DE69433816T2

DE69433816T2 - Die bestimmung von nukleinsäuremutationen durch analyse des sputum

Info

Publication number: DE69433816T2
Application number: DE69433816T
Authority: DE
Inventors: David Sidransky
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2014-11-11
Also published as: WO1995013397A1; DE69433816D1; ATE267878T1; EP0728217A4; EP0728217B1; AU690943B2; AU1175295A; US5726019A; EP1602732A2; EP1602732A3; EP0728217A1; US5561041A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Sachgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Zielnucleinsäure in Sputum und Reagentien, die dafür nützlich sind.
2. Beschreibung des Fachgebietes
Eine zunehmende Anzahl von Hinweisen erlaubt den Schluß, daß somatische Mutationen ursächlich wichtig für die Induktion menschlicher Krebserkrankungen sind. Diese somatischen Mutationen können sich in den Genomen von bis dahin normalen Zellen akkumulieren, von denen manche dann die mit bösartigem Wachstum einhergehenden Phänotypen aufweisen können. Solche onkogenen Mutationen können auch eine Anzahl verschiedener Typen von Änderungen der DNA-Struktur beinhalten, darunter Deletionen, Translokationen und Einzelnucleotid-Alterationen. Die letzteren, die auch als Punktmutationen bekannt sind, können insofern häufig an der Carcinogenese beteiligt sein, als eine Vielzahl mutagener Chemikalien solche Mutationen hervorrufen. Ferner können solche Mutationen spontan, als Ergebnis von Fehlern bei der DNA-Replikation auftreten.
Die Fortschritte der Technologie der rekombinanten DNA haben zur Entdeckung normaler Zellgene (Proto-Onkogene und Tumor-Suppressorgene) geführt, die das Wachstum, die Entwicklung und die Differenzierung steuern. Unter bestimmten Umständen wird die Regulation dieser Gene verändert, und sie bewirken, daß normale Zellen neoplastische Wachstumseigenschaften annehmen. Bis heute sind über 40 Proto-Onkogene und Suppressorgene bekannt, die je nach ihren funktionalen Eigenschaften in verschiedene Kategorien fallen. Dazu zählen (1) Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktor-Rezeptoren, (2) Boten der intrazellulären Signalübertragungswege, beispielsweise zwischen dem Cytoplasma und dem Zellkern, und (3) regulatorische Proteine, die die Genexpression und DNA-Replikation beeinflussen.
Punktmutationen waren an der Verursachung vieler menschlicher Tumore direkt beteiligt. Manche Tumore haben Onkogene der ras-Genfamilie, die sich von ihrem normalen zellulären Proto-Onkogen-Gegenstück durch das Vorhandensein einer Punktmutation an einer von einer begrenzten Anzahl von Stellen in diesen Genen unterscheiden. Ähnlicherweise finden sich in Tumorzellen oft Punktmutationen in kritischen Regionen von Tumor-Suppressorgenen, wie p53. Diese Mutationen stellen qualitative Veränderungen des Tumorzellengenoms dar, die diese Zellen von normalen Zellen unterscheiden und eine Basis für die Diagnose des genetischen Ursprungs eines zu untersuchenden Tumors bilden. Die Bestimmung von Mutationen, die aktive Onkogene erzeugt haben, kann wichtige Hinweise für die Diagnose und Prognose der Tumorentwicklung liefern. So wurde zum Beispiel festgestellt, daß eine Anzahl von Mutationen das 12te Codon des ras-Onkogens verändern und das Ersetzen eines normalerweise vorhandenen Glycins durch eine beliebige andere aus einer Anzahl alternativer Aminosäuren bewirken. Solche Aminosäuresubstitutionen erzeugen ein stark transformierendes Allel. Somit kann das Vorliegen einer bestimmten Nucleotidsubstitution eine starke Determinante für das Verhalten der Tumorzelle (z. B. ihrer Wachstumsrate, Invasivität, usw.) sein. Daraus ergibt sich, daß DNA-Sonden für Onkogenmutationen vielversprechende Diagnosereagentien der klinischen Onkologie darstellen.
Unter den verschiedenen Typen von Neoplasmen gehen eine Anzahl solcher, die in den Lungen vorkommen, mit Onkogenmutationen einher. Lungenkrebs ist die wichtigste Ursache der mit Krebs zusammenhängenden Todesfälle in den westlichen Ländern. Die Prognose für Patienten mit Lungenkrebs hängt in erster Linie vom Stadium des Tumors zur Zeit der klinischen Diagnose ab. Derzeit werden nur 25 bis 40 Prozent aller Lungentumore zum Zeitpunkt ihrer ersten Feststellung als resezierbar erachtet. Patienten mit frühzeitig diagnostizierten Tumoren im Stadium I haben eine Überlebensrate von 40 bis 70% nach einer operativen Resektion. Der Versuch eines Absuchens auf Lungenkrebs mit Sputum-Cytologie im Abstand von drei Jahren und jährlichem Thoraxröntgen hat sich als für die Früherkennung von Lungenkrebs ungeeignet erwiesen. Alternativ hat die Entdeckung, daß Tumore eine Reihe wohldefinierter genetischer Veränderungen, darunter Punktmutationen in Onkogenen durchlaufen, die An strengungen zur Entwicklung zusätzlicher nichtinvasiver Tests stimuliert, mit denen sich Neoplasien der Lunge verläßlicher feststellen lassen könnten, doch sind diese Versuche bisher gescheitert. Die vorliegende Erfindung zielt auf diesen Bedarf.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ergab sich aus der unerwarteten Entdeckung, daß Nucleinsäure, die eine mit Lungenneoplasie einhergehende mutierte Nucleotidsequenz hat, in nachweisbaren Spiegeln im Sputum von Patienten mit Lungenneoplasie vorhanden ist.
Als Folge dieser Entdeckung stellt die vorliegende Erfindung einen signifikanten Fortschritt gegenüber solchen Verfahren wie Gewebebiopsie dar, indem sie ein nichtinvasives, schnelles und genaues Verfahren zur Feststellung mutierter Nucleotidsequenzen, die mit Lungenneoplasie einhergehen, liefert. Die Vorgehensweise der Erfindung auf der Grundlage der DNA-Amplifikation kann eine Zelle mit einem mutierten Gen in einem großen Überschuß (größer als 10.000) normaler Zellen feststellen. Auf Grundlage diese Entdeckung ist es nun möglich, verschiedene andere Zielnucleinsäuren nachzuweisen, die mit anderen Krankheitsstadien einhergehen.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren, das als Hilfsmittel zur Cytopathologie verwendet werden kann, um Hochrisikopopulationen abzusuchen und um Hochrisikopatienten zu beobachten, die eine Chemoprävention oder Chemotherapie durchlaufen.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Genmutationen im Sputum. Clone mit einem PCR-Insert vom p53-Gen hybridisierten mit einer für das Codon 273 Arg → His-Mutation im Tumor (T) des Patienten (L4) spezifischen Oligomersonde, weniger Clone hybridisierten mit der gleichen Sonde im Sputum (S) des Patienten, und keine Clone hybridisierten mit der Sonde in einem Kontroll-Sputum von einem Patienten (L15) ohne Mutationen im p53- Gen im primären Lungenkrebs (C) des Patienten.
2 zeigt Sequenzierungsgele von Clonen, die die normalen und mutierten p53-Sequenzen enthielten. Die Wildtypsequenz ist in der normaleren (N) Kontrolle und der 273 CGT → CAT- (Arg → His)-mutierten Sequenz (Pfeil) im Tumor (T) mit einer residualen Wildtypbande zu sehen. Die gleiche, auch im primären Tumor gefundene mutierte Bande ist im Sputum (S) zu sehen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure mit einer mutierten Nucleotidsequenz, die im Sputum vorhanden ist, wobei das Vorhandensein der veränderten Nucleinsäuresequenz mit Lungenneoplasie einhergeht.
In ihrem weitesten Sinn erlaubt die vorliegende Erfindung den Nachweis einer beliebigen Zielnucleinsäuresequenz von diagnostischer oder therapeutischer Relevanz, bei der die Zielnucleinsäuresequenz im Sputum vorhanden ist. So kann die Zielnucleotidsequenz zum Beispiel ein mutiertes Nucleotid, ein Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP), eine Nucleotiddeletion, eine Nucleotidsubstitution oder eine beliebige andere Säuger-Nucleinsäuresequenz von Interesse sein.
In einer Ausführungsform ist das Verfahren der Erfindung zum Nachweis mutierter Nucleotidsequenzen, die sowohl mit gutartigen als auch mit bösartigen Neoplasien einhergehen, anwendbar. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Neoplasie der Lunge nachgewiesen, obwohl das Verfahren auch zum Nachweis jeder beliebigen neoplastischen mutierten Nucleotidsequenz ungeachtet ihrer Herkunft verwendet werden kann, solange die Sequenz nachweisbar im Sputum vorhanden ist. Beispielsweise sondern Kopf-Halskrebserkrankungen Krebszellen in das Sputum ab und können nachgewiesen werden.
Zahlreiche Nucleinsäuren mit mutierten Nucleotidsequenzen, die ein abnormales Genprodukt erzeugen, sind dafür bekannt, daß sie mit verschiedenen Neoplasien einhergehen. Zu den am häufigsten anzutreffenden mutierten Nucleotidsequenzen zählen Onkogene und Tumor-Suppressorgene, wie das mutierte k-ras-Onkogen, mutiert bei Dickdarmkrebs (MCC), deletiert bei Dickdarmkrebs (DCC), adenomatöser Polyposis coli (APC), familiärer adenomatöser Polyposis coli (FAP) und p53. Von besonderer Bedeutung in der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis des mutierten k-ras-Onkogens und des p53-Tumorsuppressorgens. (Vogelstein, Nature, 348: 681, 1990).
Zur Analyse von Sputumproben gemäß dem Verfahren der Erfindung ist es vorzuziehen, die in der Probe vorhandenen Epithelzellen anzureichern. Das kann durch Vermischen der Probe mit einem für Epithelzellen spezifischen monoclonalen Antikörper, wie EBA-1 oder Ber-Ep₄ (Can. Res. 53: 3455, 1993), der von Dakopatts, Gestrop, Dänemark erhältlich ist, geschehen. Fachleute werden auch andere epithelzellenspezifische monoclonale Antikörper kennen.
Die Aminosäuren, auf die in dieser Arbeit Bezug genommen wird, können nach dem folgenden Drei-Buchstaben- oder Ein-Buchstaben-Abkürzungen bestimmt werden:
Möchte man die mutierten Nucleotidsequenzen vor dem Nachweis amplifizieren, so kann dies mit Oligonucleotid(en) geschehen, die Amplifikationsprimer sind. Diese einzigartigen Oligonucleotidprimer basieren auf der Erkennung der an die mutierten Nucleotidsequenzen angrenzenden flankierenden Regionen und sind in der Lage, mit den flankierenden Regionen substantiell zu hybridisieren, so daß die Amplifikation voranschreiten kann.
Im Fall von k-ras beispielsweise umfassen diese Oligonucleotidprimer Sequenzen wie die Nucleotidsequenz 5'-AGGAATTCATGACTGAATATAAACTTGT-3' (SEQ. ID NR. 1) und/oder 5'-ATCGAATTCTATGCATATTAAAACAAGATT-3' (SEQ. ID NR. 2) und zu diesen komplementäre Sequenzen. Im Fall von p53 umfassen die Oligonucleotidprimer Sequenzen, die in der Lage sind, mit den flankierenden Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, wobei die Primer 5'-GTAGGAATTCACTTGTGCCCTGACTT-3' (SEQ. ID NR. 3) und 5'-CATCGAATTCCACTGACAACCACCCTT-5' (SEQ. ID NR. 4) (Exons 5–6) und 5'-GTAGGAATTCCAAGGCGCACTGGCCTC-3' (SEQ. ID NR. 5) und 5'-ACTGAATTCTTCGTCTCCTCCACCGC-3' (SEQ. ID NR. 6) für die Exons 7–8, und zu diesen komplementäre Sequenzen sind.
Die Primer, die gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet werden können, umfassen Oligonucleotide von ausreichender Länge und geeigneter Sequenz, um eine spezifische Initiation der Polymerisation einer signifikanten Anzahl von Nucleinsäuremolekülen, die die Zielnucleinsäure enthalten, zu liefern. Auf diese Weise ist es möglich, die spezifische Zielnucleinsäuresequenz, die die Nucleinsäure von Interesse enthält, selektiv zu amplifizieren. Spezifisch bezieht sich der Begriff „Primer", wie hierin verwendet, auf eine Sequenz, die zwei oder mehr Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide, vorzugsweise deren mindestens acht umfaßt, wobei diese Sequenz in der Lage ist, die Synthese eines Primer-Extensionsprodukts zu initiieren, das im wesentlichen komplementär zu einem Zielnucleinsäurestrang ist. Der Oligonucleotidprimer enthält typischerweise 15 bis 22 oder mehr Nucleotide, kann aber auch weniger Nucleotide enthalten.
Die Versuchsbedingungen, die zu einer Synthese führen, beinhalten das Vorhandensein von Nucleosid-Triphosphatasen und eines Mittels zur Polymerisation, wie DNA-Polymerase, und eine geeignete Temperatur und einen geeigneten pH-Wert. Der Primer ist für eine maximale Wirksamkeit bei der Amplifikation vorzugsweise einzelsträngig, kann jedoch auch doppelsträngig sein. Wenn er doppelsträngig ist, wird der Primer zuerst behandelt, um seine Stränge zu separieren, bevor er zur Herstellung von Extensionsprodukten verwendet wird. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muß lang genug sein, um die Synthese von Extensionsprodukten in Gegenwart des induzierenden Polymerisationsmittels zu primen. Die genaue Länge des Primers hängt von vielen Faktoren ab, darunter Temperatur, Puffer und Nucleotidzusammensetzung.
Primer, die gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, werden so entworfen, daß sie im wesentlichen komplementär zu jedem Strang von zu amplifizierenden Zielnucleotidsequenzen sind. Im wesentlichen komplementär bedeutet, daß die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen Strängen unter Bedingungen zu hybridisieren, die ein Funktionieren des Polymerisierungsmittels erlauben. Mit anderen Worten, die Primer sollten ausreichend Komplementarität mit den flankierenden Sequenzen haben, um mit diesen zu hybridisieren und eine Amplifikation der Nucleotidsequenz zu erlauben. Vorzugsweise hat das 3'-Ende des Primers, das verlängert wird, eine perfekte Basenpaarkomplementarität mit dem komplementären flankierenden Strang.
Oligonucleotidprimer, die gemäß der Erfindung verwendet werden, werden in jedem Amplifikationsprozeß angewandt, der größere Mengen von Zielnucleinsäure produziert. Typischerweise ist ein Primer komplementär zum negativen (–) Strang der mutierten Nucleotidsequenz, und der andere ist komplementär zum positiven (+) Strang. Eine Anlagerung der Primer zu einer denaturierten Nucleinsäure mit anschließender Extension mit einem Enzym, wie das große Fragment von DNA-Polymerase I (Klenow) oder Taq-DNA-Polymerase und Nucleotiden führt zu neusynthetisierten (+) und (–) Strängen, welche die Zielnucleinsäure enthalten. Da diese neusynthetisierten Nucleinsäuren ebenfalls Matrizen sind, führen wiederholte Zyklen der Denaturierung, Primeranlagerung und Extension zu einer exponentiellen Produktion der vom Primer definierten Region (d. h. der mutierten Zielnucleotidsequenz). Das Produkt der Amplifikationsreaktion ist eine diskrete Nucleinsäureduplex mit Enden, die den Enden des spezifischen verwendeten Primers entsprechen. Der Fachmann kennt auch andere Amplifikationsverfahren, die ebenfalls dazu verwendet werden können, die Kopien der Zielnucleinsäuren zu erhöhen.
Die Oligonucleotidprimer zur Verwendung in der Erfindung können mit jedem geeigneten Verfahren hergestellt werden, wie konventionelle Phosphotriester- und Phosphodiester-Verfahren oder automatisierte Ausführungsformen davon. In einer solchen automatisierten Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite als Startmaterialien verwendet, und sie können wie von Beaucage et al. (Tetrahedron Letters, 22: 1859–1862, 1981) beschrieben synthetisiert werden. Ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden auf einer modifizierten festen Unterlage wird in U.S. Patent Nr. 4,458,066 beschrieben. Ein Verfahren zur Amplifikation, das gemäß dieser Erfindung verwendet werden kann, ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die in den U.S. Patenten Nr. 4,683,202 und 4,683,195 beschrieben ist.
Als Start-Nucleinsäure oder -Säuren kann bzw. können jede beliebige Sputumproben-Nucleinsäure in gereinigter oder nicht gereinigter Form verwendet werden, vorausgesetzt daß sie die spezifische Nucleinsäuresequenz mit der Zielnucleinsäure enthält, oder daß sie im Verdacht steht, diese zu enthalten. So kann das Verfahren z. B. DNA oder RNA, einschließlich Messenger-RNA verwenden, wobei die DNA oder RNA einzel- oder doppelsträngig sein kann. Wenn RNA als Matrize verwendet werden soll, würden Enzyme und/oder Bedingungen, die für reverse Transkription der Matrizen-DNA optimal sind, verwendet. Ferner kann ein DNA-RNA-Hybrid, das jeweils einen Strang von beiden enthält, verwendet werden. Ein Gemisch von Nucleinsäuren kann ebenfalls verwendet werden; ebenso können die in einer vorhergehenden Amplifikationsreaktion unter Verwendung der gleichen oder verschiedener Primer hergestellten Nucleinsäuren verwendet werden. Die mutierte, zu amplifizierende Nucleotidsequenz, kann eine Fraktion eines größeren Moleküls sein oder kann anfänglich als diskretes Molekül vorliegen, so daß die spezifische Sequenz die gesamte Nucleinsäure darstellt. Es ist nicht nötig, daß die zu amplifizierende Sequenz von Anfang an in einer reinen Form vorliegt; sie kann eine untergeordnete Fraktion eines komplexen Gemisches sein, wie sie in menschlicher Gesamt-DNA enthalten ist.
Wenn die mutierte Zielnucleotidsequenz der Probe zwei Stränge enthält, ist es notwendig, die Stränge der Nucleinsäure aufzutrennen, bevor sie als Matrize verwendet werden kann. Die Auftrennung der Stränge kann entweder als separater Schritt oder gleichzeitig mit der Synthese des Primer-Extensionsproduktes ausgeführt werden. Diese Strangtrennung kann durch verschiedene geeignete denaturierende Zustände, darunter physikalische, chemische oder enzymatische Mittel erreicht werden; das Wort „denaturierend" schließt alle solche Bedeutungen ein. Ein physikalisches Verfahren zur Auftrennung von Nucleinsäuresträngen beinhaltet das Erhitzen der Nucleinsäure, bis diese denaturiert ist. Die typische Hitzedenaturierung kann Temperaturen im Bereich von 80°C bis 105°C und Zeiten im Bereich von 1 bis 10 Minuten involvieren. Die Strangauftrennung kann auch durch ein Enzym aus der als Helicasen bekannten Enzymklasse induziert werden, oder durch das Enzym RecA, das Helicaseaktivität hat, und von dem man weiß, daß es in Gegenwart von riboATP DNA denaturiert. Die für die Strangauftrennung mit Helicasen bei Nucleinsäuren geeigneten Bedingungen werden von Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology, 43: 63, 1978) beschrieben, und ein Überblick über Verfahren zur Anwendung von RecA findet sich bei C. Radding (Ann. Rev. Genetics, 16: 405–437, 1982).
Wenn die Nucleinsäure, die die zu amplifizierende Zielnucleinsäure enthält, einzelsträngig ist, wird ihr Gegenstück durch Hinzufügen von einem oder zwei Oligonucleotidprimern synthetisiert. Wird ein einzelner Primer verwendet, so wird in der Gegenwart von Primer, einem Polymerisationsmittel und den vier nachstehend beschriebenen Nucleosid-Triphosphaten ein Primer-Extensionsprodukt synthetisiert. Das Produkt ist zur einzelsträngigen Nucleinsäure komplementär und hybridisiert mit einer einzelsträngigen Nucleinsäure und bildet so eine Duplex aus Strängen unterschiedlicher Länge, die in Einzelstränge aufgetrennt werden kann, wodurch man zwei einzelne, getrennte komplementäre Stränge erhält. Alternativ können zu der einzelsträngigen Nucleinsäure zwei Primer hinzugefügt werden, und die Reaktion kann wie beschrieben ausgeführt werden.
Werden komplementäre Nucleinsäurestränge aufgetrennt, sind die getrennten Stränge unabhängig davon, ob die Nucleinsäure ursprünglich doppel- oder einzelsträngig war, als Matrize für die Synthese weiterer Nucleinsäurestränge gebrauchsfertig. Diese Synthese wird unter Bedingungen ausgeführt, die die Hybridisierung der Primer mit den Matrizen stattfinden lassen. Im allgemeinen findet die Synthese in einer gepufferten wässrigen Lösung, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7–9, am stärksten vorzuziehen ungefähr 8, statt. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß (für genomische Nucleinsäure gewöhnlich etwa 10⁸ : 1 Primer : Matrize) der beiden Oligonucleotidprimer zum Puffer, der die aufgetrennten Matrizenstränge enthält, hinzugefügt. Jedoch wird vorausgesetzt, daß die Menge des komplementären Stranges unbekannt sein kann, wenn das Verfahren der Erfindung für diagnostische Zwecke verwendet wird, so daß die Menge des Primers im Verhältnis zur Menge des Komplementärstranges nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. In der Praxis jedoch wird die Menge des hinzugefügten Primers im allgemeinen in molarem Überschuß gegenüber der Menge des komplementären Stranges (der Matrize) liegen, wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch komplizierter langkettiger Nucleinsäurestränge enthalten ist. Ein großer molarer Überschuß ist zur Verbesserung des Wirkungsgrades des Verfahrens vorzuziehen.
Bei manchen Ausführungsformen der Amplifikation werden die Substrate, zum Beispiel die Desoxyribonucleotid-Triphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP entweder separat oder zusammen mit den Primern in angemessenen Mengen zum Synthesegemisch hinzugefügt, und die so erhaltene Lösung wird ungefähr 1 bis 10 Minuten lang, vorzugsweise 1 bis 4 Minuten lang auf 90–100°C erhitzt. Nach dieser Erhitzungszeit läßt man die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, was für die Hybridisierung der Primer vorzuziehen ist. Zu dem abgekühlten Gemisch wird ein geeignetes Mittel zum Ausführen der Primer-Extensionsreaktion (in dieser Arbeit „Polymerisationsmittel" genannt) hinzugefügt, und die Reaktion wird unter Bedingungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, ablaufen gelassen. Das Polymerisationsmittel kann auch zusammen mit den anderen Reagentien hinzugefügt werden, wenn es hitzebeständig ist. Diese Synthese- (oder Amplifikations-) Reaktion kann bei Raumtemperatur bis zu einer Temperatur, über der das Polymerisationsmittel nicht mehr funktioniert, stattfinden. So ist beispielsweise, wenn DNA-Polymerase als Mittel verwendet wird, die Temperatur im allgemeinen nicht höher als ungefähr 40°C. Am bequemsten ist es, wenn die Reaktion bei Raumtemperatur stattfindet.
Das Polymerisationsmittel kann jede beliebige Verbindung oder jedes beliebige System sein, einschließlich von Enzymen, das dahingehend wirkt, die Synthese von Primer-Extensionsprodukten, zu erreichen. Zu diesem Zweck geeignete Enzyme sind zum Beispiel unter anderen E. coli-DNA-Polymerase I, Taq-Polymerase, Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, andere verfügbare DNA-Polymerasen, Polymerase-Muteine, reverse Transkriptasen, Ligase und andere Enzyme, darunter hitzebeständige Enzyme (das heißt, jene Enzyme, die eine Extension des Primers ausführen, nachdem sie ausreichend hohen Temperaturen unterworfen wurden, um eine Denaturierung zu bewirken). Geeignete Enzyme erleichtern die Kombination der Nucleotide in der richtigen Weise zur Bildung der Primer-Extensionsprodukte, die zu jedem mutierten Nucleotidstrang komplementär sind. Im allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert werden und in die 5'-Richtung entlang des Matrizenstranges bis zur Termination der Synthese voranschreiten, wobei Moleküle von unterschiedlichen Längen gebildet werden. Es kann jedoch auch Polymerisationsmittel geben, die die Synthese am 5'-Ende initiieren und in die andere Richtung voranschreiten, wobei sie den gleichen Vorgang wie oben beschrieben verwenden. Auf jeden Fall ist das Verfahren der Erfindung nicht auf die Ausführungsformen der Amplifikation, wie sie in dieser Arbeit beschrieben werden, beschränkt.
Der neusynthetisierte mutierte Nucleotidstrang und sein komplementärer Nucleinsäurestrang bilden unter den vorstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen ein doppelsträngiges Molekül, und dieses Hybrid wird in den nachfolgenden Prozeßschritten verwendet.
Im nächsten Schritt wird das neusynthetisierte doppelsträngige Molekül durch Verwendung eines beliebigen der vorstehend beschriebenen Verfahren denaturierenden Bedingungen unterworfen, um einzelsträngige Moleküle herzustellen.
Der vorstehende Prozeß wird an den einzelsträngigen Molekülen wiederholt. Wenn nötig, können zusätzliche Polymerisationsmittel, Nucleoside und Primer hinzugefügt werden, damit die Reaktion unter den vorstehend vorgeschriebenen Bedingungen ablaufen kann. Auch diesmal wird die Synthese an einem Ende eines jeden der Oligonucleotidprimer initiiert und schreitet entlang der Einzelstränge der Matrize fort und ergibt so weitere Nucleinsäure. Nach diesem Schritt besteht die Hälfte des Extensionsproduktes aus der von den beiden Primern begrenzten spezifischen Nucleinsäuresequenz.
Die Schritte der Denaturierung und Extensionsprodukt-Synthese können so oft wiederholt werden wie nötig, um die mutierte Zielnucleotidsequenz in dem Ausmaß zu amplifizieren, der für einen Nachweis nötig ist. Die Menge der produzierten mutierten Nucleotidsequenz steigt in exponentieller Weise an.
Das amplifizierte Produkt kann durch eine „Southern-Blot"-Analyse ohne Verwendung radioaktiver Sonden festgestellt werden. In einem solchen Prozeß wird zum Beispiel eine kleine DNA-Probe, die einen sehr niedrigen Spiegel mutierter Nucleotidsequenz enthält, amplifiziert und über eine Southern Blot-Technik analysiert. Die Verwendung nichtradioaktiver Proben oder Marker wird durch den hohen Spiegel des amplifizierten Signals erleichtert.
Nucleinsäuren, bei denen mit dem Verfahren der Erfindung eine Mutation festgestellt wurde, können entweder in Lösung oder nach Bindung an einen festen Träger weiter ausgewertet, festgestellt, cloniert, sequenziert und in ähnlicher Weise behandelt werden, und zwar durch jedes beliebige, üblicherweise zur Feststellung einer spezifischen DNA-Sequenz verwendete Verfahren, wie PCR, Oligomerrestriktion (Saiki et al., Bio/Technology, 3: 1008–1012, 1985), allelspezifische Oligonucleotid- (ASO-) Sondenanalyse (Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 278, 1983), Oligunucleotid-Ligierungstests (OLAs) (Landegren et al., Science, 241: 1077, 1988) und ähnlichen. Molekulare Techniken zur DNA-Analyse sind schon im Überblick beschrieben worden (Landegren et al., Science, 242: 229–237, 1988). Somit wird in einer bevorzugten Ausführungsform, bei der die festzustellende mutierte Nucleotidsequenz k-ras ist, eine Hybridisierungssonde verwendet, die in der Lage ist, mit mutierten Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die 5'-TTGCCTACGCCAACAGCTCC-3' (Val¹²) (SEQ. ID NR. 7), 5'-TTGCCTACGCCATCAGCTCC-3' (Asp¹²) (SEQ. ID NR. 8), 5'-TTGCCTACGCCACTAGCTCC-3' (Ser¹²) (SEQ. ID NR. 9), oder 5'-TTGCCTACGCCACAAGCTCC-3' (Cys¹²) (SEQ. ID NR. 10) und zu diesen komplementäre Sequenzen umfassen. Wenn die festzustellende mutierte Nucleotidsequenz p53 ist, wird eine Hybridisierungssonde verwendet, die in der Lage ist mit mutierten Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die 5'-CACAAACATGCACCTCAA-3' (His²⁷³) (SEQ. ID NR. 11) oder 5'-TGCGCCGGCCTCTCCCA-3' (Gly²⁸¹) (SEQ. ID NR. 12) und zu diesen komplementäre Sequenzen umfassen. Der Wildtyp k-ras und Wildtyp p53 werden durch Hybridisierung mit Nucleotidsonden festgestellt, die mit Nucleotidsequenzen hybridisieren, die 5'-TTGCCTACGCCACCAGCTCC-3' (SEQ. ID NR. 13) bzw. 5'-CCGGTTCATGGCGCCCAT-3' (SEQ. ID NR. 14); umfassen.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden gereinigte Nucleinsäurefragmente, die Zwischensequenzen oder Oligonucleotidsequenzen von 10–50 Basenpaaren enthalten, radioaktiv markiert. Die markierten Ansätze werden dazu verwendet, Nucleinsäure aus dem Sputum mit Hilfe der Southern-Hybridisierungstechnik zu sondieren. Nucleotidfragmente aus dem Sputum werden vor oder nach der Amplifikation durch Gelelektrophorese in Fragmente unterschiedlicher Molekularmassen aufgetrennt und auf Filter übertragen, die Nucleinsäure binden. Nachdem sie der markierten Sonde ausgesetzt wurden, die mit den die Zielnucleinsäuresequenzen enthaltenden Nucleotidfragmenten hybridisiert, wird die Bindung der radioaktiven Sonde an Zielnucleinsäurefragmente durch Autoradiographie (vgl. Genetic Engineering, 1. Ausg. Robert Williamson, Academic Press, (1981), 72–81) bestimmt. Alternativ kann Nucleinsäure aus dem Sputum direkt an Filter gebunden werden, an die die radioaktive Sonde selektiv Nucleinsäuren bindet, die die Sequenz von Interesse (spezifische Sequenzen) haben, und der Grad der Bindung wird direkt durch Zählung der radioaktiven Emissionen quantifiziert. Wenn die Zielnucleinsäure nicht amplifiziert wird, kann die Feststellung durch Verwendung einer geeigneten Hybridisierungssonde direkt auf der separierten Säuger-Nucleinsäure erfolgen. In jenen Fällen, in denen die Zielnucleinsäure amplifiziert wird, würde eine Feststellung mit der geeigneten Hybridisierungssonde nach der Amplifikation erfolgen.
Die Sonden der vorliegenden Erfindung können zur Untersuchung der Verteilung der spezifischen festgestellten Fragmente sowie des quantitativen (relativen) Bindungsgrades der Sonde verwendet werden, um das Vorkommen spezifischer, stark bindender (hybridisierender) Sequenzen zu bestimmen und somit die Wahrscheinlichkeit dafür anzuzeigen, daß ein Individuum ein geringes Risiko oder ein hohes Risiko einer neoplastischen Krankheit, wie eines Lungencarcinoms aufweist. Weiteres Clonieren erlaubt eine spezifische Auswertung der Anzahl der mutierten Nucleotide (das heißt mutierter Zellen), was eine genaue Abschätzung des Risikos der Entwicklung einer neoplastischen Krankheit erlaubt.
In den meisten Fällen wird die Sonde mit einem Atom oder anorganischen Radikal, meist unter Verwendung von Radionucliden, vielleicht aber auch Schwermetallen markiert. Bequemerweise kann ein radioaktiver Marker verwendet werden. Zu den radioaktiven Markern zählen unter anderen ³²P, ¹²⁵I, ³H, ¹⁴C oder ähnliche. Es kann jeder radioaktive Marker verwendet werden, der ein adäquates Signal liefert und eine ausreichende Halbwertszeit hat. Andere Marker beinhalten Liganden, die als spezifisches Bindungspaar-Mitglied für einen markierten Liganden dienen können, und ähnliche. Bei Immuntests wurde eine große Vielfalt von Markern benützt, die auch im vorliegenden Test leicht verwendet werden können. Die Wahl der Markierung ist von der Wirkung der Markierung auf die Hybridisierungsrate und von der Bindung der Sonde an die mutierte Nucleotidsequenz bestimmt. Es ist nötig, daß der Marker eine ausreichende Empfindlichkeit aufweist, um die Menge der für die Hybridisierung verfügbaren mutierten Nucleotidsequenz festzustellen. Andere Gesichtspunkte sind die Leichtigkeit der Synthese der Sonde, leicht verfügbare Instrumentierung, die Fähigkeit zur Automatisierung, Bequemlichkeit und ähnliche.
Die Art und Weise, wie der Marker an die Sonde gebunden wird, variiert je nach der Natur des Markers. Bei einem radioaktiven Marker kann eine Vielfalt von Techniken verwendet werden. Gemeinhin wird Nick-Translation mit einem ³²P-dNTP oder terminale Markierung mit radioaktivem ³²P unter Verwendung von γ³²P-ATP und T4-Polynucleotid-Kinase angewandt. Alternativ können Nucleotide synthetisiert werden, bei denen eines oder mehrere der vorhandenen Elemente durch ein radioaktives Isotop ersetzt sind, z. B. Wasserstoff, durch Tritium. Wenn gewünscht, können komplementäre markierte Stränge als Sonden verwendet werden, um die Konzentration von hybridisiertem Marker zu erhöhen.
Wenn andere Radionuclid-Marker beteiligt sind, können verschiedene Bindungsgruppen verwendet werden. Ein terminales Hydroxyl kann mit anorganischen Säuren (z. B. ³²P-Phosphat), mit ¹⁴C-organischen Säuren oder mit anderen verestert werden, um Bindungsgruppen für den Marker zu liefern. Alternativ können mittelstarke Basen mit aktivierbaren Bindungsgruppen substituiert werden, die dann an einen Marker gebunden werden können.
Enzyme von Interesse als Reportergruppen sind in erster Linie Hydrolasen, besonders Esterasen und Glykosidasen oder Oxidoreduktasen, besonders Peroxidasen. Zu den fluoreszierenden Verbindungen zählen Fluorescein und dessen Derivate, Rhodamin und dessen Derivate, Dansyl, Umbelliferon usw. Zu den Chemolumineszentien zählen Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazinedione (z. B. Luminol).
Die Sonde kann dazu verwendet werden, mit einer an einen wasserunlöslichen porösen Träger gebundenen Nucleotidsequenz zu hybridisieren. Je nach der Herkunft der Nucleinsäure kann die Art und Weise, wie die Nucleinsäure an den Träger gebunden ist, variieren. Durchschnittsfachleute kennen verschiedene Träger, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden können, oder können solche leicht ermitteln.
Jede beliebige im Sputum vorhandene Säugerzelle wird zur Freisetzung ihrer Nucleinsäure behandelt. Die Zielsequenzen, die mutierte Nucleotide enthalten, werden durch PCR oder andere vorstehend erwähnte Techniken amplifiziert. Die amplifizierte Nucleinsäure aus einer Sputumprobe wird auf einen Filter getropft oder ausgestrichen, so daß sie mehrere einzelne Portionen bildet. Der Filter ist ein inerter, poröser fester Träger (z. B. Nitrocellulose). Die Lyse und Denaturierung von Nucleinsäure sowie die nachfolgenden Waschvorgänge können mit einer geeigneten Lösung über einen ausreichenden Zeitraum zur Lyse der Zellen und Denaturierung der Nucleinsäure erreicht werden. Zum Lysieren wird bequemerweise das chemische Lysieren, wie vorstehend für den Sputum-Lysepuffer beschrieben verwendet. Andere Denaturierungsmittel sind unter anderen hohe Temperaturen, organische Detergentien (z. B. Alkohole, Amide, Amine, Harnstoffe, Phenole und Sulfoxide) oder bestimmte anorganische Ionen (z. B. Thiocyanate und Perchlorate).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die amplifizierte Nucleinsäure, die das mutierte Nucleotid enthält, in einen Vektor (z. B. Plasmid, Cosmid, Bakteriophage) cloniert, indem die innerhalb der Amplifikationsprimer enthaltenen 5'-Restriktionsstellen verwendet werden. Jeder Clon enthält eine Kopie der amplifizierten Zielsequenz. Der Clon wird wie vorstehend beschrieben auf Filter transferiert, anschließend erfolgt die Denaturierung. Die Hybridisierung mit einem für das mutierte Nucleotid spezifischen Oligonucleotid erlaubt die Feststellung eines mutierten Nucleotids unter 10.000 normalen Nucleotiden, die sich in einem einzigen Basenpaar unterscheiden.
Nach der Denaturierung wird der Filter in einer wässrigen gepufferten Lösung wie Tris, im allgemeinen bei einem pH-Wert von ungefähr 6 bis 8, gewöhnlich bei 7 gewaschen. Es kann sich um einen oder mehrere Waschvorgänge handeln, wobei bequemerweise die gleiche Prozedur verwendet wird, wie sie für die Lysierung und Denaturierung verwendet wurde. Nach der Beendigung der Lysierung, der Denaturierung und der Waschvorgänge wird der Filter mit der aufgetropfte Nucleinsäure bei einer hohen Temperatur, gewöhnlich von ungefähr 50 bis 70°C getrocknet. Durch diese Prozedur wird die Nucleinsäure in ihrer Position fixiert und kann zu einem genehmen Zeitpunkt mit der Sonde untersucht werden.
Die Vorhybridisierung kann durch Inkubieren des Filters bei einer leicht erhöhten Temperatur über einen ausreichenden Zeitraum mit der Hybridisierungslösung ohne die Sonde geschehen, um den Filter gründlich zu durchfeuchten. Es können verschiedene Hybridisierungslösungen verwendet werden, die von etwa 20% bis 60% Volumen, vorzugsweise 30% eines inerten polaren organischen Lösungsmittels umfassen. Eine gebräuchliche Hybridisierungslösung enthält ungefähr 50% Formamid, etwa 0,5 bis 1 M Natriumchlorid, etwa 0,05 bis 0,1 M Natriumcitrat, etwa 0,05 bis 0,2% Natriumdodecylsulfat und kleinere Mengen von EDTA, Ficoll (etwa 300–500 kD), Polyvinylpyrrolidon (etwa 250–500 kD) und Serumalbumin. In der Hybridisierungslösung sind im allgemeinen auch etwa 0,5 bis 5 mg/ml ultraschallzertrümmerter, denaturierter DNA (z. B. Kälberthymus oder Lachssperma) und wahlweise ungefähr 0,5 bis 2% Gew./Vol. Glycin enthalten. Es können auch andere Zusätze enthalten sein, wie Dextransulfat von etwa 100 bis 1000 kD und in einer Menge von etwa 8 bis 15 Gewichts-% der Hybridisierungslösung.
Die einzelne Hybridisierungstechnik ist für die Erfindung nicht von Belang. Andere Hybridisierungstechniken werden von Gall und Padue, Proc. Natl. Acad. Sci 63: 378, 1969 und John et al., Nature, 223: 582, 1969 beschrieben. In dem Maß, wie die Hybridisierungstechniken verbessert werden, können diese Verbesserungen leicht im Verfahren der Erfindung angewandt werden.
Die Menge markierter Sonde, die in der Hybridisierungslösung vorhanden ist, variiert in einem weiten Bereich, der von der Art und Weise des Markers, der Menge der markierten Sonde, die vernünftigerweise an den Filter binden kann, und der Stringenz der Hybridisierung abhängt. Im allgemeinen wird man einen wesentlichen Überschuß über die stöchiometrischen Konzentrationen der Sonde verwenden, um die Bindungsrate der Sonde an die fixierte Zielnucleinsäure zu erhöhen.
Es können verschiedene Grade der Stringenz der Hybridisierung angewandt werden. Je strenger die Bedingungen, desto größer ist die für die Hybridisierung zwischen der Sonde und der einsträngigen Zielnucleinsäuresequenz für die Duplexbildung erforderliche Komplementarität. Die Strenge kann durch Temperatur, Sondenkonzentration Sondenlänge, Ionenstärke, Zeit usw. gesteuert werden. Bequemerweise wird die Stringenz der Hybridisierung durch Änderung der Polarität der Reaktionslösung variiert, indem die Formamidkonzentration im Bereich von 20% bis 50% verändert wird. Die verwendeten Temperaturen liegen normalerweise im Bereich von etwa 20°C bis 80°C, normalerweise 30°C bis 75°C (vgl. allgemein Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel, Wiley & Sons, 1989).
Nachdem der Filter bei mäßiger Temperatur über einen für das Stattfinden der Hybridisierung ausreichenden Zeitraum mit einer Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht wurde, wird der Filter in eine zweite Lösung gebracht, die analoge Natriumchlorid-, Natriumcitrat- und Natriumdodecylsulfatkonzentrationen wie die Hybridisierungslösung aufweist. Der Zeitraum, über den der Filter in der zweiten Lösung belassen wird kann zwischen fünf Minuten und drei Stunden oder mehr liegen. Die zweite Lösung bestimmt die Stringenz, indem sie Kreuzduplexe und kurze komplementäre Sequenzen auflöst. Nach dem Spülen des Filters bei Raumtemperatur mit verdünnter Natriumcitrat-Natriumchlorid-Lösung kann der Filter auf die Gegenwart von Duplexen gemäß der Art des Markers untersucht werden. Wenn der Marker radioaktiv ist, wird der Filter getrocknet und auf Röntgenfilm belichtet.
Der Marker kann auch mit einer Fluoreszenzeinheit markiert sein, die dann mit einem spezifischen Antifluoreszenz-Antikörper sondiert wird. Mit diesem Antikörper ist beispielsweise Meerrettichperoxidase-Enzym konjugiert, das in der Lage ist, eine Chemolumineszenzreaktion zu katalysieren. Die Produktion von Licht ist dann bei schneller Belichtung auf Film sichtbar.
Die im Test der Erfindung zu verwendenden Materialien sind ideal für die Herstellung eines Kits geeignet. Ein solcher Kit kann ein in Abteilungen unterteiltes Trägermittel umfassen, so daß darin ein oder mehrere Behältnisse wie Fläschchen, Röhrchen und ähnliche untergebracht werden können, wobei jedes dieser Behältnisse eines oder mehrere der in dem Verfahren zu verwendenden separaten Elemente umfaßt.
So kann z. B. eines der Behältnisse eine Hybridisierungssonde umfassen, die feststellbar markiert ist oder feststellbar markiert werden kann. Ein zweites Behältnis kann einen Sputum/Epithelzellen-Lysepuffer enthalten. Der Kit kann auch Behältnisse haben, die Nucleotid(e) für die Amplifikation der Zielnucleinsäuresequenz enthalten, und/oder ein Behältnis, das ein Reportermittel umfaßt, wie ein Biotin-bindendes Protein, wie etwa an ein Reportermolekül, wie einen Enzym-, Fluoreszenz- oder Radionuclidmarker gebundenes Avidin oder Streptavidin.
Die vorstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis derselben kann durch Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele erreicht werden, die hier lediglich zum Zweck der Veranschaulichung geliefert werden und nicht dazu gedacht sind, den Schutzbereich der Erfindung einzuschränken.
BEISPIELE
Das John Hopkins Lung Project (JHLP) hat im Zug eines zufallsgesteuerten Versuchs einer Lungenkrebs-Durchsuchung (1974–1982) ein Archiv von Sputumproben aufgebaut. Fünfzehn Patienten dieses Versuchs entwickelten später Adenocarcinome der Lunge. Die primären Lungencarcinome von 10 dieser 15 Patienten enthielten entweder eine ras- oder p53-Genmutation. Mit einem PCR-basierten Test wurden eingelagerte Sputumproben, die vor der klinischen Diagnose gewonnen worden waren, auf das Vorliegen dieser Onkogenmutationen untersucht. Bei acht von zehn Patienten wurde die identische Mutation, die im primären Tumor bestimmt worden war, auch in wenigstens einer Sputumprobe festgestellt. Die früheste Feststellung einer clonalen Population von Krebszellen im Sputum war die in einer Probe, die mehr als ein Jahr vor der klinischen Diagnose gewonnen worden war. Diese Resultate liefern die Basis für eine neuartige Herangehensweise zur Feststellung von Lungenkrebs, die auf der Entwicklung der molekularen Genetik dieser Krankheit basiert.
BEISPIEL 1
VERFAHREN ZUR FESTSTELLUNG IM SPUTUM
A. DNA-PRÄPARATION
2 bis 3 ml von gelagerten Sputum (in normaler Kochsalzlösung als Fixiermittel) wurden in 50 ml-Röhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden 15 Minuten lang bei 1000 × g in einer Beckman Modell TJ-6-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und es wurden 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzugefügt. Die Röhrchen wurden 15 Minuten lang bei 1000 × g in einer Beckman Modell TJ-6-Zentrifuge zentrifugiert und abermals dekantiert. 1 ml 5 ng/μl Proteinase K, 1% SDS-Lösung wurden hinzugefügt, und die Röhrchen wurden gründlich gevortext. Dann wurden die Röhrchen in einem Wasserbad bei 60°C 4 bis 6 Stunden lang inkubiert. Das verdaute Sputum wurde in einen 5 ml-VACUTAINER (Becton-Dickenson) transferiert. Es wurde 1 ml PC-9 (mit Tris bei pH 9 äquilibriertes Phenol-Chloroform) hinzugefügt, und das Röhrchen wurde 1 Minute lang gevortext und dann 15 Minuten lang auf einer Hermle Z360 K-Zentrifuge bei 2500 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neuen VACUTAINER entfernt, und der letzte Schritt wurde noch einmal wiederholt.
Dann wurde der Überstand in ein neues Plastikröhrchen transferiert, und 330 μl 10 M Ammoniumacetat, 2 μl Glykogen und 3,3 ml 100% Ethanol hinzugefügt. Das Röhrchen wurde gründlich gevortext und 1 Stunde lang auf einer Hermle Z360 K-Zentrifuge bei 6000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und es wurden 3,3 ml 70% Ethanol hinzugefügt. Das Röhrchen wurde im vorstehenden Zustand 2 Minuten lang zentrifugiert und abermals dekantiert. Das so erhaltene Präzipitat wurde in einem HETOVAC (Vakuumtrockner) getrocknet. Das Präzipitat wurde dann in 100 μl destilliertem Wasser resuspendiert. Die Probe wurde bei 4°C aufbewahrt.
Ein alternatives Verfahren zur Anreicherung bösartiger Epithelzellen und zur Eliminierung nichtepithelialer Zellen im Sputum vor der PCR ist folgendes: Sputumzellen wurden durch Zentrifugierung bei 1000 × g isoliert. Die Zellen wurden zweimal in HBSS mit 2% fötalem Kälberserum (FCS) gewaschen und in 1 ml resuspendiert. Die Zellsuspension wurde auf Eis gekühlt und 20 μg/ml eines monoclonalen Antikörpers mit Spezifität für Epithelzellen, EBA-1 (andere Antikörper mit Spezifität für Epithelzellen wären ebenso wirkungsvoll) wurde zur Zellsuspension hinzugefügt und eine Stunde lang auf Eis in kubiert. Die Zellen wurden zweimal in kalter (2–8°C) HBSS mit 2% FCS gewaschen. Die Zellen wurden in kalter HBSS/2% FCS bei einer Zellkonzentration von 2–4 × 10⁶ pro ml resuspendiert.
Primäre (an Epithelzellen gebundene) EBA-Antikörper wurden an magnetischen Dynabeads (Dynal International, Oslo, Norwegen) wie folgt isoliert: Dynabeads M-450 wurden mit einem sekundären Antikörper (Schaf, anti-Maus, vom Hersteller) beschichtet. Die Kügelchen wurden zuerst zweimal 5 Minuten lang bei 2–8°C in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7.4, mit 0,1% FCS gewaschen. Die Dynabeads wurden mit einem Magneten aufgenommen, und der Überstand wurde verworfen und die Kügelchen in gleichen Anfangsvolumen resuspendiert.
Die im Verhältnis 5 Teilchen pro Zielzelle mit dem sekundären anti-murinen Antikörper beschichteten Dynabeads wurden zur Sputumprobe hinzugefügt. Die Konzentration sollte ungefähr 10⁷ Kügelchen pro ml Lösung betragen. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 4°C auf einem Rock-N-Roller inkubiert. Es wurde kalte (4–8°C) HBSS mit 1% FCS im Volumen von wenigstens 4 × von dem der Kügelchen/Zellen-Suspension hinzugefügt. Die Dynabeads wurden mit dem Magneten konzentriert. Der Überstand wurde entfernt, und die Kügelchen wurden mit HBSS/1% FCS in einem dem vorstehenden gleichen Volumen (wenigstens 4 × das Volumen der Kügelchen/Zellen-Suspension) 3 mal gründlich gewaschen. Die Dynabead/Zellen-Suspension wurde bei 1000 × g zentrifugiert und in SDS/Proteinase K resuspendiert und die DNA für die PCR isoliert.
B. PCR AMPLIFIKATION
1. Für k-ras, amplifiziere 120 bp DNA fragment:

Sputum-DNA 5 μl

Destilliertes Wasser 34 μl

PCR-Puffer (10×) 5 μl

dNTP 3 μl

Primer Kras 1 1 μl

Primer Kras 1 as 1 μl

Taq (Polymerase, 5 U/μl) 1 μl

Primer Kras 1: 5'-AGGAATTCATGACTGAATATAAACTTGT-3' (SEQ. ID NR. 1);
Kras 1 AS: 5'-ATCGAATTCTATGCATATTAAAACAAGATT-3' (SEQ. ID NR. 2).

Die Probe wurde in ein 500 μl-Röhrchen plaziert und 2 Tropfen Mineralöl hinzugefügt. Die Probe wurde auf einer Omnigene PCR-Maschine wie folgt amplifiziert: 95°C, 30 Sekunden lang; 55°C, 1 Minute lang, 35 Zyklen; 70°C, 1 Minute lang; und 70°C, 5 Minuten 1 Zyklus.
2. Für p53 (Exons 4–5), amplifiziere 500 bp-DNA-Fragment:

Sputum-DNA 5 μl

Destilliertes Wasser 34 μl

PCR-Puffer (10×) 5 μl

dNTP 3 μl

Primer 5S 1 μl

Primer Int-6AS 1 μl

Taq (Polymerase, 5 U/μl) 1 μl

Primer 5S: 5'-GTAGGAATTCACTTGTGCCCTGACTT-3' (SEQ. ID NR. 3);
Primer Int-6AS: 5'-CATCGAATTCCACTGACAACCACCCTT-3' (SEQ. ID NR. 4).

Die Probe wurde in ein 500 μl-Röhrchen plaziert und 2 Tropfen Mineralöl hinzugefügt. Die Probe wurde auf einer Omnigene PCR-Maschine wie folgt amplifiziert: 95°C, 30 Sekunden lang; 60°C, 1 Minute lang, 35 Zyklen; 70°C, 1 Minute lang; und 70°C, 5 Minuten lang, 1 Zyklus.
3. Für p53 (Exons 6–7), amplifiziere 750 bp DNA-Fragment:

Sputum-DNA 5 μl

Destilliertes Wasser 34 μl

PCR-Puffer (10×) 5 μl

dNTP 3 μl

Primer 7S 1 μl

Primer 8AS 1 μl

Taq (Polymerase, 5 U/μl) 1 μl

Primer 7S AS: 5'-GTAGGAATTCCAAGGCGCACTGGCCTC-3' (SEQ. ID NR. 5);
Primer 8 AS: 5'-ACTGAATTCTTCGTCTCCTCCACCGC-3' (SEQ. ID NR. 6).

Die Probe wurde in ein 500 μl-Röhrchen plaziert und 2 Tropfen Mineralöl hinzugefügt. Die Probe wurde auf einer Omnigene PCR-Maschine wie folgt amplifiziert: 95°C, 30 Sekunden lang; 60°C, 1 Minute lang, 35 Zyklen; 70°C, 1 Minute lang; und 70°C, 5 Minuten lang, 1 Zyklus.
Alle Amplifikationen wurden mit negativer (Wasser ohne jegliche DNA) und positiver Kontrolle (Zellinien-DNA) ausgeführt, wie SW480 (12val-Mutation k-ras) oder DZ74 (273cys-Mutation p53).
C. CLONIERUNG
Zu 5 μl des vorstehenden PCR-Produktes wurden 5 μl 2 × Stop-Puffer (Bromphenol blau in Ficoll, Glycerin und Sarcosyl mit Tris-Acetat-Puffer) hinzugefügt. Die Proben wurden auf 1% oder 2% Agarosegelen laufen gelassen, um den Ertrag der Amplifikation zu beobachten. Die verbleibenden 45 μl des PCR-Produktes wurden mit 155 μl destilliertem Wasser vermischt. Zu den 200 μl PCR-Gemisch wurden 200 μl PC-9 hinzugefügt und gründlich gevortext. Das Röhrchen wurde 2 Minuten lang in einer Hermle Z230 M Tischzentrifuge bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein anderes Röhrchen entfernt, und das Präzipitat wurde abermals mit PC-9 behandelt.
Der Zellüberstand wurde in ein neues 1,5 ml-Röhrchen entfernt, 66 μl 10 M Ammoniumacetat, 2 μl Glykogen und 660 μl 100% Ethanol wurden hinzugefügt und das Röhrchen gründlich gevortext. Das Röhrchen wurde 20 Minuten lang in einer Hermle Z230 M Tischzentrifuge bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, es wurden 660 μl 70% Ethanol hinzugefügt und die Lösung vermischt. Das Röhrchen wurde noch 2 Minuten lang zentrifugiert und abermals dekantiert. Die Probe wurde auf einem HETOVAC getrocknet.
Die DNA wurde durch Hinzufügen von 4 bis 8 μl destilliertem Wasser, je nach der Größe des Präzipitates resuspendiert. Zwei μl DNA wurden mit 1 μl T4 Lambda Zap I, (Stratagene, La Jolla, CA) und 1 μl T4-Standard-Ligierungspuffer (5×) vermischt. Das DNA-Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 65°C, 5 Minuten lang bei 37°C und 5 Minuten lang bei 24°C in einem Wasserbad inkubiert. Es wurde 1 μl T4-Ligase hinzugefügt, und das Gemisch wurde 4 bis 6 Stunden lang bei 15°C inkubiert. 1 μl des ligierten Produktes wurde mit 2,4 μl Verpackungsextrakt (Stratagene, La Jolla, CA) (Rot) und 3,74 μl Verpackungsextrakt (Gelb) vermischt. Das Ligierungsgemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur aufbewahrt. Nach 2 Stunden wurden 250 μl Phagen-Verdünnungspuffer (Phagenvorrat) zum Gemisch hinzugefügt.
Ungefähr 10 μl bis 100 μl Phagenvorrat wurden zu 100 μl XL1-B-Zellen hinzugefügt und 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Es wurden 4 ml 55°C Top-Agarose hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf L-Agar-Gelplatten bei 37°C über Nacht ausplattiert.
D. HYBRIDISIERUNG
Ein Stück Nylon-Hybridisierungstransfermembran Zetaprobe (BioRad, Richmond, CA) wurde 1 Minute lang auf die Oberfläche des Gels gelegt, das Lyseplaques enthält. Dann wurde die Membran mit der Plaqueseite nach oben auf ein Blot-Papier transferiert, wobei sie 15 Minuten lang mit 0,5 M NaOH getränkt wurde. Dann wurde die Membran zweimal 5 Minuten lang in 2 × SSC gespült. Dann wurde die Membran auf ein Blot-Papier plaziert, bevor unter UV-Licht 30 Sekunden lang die Quervernetzung vorgenommen wurde. Dann wurden die Membranen zur Hybridisierung in Plastiktüten plaziert.
Die Oligomere (Tabelle 1) wurden mit ³²P-γATP mit Standardverfahren (T4-Kinase) radioaktiv markiert. Die markierten Sonden wurden in die Plastiktüten, die die Plaque-Abdrücke enthielten, hinzugegeben. Die Hybridisierung geschah 1 Stunde lang in einem Rüttelbad bei der Temperatur, die 10°C unter der Schmelztemperatur der Sonde liegt. Dann wurden die Membranen entfernt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in 3 × SSC/0,1% SDS und 30 Minuten lang bei der Schmelztemperatur der Sonde in 3 × SSC/0,1% SDS gewaschen. Die überschüssige Lösung wurde von der Membran entfernt, bevor diese in Saran Wrap eingewickelt wurde. Die Membranen wurden bei –80°C 4 Stunden lang oder über Nacht belichtet.
TABELLE 1 Bei der Feststellung im Sputum verwendete Oligomere Zur Feststellung von p53-Genmutationen verwendete Oligomere (M. T. bzw. Melting T. = Schmelztemperatur)
(Boyle, et al., Can. Res. 53(19): 4477, 1993; Hollstein, of al., Science 253: 49, 1991; Somers, et al., Can. Res. 52: 5997, 1992; Sakai, et al., Oncogene, 7: 972, 1992).
Zur Feststellung von ras-Genmutationen verwendete Oligomere
E. HYBRIDISIERUNG UND FESTSTELLUNG
Alternativ wurden die Oligomere mit Chemolumineszenz markiert. 100 pmol Oligomere wurden zu 16 μl Cacodylatpuffer, 10 μl Fluorescin-dUDP, 16 μl terminaler Transferase und Wasser bis zu insgesamt 160 μl hinzugefügt. Das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert.
Die Membranen wurden 1 Stunde lang in [5 × SSC/0,02% SDS und 0,5% (Gew./Vol.) Blockierungsmittel (Milch) (Amersham, UK)] prä-hybridisiert. Die Sonde wurde hinzugefügt, und die Hybridisierung wurde 1 Stunde lang in einem Rüttelbad bei jener Temperatur ablaufen gelassen, die 10°C unter der Schmelztemperatur der Sonde lag. Die Membranen wurden zweimal 5 Minuten lang in 3 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen. Dann wurden die Membranen in 3 × SSC/0,1% SDS bei der Schmelztemperatur der Sonde dreimal 15 Minuten lang im Waschbad gewaschen. Die Membranen wurden 1 Minute lang gespült (NaCl, 0,15 Mol/l; Tris-Puffer, 0,1 Mol/l; pH 7.5); es folgte eine 30-minütige Inkubation in Blockpuffer (5% entrahmte Trockenmilch/TBS). Dann wurden die Membranen 1 Minute lang in TBS gespült und 30 Minuten lang in Antikörperlösung (1 : 5000 Anti-Fluorescin-Alkaliphosphatase-Antikörper (Boehringer Mannheim) in 5% Milch/TBS) inkubiert. Dann wurde die Membran unter Rütteln 8 mal 5 Minuten lang in PBS gewaschen. Das Feststellungsmittel, Lumigen PPD (Boehringer Mannheim) 1 : 100 in MgCl₂, 50 mmol/l/TBS, pH 9.5 wurde gemischt und die Blots 1 Minute lang in der Lösung inkubiert. Die überschüssige Lösung wurde entfernt und die Membran in Plastik eingewickelt und sofort 10 bis 60 Minuten lang auf Röntgenfilm belichtet.
BEISPIEL 2
Es wurden in Paraffin eingebettete primäre Lungentumorproben von 15 Patienten untersucht, die im Verlauf des JHLP-Versuchs Lungen-Adenocarcinome entwickeln sollten (Tabelle 1). Die Patienten wurden aufgrund der Verfügbarkeit von in Paraffin eingebettetem Gewebe als Folge einer chirurgischen Resektion und negativer Sputum-Cytologie vor der definitiven Diagnose ausgewählt. Nach der Extraktion von Tumor-DNA wurde ein Segment von 2 Ziel-Genen aus diesen primären Carcinomproben durch PCR amplifiziert, um Mutationen des k-ras-Onkogens und des p53-Tumor-Suppressorgens festzustellen. Es wurden Adenocarcinome gewählt, weil diese Tumore ein häufigeres Auftreten von k-ras-Mutationen (30%) als andere Lungentumore aufweisen (Rodenhuis et al., Can Res 48: 5738–5741, 1988; Rodenhuis S. & Slebos, R. J., Am Rev Res Dis 142: S27–S30, 1990). p53-Gen-Mutationen wurden untersucht, da dies die häufigsten genetischen Veränderungen sind, die sich in diesen Tumoren und in einer Vielzahl anderer Krebserkrankungen finden (Takahashi et al., Science 246: 491–494, 1989; Kishimoto et al., Can Res 52: 4799–4804, 1992; Hollstein et al., Science 253: 49–53, 1991). Die Sequenzanalyse der PCR-Produkte der zwei Zielgene bestimmte 10 primäre Tumore, die entweder eine k-ras- oder eine p53-Genmutation enthielten (Tabelle 2). Die k-ras-Mutationen waren jene, die gewöhnlich mit Adenocarcinomen der Lunge einhergingen, und sie traten vorwiegend am Codon 12 auf. Die beiden p53-Mutationen fanden an den Codons 273 und 281 statt, und beide sind schon früher bei Lungenkrebserkrankungen beschrieben worden (Takahashi et al., vorst.; Kishimoto et al., vorst.; Hollstein et al., vorst.). Viele Tumorproben waren klein (< 1 cm), und bei allen Tumoren reichte die DNA nicht für eine ausgedehnte Sequenzanalyse von p53 (Exons 5 bis 8) aus.
Nach der Bestimmung der Tumore mit Onkogen-Mutationen wurden alle verfügbaren entsprechenden Sputumproben dieser betroffenen Patienten gewonnen. Keiner der untersuchten Patienten hatte in der JHLP-Studie jemals eine positive Sputum-Cytologie. Daher wurden alle Patienten bis auf einen (L4, untersucht wegen Hustens) durch Thoraxröntgen diagnostiziert.
Die Sputumproben, die verfügbar waren (im allgemeinen eine oder zwei Proben vor der klinischen Diagnose) wurden mit einem PCR-basierten Test analysiert, der in der Lage ist, eine mutationshaltige Zelle gegen einen Hintergrundüberschuß von 10.000 normalen Zellen festzustellen (Sidransky, D. et al., Science, 252: 706–709, 1991; Sidransky, D. et al., Science, 256: 102–105, 1992). Dieser Test war auf die Amplifikation von Sputum-DNA mit nachfol gender Clonierung in einen Phagenvektor und Transfer auf Nylon-Membran, wie in Beispiel 1 beschrieben gestützt. Ein mutationsspezifisches Oligomer wurde mit jedem der Filter hybridisiert, um spezifische Punktmutationen entweder bei dem im Sputum vorhandenen k-ras- oder beim p53-Gen festzustellen. Neoplastische Zellen, die entweder ras- oder p53-Mutationen enthielten, wurden im Sputum von acht der 10 Patienten, die Tumore mit Onkogenmutationen hatten, festgestellt. Positive Sputumproben, die eine clonale Population von Krebszellen enthielten, wurden ein bis 13 Monate vor der klinischen Diagnose gewonnen (Tabelle 2). Die Feststellung einer Krebszelle unter 160 normalen Zellen (1/320 ÷ 2 = 160; jede normale Zelle steuert 2 Wildtypallele bei) erfolgte im Sputum des Patienten L4 13 Monate vor seiner klinischen Diagnose (Tabelle 2). Der Tumor von diesem Patienten enthielt > 95% positiver Plaques, wenn p53 mit einem mutationsspezifischen Codon 273-Oligomer sondiert wurde, und seine Sputumprobe enthielt ebenfalls einige positive Plaques (1). Viele Clone mit einem PCR Insert vom p53-Gen hybridisierten mit einer für die Arg-His-Mutation im Codon 273 im Tumor (T) des Patienten (L4) spezifischen Oligomersonde. Eine geringere Anzahl von Clonen hybridisierten mit der gleichen spezifischen Sonde im Sputum (S) des Patienten. Es gab keinen mit dieser Sonde hybridisierenden Clone in einem Kontroll-Sputum von einem Patienten (L15) ohne p53-Gen-Mutation in seinem primären Lungenkrebs (C). Es wurden eingelagerte Sputumproben in 30 cm³-Schraubverschlußgläsern mit 2% Carbowachs/50% Alkohol-Konservierungslösung (Saccomanno'sches Fixiermittel) ausfindig gemacht [Details zur Probenerhebung in (Berlin, N. I., Buncher, C. R., Fontana, R. S., Frost J. K. & Melamed, M. R., Am Rev Resp Dis 130: 545–549, 1984; Tockman, M. S., Chest 89: 324S–325S, 1986; Tockman, M. S. et al., J Clin Oncol 6: 1685–1693, 1988)]. Aus jeder davon wurden 5 cm³ (ungefähr 50.000–500.000 Zellen) entnommen, 5 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert und in 5 cm³ normaler Kochsalzlösung rehydratiert. Die Zellen wurden dann erneut bei 1000 × g zentrifugiert und in 1 ml 1% SDS/Proteinase K resuspendiert (5 mg/μl wurden für jede PCR-Reaktion verwendet, die in einem separaten, der PCR vorbehaltenen Raum ausgeführt wurde, um die Möglichkeit einer Kontamination auszuschließen. Die Primer von k-ras p53 enthielten EcoRI-Stellen, um das Clonieren zu erleichtern. Nach 35 Amplifikationszyklen wurden die Produkte mit EcoRI gespaltet und an Lambda Zap II (Stratagene) ligiert (Sidransky, D. et al., Science 256: 102–105, 1992. Mit Bakteriophagen infizierte XLI-Zellen wurden in einer Dichte von 500–3000 Plaques pro Platte auf L-Agar ausplattiert, auf Nylonmembranen transferiert und hybridisiert. Die zur Hybridisierung verwendeten Oligonucleotide wurden mit ³²P markiert und wie bei Sidransky, D. et al., Science 252: 706–709, 1991; Sidransky et al., 1992, vorst. beschrieben hybridisiert. Zu den für die Feststellung verwendeten Oligonucleotiden gehörten: 5'-GGAGCTGGTGGCGTAGGCAA-3' für WT-ras (SEQ. ID NR. 119), 5'-GGAGCTGTTGGCGTAGGCAA-3' für die Val¹²-Mutation (SEQ. ID NR. 115), 5'-GGAGCTGATGGCGTAGGCAA-3' für die Asp¹²-Mutation (SEQ. ID NR. 116), 5'-GGAGCTAGTGGCGTAGGCAA-3' für die Ser¹²-Mutation (SEQ. ID NR. 117), 5'-GGAGCTTGTGGCGTAGGCAA-3' für die Cys¹²-Mutation (SEQ. ID NR. 118), 5'-ATGGGCGCCATGAACCGG-3' für WT-p53 (SEQ. ID NR. 120), 5'-TTGAGGTGCATGTTTGTG-3' für die His²⁷³-Mutation (SEQ. ID NR. 121), und 5'-TGGGAGAGGCCGGCGCA-3' für die Gly²⁸¹-Mutation (SEQ. ID NR. 122).
Um die Bestimmung der Mutation des Codons 273 im Sputum zu überprüfen, wurde eine positive Plaque aus dem Sputumtest punktiert und sequenziert, wodurch das Vorliegen der gleichen Mutation bestätigt wurde (2). Die Sequenzierung der Gele vereinigter Clone nach p53 zeigt die WT-Sequenz bei einer normalen (N) Kontrolle und die Sequenz der 273 CGT-CAT- (Arg → His)- Mutationssequenz (Pfeil) im Tumor (T) mit einer residualen WT-Bande. Eine der in 1(S) gezeigten positiven Plaques wurde punktiert und sequenziert, wobei sich im Sputum (S) die gleiche Mutationsbande zeigte, die auch im primären Tumor gefunden worden war. Auf jeder Tafel stellen die Reihen von links nach rechts die Terminationen A, C, G und T dar. Kurz gesagt, wurde die Tumor-DNA aus den Paraffinscheiben durch Inkubation mit Xylol extrahiert, gefolgt von einer Behandlung mit SDS/Proteinase K und Ethanolfällung. Das Exon 1 des k-ras-Gens und die Exons 5 bis 8 von p53 wurden (wenn genügend DNA verfügbar war) durch PCR amplifiziert, in Lambda Zap II (Stratagene) cloniert und wie beschrieben sequenziert (Sidransky et al., 1991, vorst.). Jedoch wurde das p53-Gen in zwei Segmenten unter Verwendung folgender Primer amplifiziert: p53-5S 5'-GTAGGAATTCACTTGTGCCCTGACTT-3' (SEQ. ID NR. 3) und p53-6AS 5'-CATCGAATTCCACTGACAACCACCCTT-3' (SEQ. ID NR. 4) (Exons 5–6); p53-7S 5'-GTAGGAATTCCAAGGCGCACTGGCCTC-3' (SEQ. ID NR. 5) und p53-8AS 5'-ACTGAATTCTTCGTCTCCTCCACCGC-3' (SEQ. ID NR. 6) für die Exons 7–8.
In positiven Sputumproben reichte das Verhältnis von Krebs- zu normalen Zellen von 1 von 600 (Patient L5) bis 1 von 50 (Patient L3), wobei die Mehrzahl der Proben ungefähr eine Krebszelle unter 150 normalen Zellen enthielt. Fünf Kontrollpatienten mit Lungenkrebs, deren Tumore nach der Sequenzanalyse weder eine k-ras- (Codons 12 und 13) noch eine p53- (Exons 5 bis 8) Genmutation enthielten, waren nach diesem Test für alle zwölf k-ras- und beide p53-mutationsspezifischen Sonden negativ.
Bei zwei Patienten, von denen jeweils nur eine einzige Sputumprobe verfügbar war, war eine clonale Population von mutationshaltigen Zellen trotz des Vorhandenseins von Mutationen in ihrem primären Tumoren nicht feststellbar (Tabelle 2). Ferner war das erste Auftreten einer clonalen Population von Krebszellen bei positiven Patienten mit diesem Sputum-Test wegen des Fehlens von Proben vor der Diagnose nicht verfolgbar. Jedoch waren bei sechs von den 10 Patienten Sputumproben > 24 Monate vor der Diagnose verfügbar, und sie waren negativ. Dies legt die Annahme einer Grenze von 13 bis 24 Monaten vor dem klinischen Auftreten für die molekulare Diagnose nach unserem Test nahe. Als weitere Kontrolle erwiesen sich 6/8 Patienten, die anfänglich positiv getestet worden waren, in Sputumproben, die nach einer vollständigen chirurgischen Resektion ihres Tumors gewonnen worden waren, negativ. Es schien keinerlei Korrelation zwischen dem Ort des Tumors und der Fähigkeit zu bestehen, mit diesem Test Mutationen in Sputumproben festzustellen. „Falsche negative" Proben können auf ungeeignete Probenerhebung, geringen Zellengehalt oder die variable Gegenwart von Tumorzellen im Sputum zurückzuführen sein. Die durch Routine-Lichtmikroskopie aus der cytologischen Diagnose im Sputum gewonnene Information hat schon früher die Annahme nahe gelegt, daß 2 oder 3 Proben den diagnostischen Ertrag signifikant verbessern können, und dies gilt in ähnlicher Weise auch für die molekulare Diagnose.
Der Patient L4 mit einer großen T3-Läsion hat das längste Intervall (13 Monate zwischen Sputum-Feststellung und Diagnose. Er hatte auch eine negative transthorakale Biopsie 6 Monate vor der sicheren Diagnose, da beim Thoraxröntgen eine kleine Läsion festgestellt worden war. Dieser Patient hatte somit 2 Gelegenheiten für die routinemäßige cytopathologische Feststellung vor der klinischen Diagnose. Er starb 4 Monate nach der chirurgischen Resektion an der Krankheit durch Metastasierung. Dieser besondere Fall dient dazu, die Grenzen der Routine-Cytologie und die Fähigkeit zur Erweiterung der morphologischen Analyse durch die Verwendung von Sonden für spezifische Genmutationen aufzuzeigen. TABELLE 2: LUNGENKREBSPATIENTEN MIT GENMUTATIONSANALYSE DES SPUTUM

A.: Adenocarcinom
L: Großzelliges Bronchialcarcinom
Prä-Dx: Monate vor der tatsächlichen klinischen Diagnose
Op: Operation
N/A: Nicht verfügbar
ND: Nicht ausgeführt
M/T: Zahl der mutierten Allele/Total Plaques mit Zielgen-Insertion.
RUL: Rechter oberer Lungenlappen;
LUL: Linker oberer Lungenlappen;
RLL: Rechter unterer Lungenlappen;
LLL: Linker unterer Lungenlappen.

Die Ergebnisse dieser Versuche liefern eine Ausführungsform, bei der eine erfolgreiche Feststellung von Neoplasien erreicht wurde, und sie liefert eine praktische Basis für eine neue Herangehensweise an die Feststellung des Vorhandenseins von Neoplasien, wie Lungentumore in einer nichtinvasiven Form. Die Herangehensweise sollte beim Absuchen von Zellpopulationen und bei Behandlungen, die zur Minimierung der Auswirkungen von Neoplasie konzipiert sind, von Nutzen sein. Sie könnte auch dazu verwendet werden, symptomfreie Patienten abzusuchen, insbesondere jene, die aufgrund von erblich erworbenen oder Umweltfaktoren neoplasiegefährdet sind. Die derzeitige Resultate zeigen, daß ein signifikanter Anteil von Lungenkrebs im frühen Stadium und von gefährlichen vor-bösartigen Läsionen durch diese Strategie festgestellt werden kann. Darüberhinaus zeigen diese Befunde, daß neben k-ras und p53 auch andere mutierte Nucleotidsequenzen, die mit Lungenneoplasien assoziiert oder Indikatoren für solche sind, in Sputumproben ebenfalls feststellbar sein könnten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis einer Säuger-Zielnucleinsäure in einem p53-Gen, wobei die Zielnucleinsäure eine mutierte Nucleotidsequenz umfasst, in einer Sputum-Probe eines Individuums, das Neoplasie der Lunge hat oder gefährdet ist, Neoplasie der Lunge zu bekommen, wobei das Verfahren umfasst: Isolieren der Nucleinsäure, die in der zellulären Fraktion der Sputumprobe vorhanden ist; und Nachweis des Vorhandenseins der Zielnucleinsäure, wobei das Vorhandensein der veränderten Nucleinsäuresequenz mit Neoplasie der Lunge verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielnucleinsäure vor dem Nachweis amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifikation mittel Oligonucleotiden erfolgt, die mit den flankierenden Regionen der Zielnucleinsäure hybridisieren.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mutation ein mutiertes Nucleotid, einen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus, eine Nucleinsäuretranslokation, eine Nucleinsäureinsertion, eine Nucleinsäuredeletion oder eine Nucleinsäuresubstitution umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Neoplasie gutartig ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Neoplasie bösartig ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Nucleotidsequenz der flankierenden Region, mit der das Oligonucleotid hybridisiert, ausgewählt ist aus: 5'-AAGTCAGGGCACAAGTGAATTCCTAC-3' (SEQ ID NR: 125), 5'-AAGGGTGGTTGTCAGTGGAATTCGATG-3' (SEQ ID NR: 126), 5'-GAGGCCAGTGCGCCTTGGAATTCCTAC-3' (SEQ ID NR: 127), oder 5'-GCGGTGGAGGAGACGAAGAATTCAGT-3' (SEQ ID NR: 128) und komplementären Sequenzen dazu.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Oligonucleotid 5'-GTAGGAATTCACTTGTGCCCTGACTT-3' (SEQ ID NR: 3), 5'-CATCGAATTCCACTGACAACCACCCTT-3' (SEQ ID NR: 4), 5'-GTAGGAATTCCAAGGCGCACTGGCCTC-3' (SEQ ID NR: 5), oder 5'-ACTGAATTCTTCGTCTCCTCCACCGC-3' (SEQ ID NR: 6) ist und komplementäre Sequenzen dazu.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielnucleinsäure unter Verwendung einer Nucleotid-Hybridisierungssonde nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Zielnucleinsäure, mit der die Nucleotid-Hybridisierungssonde hybridisiert, ausgewählt ist aus: 5'-CACAAACATGCACCTCAA-3' (SEQ ID NR: 11), 5'-TGCGCCGGCCTCTCCCA-3' (SEQ ID NR: 12), oder 5'-CCGGTTCATGGCGCCCAT-3' (SEQ ID NR: 14) und komplementäre Sequenzen dazu.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Nucleotid-Hybridisierungssonde ausgewählt ist aus: 5'-TTGAGGTGCATGTTTGTG-3' (SEQ ID NR: 121), 5'-TGGGAGAGGCCGGCGCA-3' (SEQ ID NR: 122), 5'-ATGGGCGCCATGAACCGG-3' (SEQ ID NR: 120), oder 5'-GGAGCTGGTGGCGTAGGCAA-3' (SEQ ID NR: 119) und komplementären Sequenzen dazu.
Kit, der zum Nachweis einer Zielnucleinsäure in einem p53-Gen in einer Sputumprobe nützlich ist, wobei die Zielnucleinsäure eine mutierte Nucleotidsequenz umfasst, wobei die Sputumprobe von einem Individuum ist, das Neoplasie der Lunge hat oder gefährdet ist, Neoplasie der Lunge zu bekommen, und wobei das Vorhandsein der veränderten Nucleinsäuresequenz mit Neoplasie der Lunge verbunden ist, wobei der Kit einen oder mehrere Behälter umfasst, die eine Hybridisierungssonde enthalten, die mit der mutierten Nucleotidsequenz spezifisch hybridisiert, und einen Behälter, der einen Sputum-Epithelzellen-Lysepuffer enthält.
Kit nach Anspruch 12, der weiterhin einen Behälter umfasst, der einen Oligonucleotid-Primer zur Amplifikation der Zielnucleinsäure enthält.
Kit nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Sonde nachweisbar markiert ist.