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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren zur Diagnose
von festen Tumoren, hämatologischen
neoplastischen Erkrankungen im Menschen, Nukleinsäure und
Oligonukleotide zur Durchführung
des Verfahrens und einen Kit, umfassend die Oligonukleotide.
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Hintergrund der Erfindung
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Es
ist bekannt, dass verschiedene menschliche Erkrankungen, insbesondere
neoplastische Erkrankungen und einige hämatologische Störungen,
wie beispielsweise Leukämie,
durch eine geänderte
Funktonalität
von spezifischen Genen charakterisiert sind, welche in der normalen
Physiologie der Zelle eine Rolle spielen. Diese Gene sind in zwei
konzeptionelle Kategorien eingeteilt worden, nämlich Oncogene und Oncosuppressorgene,
abhängig
davon, ob sie während
des neoplastischen Transformationsprozesses aktiviert oder inaktiviert
werden. Einer der Hauptmechanismen zur Inaktivierung der Oncosuppressorgene,
welcher in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben wird, ist
die Hypermethylierung des Promotors.
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DNA-Methylierung,
nämlich
die Bindung der Methylgruppe (-CH3) an Cytosin,
welches im Kontext des CpG-Dinukleotids (C = Cytosin; G = Guanin;
p = Monophosphat) vorliegt, ist eine der häufigsten und am besten bekannten epigenetischen
Modifikationen, welcher DNA in Säugerzellen
unterzogen werden kann.
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Von
DNA-Methylierung ist bekannt, dass sie insbesondere bei der Gentranskription
eine regulatorische Funktion aufweist. Tatsächlich wurde beobachtet, dass
die Genpromotoren oftmals Regionen enthalten, welche insbesondere
an CpG-Dinukleotiden reich sind, die als CpG-Inseln bekannt sind,
wobei die Cytosine davon im Allgemeinen nicht methyliert sind, wenn
das Gen transkriptional aktiv ist. Wenn jedoch die Transkriptionsfähigkeit
des Gens negativ reguliert ist (d.h. wenn das Gen inaktiviert ist),
liegen die Cytosine der CpG-Inseln in den Genpromotoren methyliert
vor. DNA-Methylierung, auch mittels der Hypoacetylierung der Histone, dient
dazu, Chromatin zu verdichten, um so einen Zugang von Transkriptionsfaktoren,
welche zur Gentranskription notwendig sind, zu verhindern. Es wurde
auch beschrieben, dass das Methylierungsmuster von Zellen ererbt
wird, welche abgeleitet sind aus den Zellen, in welchen der Methylierungsprozess
ursprünglich
stattgefunden hat.
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Diese
Faktoren führten
zum Entstehen der Idee, dass die Analyse des Methylierungsstatus
der spezifischen Gene, welche in neoplastischen Transformationsprozess
eine Rolle spielen zur Diagnose von neoplastischen Erkrankungen
im Menschen ein nützliches
Werkzeug darstellen könnten.
Sowohl die wissenschaftliche Literatur als auch die Patentliteratur
haben tatsächlich
zahlreiche Studien hinsichtlich des Methylierungsstatus von Genen,
welche bei der Entwicklung von humanen Tumoren eine Rolle spielen,
beschrieben.
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Es
besteht aber noch immer Bedarf, neue Marker für neoplastische Erkrankungen
zu identifizieren, welche es einerseits möglich machen, das gegenwärtig hinsichtlich
des molekularen Mechanismus, der der Karzinogenese zugrunde liegt,
verfügbare
Wissen zu erweitern, und andererseits helfen, neue Verfahren sowohl
zur Diagnose als auch zur therapeutischen Behandlung von humanen
Tumoren bereit zu stellen.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1
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Diagramm
der Region am 5'-Ende
des CDH4-Gens entsprechend der Genbank-Sequenz AL365229 (zwischen
46200 und 50000). Das Diagramm zeigt Exon I und II des CDH4-Gens
und die CpG-Dinukleotide sind mittels vertikaler Balken angezeigt.
Die Dichte (CpG-Insel) dieser Dinukleotide um das erste Exon des CDH4-Gens
kann festgestellt werden. Die Segmente, welche einer PCR-Amplifikation mittels
der Primer cdh4-MF/MR (Produkt A), cdh4-M3F/MR (Produkt A verschachtelt)
und cdh4-M2F/M3R (Produkt B) unterzogen wurden, sind ebenfalls gezeigt.
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2
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Umgekehrte
Beziehung zwischen der Methylierung des CDH4-Promotors und der Expression
von CDH4 mRNA.
- A. DNA-Analyse von verschiedenen
humanen Zelllinien mittels MSP mit CDH4-MR/CDH4-MR-Primern: das
Auftreten einer Amplifikationsbande gibt einen Hinweis auf die Methylierung
der Region.
- B. Die gleichen Zelllinien werden mittels RT-PCR analysiert,
um CDH4-Transkription
deutlich zu machen. Es wird angemerkt, dass DNA-Methylierung mit
dem Fehlen von mRNA-Expression assoziiert ist.
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3
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Reexpression
der RNA des CDH4-Gens im Anschluss an Demethylierung.
- A. Vorliegen von Methylierung des CDH4-Promotors in den Zelllinien
HeLa und SiHa, deutlich gemacht mittels MSP mit cdh4_MF/cdh4_MR-Primern.
- B. Demethylierung der DNA der CDH4-Promotorregion in der Zelllinie
HeLa im Anschluss an die Behandlung mit Aza-C, deutlich gemacht
mittels MSP mit cdh4_UF/cdh4_UR-Primern.
- C. Reexpression des CDH4-Gens in den Proben, welche mit Aza-C
behandelt wurden, deutlich gemacht mittels RT-PCR mit cdh4_249F/cdh4_547R-Primern.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass die
Analyse des Methylierungsstatus des humanen CDH4-Gens, welches für Cadherin-4
kodiert, zur Diagnose von verschiedenen Arten humaner neoplastischer
Erkrankungen, umfassend feste Tumore und hämatologische neoplastische
Erkrankungen ein nützliches
Werkzeug darstellt.
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Die
mögliche
Rolle des CDH4-Gens bei der Tumormetastase wurde bereits in der
internationalen Patentanmeldung
WO
01/77376 vorgeschlagen. Jedoch fokussiert diese Patentanmeldung
eng auf die Analyse des Methylierungsmusters des CD22-Gens und gibt
keinen spezifischen Hinweis auf die Tatsache, dass eine veränderte Methylierung
des CDH4-Gens überhaupt
mit dem neoplastischen Status korreliert werden kann, noch identifiziert
sie spezifische Sequenzen des CDH4-Gens, welche für diagnostische
Zwecke nützlich
sind.
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Nach
intensiver Forschung haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung
herausgefunden, dass die CpG-Insel, welche am 5'-Ende des CDH4-Gens lokalisiert ist,
eine hohe Methylierungshäufigkeit
in Zellen aufweist, welche aus humanen Neoplasmen abgeleitet sind,
wohingegen sie in normalen Kontrollen nicht methyliert sind. Der
Methylierungsstatus der CpG-Insel, welche sich zwischen Nukleotid
46801 und Nukleotid 49600 der Genbank-Sequenz AL365229 erstreckt,
ist deshalb ein nützlicher
Marker für
feste Tumore und hämatologische
neoplastische Erkrankungen im Menschen.
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Entsprechend
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von
festen Tumoren und hämatologischen
neoplastischen Erkrankungen bereit, welches dadurch charakterisiert
ist, dass es umfasst, in einer Probe von genomischer DNA, den Schritt
Analysieren des Methylierungsstatus der Nukleotidsequenz der 5'-Region des CDH4-Gens
zwischen den Nukleotidpositionen, die den Nukleotiden 46801 und
49600 der Genbank-Sequenz
AL365229 (SEQ ID NO: 18) entsprechen, wobei die Methylierung der
Sequenz auf eine neoplastische Erkrankung hinweist.
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In
der vorliegenden Erfindung bezeichnet die Formulierung „Nukleotidpositionen
entsprechend den Nukleotiden 46801 und 49600 der Genbank-Sequenz
AL365229" die Tatsache,
dass die Nukleotidpositionen des CDH4-Gens der genomischen DNA,
welche zu analysieren ist, nummeriert sind auf Grundlage der Nummerierung
der Genbank-Sequenz AL365229.
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Wie
in 1 gezeigt, deckt die CpG-Insel am 5'-Ende des CDH4-Gens
eine Region von etwa 3 kb ab, welche umfasst die 5'-Region, das erste
Exon und sich in das erste Intron des Gens erstreckt.
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Wie
es nachstehend ausführlicher
beschrieben wird, haben die Erfinder auch herausgefunden, dass die
5'-Region der CpG-Insel,
nämlich
die Region zwischen den Nukleotidpositionen, die den Nukleotiden 47050
bis 47376 der Genbank-Sequenz AL365229 entsprechen, die Funktion
eines Promotors leistet und dass eine abweichende Methylierung dieser
Region, getrennt davon, dass es sich um einen Marker für Tumorerkrankungen
handelt, auch mit der Hemmung von Gentranskription korreliert. Dieses
Ergebnis stellt den molekularen Mechanismus zur Beteiligung des
CDH4-Gens am neoplastischen Prozess klar.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das diagnostische Verfahren der vorliegenden Erfindung daher
die Analyse des Methylierungsstatus der Nukleotidsequenz des CDH4-Gens
zwischen den Nukleotidpositionen, die den Nukleotiden 47050 und
47376 der Genbank-Sequenz AL365229 (SEQ ID NO: 19) entsprechen,
wobei die Methylierung der Sequenz auf eine neoplastische Erkrankung
hinweist.
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Der
Methylierungsstatus der CpG-Insel kann analysiert werden unter Verwendung
eines beliebigen geeigneten Verfahrens, wie beispielsweise unter
Verwendung von Verfahren, welche die chemische Behandlung der DNA
mit einem Reagens umfassen, welches Methylierungsunterschiede in
Sequenzunterschiede umwandeln kann. Vorzugsweise zu diesem Zweck
wird ein chemisches Reagens verwendet, welches nicht methylierte
Cytosinbasen in Uracil umwandeln kann oder in eine andere beliebige
Base, welche sich mit einer anderen Base als Guanin paaren kann.
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Ein
Reagens, welches zu diesem Zweck besonders bevorzugt ist, ist Bisulfit,
vorzugsweise Natriumbisulfit in Kombination mit Hydroquinon. In
dieser chemischen Reaktion werden die nicht methylierten Cytosine,
welche in der DNA vorliegen, tatsächlich zu Uracil deaminiert,
welches im Hinblick auf die Basenpaarung Thymidin entspricht. Die
methylierten Cytosine sind andererseits gegenüber der chemischen Behandlung
resistent und gehen deshalb keinerlei Modifikation ein. In der Folge
verbleiben die Methylcytosine, welche in der ursprünglichen
genomischen DNA vorliegen und welche anfänglich nicht von den Cytosinen
unterschieden werden konnten, da sie die gleichen Paarungseigenschaften
aufwiesen, nach der chemischen Behandlung als die einzigen in der
DNA vorliegenden Cytosine und können
anschließend
unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren identifiziert
werden.
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Die
Basensequenz der genomischen DNA, welche wie vorausstehend beschrieben,
chemisch behandelt worden ist, kann beispielsweise durch direkte
Sequenzierung analysiert werden.
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Alternativ
ist es möglich,
Verfahren wie beispielsweise methylierungsspezifische PCR (MSP)
zu verwenden, welche auf der methylierungsspezifischen Amplifikation
von Segmenten der CpG-Insel der Probe mit chemisch behandelter genomischer
DNA basiert.
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Derartige
Verfahren verwenden Oligonukleotide, welche in der Lage sind, mit
den modifizierten Sequenzen der methylierten oder nicht methylierten
CpG-Insel, welche
mittels der vorausgehend beschriebenen chemischen Behandlung erhalten
werden, selektiv zu hybridisieren.
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Die
chemische Behandlung einer Probe genomischer DNA, umfassend die
CpG-Insel des CDH4-Gens (Nukleotide 46801-49600 der Genbank-Sequenz
AL365229), wie vorausstehend beschrieben, führt tatsächlich zu zwei modifizierten
Strängen,
wobei ein jeder davon abgeleitet ist von einem der zwei Stränge der
behandelten genomischen DNA, welche aber nicht länger komplementär zueinander
sind.
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Die
Sequenzen, welche als SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 bezeichnet werden,
sind die Nukleotidsequenzen der zwei modifizierten Stränge, welche
erhalten werden, wenn alle Dinukleotide der ursprünglichen CpG-Insel
des CDH4-Gens methyliert
sind.
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Die
Sequenzen, welche als SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 bezeichnet sind,
sind die Nukleotidsequenzen der zwei modifizierten Stränge, welche erhalten
werden, wenn keines der Dinukleotide der ursprünglichen CpG-Insel des CDH4-Gens
methyliert ist.
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Die
Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO:
4 wurden auf Grundlage der Genbank-Sequenz AL365229 (Nukleotide
46801-49600) des CDH4-Gens bestimmt.
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Oligonukleotide
mit wenigstens 10 Nukleotiden Länge,
die komplementär
oder identisch sind zu einem Segment einer Zielsequenz, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
3, SEQ ID NO: 4, sind als Werkzeug zur Analyse des Methylierungsstatus
der CpG-Insel einer Probe genomischer DNA nützlich, da die Hybridisierung
davon vom Methylierungsstatus der ursprünglichen CpG-Insel der Probe
abhängig
ist. Derartige Oligonukleotide fallen in den Bereich der vorliegenden
Erfindung. Vorzugsweise sind die Oligonukleotide der Erfindung komplementär oder identisch
einem Segment einer Zielsequenz, wie vorausstehend definiert, umfassend
wenigstens ein CpG-Dinukleotid.
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Die
vorausstehend definierten Oligonukleotide können in dem diagnostischen
Verfahren der Erfindung als Amplifikationsprimer oder als Hybridisierungssonden
verwendet werden. Im letztgenannten Fall weisen sie vorzugsweise
eine Länge
von wenigstens 18 Nukleotiden auf.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wurden die Oligonukleotide der Erfindung auf Grundlage der Nukleotidsequenzen
zwischen den Positionen 250 und 576 von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID
NO: 3 und zwischen den Nukleotidpositionen 2225 bis 2551 von SEQ
ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 entwickelt. Diese Nukleotidpositionen
entsprechen dem Promotor des CDH4-Gens, nämlich den Nukleotidpositionen
47050-47376 der Genbank-Sequenz AL365229. Die Nukleotidsequenzen
zwischen den Positionen 250 und 576 von SEQ ID NO: 1 und SEQ von
ID NO: 3 werden als SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 7 bezeichnet.
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Die
Nukleotidsequenzen zwischen den Positionen 2225 und 2551 von SEQ
ID NO: 2 und von SEQ ID NO: 4 werden als SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID
NO: 8 bezeichnet.
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Das
diagnostische Verfahren der Erfindung unter Verwendung der vorausstehend
beschriebenen Oligonukleotide kann beispielsweise ein Detektionsverfahren
basierend auf DNA-Amplifikation sein, gegebenenfalls mit anschließender Detektion
der amplifizierten DNA-Fragmente mittels einer Hybridisierungssonde.
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In
einem derartigen Verfahren wirkt eine zu untersuchende Probe genomischer
DNA chemisch vorbehandelt mit einem Reagens, welches die nicht methylierten
Cytosinbasen in Uracil umwandeln kann oder in eine beliebige andere
Base, welche mit einer anderen Base als Guanin paaren kann.
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Die
zu analysierende Probe genomischer DNA wird vorzugsweise erhalten
aus einer Quelle, wie beispielsweise Blut, Serum, Plasma, Bronchialspülungen,
Auswurf, Speichel, Darmspülungen,
Urin, Fäkalien, Ejakulat,
Tupfer von unterschiedlichem Ursprung, Nadelaspirate, Lymphknotenbiopsien,
oder Kombinationen davon.
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Die
vorausstehend beschriebene chemische Vorbehandlung der genomischen
DNA wird vorzugsweise mit Natriumbisulfit und Hydroquinon durchgeführt.
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Im
Anschluss an die chemische Vorbehandlung werden zwei modifizierte
Stränge,
welche aber nicht mehr länger
komplementär
zueinander sind, aus der ursprünglichen
doppelsträngigen
genomischen DNA erhalten.
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Nach
dem chemischen Vorbehandlungsschritt kann einer der modifizierten
Stränge,
welche durch Vorbehandlung der genomischen Dann erhalten wurden,
einer Amplifikationsreaktion unterzogen werden, wobei als Amplifikationsprimer
wenigstens zwei Oligonukleotide, welche wenigstens 10 Nukleotide
lang sind, verwendet werden, wobei eines der Oligonukleotide komplementär ist zu
einem ersten Segment einer Zielsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 und
das andere Oligonukleotid identisch ist zu einem zweiten Segment
der Zielsequenz, wobei das zweite Segment der Zielsequenz stromabwärts des
ersten Segments angeordnet ist. Gemäß einer Ausführungsform
umfasst wenigstens eines der ersten und zweiten Segmente der Zielsequenz
wenigstens ein CpG-Dinukleotid. In diesem Fall ist die Amplifikationsreaktion
methylierungsspezifisch, da sie ein bestimmtes Paar Oligonukleotidprimer
verwendet, um spezifisch einen modifzierten Strang zu amplifizieren,
welcher abgeleitet ist aus der Sequenz der ursprünglich methylierten CpG-Insel.
In dieser Ausführungsform
kann eine Detektion der amplifizierten DNA-Fragmente, falls welche
vorliegen, durchgeführt
werden durch ein beliebiges per se bekanntes Verfahren, wie beispielsweise
Elektrophorese auf Agarosegel und Färben mit einem DNA-interkalierenden
Mittel, wie beispielsweise Ethidiumbromid.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
umfasst weder das erste noch das zweite Segment der Zielsequenz
ein CpG-Dinukleotid. In diesem Fall ist die Amplifikationsreaktion
nicht methylierungsspezifisch. In der Folge wird die Detektion der
amplifizierten Fragmente, falls welche vorliegen, durchgeführt durch
Hybridisierung mit einer methylierungsspezifischen Sonde, nämlich einem
Oligonukleotid, welches wenigstens 18 Nukleotide lang ist, welches
komplementär
ist zu einem dritten Segment der Zielsequenz der Amplifikationsprimer,
wobei das dritte Segment zwischen dem ersten und dem zweiten Segment
der Zielsequenz lokalisiert ist und wenigstens ein CpG-Dinukleotid umfasst.
Das dritte Segment der Zielsequenz kann gegebenenfalls mit dem ersten
oder zweiten Segment teilweise überlappen.
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Die
Hybridisierungssonde ist vorzugsweise markiert mit einem detektierbaren
Marker, wie beispielsweise einem Radioisotop, einem fluoreszierenden
Molekül,
einem Chemilumineszenz-Molekül,
einem Enzym, welches mit einem chromogenen Substrat reagieren kann,
oder mit einem Avidin/Biotin- oder einem Antigen/Antikörper-System,
welches selbst markiert ist.
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In
beiden der vorausgehend beschriebenen Ausführungsformen des Verfahrens,
ist die Amplifikationsreaktion vorzugsweise eine Polymerasekettenreaktion
(PCR). Stärker
bevorzugt ist eine Amplifikationsreaktion in zwei Schritten, welche
eine primäre
PCR umfasst, wobei sich eine halbverschachtelte oder eine verschachtelte
sekundäre
PCR anschließt.
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Da
die modifizierte genomische DNA, welche das Ziel der Amplifikationsreaktion
darstellt, anfänglich einzelsträngig ist,
wird im ersten PCR-Zyklus
nur einer der zwei Primer anfänglich
mit dem Zielstrang hybridisieren. Der erste hybridisierte Primer
wird durch eine Polymerase unter Verwendung des Zielstranges als
Matrize verlängert.
Nachfolgend hybridisiert der zweite Primer mit der neu synthetisierten
Kette und wird durch die Polymerase unter Verwendung der neu synthetisierten
Kette als Matrize verlängert.
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Auf
diese Art und Weise wird die anfänglich
einzelsträngige
Ziel-DNA in doppelsträngige
DNA umgewandelt. In den nachfolgenden Zyklen der PCR-Reaktion hybridisieren
im Gegensatz dazu die zwei Amplifikationsprimer jeweils gleichzeitig
mit einem Strang der doppelsträngigen
Ziel-DNA.
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Tabelle
1 zeigt einige spezifische Beispiele für Oligonukleotide, welche als
Primer oder Sonden in dem diagnostischen Verfahren der Erfindung
geeignet sind.
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Die
Oligonukleotide cdh4_MF, cdh4_MR und cdh4_M3F wurden entwickelt,
um spezifisch mit SEQ ID NO: 5 zu hybridisieren. Wenn sie als Primer
in einer PCR-Amplifikation verwendet werden, amplifiziert das Oligonukleotidpaar
cdh4_MF und cdh4_MR eine Sequenz mit 326 bp zwischen Nukleotid 1
und Nukleotid 326 von SEQ ID NO: 5; das Oligonukleotidpaar cdh4_M3F
und cdh4_MR amplifiziert eine Region mit 245 bp zwischen Nukleotid
82 und Nukleotid 326 von SEQ ID NO: 5.
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Die
Oligonukleotide cdh4_UF und cdh4_UR wurden entwickelt, um mit SEQ
ID NO: 7 zu hybridisieren. Wenn sie als Primer in einer PCR-Amplifikation
verwendet werden, amplifiziert das Oligonukleotidpaar cdh4_UF und
cdh4_UR eine Sequenz mit 327 bp zwischen Nukleotid 1 und Nukleotid
327 von SEQ ID NO: 7.
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Es
wurden auch Oligonukleotide in der Region der CpG-Insel, welche
im ersten Intron lokalisiert ist, entworfen. Diese Oligonukleotide
wurden entworfen, um mit dem Teil von SEQ ID NO: 1 zwischen Nukleotid 799
(cdh4_M2F) und Nukleotid 1061 (cdh4_M2R) zu hybridisieren.
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Ein
Kit zur Durchführung
des diagnostischen Verfahrens der Erfindung fällt auch in den Bereich der vorliegenden
Erfindung, wobei der Kit beispielsweise ein Paar Amplifikationsprimer
wie vorausstehend definiert umfassen kann, gegebenenfalls in Kombination
mit einem Reagens, welches die nicht methylierten Cytosinbasen in
Uracil oder eine beliebige andere Base, welche mit einer anderen
Base als Guanin paaren kann, umwandeln kann, wie beispielsweise
Natriumbisulfit in Kombination mit Hydroquinon. Der Kit kann ferner DNA-Detektionsmittel
umfassen, wie beispielsweise eine methylierungsspezifische Hybridisierungssonde,
wie vorausstehend definiert, und/oder DNA-Amplifikationsmittel wie
beispielsweise ein Polymeraseenzym. Als Alternative zu der Sonde
kann der Kit ein DNA-Detektionsreagens umfassen, wie beispielsweise
ein DNA-interkalierendes Mittel, beispielsweise Ethidiumbromid.
Schließlich
kann der Kit der Erfindung ein zweites Paar Amplifikationsprimer
umfassen, welche wenigstens 10 Nukleotide lang sind, wobei eines
der Oligonukleotide komplementär
ist zu einem ersten Segment einer Zielsequenz, die ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID:
7 und SEQ ID NO: 8, und das andere zu einem zweiten Segment der Zielsequenz
identisch ist, wobei das zweite Segment stromabwärts des ersten Segments angeordnet
ist. Vorzugsweise umfasst wenigstens eines der ersten und zweiten
Segmente der Zielsequenz wenigstens ein TpG-Dinukleotid. Das zweite
Primerpaar wird als Kontrolle verwendet, dass die DNA im Anschluss
an die Behandlung mit Bisulfit überhaupt
modifiziert worden ist, wobei es so möglich ist, ein negatives Amplifikationsergebnis
mit Primern, welche auf Grundlage der modifizierten Nukleotidsequenzen
entwickelt wurden, die aus der methylierten CpG-Insel abgeleitet
sind, zu validieren.
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Die
folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung bereitgestellt
und sollen den Bereich der Erfindung, der in den angefügten Ansprüchen definiert
wird, nicht beschränken.
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Beispiele
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Beispiel 1: Analyse des Methylierungsstatus
des CDH4-Gens in Tumorzelllinien
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Es
wurde der Methylierungsstatus der CpG-Insel des CDH4-Gens in den
Zelllinien Hela, SiHa, MCF-7, SkLu-1, BT20, RKO, Hey, G401 und 293
analysiert. Die Zelllinie MDA-MB-231, in welcher CDH4 exprimiert wird,
wurde als negative Methylierungskontrolle verwendet. Diese Zelllinien
wurden auch mittels CDH4-Gen-Transkriptionsanalyse
analysiert, wobei die Linie MDA-MB-231 als positive Transkriptionskontrolle verwendet
wurde.
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Der
Methylierungsstatus wurde analysiert unter Verwendung des MSP-Verfahrens mit chemischer
Behandlung der genomischen DNA durch Natriumbisulfit und Hydroquinon
und PCR-Amplifikation unter Verwendung des cdh4_MF/cdh4_MR-Primerpaars.
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Die
Transkription wurde analysiert durch reverse Transkription der Boten-RNA in cDNA, wobei
sich PCR unter Verwendung der folgenden Primer anschloss:
cdh4_249F:
GTTGGGGCAGATGGGACAGT (SEQ ID NO: 16)
cdh4_547R: ACGTTGATGGGCGGGATGAC
(SEQ ID NO: 17)
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in Panel A (Methylierung) bzw. Panel
B (Transkription) von 2 gezeigt. 2 zeigt,
dass die CpG-Insel am 5' des
CDH4-Gens methyliert ist in den Zelllinien Hela, SiHa, MCF-7, SkLu-1,
BT20 und RKO, und dass das CDH4-Gen in diesen Linien nicht exprimiert
wird, während
in den Linien Hey, G401 und 293, die CpG-Insel nicht methyliert
ist und das CDH4-Gen
exprimiert wird.
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Diese
Untersuchung machte es daher möglich,
eindeutig festzustellen, dass es eine direkte Beziehung zwischen
Methylierung und Hemmung von Transkription des CDH4-Gens gibt.
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Studien,
welche mit der Zelllinie MDA-MB-231 durchgeführt wurden, machten es auch
möglich,
eine spezifische Region der CpG-Insel zu identifizieren, von welcher
sich erwies, dass sie bei der Regulation der Transkription des CDH4-Gens
eine spezielle Rolle spielt. Diese Region, welche Transkription
reguliert, ist 5' vom
ersten Exon aus lokalisiert. In der Zelllinie, MDA-MB-231, in welcher
CDH4 normal transkribiert wird, wurde tatsächlich Methylierung im Intron
beobachtet (welche sich von Nukleotid 47464 bis 49831 der Genbank-Sequenz
AL365229 erstreckt), aber ein Fehlen von Methylierung am 5' des Gens (Nukleotide 47050-47376
der gleichen Sequenz). Methylierung der CpG-Region zwischen den
Nukleotiden, die den Positionen 47050-47376 der Genbank AL365229
entsprechen, hemmt daher ein Funktionieren des CDH4-Gen-Promotors.
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Beispiel 2: Wirkung der Behandlung mit
einem demethylierenden Arzneimittel
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In
einer anderen Untersuchung ist gezeigt worden, dass die Demethylierung
der CpG-Insel, welche durch die Behandlung mit einem demethylierenden
Arzneimittel erreicht wird, die Expression des CDH4-Gens in der
Zelllinie HeLa wiederherstellt. Die Ergebnisse dieses Experiments
sind in 3 gezeigt.
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Die
Zelllinie HeLa wurde einer Methylierungsanalyse mittels der MSP-Technik unterzogen,
wobei die Primer cdh4_MF/cdh4_MR verwendet wurden. Wie erwartet,
erwies sich der Promotor des CDH4-Gens dieser Zelllinie als methyliert
(siehe Panel A von 3).
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Die
Zelllinie HeLa wurde anschließend
MSP unterzogen, wobei das cdh4_UF/cdh4_UR-Primerpaar verwendet wurde,
welches nicht methylierungsspezifisch ist. DNA, welche aus peripherem
Blut von gesunden Individuen extrahiert wurde, wurde als Positivkontrolle
verwendet, Die erhaltenen Ergebnisse sind in Panel B von 3 gezeigt.
Wie erwartet, liegt in den HeLa- Zellen
(in 3B als „unbehandelt" bezeichnet) keine DNA-Amplifikation
vor, während
die Positivkontrolle („Blut") amplifiziert ist.
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Die
HeLa-Zellen werden anschließend
einer Behandlung unterzogen mit: (i) dem demethylierenden Arzneimittel
5-AZA-2-Deoxycytidin (5-AZA-CdR, bezeichnet als „AZA-C" in 3); (ii)
dem Hypoacetylierungsmittel Trichostatin-A („TSA"); und (iii) 5-AZA-CdR in Kombination
mit TSA. Die Behandlung mit dem demethylierenden Arzneimittel führte zu
der Demethylierung der CpG-Insel, wie durch positive Amplifikation
mit den Primern cdh4_UF/UR bestätigt
wurde (siehe Panel B von 3). Im Gegensatz dazu wies das
Hypoacetylierungsmittel Trichostatin-A keinen beobachtbaren Effekt
auf.
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Abschließend zeigt
Panel C von 3 die Ergebnisse der Analyse
der Expression des CDH4-Gens in HeLa-Zellen nach der Behandlung
mit 5-AZA-CdR allein, 5-AZA-CdR + TSA und TSA allein (die Positivkontrolle
war die Zelllinie MDA-MB-231). Wie erwartet, erwies sich, dass das
CDH4-Gen in den Zellen, welche nur mit 5-AZA-CdR und mit 5-AZA-CdR
+ TSA behandelt wurden, exprimiert wird, aber nicht in den Zellen,
welche nur mit TSA behandelt wurden.
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Dieses
Ergebnis ist insbesondere deshalb wichtig, da es einen schlüssigen Beweis
der kausalen Beziehung zwischen Methylierung des Promotors und Transkription
des CDH4-Gens bereitstellt.
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Zusammengefasst
konnte auf Grundlage der Daten, welche aus den Zelllinien-Untersuchungen
erhalten wurden, gefolgert werden, dass Methylierung des CDH4-Promotors
in 6 der 10 analysierten Zelllinien vorliegt und dass die Methylierung
für die
Hemmung der Transkription des CDH4-Gens verantwortlich ist. Dies
ist daher möglicherweise
bei der Bestimmung der neoplastischen Charakteristika der untersuchten
Zelllinien von Bedeutung.
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Beispiel 3: Untersuchung der Methylierung
des CDH4-Gens in humanen Tumoren
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Bei
der Untersuchung der humanen Tumorentstehung geben die Daten, welche
von den Zelllinien erhalten wurden, einen Hinweis auf einen möglichen
pathogenen Mechanismus, aber ein direkter Beweis kann nur aus Untersuchungen
an Primärtumoren
erhalten werden.
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Entsprechend
wurden verschiedene Arten von humanen Geweben, sowohl neoplastische
als auch nicht-neoplastische Gewebe, hinsichtlich des Vorliegens
von Methylierung des CDH4-Promotors untersucht.
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Die
Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, dass die neoplastischen Gewebe,
welche am häufigsten Gegenstand
einer Methylierung des CDH4-Promotors
sind, Magenkarzinome (100% der Fälle)
und kolorektale Karzinome (78% der Fälle) sind.
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Um
auszuschließen,
dass die erhaltenen Daten durch gewebespezifische Methylierung oder
durch Methylierung, welche mit dem Alter des Patienten korreliert
ist, bedingt sind und deshalb nicht direkt durch die neoplastische
Art des Gewebes begründet
sind, wurden Proben der Magenschleimhaut und der kolorektalen Schleimhaut
auch von Individuen analysiert, welche nicht unter einer neoplastischen
Erkrankung litten. In keinem Fall wurde irgendeine Methylierung
festgestellt. Diese Daten zeigen, dass die Methylierung der CpG-Insel des
CDH4-Gens während der
neoplastischen Transformation entsteht und deshalb als tumorspezifischer
diagnostischer Marker verwendet werden kann. Sie zeigen auch ein
bestimmtes Maß an
Spezifität
hinsichtlich der Art der Neoplasie, bei welcher Methylierung auftritt.
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Zusätzlich wurde
bewertet, ob die Methylierung des CDH4-Gens im neoplastischen Prozess
früh oder spät auftritt.
Nach Karzinomen wurden deshalb Darmadenoma, d.h. gutartige Neoplasmen,
untersucht, wobei es sich gemäß einem
gut bekannten Multiphasenmodell zu kolorektaler Neoplasie um ein
frühes
Stadium der Entwicklung zu invasiven Karzinomen hin handelt. Eine
Analyse von 5 Darmadenoma zeigte, dass sie alle im CDH4-Methylierungstest
positiv waren, wodurch gezeigt wird, dass diese epigenetische Läsion früh auftritt.
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Es
wurden auch 17 Gewebeproben, benachbart zum Darm-Tumor, und 21 Gewebeproben,
benachbart zum Magentumor, analysiert, wobei die histopathalogische
Analyse dieser Proben keine Veränderungen hinsichtlich
des neoplastischen Typs detektiert hatte.
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Der
CDH4-Methylierungstest macht es möglich, das Vorliegen von CDH4-Methylierung auch
in diesen Proben zu identifizieren, wodurch gezeigt wurde, dass
im Vergleich mit herkömmlichen
Techniken, beim Detektieren von Gewebeveränderungen, welche wahrscheinlich
pre-neoplastischer Art sind, Techniken auf Grundlage epigenetischer
Typmarker eine größere Sensitivität aufweisen.
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Dank
der hohen Spezifität
und Sensitivität
der Analysetechniken können
die Veränderungen
der Methylierung, welche in menschlichen Tumoren beobachtet wurden,
auch in organischen Fluiden deutlich gemacht werden. Dieses Phänomen kann
anhand der Tatsache erklärt
werden, dass Tumorzellen von der neoplastischen Masse losgelöst werden
können
und DNA in das Kreislaufsystem oder in das Lumen des Organs, aus
welchem sie stammen, abgeben können.
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Es
wurde deshalb der Versuch unternommen, das Vorliegen zirkulierender
Tumor-DNA durch Analyse von 11 Blutproben aus Patienten mit einem
kolorektalen Tumor zu detektieren. Der Methylierungstest erwies sich
in 5 von 11 Proben (45%) als positiv, wobei eine einfache PCR (50
Zyklen) verwendet wurde, wobei unter den gleichen Bedingungen keine
Spuren von Methylierung in 17 Blutproben an gesunden Freiwilligen
festgestellt wurden. Wenn der Test durchgeführt wurde mit einer primären PCR
(cdh4-MF/cdh4-MR-Primer) und einer anschließenden halbverschachtelten
sekundären
PCR (cdh4-M3f/cdh4-MR-Primer)
wurde die Rate der Positiven erhöht
auf 9 aus 11 (82%), in Blutproben von Patienten, welche unter kolorektalem
Karzinom leiden.
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Tabelle
2 fasst alle vorausstehend beschriebenen Ergebnisse zusammen. Tabelle 2. Prozentsatz der Methylierung
des CDH4-Promotors in humanen Geweben
| Probe | | Methylierung |
| Magen | Karzinom | 100,00
(21/21) |
| Schleimhaut
benachbart zum Tumor | 81,0
(17/21) |
| Darm | Karzinom | 77,6
(38/49) |
| Schleimhaut
benachbart zum Tumor | 29,4
(5/17) |
| Adenom | 100,0
(5/5) |
| Blut | 82,0
(9/11) |
| Brust | Karzinom | 42,6
(20/47) |
| Gebärmutterhals | Karzinom | 35,0
(7/20) |
| Leber | Karzinom | 4,3
(1/23) |
| normale Kontrollen | Magenschleimhaut | 0,0
(0/6) |
| Darmschleimhaut | 0,0
(0/3) |
| Blut | 0,0
(0/17) |
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass die MSP-Technik, welche mit dem CDH4-Marker angewandt
wird ausreichend sensitiv ist, um Spuren von zirkulierender Tumor-DNA
zu detektieren und deshalb zu Diagnosezwecken verwendet werden kann
mittels eines relativ einfachen Assays, welcher durch nicht-invasive
Verfahren bei niedrigen Kosten durchgeführt werden kann.
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Neben
Blut können
durch die beschriebene Methodik auch andere organische Fluide analysiert
werden. Derartige Fluide, welche beispielhaft erwähnt werden
können,
sind Serum, Plasma, Bronchialspülungen, Auswurf, Speichel,
Darmspülungen,
Urin, Fäkalien,
Ejakulat, Tupfer von unterschiedlichem Ursprung, Nadelaspirate und
Lymphknotenbiopsien.
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Zusammenfassend
haben es die Daten, welche aus Primärtumoren erhalten wurden, möglich gemacht,
das Vorliegen der veränderten
Methylierung der CpG-Insel des CDH4-Gens zu zeigen, insbesondere der
Promotorregion, mit einer Häufigkeit,
welche in Abhängigkeit
von der Art der Neoplasie variiert. In einigen Fällen war die Häufigkeit
100% oder sehr eng bei 100%, wie beispielsweise in Darmkarzinomen
oder kolorektalen Karzinomen. Diese Veränderung tritt früh im neoplastischen
Prozess auf und kann durch nichtinvasive Untersuchungen, welche
an biologischen Proben nicht-neoplastischer Natur, wie beispielsweise
Blutproben, durchgeführt
werden, deutlich gemacht werden.
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Beispiel 4: Materialien und Verfahren
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Proben
von Tumorgeweben wurden entnommen aus Patienten mit kolorektalem
Karzinom, Magenkarzinom, Leberkarzinom, Brustkarzinom, Prostatakarzinom,
Eierstockkarzinom oder Gebärmutterhalskarzinom während des
chirurgischen Eingriffs und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren.
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Das
Blut wurde vor dem chirurgischen Eingriff von Patienten gewonnen,
welche unter kolorektalem Karzinom litten. Es wurden 3 ml peripheres
Blut in einem Vacutainer-Röhrchen
gesammelt, welches 5,9 mg EDTA enthielt.
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Das
Tumorgewebe wurde über
Nacht bei 37°C
in Hirt-Lösung
(50 mM Tris-HCl
pH 8, 50 mM EDTA, 0,6% SDS) lysiert mit Zugabe von 200 μg/ml Proteinase
K bei 37°C über Nacht.
Die DNA wurde anschließend mit
Phenolchloroform extrahiert, mit 3 M Na-Azetat und ETOH präzipitiert
und in TE (Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM) resuspendiert.
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Die
DNA wurde aus dem Blut mit dem PROMEGA Kit Kat. Nr. #'A1120 extrahiert,
wobei von einem Volumen von 600 μl
Gesamtblut ausgegangen wurde und resuspendiert in TE (Tris-HCl pH
8 10 mM, EDTA 1 mM).
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Die
DNA-Proben wurden klinisch modifiziert gemäß dem Protokoll, welches beschrieben
wird von Herman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821, 1996),
an welchem einige Modifikationen durchgeführt wurden. Für jede Probe
wurde 1 μg
DNA in 50 μl
H2O verdünnt
und denaturiert mit 3,5 μl,
3 M NaOH bei 37°C
für 10
Minuten. Anschließend
wurden 30 μl
von 10 mM Hydroquinon (Sigma Kat. Nr. H-9003) und 520 μl 3 M Natriumbisulfit
pH 5 (Sigma S-8890) zugegeben und das Gemisch wurde für 16 Stunden
bei 50°C
inkubiert. Die Proben wurden gereinigt mit 0,6 ml Harz aus dem DNA
Wizard Cleanup Kit (Promega Kat. Nr. #A7280). Es wurde dreimal mit
80% Isopropanol gewaschen, wobei nach Abschluss hiervon 100 μl H2O, welche auf 70°C vorerwärmt waren, zur Resuspendierung
der DNA zugegeben wurden. 11 μl
3 M NaOH wurden für
5 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben und die Proben wurden präzipitiert
mit 66 μl
10 M NH4-Acetat und ETOH unter Verwendung
von 1 μl
Glykogen als Träger
(Invitrogen Kat. Nr. #10814-010). Abschließend wurde die modifizierte
DNA resuspendiert in 40 μl
H2O, welches auf 70°C vorerwärmt war.
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Die
PCR-Analyse der DNA-Proben aus Tumorgewebe wurde durchgeführt mit
den Primern cdh4_MF und cdh4_MR. Die PCR wurde durchgeführt mit
HotStart Taq DNA-Polymerase (Qiagen Kat. Nr. #203203) unter Zugabe
von 10% DMSO gemäß den im
Folgenden beschriebenen Bedingungen:
95°C für 15 Minuten;
95°C für 30 Sekunden,
60°C für 30 Sekunden,
72°C für 1 Minute,
40 Zyklen;
72°C
für 10
Minuten.
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Die
PCR an den DNA-Proben aus Blut wurde in zwei Schritten durchgeführt, wobei
im ersten Schritt (primäre
PCR) das cdh4_MF und cdh4_MR-Paar
mit 50 Reaktionszyklen verwendet wurde und im zweiten Schritt (halbverschachtelte
sekundäre
PCR) die Primer cdh4_M3F und cdh4_MR bei weiteren 50 Reaktionszyklen
verwendet wurden, wobei 1 μl
aus der primären
PCR-Reaktion 1:10 verdünnt
verwendet wurde.
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Das
Vorliegen von Amplifikaten wurde detektiert durch Unterziehen der
PCR-Produkte einer Elektrophorese in 1,5% Agarosegel (Fisher Kat.
Nr. #AS-109) und
mit Ethidiumbromid und Ultraviolettlicht bestätigt.
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Diskussion
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Die
erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass eine abweichende Methylierung
der CpG-Insel zwischen den Nukleotidpositionen 46801 und 49600 der
Genbank-Sequenz
AL365229, entsprechend der 5'-Region
des CDH4-Gens und insbesondere der Promotorregion, einen nützlichen
diagnostischen Marker für
neoplastische Erkrankungen darstellt. Die Möglichkeit, dass das CDH4-Gen
eine Oncosuppressorfunktion aufweist, legt darüber hinaus nahe, dass diese
Art von Untersuchung ein mögliches
Werkzeug zur Bewertung der Nützlichkeit der
Verwendung von CDH4 als Werkzeug zur anti-neoplastischen Gentherapie
sein kann.
-
Die
MSP-Methylierungsanalysetechnik (methylierungsspezifische PCR) ist
beschrieben worden von Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:9821, 1996 und in
US-Patent
Nr. 5,786,146 .
-
Selbstverständlich kann
das diagnostische Verfahren der Erfindung auch durchgeführt werden
unter Verwendung anderer Arten von Assays, welche eine veränderte DNA-Methylierung
bestätigen
können.
Von diesen sollen die Folgenden beispielhaft genannt werden: (i) „MethyLight", beschrieben von
Eads et al., Cancer Research 59:2302, 1999; (ii) Ms-SNuPE (methylierungssensitive
Einzelnukleotid-Primerextension), beschrieben von Gonzalgo et al.,
Nucleic Acid Research 25:2529, 1997; (iii) „COBRA" (kombinierte Bisulfit-Restriktionsanalyse),
beschrieben von Xiong et al., Nucleic Acid Research 25: 2532, 1997; „MS. AP-PCR" (methylierungssensitive
arbitrarily-primed Polymerasekettenreaktion), beschrieben von Gonzalgo
et al., Cancer Research 57: 594, 1997; „MCA" (Amplifikation einer methylierten CpG-Insel),
beschrieben von Toyota et al., Cancer Research 59: 2307, 1999 und
im Patent
WO 00/26401
A1 .
-
Im
Lichte der Häufigkeit,
welche in Magendarmtrakt-Tumoren beobachtet wird, ist der CDH4-Methylierungsmarker
bei kolorektalen Tumoren und Magentumoren von besonderer Bedeutung.
Diese Neoplasien sind in der westlichen Bevölkerung unter den am stärksten verbreiteten
Neoplasien und trotz des in der biochemischen Forschung erreichten
Fortschritts bleibt die Sterblichkeit sehr hoch. Dies ist hauptsächlich einer
schlechten Prognose aufgrund eines fortgeschrittenen Stadiums der
Krankheit zum Zeitpunkt der Diagnose zuzuschreiben. Gegenwärtig verwendete
diagnostische Techniken basieren auf radiographischen und/oder endoskopischen
Verfahren, welche aufwändig
und invasiv sind. Eine Alternative zur Diagnose durch Bildgebung wird
gegenwärtig
repräsentiert
durch Testen nach okkultem Blut in den Fäkalien oder nach Tumorantigenen
im Serum. Während
der erste Test etwas unverlässlich
ist, da er nicht vollständig
spezifisch ist und eine niedrige Sensitivität aufweist, wobei er kleine
Neoplasmen nicht diagnostizieren kann, erweisen sich Tests basierend auf
der Detektion von Tumorantigenen in Serum als von geringem Nutzen,
da sie nur dann informativ sind, wenn die Erkrankung einmal ein
fortgeschrittenes Stadium erreicht hat.
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Aus
diesem Grund ist es wünschenswert,
Marker für
Neoplasie zu identifizieren, welche charakterisiert sind durch ein
hohes Maß an
Spezifität
und welche detektierbar sind bei einem sehr hohen Grad an Sensitivität mittels
im Wesentlichen nicht-invasiver und kostengünstiger Verfahren.
-
Die
abweichende Methylierung der CpG-Insel von CDH4 ist ein Marker,
der diese Anforderungen erfüllt.
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Wie
in der vorliegenden Untersuchung gezeigt, kann die Methylierung
der CpG-Insel von CDH4 in verschiedenen humanen Tumoren detektiert
werden, insbesondere in Magenkarzinomen, kolorektalen Karzinomen
und Brustkarzinomen. Die erhaltenen Ergebnisse legen jedoch nahe,
dass dieser Marker auch verwendet werden kann bei der Diagnose eines
breiten Bereichs neoplastischer Erkrankungen, umfassend sowohl feste Tumore
als auch neoplastische Erkrankungen des Bluts, und insbesondere
bei der Diagnose von primären
Tumoren des Zentralnervensystems, cerebralen Metastasen, Tumoren
des Auges, Tumoren der Hypophyse, Tumoren der Schilddrüse, Tumoren
der Nebennierenrinde, Tumoren des diffusen endokrinen Systems, Tumoren des
Kopfes und des Halses, Tumoren der Lunge, bösartigem Mesotheliom, Thymomen
und Thymustumoren, Tumoren des Herzens und großer Blutgefäße, primären thorakalen Keimzellentumoren,
metastatischen Tumoren der Thorax, Speiseröhrentumoren, Lebertumoren,
Magentumoren, Tumoren der Gallenblase und der Gallengänge, Tumoren
des exokrinen Pankreas, Tumoren der Vater-Ampulle, Tumoren des Dünndarms,
Tumoren des Wurmfortsatzes und des Bauchfells, Tumoren des Dickdarms
und des Rektums, Tumoren des Anus, Nierentumoren, Tumoren des Beckens
und des Harnleiters, Tumoren der Blase, Tumoren der Prostata, Tumoren des
Penis und der Harnröhre,
testikulärem
Tumor, Tumoren der Vulva und der Vagina, Tumoren des Gebärmutterhalses,
Gebärmutterschleimhautkrebs,
Eileitertumoren, Eierstocktumoren, gynäkologischen Sarkomen, Brusttumoren,
bösartigem
Melanom, Tumoren der Haut, Tumoren der Knochen, Weichgewebesarkosomen, Wilms-Tumor,
Neurobastom, Rhabdomyosarkom, Kaposi-Sarkom, myelodysplastischem
Syndrom, akuter myeloischer Leukämie
beim Erwachsenen und beim Kind, chronischer myeloischer Leukämie, akuter
Lymphozytenleukämie
beim Erwachsenen, akuter Lymphozytenleukämie beim Kind, chronischer
Lymphozytenleukämie, Haarzellenleukämie, Basophilenleukämie, Hodgkin-Krankheit, Nicht-Hodgkin-Lymphomen,
Pilzmykose und Sézary-Syndrom,
Plasmazelltumoren, chronischen myeloproliferativen Störungen (essentielle
Thrombozytopenie, Myelofibrose mit Myeloidmetaplasie, echte Polycythämie).
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Die
Methylierung dieses Markers ist darüber hinaus spezifisch für das neoplastische
Gewebe, dahingehend, dass sie in normalen Proben nicht festgestellt
wird. Darüber
hinausgehend ist CDH4-Methylierung auch im Blut von Patienten detektierbar,
welche unter Neoplasie leiden, wobei es sich hinsichtlich der Entwicklung
von nicht-invasiven diagnostischen Assays, welche an Proben aus
biologischen Material durchgeführt werden,
die leicht zu entnehmen sind, wie beispielsweise Serum, Plasma,
Bronchialspülungen,
Auswurf, Speichel, Darmspülungen,
Urin, Fäkalien,
Ejakulat, Nadelaspiratproben, Tupfer oder Lymphknoten, um einen
erheblichen Vorteil handelt. Darüber
hinaus ist es vernünftig
anzunehmen, dass dieser Marker für
die frühe
Diagnose von Tumoren verwendet werden kann, da die Methylierung
des CDH4-Promotors in einem früheren
Stadium dieser Erkrankung auftritt, wie es durch Darmadenoma beispielhaft
dargelegt ist. Angesichts der möglichen
Oncosuppressoreigenschaften des CDH4-Gens (in anderen Worten, ein
Gen, welches einige wesentliche Eigenschaften der neoplastischen
Zelle hemmen kann), kann die Bestimmung des Methylierungsstatus dieses
Gens auch verwendet werden, um wertvolle Hinweise betreffend die
Verwendung von CDH4 in Gentherapieprotokollen bereitzustellen. Sequenzprotokoll
