricht somit einer 2fach höheren Expression des Gens im jeweiligen Tumorgewebe im Vergleich zum normalen Umgebungsgewebe, ein SLR- Wert von 2 entspricht einer 4fach höheren Expression im Vergleich zum Umgebungsgewebe. Ein negativer SLR- Wert entspricht einer verminderten Expression im jeweiligen Tumorgewebe im Vergleich zum normalen Umgebungsgewebe. So entspricht ein SLR- Wert von -1 einer im Tumorgewebe im Vergleich zum normalen Gewebe um die Hälfte verringerten Expression. Ein SLR- Wert von -2 entspricht einer auf ein Viertel der Expression im Normalgewebe verringerten Expression. Die SLR-Werte werden in den Figuren 1 bis 4 in Balkendiagrammen dargestellt. In den Figuren 1 bis 4 ist als „mean HK" der Mittelwert der „signal log ratio" für heiße Knoten angegeben (HK als Tumorgewebe, UGHK als Umgebungsgewebe in Formel 1). Entsprechend erhaltene Werte für die gutartigen kalten Schilddrusenknoten (KK), papillären Schilddrüsenkarzinome (PTC) und follikulären Schilddrüsenkarzinome (FTC) sind als „mean KK", „mean PTC" bzw. „mean FTC" angegeben. Die Nummern über bzw. unter den Balken entsprechen den Gen-Nummern aus den Tabellen 1 bis 4.
In Tabelle 1 sind die Gene aufgelistet, deren Expression in gutartigen heißen Schilddrusenknoten im Mittel gegenüber ihrer Expression in normalem Umgebungsgewebe, gegenüber ihrer Expression in kalten Knoten und gegenüber ihrer Expression in Schilddrusenkarzinomen (papilläres und follikuläres Schilddrüsenkarzinom) mindestens doppelt so hoch oder mindestens um die Hälfte vermindert ist.
Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen heißen Knoten gegenüber gutartigen kalten Knoten, bösartigen follikulären Karzinomen und bösartigen papillären Karzinomen, bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 1 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 22 erfolgt,
3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 1 bis 3, 5 bis 8, 11, 13 bis 15 und 19 bis 22 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 4, 9, 10, 12 und 16 bis 18 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen heißen Knotens liefert.
In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens erfolgt eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens zwei, drei, vier oder fünf Genen ausgewählt aus den in Tabelle 1 aufgeführten Genen, in weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die mRNA-Transkripte von mindestens 10 bzw. mindestens 15 Genen analysiert, um die Aussagekraft zu verbessern.
Die in Tabelle 1 zusammengefassten differentiellen Expressionswerte werden nachfolgend anhand der Gene Gen Nr. 2 (type I 5 iodothyronine deiodinase) und Gen Nr. 4 (single- stranded-DNA-binding protein) näher erläutert:
Gen Nr. 2 (type I 5 iodothyronine deiodinase, NMJ300792, Proben-Set-ID 31966_at) weist eine SLR von 2.0 in heißen Knoten (HK) im Vergleich zu den normalen Umgebungsgeweben heißer Knoten auf, das entspricht einer 4fach höheren Expression in den HK im Vergleich zum Umgebungsgewebe heißer Knoten (UGHK)- In kalten Knoten (KK) beträgt die SLR 0.8 im Vergleich zu den normalen Umgebungsgeweben kalter Knoten (UGKK). Das entspricht einer 1.2fach höheren Expression in den ?KK im Vergleich zu UGKK- Im Vergleich der papillären Karzinome (PTC) zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR -3.8, das entspricht einer 0.07fachen Expression, d. h. einer um ca. Faktor 14 verminderten Expression in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben (UGpTc). In follikulären Karzinomen (FTC) beträgt die SLR -0.8 im Vergleich zu den normalen Umgebungsgeweben follikulärer Karzinome (UGFTC)- Das entspricht einer 0.6fachen Expression, d.h. einer um ca. Faktor 1.7 verminderten Expression ind den FTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben.
Folglich ist Gen Nr. 2 (type 1 5 iodothyronine deiodinase) in Heißen Knoten gegenüber Kalten Knoten und gegenüber follikulären und papillären Schilddrusenkarzinomen spezifisch überexprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von heißen Schilddrusenknoten dar.
In PTC ist die type I 5 iodothyronine deiodinase spezifisch vermindert exprimiert. Sie stellt daher auch einen spezifischen Marker zur Diagnose von Schilddrusenkarzinomen, insbesondere zur Diagnose von papillären Schilddrüsenlcarzmomen dar und ist nochmals in Tabelle 3 aufgeführt.
Gen Nr. 4 (single-stranded-DNA-binding protein, NM_012446, Proben-Set-ID 32668_at) weißt eine SLR von -0.9 in HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben (UGHK ) auf, das entspricht einer 0.53 fachen Expression in den HK, d. h. einer um ca. Faktor 1.9 verminderten Expression, in den HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben (UGHK)- In kalten Knoten (KK) beträgt die SLR 0.3 im Vergleich zu deren Umgebungsgewebe, das entspricht einer 1.23fachen Expression in den IOC im Vergleich zu den korrespondierenden Umgebungsgeweben. Im Vergleich der papillären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 0.8, das entspricht einer 1.74fachen Expression in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 0.0, das entspricht einer unveränderten Expression.
Folglich ist Gen Nr. 4 in HK spezifisch vermindert exprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von heißen Schilddrusenknoten dar.
Fig. 1 zeigt die differentielle Expression der Gene 1 bis 22 aus Tabelle 1, die als spezifische Marker für heiße Schilddrusenknoten fungieren, in einem Balkendiagramm. Die Nummern über bzw. unter den Balken entsprechen den Gen-Nummern aus Tabelle 1.
In Tabelle 2 sind die Gene aufgelistet, deren Expression in gutartigen kalten Schilddrusenknoten im Mittel gegenüber ihrer Expression in normalem Umgebungsgewebe, gegenüber ihrer Expression in heißen Knoten und gegenüber ihrer Expression in Schilddrusenkarzinomen (papilläres und follikuläres Schilddrüsenkarzinom) mindestens doppelt so hoch oder mindestens um die Hälfte vermindert ist.
Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen kalten Knoten gegenüber gutartigen heissen Knoten, bösartigen follikulären Karzinomen und bösartigen papillären Karzinomen, bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 2 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 23 bis 35 erfolgt,
3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 23 bis 27 und 33 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene 28 bis 32, 34 und 35 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen kalten Knotens liefert. In bevorzugten Ausfuhrungsformen des Verfahrens erfolgt eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens zwei, drei, vier oder fünf Genen ausgewählt aus den in Tabelle 2 aufgeführten Genen, in weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die mRNA-Transkripte von mindestens 10 bzw. mindestens 15 Genen analysiert, um die Aussagekraft zu verbessern.
Die in Tabelle 2 zusammengefaßten differentiellen Expressionswerte werden nachfolgend anhand der Gene Nr. 23 (fibroblast growth factor 7) und Nr. 29 (chromosome 21 open reading frame 5) näher erläutert:
Gen Nr. 23 (fibroblast growth factor 7, NM_002009, Proben-Set-ID 1466_s_at) weist eine SLR von -1.2 in HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben auf, das entspricht einer 0.44fachen Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 1.3, das entspricht einer 2.46fachen Expression in den ICK im Vergleich zu den korrespondierenden Umgebungsgeweben. Im Vergleich der papillären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR -0.8, das entspricht einer 0.57fachen Expression in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR -3.0, das entspricht einer 0.125fachen Expression in den FTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben.
Folglich ist Gen Nr. 23 (fibroblast growth factor 7) in KK gegenüber HK, FTC und PTC spezifisch überexprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von kalten Schilddrusenknoten dar.
Gen Nr. 29 (chromosome 21 open reading frame 5, NM_005128, Proben-Set-ID 37827_r_at) weißt eine SLR von 0.5 in HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben (UHK) auf, das entspricht einer 1.41 fachen Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR -0.9 , das entspricht einer 0.54fachen Expression in den KK im Vergleich zu den korrespondierenden Umgebungsgeweben. Im Vergleich der papillären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 0.8, das entspricht einer 1.74fachen Expression in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR -0.1, das entspricht einer 0.93fachen Expression in den FTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweb en. Folglich ist Gen Nr. 29 (chromosome 21 open reading frame 5) in KK gegenüber HK, FTC und PTC vermindert exprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von kalten Schilddrusenknoten dar.
Fig. 2 zeigt die differentielle Expression der Gene 23 bis 35 aus Tabelle 2, die als spezifische Marker für kalte Schilddrusenknoten fungieren, in einem Balkendiagramm. Die Nummern über bzw. unter den Balken entsprechen den Gen-Nummern aus Tabelle 2.
In Tabelle 3 sind die Gene aufgelistet, deren Expression in bösartigen papillären Schilddrusenkarzinomen im Mittel gegenüber ihrer Expression in normalem Umgebungsgewebe, gegenüber ihrer Expression in follikulären Schilddrusenkarzinomen und gegenüber ihrer Expression in gutartigen Schilddrüsentumoren (heiße Knoten und kalte Knoten) mindestens doppelt so hoch oder mindestens um die Hälfte vermindert ist.
Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von bösartigen papillären Karzinomen gegenüber gutartigen heißen Knoten, gutartigen kalten Knoten und bösartigen follikulären Karzinomen, bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 3 aufgeführten Genen erfolgt,
3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 45, 47 bis 52, 54 bis 62, 64 bis 68, 70, 71, 74, 75, 77 bis 83, 85, 87, 89, 91 bis 94, 101 bis 107, 110, 112 bis 115, 118, 119, 121 bis 125, 130, 131 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 2, 15, 46, 63, 69, 88, 95 bis 97, 108, 109, 111, 120, 126 bis 129 und 132 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen papillären Schilddrüsenkarzinoms liefert. In bevorzugten Ausfuhrungsformen des Verfahrens erfolgt eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens zwei, drei, vier oder fünf Genen ausgewählt aus den in Tabelle 3 aufgeführten Genen, in weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die mRNA-Transkripte von mindestens 10 bzw. mindestens 15 Genen analysiert, um die Aussagekraft zu verbessern.
Die in Tabelle 3 zusammengefassten differentiellen Expressionswerte werden nachfolgend anhand der Gene Nr. 36 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1) und Nr. 42 (homogentisate 1 2-dioxygenase) näher erläutert:
Gen Nr. 36 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1, NM_003254, Proben-Set-ID 1693_s_at) weist eine SLR von 0.0 in HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben auf, das entspricht einer unveränderten Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR -0.7, das entspricht einer 0.62fachen Expression in den KK im Vergleich zu den korrespondierenden Umgebungsgeweben. Im Vergleich der papillären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 2.9, das entspricht einer 7.46fachen Expression in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 0.0, das entspricht einer unveränderten Expression in den FTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben.
Folglich ist Gen Nr. 36 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1) in PTC gegenüber HK, KK und FTC spezifisch überexprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von Schilddrusenkarzinomen, insbesondere zur Diagnose von papillären Schilddrusenkarzinomen dar.
Gen Nr. 42 (homogentisate 1 2-dioxygenase, NM_000187, Proben-Set-ID 31844_at) weist eine SLR von 1.3 in HK im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben auf, das entspricht einer 2.46fachen Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR 0.8, das entspricht einer 1.74fachen Expression in den KK im Vergleich zu den korrespondierenden Umgebungsgeweben. Im Vergleich der papillären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR -3.4, das entspricht einer 0.09fachen Expression d. h. einer um ca. Faktor 10.5 verminderten Expression, in den PTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu deren Umgebungsgewebe beträgt die SLR -3.3, das entspricht einer 0.1 fachen Expression d. h. einer um ca. Faktor 10 verminderten Expression in den FTCs im Vergleich zu deren Umgebungsgeweben.
Folglich ist Gen Nr. 42 (homogentisate 1 2-dioxygenase) in PTC und FTC (s. Tabelle 4) gegenüber HK und KK spezifisch vermindert exprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von Schilddrusenkarzinomen dar.
Fig. 3 zeigt die differentielle Expression der Gene 2, 13, 15, 16, 22, 32, 33 und 36 bis 132 aus Tabelle 3, die als spezifische Marker für papilläres Schilddrüsenkarzinom fungieren, in einem Balkendiagramm. Die Nummern über bzw. unter den Balken entsprechen den Gen-Nummern aus Tabelle 3.
In Tabelle 4 sind die Gene aufgelistet, deren Expression in bösartigen follikulären Schilddrusenkarzinomen im Mittel gegenüber ihrer Expression in normalem Umgebungsgewebe, gegenüber ihrer Expression in papillären Schilddrusenkarzinomen und gegenüber ihrer Expression in gutartigen Schilddrüsentumoren (heiße Knoten und kalte Knoten) mindestens doppelt so hoch oder mindestens um die Hälfte vermindert ist. Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von bösartigen follikulären Karzinomen gegenüber gutartigen heißen Knoten, gutartigen kalten Knoten und bösartigen papillären Karzinomen, bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 4 aufgeführten Genen erfolgt,
3.) eine erhöhte Menge an Transkxipten der Gene Nr. 133 und 134 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 8 und 135 bis 153 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen follikulären Schilddrüsenkarzinoms liefert. In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens erfolgt eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte von mindestens zwei, drei, vier oder fünf Genen ausgewählt aus den in Tabelle 4 aufgeführten Genen, in weiteren bevorzugten Ausf hrungsformen werden die mRNA-Transkripte von mindestens 10 bzw. mindestens 15 Genen analysiert, um die Aussagekraft zu verbessern.
Die in Tabelle 4 zusammengefaßten differentiellen Expressionswerte werden nachfolgend anhand der Gene Nr. 133 (UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4- galactosyltransferase) und Nr. 138 (BENE protein) näher erläutert:
Gen Nr. 133 (UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4- galactosyltransferase, NM_001497, Proben- Set-ID 40960_at) weist eine SLR von 0.1 in HK im Vergleich zu den Umgebungsgeweben auf, das entspricht einer 1,1 -Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR -0.3, das entspricht einer 0,8fachen Expression in den KK im Vergleich zu den Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR 2.0, das entspricht einer 4-fachen Expression in den FTC im Vergleich zu den Umgebungsgeweben und im Vergleich der papillären Karzinome zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR 0.0, das entspricht einer unveränderten Expression in den PTC im Vergleich zu den Umgebungsgeweben.
Folglich ist Gen Nr. 133 in FTC spezifisch gegenüber HK, KK und PTC überexprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von follikulären Schilddrusenkarzinomen dar.
Gen Nr. 138 (BENE protein, NM_005434, Proben-Set-ID 33331_at) weist eine SLR von 0.7 in HK im Vergleich zu den Umgebungsgeweben auf, das entspricht einer 1,62-fachen Expression in den HK. Im Vergleich kalte Knoten zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR 1.0, das entspricht einer 2-fachen Expression in den KK im Vergleich zu den Umgebungsgeweben. Im Vergleich der follikulären Karzinome zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR -1.6, das entspricht einer 0,33-fachen Expression in den FTC im Vergleich zu den Umgebungsgeweben und im Vergleich der papillären Karzinome zu den Umgebungsgeweben beträgt die SLR 1.3, das entspricht einer 2,46-fachen Expression in den PTC im Vergleich zu den Umgebungsgeweben. Folglich ist Gen Nr. 138 in FTC gegenüber HK, KK und PTC spezifisch vermindert exprimiert und stellt daher einen spezifischen Marker zur Diagnose von follikulären Schilddrusenkarzinomen dar.
Fig. 4 zeigt die differentielle Expression der Gene 8, 13, 22, 33, 42, 53, 72, 73, 76, 84, 86, 90, 98, 99, 100, 116, 117 und 133 bis 153 aus Tabelle 4, die als spezifische Marker für follikuläres Schilddrüsenkarzinom fungieren, in einem Balkendiagramm. Die Nummern über bzw. unter den Balken entsprechen den Gen-Nummern aus Tabelle 4.
Die Unterscheidung von gutartigen Tumoren gegenüber bösartigen Karzinomen erfolgt vorzugsweise, indem in der isolierten RNA zusätzlich eine quantitative Bestimmung der Transkripte eines Referenzgens erfolgt. Die Expression des Referenzgenes dient als interner Standard. Der ermittelte Wert für die m?RNA-Expression des tumorspezifischen Genes wird bevorzugt durch den ermittelten Wert für die Expression des Referenzgens geteilt. Aus der Höhe des so erhaltenen Quotienten können dann Rückschlüsse auf den Grad der Malignität des Tumors getroffen werden.
Das Referenzgen ist ein Gen, welches in gesundem Schilddrüsengewebe sowie in gutartigen und bösartigen Tumoren der Schilddrüse in gleicher Höhe exprimiert wird. Bevorzugte Referenzgene werden in Tabelle Nr. 5 angegeben.
Vorteilhaft ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine verbesserte Unterscheidung von gutartigen kalten Schilddrusenknoten von bösartigen Schilddrusenkarzinomen anhand der Quantifizierung der oben genannten Gene in einer äußerst kleinen Probe von Schilddrüsengewebe, insbesondere in FNAZ-Material, möglich. Durch die Quantifizierung dieser Gene kann der Prozentsatz der Schilddrüsenpunktionen, bei denen nach dem Stand der Technik keine ausreichende Beurteilung möglich ist, minimiert werden. Somit können unnötige Schilddrüsenoperationen vermieden werden.
Der Vergleich der Meßwerte mit Referenzbereichen, die für die unterschiedlichen benignen und malignen Schilddrüsenerkrankungen erstellt werden, gestattet somit eine Unterscheidung zwischen gutartigen (benignen) und bösartigen (malignen) Schilddrusenknoten. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 2 (spezifische Gene für gutartige kalte Knoten) aufgeführten Genen und mindestens eines Genes ausgewählt aus den in den Tabellen 3 und 4 aufgeführten Genen bestimmt, wobei a.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 23 bis 27 und 33 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert, b.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 28 bis 32, 34 und 35 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert, c.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 45, 47 bis 52, 54 bis 62, 64 bis 68, 70, 71, 74, 75, 77 bis 85, 87, 89, 91 bis 94, 101 bis 107, 110, 112 bis 115, 118, 119, 121 bis 125, 130, 131 sowie der Gene Nr. 133 und 134 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert, d.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 2, 13, 15, 22, 33, 42, 46, 53, 63, 69, 72, 73, 76, 86, 88, 90, 95 bis 100, 108, 109, 111, 116, 117, 120, 126 bis 129, 132 sowie der Gene Nr. 8 und 135 bis 153 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert e.) und wobei zusätzlich ein Referenzgen in der Gewebeprobe gemessen wird.
In alternativen Ausfülrrungsformen des Verfahrens wird, um die Aussagefähigkeit des Verfahrens weiter zu verbessern, zusätzlich die Expression mindestens eines Gens aus der Gruppe der Gene spezifisch für heiße Knoten aus der Tabelle 1 und/oder weiterer Gene aus den Tabellen 2, 3 und 4 gemessen. Die Entnahme der Gewebeprobe erfolgt vorzugsweise per Punktion der Schilddrüse bzw. Feinnadelaspirationszytologie (FNAZ). Aus der Gewebeprobe wird in bekannter Weise RNA isoliert (14).
Bevorzugt erfolgt die quantitative Messung der mRNA-Genexpression mittels quantitativer RT-PCR. In dem bekannten Prozess der RT-PCR wird zunächst mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) basierend auf der isolierten RNA komplementäre DNA (cDNA) synthetisiert. Als Primer für die RT kann grundsätzlich ein Oligo-dT verwendet werden. Die Verwendung von Random-Hexamer -Primern für die RT führte jedoch erfindungsgemäß zu einer deutlichen Erhöhung der Sensitivität (mind. Faktor 4). Das Random-Hexamer- OligonuMeotid enthält jeweils eine Mischung von A, G, T, C an allen sechs Positionen und hybrisiert unspezifisch mit mRNA-Sequenzen.
Einzelne cDNAs werden in der anschließenden PCR mit einem sequenzspezifischen Primerpaar amplifiziert. Die Primer für die PCR haben bevorzugt eine Länge von 15 bis 30 Basenpaaren und werden Intron-überlappend konzipiert, um im Falle einer Verunreinigung der RNA mit genomischer DNA nur cDNA zu amplifizieren.
Besonders bevorzugt wird die PCR als Real-time-PCR durchgeführt. Bekannte Real-time PCR Verfahren sind z. B. die TaqMan®, FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), LightCycler® und Beacon- Verfahren. Durch die Verwendung von Fluoreszenz-markierten Primern oder dem Einsatz von genspezifischen Oligonukleotiden als Hybridisierungsproben mit unterschiedlichen Farbstoff- oder Fluoreszenzmarker-Anbindung (TaqMan®, FRET, Beacon) kann bei diesen Verfahren vorteilhaft das PCR-Produkt während der PCR spezifisch quantifiziert werden.
In einer besonderen Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt zusätzlich ein Nachweis von Pax8/PPARγ- und/oder Ret/PTC-Rearrangements und/oder von BRAF- Mutationen bevorzugt ebenfalls mittels PCR, besonders bevorzugt nach den von Cheung CC et al (17) für die Pax8/PPARγ~ und von Nikiforova MN (18) für die Ret/PTC-Rearrangements und von Salvatore G et al. (19) für die BRAF-Mutationen beschriebenen Verfahren.
Beim Screening auf das Pax8-PPARγ-Rearrangement (17) wird das Auftreten eines Rearrangements zwischen dem Pax8- und rlem PPARγ-Gen, das in einem Teil der follikulären Schilddrüsenkarzinome nachgewiesen wurde, analysiert. Dieses Rearrangement stellt daher einen zusätzlichen diagnostischen Marker für follikuläre Schilddrüsenkarzinome dar.
Beim Screening auf das Ret-PTC-Rearrangement (18) wird das Auftreten der häufigsten Rearrangements zwischen der zytoplasmatischen Domäne des ret-Protoonkogens mit ubiquitär in der Schilddrüse exprimierten Promotoren (Ret/PTCl: H4 und Ret/PTC3: elel) analysiert. Diese Rearrangements wurden in einem Teil der papillären Schilddrüsenkarzinome nachgewiesen und stellen daher einen zusätzlichen diagnostischen Marker für papilläre Schilddrüsenkarzinome dar.
Beim BRAF-Mutationsscreening (19) wird die Basensequenz des in 45 % der papillären Schilddrusenkarzinomen mutierten Genes BRAF (V600E) (Homo sapiens BRAF) Marker analysiert. Eine BRAF-Mutation stellt daher einen zusätzlichen diagnostischen Marker für papilläre Schilddrüsenkarzinome dar.
Durch die Analyse dieser zusätzlichen diagnostischen Marker kann die Aussagekraft des erfindungsgemäßen Verfahrens über die Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen Schilddrüsentumoren noch weiter erhöht werden.
Durch die Messung eines solchen zusätzlichen Markers kann die Aussagekraft des erfindungsgemäßen Verfahrens über die Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen Schilddrüsentumoren noch weiter erhöht werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur differentiellen Diagnose mittels RT-PCR wird bevorzugt ein diagnostischer Kit verwendet, der jeweils folgende Bestandteile enthält: 1) für die cDNA-Synthese: a) Random-Hexamer-Primer, b) Reverse Transkriptase; 2) für die PCR: c) mindestens zwei Primer, die mit der cDNA eines der Gene ausgewählt aus den Gruppen der tumorspezifischen Gene aus den Tabellen 1, 2, 3 und 4 hybridisieren; d) mindestens zwei Primer, die mit der cDNA eines Referenzgens, bevorzugt ausgewählt aus der in der Tabelle 5 angegebenen Gruppe der Referenzgene, hybridisieren, e) eine über 80°C beständige DNA-Polymerase, wie z. B. taq-Polymerase; sowie dNTP-Mix (bevorzugt lOmM), DDT, RNase-Inhibitor und entsprechende Reaktionspuffer.
In einer weniger bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit für die cDNA-Synthese oligo- dT anstelle des Random-Hexamers.
Beispiele für Primerpaare, welche die spezifische Amplifizierang der Gene Nr. 66 und 67 sowie 154 bis 157 ermöglichen, sind in den SEQ ID no 1 bis 12 angegeben.
In einer Ausführungsform des Kits ist jeweils einer der Primer aus 2)c) (für das tumorspezifische Gen) und 2)d) (für das Referenzgen) Fluoreszenz-markiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der diagnostische Kit zur Durchführung einer Real-Time PCR bevorzugt als zusätzliche Bestandteile: f) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenzmarkierter Hybridisierangssonden, die spezifisch mit dem tumorspezifischen Gen aus Tabelle 1, 2, 3 oder 4 hybridisieren, und g) eine Fluoreszenz-marlάerte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenzmarkierter Hybridisierangssonden, die spezifisch mit dem Referenzgen aus Tabelle 5 hybridisieren.
Sowohl als Primer, als auch als Hybridisierangssonden werden bevorzugt DNA- Oligonukleotide mit einer Länge von 10 bis 30 Nukleotiden gewählt. In einer Ausführungsform enthält die Hybridisierungssonde neben dem Fluoreszenzfarbstoff einen weiteren Farbstoff, der durch einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) die Fluoreszenz quencht, solange die Probe nicht mit der amplifizierten cDNA hybridisiert. In einer alternativen Ausführangsform des Kits werden zwei Hybridisierangssonden eingesetzt, bei denen jeweils eine Sonde mit einem Farbstoff markiert ist. Ein solches Sondenpaar wird so gewählt, dass sie in einem geringen Abstand, bevorzugt im Abstand von 1-5 bp, auf der amplifizierten cDNA hybridisieren. Durch die Hybridisierung werden die Fluoreszenzfarbstoffe so nahe zueinander gebracht, dass FRET stattfindet und die cDNA quantifiziert werden kann. Anschließend werden (in der Extensionsphase der PCR), durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase, die Sonden von der cDNA abgetrennt. In einer bevorzugten Variante ist in einem Sondenpaar, die erste Sonde am 3 '-Ende mit Fluorescein (FL) und die andere an ihrem 5 '-Ende mit LightCycler-Red-640 markiert.
Fluoreszenz-markierte Hybridisierangssonden sind z. B. als LightCycler®, TaqMan® oder „molecular beacons" auf dem Markt und ermöglichen eine Quantifizierung während der PCR.
Beispiele für Hybridisierangssonden, welche die spezifische Erkennung von cDNA der Gene Nr. 67, 154, 155 und 157 ermöglichen, sind in den SEQ ID no 13 bis 20 angegeben. Die Sequenzen gemäß SEQ ID no 13 und 14, 15 und 16, sowie 17 und 18 können jeweils als Sondenpaar eingesetzt werden, da sie in einem geringen Abstand, bevorzugt im Abstand von 1 bis 5 bp, auf der amplifizierten cDNA hybridisieren.
Dazu sind die SEQ ID No. 13, 15 und 17 vorzugsweise am 3 '-Ende mit Fluorescein (FL) und die SEQ ID No. 14, 16 und 18 an ihrem 5'-Ende mit LightCycler-Red-640 markiert und ermöglichen die Quantifizierung nach dem LightCycler®-Verfahren.
Die 3 '-Hydroxylgruppe der SEQ ID No. 14, 16 und 18 ist dazu vorzugsweise mit einer Phosphatgruppe gegen die nicht erwünschte Extension durch die Polymerase blockiert. Nach der Hybridisierang bleibt zwischen den beiden Sonden ein Abstand von einer bis fünf Basen, damit die Farbstoffe nicht kollidieren.
Die Sonde für Gen Nr. 67 (COX-2) gemäß SEQ ID No. 19 und für Gen Nr. 155 (ß- Aktin) gemäß SEQ ID No. 20 ist vorzugsweise am 5'-Ende mit VIC und am 3' Ende mit TAMRA- 3' markiert und ermöglicht die Quantifizierung nach dem TaqMan®- Verfahren. Für eine Multiplex-PCR unterscheiden sich die Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen die Primer bzw. Hybridisierangssonden markiert sind, in ihren Absorptions- und/oder Emissionsspektren. Dies ermöglicht eine parallele Quantifizierung der amplifizierten cDNA des tumorspezifischen Gens und der cDNA des Referenzgens.
Durch nachfolgende Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung und die der Erfindung zugrunde liegende wissenschaftlicher Erkenntnis näher erläutert:
Dabei zeigen
Fig. 1 Mittelwert ± SEM (SEM = Standardfehler des Mittelwertes) der „signal log ratio" der Gene 1 bis 22 aus Tabelle 1 in heißen Schilddrusenknoten, gutartigen kalten Schilddrusenknoten sowie papillären und follikulären Schilddrusenkarzinomen jeweils im Verhältnis zu der Expression im korrespondierenden Umgebungsgewebe.
Fig. 2 Mittelwert ± SEM (SEM = Standardfehler des Mittelwertes) der „signal log ratio" der Gene 23 bis 35 aus Tabelle 2 in heißen Schilddrusenknoten, gutartigen kalten Schilddrusenknoten sowie papillären und follikulären Schilddrusenkarzinomen jeweils im Verhältnis zu der Expression im korrespondierenden Umgebungsgewebe.
Fig 3 Mittelwert + SEM (SEM = Standardfehler des Mittelwertes) der „signal log ratio" der Gene 2, 13, 15, 16, 22, 32, 33 und 36 bis 132 aus Tabelle 3 in heißen Schilddrusenknoten, gutartigen kalten Schilddrusenknoten sowie papillären und follikulären Schilddrusenkarzinomen jeweils im Verhältnis zu der Expression im korrespondierenden Umgebungsgewebe.
Fig. 4 Mittelwert ± SEM (SEM = Standardfehler des Mittelwertes) der „signal log ratio" der Gene 8, 13, 22, 33, 42, 53, 72, 73, 76, 84, 86, 90, 98, 99, 100, 116, 117 und 133 bis 153 aus Tabelle 4 in heißen Schilddrusenknoten, gutartigen kalten Schilddrusenknoten sowie papillären und follikulären Schilddrusenkarzinomen jeweils im Verhältnis zu der Expression im korrespondierenden Umgebungsgewebe.
Ausftihrungsbeispiel 1:
Untersuchung der differentiellen Genexpression mit Affymetrix GeneChips U95Av2 (Affymetrix; Santa Clara, CA, USA):
Zunächst wurde dazu Total-RNA aus 15 heißen Schilddrusenknoten, deren Umgebungsgewebe, 22 kalten Schilddrusenknoten, sowie deren Umgebungsgewebe mittels TRIzol-Reagenz (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) entsprechend der Herstellerangäben isoliert. Anschließend wurde die Total-RNA mit Hilfe des RNeasy its (Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend dem Protokoll des Herstellers aufgereinigt. Qualität und Quantität der RNA wurden auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) unter Verwendung des RNA 6.000 LabChip Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) entsprechend der Herstellerangaben ermittelt.
Herstellung, Aufreinigung und Analyse der cRNA erfolgte nach den mitgelieferten Protokollen von Affymetrix. Die Synthese doppelsträngiger cDNA erfolgte aus 10 μg total RNA. Dabei wurde die Superscript II Reverse-Transcriptase (Superscript II, Life Technologies, Gaithersburg, MD USA) und ein oligo-dT-Primer mit einer T7-RNA- Polymerase-Promoter-Sequenz (Genset SA, Paris, Frankreich) verwandt. Die cDNA wurde anschließend mittels Phenol-Chloroform-Extraktion aufgereinigt. Danach erfolgte die cRNA- Synthese in einer in vz'tro-Transkription unter Verwendung des ENZO BioArray RNA Labeling Kits (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Nicht inkorporierte Nukleotide wurden durch eine Rneasy Kit-Aufreinigung (QIAGEN, Hilden, Deutschland) entfernt. Die cRNA wurde danach entsprechend dem Affymetrix Protokoll fragmentiert und über Nacht auf die Affymetrix GeneChips U95Av2 hybridisiert. Waschen, Färben und Scannen der GeneChips erfolgte ebenfalls entsprechend den Vorschriften des Affymetrix Protokolls.
Der Vergleich der Expressionsdaten dieser 15 heißen Schilddrusenknoten, 22 kalten Schilddrusenknoten und deren normaler Umgebungsgewebe erfolgte mit Expressionsdaten von 8 follikulären Karzinomen und 8 Normalgeweben und 8 papillären Karzinomen und deren Umgebungsgewebe.
Die Datenanalyse erfolgte in einem ersten Schritt mit der „Significance analysis of microarrays" (SAM)-Methode. Es handelt sich dabei um einen Algorithmus, mit dessen Hilfe differentiell exprimierte Gene mit statistisch adjustierter Signifikanz (in Bezug auf die große Anzahl parallel berechneter Gene) identifiziert werden können. Dabei wurden die Einstellungen der S AM- Analyse so gewählt, daß maximal 1% Falsch-Positive Gene detektiert wurden. In einem zweiten Schritt der Datenanalyse wurden aus der resultierenden Genmenge der SAM-Analyse die Gene identifiziert, deren absolute Signalwerte größer als 200 waren, was garantiert, daß diese Gene mittels real-time RT-PCR nachgewiesen werden können und zusätzlich mindestens zweifache Expressionsunterschiede zwischen den untersuchten Entitäten (heiße Knoten, kalte Knoten, papilläre Karzinome und follikuläre Karzinome) aufwiesen, was sicherstellen soll, daß quantitative Expressionsunterschiede mittels real time RT-PCR detektiert werden können. Die resultierenden Genmengen wurden schließlich gemäß ihrer Spezifität unterteilt in Gene, die ein spezifisches Expressionsmuster für heiße Schilddrusenknoten aufweisen; Gene, die ein spezifisches Expressionsmuster für kalte Schilddrusenknoten aufweisen; Gene, die ein spezifisches Expressionsmuster für papilläre Karzinome aufweisen und Gene, die ein spezifisches Expressionsmuster für follikuläre Schilddrüsenkarzinome aufweisen.
Ausführungsbeispiel 2:
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren wird zunächst eine Gewebeprobe mittels Feinnadelaspirationszytologie (FNAZ) entnommen.
Die Feinnadelaspiration erfolgt am liegenden Patienten nach Hautdesinfektion ohne Lokalanästhesie durch Einmalkanülen mit einem Außendurchmesser von 0,6 bis 0,7 mm möglichst unter sonographischer Kontrolle. Pro Knoten sollten fächerartig mindestens zwei Punktionen in verschiedene Knotenareale durchgeführt werden. Zystenpunktate sollten zentrifugiert werden und bei Versand der Zystenflüssigkeit sollte Heparin zugesetzt werden. Nach Zystenentleerang ist zudem eine erneute Punktion solider Knotenanteile anzustreben.
Ausftihrungsbeispiel 3:
Zur Extraktion von RNA werden die Einmalkanülen mit der Gewebeprobe aus Ausführungsbeispiel 2 in 1 ml TRIzol (in 1,5 ml Eppendorf-Tubes) mehrfach gründlich ausgespült. Anschließend wird das Homogenat gevortext und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgt eine Zugabe von 200 μl Chloroform. Vor einer erneuten Inkubation bei Raumtemperatur (2-3 min) wird das Eppendorf-Tube ca. 15 sec kräftig geschüttelt. Nach dem Inkubationsschritt wird 15 min bei 4 °C und 15.000 rpm abzentrifugiert. Die obere Phase wird anschließend in ein neues Tube überführt und nach Zugabe von 500 μl Isopropanol leicht das Tube geschwenkt und abermals für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. (Die Interphase und die phenolische Phase werden zur Extraktion der DNA verwandt (siehe Ausführungsbeispiel 8)). Danach erfolgt eine erneute Zentrifugation für 15 min bei 4 °C und 15.000 rpm. Nachdem der Überstand abgenommen wurde wird das RNA-P eilet mit 150 μl 70 %igem Ethanol gewaschen und nochmals für 5 min bei 4 °C und 15.000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wird erneut abgenommen und das RNA-Pellet kurz bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wird es in 12 μl Wasser aufgenommen.
Die Synthese der cDNA erfolgte in einem Reaktionsansatz bestehend aus 11,5 μl RNA (s.o.), 0,5 μg Random-Hexamer-Primer, 5x Erststrang-Puffer (250 M Tris-HCl [pH 8.3], 375 mM KC1, 15 mM MgCl2) (GibcoBRL, Karlsrahe, Deutschland), 0.5 mM dNTPs, 5 mM DTT (GibcoBRL), 15 U Prime RNase Inhibitor (PeqLab, Erlangen, Deutschland), und 200 U Moloney murine leukemia viras reverse transcriptase (GibcoBRL, Karlsruhe, Deutschland) für 1 Stunde bei 37 °C mit einem abschließenden Hitzeschritt bei 94 °C für 5 min.
Ausführungsbeispiel 4:
Die gemäß Ausführungsbeispiel 3 erhaltene cDNA wird einer quantitativen PCR- wie folgt differentiell auf einem LightCycler (Röche, Mannheim, Deutschland) analysiert:
Dabei wurde die Expression des in papillären Schilddrusenkarzinomen überexprimierten Genes Cyclooxygenase-2 (Homo sapiens COX-2, Gen Nr. 67 aus Tabelle 3) als diagnostischer Marker analysiert. Als endogene (innere) Kontrolle wurde in einem parallel PCR Ansatz die Expression des Referenzgenes ß-Aktin (Gen Nr. 155 aus Tabelle 5) quantitativ analysiert.
Zuerst wurden optimale PCR-Bedingungen, entsprechend den Herstellervorgaben etabliert (14). Die Amplikons (COX-2 und ß-Aktin) wurden anschließend in den pGEM-T- Vektor (Promega, Madison, WI, USA) kloniert und Eichkurven, mittels Plasmidveidünnungsreihen, unter Verwendung des LightCycler DNA Master S YBR Green I Kits (Röche), erstellt.
Der 20-μl-Reaktionsansatz zum Nachweis von COX-2 setzt sich dabei wie folgt zusammen:
- 2 μl LightCycler DNA Master SYBR Green I,
- 5 M zusätzliches MgCl2,
- je 0,5 μM Forward- und Reverse-Primer gemäß SEQ ID No. 3 und 4,
- 2 μl cDNA Template aus Ausführungsbeispiel 3.
Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 95°C 1 min., 40 Zyklen: 95°C 0 sec, 64 °C 7 sec, 72°C 13 sec.
Der 20-μl-Reaktionsansatz zum Nachweis des Referenzgens ß-Aktin setzt sich dabei wie folgt zusammen:
- 2 μl LightCycler DNA Master SYBR Green I,
- 4mM zusätzliches MgCl2,
- je 0,5 μM Forward- und Reverse-Primer gemäß SEQ ID No. 7 und 8, und 2 μl cDNA Template aus Ausführungsbeispiel 3.
Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
95°C 1 min., 40 Zyklen: 95°C 0 sec, 55 °C 7 sec, 72°C 9 sec.
Die Primer wurden von MWG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert.
Ausführungsbeispiel 5:
Die gemäß Ausführungsbeispiel 3 erhaltene cDNA wird einer quantitativen PCR wie folgt differentiell auf einem LightCycler (Röche, Mannheim, Deutschland) analysiert:
Dabei wurde die Expression des in papillären Schilddrusenkarzinomen überexprimierten Genes Cyclooxygenase-2 (Homo sapiens COX-2, Gen Nr. 67 aus Tabelle 3) als diagnostischer Marker analysiert. Als endogene Kontrolle wurde in einem parallel PCR Ansatz die Expression des Referenzgenes ß-Aktin (Gen Nr. 155 aus Tabelle 5) quantitativ analysiert.
Zuerst wurden optimale PCR-Bedingungen, entsprechend den Herstellervorgaben etabliert (14). Die Amplikons (COX-2 und ß-Aktin) wurden anschließend in den pGEM-T- Vektor (Promega, Madison, WI, USA) Moniert und Eichkurven, mittels Plasmidveidünnungsreihen, unter Verwendung des LightCycler DNA Master Hybridization Probes Kits (Röche), erstellt.
Der 20-μl-Reaktionsansatz zum Nachweis von COX-2 setzt sich dabei wie folgt zusammen: - 2 μl LightCycler DNA Master Hybridization Probes,
- 5 mM zusätzliches MgCl2,
- je 0,5 μM Forward- und Reverse-Primer gemäß SEQ ID No. 3 und 4,
- 0,15 μM der 5'-VIC- und 3' TAMRA markierten TaqMan-Sonde mit einer DNA Sequenz gemäß SEQ ID No. 19 und 2 μl cDNA Template aus Ausführungsbeispiel 3.
Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
95°C 1 min., 40 Zyklen: 95°C 0 sec, 64 °C 7 sec, 72°C 13 sec.
Der 20-μl-Reaktionsansatz zum Nachweis des Referenzgens ß-Aktin setzt sich dabei wie folgt zusammen:
- 2 μl LightCycler DNA Master Hybridization Probes,
- 4mM zusätzliches MgCl2,
- je 0,5 μM Forward- und Reverse-Primer gemäß SEQ ID No.7 und 8,
- 0,15 μM der 5'-VIC- und 3' TAMRA markierten TaqMan-Sonde mit einer DNA Sequenz gemäß SEQ ID No 20 und 2 μl cDNA Template aus Ausführungsbeispiel 3.
Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt:
95°C 1 min., 40 Zyklen: 95°C 0 sec, 55 °C 7 sec, 72°C 9 sec.
Die Primer wurden von MWG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert. Die 5'-VIC- und 3' TAMRA markierten TaqMan-Sonden sind bei Applied Biosystems (Darmstadt, Deutschland) erhältlich.
Ausfflhrungsbeispiel 6:
Für andere Marker bzw. Referenzgene wird eine PCR entsprechend den in Ausführungsbeispiel 4 angegebenen Bedingungen durchgeführt. Das zusätzlich zugesetzte MgCl2, die Annealingtemperatur und die Elongationszeit sind abhängig von dem zu amplifϊzierenden Marker bzw. Referenzgen und werden so optimiert, daß eine Schmelzkurve mit einem einzigen Maximalwert detektiert wird. Zusätzlich wurden die Amplikons mittels Agarosegelelektrophorese hinsichtlich einer korrekten Größe der Bande untersucht.
Die Amplifikationen wird generell mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 95°C 1 min., 40 Zyklen: 95°C 0 sec, x°C 7 sec, 72°C y sec. Dabei entspricht x der optimierten Annealing-Temperatur für das spezifische Gen und y entspricht der Elongationszeit des spezifischen Amplikons. Die PCR-Konditionen für die Gene Nr. 66 und 67 aus Tabelle 3 und die Gene 154 bis 157 aus Tabelle 5 werden in der nachfolgenden Übersicht zusammengefasst:
Figure imgf000028_0001
Ausführungsbeispiel 7: Ein ?Kit zur Durchführang des erfindungsgemäßen Verfahren per real time PCR enthält beispielhaft folgende Komponenten zum Nachweis des in papillären Schilddrusenkarzinomen überexprimierten Genes Homo sapiens cyclooxygenase-2 (COX-2, Gen Nr. 67 aus Tabelle 3) als diagnostischem Marker und des Referenzgenes ß-Aktin (Gen Nr. 155 aus Tabelle 5):
1. Für die cDNA-Synthese: 20 μg Random-Hexamer-Primer - 0,1 MDTT - 10 mM dNTP-Mix (je 10 M dATP, dCTP, dGTP und dTTP) 10.000 U Reverse Transkriptase - 10.000 U RNase Inhibitor - 5x Erststrang-Puffer
2. Für die real time PCR - 5 nmol Forward-Pri er COX-2 (Nr. 96; Markergen) gemäß SEQ ID No.3, - 5 nmol Reverse-Primer COX-2 (Nr. 96; Markergen) gemäß SEQ ID No. 4, - 1 nmol einer 5'-VIC- und 3' TAMRA markierten TaqMan-Sonde für COX-2 (Nr.67; Markergen) mit einer DNA Sequenz gemäß SEQ ID No. 19, 5 nmol Forward-Primer ß-Aktin (Nr.155; Referenzgen) gemäß SEQ ID No. 7, 5 nmol Reverse-Primer ß-Aktin (Nr. 155; Referenzgen) gemäß SEQ ID No. 8, 1 nmol einer 5 -VIC- und 3' TAMRA markierten TaqMan-Sonde für ß-Aktin (Nr. 155; Referenzgen) mit einer DNA Sequenz gemäß SEQ ID No.20, - 5x PCR-Puffer 100 U Taq-Polymerase.
Ausführungsbeispiel 8:
Nachdem die wäßrige Phase zur RNA Extraktion (Ausführungsbeispiel 3) abgenommen wurde, wird die DNA aus der Interphase und der organischen Phase mittels Ethanol präzipitiert. Dazu werden 0,3 ml 100% Ethanol zur Interphase und organischen Phase zugegeben und durch leichtes Schwenken gemischt. Anschließend werden die Proben 2-3 min bei 15-30°C gelagert und dann die DNA bei 2.000 x g für 5 min bei 4°C abzentrifugiert. Nach Entfernen des Phenol/Ethanol-Überstandes wird die DNA mit 1 ml einer 0,1M Natriumeitrat in 10% Ethanollösung gewaschen. Das DNA-Pellet wird dabei 30 min bei Raumtemperatur in der Lösung gelagert und anschließend bei 2.000 x g für 5 min bei 4°C abzentrifugiert. Nachdem dieser Waschschritt wiederholt wurde, wird die DNA in 1,5 ml 75% Ethanol für 15- 20 min bei Raumtemperatur gelagert und anschließend bei 2.000 x g für 5 min bei 4°C abzentrifugiert. Das DNA-Pellet wird Luft getrocknet und in 8mM NaOH resuspendiert.
Ausführungsbeispiel 9:
Mit der gemäß Ausführungsbeispiel 8 erhaltenen DNA wird wie folgt ein BRAF- Mutationsscreening (19) durchgeführt: Der 25-μl-Reaktionsansatz zur Amplifizierang von BRAF setzt sich dabei wie folgt zusammen:
- 10 mM Tris ΪCl, 50 M KC1, 1,5 mM MgCL (pH 8,3),
- 0,2 mM dNTP-Mix
- je 0,8 pmol Forward- (5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3') und Reverse- (5'- GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3 ') Primer,
- 5 μl DNA Template aus Ausführangsbeispiel 9,
- 1 U AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems).
Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 94 °C 5 min., 40 Zyklen: (94°C 30 sec, 60 °C 30 sec, 72 °C 60 sec), 72 °C 5 min.
Nach erfolgter Amplifizierang und anschließender Aufreinigung des PCR-Produ?ktes mittels QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) (entsprechend den Herstellervorgaben), erfolgt eine Sequenzierung des PCR-Produktes mit dem Forward-Primer unter Verwendung des Big Dye Terminator Kits (Applied Biosystems) auf einem ABI Prism DNA Sequencer.
Die Primer wurden von MWG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert.
Ausführungsbeispiel 10:
Mit der gemäß Ausführungsbeispiel 3 erhaltenen cDNA wird wie folgt ein Screening auf das Pax8-PPARγ-Rearrangement (17) durchgeführt:
Der 30-μl-Reaktionsansatz zur Amplifizierang des Rearrangements setzt sich dabei wie folgt zusammen:
- 10 mM TrisJHCl, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCfe (pH 8,3),
- 0,2 mM dNTP-Mix
- je 0,8 pmol Forward- (5'-AACCTCTCGACTCACCAGAC-3') und Reverse- (5'- AGAATGGCATCTCTGTGTCAAC-3') Primer,
- 2 μl cDNA Template aus Ausführangsbeispiel 3,
- 1 U AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems).
Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 94 °C 5 min., 40 Zyklen: (94°C 40 sec, 60 °C 1 min, 72 °C 1 min), 72 °C 5 min.
Nach erfolgter Amplifizierang wird das PCR Produkt elektrophoretisch auf einem 1,5 % Agarosegel aufgetrennt.
Ausfflhrungsbeispiel 11:
Mit der gemäß Ausführungsbeispiel 3 erhaltenen cDNA wird wie folgt ein Screening auf das Ret-PTC-Rearrangement (18) durchgeführt:
Der 30-μl-Reaktionsansatz zur Amplifizierang des Rearrangements setzt sich dabei wie folgt zusammen:
- 10 mM TrisJHCl, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCfc (pH 8,3),
- 0,2 mM dNTP-Mix
- je 1 mM Forward- (Ret/PTCl: 5'-GTCGGGGGGCATTGTCATCT-3', Ret/PTC3 : 5'- TGGAGAAGAGGAGCTGTATC-3') und Reverse- (Ret/PTCl: 5'-AAGTTCTTCC GAGGGAATTC-3', Ret/PTC3: 5'-CTTTCAGCATCTTCACGG-3') Primer,
- 2 μl cDNA Template aus Ausführangsbeispiel 3,
- 1 U AmpliTaq DNA Polymerase (Applied Biosystems).
Die PCR wird mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 95 °C 4 min., 40 Zyklen: (95°C 30 sec, 55 °C 30 sec, 72 °C 30 sec), 72 °C 5 min.
Nach erfolgter Amplifizierang wird das PCR Produkt elektrophoretisch auf einem 1,5 % Agarosegel aufgetrennt. In der Erfindungsbeschreibung werden folgende Abkürzungen verwendet:
bp Basenpaare cDNA zur mRNA komplementäre DNA
COX-2 Cyclooxygenase-2 cRNA Kopie-RNA
DNA Desoxyribonukleinsäure
DDT Dithiothreitol
ETS-1 Human erythroblastosis viras oncogene homolog 1
FNAZ Feinnadelaspirationszytologie
FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
FTC follikuläres Schilddrüsenkarzinom
GAPDH Glyzerinaldehyd-Dehydrogenase
HK heiße Schilddrusenknoten
KK kalte Schilddrusenknoten
MEN Multiple endokrine Neoplasie μM μmol/Liter mM mmol/Liter mRNA Messenger-RNA
NCBI National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA
PBS Phosphatsalzpufferlösung
PCR Polymerasekettenreaktion
PTC papillären Schilddrusenkarzinomen
RT-PCR Reverse Transkriptase PCR
RNA Ribonukleinsäure mRNA Messenger-RNA rRNA Ribosomale Ribonukleinsäure
SEM Standardfehler des Mittelwertes
SLR Signal log ratio
TG Thyroglobulin
TSH thyroid stimulating hormone, Thyrotropin
TSHR Thyrotropinrezeptor
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Claims

Patentansprüche1) Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen Tumoren gegenüber bösartigen Tumoren bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 153 erfolgt, wobei a.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 1 bis 3, 5 bis 8, 11, 13 bis 15 und 19 bis 22 sowie der Gene 23 bis 27 und 33 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert, b.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 4, 9, 10, 12, 16 bis 18 sowie der Gene 28 bis 32, 34 und 35 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen Tumors liefert, c.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 45, 47 bis 52, 54 bis 62, 64 bis 68, 70, 71, 74, 75, 77 bis 85, 87, 89, 91 bis 94, 101 bis 107, 110, 112 bis 115, 118, 119, 121 bis 125, 130, 131 sowie der Gene Nr. 133 und 134 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert, d.) eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 2, 13, 15, 22, 33, 42, 46, 53, 63, 69, 72, 73, 76, 86, 88, 90, 95 bis 100, 108, 109, 111, 116, 117, 120, 126 bis 129, 132 sowie der Gene Nr. 8 und 135 bis 153 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen Tumors liefert.
2) Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen heißen Knoten gegenüber gutartigen kalten Knoten, bösartigen follikulären Karzinomen und bösartigen papillären Karzinomen, bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 1 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 22 erfolgt,
3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 1 bis 3, 5 bis 8, 11, 13 bis 15 und 19 bis 22 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 4, 9, 10, 12 und 16 bis 18 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen heißen Knotens liefert.
3) Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen kalten Knoten gegenüber gutartigen heissen Knoten, bösartigen follikulären Karzinomen und bösartigen papillären Karzinomen, bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 2 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 23 bis 35 erfolgt,
3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 23 bis 27 und 33 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene 28 bis 32, 34 und 35 einen Hinweis auf das Vorliegen eines gutartigen kalten Knotens liefert.
4) Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von bösartigen papillären Karzinomen gegenüber gutartigen heißen Knoten, gutartigen kalten Knoten und bösartigen follikulären Karzinomen, bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 3 aufgeführten Genen erfolgt,
3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 45, 47 bis 52, 54 bis 62, 64 bis 68, 70, 71, 74, 75, 77 bis 83, 85, 87, 89, 91 bis 94, 101 bis 107, 110, 112 bis 115, 118, 119, 121 bis 125, 130, 131 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 2, 15, 46, 63, 69, 88, 95 bis 97, 108, 109, 111, 120, 126 bis 129 und 132 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen papillären Schilddrüsenkarzinoms liefert.
5) Verfahren zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von bösartigen follikulären Karzinomen gegenüber gutartigen heißen Knoten, gutartigen kalten Knoten und bösartigen papillären Karzinomen, bei dem:
1.) RNA aus einer Gewebeprobe der Schilddrüse isoliert wird,
2.) in der isolierten RNA eine quantitative Bestimmung der mRNA-Transkripte mindestens eines Genes ausgewählt aus den in Tabelle 4 aufgeführten Genen erfolgt,
3.) eine erhöhte Menge an Transkripten der Gene Nr. 133 und 134 sowie eine erniedrigte Menge an Transkripten der Gene Nr. 8 und 135 bis 153 einen Hinweis auf das Vorliegen eines bösartigen follikulären Schilddrüsenkarzinoms liefert.
6) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in der isolierten RNA zusätzlich eine quantitative Bestimmung der Transkripte eines Referenzgens erfolgt.
7) Verfahren nach Ansprach 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzgen aus der Gruppe der in Tabelle 5 angegebenen Gene mit den Gen-Nummern 154 bis 157 gewählt wird.
8) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Gewebeprobe ein Schilddrüsenpunktat oder eine Feinnadelaspirationszytologie (FNAZ) gewählt wird. 9) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine Analyse auf das Vorhandensein von Pax8/PPARg- und/oder Ret/PTC- Rearrangements und/oder von BRAF-Mutationen durchgeführt wird.
10) Diagnostischer Kit zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren zur Unterscheidung von gutartigen Tumoren gegenüber bösartigen Tumoren mittels RT- PCR, der folgende Bestandteile enthält: 1.) für die cDNA-Synthese: a.) Random-Hexamer-Primer oder oligo dT, b.) Reverse Transkriptase; 2.) für die PCR: a.) mindestens zwei Primer, die spezifisch mit der cDNA eines der Gene ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 153 hybridisieren; b.) mindestens zwei Primer, die spezifischmit der cDNA eines Refere nzgens ausgewählt aus den in Tabelle 5 angegebenen Genen mit den Gen-Nummern 154 bis 157 hybridisieren, c.) eine über 80°C beständige DNA-Polymerase, sowie entsprechende Reaktionspuffer.
11) Diagnostischer Kit nach Ansprach 10, dadurch gekennzeichnet, dass er als zusätzliche Bestandteile für die PCR enthält: d.) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenzmarkierter Hybridisierangssonden, die spezifisch mit der cDNA eines der Gene ausgewählt aus den in Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgeführten Genen mit den Gen-Nummern 1 bis 153 hybridisieren, und e.) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein Paar Fluoreszenzmarkierter Hybridisierangssonden, die spezifisch mit der cDNA eines Referenzgens ausgewählt aus den in Tabelle 5 angegebenen Genen mit den Gen-Nummern 154 bis 157 hybridisieren. 12) Verwendung eines Gens aus Tabelle 1 als spezifischer Marker zur Diagnose von heißen S childdrüsenknoten.
13) Verwendung eines Gens aus Tabelle 2 als spezifischer Marker zur Diagnose von gutartigen kalten Schilddrusenknoten.
14) Verwendung eines Gens aus Tabelle 3 oder 4 als spezifischer Marker zur Diagnose von bösartigen Schilddrusenkarzinomen.
15) Verwendung eines Gens aus Tabelle 3 ausgewählt aus den Genen mit den Gen-Nummern 2, 15, 16, 32, 36 bis 41, 43 bis 52, 54 bis 71, 74, 75, 77 bis 83, 85, 87 bis 89, 91 bis 97, 101 bis 115, 118 bis 132 als spezifischer Marker zur Diagnose von bösartigen papillären S childdrüsenkarzinomen.
16) Verwendung eines Gens aus Tabelle 4 ausgewählt aus den Genen mit den Gen-Nummern 8 und 133 bis 153 als spezifischer Marker zur Diagnose von bösartigen follikulären S childdrüsenkarzinomen.
17) Hybridisierungssonde mit einer DNA-Sequenz gemäß SEQ ID No. 19 oder 20.
18) Verwendung einer Primersequenz ausgewählt aus der Gruppe der DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis 4 oder einer Hybridisierungssonde mit einer DNA-Sequenz gemäß SEQ ID No. 19 oder 20 zur differentiellen Diagnose von Schilddrüsentumoren, insbesondere zur Unterscheidung von gutartigen Schilddrusenknoten von Schilddrusenkarzinomen.
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