DE69434809T2

DE69434809T2 - Bc200 rna, daraus abgeleitete proben und entsprechende anwendungen

Info

Publication number: DE69434809T2
Application number: DE69434809T
Authority: DE
Inventors: Henri New York TIEDGE; Jürgen New York BROSIUS
Original assignee: Mount Sinai School of Medicine
Current assignee: Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-25
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2014-05-26
Also published as: CA2163249A1; ATE335091T1; EP0701629B1; WO1994028176A3; US5670318A; JPH08510649A; EP0701629A1; WO1994028176A2; DE69434809D1; US5736329A

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Anmeldung bezieht sich auf Oligonucleotidsonden, die für menschliche BC200-RNA spezifisch sind, und auf die Verwendung dieser Sonden beim Screenen nach neoplastischen Erkrankungen und neurologischen und psychiatrischen Störungen.
BC200-RNA ist eine 200 Nucleotide lange, nicht translatierbare RNA, die vorwiegend im Nervensystem von Primaten, einschließlich des Menschen, exprimiert wird. Watson und Sutcliffe, Molecular & Cellular Biology 7, 3324-3327 (1987), berichteten über eine Nucleotid-Teilsequenz von BC200-RNA aus Affenhirnen. Diese 138-Nucleotid-Sequenz wies eine beträchtliche Homologie zum linken Alu-Monomer auf, einer Sequenz, die im gesamten menschlichen Genom und in anderen Primatengenomen oftmals wiederholt wird. Watson und Sutcliffe stellten die Hypothese auf, dass der Rest der 200-Nucleotid-RNA einem Poly-(A)-Trakt entsprechen könnte.
Wir bestimmten nunmehr die komplette Sequenz für menschliche BC200-RNA und fanden heraus, dass das 3'-Ende des Polynucleotids eine nur einmal vorhandene Sequenz umfasst, die zum spezifischen Nachweis des Vorhandenseins von menschlicher BC200-RNA verwendet werden kann, und zwar ohne Störung durch andere Fälle der Alu-Sequenz innerhalb des Genoms. Weiters fanden wir heraus, dass BC200-RNA in einer Vielzahl von nicht-neuronalen menschlichen Tumorgeweben durchwegs in großen Mengen vorkommt, während sie in normalem nicht-neuronalem Gewebe mit Ausnahme von Keimzellen in nachweisbaren Mengen nicht vorzukommen scheint.
Demgemäß besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von Oligonucleotidsonden, die sich spezifisch mit dem nur einmal vorhandenen Abschnitt von menschlicher BC200-RNA oder einer korrespondierenden chromosomalen DNA-Sequenz verbinden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Testen hinsichtlich des Vorhandenseins von BC200-RNA in einer Gewebeprobe, insbesondere für die Zwecke des Screenens nach neoplastischen Erkrankungen und neurologischen und psychiatrischen Störungen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Ausstattungen, welche beim Testen hinsichtlich des Vorhandenseins von BC200-RNA in einer Gewebeprobe nützlich sind.
Kurzfassung der Erfindung
Das am Nucleotid 159 beginnende 3'-Ende von BC200-RNA hat die Sequenz:
Erfindungsgemäße Oligonucleotidsonden sind zu zumindest einem Teil dieser Sequenz komplementär, so dass sie spezifisch und selektiv an menschliche BC200-RNA binden. Die Sonden sind beim Bestimmen der Verteilung von BC200-RNA im Körper und als Indikator für neoplastische Erkrankungen in nicht-neuronalem Gewebe nützlich. Sonden, welche die Nucleotide 48 und 49 oder die Nicht-A-Nucleotide des A-reichen Bereichs (146-148) von BC200-RNA umspannen, sind außerdem nützlich für das Nachweisen der RNA.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A und 1B zeigen die Ergebnisse von Northern-Blot-Versuchen zum Nachweisen von BC200-RNA in verschiedenen menschlichen Geweben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Bei Primaten-BC200-RNA handelt es sich um eine 200 Nucleotide lange, nicht translatierbare RNA. Wir legten die primäre Sequenz von menschlicher BC200-RNA wie folgt fest:
Die X an den Positionen 1 und 2 sind unabhängig voneinander entweder G oder fehlen.
Diese primäre Sequenz kann in drei strukturelle Domänen unterteilt werden. Domäne I umfasst die Nucleotide 1-122 und ist im Wesentlichen zu Alu-repetitiven Elementen homolog, welche in hohen Kopiezahlen in Primatengenomen zu finden sind. Dieser Bereich umfasst jedoch zwei Basen, die in Alu- oder SRP-RNA nicht zu finden sind, d.h., Nucleotide an den Positionen 48 und 49, welche zum Entwickeln von Amplifikationsprimern, die für BC200-Sequenzen spezifisch sind, eingesetzt werden können. Domäne II ist ein A-reicher Bereich, der aus den Nucleotiden 123-158 besteht. Domäne III, die aus den Nucleotiden 159-200 besteht, enthält eine nur einmal vorhandene Sequenz ohne Homologie zu anderen bekannten menschlichen Sequenzen, welche zum Identifizieren von BC200-RNA in Geweben eingesetzt werden kann.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Oligonucleotidsonden bereitgestellt, welche zu den nur einmal vorhandenen Sequenzen der Domäne III von menschlicher BC200-RNA oder zu einer korrespondierenden chromosomalen DNA komplementär sind, d.h., welche zu zumindest einem Teil der Sequenz:
komplementär sind.
Bei solchen Sonden handelt es sich um lineare Oligonucleotide, die etwa 10 bis 60 Basen enthalten. Die Länge muss ausreichend sein, um für einen angemessenen Grad an Spezifität zu sorgen, so dass einer Bindung an BC200-RNA gegenüber einer Bindung an andere Polynucleotide der Vorzug gegeben wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Oligonucleotidsonde" entweder auf eine DNA- oder eine RNA-Sonde.
Eine zum Umfang der Erfindung gehörige Sonde ist zu den Nucleotiden 156-185 von BC200-RNA komplementär. Diese 30-Nucleotid-Sonde hat die Sequenz:
Bei einer weiteren nützlichen Sonde handelt es sich um eine 21-Nucleotid-Sonde, die zu den Nucleotiden 158-178 komplementär ist, d.h.:
Wie aus diesen beiden Beispielen hervorgeht, können geeignete Sonden zu den BC200-RNA-Abschnitten außerhalb der Domäne III komplementär sein, vorausgesetzt, dass sie ebenso zu einem Teil (d.h. zu zumindest etwa 10 Basen) der einzigartigen Domäne III komplementär sind, welcher ausreicht, um für Spezifität zu sorgen. Die Sonden können auch ausschließlich zu Teilen der Domäne III komplementär sein. Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einer zweiten Klasse von Sonden, die zu einem Teil der Domäne II, der die Nucleotide 146-148 umspannt, komplementär sind. Diese Sonden können zur Detektion von BC200-RNA oder als Amplifikationsprimer verwendet werden.
Gemäß wiederum einem weiteren Aspekt der Erfindung können Sonden verwendet werden, die zu einem Teil der Alu-repetitiven Sequenz komplementär sind und spezifisch mit diesem hybridisieren, welcher die beiden einzigartigen Nucleotide an den Positionen 48 und 49 von BC200-RNA oder der korrespondierenden DNA umspannt. Beispiele für solche Sonden sind:
eine Antisinnsonde, die BC200-RNA bindet, und
eine Sinnsonde, die an korrespondierende DNA-Sequenzen bindet. Diese Sonden können für die Detektion oder als Amplifikationsprimer verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Sonden können durch irgendeine aus einer Vielzahl von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. RNA-Sonden können beispielsweise durch in vitro-Transcription erzeugt werden. Bei dieser Vorgehensweise wird die gewünschte Sequenz zuerst in einen geeigneten Transcriptionsvektor (z.B. pBluescript) kloniert. Dieser Vektor wird linearisiert, so dass die Transcription an einer spezifischen Stelle endet, und die RNA wird aus solchen linearisierten Matrizen unter Verwendung von SP6-, T3- oder T7-RNA-Polymerase transcribiert. Die Sonden können ³⁵S- oder ³H-markiert werden, indem die passenden radiomarkierten Vorläufer zur Reaktionsmischung hinzugefügt werden. Matrizen-DNA wird dann mit DNase I aufgeschlossen. RNA-Sonden können durch Geifiltration oder Gelelektrophorese weiter gereinigt werden.
Die Sonden können auch durch Oligomarkierung hergestellt werden, obwohl diese Technik für längere Nucleinsäurepolymere eher geeignet ist. Bei diesem Verfahren wird doppelsträngige DNA zuerst denaturiert. Zufallssequenz-Oligonucleotide werden dann als Primer für die Matrizen-gerichtete Synthese von DNA eingesetzt. Bei dieser Anwendung wird häufig das Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I verwendet. Wenn es sich bei der Matrize um RNA handelt, kann eine Reverse Transcriptase eingesetzt werden. Die Markierung der Sonde wird durch den Einbau radiomarkierter Nucleotide, z.B. von [α-³²P]dNTPs, erzielt.
Eine weitere Vorgehensweise zum Erzeugen von Sonden ist die Nick-Translation. Bei diesem Verfahren wird doppelsträngige DNA verwendet. Einzelstrangbrüche (Lücken in einem Strang) werden durch DNase I eingeführt. Gleichzeitig wird E. coli-DNA-Polymerase I verwendet, um an den Einzelstrangbruchpunkten Nucleotidreste zu den 3'-Enden der DNA hinzuzufügen. Der Einbau radiomarkierter Vorläufernucleotide führt zur gleichmäßigen Markierung der Sonde. Die Sonden enthalten beide Stränge.
Einzelsträngige DNA-Sonden können aus Matrizen hergestellt werden, die von Bakteriophagen-M13- oder ähnlichen Vektoren abgeleitet sind. Ein Oligonucleotidprimer, der zu einem spezifischen Segment der Matrize komplementär ist, wird dann mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I verwendet, um einen zur Matrize komplementären, radiomarkierten Strang zu erzeugen. Die Sonde wird beispielsweise unter denaturierenden Bedingungen durch Gelelektrophorese gereinigt.
Oligonucleotide jeder gewünschten Sequenz können ebenfalls chemisch synthetisiert werden. Bei der automatisierten Synthese von Oligonucleotiden werden Festphasenverfahren routinemäßig eingesetzt.
Sonden, die bei der Erfindung nützlich sind, können markiert werden. Eine Vielzahl von Enzymen kann zum Anbringen von Radiomarkierungen (unter Verwendung von dNTP-Vorläufern) an DNA-Enden verwendet werden. Die 3'-Enden doppelsträngiger DNA können beispielsweise unter Verwendung des Klenow-Fragments von E. coli-DNA-Polymerase I markiert werden. Eine DNA mit glatten Enden oder vertiefte 3'-Enden sind geeignete Substrate. T4-DNA-Polymerase kann ebenfalls zum Markieren hervorstehender 3'-Enden verwendet werden. T4-Polynucleotidkinase kann verwendet werden, um eine ³²P-Phosphatgruppe zu den 5'-Enden einer DNA zu transferieren. Diese Reaktion ist besonders nützlich, um einzelsträngige Oligonucleotide zu markieren. Sonden können auch durch PCR-Markierung markiert werden, wobei markierte Nucleinsäuren und/oder markierte Primer bei der PCR-Erzeugung von Sonden aus einem geeigneten Klon verwendet werden. Siehe Kelly et al., Genomics 13:381-388 (1992).
Die erfindungsgemäßen Sonden können verwendet werden, um Gewebe hinsichtlich des Vorhandenseins von BC200-RNA zu screenen. Zum Beispiel wurde die Verteilung von BC200-RNA in der menschlichen Netzhaut untersucht, mit dem Ergebnis, dass BC200-RNA in der Ganglionzellschicht, in der inneren plexiformen Schicht und in der innersten Schicht der inneren Kernschicht, jedoch nicht in anderen Teilen der Netzhaut nachgewiesen wurde. Eine ähnliche Kartierung war im Hippocampus und beim Neocortex möglich, und zwar unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sonden.
Indem wir die obenstehend erwähnten Sonden in in situ-Hybridisierungsversuchen verwendeten, wiesen wir nach, dass die BC200-Expressionsstärken in manchen Gehirnbereichen alternder Individuen und in Alzheimer-Gehirnen verändert sind. Es stellte sich heraus, dass die BC200-Pegel in mehreren kortikalen Bereichen, insbesondere in den Brodmann-Bereichen 9 und 17/18, mit dem Alter (Altersgruppe 50-90 Jahre) abnehmen. In denselben Gehirnbereichen von Alzheimer-Patienten wurde ein drastischer Anstieg der BC200-Expression beobachtet. Daher können BC200-Sonden verwendet werden, um zwischen einer Alzheimer-Erkrankung und dem normalen Alterungsprozess zu unterscheiden.
Nicht-neuronale Gewebe können gemäß der Erfindung ebenfalls hinsichtlich des Vorhandenseins von BC200-RNA untersucht werden. Wir beobachteten, dass die meisten normalen, nicht-neuronalen Gewebe keine nachweisbaren Mengen an BC200-RNA enthalten, dass aber eine Vielzahl von menschlichen Tumorgeweben BC200-RNA exprimiert, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sonden nachgewiesen werden kann. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Screenen nach neoplastischen Erkrankungen, wobei Sonden für BC200-RNA verwendet werden.
Die grundlegende Methodik des Screeningvorgangs umfasst die folgenden Schritte:

(1) das Behandeln einer physiologischen Probe, um RNA und/oder DNA für die Hybridisierung verfügbar zu machen;
(2) das Hybridisieren der behandelten Probe mit einer für die Domäne III von menschlicher BC200-RNA spezifischen Sonde; und
(3) das Analysieren hinsichtlich des Auftretens einer Hybridisierung. Geeignete physiologische Proben umfassen Biopsieproben, Körperflüssigkeiten wie z.B. Sputum, Abgekratztes vom Gebärmutterhals oder von der Speiseröhre und Hautproben. Neuronales Gewebe, z.B. Biopsieproben und Post-Mortem-Material, kann für eine Bewertung neurologischer Störungen ebenfalls hinsichtlich BC200-RNA gescreent werden.

Obgleich das zur Behandlung der Gewebeprobe angewandte Verfahren nicht entscheidend ist, vorausgesetzt, dass Nucleinsäuren in der Probe für die Hybridisierung verfügbar gemacht werden, sind mehrere spezifische Optionen beachtenswert. Die direkte Isolierung von RNA durch das Guanidinthiocyanat-Verfahren, gefolgt von einer CsCl-Dichtegradient-Zentrifugation, kann in vielen Fällen effektiv sein, insbesondere für eine Isolierung von RNA aus Biopsieproben (siehe Beispiel 4). Wenn die Probengröße gering ist, wie z.B. in einer Sputumprobe, kann jedoch eine Amplifikation der RNA wünschenswert sein.
Die Amplifikation der RNA kann erzielt werden, indem zuerst Zellen in der Probe lysiert werden, um die RNA für eine Hybridisierung verfügbar zu machen. Dies kann durch (1) Extraktion von RNA mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt von einer Zentrifugation in Cäsiumchlorid; (2) Extraktion von RNA mit Guanidin-HCl und organischen Lösungsmitteln; oder (3) Extraktion von RNA mit milden Detergentien (wie z.B. NP-40), kombiniert mit Proteinase-Aufschluss, bewerkstelligt werden. Diese und andere RNA-Extraktionsverfahren sind bei Sambrook et al. beschrieben. Die isolierte RNA wird in cDNA umgewandelt, die danach unter Verwendung von Sonden, die hinsichtlich des 3'-Endes der BC200-Sequenz selektiv sind, amplifiziert wird. (Siehe Beispiel 3 und das hier durch Bezugnahme aufgenommene U.S.-Patent Nr. 4,683,202). cDNA kann auch unter Anwendung von auf Ligase basierenden Verfahren (Barany et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88, 189-193 (1991)) oder von isothermen Verfahren auf Basis einer Transcription (Kwoh et al., Proc. Nat'. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)) amplifiziert werden. Die amplifizierte DNA kann dann mittels einer geeigneten Sonde gemäß der Erfindung direkt nachgewiesen werden.
Die Hybridisierung kann unter Anwendung irgendeiner der zahlreichen Verfahrensweisen, die beim Analysieren hinsichtlich Nucleinsäuren bekannt sind, durchgeführt werden. Diese umfassen verschiedene Blot-Techniken (d.h. Punkt, Northern, Southern etc.) und Techniken auf Sandwich-Basis, wie z.B. jene, die in den U.S.-Patenten Nr. 4,486,539; 4,751,177; 4,868,105; 4,894,325 und in der europäischen Patentveröffentlichung 0 238 332 (alle sind hier durch Bezugnahme aufgenommen) beschrieben sind. Um die Detektion zu erleichtern, kann die Sonde eine Markierung, wie z.B. eine Radiomarkierung, eine chemilumineszente Markierung, eine fluoreszierende Markierung oder eine chromogene Markierung, oder eine Immobilisierungskomponente aufweisen. Mit Biotin oder Digoxygenin modifizierte Sonden, die entweder als nachweisbare Markierung oder als Immobilisierungskomponente dienen können, sind besonders nützlich.
Die erfindungsgemäßen Sonden werden geeigneterweise als Teil einer Ausstattung zum Screenen von Gewebe hinsichtlich BC200-RNA geliefert. Zusätzlich zur Sonde oder zu einem anderen Nachweisreagens, das ein diagnostisches Reaktionsprodukt erzeugt, wenn BC200-RNA vorhanden ist, kann eine solche Ausstattung eines oder mehr von Folgendem umfassen:

(1) einen festen Träger, an dem das diagnostische Reaktionsprodukt während des Screeningvorgangs befestigt ist;
(2) Amplifikationsprimer und Enzyme für die Amplifikation von Nucleinsäuren in einer Probe;
(3) ein markiertes Reagens, das mit dem diagnostischen Reaktionsprodukt reagiert, um dieses nachweisbar zu machen; und
(4) Lösungen, die dahingehend wirksam sind, die physiologische Probe zu lysieren, um die RNA für eine Hybridisierung verfügbar zu machen. Geeignete Amplifikationsprimer umfassen jene, die in Beispiel 2 identifiziert werden, sowie andere, die zu einer Amplifikation – falls eine solche vorhanden ist – der Domäne III von BC200-RNA, möglicherweise zusammen mit Teilen der Domänen II und I, führen. Ein besonders bevorzugter 5'-Amplifikationsprimer ist ein solcher, der zu einem Teil der Domäne I von BC200-RNA oder zur korrespondierenden cDNA, welche die einzigartigen Nucleotide an den Positionen 48 und 49 umfasst, komplementär ist. Geeignete Enzyme umfassen Reverse Transcriptase, Taq-Polymerase, rTth-DNA-Polymerse und RNA-Polymerse.

Obgleich die Erfindung hauptsächlich in Hinblick auf die Verwendung von Oligonucleotidhybridisierungssonden zum Nachweisen von BC200-RNA beschrieben ist, ist zu erkennen, dass das günstige Ergebnis beim Screenen nach neoplastischen Erkrankungen mittels irgendeiner Detektionstechnik erzielt werden kann. Beispielsweise könnten RNA-spezifische Antikörper für BC200-RNA z.B. in einem ELISA-Assay verwendet werden, um in Gewebeproben BC200-RNA nachzuweisen. Siehe Uchiumi et al., J. Biol. Chem. 266:2054-62 (1991). Peptidnucleinsäuren, die mit BC200-RNA hybridisieren, können ebenfalls als diagnostische Reagenzien verwendet werden. Siehe Hanvey et al., Science 258:1481-1485 (1992). Wir beobachteten ebenso, dass BC200-RNA mit Proteinen in vivo komplexiert werden kann, um ein Ribonucleoprotein („RNP") zu bilden. Für BC200-RNP spezifische Antikörper könnten in einem Immunoassay-Detektionsschema ebenfalls eingesetzt werden.
BEISPIEL 1
Bestimmung der menschlichen BC200-RNA-Sequenz
Zelluläre Gesamt-RNA und Poly(A)⁺-RNA wurden gemäß dem Verfahren von Feramisco et al., J. Biol. Chem. 257:11024-11031 (1982), aus einem menschlichen Neocortex isoliert. 5 μg Poly(A)⁺-RNA wurden mit einem CTP-Schwanz versehen, wobei Poly-A-Polymerase verwendet wurde, und die einen C-Schwanz aufweisende RNA wurde in doppelsträngige cDNA umgewandelt, wie bei DeChiara et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:2624-2628 (1987), beschrieben. EcoRI-DNA-Linker (Pharmacia) wurden gemäß den Instruktionen des Herstellers angefügt, und eine cDNA, die kleiner als etwa 400 Basenpaare war, wurde auf einem 4%igen Polyacrylamidgel ausgewählt. Eine elektrisch eluierte cDNA wurde entsprechend dem Handbuch des Herstellers in λZAP (Stratagene) geschlossen. Wir screenten 3,6 × 10⁴ Plaques mit einer Oligonucleotidsonde, die zu den sechzig am meisten 3'-gelegenen Nucleotiden von Ratten-BC1-RNA (DeChiara et al., 1987; Tiedge et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88:2093-2097 (1991)) komplementär war, bei niedriger Stringenz (letzte Wäsche bei 35°C in 6 × SSC; 1 × SSC ist 150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,4). Vier Klone wurden als positiv erkannt, und die Sequenzen ihrer Einfügungen (beide Stränge) wurden mittels der enzymatischen Kettenabbruchreaktion bestimmt. Sanger et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977); Toneguzzo et al., Biotechniques 6:460-469 (1988). Zwölf zusätzliche Klone wurden später identifiziert und sequenziert, wobei das enzymatische Kettenabbruchverfahren nach einem Rescreening der Bibliothek mit Oligonucleotidsonden, die zu spezifischen BC200-RNA-Sequenzen komplementär waren, zur Anwendung kam, und lieferten zusätzliche Informationen über die Domäne I. Die resultierende, auf allen Klonen basierende Sequenz ist obenstehend dargestellt (SEQ ID NO 1).
BEISPIEL 2
Amplifikation von BC200-RNA
Die 5'- und die 3'-Domäne von BC200-RNA wurden getrennt amplifiziert.
Für die Amplifikation der 5'-BC200-Sequenz wurde 1 μg Gesamt-RNA mittels des Guanidiniumthiocyanat-Verfahrens, gefolgt von einer Phenolextraktion und einer CsCl-Zentrifugation, aus einem menschlichen Neocortex isoliert und unter Verwendung der thermostabilen rTth-DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Instruktionen des Herstellers in Erststrang-cDNA umgewandelt. Der in diesem Schritt verwendete Primer war
Das 3'-Ende des Produkts wurde dann unter Verwendung von dTTP und terminaler Transferase (Boehringer Mannheim) mit einem T-Schwanz versehen. Die mit einem Schwanz versehene cDNA wurde in 30 Zyklen (Denaturierung für 30 Sekunden bei 94°C, Reassoziierung für 1 Minute bei 55°C, Verlängerung für 2 Minuten bei 72°C; die anfängliche Denaturierung erfolgte bei 94°C für 4 Minuten, die endgültige Verlängerung erfolgte bei 72°C für 10 Minuten) PCR-amplifiziert (Frohman et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:8998-9002 (1988)), wobei die Primer
verwendet wurden.
Die Produkte wurden in einem zweiten Satz von 30 Zyklen (hinsichlich der Bedingungen siehe oben) weiter amplifiziert, wobei der Adapter-Primer
verwendet wurde.
Nach dem Aufschluss mit EcoRI wurden die PCR-Produkte entsprechend dem Handbuch des Herstellers in die EcoRI-Stelle von λZAPII (Stratagene) kloniert. 10³ Plaques wurden mit einer internen Oligonucleotidsonde
gescreent, und 6 positive Klone wurden sequenziert.
Für die Amplifikation der 3'-BC200-Sequenz wurden 10 μg Gesamt-RNA aus einem menschlichen Neocortex unter Verwendung von Poly-A-Polymerase mit einem A-Schwanz versehen (DeChiara et al., 1987). Die mit einem Schwanz versehene RNA wurde dann mit Reverse Transcriptase in Gegenwart von MeHgOH (Invitrogen) in Erststrang-cDNA umgewandelt, wobei der Primer
verwendet wurde.
Dieser Primer wurde in Kombination mit dem Primer
auch für eine PCR-Amplifikation verwendet (siehe oben).
Die Produkte wurden in λZAPII kloniert (siehe oben), und 14 Klone, die mit SEQ ID NO 11 identifiziert wurden, wurden mittels der enzymatischen Kettenabbruchreaktion sequenziert.
BEISPIEL 3
Produktion einer BC200-RNA-spezifischen Sonde
Zwei Typen von Sonden wurden routinemäßig eingesetzt. Im ersten Beispiel wurde ein Oligodesoxynucleotid der gewünschten Sequenz chemisch synthetisiert und durch Chromatographie oder Gelelektrophorese gereinigt. Das Oligonucleotid wurde dann durch Phosphorylierung des 5'-Endes radiomarkiert. Dies wurde durch Verwendung des Enzyms Polynucleotidkinase mit γ³²P-markiertem ATP erzielt. Die radiomarkierte Sonde (spezifische Aktivität: > 10⁸ cpm/μg) wurde durch Gelfiltration von nicht eingebauter Markierung getrennt, und die Sonde wurde bei einer Konzentration von 10⁶ cpm/ml verwendet.
Im zweiten Beispiel wurden RNA-Sonden durch in vitro-Transcription hergestellt. Bei dieser Vorgehensweise wurde die gewünschte Sequenz zuerst in einen geeigneten Transcriptionsvektor (z.B. pBluescript) kloniert. Dieser Vektor wurde dann linearisiert (so dass die Transcription an einer gewünschten Stelle enden würde), und die RNA wurde aus solchen linearisierten Matrizen unter Verwendung von SP6-, T3- oder T7-RNA-Polymerase transcribiert. ³⁵S- oder ³H-UTP war während der Transcriptionsreaktion vorhanden, und die resultierenden Sonden waren somit ³⁵S- oder ³H-markiert. Matrizen-DNA wurde dann mit DNase I aufgeschlossen, die Proteine wurden phenolextrahiert, und die Sonden wurden mit Ethanol gefällt. RNA-Sonden wurden häufig bei in situ-Hybridisierungsversuchen verwendet.
BEISPIEL 4
Bewertung von BC200-RNA in menschlichen Geweben
Menschliches Biopsiematerial wurde erhalten, welches das Tumorgewebe selbst und angrenzendes normales Gewebe von demselben Organ enthielt. Tumorgewebe und normales Gewebe wurden getrennt und bis zur weiteren Verarbeitung eingefroren. Aus einem solchen Gewebe wurde RNA extrahiert, wobei das Guanidinthiocyanat-Verfahren in Kombination mit einer CsCl-Dichtezentrifugation zur Anwendung kam.
Für die Northern-Hybridisierungsanalyse wurden 10 μg Gesamt-RNA (pro Probe) in Gegenwart von 2,2 M Formaldehyd auf einem 1,5%igen Agarosegel laufen gelassen. Die RNA wurde auf Gene-Screen-Membrane (NEN) übertragen und durch UV-Beleuchtung immobilisiert. BC200-RNA wurde auf solchen Blots nachgewiesen, indem eine Sonde verwendet wurde, die im nur einmal vorhandenen 3'-Bereich der BC200-RNA 30 Nucleotide erkennt. (SEQ ID NO 3). Die Hybridisierung erfolgte bei 42°C. Die Filter wurden bei 50°C in 0,5 × SSC, 0,1% SDS, gewaschen und für eine Autoradiographie exponiert.
Die Ergebnisse dieser Versuche werden in 1 und 2 gezeigt. 1 zeigt die Expressionsstärken von BC200-RNA (1A) und 7SL-RNA (1B) in einer Vielzahl von Tumorgeweben und entsprechenden normalen Geweben; 7SL-RNA wurde als Kontroll-RNA überwacht, die von allen Zelltypen ubiquitär exprimiert wird. Abkürzungen: HB, menschliches Gehirn (normales Gewebe, als positive Kontrolle geladen); HLU, menschliche Lunge (squamöses Zellkarzinom); HM, menschliches metastatisches Lungenmelanom; HBT, menschlicher Brusttumor (Adenokarzinom); HP, menschliches Parotiskarzinom; T, Tumorgewebe; N, angrenzendes normales Gewebe von demselben Organ. Es ist zu beachten, dass in den in 1A gezeigten Beispielen BC200-RNA in nicht-neuronalem Tumorgewebe stark exprimiert wird und zugleich im korrespondierenden normalen Gewebe nicht nachweisbar ist. 2 umfasst Beispiele von Tumoren, die BC200-RNA nicht exprimieren. 2A stellt BC200-RNA dar; 2B stellt 7SL-RNA dar. Abkürzungen: HB, menschliches Gehirn; HLu, menschliche Lunge (squamöses Zellkarzinom); HL, menschlicher Lebertumor; HBd, menschliches Blasenkarzinom; HK, menschliches Nierenkarzinom; HC, menschliches Dickdarmkarzinom. In situ-Hybridisierungsversuche bestätigten, dass die RNA in BC200-positiven Tumoren von Tumorzellen, jedoch nicht von benachbarten, nicht bösartigen Zellen (z.B. Stromazellen, Entzündungszellen) exprimiert wird.
Eine Zusammenfassung der Versuchsdaten hinsichtlich der Expression von BC200-RNA in verschiedenen menschlichen Tumoren ist in Tabelle 1 angegeben. Die Symbole +, ++ und +++ geben die ansteigenden Pegel der RNA an, welche nachgewiesen wurde.
Besonders bemerkenswert ist die Übereinstimmung von Patient zu Patient bei den Daten: es zeigte sich, dass Brustadenokarzinomgewebe bei fünf verschiedenen Patienten hohe Pegel an BC200-RNA exprimierte, während z. B. Kolonadenokarzinome sich bei dieser Analyse niemals als positiv erwiesen. Dies weist auf die Fähigkeit von BC200-RNA hin, als Breitbandmarker für eine Vielzahl von Tumoren und neoplastischen Erkrankungen zu wirken.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligonucleotidsonde mit der Sequenz: TTGTTGCTTT GAGGGAAGTT ACGCTTATTT (SEQ ID NO. 3)
Oligonucleotidsonde mit der Sequenz: TTTGAGGGAA GTTACGCTTA T (SEQ ID NO. 7)
Oligonucleotidsonde gemäß Anspruch 1 oder 2, welche weiters eine nachweisbare Markierung umfasst.
Oligonucleotidsonde gemäß Anspruch 3, wobei die Markierung eine radioaktive, chemilumineszente, fluoreszierende oder chromogene Markierung ist.
In vitro-Verfahren zum Screenen von nicht-neuronalem menschlichem Gewebe hinsichtlich des Vorhandenseins einer Neoplasie, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) das Vorbereiten einer Testprobe von menschlichem Gewebe, so dass RNA in der Testprobe zum Reagieren mit einem Nachweisreagens in der Lage ist; (b) das Kombinieren der Testprobe mit dem Nachweisreagens unter Bedingungen, die ein nachweisbares Reaktionsprodukt hervorbringen, wenn BC200 RNA in der Testprobe vorhanden ist, so dass die Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt ein Indikator für die vorhandene Menge an BC200 RNA ist; (c) das quantitative Bestimmen der Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt,das hergestellt wurde; und (d) das Vergleichen der Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt mit einer Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt, das aus einer Kontrollprobe von normalem menschlichem Gewebe hergestellt wurde; wobei eine im Vergleich zur Kontrollprobe erhöhte Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt in der Testprobe eine positive Korrelation mit dem Vorhandensein einer Neoplasie aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Nachweisreagens eine Oligonucleotidsonde ist, die (1) mit einem RNA-Molekül mit der Sequenz UAAGCGUAAC UUCCCUCAAA GCAACAACCC CCCCCCCCCU UU [SEQUENZ ID NO 2] hybridisieren kann und (2) selektiv mit menschlicher BC200 RNA hybridisieren kann.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Sonde die Sequenz TTGTTGCTTT GAGGGAAGTT ACGCTTATTT (SEQ ID NO. 3) aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Sonde die Sequenz TTTGAGGGAA GTTACGCTTA T (SEQ ID NO. 7) aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das nachweisbare Reaktionsprodukt immobilisiert wird, um die Festellung, ob BC200 RNA in der Probe vorhanden ist, zu erleichtern.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Sonde eine nachweisbare Markierung umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, weiters umfassend die Schritte des Umwandelns der in der Gewebeprobe vorhandenen RNA in DNA und des selektiven Amplifizierens der DNA in der Probe, um die Anzahl der DNA-Sequenzen zu erhöhen, die mit BC200 RNA, falls diese vorhanden ist, übereinstimmen, wobei die Oligonucleotidsonde zur amplifizierten DNA-Sequenz komplementär ist.
Oligonucleotidsonde, die zu zumindest einem Teil der Alu-repetitiven Domäne von menschlicher BC200 RNA mit der Nucleotidsequenz XXCCGGGCGC GGUGGCUCAC GCCUGUAAUC CCAGCUCUCA GGGAGGCUAA GAGGCGGGAG GAUAGCUUGA GCCCAGGAGU UCGAGACCUG CCUGGGCAAU AUAGCGAGAC CCCGUUCUCC AGAAAAAGGA AAAAAAAAAA CAAAAGACAAUA AGCGUAACUU CCCUCAAAGC AACAACCCCC CCCCCCCUUU [SEQ ID NO. 1] komplementär ist und selektiv an diesen bindet, wobei jener Teil der Alu-repetitiven Domäne, zu dem die Sonde komplementär ist, die Basen an den Positionen 48 und 49 der menschlichen BC200 RNA-Sequenz umfasst.
Oligonucleotidsonde gemäß Anspruch 12, wobei die Sonde die Sequenz CCTCTTAGCC TCCCTGAGAG CT (SEQ ID NO. 12) aufweist.
Oligonucleotidsonde gemäß Anspruch 12, wobei die Sonde die Sequenz CCAGCTCTCA GGGAGGCTAA (SEQ ID NO. 13) aufweist.
Oligonucleotidsonde, die zu zumindest einem Teil des A-reichen Bereichs von menschlicher BC200 RNA mit der Nucleotidsequenz XXCCGGGCGC GGUGGCUCAC GCCUGUAAUC CCAGCUCUCA GGGAGGCUAA GAGGCGGGAG GAUAGCUUGA GCCCAGGAGU UCGAGACCUG CCUGGGCAAU AUAGCGAGAC CCCGUUCUCC AGAAAAAGGA AAAAAAAAAA CAAAAGACAAUA AGCGUAACUU CCCUCAAAGC AACAACCCCC CCCCCCCUUU [SEQ ID NO. 1] komplementär ist und selektiv an diesen bindet, wobei jener Teil des A-reichen Bereichs, zu dem die Sonde komplementär ist, die Basen an den Positionen 146-148 der menschlichen BC200 RNA-Sequenz umfasst.
Oligonucleotidsonde, die (1) mit einem cDNA-Transcript eines RNA-Moleküls mit der Sequenz UAAGCGUAAC UUCCCUCAAA GCAACAACCC CCCCCCCCCU UU [SEQUENZ ID NO 2] hybridisieren kann und (2) selektiv mit menschlicher BC200 RNA hybridisieren kann.
Ausstattung zum Identifizieren von BC200 RNA-haltigen Gewebeproben, umfassend: (a) ein Nachweisreagens, das eine Oligonucleotidsonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, 12 bis 15 und 16 ist und ein spezifisches nachweisbares Reaktionsprodukt erzeugt, wenn BC200 RNA in der Probe vorhanden ist; und (b) einen festen Träger, der zum Immobilisieren des nachweisbaren Reaktionsprodukts angepasst ist.
Ausstattung zum Identifizieren von BC200 RNA-haltigen, menschlichen Gewebeproben, umfassend: (a) ein Nachweisreagens, das eine Oligonucleotidsonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, 12 bis 15 und 16 ist und ein spezifisches nachweisbares Reaktionsprodukt erzeugt, wenn BC200 in der Probe vorhanden ist; und (b) Amplifikationsprimer, die dahingehend wirksam sind, die selektive Amplifikation einer zu BC200 RNA komplementären DNA zu ermöglichen.
Ausstattung gemäß Anspruch 17, wobei das Nachweisreagens eine Oligonucleotidsonde ist, die (1) mit einem RNA-Molekül mit der Sequenz UAAGCGUAAC UUCCCUCAAA GCAACAACCC CCCCCCCCCU UU [SEQUENZ ID NO 2] hybridisieren kann und (2) selektiv mit menschlicher BC200 RNA hybridisieren kann.
Ausstattung zum Identifizieren von BC200 RNA-haltigen Gewebeproben, umfassend: (a) ein Nachweisreagens, das eine Oligonucleotidsonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, 12 bis 15 und 16 ist und ein diagnostisches Reaktionsprodukt erzeugt, wenn BC200 in der Probe vorhanden ist; und (b) ein markiertes Reagens, das mit dem diagnostischen Reaktionsprodukt reagiert, um dieses nachweisbar zu machen.
Ausstattung gemäß Anspruch 18, wobei das Nachweisreagens eine Oligonucleotidsonde ist, die (1) mit einem RNA-Molekül mit der Sequenz UAAGCGUAAC UUCCCUCAAA GCAACAACCC CCCCCCCCCU UU [SEQUENZ ID NO 2] hybridisieren kann und (2) selektiv mit menschlicher BC200 RNA hybridisieren kann.
In vitro-Verfahren zum Screenen von menschlichem Gehirngewebe hinsichtlich des Vorhandenseins einer Alzheimer-Erkrankung, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) das Vorbereiten einer Testprobe von menschlichem Gehirngewebe, so dass RNA in der Testprobe zum Reagieren mit einem Nachweisreagens in der Lage ist; (b) das Kombinieren der Testprobe mit dem Nachweisreagens unter Bedingungen, die ein nachweisbares Reaktionsprodukt hervorbringen, wenn BC200 RNA in der Testprobe vorhanden ist, so dass die Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt ein Indikator für die vorhandene Menge an BC200 RNA ist; (c) das quantitative Bestimmen der Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt, das hergestellt wurde; und (d) das Vergleichen der Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt mit einer Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt, das unter Anwendung derselben Verfahrensweise bei einer Kontrollprobe von normalem menschlichem Gehirngewebe hergestellt wurde, wobei eine im Vergleich zur Kontrollprobe erhöhte Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt in der Testprobe eine positive Korrelation mit dem Vorhandensein einer Alzheimer-Erkrankung bei einem Patienten aufweist.
In vitro-Verfahren zum Screenen von menschlichem Brustgewebe hinsichtlich des Vorhandenseins eines Adenokarzinoms, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) das Vorbereiten einer Testprobe von menschlichem Brustgewebe, so dass RNA in der Testprobe zum Reagieren mit einem Nachweisreagens in der Lage ist; (b) das Kombinieren der Testprobe mit dem Nachweisreagens unter Bedingungen, die ein nachweisbares Reaktionsprodukt hervorbringen, wenn BC200 RNA in der Probe vorhanden ist, so dass die Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt ein Indikator für die vorhandene Menge an BC200 RNA ist; (c) das quantitative Bestimmen der Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt, das hergestellt wurde; und (d) das Vergleichen der Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt mit einer Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt, das aus einer Kontrollprobe von normalem menschlichem Brustgewebe hergestellt wurde, wobei eine im Vergleich zur Kontrollprobe erhöhte Menge an nachweisbarem Reaktionsprodukt in der Testprobe eine positive Korrelation mit dem Vorhandensein eines Brust-Adenokarzinoms aufweist.