KR101644043B1 - Ｒｎａ에 특이적으로 결합하는 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 BC200 RNA 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자, 이를 포함하는 BC200 RNA 탐지용 조성물, 키트, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한 시료 내 BC200 RNA 탐지 방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 관련 질환 진단용 조성물 및 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 BC200 RNA 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자, 이를 포함하는 BC200 RNA 탐지용 조성물, 키트, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한 시료 내 BC200 RNA 탐지 방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 관련 질환 진단용 조성물 및 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
RNA가 단순히 유전정보로의 전달자로서의 역할 뿐만 아니라, 2차 혹은 3차 구조를 가짐으로써 다양한 세포내 기능을 하는 것으로 밝혀지고 있다. 즉, RNA가 세포 내에서 기능을 하기 위해서는 이에 필요한 2차 또는 3차 구조를 가지고 있어야만 한다. 그러므로 세포에는 같은 염기서열을 가지고 있지만 2차 또는 3차 구조가 다른 RNA가 존재한다. 그러나 현재까지 RNA를 분석하기 위해서 기본적으로 사용하는 방법은 혼성체화(hybridization)인데, 혼성체화 조건에서는 RNA의 2차 또는 3차 구조가 유지되기 어렵기 때문에 이 방법으로 염기서열은 같으나 구조가 다른 RNA를 구별할 수 없었다.
또한, BC200 RNA(brain cytoplasmic 200)를 비롯하여 여러 기능성 RNA의 중요성이 확대되고, 그 이해가 절대적으로 요구되고 있다. 새로운 기능성 생체 분자로 대두되고 있는 RNA의 구조를 인지할 수 있는 항체가 개발된다면, 학문적으로는 세포에서 일어나는 RNA-단백질 상호작용 원리의 기본적인 개념을 도입할 수 있고, 세포 내 RNA 기능을 구조적인 측면에서 조사할 수 있을 뿐만 아니라, 분자 인지의 새로운 기술로서 바이오칩(biochip)이나 바이오센서(biosensor)는 물론 진단 및 치료제의 개발 등에 효과적인 활용을 기대할 수 있다.
이에 따라, RNA를 인식하는 항체의 중요성이 알려진 후, RNA와 결합하는 항체를 찾으려는 노력이 계속되고 있다.
그러나, 항체는 항원(antigen)과의 반응에서 고도의 친화성과 특이성을 나타내므로, 항체를 RNA 구조를 인지하는 분자로 개발할 수 있지만 동물을 이용하는 기존의 방법으로 항체를 제조할 수 없다. 그 이유는 RNA가 매우 불안정하여 동물에 주입하는 순간 분해되기 때문이다. 이러한 이유에서 RNA 구조를 인지하는 항체 제조 연구는 거의 시도되지 않았다. 하지만 최근 개발되고 있는 인간 항체 라이브러리를 이용하면 시험관 내에서 특정 분자의 구조를 인지하는 항체를 창출할 수 있기 때문에, 인간 항체 라이브러리는 RNA의 불안정성 문제점을 극복하고 RNA의 구조를 인지하는 인간 항체의 창출에 이용될 수 있다.
RNA와 결합하는 항체를 찾는 방법으로는, 예를 들어, Jing-Dong Y., et al.(PNAS Vol.105, No.1, 82-87 (2007), Synthetic antibodies for specific recognition and crystallization of structured RNA)에는 자성 비드(magnetic bead)를 사용하여 패닝하는 방법이 개시되어 있으나, 상기 선행논문은 자성 비드가 가지고 있는 유동성 때문에 용액 분리 과정에서 비특이성의 문제점을 가지고 있으며, 더구나 패닝 차수(round)가 늘어남에도 동일한 횟수로 세척할 경우 항원에 대한 친화력이 강하고 특이적인 항체 선별에 있어 단점이 있다. 또한 합성 라이브러리를 사용하고 있기에 상기 언급한 활용에 있어 큰 제한이 있을 수 있으며, 현재까지 상기 문제점들을 보완한 선별 방법은 개발되고 있지 않은 실정이다.
이에, 본 발명자들은 연구를 지속하여 RNA에 결합하는 항체의 선별방법 및 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체에 관하여 기능성 RNA의 구조를 인식하는 인간 항체의 제조에 유용하게 사용되며, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체는 BC200 RNA를 인지하거나 그 작용을 조절할 수 있어 관련 의약분야에 다양하게 적용될 수 항체를 개발하여 출원한 바 있다(출원번호 10-2012-0155487).
본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 상보성결정영역 1 (CDR1), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열 중 4번째 아미노산 S 가 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 BC200(brain cytoplasmic 200) RNA의 서열번호 13의 50번 내지 120번 위치에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 7 내지 서열번호 10으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성결정영역3 (CDR3)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하는 핵산분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 탐지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 탐지용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 시료 내 BC200 RNA 탐지 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, BC200 RNA 관련 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, BC200 RNA 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 구현예로서, 본 발명은,
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 상보성결정영역 1 (CDR1),
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및,
서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1,
서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및
서열번호 6의 아미노산 서열 중 4번째 아미노산 세린(serine, S)이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 상기 경쇄 가변영역(VL)의 CDR3 는 서열번호 6의 아미노산 서열 중 4번째 아미노산 세린(serine, S)이 글리신(Glycine, G), 알라닌(Alanine, A), 시스테인(Cysteine, C) 또는 발린(Valine, V)으로 치환된 서열로 이루어지는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 구체적인 일구현예로서, 본 발명은 상기 경쇄 가변영역(VL)의 CDR3 는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
또 다른 구체적인 일구현예로서, 본 발명은 상기 경쇄 가변영역(VL)의 CDR3 는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
또 다른 구체적인 일구현예로서, 본 발명은 상기 경쇄 가변영역(VL)의 CDR3 는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
또 다른 구체적인 일구현예로서, 본 발명은 상기 경쇄 가변영역(VL)의 CDR3 는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
상기 항체는 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL ) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; (v) 분리된 CDR영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) 등을 포함한다.
본 명세서에서 파아지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 "패닝(panning)"이라고 한다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 통상의 기술자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편일 수 있다. 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
BC200(brain cytoplasmic 200) RNA는 본래 영장류의 뇌에서 발현되는 신경세포 특이적 ncRNA(non-coding RNA)로서 처음 발견되었으며(Tiedge, H., et al., J Neurosci, 1993 및 Watson, J.B. and Sutcliffe, J.G., Mol Cell Biol, 1987), 신경세포의 수상돌기에서 국부적으로 단백질 합성을 조절하는 인자로 여겨지고 있다(Lin, D., et al., Mol Cell Biol, 2008). 또한 BC200 RNA가 신경 조직 외에 다양한 유래의 종양 조직에서도 발현되며 특히, 유방암의 경우에는 양성 종양에 비해서 전이성 유방암에서 더 높은 발현을 보인다는 것이 보고되었다(Chen, W., et al., J Pathol, 1997 및 Iacoangeli, A., et al., Carcinogenesis, 2004). 더불어 알츠하이머병과 같은 신경관련 질환에서도 많은 BC200 RNA가 발견되는 것으로 알려지고 있다(Lukiw, W.J., et al., Neurochem Res, 1992 및 Mus, E., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2007). 본 발명에서 BC200 RNA은 서열번호 13의 염기서열을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 13으로 이루어진 염기서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예는 BC200(brain cytoplasmic 200) RNA의 서열번호 13의 50번 내지 120번 위치에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 구체적으로 BC200 RNA 내의 서열번호 11(ggaguucgag) 또는 서열번호 12(gcaauauag) 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 일구현예로서 본 발명은 서열번호 7 내지 서열번호 10으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성결정영역3 (CDR3)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하는 핵산분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 상보성결정영역 1 (CDR1),
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및,
서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1,
서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및
서열번호 6의 아미노산 서열 중 4번째 아미노산 S 가 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, BC200 RNA의 탐지용 조성물, 또는 BC200 RNA 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 탐지용 조성물은 단백질에 특이적인 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
한편, 상기 탐지용 조성물은 탐지의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다 (Antibodies: A Labotory Manual, Harlow＆Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
바람직하게는, 상기 탐지용 또는 진단용 조성물은 탐지용 또는 진단용 키트, 마이크로어레이, 단백질 칩의 형태로 제공될 수 있다. 상기 진단용 키트로는 예를 들면, 샘플 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 샘플에 적용되는 샘플패드 (sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 샘플이 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막 (예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어질 수 있다.
또한 본 발명의 일구현예로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 시료 내 BC200 RNA 탐지 방법에 관한 것일 수 있다.
상기 ‘시료’는 BC200 RNA를 함유하거나 또는 함유할 것으로 추정되는 임의의 물질을 말한다. 시료는 천연 또는 합성된 것일 수 있고, 통상의 기술자에게 공지된 임의 수단을 통해 수득될 수 있다. 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨 뿐만 아니라, 시험관 내 세포 배양 성분의 시료, 예를 들면, 세포 성분, 세포배양배지, 재조합세포 등을 포함할 수 있다. 상기 시료와 결합여부를 판단함으로써 시료 내 BC200 RNA를 탐지할 수 있다.
또한, 본 발명의 일구현예로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 암 및 신경질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 BC200 RNA 관련 질환 진단용 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 암은 유방암, 이하선암, 설암, 자궁경부암, 식도암, 폐암 또는 난소암 등일 수 있으며, 신경질환은 알츠하이머일 수 있다.
상술한 바와 같이, BC200 RNA는 다양한 유래의 종양 조직에서도 발현되며 특히, 유방암의 경우에는 양성 종양에 비해서 전이성 유방암에서 더 높은 발현을 보인다는 것이 보고되었고(Iacoangeli, A., et al., Carcinogenesis. 2004 Nov;25(11):2125-33 BC200 RNA in invasive and preinvasive breast cancer.), BC200 RNA의 발현이 유방암, 자궁경부암, 식도암, 폐암, 난소암,이하선암 및 설암에서도 나타나는 것에 대해서도 보고된 바 있다(Chen, W., et al., J Pathol, 1997Nov;183(3):345-51. Expression of neural BC200 RNA in human tumours). 또한, 알츠하이머병과 같은 신경관련 질환에서도 많은 BC200 RNA가 발견되는 것으로 알려지고 있으므로(Lukiw, W.J., et al., Neurochem Res. 1992 Jun;17(6):591-7. BC200 RNA in normal human neocortex, non-Alzheimer dementia (NAD), and senile dementia of the Alzheimer type (AD). 및 Mus, E., P.R. Hof, and H. Tiedge, Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jun 19;104(25):10679-84. Dendritic BC200 RNA in aging and in Alzheimer's disease.), 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 환자 시료 내 BC200 RNA 의 발현 수준을 탐지함으로써, 해당 환자가 암이나 신경질환 등 BC200 RNA 관련 질환인지 여부를 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 국내공개특허 제 10-2011-0075173호를 통하여 BC200 RNA의 발현양을 감소시키면 암의 전이를 줄일 수 있음을 확인함으로써, BC200이 암의 전이를 예방 및/또는 치료하기 위한 타겟이 될 수 있음을 입증하였다.
이에 따라, 본 발명의 또 다른 일구현예는, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 암 전이 억제용 및/또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
아울러, 위에서 언급한 바와 같이, BC200 은 여러 종류의 암과 신경질환에서 특이적으로 발현되어 이들 질환의 발병, 유지 또는 진행과 관련이 있다는 것이 여러 선행문헌을 통하여 시사되고 있으므로, 본 발명의 또 다른 일구현예는, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 암 및 신경질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 BC200 RNA 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 암은 유방암, 이하선암, 설암, 자궁경부암, 식도암, 폐암 또는 난소암 등일 수 있으며, 신경질환은 알츠하이머일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상술한 항체 외에도, 1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 이 때, 부형제라함은 상기 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용 가능한 임의의 불활성 성분을 의미한다. 상기 고분자 외에, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 적당한 부형제로는, 1) 락토스, 유당, 만니톨, 셀룰로오스, 소르비톨 등 또는 이들의 임의의 조합의 희석제, 2) 콜로이드성 이산화규소, 탈크 등 또는 이들의 임의의 조합의 활택제, 3) 스테아린산 마그네슘, 스테아린산, 경화유, 나트륨 스테아릴 푸마레이트 등 또는 이들의 임의의 조합의 윤활제, 4)착색제 또는 방부제 등이 있다.
다만, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 부형제의 종류에는 위 나열된 것들에 한정되지는 않으며, 이외에도 다양한 부형제들이 제한없이 포함될 수 있다.
상기 매트릭스 형태로 제공되는 약학 조성물은 정제 형태일 수 있다. 또한 경구적으로 복용하기에 적합한 투여 형태로 제제화 될 수 있다.
본 발명에 따른 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 BC200 RNA를 인지하거나 그 작용을 조절할 수 있어, BC200 RNA 관련 질환의 진단 및 치료에 유용하게 응용될 수 있다. 또한, 본 발명의 RNA에 결합하는 항체의 선별방법은 기능성 RNA의 구조를 인식하는 인간 항체의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 BC200 RNA의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 패닝법을 이용하여 선별한 파아지에 디스플레이된 다클론 Fab 항체 (polyclonal Fab antibody)의 RNA에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 패닝법을 이용하여 선별한 파아지에 디스플레이된 Fab 형태의 단일 클론 항체의 RNA에 대한 결합력을 닷 블랏으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 동물 세포주에서 발현된 항체를 정제한 후 SDS-PAGE로 분석할 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 동물 세포주에서 발현된 항체를 정제한 후 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 BC200 RNA를 인식하는 항체의 CDR 서열 및 항체-RNA 복합체의 해리상수를 나타낸 것이다.
도 7은 항체-RNA 복합체의 해리상수를 구하기 위한 결합법을 나타낸 것이다.
도 8은 대장균에서 유래한 6S RNA를 음성 대조군으로 사용한 경우의 결합법을 나타낸 것이다.
도 9는 PCR 돌연변이법을 동반한 sib 선별(selection)을 이용한 새로운 친화도 성숙과정(affinity maturation)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 10은 MabBC200-A 항체로부터 유래되어 친화도 성숙 과정을 거친 클론들의 CDR 서열 및 항체-RNA 복합체의 해리상수를 나타낸 것이다.
도 11은 친화도 성숙과정을 거친 항체-BC200 RNA 복합체의 해리 상수를 구하기 위한 결합법을 나타낸 것이다.
도 12는 RNA(51-120)과 그 유도체들의 2차 구조를 나타낸 것이다. RNA(51-120)는 BC200 RNA의 51~120번의 서열 및 5’끝에 2개, 3’끝에 1개를 추가로 가진, 총 73개의 핵산으로 이루어져 있으며, MabBC200-A3와 결합하는 자리는 빨간 글자로 표시하였다.
도 13은 항체 MabBC200-A3에 결합하는 RNA를 찾기 위한 SELEX의 모식도를 나타낸 것이며, IP는 면역침강을 의미한다.
도 14는 SELEX 8라운드를 마친 후 선택된 RNA들의 2차 구조를 나타낸 것이며, 항체와 결합하는 자리는 빨간 글자로 표시하고, 랜덤화 된 서열은 박스표시하였다.
도 15는 각 RNA-항체 복합체의 해리 상수를 구하는 결합법을 나타낸 것이다.
도 16은 RNA(51-120) 및 그 유도체들의 RNA-항체 복합체의 해리 상수를 구하기 위한 결합법을 나타낸 것이다.
도 17은 히드록실 라디칼 (hydroxyl radical) 발자국법을 이용하여 0, 5, 10, 및 50nM의 MabBC200-A3와 BC200 RNA의 결합영역을 나타낸 것이다.
도 18은 BC200 RNA 구조 중 항체와 결합하는 BC200 RNA의 영역을 낸 것이다.
도 19는 BC200 RNA 구조 중 항체가 결합하고 있는 영역을 포함하는 51번부터 119번 염기까지 예측한 3차 구조를 나타낸 것이다.
도 20은 유방암세포주 (MCF7, SKBR3, MDA-MB-231, MDA-MB-435, Hs578T 및 T47D)와 일반 유방 세포주인 MCF10A에서의 전체 세포 RNA (total cellular RNAs) 중 BC200 RNA 양을 Northern 분석을 통해 확인한 것을 나타내었다.
도 21은 MabBC200-A3에 의해 면역 침강된 면역침전물 내의 BC200 RNA를 Northern 분석을 통해 나타낸 것이다(MabN: 음성대조군).
도 22는 MabBC200-A와 FITC가 부착된 항 인간 IgG (anti-human IgG)를 세포에 처리한 후 흐름 세포 측정법(flow cytometry) 으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 상기 도 17의 흐름 세포 측정법(flow cytometry)에 의한 형광 값 및 도 20의 Northern 분석 값의 비교 그래프를 나타낸 것이다. 흐름 세포 측정법은 MabN으로, Northern 분석은 5S로 보정하였으며 (normalized), 비교 값 (the relative signal)은 각 세포에 대한 비례 값으로 나타내었다 (arbitrary unit).
도 24는 MabBC200-A3로 처리된 세포 용해물 (lysate)을 면역 침강하여, 면역침강물 내의 BC200 RNA 양을 Northern 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 25는 세포 면역침강 (cellular IP) 후의 Northern 분석 값과 도 22의 흐름 세포 측정 값의 비교 그래프를 나타낸 것이다.
도 26은 BC200 RNA의 특이한 구조적 모티프를 인식하는 인간 항-RNA 항체를 나타낸 것이다.
도 2는 패닝법을 이용하여 선별한 파아지에 디스플레이된 다클론 Fab 항체 (polyclonal Fab antibody)의 RNA에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 패닝법을 이용하여 선별한 파아지에 디스플레이된 Fab 형태의 단일 클론 항체의 RNA에 대한 결합력을 닷 블랏으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 동물 세포주에서 발현된 항체를 정제한 후 SDS-PAGE로 분석할 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 동물 세포주에서 발현된 항체를 정제한 후 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 BC200 RNA를 인식하는 항체의 CDR 서열 및 항체-RNA 복합체의 해리상수를 나타낸 것이다.
도 7은 항체-RNA 복합체의 해리상수를 구하기 위한 결합법을 나타낸 것이다.
도 8은 대장균에서 유래한 6S RNA를 음성 대조군으로 사용한 경우의 결합법을 나타낸 것이다.
도 9는 PCR 돌연변이법을 동반한 sib 선별(selection)을 이용한 새로운 친화도 성숙과정(affinity maturation)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 10은 MabBC200-A 항체로부터 유래되어 친화도 성숙 과정을 거친 클론들의 CDR 서열 및 항체-RNA 복합체의 해리상수를 나타낸 것이다.
도 11은 친화도 성숙과정을 거친 항체-BC200 RNA 복합체의 해리 상수를 구하기 위한 결합법을 나타낸 것이다.
도 12는 RNA(51-120)과 그 유도체들의 2차 구조를 나타낸 것이다. RNA(51-120)는 BC200 RNA의 51~120번의 서열 및 5’끝에 2개, 3’끝에 1개를 추가로 가진, 총 73개의 핵산으로 이루어져 있으며, MabBC200-A3와 결합하는 자리는 빨간 글자로 표시하였다.
도 13은 항체 MabBC200-A3에 결합하는 RNA를 찾기 위한 SELEX의 모식도를 나타낸 것이며, IP는 면역침강을 의미한다.
도 14는 SELEX 8라운드를 마친 후 선택된 RNA들의 2차 구조를 나타낸 것이며, 항체와 결합하는 자리는 빨간 글자로 표시하고, 랜덤화 된 서열은 박스표시하였다.
도 15는 각 RNA-항체 복합체의 해리 상수를 구하는 결합법을 나타낸 것이다.
도 16은 RNA(51-120) 및 그 유도체들의 RNA-항체 복합체의 해리 상수를 구하기 위한 결합법을 나타낸 것이다.
도 17은 히드록실 라디칼 (hydroxyl radical) 발자국법을 이용하여 0, 5, 10, 및 50nM의 MabBC200-A3와 BC200 RNA의 결합영역을 나타낸 것이다.
도 18은 BC200 RNA 구조 중 항체와 결합하는 BC200 RNA의 영역을 낸 것이다.
도 19는 BC200 RNA 구조 중 항체가 결합하고 있는 영역을 포함하는 51번부터 119번 염기까지 예측한 3차 구조를 나타낸 것이다.
도 20은 유방암세포주 (MCF7, SKBR3, MDA-MB-231, MDA-MB-435, Hs578T 및 T47D)와 일반 유방 세포주인 MCF10A에서의 전체 세포 RNA (total cellular RNAs) 중 BC200 RNA 양을 Northern 분석을 통해 확인한 것을 나타내었다.
도 21은 MabBC200-A3에 의해 면역 침강된 면역침전물 내의 BC200 RNA를 Northern 분석을 통해 나타낸 것이다(MabN: 음성대조군).
도 22는 MabBC200-A와 FITC가 부착된 항 인간 IgG (anti-human IgG)를 세포에 처리한 후 흐름 세포 측정법(flow cytometry) 으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 상기 도 17의 흐름 세포 측정법(flow cytometry)에 의한 형광 값 및 도 20의 Northern 분석 값의 비교 그래프를 나타낸 것이다. 흐름 세포 측정법은 MabN으로, Northern 분석은 5S로 보정하였으며 (normalized), 비교 값 (the relative signal)은 각 세포에 대한 비례 값으로 나타내었다 (arbitrary unit).
도 24는 MabBC200-A3로 처리된 세포 용해물 (lysate)을 면역 침강하여, 면역침강물 내의 BC200 RNA 양을 Northern 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 25는 세포 면역침강 (cellular IP) 후의 Northern 분석 값과 도 22의 흐름 세포 측정 값의 비교 그래프를 나타낸 것이다.
도 26은 BC200 RNA의 특이한 구조적 모티프를 인식하는 인간 항-RNA 항체를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
바이오틴화
RNA
제작
1.1 어댑터
RNA
의 서열을 포함한
BC200
RNA
발현 벡터 제작
어댑터 RNA(서열번호 14, ggaucgcauu uggacuucug cccgcaaggg caccacgguc ggaucc)의 서열을 포함한 BC200 RNA(서열번호 13)를 시험관 내 전사반응을 통해 제작하기 위하여, RNA 발현 플라스미드를 구축하였다. 사람 지노믹 DNA(human genomic DNA, Roche사, 독일)를 주형으로 하여 정방향 프라이머(forward primer)로서 T7 프로모터(T7 promoter) 서열과 BC200 5’ 말단의 일부 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드(서열번호 16, gaattctaat acgactcact ataggccggg cgcggtg), 및 역방향 프라이머(reverse primer)로서 BC200 3’말단의 일부 서열, 어댑터 RNA의 서열 및 StuI 부위의 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드(서열번호 17, cttccggatc cgaccgtggt gcccttgcgg gcagaagtcc aaatgcgatc caaagggggg gggggg)를 이용하여 2X TOPSimple PreMix-Forte(Enzynomics사, 대한민국)로 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 95℃ 에서 3분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 35회 반응시킨 후, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 반응시킴으로써 이루어졌다.
합성된 DNA를 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하고, DNA를 MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction kit(Intron사, 대한민국)로 정제하였다. 정제된 DNA를 T-blunt vector(Solgent사, 대한민국)와 반응시키고, 대장균 DH5α에 열충격(Heat shock)으로 형질전환시켜 LB 암피실린(100μg/ml, ampicillin, Amp) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하고, 나타난 단일 콜로니를 LB 암피실린(100μg/ml) 액체배지 3㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 DNA를 추출하여, 염기서열 분석을 의뢰하였다(Solgent사, 대한민국). 그 결과, T7 프로모터, BC200 RNA, 어댑터 RNA, 그리고 StuI 부위의 서열들과 일치됨을 확인하였다.
1.2 시험관 내 전사반응을 통한
RNA
제작
상기 실시예 1.1에서 준비된 DNA는 제한효소 StuI을 사용하여 절단하였고, 상기 제한효소로 절단한 절편을 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하고, DNA를 MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction kit로 정제하였다. 정제된 DNA를 RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems for T7 kit(Promega사, 미국)로 반응시켜 7M 요소가 포함된 5% PAGE를 이용하여 RNA 밴드를 분리하고, RNA 용출 용액(Tris-Cl, pH7.5, 0.3M NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS)에 넣어 4℃에서 16시간 동안 용출하였다.
상기 용출액을 15,000 x g로 1분 동안 원심분리하고, 상층액만 0.4μm 필터로 걸러주고, 페놀을 동일양으로 넣고 15,000 x g로 10분 동안 원심분리하고, 상층액만 새 튜브에 옮겼다. 여기에 클로로포름을 동일 양으로 넣고 15,000 x g로 10분 동안 원심분리하고, 상층액만 새 튜브에 옮기고, 상층액 양의 2.5배에 해당하는 에탄올을 넣고, -70℃에서 보관하였다. 상기 용액을 2 내지 8℃에서 15,000 x g로 5분 동안 원심분리하여 에탄올을 제거하였고, 70% 에탄올과 100% 에탄올을 차례로 넣고 동일한 방식으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후, RNA 펠렛을 진공펌프를 이용하여 상온에서 3분 동안 건조시켰다.
1.3
RNA
바이오틴화
상기 실시예 1.2에서 준비된 RNA와 어댑터 RNA에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴화 올리고뉴클레오티드(서열번호 15, aggatccgac cgtggtgccc t)를 1:2.5의 비율로 혼합하고 85℃에서 5분간 반응한 뒤, 상온까지 서서히 온도를 내림으로써 바이오틴화 RNA를 얻었다.
실시예
2.
Fab
(
antigen
binding
fragment
) 형태의 인간 항체 라이브러리를 파아지에 디스플레이된 형태로 전환
Fab 형태의 대형 인간 항체 라이브러리로, kappa 경쇄와 lambda 경쇄가 인간 생체에 존재하는 비율과 동일한 6:4로 존재하는 라이브러리 세포 1.5 X 1011을 2YT 및 암피실린 100μg/ml를 포함하는 배지(2.1L)에서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후(OD600=0.7~0.8), 헬퍼 파아지(helper phage) VCSM13을 MOI값이 1:20이 되도록 감염시켜 37℃에서 30분 동안 정치한 후 37℃에서 30분 동안 흔들어 키웠다. 여기에 카나마이신(70μg/ml, kanamycin, Kan)을 넣고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.
배양한 세포를 4℃에서 5,000 rpm(Supra 22K, A500s-6 No.11, 한일과학사업사, 대한민국)으로 15분 동안 원심분리한 후, 상층액에 5mM PEG(polyethylene glycol) 8000과 500mM NaCl을 첨가하여 얼음에서 2시간 동안 반응하였다. 다시 4℃에서 10,000 rpm(Supra 22K, A500s-8 Rotor No.7, 한일과학사업사, 대한민국)으로 1시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 완벽히 제거하고 펠렛에 10 ml PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(13,000 x g, 10분)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 용액을 새 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.
실시예
3.
RNA
에 대한
패닝과정
3.1
스트렙트아비딘
코팅
이뮤노튜브에 스트렙트아비딘 100ng을 1 ml 코팅 완충용액(15 mM Na2CO3, 34.84 mM NaHCO3, pH 9.6)에 녹여서 넣고 4℃에서 16시간 동안 코팅하였고, 0.05% PBST(Tween20 를 0.05% 함유한 PBS)로 1회 세척하였다. 여기에 3% BSA 2 ml를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켜 차단(blocking)하고, 0.05% PBST로 2회 세척하였다.
3.2
바이오틴화
올리고뉴클레오티드 및
스트렙트아비딘과
반응하는 음성군 항체를 제거
상기 실시예 3.1에서 제작한 이뮤노튜브에 상기 실시예 2에서 제조한 파아지에 디스플레이된 라이브러리 항체 1 ml(1.2 X 1013/ml)와 바이오틴화 올리고뉴클레오티드 100 pmol을 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시키고, 항원에 결합하지 않은 파아지(음성군)를 상기 실시예 3.1에서 제작한 이뮤노튜브에 넣고 실온에서 30분동안 반응시켰으며, 이 과정을 2회 반복하여 음성군에 결합하는 파아지를 제거하였다.
3.3
RNA
와 결합하는 항체 선별
상기 실시예 3.2의 음성군에 결합하는 항체를 제거한 라이브러리 파아지 항체를 실시예 1.3에서 제작한 바이오틴화 RNA 10 pmol과 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 상기 실시예 3.1의 이뮤노튜브에 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다.
3.4
RNA
와 결합력이 약한 항체를 세척하여 제거
상기 실시예 3.3의 이뮤노튜브를 0.05% PBST로 10회 세척하였다. 이 때, 패닝 회차가 증가할수록 세척 횟수를 10회씩 늘렸다. 즉, 2차 패닝에서는 20회, 3차 패닝에서는 30회, 4차 패닝에서는 40회를 세척하였다.
3.5
RNA
와 결합하고 있는
파아지의
용출
상기 실시예 3.4의 이뮤노튜브에 PBS 1 ml에 녹인 효모 전체 RNA(yeast total RNA) (구입처: 라이프 테크놀로지스) 5mg을 넣고 상온에서 10분간 반응시켜, RNA에 결합한 항체만을 떼어내었다.
3.6
패닝
결과물을
콜로니
형태로 변환 후 저장 및 다음
패닝을
위하여
파아지에
디스플레이된 형태로 변환
대장균 TG1(F' [traD36 proAB + lacI q lacZ Δ M15]supE thi -1 Δ( lac - proAB ) Δ(mcrB-hsdSM)5, (rK - mK - ))의 단일 콜로니를 2YT배지(10 ml)에서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 키운 배양액(OD600=0.7~0.8)에 상기 실시예 3.5에서 용출된 파아지를 감염시키고, 37℃에서 30분 동안 정치한 후 37℃에서 30분 동안 흔들어 키웠다. 상기 배양액을 4℃에서 3,500rpm(Supra 22K, Rotor A500s-8 No.7, 한일과학사업사, 대한민국)으로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 1 ml의 2YT배지에 녹여 SOB, 10mM MgCl2, 100mM glucose 및 암피실린 100μg/ml을 포함한 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 고체배지에서 자란 콜로니들은 2YT, 100mM Glucose, 5mM MgCl2 및 암피실린 100μg/ml을 포함한 배지 10 ml에 녹이고, 새 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.
이를 파아지로 다시 전환하기 위하여 상기 세포를 녹여 2YT 및 암피실린 100μg/ml를 포함하는 배지에 OD600=0.1~0.15가 되도록 넣은 후 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후(OD600=0.7~0.8), 헬퍼 파아지(helper phage) VCSM13을 MOI값이 1:20이 되도록 감염시켜 37℃에서 30분 동안 정치한 후 37℃에서 30분 동안 흔들어 키웠다. 여기에 카나마이신(70μg/ml, kanamycin, Kan)을 넣고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 4℃에서 5,000 rpm(Supra 22K, A500s-6 Rotor No.11, 한일과학사업사, 대한민국)으로 15분 동안 원심분리한 후, 상층액에 5mM PEG(polyethylene glycol) 8000과 500mM NaCl을 첨가하여 얼음에서 2시간 동안 반응하였다. 다시 4℃에서 10,000 rpm(Supra 22K, Rotor A500s-8 No.7, 한일과학사업사, 대한민국)으로 1시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 완벽히 제거하고 펠렛에 10 ml PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(13,000 x g, 10분)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 용액을 새 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.
이를 파아지로 다시 전환하기 위하여 상기 세포를 녹여 2YT 및 암피실린 100μg/ml를 포함하는 배지에 OD600=0.1~0.15가 되도록 넣은 후 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후(OD600=0.7~0.8), 헬퍼 파아지(helper phage) VCSM13을 MOI값이 1:20이 되도록 감염시켜 37℃에서 30분 동안 정치한 후 37℃에서 30분 동안 흔들어 키웠다. 여기에 카나마이신(70μg/ml, kanamycin, Kan)을 넣고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 4℃에서 5,000 rpm(Supra 22K, A500s-6 Rotor No.11, 한일과학사업사, 대한민국)으로 15분 동안 원심분리한 후, 상층액에 5mM PEG(polyethylene glycol) 8000과 500mM NaCl을 첨가하여 얼음에서 2시간 동안 반응하였다. 다시 4℃에서 10,000 rpm(Supra 22K, Rotor A500s-8 No.7, 한일과학사업사, 대한민국)으로 1시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 완벽히 제거하고 펠렛에 10 ml PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(13,000 xg, 10분)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 용액을 새 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.
상기 실시예 3.1 내지 3.6의 과정을 총 4번 반복하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 패닝 횟수 | 초기 파아지수 | 결합한 파아지수 |
| 1차 | 1.2 X 1013 | 6.1 X 106 |
| 2차 | 3.0 X 1013 | 9.9 X 106 |
| 3차 | 1.8 X 1013 | 9.7 X 107 |
| 4차 | 1.2 X 1013 | 2.2 X 108 |
실시예
4.
RNA
ELISA
및 닷
블랏(dot blot)을
통한
패닝
결과 확인
4.1
RNA
ELISA
를 통한
패닝
결과 확인
상기 실시예 3에 따라 1차부터 4차까지 패닝하여, 얼려두었던 세포 스톡 (stock)을 상기 실시예 3.6과 동일한 방법으로 파아지 형태로 전환하였다. 96 웰 면역 플레이트(NUNC 439454)에 스트렙트아비딘을 웰 당 100 ng씩 4℃에서 16시간 정도 코팅 완충용액으로 처리하여 코팅한 후, 0.05% PBST 200μl로 1번 세척하고, 0.05% PBST에 녹인 3% BSA를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 동시에 새 튜브에서 1차 내지 4차 패닝 결과 BC200 RNA를 인식하는 항체를 디스플레이하고 있는 파아지 100μl와 바이오틴화 BC200 RNA 4pmol을 상온에서 반응시켰다. 차단된 각 웰을 0.05% PBST 200μl로 2번 세척한 다음 상기 항체를 디스플레이하고 있는 파아지와 바이오틴화 BC200 RNA 반응물을 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 0.05% PBST 200 μl로 3번 세척한 후 이차 항체인 항-인간IgGF(ab)2' -HRP(Pierce사, 미국)를 1:2000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
PBS-트윈20(0.05%) 0.05% PBST 200μl로 4번 세척한 후에 BD OptEIA TMB Substrate Reagent Set(BD사, 미국)로 기질 용액을 만들어, 웰 당 100 μl씩 넣어 5분 동안 발색시키고, 2.5M 황산수용액 50 μl를 넣어 반응을 종료시킨 뒤 분광광도계(Spectrophotometer)(MolecularDevice사, 미국)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, BC200 항원에 있어서 3차 패닝 단계부터 역가가 증가하는 것을 확인하였다.
4.2 닷
블랏을
통한 단일 클론 항체의 결합력 확인
상기 실시예 3에 따라 얻은 4차 패닝 세포 스톡을 녹인 후, 2YT 암피실린(100μg/ml) 고체배지에 단일 콜로니로 분별될 수 있도록 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니 항체를 파아지로 다시 전환하기 위하여 녹여 2YT, 100mM Glucose 및 암피실린 100μg/ml를 포함하는 배지에 접종하여 상기 실시예 3.6과 동일한 방법으로 파아지 형태로 전환하였다. 이때, 인간 항체 라이브러리에서 무작위로 뽑아 제작한 단일 클론 항체를 대조군으로 이용하였다. Dot blot kit(schleicher and schuell사, 독일)에 제작한 항체를 디스플레이하고 있는 파아지 100μl를 넣고 상온에서 1시간 동안 Hybond-ECL막(GE사, 미국)에 결합시켰다. 상기 막은 PBS에 녹인 2% 탈지유(skim milk)로 상온에서 1시간동안 차단하고, 85℃오븐에서 1시간 동안 교차 결합(cross linking)시켰다. 교차 결합된 막은 탐침(probe)으로써 α-32p[CTP]를 사용하여 내부 표지된 BC200 RNA를 포함하는 Rapid-hyb buffer(GE사, 미국)와 회전기(rotator)에서 16시간 동안 반응시켰다. 이 때 BC200 RNA는 2차 구조를 이루도록 65℃에서 5분 반응시키고, 4℃에서 10분 반응시킨 것을 사용하였다. 마지막으로 세척 용액 I(2X SSC, 0.1% SDS)과 세척 용액 II(0.2X SSC와 0.1% SDS)로 세척한 뒤에, imaging plate(Fujifilm사, 일본)에 감광시키고, 그 신호를 BAS7000(Fujifilm사, 일본)로 관찰하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, BC200 항원에 있어서 강력하게 결합하는 단일 클론 파아지 항체 들을 확인할 수 있었으며 이를 MabBC200-A와 MabBC200-B로 명명하였다.
실시예
5. 동물세포 전체
IgG
발현벡터 제조
5.1 전체
IgG1
변환 분석
BC200 RNA에 결합하는 인간 단일 클론 항체를 Fab 형태에서 IgG1 전체 형태의 항체로 전환하기 위해, 단일 클론 DNA 1fmol과 15pmole의 중쇄 또는 경쇄 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 20 내지 서열번호 31), 2X TOPSimple PreMix-Forte(Enzynomics사, 대한민국)를 혼합하여 SOEing PCR법을 사용하여 반응을 실시하였다. 합성된 DNA를 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 예상되는 사이즈의 DNA 밴드를 자른 후, MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction kit(Intron사, 대한민국)로 정제하였다. 정제된 DNA를 제한효소로 처리한 pdCMV-dhfrC-chimeric 벡터(Eung Suk, L., et al., Exp. And Mol. Med., 2012) 1μl(10ng), 중쇄(100~200 ng) 15 μl, 10X 완충용액 2 μl, 리가아제(Ligase, Promega사, 미국) 1 U 및 증류수를 혼합하여 17℃에서 16시간 방치하여 상기 벡터와 연결하였다. 상기 벡터를 대장균 DH5α에 열충격(Heat shock)으로 형질전환시켜 LB 암피실린(100μg/ml, ampicillin, Amp) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하고, 나타난 단일 콜로니를 LB 암피실린(100μg/ml) 액체배지 3㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 DNA를 추출하여, 염기서열을 ABI-3730xl automatic sequencer 로 분석하였다(Solgent사, 대한민국).
그 결과, 전체 IgG1으로 전환한 BC200 RNA에 결합하는 항체의 중쇄 및 경쇄 서열이 Fab 형태로 얻은 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다.
5.2 전체
IgG
의 검증
293T 세포에 Noble enhancer 36 μl, Noble factor 40 μl(Noble Bioscience사, 대한민국)와 전체 형태(whole form) 항체 DNA 10 μg을 넣어 형질감염하여 얻은 상등액을 recombinant protein G agarose(Invitrogen사, 미국)로 정제한 후 용출액을 SDS-PAGE와 ELISA로 확인하였고, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4 및 도 5에서 나타난 바와 같이, 성공적으로 전체 IgG1 형태로 전환되었음을 확인하였다.
실시예
6. 전체
IgG1
형태 단일 클론 항체의 결합력 확인
6.1 필터
결합법(filter binding assay)를
통한 단일 클론 항체의 결합력 확인
상기 실시예 5에 따라 얻은 단일 클론 항체를 희석하여 농도별로 65℃에서 5분 반응시키고, 4℃에서 10분 반응시킨 BC200 RNA 동일양과 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이때, pdCMV-dhfrC-chimeric-A10A3 벡터(Eung Suk, L., et al., Exp. And Mol. Med., 2012)에서 만들어지는 항체를 항체 대조군으로, 대장균 유래 6S RNA를 RNA 대조군으로 이용하였다.
Dot blot kit(schleicher and schuell사, 독일)에 상기 반응물을 넣고 Hybond-ECL막(GE사, 미국)과 Hybond-XL막(GE사, 미국)에 차례로 통과시켰다. 이 때 결합하지 않은 BC200 RNA양을 분석하기 위해 BC200 RNA만을 통과시키는 실험도 동시에 수행하였다. 상기 Hybond-XL막은 85℃의 오븐에서 1시간 동안 교차 결합(cross linking)시켰다. 여기에 탐침(probe)으로써 α-32p[CTP]를 사용하여 내부 표지된 BC200 RNA를 포함하는 Rapid-hyb buffer(GE사, 미국)와 회전기(rotator)에서 16시간 동안 반응시켰다.
마지막으로 세척 용액 I(2X SSC, 0.1% SDS)과 세척 용액 II(0.2X SSC와 0.1% SDS)로 세척한 뒤에, imaging plate(Fujifilm사, 일본)에 감광시키고, 그 신호를 BAS7000(Fujifilm사, 일본)로 관찰하였다.
6.2
BC200
RNA
와 전체
IgG
형태 단일 클론 항체의 결합 친화도 분석
상기 실시예 5.2에서 얻은 결과를 하기 수학식 1을 바탕으로 분석하여 해리상수 Kd값을 산출하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
[수학식 1]
하기 표 2에 나타난 바와 같이, MabBC200-A와 MabBC200-B의 해리상수 Kd값이 각각 3.6 X 10-8 M과 7.6 X 10-8 M인 것으로 산출되었다 (도 6 내지 도 8).
| MabBC200-A | MabBC200-B | |
| 해리상수 값 (Kd) (M) | 3.6 X 10-8 | 7.6 X 10-8 |
라이브러리가 인간 naive 항체로부터 제작되었고 어떠한 특정 성향도 존재하지 않기 때문에, 이런 6개 아미노산이 공통적으로 존재한다는 사실은 BC200 RNA와의 상호작용에 있어서 이 아미노산들이 중요한 역할을 할 수도 있음을 암시하는 것이다.
실시예
7. 친화도 성숙과정(
affinity
maturation
)
BC200 RNA에 결합하는 항체의 결합력을 높이기 위해 친화도가 높은 MabBC200-A를 이용하여 친화도 성숙과정을 수행하였다(도 9). 기존의 방식과는 달리 RNA에 대한 결합력을 높이기 위하여, sib 선별(selection)을 활용하였으며, 무작위 코돈을 이용한 PCR 돌연변이법을 이용하였다. 친화도 성숙과정의 모식도는 도 5에 나타내었다. 핵심이 되는 원리는 원리는 sib 선별(selection)이며, NNS코돈 (N=A, G, C, T; S=G, C)을 포함한 프라이머로 PCR을 돌려 돌연변이를 생성하게 하는 방법을 동반한다. sib 선별(selection)이란, 상위 스크리닝과 하위 스크리닝으로 나눠서 스크리닝을 하는 것이다. 구체적으로, 본 발명 경쇄의 CDR3 영역 내 총 9개 아미노산 각각의 자리에 랜덤으로 아미노산을 들어가게 하여 총 9개의 풀(pool)을 만들고, 이들이 가지는 BC200 RNA에 대한 결합력을 확인하여 상위 스크리닝을 수행하였다.
모든 20개의 아미노산을 약 90% 이상의 확률로 커버할 수 있는 개수인 총 96개의 클론을 분석하였으며, 아래 방정식은 96개의 클론이 모든 20개의 아미노산을 90% 이상의 확률로 커버할 수 있다는 사실을 나타낸다.
상기 식에서 P는 모든 단일 클론을 커버할 수 있는 확률, X는 커버되어야 할 클론 개수, 그리고 N은 테스트될 클론의 개수를 나타낸다.
이후 총 96개 클론 중 가장 높은 결합력을 가진 클론을 확인하는 하위 스크리닝을 수행하였다.
상기 분석을 통해 MabBC200-A 유래의 4개의 클론이 기존 클론보다 결합력이 높은 것을 확인하였으며, 이들을 각각 MabBC200-A1, MabBC200-A2, MabBC200-A3, MabBC200-A4으로 명명하였다. 각각의 결합력을 분석한 결과, Kd값이 기존 MacBC200-A보다 2배 내지 5배 정도 향상된 것을 확인하였다(도 10 및 도 11). 특히 MabBC200-A3의 결합력이 가장 높은 것을 알 수 있었다.
실시예
8. 단일 클론
Mab
항체의 서열 분석
상기 실시예 6에서 확인된, BC200 RNA을 특이적으로 인식하는 단일 클론 항체들을 2YT 암피실린(100μg/ml)에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 단일 클론으로부터 DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 DNA를 수득한 후, 프라이머H(서열번호 18, gcgaagtcac ccatcagg)와 프라이머L(서열번호 19, tagctcactc attaggca)을 이용하여 중쇄와 경쇄의 염기서열을 ABI-3730xl 자동서열분석기 (automatic sequencer) (Solgent사, 대한민국) 로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. MabBC200-A 유래의 4개의 클론인 MabBC200-A1, MabBC200-A2, MabBC200-A3, MabBC200-A4가 각각 경쇄 가변 영역 내의 CDR3 서열이 S107G, S107A, S107C, S107V로 돌연변이된 클론임을 알아내었다. 하기 표 3은 Mab BC200 RNA에 결합하는 항체의 CDR 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
| CDR1 | CDR2 | CDR3 | ||
| MabBC200-A | 중쇄 가변 영역 | GYTLSAYY (서열번호 1) |
INPRGGRT (서열번호 2) |
CAARGSPRSRFYYGMGVW (서열번호 3) |
| 경쇄 가변 영역 | QSINNY (서열번호 4) |
ATS (서열번호 5) |
CQQSYSFPWTF (서열번호 6) |
|
| MabBC200-A1 | 경쇄 가변 영역 | 상동 | 상동 | CQQGYSFPWTF (서열번호 7) |
| MabBC200-A2 | 경쇄 가변 영역 | 상동 | 상동 | CQQAYSFPWTF (서열번호 8) |
| MabBC200-A3 | 경쇄 가변 영역 | 상동 | 상동 | CQQCYSFPWTF (서열번호 9) |
| MabBC200-A4 | 경쇄 가변 영역 | 상동 | 상동 | CQQVYSFPWTF (서열번호 10) |
실시예
9. 항체와 결합하는
BC200
RNA
영역의 확인
BC200 RNA의 어느 영역이 항체와 결합하고 있는지를 알아보기 위해, 하이드록실 라디칼 (hydroxyl radical)과 납(II) (Pb2 +)을 이용해 RNA 발자국법 (RNA footprinting)을 수행하였으며, 상기 실시예 6에서 가장 결합력이 높은 것으로 확인된 항체인 MabBC200-A3를 이용하여 분석하였다. 철/EDTA를 이용한 펜톤 반응 (Fenton reaction)을 이용하여 히드록실 라디칼 발자국법을 수행하였다. BC200 RNA의 3’ 말단은 T4 RNA 리가아제 (ligase)에 의해 [32P]pCp로 표지한 후, 65℃에서 5분간 가열, 얼음에서 10분간 냉각 후 상온 상태로 유지하였다. 그 후, 1μl의 5mg/ml 헤파린, 1μg의 효모 전체 RNA와 해당하는 항체를 RNA와 반응시켰으며, 총 반응 부피는 7μl로 하였다. 상기 반응은 상온에서 30분간 PBS에서 진행하였다. 그 후, 1μl의 1mM Fe(II)(NH4)2(SO4)2, 1μl의 1.25mM EDTA, 그리고 1μl의 60mM 아스코르브산 나트륨(Sodium ascorbate)를 추가하였으며, 상온에서 30분간 반응을 진행하였으며, 1μl의 100mM 티오요소 (thiourea)와 11μl의 겔 로딩 버퍼 II(gel loading buffer II) (Ambion)로 반응을 종결시켰다. 상기와 같은 방법으로 얻은 샘플을 95℃에서 5분간 끓인 후, 5% (v/v) 폴리아크릴아미드 (polyacrylamide)와 9M 요소의 서열 젤 (sequencing gel)에 로딩하였으며, RNase T1 래더(ladder)(Ambion, 미국) 제작은 판매자의 지시사항대로 수행하였다.
상기 RNA 발자국법을 통하여 BC200 RNA(서열번호 13)내 60번부터 110번에 해당하는 도메인에 결합 영역이 있는 것을 확인하였다. 이 영역이 결합에 어떻게 관여하고 있는지 알아보기 위해, 73개의 서열을 가진 RNA 조각을 만들었다.
RNA(51-120)이라는 RNA로써 BC200 RNA의 51번부터 120번에 해당하는 서열을 포함하고 있으며, 5’ 끝에 2개(GG), 3’ 끝에 1개의 서열(C)을 추가하였다. 필터 결합법을 통해, 약 10nM의 해리상수(Kd)를 가지는 것을 관찰하였으며, 이를 통해 RNA(51-120) 역시 항체와의 결합에 있어 충분함을 확인하였다(도 12). 이후, BC200 RNA의 어떤 서열이 결합에 중요한지를 알아보기 위해, 19개 서열의 결합영역 중 단일 가닥의 11개의 서열을 선택하고 여기에 랜덤한 염기가 들어가게끔 라이브러리를 제작하였다.
RNA(51-120)에서부터 제작한 라이브러리는 411 (4.2 x 106)의 다양성을 가지게 되며, 이 풀(pool)을 이용하여 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 수행하였다(도 13). 가짜 결합자들 (false positive binders)을 제거하기 위한 과정으로서, 최초 라운드에서 RNA 0.2ng (4.2 x 106 분자들)을 10μl의 protein G agarose (Invitrogen, 미국)과 30분 동안 PBS 50μl에서 반응시켰다. 그 다음으로 2.8nM의 MabBC200-A3와 PBS 100μl에서 상온 30분간 반응시켰다. protein G agarose를 이용하여 항체-RNA 복합체를 면역침강시키고, 면역침강물을 0.05% Tween-20을 포함한 PBS로 세척하고 페놀 추출하였다. 이후 상기 RNA를 에탄올 침강법에 의해 재생산하여 RT-PCR을 이용하여 증폭하였다.
상기 RT-PCR 수행시 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다:
RNA(51-120)-T7-up(서열번호 32): 5′-CCG GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGC GGG AGG ATA GC-3’
RNA(51-120)-T7-dn (서열번호 33): 5′-TCC CCC GGG AGA ACG GGG TCT CGC-3’
증폭된 cDNA를 뒤 이은 라운드들에 쓰일 RNA에 제작에 사용하였으며, 8라운드 후, 증폭된 cDNA를 T-blunt 벡터 (Solgent, 한국)에 클로닝하여, 시퀀싱을 분석하여 하기 표 4에 나타내었다(표 4).
| RNA | Frequency | Sequence (5'?3') |
| RNA(51-120) | - | GGGAGGCGGGAGGAUAGCUUGAGCCCAGGAGUUCGAGACCUGCCUGGGCAAUAUAGCGAGACCCCGUUCUCCC |
| Randomized RNA pool | - | GGGAGGCGGGAGGAUAGCUUGAGCCCAGGAGNNNNNNACCUGCCUGGGCNNNNNAGCGAGACCCCGUUCUCCC |
| S1 | 46 | GGGAGGCGGGAGGAUAGCUUGAGCCCAGGAGUUCGAGACCUGCCUGGGCAAUAUAGCGAGACCCCGUUCUCCC |
| S7 | 1 | GGGAGGCGGGAGGAUAGCUUGAGCCCAGGAGCAAGCGACCUGCCUGGGCAGUAUAGCGAGACCCCGUUCUCCC |
| S14 | 1 | GGGAGGCGGGAGGAUAGCUUGAGCCCAGGAGUAUUCUACCUGCCUGGGCUAUCCAGCGAGACCCCGUUCUCCC |
| S40 | 1 | GGGAGGCGGGAGGAUAGCUUGAGCCCAGGAGUAUCGCACCUGCCUGGGCUAUAUAGCGAGACCCCGUUCUCCC |
| S50 | 1 | GGGAGGCGGGAGGAUAGCUUGAGCCCAGGAGACACUUACCUGCCUGGGCUAAGCAGCGAGACCCCGUUCUCCC |
상기 표 4에서 항체 MabBC200-A3와 결합하는 자리는 진한 글자로 표시하였으며, 랜덤화된 서열을 박스표시하였고, BC200 RNA와 다른 서열은 음영처리하였다.
8 라운드의 선택 과정을 거친 후 50개의 단일 클론을 골라 서열을 확인하였으며, 놀랍게도, 46개의 클론이 기존의 RNA(51-120)과 같은 서열임을 확인할 수 있었다. 이와 달리 다른 4개의 클론들은 5~10개의 서열이 달랐으며, 모두 MabBC200-A3 항체에 대한 해리상수 값이 1mM 이상이었다(도 14 및 도 15). 이 RNA들의 결합력을 RNA(51-120)과 비교해 현저히 떨어지는 값이었기 때문에, 본 발명자들은 이 4개가 항체에 대한 결합력이 없음으로 판단하였고, RNA(51-120)이 RNA 풀(pool)에서 유일하게 결합할 수 있는 RNA임을 확인하였다.
상기 SELEX 결과로부터 항체의 특이성을 결정하는데 있어 RNA의 11개의 염기 모두가 중요함을 확인할 수 있었다.
다음으로, 항체와의 결합에 있어 BC200 RNA의 특정 구조가 필요한 것인지 알아보기 위하여 RNA(51-120)의 구조 형성에 있어 중요한 71~77번 및 91~97번 자리의 서열들이 상보적인 결합을 못하도록 돌연변이를 제작하였다. 73~75번의 CCA는 GGU로 바꾸고, 이를 RNA(51-120)-M1으로 명명하여 항체와의 결합력을 살펴본 결과, 항체와의 결합이 이루어지지 않았다. 그러나, RNA(51-120)-M1의 반대편의 보충적인 돌연변이를 통해 다시 상보적인 결합을 회복시킨 RNA(51-120)-M12는 RNA(51-120)과 비슷한 수준으로 결합하는 것을 관찰하였다(도 16). 이를 통해 항체-RNA 결합에 있어 RNA의 구조도 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 BC200 RNA의 두 부분인 76 내지 85번(서열번호 11, ggaguucgag) 및 96번 내지 104번(서열번호 12, gcaauauag)이 항체에 의해 보호되는 것을 확인하였다. 또한, BC200 RNA의 2차 구조를 살펴보면 두 부분은 반 나선차이만큼 떨어져 있으며, 예측된 3차 구조를 보면 알 수 있듯이 항체와의 결합 시에는 같은 곳을 향하고 있음을 알 수 있었다. 발자국법에서 상기 부분을 제외하고는 다른 부분에서 특정한 변화가 없었기 때문에, 항체와의 결합에 있어 BC200 RNA 구조는 변하지 않는 것을 알 수 있었다(도 17 내지 19).
실시예
10. 항체의
BC200
RNA
에의 결합 확인
10.1
노던블롯
(
northern
blot
) 을 이용한 전체
RNA
의 양 확인
MabBC200-A3가 RNA를 효과적으로 구별할 수 있는지 알아보기 위해, 유방암 세포주의 전체 RNA를 이용하였으며, 우선 유방암 세포주에서 세포주에서 BC200 RNA의 양을 northern blot으로 확인하였다. 전체 세포 RNA는 Easy-Blue 키트를 이용해 세포에서 추출하였으며, Northern 분석을 위해, RNA 샘플은 7M 요소가 포함된 6% 폴리아크릴아미드 젤(PAGE)에서 전기영동 후, 하이본드-XL막 (Hybond-XL membrane)에 트랜스퍼 (transfer)하였다. 접합과정은 5' 말단이 32P로 표지된 BC200 RNA와 상보적인 서열을 가진 올리고뉴클레오티드로 진행하였다.
7SL RNA와 5S RNA는 5’ 말단이 32P로 표지된 7SL 상보 올리고뉴클레오티드 (서열번호 34; 5′-GAGGTCACCATATTGATGCCGAACTTAGTG)와 5S 상보 올리고뉴클레오티드(서열번호 35; 5′-CATCCAAGTACTAACCAGGCCC)로 검출하였으며, 막은 필터결합법에서 언급된 것과 같은 방법으로 분석하였다. 상기 분석 결과, BC200 RNA의 양은 세포주마다 달랐으며, MDA-MB-231 = SKBR3 < T47D < Hs578T < MDA-MB-435 < MCF7순이었다. MDA-MB-231나 SKBR3에서는 거의 발견되지 않았고, 일반 유방 세포주인 MCF10A도 비슷한 것을 알 수 있었다(도 20).
10.2
면역침강법(Immunoprecipitation)을
이용한 항체와
BC200
RNA
의 결합확인
냉각된 PBS로 세척된 세포를 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum)이 포함된 PBS에 풀어주었다. 이후 0.1% 포름알데히드로 상온에서 15분간 고정과정을 거쳤고, 0.1% 트윈-20이 포함된 PBS에서 세포의 투과성을 증가시켰으며, 다음으로 상온에서 30분간 MabBC200-A3와 반응시켰다. 매 단계마다 냉각된 PBS로 세포를 두 번씩 세척하였다. 이후 냉각된 RIPA용액 (150mM 염화나트륨 (NaCl), 1% 데옥시콜레이트 나트륨 (Sodium deoxycholate), 0.1% SDS, 1% 트리톤 X-100 (Triton X-100), 2mM EDTA, 및 50mM Tris-HCl, pH 7.5)에서 반응시켰으며 얼음에서 30분간 진행하였고, 16,000g의 속도로 20분간 원심분리하였다. 상층액인 세포 용해물 (cell lysates)을 단백질 G를 이용한 면역침강법에 사용하였다. 면역침강물 내의 BC200 RNA와 7SL RNA의 양은 Northern 블랏을 통해 분석하였다. 전체 세포 용해물은 input으로써 항체 처리를 제외하고 위와 같은 과정을 거쳤다. 세포 내에 들어간 항체의 양을 측정하기 위해, 세포 용해물을 마지막 세척과정 없이 Western 블랏으로 분석하였다. 요약하자면 정제된 RNA를 50μl PBS에 30분간 MabBC200-A3와 반응시켰고, 단백질 G를 이용하여 면역침강하였다. 면역침강물은 페놀 추출 (phenol extraction)하였고 BC200 RNA의 양은 Northern 블랏에 의해 분석하였다. 그 결과, 음성 항체와는 달리 MabBC200-A3를 통해 BC200 RNA를 발현하고 있는 세포에서 BC200 RNA가 면역침강된 것을 확인할 수 있었다. 7SL RNA는 SRP (signal recognition particle)의 구성원으로써, Alu의 전구체이며, 인간 유전체에서 가장 많이 존재하는 TE (transposable element)다. BC200 RNA의 5’ Alu 도메인은 7SL RNA와 서열상 매우 높은 보존성을 보인다. MabBC200-A3가 결합하는 BC200 RNA의 영역이 Alu 도메인 내에 있는 반면, 7SL RNA는 이 항체에 의해 면역침강이 되지 않는다는 점을 미루어 볼 때, MabBC200-A3는 BC200 RNA만을 특이적으로 인식한다는 점을 알 수 있다 (도 21).
10.3 흐름 세포 측정법 (
flow
cytometry
)을 이용한 항체와
BC200
RNA
의 결합확인
MabBC200-A3가 세포 내에 존재하고 있는 BC200 RNA를 인식할 수 있는지를 알아보고자, MabBC200-A3를 1차 항체로 사용하여 흐름 세포 측정법 (flow cytometry)을 수행하였다 (도 22). 세포 준비 및 1차 항체 처리는 상기 9.2의 면역침강법과 동일하다. 그 다음으로 세포에 2차 항체로써 형광물질 이소치오시아네이트 (FITC, fluorescein isothiocyanate)가 달린 항 인간 IgG (anti-human IgG)로 상온에서 30분간 암상태 (in the dark)에서 처리하였다. 세포를 수집하고, 스트라이너 뚜껑 튜브 (Strainer capped tubes)로 필터링 하고, LSRII 흐름 세포 측정기 (BD Science, 미국)를 이용하여 형광값을 분석하였다. 이후 Flowing software를 이용하여 그래프를 그렸다. 흐름 세포 측정법을 이용하여 측정한 형광 세기는 northern blot과 달랐다 (도 23). 세포의 BC200 RNA양을 나타내는 Northern 신호는 T47D < Hs578T < MDA-MB-435 < MCF7 순이었지만, 형광 신호는 MDA-MB-435 < T47D < MCF7 < Hs578T순이었다. 흐름 세포 측정법의 신호가 실제로 BC200 RNA-항체 복합체로부터 유래된 것인지를 확인하기 위해, 복합체를 세포 용해물 (cell lysate)에서 면역침강하고, BC200 RNA의 양을 northern blot 으로 확인하였다(도 24). 비교 결과, 면역침강된 BC200 RNA의 양이 흐름 세포 측정법에서 얻은 신호와 거의 일치함을 볼 수 있었다 (도 25). 이는 BC200 RNA가 세포 내에서 두 가지 형태로 존재한다는 점을 가리키며, 하나는 MabBC200-A3에 의해 인식되는 형태, 다른 하나는 항체에 의해 인식되지 않는 형태임을 나타낸다. 흥미롭게도, 에스트로젠이 발현되지 않는 MDA-MB-435와 Hs578T는 비슷한 양의 BC200 RNA를 발현하는데도 불구하고, 항체에 의해 인식되는 BC200 RNA의 양은 다르다. 즉, MDA-MB-435에서는 대부분의 BC200 RNA가 항체에 의해 인식되지 않는 반면, Hs578T에는 가장 많은 양의 BC200 RNA가 항체에 의해 인식됨을 알 수 있었다.
<110> KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
<120> RNA-SPECIFIC BINDING ANTIBODY
<130> DPP20137350KR
<160> 35
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MabBC200-A Heavy Chain CDR1
<400> 1
Gly Tyr Thr Leu Ser Ala Tyr Tyr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MabBC200-A Heavy Chain CDR2
<400> 2
Ile Asn Pro Arg Gly Gly Arg Thr
1 5
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MabBC200-A Heavy Chain CDR3
<400> 3
Cys Ala Ala Arg Gly Ser Pro Arg Ser Arg Phe Tyr Tyr Gly Met Gly
1 5 10 15
Val Trp
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MabBC200-A Light Chain CDR1
<400> 4
Gln Ser Ile Asn Asn Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MabBC200-A Light Chain CDR2
<400> 5
Ala Thr Ser
1
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MabBC200-A Light Chain CDR3
<400> 6
Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MabBC200-A1 Light Chain CDR3
<400> 7
Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MabBC200-A2 Light Chain CDR3
<400> 8
Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MabBC200-A3 Light Chain CDR3
<400> 9
Cys Gln Gln Cys Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MabBC200-A4 Light Chain CDR3
<400> 10
Cys Gln Gln Val Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BC200 RNA 76-85 position
<400> 11
ggaguucgag 10
<210> 12
<211> 9
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BC200RNA 96-104 position
<400> 12
gcaauauag 9
<210> 13
<211> 200
<212> RNA
<213> Human
<400> 13
ggccgggcgc gguggcucac gccuguaauc ccagcucuca gggaggcuaa gaggcgggag 60
gauagcuuga gcccaggagu ucgagaccug ccugggcaau auagcgagac cccguucucc 120
agaaaaagga aaaaaaaaaa caaaagacaa aaaaaaaaua agcguaacuu cccucaaagc 180
aacaaccccc cccccccuuu 200
<210> 14
<211> 46
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adaptor RNA
<400> 14
ggaucgcauu uggacuucug cccgcaaggg caccacgguc ggaucc 46
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Biotin oligonucleotide
<400> 15
aggatccgac cgtggtgccc t 21
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7-BC200-Fwd
<400> 16
gaattctaat acgactcact ataggccggg cgcggtg 37
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Biotin-StuI-Rev
<400> 17
cttccggatc cgaccgtggt gcccttgcgg gcagaagtcc aaatgcgatc caaagggggg 60
gggggg 66
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer H
<400> 18
gcgaagtcac ccatcagg 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PrimerL
<400> 19
tagctcactc attaggca 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Uni-HC_PCR1-Up
<400> 20
ccggaattca ctctaacc 18
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A-HC_PCR1-Dn
<400> 21
gaacctggga gaggacacct gtag 24
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A-HC_PCR2-Up
<400> 22
cctctcccag gttcagctgg tgc 23
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Uni-HC_PCR2-Dn
<400> 23
cgatgggccc ttggccgtgc 20
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-HC_PCR1-Dn
<400> 24
gcatttggga gaggacacct gtag 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-HC_PCR2-Up
<400> 25
cctctcccaa atgcagctgg tgc 23
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A-LC_PCR1_Up
<400> 26
gaaggagata ttgtgatgac cc 22
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A-LC_PCR2_Up
<400> 27
cacaatatct ccttc 15
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Uni-LC_PCR2_Dn
<400> 28
cccaagcttc ggcacg 16
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-LC_PCR1_Dn
<400> 29
agccaccgta cgtaggacgg tcagcttgg 29
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-LC_PCR1_Up
<400> 30
gaaggacagt ctgtgctgac gc 22
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-LC_PCR2_Up
<400> 31
gcacagactg tccttcaaca ccagac 26
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNA(51-120)-T7-up
<400> 32
ccggaattct aatacgactc actataggga ggcgggagga tagc 44
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNA(51-120)-T7-dn
<400> 33
tcccccggga gaacggggtc tcgc 24
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7SL complementary oligonucleotide
<400> 34
gaggtcacca tattgatgcc gaacttagtg 30
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5S complementary oligonucleotide
<400> 35
catccaagta ctaaccaggc cc 22
Claims (15)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 상보성결정영역 1 (CDR1),
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및,
서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1,
서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및
서열번호 6의 아미노산 서열 중 4번째 아미노산 세린(serine, S)이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역(VL)의 CDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열 중 4번째 아미노산 세린(serine, S)이 글리신(Glycine, G), 알라닌(Alanine, A), 시스테인(Cysteine, C) 또는 발린(Valine, V)으로 치환된 서열로 이루어지는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역(VL)의 CDR3은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역(VL)의 CDR3은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역(VL)의 CDR3은 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역(VL)의 CDR3은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 서열번호 13의 핵산서열로 이루어진 BC200(brain cytoplasmic 200) RNA의 50번 내지 120번 핵산 위치에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
상기 항체는
랜덤 프라이머를 이용한 PCR 증폭 반응을 수행하여, 항체 유전자의 CDR 서열 내 특정 염기 위치에서 점 돌연변이를 포함하는 변이항체 유전자 풀(pool)을 2종 이상 제조하고, 상기 각각의 변이항체 유전자 풀은 점돌연벼이로 인한 변이 아미노산 위치가 상이한 것이며;
상기 변이항체 유전자 풀로부터 발현된 변이항체 풀과 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 BC200 RNA를 반응시켜, 비변이 항체보다 결합력이 높은 변이항체 풀을 선별하는 상위 스크리닝 단계;
상기 선별된 변이항체 풀에 대응하는 단클론 항체 풀을 제작하는 단계; 및
상기 단클론 항체 풀 및 상기 BC200 RNA를 반응시켜 비변이 항체보다 결합력이 높은 단클론 항체를 선별하는 하위 스크리닝 단계를 포함하는,
항체 또는 이의 항원 결합 단편 선별 방법으로 얻어진 것인,
항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제7항에 있어서, BC200(brain cytoplasmic 200) RNA 내의 서열번호 11 또는 서열번호 12 영역에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성결정영역1(CDR1);
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성결정영역2(CDR2);
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 상보성결정영역3(CDR3);
서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성결정영역1(CDR1);
서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 상보성결정영역2(CDR2); 및
서열번호 6의 아미노산 서열 중 4번째 아미노산 세린(serine, S)이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어지는 경쇄 상보성결정영역3(CDR3)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하는 핵산분자.
- 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 탐지용 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 탐지용 키트.
- 랜덤 프라이머를 이용한 PCR 증폭 반응을 수행하여, 항체 유전자의 CDR 서열 내 특정 염기 위치에서 점 돌연변이를 포함하는 변이항체 유전자 풀(pool)을 2종 이상 제조하고, 상기 각각의 변이항체 유전자 풀은 점돌연벼이로 인한 변이 아미노산 위치가 상이한 것이며;
상기 변이항체 유전자 풀로부터 발현된 변이항체 풀과 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 BC200 RNA를 반응시켜, 비변이 항체보다 결합력이 높은 변이항체 풀을 선별하는 상위 스크리닝 단계;
상기 선별된 변이항체 풀에 대응하는 단클론 항체 풀을 제작하는 단계; 및
상기 단클론 항체 풀 및 상기 BC200 RNA를 반응시켜 비변이 항체보다 결합력이 높은 단클론 항체를 선별하는 하위 스크리닝 단계를 포함하는,
항체 또는 이의 항원 결합 단편 선별 방법으로서,
상기 선별된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 BC200 RNA의 50번 내지 120번 염기서열에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 선별 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 유방암 진단용 조성물.
- 삭제
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