CN110603055B - 与暴露于细胞膜上的赖氨酰-tRNA合成酶N末端区域特异性结合的抗体 - Google Patents

与暴露于细胞膜上的赖氨酰-tRNA合成酶N末端区域特异性结合的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与暴露于细胞膜上的赖氨酰‑tRNA合成酶N末端区域特异性结合的抗体及其用途，更具体地，涉及具有在本说明书中记载的特定互补决定区(CDR)序列，且特异性结合在赖氨酰‑tRNA合成酶(KRS，Lysyl‑tRNA synthetase)N末端中包含SEQ ID NO:97的抗原表位(epitope)的抗体或其片段，以及上述抗体或片段在转移抑制和癌症诊断中的用途，以及用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病的药学组合物。本发明的抗体或其片段与暴露于细胞膜上的KRS N末端区域的特异性结合能力非常优异，根据本发明的抗体或其片段对于诊断癌症是有效的，具有抗癌和转移抑制作用，可很好地用于预防或治疗与免疫细胞迁移相关的疾病。

Description

与暴露于细胞膜上的赖氨酰-tRNA合成酶N末端区域特异性结 合的抗体
本申请要求于2017年3月27日申请的韩国专利申请第10-2017-0038775号、2017年9月15日申请的韩国专利申请第10-2017-0118890号及第10-2017-0118917号的优选权，其申请文件全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及与暴露于细胞外的赖氨酰-tRNA合成酶N末端区域特异性结合的抗体或其片段，及其用途，更详细地，涉及具有在本申请中记载的特定互补决定区(CDR)序列，且与在赖氨酰-tRNA合成酶(KRS，Lysyl-tRNA synthetase)N末端中包含如SEQ ID NO:97所示序列的抗原表位(epitope)特异性结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段在抑制癌症转移中的用途，所述抗体或其片段在癌症诊断中的用途，以及预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病的药物组合物。
背景技术
最近的研究已经确定，通常存在于胞质溶胶(cytosol)中的人赖氨酰-tRNA合成酶向质膜(细胞膜)迁移(translocation)并与存在于质膜上的67-kDa层粘连蛋白受体(67LR)相互作用，来促进肿瘤(或癌症)细胞的迁移以影响癌症的转移(metastasis)(Dae Gyu Kimet al.,Chemical inhibition of prometastatic lysyl-tRNAsynthetaselamininreceptor interaction,Nat Chem Biol.2014Jan；10(1):2934,Dae Gye Kimet.al.Interaction of two translational components,lysyl-tRNAsynthetase andp40/37LRP,in plasma membrane promotes laminin-dependent cell migration,FASEBJ.(2012)26,4142-4159)。人赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)(Genbank Accession No.NP_005539.1等)包含N末端延伸(N-terminal extension，1-72)、反密码子结合域(anticodon-binding domain，73-209)及催化域(catalytic domain，220-597)。人赖氨酰-tRNA合成酶为蛋白质合成所必需的酶，通常存在于胞质溶胶中的多重tRNA合成酶复合物(multi-tRNAsynthetase complex，MSC)内。但是，在层粘连蛋白(laminin)信号发生后，p38 MAPK在T52残基上使赖氨酰-tRNA合成酶磷酸化，赖氨酰-tRNA合成酶向细胞膜迁移以保护67LR避免泛素介导的降解。并且，据报告，向细胞膜迁移的赖氨酰-tRNA合成酶使与癌症转移关联的67LR稳定化，并与其相互作用，从的促进癌症转移(cancer metastasis)。
另一方面，免疫细胞参与体内的一种主要防御机制，但是，据最近的报告，免疫细胞的过度激活成为主要发病机制中的一种。通常在炎症性免疫细胞活化后观察到免疫细胞的迁移性增加，特别是，据报道这种免疫细胞的迁移和侵袭与以下疾病的疾病病理密切相关。例如，病变发生在心脏和主要动脉的心血管疾病包括动脉粥样硬化和冠状动脉疾病等(Ross R et al.,New Engl J Med，1999：340(2)：115-26，Poli G et al.,RedoxBiol2013；1(1)：125-30，Libby P et al.,Circulation 2002；5；105(9)：1135-43)。动脉粥样硬化症为胆固醇引起的炎症性疾病，由沉积在动脉内侧膜的胆固醇和从血液向动脉内侧迁移的免疫细胞构成的粉瘤引起。即，粉瘤是由免疫细胞(如单核细胞)迁移到胆固醇氧化物引起炎症的部位形成的。粉瘤的形成使血管的内部面变得粗糙，血管壁增厚，因此血管内部的直径变窄，导致血液循环不畅。若粉瘤周围的纤维膜破裂，则导致血管血栓和粉瘤出血，使血管内径急剧变窄或血管堵塞。这主要发生在向心脏供血的血管、向脑供血的血管、向肾脏供血的血管及外周血管中，从而引起缺血性心脏疾病、缺血性脑血管病(脑卒中)、肾衰竭，以及肢体缺血性动脉病。众所周知，在这种心血管疾病的发生及发展过程中，诱导单核细胞的移动并引起炎症反应的CC趋化因子配体(CCL 2，MCP-1)起到重要作用，因此，提出通过抑制CCL2的作用及其导致的单核细胞的迁移来治疗如上所述的心血管疾病的方法(GuL et al.,Mol Cell,1998；2(2):275-81,Aiello RJ et al.,Arterioscler Thromb VascBiol 1999；19(6):1518-25,Gosling J1 et al.,Clin Invest 1999；103(6):773-8,Harrington JR et al.,Stem Cells 2000；18(1):65-6,Ikeda U et al.,ClinCardiol2002,25(4):143-7)。
肺动脉高压(Pulmonary Arterial Hypertension，PAH)在肺高血压世界卫生组织(WHO)临床分类指南(ESC Guidelines，European Heart Journal 2015)中被分为I级，是一种罕见病，临床特征为呼吸困难、平均肺动脉压(mean pulmonary artery pressure，mPAP)的升高(mPAP＞25mm Hg)及右心室功能不全。遗传、感染、关联疾病等多种先存因素参与了这种肺动脉高压，但已知内皮损伤(endothelial cell injury)引起的免疫反应是一个关键的病理因素(Huertas et al.,Circulation,129:1332-1340,2014)。对于这种现象，免疫细胞的浸润和功能障碍(dysfunction)引起的一连串的过程与病理现象具有密切的联系，尤其是免疫细胞和血管内皮细胞相互作用在肺动脉高压中尤为重要。不仅如此，据报告，单核细胞和巨噬细胞的浸润也促进奥尔波特综合征(Alport syndrome)的进展。
在与纤维化(fibrosis)关联的疾病中，持续(慢性)炎症反应使伤口愈合程序(wound-healing program)活性化，这将导致纤维化。组织损伤后，单核细胞/巨噬细胞或中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等的炎症性免疫细胞在被激活的同时快速地向损伤部位渗透，并分泌各种细胞因子，进而激活周围的成纤维细胞或上皮细胞、平滑肌细胞，使其活性化为类成肌细胞，所述类成肌细胞生成并分泌大量的细胞外基质蛋白，最终在组织累积大量的细胞外基质蛋白，从而留下伤痕并导致组织的纤维化或肥大化(Gurtner GC etal.,Trends Cell Biol.15:599-607,2005)。这种病理机制为切口、烧伤、褥疮等，或者肝、肾脏、血管、肺等的组织硬化性纤维化引起的皮肤组织内的伤痕形成的根本原因之一。在属于慢性自我免疫疾病的硬皮病(scleroderma)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、骨髓纤维化(myelofibrosis)、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosu)中，主要病理特性也为纤维化。还已知，炎症免疫细胞的激活对特应性疾病、哮喘疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、银屑病、瘢痕疙瘩、增殖性视网膜病等的病理现象有所贡献。
尤其，在上述伤口愈合程序(wound-healing program)中，将激活为类成肌细胞的成纤维细胞称为肌成纤维细胞(myofibroblast)。由于肌成纤维细胞为与纤维化关联的所有疾病病理的关键，因此，去除诱导肌成纤维细胞的活性的分子生物学或免疫学机制，成为疾病治疗的核心要素。众所周知，许多类型的先天性免疫(innate immunity)或后天性免疫(adaptive immunity)在成纤维细胞(fibroblast)的活性和分化中是重要的，因此，在伤患处去除炎症反应，成为中断纤维化的组织重塑(tissue remodeling)为纤维化并维持正常组织形态的关键要素。但是，由于实践中不易去除炎症反应，因此，了解先天性免疫或后天性免疫的机制来寻找核心介质(mediator)在减慢纤维化中是重要的。
在某些情况下，单核细胞、巨噬细胞等有助于伤口愈合(wound healing)，但是，分泌活性氧(reactive oxygen)、氮(nitrogen)等，因而对周围细胞有害。因此，若无法迅速去除单核细胞、巨噬细胞，则进一步诱发组织损伤，并导致纤维化。因此，限制在上述疾病的初期最先反应的单核细胞、巨噬细胞被认为是治疗各种慢性炎症及纤维化相关疾病的一种战略。
还已知，当伤口愈合机制触发纤维化反应时，与血凝反应关联的血小板源性生长因子(PDGF，platelet-derived growth factor)将其他炎症反应免疫细胞招募到伤患处，TGF-β1会加速局部成纤维细胞的细胞外基质合成。然而有报道称，即使在凝血因子缺乏的情况下，参与血凝的因子也会导致纤维化。
另一方面，在N末端延伸(N-ext)中缺失40个末端残基的Myc-KRS 41-597(ΔN)不存在于(localize)质膜上的事实意味着，KRS N-ext区域是KRS向细胞膜迁移(translocation)过程的必要的区域。关于癌症转移，具体地，已知KRS N-ext区域在其相互作用中参与KRS和67LR的结合。为了将该事实用于治疗或诊断目的，需根据构成KRS蛋白的多个域区域的特性，特异性靶向KRS蛋白中的特定位点(特别是KRS N-ext)。
然而，尽管包括KRS在内的氨酰tRNA合成酶(ARS，aminoacyl tRNA synthetase)作为生物标记很重要，但就蛋白质结构而言，ARS是相似的，因此通过ARS蛋白免疫动物获得的抗体呈现出交叉反应，例如，与其他ARS结合，且在许多情况下，甚至不会产生高敏感性抗体。
在如上所述的由免疫细胞过度活性化引起的疾病中，常规地提出了用于防止免疫细胞的迁移(及浸润)的靶标因子(target factor)，且已经尝试设计治疗方法来调节靶标因子的疾病但是各自的局限性已被报道。因此，为了有效地治疗疾病，在免疫细胞迁移过程中，确定关键介质(mediator)以及控制其的策略依然是一个严峻的挑战。
发明详述
技术问题
本发明人在研究制备与暴露于细胞外的KRS N末端区域特异性结合的抗体的过程中，证实了在本说明书中记载的具有特定互补决定区(CDR)序列的抗体对KRS N末端区域呈现非常高的结合特异性(specificity)及结合亲和力(affinity)，并在体内(in vivo)抑制癌症转移。并且，本发明人证实，在免疫细胞(单核细胞/巨噬细胞)的细胞膜区域中KRS的水平增加为免疫细胞迁移及浸润相关的疾病的重要病理现象，因此KRS与层粘连蛋白(尤其，层粘连蛋白亚型α4β2γ1)具有特别的关联性，并证实本发明中提供的KRS N末端结合抗体降低了在免疫细胞的细胞膜中增加的KRS水平，并实际上抑制了免疫细胞迁移及浸润，因此具有治疗相关疾病的效果，本发明人从而完成了本发明。
因此，本发明的一方面提供与赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)N末端中包含如SEQ IDNO:97所示序列的抗原表位特异性结合的抗体或其片段。
本发明的另一方面提供编码本发明所述抗体或其片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的重组表达载体及利用所述重组表达载体转化而成的细胞。
本发明的另一方面提供制备与暴露于细胞外的赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)N末端特异性结合的抗体或其片段的方法，所述方法包括：(a)利用上述重组表达载体转化宿主细胞；(b)培养转化的宿主细胞以生成抗体或其片段；以及(c)获取在宿主细胞中生成的抗体或其片段。
本发明的还有一个方面提供包含本发明所述的抗体或其片段作为有效成分的用于抑制癌症转移的药学组合物。
本发明还有一个方面提供由本发明所述的抗体或其片段组成的用于抑制癌症转移的药学组合物。
本发明还有一个方面提供基本上由本发明所述的抗体或其片段组成的用于抑制癌症转移的药学组合物。
本发明还有一个方面提供包含本发明所述的抗体或其片段作为有效成分的用于诊断癌症的组合物。
本发明还有一个方面提供由本发明所述的抗体或其片段组成的用于诊断癌症的组合物。
本发明还有一个方面提供基本上由本发明所述的抗体或其片段组成的用于诊断癌症的组合物。
本发明还有一个方面提供包含本发明所述的抗体或其片段作为有效成分的用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病药学组合物。
本发明还有一个方面提供由本发明所述的抗体或其片段构成的用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病药学组合物。
本发明还有一个方面提供基本上由本发明所述的抗体或其片段构成的用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病药学组合物。
本发明还有一个方面提供本发明所述的抗体或其片段在制备用于抑制癌症转移的制剂中的用途。
本发明还有一个方面提供抑制有需要的受试者中抑制癌症转移的方法，所述的方法包括以有效抑制癌症转移的量向所述的受试者给药本发明所述的抗体或其片段。
本发明还有一个方面提供本发明所述的抗体或其片段在制备用于诊断癌症的制剂中的用途。
本发明还有一个方面提供诊断需要的受试者中癌症的方法，所述的方法包括以有效诊断癌症的量向所述受试者给药本发明所述的抗体或其片段。
本发明还有一个方面提供本发明所述的抗体或其片段在制备用于治疗免疫细胞迁移相关疾病的制剂中的用途。
本发明还有一个方面提供治疗有需要的受试者中免疫细胞迁移相关疾病的方法，所述的方法包括以有效治疗免疫细胞迁移相关疾病的量向所述受试者给药本发明所述的抗体或其片段。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供与赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)N末端中包含如SEQ IDNO:97所示序列的抗原表位特异性结合的抗体或其片段。
根据本发明的一个方面，提供编码本发明所述的抗体或其片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的重组表达载体及利用所述重组表达载体转化而成的细胞。
根据本发明的一个方面，提供制备与暴露于细胞外的赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)N末端特异性结合的抗体或其片段的方法，所述方法包括：(a)利用上述重组表达载体转化宿主细胞；(b)培养转化的宿主细胞以生成抗体或其片段；以及(c)获取在宿主细胞中生成的抗体或其片段。
根据本发明的另一个方面，提供包含本发明所述的抗体或其片段作为有效成分的用于抑制癌症转移的药学组合物。
根据本发明的另一个方面，提供由本发明的抗体或其片段组成的用于抑制癌症转移的药学组合物。
根据本发明的另一个方面，提供基本上由本发明所述的抗体或其片段组成的用于抑制癌症转移的药学组合物。
根据本发明的另一个方面，提供包含本发明所述的抗体或其片段作为有效成分的用于诊断癌症的组合物。
根据本发明的另一个方面，提供由本发明所述的抗体或其片段组成的用于诊断癌症的组合物。
根据本发明的另一个方面，提供基本上由本发明所述的抗体或其片段组成并作为癌症诊断的活性成分的组合物。
根据本发明的另一个方面，提供包含本发明所述的抗体或其片段作为有效成分的用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病药学组合物。
根据本发明的另一个方面，提供由本发明所述的抗体或其片段组成的用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病药学组合物。
根据本发明的另一个方面，提供基本上由本发明所述的抗体或其片段组成的用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病的药学组合物。
根据本发明的另一个方面，提供本发明所述的抗体或其片段在制备用于抑制癌症转移的制剂中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供抑制有需要的受试者中癌症转移的方法，所述的方法包括以有效抑制转移的量给药本发明所述的抗体或其片段。
根据本发明的另一个方面，提供本发明所述抗体在制备用于癌症诊断的制剂中的用途。
根据本发明的另一方面，提供诊断有需要的受试者中癌症的方法，所述的方法包括以有效诊断癌症的量向所述受试者给药本发明所述的抗体或其片段。
根据本发明的另一个方面，提供本发明所述的抗体或其片段在制备用于治疗免疫细胞迁移相关疾病的制剂中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供治疗有需要的受试者中免疫细胞迁移相关疾病的方法，所述的方法包括以有效治疗免疫细胞迁移相关疾病的量向所述受试者给药本发明所述的抗体或其片段。
以下，详细说明本发明。
如本发明所用，“暴露于细胞外的赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)N末端区域”是指当在细胞内生成的KRS迁移到细胞膜(或质膜)时，暴露于细胞外(extracellular)区域或在细胞膜表面的特定序列，通常，可指KRS N末端的1个至72个氨基酸区域的一部分或全长序列。另外，KRS N末端区域存在物种序列相似性，尤其，包括SEQ ID NO:97表示的氨基酸序列。优选地，在人中，所述的KRS N末端区域包含如SEQ ID NO:75所示的序列，在小鼠(mouse)中，包含如SEQ ID NO:113所示的序列，在大鼠(rat)中，包含如SEQ ID NO:114所示的序列。
如本发明所用，术语“KRS”是指以赖氨酰-tRNA合成酶周知的全长多肽或任何包括N末端区域(N-terminal extention)的赖氨酰-tRNA合成酶片段序列。如上所述，本发明的所述抗体或其片段特异性检测暴露于细胞外的KRS N末端区域，因此还可检测包括如上所述的KRS全长多肽或任何包含N末端区域的KRS片段序列。对KRS的具体序列没有特别限制，只要所述序列包含如SEQ ID NO:75所示的多肽，且是本领域周知的KRS即可。例如，本发明的KRS包括：来源于人(homo sapiens)且已知其NCBI(Genbank)登录号为NP_005539.1等的序列；来源于小鼠(Mus musculus)且已知其NCBI(Genbank)Accession No.NP_444322.1等的序列，以及来源于大鼠(Rattus norvegicus)且已知其NCBI(Genbank)登录号为XP_006255692.1等的序列，除此之外，可参照下述序列信息，但并不限定于此：XP_005004655.1(豚鼠：Cavia porcellus)、XP_021503253.1(沙鼠，Meriones unguiculatus)、XP_002711778.1(兔，Oryctolagus cuniculus)、XP_536777.2(狗，Canis lupus familiaris)、XP_003126904.2(猪，Sus scrofa)、XP_011755768.1(猴，Macaca nemestrina)、XP_008984479.1(狨猴，Callithrixjacchus)、XP_019834275.1(牛，Bos indicus)、XP_511115.2(黑猩猩，Pan troglodytes)。最优选地，KRS可以为由如SEQ ID NO:76(GenbankAccession No.NP_005539.1)所示的氨基酸序列形成的多肽。
如本发明所用，抗体(antibody)还称为免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，为选择性地作用于抗原来参与生物体免疫的蛋白质的总称。在自然中发现的全抗体(wholeantibody)通常由两对轻链(light chain，LC)及重链(heavy chain，HC)组成，其中每条为由多个结构域组成的多肽，或具有两对HC/LC作为基本单位。构成哺乳动物的抗体的重链有5种类型，用希腊字母α、δ、ε、γ及μ表示，根据重链的种类，分别构成不同类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。构成哺乳动物的抗体的轻链有两种类型分别由λ及κ表示。
抗体的重链与轻链根据氨基酸序列的可变性在结构上分为可变区和恒定区。根据抗体的种类，重链的恒定区由三个或四个重链恒定区域组成，例如CH1、CH2及CH3(IgA、IgD及IgG抗体)及CH4(IgE及IgM抗体)，轻链具有一个恒定区CL。重链与轻链的可变区分别由重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)一个结构域形成。轻链与重链通过一个共价二硫键(disulfide bond)相互连接，其可变区和恒定区平行排列，并且与轻链连接的两个重链分子通过两个共价二硫键相连接，来形成全抗体。全抗体通过重链及轻链的可变区与抗原特异性结合。全抗体由两对重链和轻链(HC-LC)形成，因此，一个全抗体分子具有二价单特异性，通过两个可变区与两个相同的抗原相结合。
包括抗原结合位点的抗体可变区细分为具有低序列变异性的构架区(frameworkregion，FR)和高序列变异性的高变区(hypervariable region)的互补决定区(complementary determining region，CDR)。在VH与VL中，三个CDR及四个FR从N末端到C末端的方向以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序排列。在抗体的可变区域中，具有最高序列变异性的CDR为与抗原直接结合的位点，对于抗体的抗原特异性尤为重要。
本发明提供包含赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)N末端中包含如SEQ ID NO:97所示序列的抗原表位特异性结合的抗体或其片段。
如本发明所用，“抗原表位”指的是能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。抗原表位通常由分子的表面基团，如氨基酸或糖侧链形成，且通常具有特定的三维结构特性及特定的电荷特性。构象抗原表位与非构象抗原表位的区别在于，在具有改性溶剂的情况下，与构象表抗原位的结合丧失，但是，不丧失与非构象抗原表位的结合。抗原表位可包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为抗原表位的免疫原性成分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如，被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基[即，位于特异性抗原结合肽的足迹(footprint)内的氨基酸残基]。
优选地，所述抗原表位为衍生自KRS N末端序列的本发明的N3单克隆抗体结合的位点，并且对其具体序列没有特别限制，只要是所述序列为包含SEQ ID NO:97所示的氨基酸(klsknelkrrlka)的连续区域即可，且通常由13-52个氨基酸的序列组成，更优选地，由13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、或42个氨基酸的序列形成，包含SEQ ID NO:97。
优选地，在本发明的上述抗原表位中，可以包括衍生自人KRS N末端的SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100及SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列；衍生自小鼠KRS N末端的SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105及SEQ ID NO:106所示的氨基酸序列；衍生自大鼠KRS N末端的SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110及SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列。更优选地，所述抗原表位可以为SEQ ID NO:75(SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100及SEQ ID NO:101)表示的人KRS酶N末端区域的第15-29位的氨基酸序列，最优选地，可以为SEQ ID NO:75表示的人KRS N末端区域的第15-42位的氨基酸序列(SEQ ID NO:101)。
本发明提供的“与暴露于细胞外的KRS N末端区域特异性结合的抗体或其片段”包括重链可变区以及轻链可变区，所述重链可变区(VH)包含重链互补决定区1(CDR1)、重链互补决定区2(CDR2)以及重链互补决定区3(CDR3)，所述重链互补决定区1(CDR1)包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:37组成的群组中的氨基酸序列，所述重链互补决定区2(CDR2)包含选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27及SEQID NO:39组成的群组中的氨基酸序列，所述重链互补决定区3(CDR3)包含选自由SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:41组成的群组中的氨基酸序列，所述轻链可变区域包含轻链互补决定区1(CDR1)、轻链互补决定区2(CDR2)以及轻链互补决定区3(CDR3)，所述轻链互补决定区1(CDR1)包含选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:43组成的群组中的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2(CDR2)包含选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:45组成的群组中的氨基酸序列，所述轻链互补决定区3(CDR3)包含选自由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:47组成的群组中的氨基酸序列。
由所述CDR序列构成的抗体具有与暴露于细胞外的KRS N末端区域特异性结合的优异能力。这在本发明的说明书的实施例中进行了详细描述。在本发明的一个实施例中，为了制备与暴露于细胞外的KRS N末端区域特异性结合的scFv，通过如下的五个实验步骤筛选了在与KRS N末端结合的过程中X显示出高结合特异性及结合亲和力的scFv，即，通过scFv噬菌体文库(phage library)筛选的第一次筛选、间接酶联免疫吸附法(indirectELISA)(第二次筛选)、蛋白质印迹法(第三次筛选)、免疫沉淀法(第四次筛选)、免疫荧光染色(第五次筛选)。通过scFv噬菌体文库筛选在第一次筛选中总共筛选了1920个scFv克隆，通过上述五个步骤的筛选，最终选择了特异性最高的N3 scFv、N5 scFv、N7scFv、N9 scFv四种类型的片段。另外，将所述scFv转化为IgG抗体，从而制备N3 IgG、N5 IgG、N7 IgG、N9 IgG的抗体，经确认，这些抗体也在KRS N末端结合过程中呈现高结合特异性。
本发明所述的与暴露于细胞外膜的KRS N末端区域特异性结合的抗体或其片段为包括如下的重链可变区域及轻链可变区域的CDR结构的抗体，其中(i)、(ii)、(iii)及(iv)在相应的实施例中分别示出N3、N5、N7及N9抗体的CDR组合：
(i)包括重链互补决定区1、重链互补决定区2以及重链互补决定区3的重链可变区，所述重链互补决定区1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区3包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；以及包括轻链互补决定区1、轻链互补决定区2以及轻链互补决定区3的轻链可变区，所述轻链互补决定区1包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区3包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
(ii)包括重链互补决定区1、重链互补决定区2以及重链互补决定区3的重链可变区，所述重链互补决定区1包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区3包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；以及包括轻链互补决定区1、轻链互补决定区2以及轻链互补决定区3的轻链可变区，所述轻链互补决定区1包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区3包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
(iii)包括重链互补决定区1、重链互补决定区2以及重链互补决定区3的重链可变区，所述重链互补决定区1包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区3包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；以及包括轻链互补决定区1、轻链互补决定区2以及轻链互补决定区3的轻链可变区，所述轻链互补决定区1包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区3包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；以及
(iv)包括重链互补决定区1、重链互补决定区2以及重链互补决定区3的重链可变区，所述重链互补决定区1包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区3包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；以及包括轻链互补决定区1、轻链互补决定区2以及轻链互补决定区3的轻链可变区，所述轻链互补决定区1包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区3包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
最优选地，本发明的所述抗体或其片段包括如下的重链可变区及轻链可变区：在所述抗体或其片段中，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:49(N3 VH)、SEQ ID NO:53(N5 VH)、SEQ ID NO:57(N7 VH)及SEQ ID NO:61(N9 VH)组成的群组中的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:51(N3 VL)、SEQ ID NO:55(N5轻链可变区)、SEQ ID NO:59(N7 VL)及SEQ ID NO:63(N9 VL)组成的群组中的氨基酸序列。
包含所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)的抗体可以为包含重链和轻链的抗体，所述重链包含选自由SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85及SEQ ID NO:89组成的群组中的氨基酸序列，所述轻链包含选自由SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:87及SEQ ID NO:91组成的群组中的氨基酸序列。
最优选地，所述抗体为包含如下的重链及轻链的抗体，即，包含如SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列的重链及包含如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列的轻链；包含如SEQ IDNO:81所示的氨基酸序列的重链及包含如SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列的轻链；包含如SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列的重链及包含如SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列的轻链；包含如SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列的重链及包含如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列的轻链。
本发明所述的“与暴露于细胞外的KRS N末端区域特异性结合的抗体”，其种类没有限制，只要是具有如上所述的CDR组合或具有重链可变区及轻链可变区的组合的抗体抗体即可。作为一个具体实施例，所述抗体可选自由IgG、IgA、IgM、IgE及IgD组成的群组，优选地，可以为IgG抗体。
本发明的所述抗体，可以为单克隆(monoclonal)抗体或多克隆(polyclonal)抗体，只要是与KRS N末端区域特异性结合的具有如上所述的CDR组合或具有VH和VL组合的抗体，但优选一组单克隆抗体，其中的每一个抗体具有基本上相同的重链和轻链氨基酸序列。
本发明的所述抗体可来源于包括哺乳动物在内的任何动物，所述的哺乳动物包括人类和鸟类，优选地，可以来源于人。然而，本发明的所述抗体可为包括来源于人的抗体的一部分和来源于其他种类的动物的抗体的一部分的嵌合(chimeric)抗体。即，本发明包括嵌合抗体、人源化抗体、人源抗体，优选地，可以为人源抗体。
另外，本发明中的所述抗体的片段指的是保留全抗体的抗原特异性结合力的抗体片段，优选地，所述片段保留亲本抗体的KRS N末端结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％。具体地，所述片段可以为Fab、F(ab)2、Fab'、F(ab')2、Fv、双链抗体(diabody)、scFv等的形态。
Fab(fragment，antigen-binding)为抗体的抗原结合片段，且由一条重链和一条轻链组成，其各自由一个可变区和恒定区构成。F(ab')2为利用胃蛋白酶水解抗体生成的片段，呈两个Fab在重链铰链(hinge)区中通过二硫键(disulfide bond)连接的形态。F(ab')为单链抗体片段，其中通过还原F(ab')2片段的二硫键将重链铰链添加到与F(ab')2片段分离的Fab上。Fv(variable fragment)为仅由重链和轻链各自的可变区构成的抗体片段。scFv(single chain variable fragment)为重组抗体片段，其中重链可变区和轻链可变区通过柔性的肽连接子彼此连接。双链抗体(diabody)是指这样的片段，其中scFv的VH与VL通过非常短的连接子连接，因此，彼此无法相结合，并分别与相同形态的其他scFv的VL与VH相结合来形成二聚体。
由于本发明的目的，所述抗体的片段不限于其结构或构象，只要是所述抗体的片段保留对于KRS N末端区域的结合特异性即可，优选地，可以为scFv。本发明的scFv具有对KRS N末端区域特异性的CDR构象或VH和VL构象，且其序列不特别限制，只要是VH的C末端与VL的N末端通过连接子连接即可。所述连接子并没有特别限制，只要是在本领域周知的适用于scFv的连接子即可，可以为包括如SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列的肽。具体地，本发明的所述scFv可包括选自由SEQ ID NO:67(N3 scFv)、SEQ ID NO:69(N5 scFv)、SEQ ID NO:71(N7 scFv)及SEQ ID NO:73(N9 scFv)组成的群组中的氨基酸序列。
本发明的所述抗体或其片段可包括实质上不改变其生物活性的保守氨基酸取代(称为抗体的保守变体)。
另外，如上所述的本发明的抗体或其片段可以为与酶、荧光物质、辐射物质及蛋白质等缀合的抗体或其片段，但并不限定于此。并且，使所述抗体与上述物质缀合的方法在本领域周知。
本发明提供编码如上所述的本发明的抗体或其片段的多核苷酸。
在本说明书中，所述多核苷酸还可描述为寡核苷酸或核酸，并且包括通过使用DNA分子[例如，cDNA或基因组DNA(genomic DNA)]、RNA分子(例如，mRNA)、核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物(例如，肽核酸及非自然生成的核苷酸类似物)及它们的混合物质。所述多核苷酸可以为单链(single-stranded)或双链(double stranded)。
所述多核苷酸指的是编码由重链和轻链组成的抗体的核苷酸序列，每一个重链和轻链具有对KRS N末端区域特异的CDR构象或VH和VL构象。本发明的所述多核苷酸并不特别限于其序列，只要是编码本发明的所述抗体或其片段的序列即可。在根据本发明的上述抗体中，编码前述CDR序列的所述多核苷酸并没有特殊限制，但优选地，可包括SEQ ID NO:2(重链CDR1)、SEQ ID NO:4(重链CDR2)、SEQ ID NO:6(重链CDR3)、SEQ ID NO:8(轻链CDR1)、SEQ ID NO:10(轻链CDR2)、SEQ ID NO:12(轻链CDR3)、SEQ ID NO:14(重链CDR1)、SEQ IDNO:16(重链CDR2)、SEQ ID NO:18(重链CDR3)、SEQ ID NO:20(轻链CDR1)、SEQ ID NO:22(轻链CDR2)、SEQ ID NO:24(轻链CDR3)、SEQ ID NO:26(重链CDR1)、SEQ ID NO:28(重链CDR2)、SEQ ID NO:30(重链CDR3)、SEQ ID NO:32(轻链CDR1)、SEQ ID NO:34(轻链CDR2)、SEQ IDNO:36(轻链CDR3)、SEQ ID NO:38(重链CDR1)、SEQ ID NO:40(重链CDR2)、SEQ ID NO:42(重链CDR3)、SEQ ID NO:44(轻链CDR1)、SEQ ID NO:46(轻链CDR2)或SEQ ID NO:48(轻链CDR3)表示的核苷酸序列。
另外，在本发明的抗体中，对编码如上所述的VH和VL的多核苷酸的序列没有特殊限制，但优选地，可包括如SEQ ID NO:50(VH)、SEQ ID NO:52(VL)、SEQ ID NO:54(VH)、SEQID NO:56(VL)、SEQ ID NO:58(VH)、SEQ ID NO:60(VL)、SEQ ID NO:62(VH)或SEQ ID NO:64(VL)所示的核苷酸序列。
另外，优选地，编码所述抗体的片段的多核苷酸可包含选自由编码本发明的scFv的SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72及SEQ ID NO:74组成的群组中的核苷酸序列。
可通过本领域周知的方法获取编码本发明的所述抗体或其片段的多核苷酸。例如，基于对所述抗体的重链及轻链的一部分或全部进行编码的DNA序列或相应氨基酸序列，通过本领域周知的寡核苷酸合成技术，如聚合酶链式反应(PCR)方法等合成多核苷酸。
本发明提供了重组表达载体，其包含编码本发明的所述抗体或其片段的多核苷酸。
如本发明所用，“重组(recombinant)”与“基因操作(genetic manipulation)”可互换使用，是指通过使用分子克隆(molecular cloning)实验技术，例如基因转化、裂解或连接制备自然状态中不存在的形态的基因。
如本发明所用，术语“表达(expression)”指的是在细胞中生成蛋白质或核酸。
如本发明所用，术语“重组表达载体”为可以在适合的宿主细胞(host cell)中表达目的蛋白质或核酸(RNA)的载体，并且是指包括必需控制元件的基因构建体，所述必需控制元件可操作地连接以能够表达多核苷酸(基因)插入物。术语“可操作地连接”(operablylinked)是指为执行常规功能而进行的核酸表达调节序列和编码目的蛋白质或RNA的核酸序列功能连接(functional linkage)，意味着通过表达控制序列以使基因表达的方式连接。所述表达控制序列(expression control sequence)是指控制特定宿主细胞中可操作地连接的多核苷酸序列表达的DNA序列。这种表达控制序列包括用于转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、对适合的mRNA核蛋白体结合位点进行编码的序列、用于控制转录及翻译的结束的序列、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化A信号及增强子等。
本发明的重组表达载体并不特别限于其类型，只要是在克隆领域通常使用的载体即可，所述重组表达载体的实例包括质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体及病毒载体等，但并不限定于此。所述质粒的实例包括来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒[pBR322、pBR325、pUC118及pUC119、pET-22b(+)]、来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(pUB110及pTP5)及来源于酵母的质粒(YEp13、YEp24及YCp50)，所述病毒的实例可包括动物病毒，例如逆转录病毒、腺病毒或牛痘病毒；昆虫病毒，例如杆状病毒。
本发明的重组表达载体是指可操作地连接以便能够在合适的宿主细胞中表达的基因构建体，编码抗体或其片段的多核苷酸，所述抗体或其片段由具有可与KRS N末端区域特异性结合的如上所述的CDR或VH和VL的结构的重链及轻链形成。
编码本发明的抗体的重链和轻链的多核苷酸可被分别包含于不同的重组表达载体，还可被包含于一个重组表达载体。
本发明提供利用如上所述重组表达载体转化的细胞。
本发明的细胞并不特别限于其类型，只要是用于表达编码抗体或其片段的核苷酸即可，所述的抗体或其片段被包含在本发明的重组表达载体的中。本发明的利用重组表达载体转化的细胞(宿主细胞)可以为原核生物(例如，大肠菌)、真核生物(例如，酵母或其他菌类)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞[例如，人类细胞、猴细胞、仓鼠(hamster)细胞、大鼠细胞(rat cell)、小鼠细胞(mouse cell)、昆虫细胞]或来源于它们的杂交瘤。优选地，所述细胞可以为来源于包括人类的哺乳类的细胞。
适合本目的的示例性原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)及志贺氏菌属(Shigella)及杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)及地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)及链霉菌属(Streptomyces)。对本发明的细胞没有特别限制，只要是可表达本发明的载体即可，但可以优选为大肠杆菌。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)最常用作本发明细胞中的真核生物。然而，可使用诸多其他种属、种及菌株，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、瓦尔提克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；子囊菌酵母属(yarrowia)(EP 402，226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183，070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia(EP 244，234))；粗糙链孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如许旺酵母(occidentalis)；及丝状真菌，例如链孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)及曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(nidulans)及黑曲霉(A.niger)，但并不限定于此。
术语“转化(transformation)”是指由于外源多核苷酸的导入而导致的宿主细胞的基因型的修饰，也指将外源多核苷酸导入宿主细胞内而与用于转化的方法无关。引入宿主细胞的外源多核苷酸被整合到并保留在宿主细胞的基因组中，或者被保留而不被整合进其中，本发明包括两者。
能够表达本发明的与KRS N末端区域特异性结合的抗体或其片段的重组表达载体可通过如下的本领域公知方法引入用于生成抗体或其片段的细胞，即，如瞬时转染(transient transfection)、微注射、转导(transduction)、细胞融合、磷酸钙沉淀法、脂质体转染(liposome-mediated transfection)、DEAE葡聚糖介导的转染(DEAE dextran-mediated transfection)、聚凝胺介导的转染(polybrene-mediated transfection)、电穿孔法(electroporation)、基因枪(gene gun)及已知的将核酸引入细胞的方法，但并不限定于此。
本发明提供制备与暴露于细胞外的KRS N末端特异性结合的抗体或其片段的方法，所述方法包括：(a)利用上述重组表达载体转化宿主细胞；(b)培养转化的宿主细胞以生成抗体或其片段；以及(c)获取在宿主细胞中生成的抗体或其片段。
在步骤(a)中，为了产生根据本发明的所述抗体或其片段，利用所述重组表达载体转化宿主细胞，在所述重组表达载体中，编码所述抗体或其片段的多核苷酸被可操作地连接。
本领域普通技术人员可根据如上所述所选择的宿主细胞和重组表达载体选择适当的转化方法来进行此步骤。包括重链和轻链的核苷酸序列的重组表达载体可以在同一宿主细胞中共同转化以使重链和轻链在一个细胞中表达，或者可使包括重链和轻链的核苷酸序列的重组表达载体分别在不同的宿主细胞转化来单独表达重链和轻链。
在步骤(b)中，孵育转化的宿主细胞以从导入宿主细胞的重组表达载体生成本发明的抗体的重链、轻链或抗体片段的多肽。
可根据本领域通常使用的方法适当地选择用于培养所述宿主细胞的培养基组分、培养条件以及培养时间等。在宿主细胞中生成的抗体分子可累积于细胞的胞质溶胶内，或者通过适当的信号序列分泌于细胞外部或培养基中，或者使用周质等进行靶向(targeted)。并且，优选地，利用本领域公知的方法进行蛋白质复性(refolding)并使根据本发明的抗体具有功能性构象(conformation)，从而使其维持对于KRS N末端的结合特异性。对于IgG型抗体的产生，重链和轻链可以在不同的细胞表达，然后在单独的步骤中相互接触，以形成全抗体，或者使重链和轻链在相同的细胞中表达，在细胞内部形成全抗体。
在步骤(c)中，获得在宿主细胞生成的抗体或其片段。
本领域普通技术人员可考虑在宿主细胞中生成的抗体或其片段的多肽的特性、宿主细胞的特性、表达方式或多肽的靶向与否等来适当地选择及控制收集方法。例如，可以通过获得在其中培养宿主细胞的培养基并通过离心去除杂质等来收集分泌到培养基中的所述抗体或其片段。根据需求，为了使存在于细胞中的特定细胞器或胞质溶胶的抗体外排到细胞外部并收集，可在不影响抗体或其片段功能结构的程度上裂解细胞。所获取的抗体可进一步通过层析、使用过滤器的过滤、透析等的方法进一步去除杂质，并浓缩。
本发明制备(生成)方法的多肽可以为本发明的抗体或其片段本身，还可以为与除本发明的抗体或其片段之外的其他氨基酸序列进一步结合的抗体或其片段。在此情况下，可利用本领域的普通技术人员所熟知的方法将所述氨基酸序列从本发明的抗体或其片段去除。
本发明的抗体或其片段与KRS N末端特异性结合，因此，可用于诊断分析，以检测并定量如特定细胞、组织或血清内的KRS蛋白质。特别是，无需裂解细胞就可以特异性检测暴露于细胞外的KRS N末端区域。因此，本发明提供了用于特异性检测暴露于细胞外的KRSN末端的方法，所述包括：使上述抗体或其片段与样品相接触的步骤；以及检测上述抗体或其片段的步骤。
本发明的所述检测方法可以包括制备样品的步骤，使用本发明的抗体或其片段对其进行检测以确定KRS(或暴露于细胞外的KRS N末端肽)的有无及其浓度[步骤(1)]。
本领域普通技术人员可适当地选择利用抗体的公知的检测蛋白质的方法，并可根据选择的方法准备适合的样品。另外，样品可以是为了诊断是否存在癌症(特别是乳腺癌或肺癌)或癌症转移而通过活体组织检查等从受试者获取的细胞或组织、血液、血清、血浆、唾液、脑脊液等。利用上述抗体的检测蛋白质的方法实例包括，但不限于蛋白质印迹法、免疫印迹法、斑点印迹法、免疫组织化学染色(immunohistochemistry)、酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫检定法(radioimmunoassay)、竞争结合分析、免疫沉淀法等。例如，对于蛋白质印迹法，可通过向样品或细胞的溶解物添加适合于电泳的缓冲液，然后煮沸来制备制剂，对于免疫组织化学染色，可通过固定和封闭细胞或组织切片，然后封闭(blocking)来进行处理。
接着，进行使本发明的抗体或其片段与在如上所述的步骤中准备的样品相接触的步骤[步骤(2)]。
本发明的抗体具有如上所述的CDR或VH和VL的构象，且与KRS N末端特异性结合的抗体或其片段，其具体种类和序列结构如上所述。
可以用一般的可检测部分(moiety)标记所述抗体或其片段，以进行其“检测”。例如，可利用在文献[Current Protocols in Immunology，Volumes 1 and 2,1991,Coligenet al.,Ed.Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs]记载的技术使用放射性同位素或荧光标签来标记所述抗体或其片段。另外可利用各种酶-底物标签，酶标记的实例包括荧光素酶，如果蝇荧光素酶及细菌荧光酶(美国专利第4737456号)的、萤光素(luciferin)、邻苯二甲酸二氢嗪二酮(2,3-dihydrophthalazine dionise)、苹果酸脱氢酶、尿素酶(urase)、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如，尿酸酶及黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。使抗体与酶缀合的技术记载于如文献[O'Sullivan et al.,1981,Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods in Enzym.(J.Langone&H.VanVunakis,eds.),Academic press,N.Y.,73:147-166]。可利用各种公知技术将标签与抗体直接或间接缀合。例如，抗体可与生物素(biotin)缀合，属于在上述内容中提及的三种大范围种类的任何标签可与亲和素缀合，反之亦然。生物素选择性地与亲和素(avidin)结合，因此，上述标签可通过如上所述的间接方式与抗体缀合。或者，为了实现标签与抗体的间接缀合，可将所述抗体与半抗原(hapten)[例如，地高辛(digoxin)]缀合，在上述内容中提及的不同类型的标签中的一个可与抗-半抗原抗体缀合例如，抗-地高辛抗体)。因此，抗体与标签之间的间接接合是可以实现的。
如本发明所用，“接触(contacting)”的含义为其的普通含义，是指使两个以上的物质混合、结合或相接触。所述接触可在体外(in vitro)或其他容器(container)中进行，或者，可在原位(in situ)、体内、受试者内、组织内、细胞内进行。
接着，在完成上述步骤(2)之后，进行从样品中检测根据本发明的抗体或其片段的步骤[步骤(3)]。
上述“检测”是对根据本发明的抗体或其片段与抗原的复合物进行的，所述的组合物在样品中形成，是指检测KRS N末端肽(或包含肽的蛋白质，如KRS)的存在与否或测定上述肽的水平(包括定性测定或定量测定)。因此，在完成上述步骤(2)之后且后述的检测步骤[步骤(3)]之前，本发明的检测方法还可包括去除未与KRS N末端区域一起形成复合物的多余抗体或其片段的步骤。
在如上所述的步骤(2)中使用的抗体或其片段包含直接标记抗体或其片段的可检测的部分，如荧光、放射性同位素或酶的情况下，可根据检测相应部分的本领域公知的方法进行检测。例如，放射性可通过如闪烁计数(scintillation counting)测定，荧光可利用荧光计进行定量。
在上述步骤(2)中使用的抗体或其片段本身不包括如上所述的可检测部分的情况下，可利用被荧光、放射性、酶等标记的二次抗体间接检测。所述二次抗体与根据本发明的抗体或其片段(一次抗体)结合。
最近的研究表明，存在于胞质溶胶(cytosol)的人赖氨酰-tRNA合成酶(KRS，lysyl-tRNAsynthethase)向质膜(细胞膜)迁移(translocation)以与存在于质膜上的67LR(67-kDa层粘连蛋白受体)相互作用，从而促进肿瘤(或癌)细胞的迁移，影响癌症的转移(metastasis)(Dae Gyu Kim et al.,Chemical inhibition of prometastatic lysyl-tRNA synthetaselaminin receptor interaction,Nat Chem Biol.2014Jan；10(1):2934.)。在此情况下，已知KRS N末端扩展(terminal extension)(N-ext)区域为KRS向细胞膜迁移(translocation)的必要条件。关于癌症转移，具体地，已知KRS N末端扩展区域(N-ext)在KRS与67LR的相互作用中，参与它们的结合。
根据本发明的抗体及其片段与上述KRS N末端扩展区域特异性结合的能力优异。实际上，根据本发明的抗体及其片段与KRS N末端扩展区域结合，从而抑制与层粘连蛋白受体的结合(相互作用)，从而显示出抑制癌症转移的优异能力。这在本说明书的实施例中得到了很好的描述。本说明书的一个实施例证实，由于将本发明的抗体施用于具有诱发的癌症的体内癌症转移模型中，本发明的抗体示出剂量依赖性的优异的癌症转移功效。尤其，相比于现有的以抑制层粘连蛋白受体(67LR)与KRS的相互作用来抑制癌症转移的YH16899化合物，具有优异的癌症转移抑制功效。
因此，本发明提供包含如上所述的本发明的抗体或其片段作为有效成分的用于抑制癌症转移的药学组合物及用于诊断癌症的组合物。
并且，本发明提供由如上所述的本发明的抗体或其片段组成的用于抑制癌症转移的药学组合物及用于诊断癌症的组合物。
并且，本发明提供基本上由如上所述的本发明的抗体或其片段组成的用于抑制癌症转移的药学组合物及用于诊断癌症的组合物。
所述癌症并不特别限于其类型，只要是在本领域作为恶性肿瘤而周知的癌症即可，其实例可以为选自由乳腺癌、大肠癌、肺癌、小细胞肺癌、胃癌、肝癌、血癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性白血病或急性白血病、淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤及垂体腺瘤组成的群组中。优选地，在本发明中，上述癌症可以为乳腺癌或肺癌。
本发明提供包含如上所述的本发明的抗体或其片段作为有效成分的用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病药学组合物。
并且，本发明提供由如上所述的本发明的抗体或其片段组成的用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病药学组合物。
并且，本发明提供基本上由如上所述的本发明的抗体或其片段组成的用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病药学组合物。
如本发明所用，上述术语“免疫细胞”优选是指单核细胞或巨噬细胞。
如本发明所述，术语“免疫细胞迁移相关疾病”并不特别限于其特定类型，只要是在本领域以过多的免疫细胞迁移(及浸润)为主要发病机制而公知的疾病即可，其实例可选自由心血管疾病、纤维化疾病、慢性炎症性疾病及奥尔波特综合征(Alport syndrome)组成的群组。
上述心血管疾病并不限于以下特定类型的心血管疾病，可选自由肺动脉高压、动脉粥样硬化、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑血管病、动脉硬化及中膜硬化组成的群组。
上述纤维化疾病并不限于以下特定类型，可选自由硬皮病(scleroderma)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、克罗恩病(Crohn”s disease)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、骨髓纤维化(myelofibrosis)、肺纤维化(pulmonary fibrosis)、肝纤维化(hepathic fibrosis)、肝硬化(liver cirrhosis)、肾纤维化(kidneyfibrosis)、肌纤维变性(myofibrosis)、心肌纤维化、系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosu)、遗传性纤维化、感染性纤维化(尤其，持续感染引起的纤维化)、刺激性纤维化(反复暴露于刺激性物质，如烟草、毒性物质等而引起的纤维化)、慢性自身免疫性纤维化、器官移植中抗原不相容引起的纤维化、高脂血症引起的纤维化、肥胖引起的纤维化、糖尿病纤维化、高血压引起的纤维化及支架植入过程中纤维化引起的闭塞组成的群组。
上述慢性炎症性疾病可选自由哮喘、特应性皮炎、湿疹、银屑病、骨关节炎、痛风、银屑病性关节炎、肝硬化、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis)、慢性阻塞性肺病、鼻炎、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾功能衰竭、糖尿病神经病变及多发性硬化症组成的群组。
根据本发明的药学组合物可单独包含本发明的抗体或其片段，或者还可包含一个以上的医药上可接受的载体。上述“医药上可接受的”是指如下的组合物，即，生理上可接受，当向人给药时，不抑制活性成分的作用，且通常不诱发过敏反应或类似反应，如肠胃不适和头晕的非毒性组合物。
在根据本发明的药学组合物中，当临床给药上述抗体或其片段时，能够以口服及肠外的各种剂型给药。所述抗体或其片段在配制时，可使用通常使用的稀释剂或赋形剂，如填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂来制备。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊、锭剂等。这种固体制剂可通过将本发明的所述抗体或其片段或其医药上可接受的盐与至少一个赋形剂，如淀粉、碳酸钙、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)或明胶，混合来制备。此外，除简单地赋形剂之外，还可使用润滑剂，如硬脂酸镁、滑石粉。用于口服给药的液体制剂包括悬浮液、内服溶液、乳液、糖浆等。除经常使用的简单稀释剂(如水和液体石蜡)外，液体制剂中可包含几种赋形剂如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。
用于肠外给药的示例性制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮溶剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。本发明的治疗用组合物可以冻干饼或者水溶液的形式制备，以将任一生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,l9thEdition,Alfonso,R.,ed,Mack Publishing Co.(Easton,PA:1995))和具有优选纯度的抗体混合和储存。在使用剂量和浓度下，可接受的载体、赋形剂或稳定剂对使用者无毒，其实例包括缓冲溶液，例如磷酸、柠檬酸及其他有机酸；包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子(小于约10个的残基)的多肽；蛋白质，例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如，聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如，甘氨酸、谷氨酸盐、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖类、双糖类，及包括葡萄糖、甘露糖或糊精在内的其他碳水化合物；螯合剂，例如，乙二胺四乙酸(EDTA)；糖醇，例如，甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子，例如，钠；和(或)非离子表面活性剂，例如，吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。
本发明的抗体能够以药学有效量向对抗癌症或免疫细胞迁移相关疾病的受试者施用。如本发明所用，“药学有效量”是指相比于阴性对照组，显示更高反应的量，优选地是指足以治疗癌症的量或足以抑制癌症转移的量及足以治疗免疫细胞迁移相关疾病的量。本发明的抗体或其片段的总有效剂量能够以单剂量(single dose)向患者给药，或者可通过多个剂量(multiple dose)长期给药的分次治疗方法(fractionated treatmentprotocol)给药。通常，本发明的抗体或其片段向人体给药量为0.01～100mg/kg/周，优选地，为0.1～20mg/kg/周，更优选地，为5～10mg/kg/周。然而，关于本发明的抗体或其片段的剂量，其对患者的有效剂量是根据各种因素，例如药学组合物的给药途径、治疗次数、患者的年龄、体重、健康状态、性别、疾病的严重程度、饮食及排泄率，因此，考虑这一事实，本领域的普通技术人员，可将根据特定用途确定合适有效量的本发明的抗体或其片段根据作为癌症转移抑制剂。本发明的药学组合物只要呈现出本发明的效果，则其剂型、给药途径及给药方法没有特殊限制。本发明的组合物的给药途径可以为公知的抗体给药方法，例如，通过静脉、腹膜、颅内、皮下、肌肉、眼内、动脉内、脑脊液或病灶内的注射或输注，或者通过下述记载的缓释(sustained release)系统注射或输注。例如，本发明的抗体可全身给药或局部给药。
为了预防或治疗癌症，本发明的药学组合物可单独使用，或者与手术、激素治疗、化学治疗及使用生物反应控制剂的方法结合使用。
为了预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病，本发明的药学组合物可单独使用，或者与手术、激素治疗、化学治疗及使用生物反应控制剂的方法结合使用。
可通过检测生物样品中的KRS蛋白质(尤其，暴露于细胞外的KRS N末端区域)评估根据本发明的癌症(或癌症转移)的诊断及预后，且可通过检测生物样品中的KRS蛋白质(尤其，暴露于细胞外的KRS N末端区域)评估根据本发明的免疫细胞迁移相关疾病的诊断及预后。
如本发明所用，术语“诊断”是指确认病理状态的存在或特征。在本发明中，上述诊断用于确认癌症或/和癌症转移或免疫细胞迁移相关疾病的发生活可能性(风险)。术语“检测”如上所述，并且所述生物样品包括血液及源于生物的其他液体试样、活检标本、固体组织样品(例如组织培养物)或来源于此的细胞。更具体地，生物样品的实例可包括但不限于组织、提取物、细胞裂解物、全血、血浆、血清、唾液、眼内液、脑脊液、汗液、尿液、乳、腹水液、滑液、腹膜液。上述样品可从动物获取，优选地，可从哺乳动物获取，最优选地，可从人获取。上述样品可在用于检测之前进行预处理。所述预处理的实例可包括过滤、蒸馏、萃取、浓缩、干扰成分失活、试剂添加等。此外，可从上述样品分离核酸及蛋白质来用于检测。
根据本发明的抗体或其片段可作为诊断试剂盒提供，上述试剂盒只要是在本领域作为提供具有抗体或特定结合域的肽作为成分的试剂盒，则其种类没有特殊限制，并且其实例包括用于蛋白质印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定、放射免疫扩散法、Ouchterlony免疫扩散法、火箭免疫电泳、免疫组织化学、免疫沉淀试验、补体固定试验、FACS或蛋白质芯片用试剂盒等。
本发明的抗体或其片段可在试剂盒中使用，即，以预定量的试剂与用于进行诊断测定的说明书的包装的组合。在抗体被酶标记的情况下，所述试剂盒可包含酶所需的底物和辅因子(cofactor)(例如，提供发色团或荧光团的底物前体)。另外，可包含其他添加剂，如稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量能够大幅度变化以提供试剂的溶液内浓度，这实质上优化了测定的灵敏度。所述试剂可作为干燥粉末提供，通常冻干，包含溶解时提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
本发明提供本发明所述的抗体或其片段在制备用于抑制癌症转移的制剂中的用途。
本发明提供在有需要的受试者中抑制癌症转移的方法，所述的方法包括以有效抑制癌症转移的量向所述的受试者给药本发明所述的抗体或其片段。
本发明提供本发明所述的抗体或其片段在用于制备用于诊断癌症的制剂中的用途。
本发明提供在有需要的受试者中诊断癌症的方法，所述的方法包括以有效诊断癌症的量向所述受试者给药本发明所述的抗体或其片段。
本发明提供本发明所述的抗体或其片段在用于制备用于治疗免疫细胞迁移相关疾病的制剂中的用途。
本发明提供治疗有需要的受试者中的免疫细胞迁移相关疾病的方法，所述方法包括以有效治疗免疫细胞迁移相关疾病的量向所述受试者给药本发明所述的抗体或其片段。
如本发明所用，术语“有效量”是指显示出减轻、治疗、预防、检测或诊断癌症的效果或抑制或减少癌症转移的效果的量，是指显示出减轻、治疗、预防、检测或诊断免疫细胞迁移相关疾病效果的量。术语“受试者”可以为动物，优选地，可以为哺乳动物，尤其是包括人类的动物，还可以为来源于动物的细胞、组织、器官等。所述受试者可以为需要上述效果的患者(patient)。
如本发明所用，术语“治疗”广泛地指改善癌症、癌症相关疾病、与免疫细胞迁移有关的疾病，可以包括治愈或基本上预防或缓解疾病的状态，可以包括减轻、治愈或预防由癌症或癌症相关疾病引起的一种或大多数症状，但并不限定于此。
如本发明所用，术语“包含(comprising)”与“含有”或“特征在于”同义使用，在组合物或方法中，并不排除未提及的其他成分或步骤。术语“由……组成(consisting of)”是指排除其他未另外指定的要素、步骤或成分。术语“基本上由……组成(essentiallyconsisting of)”是指在组合物或方法的范围内，包括所提及的要素或步骤，并包括对其的基本特性没有实质性影响的任何要素或步骤。
有益效果
根据本发明的抗体或其片段具有在本说明书中记载的特定互补决定区(CDR)，并且与暴露于细胞外膜的KRS N末端区域特异性结合的能力非常优异。此外，根据本发明的抗体或其片段特异性地靶向体内的KRS N末端区域，因此，抑制层粘连蛋白受体与KRS N末端区域的相互作用，从而在抑制癌症转移方面发挥优异的效果，并且能够控制免疫细胞的迁移，从而对于免疫细胞迁移相关疾病的预防、缓解及治疗等具有显著的效果。
附图简要说明
图1显示通过蛋白质印迹法(WB)筛选与KRS全长序列或KRS N末端片段结合的scFv噬菌体克隆(phage clone)的结果。
图2显示通过免疫沉淀法(IP)筛选与KRS全长序列或KRS N末端片段结合的scFv噬菌体克隆的结果。
图3a显示了结果，其中通过myc-KRS T52D[活性突变体(Active mutant)]表达构建具有暴露于细胞外的KRS N末端区域的细胞，并研究了N3、N5、N7及N9的scFv克隆(clone)是否与上述暴露区域结合(KRS：是指myc-KRS T52D)。
图3b显示在非活性突变体(Inactive mutant)(myc-KRS T52A)或WT-KRS(lamininuntreated)表达组中，经N3、N5、N7及N9 scFv克隆处理后，由于KRS N末端没有暴露于细胞膜上，未观察到任何检测信号。
图3c显示当用层粘连蛋白处理标记有myc的WT-KRS、T52D、T52A的细胞，并进行scFv染色时，在在层粘连蛋白处理的WT-KRS和T52D突变体(mutant)的膜定位(membranelocalization)的相似的位点观察到染色，转化的myc也在相同的位置染色，但是T52A中未被染色(scFv：绿色，myc：红色)。
图4显示用全长(Full length)KRS(由F表示，SEQ ID NO:76)、一个在N末端1～71位氨基酸缺失的KRS片段(用1表示)及由N-末端的第1～200个氨基酸残基组成的KRS片段(由2表示)，证实N3、N5、N7及N9 scFv克隆是否特异性结合于KRS N末端的蛋白质印迹结果。
图5a显示证实代表本发明抗体的N3 IgG和N5 IgG的KRS的结合能力的蛋白质印迹结果。
图5b显示证实代表本发明抗体的N3 IgG及N5 IgG的KRS的结合能力的免疫沉淀结果。
图6a显示证实N3 IgG的KRS N末端结合能力的结果。
图6b显示证实N5 IgG的KRS N末端结合能力的结果。
图7a显示通过免疫荧光染色法，将转化表达WT-KRS的细胞用层粘连蛋白处理，使KRS N末端区域暴露于细胞外后，处理本发明的抗体N3 IgG，来研究N3 IgG对于上述暴露区域的结合的结果。
图7b显示通过免疫荧光染色法，通过T52D-KRS[(活性突变体(active mutant)，myc标记的KRS(myc tagged KRS)]表达构建细胞外暴露KRS N末端区域的细胞，然后处理本发明的抗体N3 IgG，来研究对于上述暴露区域的结合的结果。通过向细胞膜传递渗透性的实验中也证实，本发明的抗体易位进入细胞内部并可与存在于细胞内部的KRS蛋白质结合。
图7c显示通过免疫荧光染色法，将转化表达WT-KRS的细胞用层粘连蛋白处理，使KRS N末端区域暴露于细胞外后，处理本发明的抗体N5 IgG，来研究N5 IgG对于上述暴露区域的结合的结果(N5 IgG：绿色)。
图8显示通过MTT试验(MTT assay)确认本发明的抗体N3 IgG没有细胞毒性的结果。
图9a显示通过本发明的抗体N3 IgG处理确认细胞迁移(cell migration)被抑制的结果。
图9b显示确认本发明的抗体N3 IgG以剂量依赖的方式显著抑制细胞迁移(cellmigration)的结果。
图10以图示化的方式显示在利用体内癌症转移模型的实验中，构建小鼠癌症转移模型、给药治疗物质(抗体或YH16899)及观察小鼠模型中的肺转移的实验日程。
图11显示了小鼠肺标本，其能够证实在体内癌症转移模型中，通过给药本发明的抗体N3 IgG，癌症的肺转移被显著抑制。可通过在肺标本中产生的结节的数量及状态来评价癌症转移的进展情况及严重程度。
图12显示在体内癌症转移模型中，证实通过给药本发明的抗体N3 IgG，相比于对照组，肺结节的生成被显著抑制(即，癌症的肺转移被显著抑制)的结果。
图13比较显示了对照组和N3 IgG的治疗组中的肺组织，并证实了相比于本发明的抗体治疗组，在对照组中的转移的结节部位中表达了大量的层粘连蛋白受体。
图14分别显示对照组、YH16899治疗组、N3 IgG的治疗组中的肺标本，显示相比于对照组，YH16899治疗组及N3 IgG的治疗组中的肺结节的生成被显著抑制的结果。
图15显示在YH16899治疗组、N3 IgG的治疗组中，根据上述癌症转移抑制剂物质的处理浓度的肺转移抑制效率(肺结节生成抑制效率)。
图16显示定量确认N3 IgG与人(human，h)KRS N末端的肽片段(F1、F2、F3、F4、F5)的结合力的SPR结果(序列下方的灰色条表示相应区域(F1至F5)的N3抗体的结合能力，条的颜色越深表示结合强度越高)。
图17显示定量确认N3 IgG与人(human，h)、小鼠(mouse，m)、大鼠(rat，r)KRS N末端的肽片段(F1、F3、F5)的结合力的SPR结果[序列下方的灰色条表示相应区域(F1至F5)的N3抗体的结合能力，条的颜色越深表示结合强度越高]。
图18a显示通过转板迁移测定法(transwell migration assay)，比较胶原(collagen)、纤连蛋白(fibronectin)及层粘连蛋白(laminin)对于免疫细胞(单核细胞/巨噬细胞)迁移的影响结果，并提供了迁移细胞(migrating cell)的显微镜图像。
图18b为在图18a的显微镜图像上测定(定量)的细胞计数的图。
图19a为通过转板迁移测定法，比较各种层粘连蛋白亚型(LN111、LN211、LN221、LN411、LN421、LN511、LN521)对免疫细胞(单核细胞/巨噬细胞)迁移的影响的结果，并提供了迁移细胞的显微镜图像。
图19b为在图19a的显微镜图像上测定(定量)的细胞计数的图。
图19c显示通过蛋白质印迹法，证实通过LN421处理在单核细胞/巨噬细胞膜中的KRS增加的结果。
图20a为通过转板迁移测定法，比较本发明的抗体N3 IgG对LN421特异性单核细胞/巨噬细胞迁移的抑制作用的结果，并提供了迁移细胞的显微镜图像。
图20b显示在图20a的显微镜图像上测定(定量)细胞计数的图。
图20c显示通过蛋白质印迹法，证实通过LN421处理在单核细胞/巨噬细胞膜中增加的KRS水平被本发明的抗体N3 IgG处理减少的结果。
图21a显示在肺动脉高压(PAH)模型中，通过给药本发明的抗体N3 IgG，右心室收缩压(right ventricular end-systolic pressure；RVESP)发生变化[Mock IgG：阴性对照组，Ab 1mpk：N3抗体1mpk，Ab 10mpk：N3抗体10mpk，西地那非(sildenafil)：阳性对照组]。
图21b显示在肺动脉高压(PAH)模型中，通过给药本发明的抗体N3 IgG，左心室收缩末压(left ventricular end-systolic pressure；LVESP)发生变化[Mock IgG：阴性对照组，Ab 1mpk：N3 IgG 1mpk，Ab 10mpk：N3 IgG 10mpk，西地那非(sildenafil)：阳性对照组]。
图22显示IHC染色结果，其证实在肺动脉高压(PAH)模型中，通过给药本发明的抗体N3 IgG减少免疫细胞迁移及浸润。
具体实施方式
以下，将详细说明本发明。
但是，下述实施例仅用于举例说明本发明，并非旨在限制本发明的范围。
实施例1
scFv文库(library)筛选
1-1.筛选scFv噬菌体(phage)_第一次筛选
为了筛选当KRS全长序列(SEQ ID NO:76)中的KRS通过层粘连蛋白信号向细胞膜迁移时，仅与暴露于细胞外的KRS N末端(SEQ ID NO:75)区域特异性结合的scFv，使用衍生自HA标记(HAtag)的人的B细胞的scFv噬菌体文库进行噬菌体展示淘选(phage displaypanning)。在本实验中使用的scFv展示(display)噬菌体文库(Library size：app.7.6×109Library produced by prof.Hyunbo Shim)公开于韩国授权专利10-0961392号。如下述表1所示，将KRS全长序列及具有N末端特定不同区域的KRS片段用作用于噬菌体显示淘选实验的抗原蛋白质。
向包含1ml的1×磷酸盐缓冲液(PBS)的免疫(Immuno)管添加1～10μg的抗原蛋白质，在37℃的温度、200rpm条件下，孵育1个小时，从而在管内侧的表面包被抗原。倒出抗原溶液，并利用自来水清洗一次以去除未包被的抗原。为了防止抗原蛋白质与噬菌体(phage)之间的非特异性结合，将免疫管和scFv文库分别与包含3％的脱脂乳的1×磷酸盐吐温缓冲液(包含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液)在室温下孵育1个小时。在免疫管中去除脱脂乳后，添加scFv文库，在37℃的温度条件下，以150rpm反应1个小时，使scFv噬菌体与抗原结合。scFv噬菌体在管中孵育后，利用1×磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗2～5次，以去除未结合的scFv噬菌体。
在常温条件下添加1ml的三乙胺(triethylamine)(100mM)来在10分钟以内分离与各个KRS抗原特异性结合的scFv噬菌体，并利用Tris(1M，pH 7.4)进行中和。向以OD<1培养的ER2537大肠杆菌(E.coli)添加过滤的噬菌体scFv，随后在37℃的温度条件下，以120rpm孵育1个小时30分钟进行感染。将感染了噬菌体的大肠杆菌离心以部分去除培养上清液后，进行再分散，涂布于包含氨苄青霉素和葡萄糖(2％)的直径为15cm的琼脂糖板。第二天，应用5ml的SB培养基来收集平板中生长的所有细胞，加入甘油(glycerol)(50％)至其体积为整个体积的0.5倍并混合，将混合物分装成1ml，并以-80℃的温度条件保存[scFv淘选原料(stock)]。将上述制备的20μl的原料接种到20ml的SB溶液接种并进行孵育，然后利用辅助噬菌体(helper phage)构建到scFv噬菌体文库(1ml)以用于之后步骤的噬菌体淘选(phagepanning)。将用于分离表达与抗原特异性scFv的噬菌体的上述过程重复2～3次。
1-2.通过ELISA筛选结合特异性scFv抗体_第二次筛选
通过实施间接ELISA来研究了在实施例1-1中筛选的scFv表达的噬菌体是否与上述的KRS全长或N末端片段结合。
稀释通过重复3次淘选(Panning)获取的scFv产物并涂敷于直径10cm的琼脂糖板上。第二天，选择各自的菌落(colony)在含有200μl的SB培养基的96孔板中培养。在检查菌落整体生长良好后，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(1mM)并在30℃的温度条件下培养16小时从而诱导scFv的生成。第二天，对96孔板进行离心分离来分离细胞，之后，通过利用TES溶液裂解细胞，并再次进行离心，仅分离上清液。利用获取的上清液实施间ELISA来筛选了与抗原特异性结合的scFv。分别用KRS全长抗原或N末端片段抗原包被板，与含有scFv的培养上清液孵育，再与二次级抗体抗-HA-HRP抗体[罗氏应用科学(Roche AppliedScience)]孵育。利用四甲基苄亚胺(Tetramethylbenzimidine，TMB)[赛默飞世尔(Thermoscientific)]进行发色反应后，利用H2SO4(1M)终止发色反应，利用酶联免疫检测仪(ELISAreader)在450nm处测定吸光度。对于对照组(空白)[control(blank)]和如上所述的抗原(Ag)同时进行ELISA，仅选择具有正(positive)值的菌落。在1920个进行ELISA的菌落中，有93个被选为阳性(参照表1)。
表1
1-3测序
为了在实施例1-2中通过ELISA筛选(screening)选出93个菌落，对序列(sequence)进行分析，过滤掉具有相同CDR序列的Ab。具体地，测序通过如下的方法进行：培养保有scFv克隆的大肠杆菌后，通过微量制备(miniprep)获得噬菌粒(phagemid)。使用OMP引物(Omp primer)(Hye young Yang,et.al.,2009,Mol.Cells 27,225-235)对噬菌粒进行测序。由此获得的序列通过Bioedit程序用于验证噬菌粒的CDR区的序列。其中，去除具有重复的CDR序列的克隆，来验证各个独立的CDR序列的scFv克隆。
表2
通过测序筛选的重复的CDR序列的抗体的结果，获得了38个具有不同CDR序列的scFv克隆，如表2所示。
1-4.通过蛋白质印迹法(western blot)筛选特异性结合scFv抗体_第三次筛选
通过蛋白质印迹法研究了在实施例1-3中分离的38个scFv克隆是否与KRS特异性结合。
在5ml含有卡那霉素的SB培养基[胰化蛋白胨(Bactotrytone)30g、酵母提取物(yeast extract)20g、MOPS缓冲液10g/L]中培养的上述scFv阳性单菌落克隆，开始进行种子培养(seed culture)，过夜(overnight)培养后，将培养物移到500ml的含有卡那霉素的SB培养基中。当600nm处的OD值约为0.5时，加入1mM IPTG，并在30℃温度条件下过夜孵育，从而在大肠菌的周质(periplasm)表达scFv蛋白质。第二天，将通过离心分析获取的大肠菌在1×TES缓冲液(TES buffer)[50mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mM的乙二胺四乙酸、20％蔗糖(Sucrose)、pH 8.0]进行悬浮后，添加1.5倍的0.2×TES并混合，然后进行离心分离来获取上清液，从而提取周质。
最后，向从周质提取的scFv抗体中添加5mM MgSO4，将所得材料与事先用磷酸盐缓冲液平衡的Ni-NTA珠混合，然后在冷藏中搅拌1个小时使抗体与Ni-NTA珠结合。之后，进行亲和层析以利用PBS充分洗去未结合的蛋白质。利用含有5mM咪唑(Imidazole)的缓冲液进一步充分清洗之后，利用200mM的咪唑缓冲液洗脱出结合的scFv抗体。对洗脱的抗体进行透析，并通过电泳检测其纯度。通过BCA分析对蛋白质进行定量，并且记录纯化的抗体的量，然后将一定量的抗体分装，进行冷冻保存。
如上所述，将从周质提取的scFv抗体用于蛋白质印迹法用于研究scFv抗体是否与KRS全长或各自的KRS N末端片段结合。将30μg的HCT116细胞裂解产物(cell lysate)经SDSPAGE电泳后，转移至PVDF膜上，并利用3％脱脂乳(skim milk)进行封闭(blocking)。然后以1.0μg/μl添加的提取的scFv抗体，孵育1个小时。洗脱未结合的scFv抗体，为进行检测，将与抗原结合的scFv反应与连接辣根过氧化物酶(HRP，horseradish peroxidase)的抗(Anti)-HA二次抗体孵育，并在暗室中将ECL试剂用作底物，进行膜敏化(film sensitization)。对敏化的带与标准分子标记进行比较，确定与KRS全长及各自的片段大小相对应的带。
通过进行上述蛋白质印迹法，排除了过于弱的条带[模糊带(faint band))、非特异性条带(non-specific band)[双条带(double band))的scFv克隆。因此，选择了13个scFc克隆，这些结果显示于图1。
1-5.通过免疫沉淀法筛选结合特异性scFv抗体_第四次筛选
进行免疫沉淀(immunoprecipitation)以研究在实施例1-4中筛选的scFv克隆是否与天然(native)KRS结合(binding)。使纯化的scFv克隆与HCT116细胞裂解产物进行Ag-Ab结合反应，并利用scFv的HA-标签进行免疫沉淀。
具体地，利用包含150mM的NaCl、0.5％Triton X-100、0.1％SDS及蛋白酶抑制剂的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4，裂解缓冲液)裂解HCT116细胞。将每种scFv(5μg)添加到500μg的HCT116细胞裂解产物中，然后在4℃的温度条件下孵育过夜。添加30μl的抗-HA琼脂糖珠(agarose bead)后，在4℃的温度条件下孵育4个小时。通过离心去除上清液。在SDS样品缓冲液中溶解通过上述方式获取的沉淀物，并煮沸7分钟。重复两次溶解和煮沸的过程。
将通过上述的过程制备的每种免疫沉淀样品通过SDS PAGE电泳后，转移至PVDF膜上并利用3％脱脂乳进行封闭。之后添加KRS多克隆抗体(polyclonal antibody)[兔(rabbit)，Neomics，Co.Ltd.#NMS-01-0005]孵育1个小时。洗去未结合的抗体后，添加抗兔(anti-rabbit)二次抗体[赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，#31460]，然后孵育。与二次抗体一起孵育后，在暗室中使用ECL试剂作为底物进行膜敏化。对敏化的带与标准分子标记进行比较，以确定与KRS全长及各个的片段大小相对应的带。
因此，选择了12个scFc克隆，在图2示出其结果。
1-6.通过免疫荧光法筛选结合特异性scFv抗体_第五次筛选
为了研究在上述实施例1-5中筛选的scFv克隆是否与暴露于细胞膜的KRS N末端区域结合，进行了免疫荧光染色(immunofluorescence)。为了产生KRS暴露在细胞膜的现象，使用了KRS-T52D突变体(活性突变体)。具体地，将A549细胞接种玻璃盖玻片(glasscoverslip)后(1×105细胞，基于12孔板)，24小时之后，分别使myc-KRS WT/myc-KRS T52D(活性突变体)/myc-KRS T52A(非活性突变体)过表达。在培养24个小时之后，利用无血清培养基(RPMI 1640 media)在37℃的温度条件下培养1个小时。之后，将细胞用10μg/ml的层粘连蛋白(L2020；Sigma)处理，然后在37℃的温度条件下孵育1个小时。使用pcDNA3-myc-KRSWT载体作为主链(backbone)通过定点突变[QuikChangeⅡ定点突变试剂盒(Site-DirectedMutagenesis kit)，安捷伦科技有限公司(Agilent)，#200523]构建myc-KRS T52D(活性突变体)及myc-KRS T52A(非活性突变体)载体。
利用PBS(4℃)清洗上述准备的样品后，用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)固定10分钟，然后洗涤。使用CAS封闭10分钟，使用scFv及Myc抗体处理2小时。之后，将未结合的抗体洗掉，并与二次抗体在暗室孵育1个小时。挂载前，进行10分钟的DAPI染色。
如图3所示，实验结果表明，总共筛选了4个(N3、N5、N7及N9)不与非活性突变体(T52A)和WT-KRS(未用层粘连蛋白处理)(laminin untreated)结合并仅与活性突变体的细胞结合的scFv克隆。当进行层粘连蛋白处理以诱导WT-KRS的膜定位，以及对scFv进行染色时，在WT-KRS和T52D突变体中观察到相似的染色区域。
经确认，这些克隆与细胞的表面(tip)特异性结合。
1-7.验证与KRS N末端的特异性结合能力
为了研究通过实施例1-6最终筛选的scFv克隆(N3、N5、N7及N9)是否实际与KRS N末端结合，使用全长KRS(由F表示，SEQ ID NO:76)、N末端的第1～71个氨基酸缺失的KRS片段(如SEQ ID NO:1所示)及由N末端的第1～200个氨基酸形成的KRS片段(如SEQ ID NO:2所示)进行蛋白质印迹法。
通过上述实施例1-6中记载的方法利用编码全长KRS和KRS片段的多核苷酸转化A549细胞。此后，对细胞进行裂解，并采用与实施例1-4中记载相同的方法进行蛋白质印迹。
如图4所示，结果证实筛选的scFv克隆(N3、N5、N7及N9)仅在具有N末端第1～200位氨基酸的片段中显示带，而在没有N末端1～72位氨基酸的片段1中未显示带。由此，证实scFv N3、N5、N7及N9克隆均与KRS N末端特异性结合。
1-8.KRS N末端结合特异性scFv克隆的序列分析
分析通过上述实施例1-6最终筛选的scFv克隆(N3、N5、N7及N9)的CDR构象及VH和VL序列分析。采用与实施例1-3相同的方法进行测序。
测序结果显示，N3 scFv由如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列形成，在其中间包含SEQ ID NO:65表示的连接子序列。此外，N3的VH由如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列形成，且N3的VL由如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列形成。对N3的VH和VL包含的各个CDR进行测序的结果显示，N3 VH包含如SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、如SEQ ID NO:3所示的重链CDR2及如SEQ ID NO:5所示的重链CDR3，上述N3的VL包括如SEQ ID NO:7所示的轻链CDR1、如SEQID NO:9所示的轻链CDR2及如SEQ ID NO:11所示的轻链CDR3。
N5 scFv由如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列形成，在其中间包含如SEQ ID NO:65所示的连接子序列。此外，N5的VH由如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列形成，且N5的VL由如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列形成。N5 VH包含如SEQ ID NO:13所示的重链CDR1、如SEQ ID NO:15所示的重链CDR2及如SEQ ID NO:17所示的重链CDR3，N5 VL包含如SEQ IDNO:19所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO:21所示的轻链CDR2及如SEQ ID NO:23所示的轻链CDR3。
N7 scFv由如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列形成，在其中间包含SEQ ID NO:65的连接子序列。此外，N7的VH由如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列形成，N7的VL由如SEQ IDNO:59所示的氨基酸序列形成。N7的VH包含如SEQ ID NO:25所示的重链CDR1、如SEQ ID NO:27所示的重链CDR2及如SEQ ID NO:29所示的重链CDR3，N7的VL包含如SEQ ID NO:31所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO:33所示的轻链CDR2及如SEQ ID NO:35所示的轻链CDR3。
N9 scFv由如SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列形成，在其中间包含SEQ ID NO:65的连接子序列。此外，N9的VH由如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列形成，N9的VL由如SEQ IDNO:63所示的氨基酸序列形成。N9的VH包含如SEQ ID NO:37所示的重链CDR1、如SEQ ID NO:39所示的重链CDR2及如SEQ ID NO:41所示的重链CDR3，N9的VL包含如SEQ ID NO:43所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO:45所示的轻链CDR2及如SEQ ID NO:47所示的轻链CDR3。
实施例2
将scFv抗体转换为IgG抗体并特异性评估其特异性结合能力
2-1.scFv抗体转换为IgG
首先，通过PCR从N3、N5、N7及N9噬菌体的基因组中扩增编码scFv的多核苷酸。用于扩增上述scFv抗体VH区域的基因的引物的核苷酸序列如下：正向(Forward)(AGA GAG TGTACA CTC C CA GGC GGC CGA GGT GCA G，SEQ ID NO:93)，反向(Reverse)(CGC CGC TGGGCC CTT GGT GGA GGC TGA GCT CAC GGT GAC CAG，SEQ ID NO:94)。用于扩增scFv抗体的VL区域基因的引物的核苷酸序列如下：正向(AAG CGG CCG CCA CCA TGG GAT GGA GCT GTATCA TCC TCT TCT TGG TAG CAA CAG CTA CAG GTG TAC ACT CCC AGT CTG TGC TGA CTCAG，SEQ ID NO:95)，反向(CGC CGC CGT ACG TAG GAC CGT CAG CTT GGT，SEQ ID NO:96)。
以各个噬菌体DNA(50ng)为模板，利用上述引物(分别为10pmol)在以下条件：95℃/3min；95℃/30sec、60℃/30sec、72℃/30sec、30个循环；72℃/5min下进行PCR，来扩增N3、N5、N7或N9 scFv的VH或VL基因。使用限制性内切酶将PCR产物插入到用于IgG产生的pcDNA3.4载体中。使IgG的重链(heavy chain)和轻链(light chain)的蛋白质在不同的质粒中单独表达。
使在上述步骤中制备的载体在Freestyle 293F细胞共同转化，使得轻链和重链在细胞内同时表达，上述载体包含编码包括scFv的可变区域的IgG(以下，分别称为N3 IgG、N5IgG、N7 IgG、N9 IgG)的轻链和重链DNA。将转化的293F细胞在37℃、8％CO2的条件下培养7天，获得上清液。利用醋酸纤维素滤膜(cellulose acetate membrane filter)[气孔尺寸(pore size)为0.22μm，康宁公司(Corning)]对上清液进行过滤，并使用CaptivATMPriMAB蛋白A柱(protein A column)(Repligen，USA)进行提纯。利用BCA试剂盒(Pierce，23225)测定获取的抗体浓度，利用生物分析仪(Bioanalyzer)[安捷伦2100生物分析仪(Agilent 2100Bioanalyzer)]分析了在还原和非还原条件下生成的IgG抗体蛋白质。
2-2.转换的IgG的KRS结合能力验证_蛋白质印迹法及免疫沉淀法
通过蛋白质印迹法(WB)及免疫沉淀法(IP)验证了对于在上述实施例2-1中制备的IgG的KRS的结合能力。以与在上述实施例1-4中记载的相同的方式进行蛋白质印迹法，以与在上述实施例1-5中记载的相同的方式进行免疫沉淀法。
结果证实：在本发明构建的IgG与KRS结合，图5显示了以N3 IgG及N5 IgG为代表的这种结果。
2-3.验证转换(converted)的IgG的KRS N末端特异性结合能力_SPR
利用Biacore 2000 SPR(Surface Plasmon Resonance；表面等离子体共振)[通用电气医疗集团(GE healthcare)，美国)]生物传感器测定提纯的抗体蛋白质(N3 IgG及N5IgG)和抗原(KRS1-207 aa)的定量结合能力。将KRS固定于传感器芯片(sensor chip)(CM5，GE healthcare，US)后，使用HES缓冲液(10mM的HEPES，pH 7.4，150mM的NaCl、3mM的EDTA、0.005％表面活性剂P20)连续稀释的抗体蛋白质(6.25～100nM)依次以30μl/min的速度流动3分钟，并使1M的NaCl/20mM的NaOH以30μl/min的速度流动3分钟，从而诱导与抗原结合的蛋白质解离。将mock IgG用作对照组。具体实验条件如下；
固定抗原(Immobilized Antigen)：KRS
固定水平(Immobilized level)：185 RU
抗体(Antibody)：N3 IgG、N5 IgG
电泳缓冲液(Running buffer)：HBS-N缓冲液
再生(Regeneration)：2M的NaCl，20mM的NaOH[流速(flow)30μl/min 1min]
表3
Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
N3 IgG 1.09E+05 0.009055 8.34E-08
N5 IgG 3.13E+06 0.003282 1.05E-09
上述表3显示利用Biacore 2000SPR测定N3 IgG、N5 IgG的动力学速率常数和平衡解离常数。利用BIA evaluation ver.3.2软件，通过动力学速率常数(ka及kd)和平衡解离常数(KD)获取了亲和度。图6分别示出N3 IgG、N5 IgG的SPR图表结果。通过图6及表3确认，本发明的N3 IgG、N5 IgG与KRS N末端区域的结合力特异性高。在作为对照组的mock IgG中，没有结合信号(binding signal)。
2-4.验证转换的IgG的KRS N末端特异性结合能力_免疫荧光染色
为了研究在本发明中构建的IgG是否与暴露于细胞膜(cell membrane)上的KRS区域结合，进行了免疫荧光染色(immunofluorescence)。免疫荧光染色采用与实施例1-6最后那个记载的方法相同的方法进行，以N3 IgG和N5 IgG为代表。
如图7a所示，结果证实当通过层粘连蛋白来诱导WT-KRS的膜定位的情况下，N3IgG很好地与暴露于细胞外的KRS N末端区域特异性结合。如图7b所示，在利用T52D-KRS[活性突变体，标记(tagged)有myc的KRS]的实验中，本发明的抗体很好地与暴露于细胞外的KRSN末端部分特异性结合，当实验细胞的通透性增强时，以高灵敏度检测了存在于胞质溶胶中的的KRS蛋白质。在图7c中所示，当用层粘连蛋白来诱导WT-KRS的膜定位时，N5 IgG很好地与暴露于细胞外的KRS N末端区域特异性结合。
由此，证明本发明中提供的抗体与暴露于细胞外的KRS N末端区域的结合特异性高。
实施例3
癌症转移抑制作用的验证
3-1.细胞毒性评价
代表性地，利用N3 IgG进行行MTT试验。将A549细胞(5000个细胞/孔)向96孔板接种并培养。通过使用无血清培养基清洗上述细胞后，以0、50、100、500nM的浓度[在无血清培养基中(in serum free media)]分别处理人(human)mock IgG及N3 IgG。培养24个小时后，分别以50μg/孔添加MTT溶液，并孵育4个小时。去除MTT溶液后，使用100μl的DMSO处理孔，并在570nm中测定吸光度。
如图8所示，实验结果证实本发明的抗体未呈现细胞毒性。
3-2.细胞迁移(cell migration)分析
如现有技术(Park,S.G.et al.,Human lysyl-tRNA synthetase is secreted totrigger pro-inflammatory response,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A102,6356-6361(2005))中记载，利用具有聚碳酸酯膜(8.0μm孔径，Costar)的24-孔Transwell腔室(chamber)测定细胞迁移。在上述Transwell腔室中，利用10μg的层粘连蛋白(在明胶中))包被下孔(lower well)，并通过紫外线(UV)进行干燥。之后，在无血清(serumfree)RPMI培养基悬浮A549细胞后，以每个孔1×105细胞的浓度放入上腔室。用100nM或500nM的N3 IgG或人mock IgG(对照组)处理所述腔室，并孵育24个小时。之后，利用PBS清洗2次，用70％MeOH(在PBS中)处理30分钟。再次利用PBS清洗2次，并用苏木精溶液(Hematoxylin solution)处理30分钟的时间。利用DW清洗上述腔室3次，将腔室内的膜(membrane)剪切并安装于载玻片(slide glass)。
如图9a所示，实验结果显示N3 IgG呈现显著抑制A549细胞迁移的效果。实验结果还表明这种细胞迁移抑制作用具有浓度依赖性(参照图9b)。
3-3.评价体内癌症转移模型中的癌症转移抑制效果
由于KRS可通过与癌症转移相关的67LR促进细胞迁移，因此，使用小鼠乳腺癌4T-1细胞(韩国细胞库)制备了肿瘤(癌症)动物模型，该细胞可在肺中很好地转移。向6只7周龄BALB/cAnCr老鼠(Dooyeol Biotech)的脂肪垫(fat pad)注入4×104个4T1细胞，来构建原位(orthotopic)乳腺癌动物模型。
向乳房脂肪垫(Mammmary Fat pad)中注入癌细胞，10天后(day 10)，从脂肪垫上切除癌组织。1天后(day 11)，每隔3天通过尾静脉静脉注射(tail vein i.v.injection)N3IgG(10mg/kg)，每周2次，共2周(总4次，第11、14、18、21日)的时间，向对照(control)mockIgG(Thermo#31154)给药相同剂量。在所有抗体给药方案完成的一周后，即癌细胞注射后28天后，处死小鼠来获取肺组织。当解剖肺组织时，利用注射器向支气管注入生理盐水，使肺膨胀后采样肺组织，在布安氏液(Bouin’s solution)(Sigma#HT10132)保存24个小时。之后，通过显微镜对肺的每个叶中的转移结节进行计数。
如图11及图12所示，实验结果证实，在对照组中，由于癌症转移，在肺中产生许多结节，而在N3 IgG的治疗组中，这些结节被显著抑制。图13对比显示了对照组和N3IgG的治疗组中的肺组织，并证实相比于本发明的抗体治疗组，在对照组中的转移结节部位中表达了大量层粘连蛋白受体。
3-4.在体内癌症转移模型中，抗癌症转移化合物(YH16899)的功效比较
如在前述文章“Dae Gyu Kim et al.,(2014)”中已知YH16899的化合物通过抑制67LR与KRS相互作用来抑制癌症转移的效果。因此，对YH16899和本发明的抗体N3 IgG的癌症转移抑制功效进行比较。通过与上述实施例3-3相同的方法构建体内肿瘤模型并观察肺转移状态。每天口服给药YH16899100mpk。通过小鼠尾巴以不同的浓度(1mpk、10mpk)静脉注射N3 IgG。
如图14及图15所示，实验结果证实，在N3 IgG治疗组中，肺结节以剂量依赖性方式显著降低，相比于YH16899 100mpk治疗组，仅以1mpk N3 IgG的治疗显著抑制癌症转移。
实施例4
KRS抗体结合位点的验证
4-1.KRS单克隆抗体与人KRS结合的位置
为了研究在上述内容中制备的KRS抗体中，N3 IgG与人KRS的结合位点，以如下的方式实施了表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance)实验。
首先，利用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将N3 IgG抗体固定于安装有S系列(Series S)传感器芯片CM5(GE Healthcare)的Biacore T200(GE Healthcare)上。之后，将记载于下述表4的肽以相应浓度溶解于PBS中，使其流动60秒钟。接着，使PBS流动5分钟。然后，通过Biacore T200 Evaluation软件v2.0(GE Healthcare)分析结合力。
表4
多肽信息
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如图16所示，结果显示N3 IgG与抗原表位F1、F2、F3、F4结合，但不与表位F5结合。并且，与抗原表位F4的结合力最强，与F3、F2、F1的结合能力依次增强。
这些结果证实了N3 IgG抗体的主要结合位点与KRS N末端区域的15～29位氨基酸相对应。
4-2.KRS单克隆抗体与其他物种间的交叉活性(cross activity)
在上述实施例中，验证了作为KRS抗体的N3 IgG与人KRS结合位点，并且为了研究N3 IgG是否与其他种的小鼠(m)、大鼠(r)具有交叉活性，以如下的方式实施了SPR实验。
以与在上述实施例4-1记载相同的实验方法，通过利用胺偶联试剂盒(GEHealthcare)将N3 IgG抗体固定于芯片，将以相应浓度溶解在PBS中的上表4所述的肽流动60秒钟，接着，使PBS流动5分钟。之后，通过Biacore T200 Evaluation软件v2.0(GEHealthcare)分析结合能力。
如图17所示，结果显示N3 IgG抗体与人(h)、小鼠(m)、大鼠(r)的抗原表位F1、F2、F3、F4结合，但不与F5结合。并且，在人、小鼠、大鼠中，抗原表位F3的结合力强于F1(F2、F4数据未图示)。
这些结果可以证实N3 IgG抗体具有物种间交叉活性。
实施例5
验证免疫细胞迁移及浸润中的层粘连蛋白信号的作用
研究了构成血管的几种细胞外基质中的哪些促进单核细胞/巨噬细胞的迁移和浸润。使用胶原蛋白(collagen)、纤连蛋白(fibronectin)及层粘连蛋白(laminin)作为细胞外底物进行转板迁移测定法(transwell migration assay)，具体实验方法如下。将小室(Transwell)(Corning，#3421-5mm)用明胶(gelatin)(0.5mg/ml)包被，然后将RAW 264.7细胞(1×105个细胞/孔)接种(seeding)到顶部腔室(top chamber)。将每种包含层粘连蛋白(层粘连蛋白混合物，Biolamina)、纤连蛋白或胶原蛋白(10μg/ml)的无血清DMEM(SerumFree DMEM)(500μl)分别置于底部腔室(bottom chamber)。24小时后，利用棉签去除存在于膜上侧的非迁移(non-migrating)细胞。底部腔室中的细胞用70％的甲醇(Methanol)处理30分钟固定(fix)，然后利用50％的苏木精(Hematoxylin)染色30分钟。染色后，取出膜并固定于载玻片上，通过高分辨率显微镜观察存在于膜的底表面的迁移细胞并定量。
如图18a及图18b所示，实验结果证实在各种细胞外基质中，层粘连蛋白最强地促进单核细胞/巨噬细胞的迁移。
实施例6
层粘连蛋白亚型(subtype)的免疫细胞迁移及浸润作用
评价了层粘连蛋白亚型对免疫细胞迁移和浸润中的作用。通过与实施例5相同的方法，使用LN111、LN211、LN221、LN411、LN421、LN511、LN521作为各种层粘连蛋白亚型蛋白质(购自Biolamina)进行转板迁移测定。上述层粘连蛋白亚型的具体序列可根据形成各个层粘连蛋白亚型的链参照SEQ ID NO:115的α4链、SEQ ID NO:121的α2链、SEQ ID NO:122的α5链、SEQ ID NO:117的β2链、SEQ ID NO:123的β1链、SEQ ID NO:119的γ1链。
将RAW 264.7细胞(2×106个细胞)培养18个小时后，在无血清DMEM培养基(serumfree-DMEM media)中用每种层粘连蛋白亚型(1μg/ml)分别处理后，在0小时、12小时、24小时后获取(harvest)。通过使用蛋白质提取亚细胞蛋白质组提取试剂盒(ProteoExtractSubcellular Proteome Extraction Kit)(Calbiotech，cat#539790)将RAW 264.7细胞蛋白(cell protein)分离为胞质溶胶和膜组分(membrane fraction)。对获取的蛋白质进行电泳后，转移至PVDF膜(Milipore)并利用3％的脱脂乳封闭。之后，添加KRS多克隆抗体(polyclonal antibody)(兔，Neomics，Co.Ltd.#NMS-01-0005)，然后孵育1个小时。去除未结合的抗体，并添加抗-兔二次抗体[赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，#31460]，然后进行孵育。在与二次抗体进行孵育后，在暗室中使用ECL试剂作为底物进行膜敏化。对敏化的带与标准分子标记进行比较，以确定与KRS的大小相对应的带。将Na+/K+ATPase(Abcam)和微管蛋白(tubulin)(Sigma)抗体分别用于质膜(plasma membrane)和胞质溶胶鉴定。
如图19a及图19b所示，实验结果证实在所有测试的层粘连蛋白亚型中，单核细胞/巨噬细胞通过对α4β2γ1亚型(LN421)的特异性反应而迁移。即，证实了单核细胞/巨噬细胞特异性响应LN421而迁移及浸润。并且，如图19c所示，已证实用LN421处理单核细胞/巨噬细胞增加了细胞膜区域中检测到的KRS的量，但部分减少了胞质溶胶(cytosol)区域检测到的KRS的量。这些结果表明，在单核/巨噬细胞内表达后普遍存在于胞质溶胶区域的KRS，经LN421处理后转移到细胞膜区域，而免疫细胞膜区域中KRS的增加对应于与免疫细胞迁移及浸润相关疾病中的重要病理现象。
实施例7
制备用于降低细胞膜KRS水平的抗体及免疫细胞迁移/浸润控制作用的验证
在上述实施例1中制备的抗体中，代表性地利用N3 IgG抗体来研究对免疫细胞迁移及浸润的影响。具体实验方法如下。利用明胶(0.5mg/ml)涂敷小室(Transwell)(Corning，#3421-5mm)后，然后将RAW 264.7细胞(1×105个细胞/孔)接种到顶部腔室中。将包含层粘连蛋白421(1μg/ml)的无血清DMEM(Serum Free DMEM)(500μl)置于底部腔室中。用每种抗体以100nM浓度处理顶部腔室。24小时后，利用70％甲醇固定30分钟后，利用50％的苏木精染色30分钟。利用棉签去除存在于膜上侧的非迁移细胞后，取出膜并将其安装于载玻片。通过高分辨率显微镜观察存在于膜的底表面的迁移细胞(图20a)，并在获取的图像中测定细胞数并以图表显示(图20b)。
处理用层粘连蛋白421(1μg/ml)和抗体(100nM)处理RAW264.7细胞并孵育24个小时后收获。此后，使用蛋白质提取亚细胞蛋白质组提取试剂盒(Calbiochem)将收获物分离为膜与胞质溶胶、进行采样，然后对KRS进行蛋白质印迹。具体方法与在实施例6中记载的方法相同。
如图20a及图20b所示，实验结果证实本发明的抗体有效地特异性抑制LN421依赖性单核细胞/巨噬细胞迁移。如图20c所示，LN421处理增加了单核细胞/巨噬细胞细胞膜的KRS水平，并且通过N3 IgG抗体处理，有效地降低了细胞膜中的KRS水平。
这些结果证实本发明的抗体具有作为与免疫细胞(如单核细胞/巨噬细胞的)迁移相关的疾病的新治疗剂的可能性。
实施例8
免疫细胞迁移相关疾病的体内模型中的作用验证
如上述实施例，在本发明的抗体中，代表性地，利用N3 IgG抗体实施如下的实验。
试验方法
1.构建肺动脉高压(PAH)模型及测验物质的给药
为了在7周龄的SD大鼠(Orientbio Inc.)中诱发肺动脉高压，皮下注射60mpk的野百合碱(MCT)。之后，将大鼠分为4个组(每组5只)，在3周内分别给药1mpk的Mock人IgG(赛默飞世尔科技，阴性对照组)、1mpk的N3 IgG、10mpk的N3 IgG、25mpk的西地那非(sildenafil)(阳性对照组)。所有抗体以1周2次的频率静脉注射，西地那非以1日1次的频率口服给药。
2.测定血流及血压
3周后，利用异氟烷(isoflurane)麻醉大鼠，利用高精度气动测量系统(MPVS心血管压力和容量系统，型号名称：MPVS Ultra，制造商：Millar Instruments)测定血流量和压力。利用专用导管(Mikro-Tip大鼠压力导管，制造商：Millar Instruments)测定右心室收缩末压(RVESP)及右心室舒张末压、左心室收缩末压及左心室舒张末压。利用血管周围(perivascular)超声流探头(TransonicFlowprobes，制造商：Millar Instruments)测定心输出量，并且其实验方法通过与下述文献中记载的相同方法进行：Pacher P,Nagayama T,Mukhopadhyay P,Batkai S,Kass DA.Measurement of cardiac function usingpressure-volume conductance catheter technique in mice and rats.Nat Protoc2008；3(9):1422-34.。
3.免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC)
按照常规步骤，将收集的肺固定于多聚甲醛(PFA，paraformaldehyde)中，然后经过洗涤、脱水、清洗后进行石蜡浸润包埋。将大鼠的肺组织石蜡块显微切片至6μm的厚度，并制备载玻片。之后，以如下的方式进行染色。样品首先用二甲苯(xylene)处理5分钟3次，用100％乙醇、95％乙醇、90％乙醇、70％乙醇、DW依次处理2分钟，然后用PBS清洗5分钟。经0.3％的H2O2处理后，利用PBS洗涤样品2次每次5分钟。将样品浸泡在0.01M的柠檬酸盐缓冲剂(citrate buffer)中，加热，并用PBS-T(0.03％的吐温20)清洗。之后，在室温条件下封闭[2％牛血清白蛋白(BSA)&2％PBS山羊血清(goat serum in PBS)]30分钟。将样品在4℃下用抗-CD68抗体(1:200，ED1克隆，Abcam)过夜染色。利用PBS-T清洗3次每次5分钟，然后用聚合物-HRP抗鼠EnVision试剂盒(DAKO)在4℃的温度条件下处理1个小时。利用PBS-T清洗3次后，然后通过DAB底物缓冲液及DAB色原20处理来显色。染过的组织用梅氏苏木精(Mayershematoxylin)(Sigma)处理1分钟，然后依次用70％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、100％乙醇处理2次，每次2分钟。最后，将组织用二甲苯处理3次，每次5分钟，然后在光学显微镜下观察。
实验结果
8-1.验证血压及心输出量变化
PAH是一种免疫细胞的浸润与病理现象的密切相关的疾病，用N3 IgG抗体(1mpk或10mpk)处理其模型(静脉注射，1周2次)3周，测定右心室收缩末压(right ventricularend-systolic pressure；RVESP)、右心室舒张末压(right ventricular end-diastolicpressure；RVEDP)、左心室收缩末压(left ventricular end-systolic pressure；LVESP)左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure；LVEDP)及心输出量(cardiac output；CO)，在表5中示出结果。
表5
(MCT+mock IgG治疗组的一只动物在麻醉期间死亡，西地那非治疗组的一只动物在手术过程中死亡，因此，未测定其CO)。
在肺动脉高压中，由于肺动脉变窄，使右心室末端压力上升，最终导致右心室衰竭。另外，由于持续的高血压，其奖赏机制受损，则导致右心室肥大，随后右心室扩张。这导致室间隔迁移引起的左心室的压迫，导致左心室的收缩末期容量及心输出量的减少(WooSeok Lee,et al.,Clinical Characteristics and Prognostic Factors ofPatients with Severe Pulmonary Hypertension,Korean Circulation J 2007；37:265-270)。最终，肺动脉高压主要与右心室相关，但是还与左心室的功能相关。
PAH患者显示RVESP增加，这在本实验的PAH模型中也观察到。对此，如图21a所示，N3抗体在两种浓度下均显著降低RVESP，并且比阳性对照组药物西地那非更有利地降低RVESP。
另外，未观察到由于给药N3 IgG抗体而导致的左心室收缩末压(LVESP)降低，而是如图21b所示，在给药本发明的抗体的组中，，LVESP显著增加。因此，本发明的抗体与西地那非用作现有的肺动脉高压的治疗剂相反，其中西地那非引起肺动脉扩张和全身动脉扩张，从而具有降低全身性血压(systemic blood pressure)的风险。
即，证实了相比于西地那非，本发明的抗体显示出对全身性动脉压(systemicartery pressure)的影响低的趋势，并且考虑到在临床现场中给药西地那非时具有诱发低血压的风险，这种效果将认为是治疗药剂的有利特性。不仅如此，严重的肺动脉高血压可导致收缩期右心室衰竭(systolic RV failure)，并可伴有低心输出量(cardiac output)及全身性低血压(systemic hypotension)。
然而，通过借助本发明的抗体使肺动脉高压好转的治疗有望增加心输出量(cardiac output)和全身性血压(systemic blood pressure)生成，由此，可预计血压正常化的效果。
综上所述，证明给药本发明的抗体可降低现有治疗药物的副作用风险，并显示PAH症状缓解和治疗的效果。
8-2.心脏超声波检查(Echocardiography)
分别在MCT单独给药组(即，受试物非给药PAH模型)的3只动物、MCT+西地那非给药组的3只动物中观察到表明右心室压力超负荷的D形左心室(D-shaped left ventricle)，但在治疗抗体给药组中未观察到上述征象。
不仅如此，如下述表6所示，各组的体重增加程度相似，没有显著差异。即，未观察到表明由于给药治疗抗体引起的异常征兆，包括异常体重减轻。
表6
8-3.单核细胞/巨噬细胞迁移及浸润程度的验证
通过使用每个实验组的肺组织，对作为单核细胞/巨噬细胞标记的CD68进行IHC染色。如图22所示，实验结果证实本发明的N3 IgG抗体治疗组明显降低单核细胞/巨噬细胞的肺组织浸润，且这种效果明显优于西地那非。
工业实用性
如上所述，根据本发明的抗体或其片段具有本说明书定义的特定CDR(互补决定区)序列，与暴露于细胞外的KRS N末端区域特异性结合的能力非常优异，因此，可用于诊断已知伴随KRS的特异性形态的疾病(例如，癌症)。此外，根据本发明的抗体或其片段也特异性地靶向体内KRS N末端区域，因此抑制层粘连蛋白受体与KRS N末端区域的相互作用，从而对癌症转移发挥了出色的抑制作用，因此，可用作治疗剂。此外，根据本发明的抗体或其片段可控制免疫细胞的迁移，因此可以非常有利地用于预防、改善及治疗与免疫细胞迁移有关的疾病，因此，具有很高的工业实用性。
<110> 医药生命融合研究团
<120> 与暴露于细胞膜上的赖氨酰-tRNA合成酶N末端区域特异性结合的抗体
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85 90 95
Ala Arg Met Ala Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3 VH
<400> 50
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttatg ataatggtaa tacatattac 180
gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagaatggcg 300
cttgatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348
<210> 51
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3 VL
<400> 51
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 52
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3 VL
<400> 52
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattatg tcacctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gataatagta atcggccaag cggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct tcttgggatg atagcctgag tgcttatgtc 300
ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330
<210> 53
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N5 VH
<400> 53
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Gly Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N5 VH
<400> 54
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaaag ggctggagtg ggtctcatgg atctattctg gtagtggtaa taaatattac 180
gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatgggt 300
ttggatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348
<210> 55
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N5 VL
<400> 55
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 56
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N5 VL
<400> 56
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgtactg gctcttcatc taatattggc aataattatg tctcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gatgataatc agcggccaag cggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt acttgggatg atagcctgag tgcttatgtc 300
ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330
<210> 57
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N7 VH
<400> 57
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Gly Thr Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ala Arg Pro Pro Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N7 VH
<400> 58
gaggtgcagc tgttggagtc ggggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattattata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctattctg gtactggtag tatatattac 180
gctgattctg tagaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagacctccg 300
tatcatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348
<210> 59
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N7 VL
<400> 59
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 60
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N7 VL
<400> 60
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattatg tcacctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta atcggccaag cggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggacg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatt atagcctgag tggttatgtc 300
ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330
<210> 61
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N9 VH
<400> 61
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ala Arg Glu Thr Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N9 VH
<400> 62
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatgg atctattctg gtgatagtag taaatattac 180
gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagagagacg 300
cggacgttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348
<210> 63
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N9 VL
<400> 63
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Phe Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 64
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N9 VL
<400> 64
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgtactg gctcttcatt taatattggc agtaatgctg tctactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tataatagtc agcggccaag cggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtggc tcttgggatg ctagcctgag tggttatgtc 300
ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于scFv的连接子
<400> 65
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 66
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于scFv的连接子
<400> 66
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggatcc ggcggtggcg gatcg 45
<210> 67
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3 scFv (VH+linker+VL)
<400> 67
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ala Arg Met Ala Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
130 135 140
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile
145 150 155 160
Gly Ser Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
195 200 205
Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp
210 215 220
Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu
<210> 68
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3 scFv (VH+连接子+VL)
<400> 68
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttatg ataatggtaa tacatattac 180
gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagaatggcg 300
cttgatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagg tggaggcggt 360
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gcttcttggg atgatagcct gagtgcttat gtcttcggcg gaggcaccaa gctgacggtc 720
cta 723
<210> 69
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N5 scFv (VH+连接子+VL)
<400> 69
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Gly Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
130 135 140
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile
145 150 155 160
Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
195 200 205
Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp
210 215 220
Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu
<210> 70
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N5 scFv (VH+连接子+VL)
<400> 70
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaaag ggctggagtg ggtctcatgg atctattctg gtagtggtaa taaatattac 180
gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatgggt 300
ttggatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagg tggaggcggt 360
tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgcagtctg tgctgactca gccaccctca 420
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acctcagcct ccctggccat cagtgggctc cggtccgagg atgaggctga ttattactgt 660
ggtacttggg atgatagcct gagtgcttat gtcttcggcg gaggcaccaa gctgacggtc 720
cta 723
<210> 71
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N7 scFv (VH+连接子+VL)
<400> 71
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Gly Thr Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ala Arg Pro Pro Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
130 135 140
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile
145 150 155 160
Gly Ser Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
195 200 205
Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp
210 215 220
Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu
<210> 72
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N7 scFv (VH+连接子+VL)
<400> 72
gaggtgcagc tgttggagtc ggggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattattata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctattctg gtactggtag tatatattac 180
gctgattctg tagaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagacctccg 300
tatcatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagg tggaggcggt 360
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gcgtctggga cccccgggca gagggtcacc atctcttgta ctggctcttc atctaatatt 480
ggcagtaatt atgtcacctg gtaccagcag ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc 540
tatgctgata gtaatcggcc aagcggggtc cctgaccgat tctctggctc caagtctggc 600
acctcagcct ccctggccat cagtgggctc cggtccgagg acgaggctga ttattactgt 660
ggtgcttggg attatagcct gagtggttat gtcttcggcg gaggcaccaa gctgacggtc 720
cta 723
<210> 73
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N9 scFv (VH+连接子+VL)
<400> 73
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ala Arg Glu Thr Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
130 135 140
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Phe Asn Ile
145 150 155 160
Gly Ser Asn Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
195 200 205
Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp
210 215 220
Ala Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu
<210> 74
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N9 scFv (VH+连接子+VL)
<400> 74
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatgg atctattctg gtgatagtag taaatattac 180
gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagagagacg 300
cggacgttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagg tggaggcggt 360
tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgcagtctg tgctgactca gccaccctca 420
gcgtctggga cccccgggca gagggtcacc atctcttgta ctggctcttc atttaatatt 480
ggcagtaatg ctgtctactg gtaccagcag ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc 540
tattataata gtcagcggcc aagcggggtc cctgaccgat tctctggctc caagtctggc 600
acctcagcct ccctggccat cagtgggctc cggtccgagg atgaggctga ttattactgt 660
ggctcttggg atgctagcct gagtggttat gtcttcggcg gaggcaccaa gctgacggtc 720
cta 723
<210> 75
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 暴露于膜上的赖氨酰tRNA合成酶N端
<400> 75
Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro
1 5 10 15
Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys
20 25 30
Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Ser Gln Ala Thr
50
<210> 76
<211> 597
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 赖氨酰tRNA合成酶(KRS)全长
<400> 76
Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro
1 5 10 15
Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys
20 25 30
Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val
50 55 60
Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val Asp Pro Asn Gln Tyr Tyr Lys Ile Arg
65 70 75 80
Ser Gln Ala Ile His Gln Leu Lys Val Asn Gly Glu Asp Pro Tyr Pro
85 90 95
His Lys Phe His Val Asp Ile Ser Leu Thr Asp Phe Ile Gln Lys Tyr
100 105 110
Ser His Leu Gln Pro Gly Asp His Leu Thr Asp Ile Thr Leu Lys Val
115 120 125
Ala Gly Arg Ile His Ala Lys Arg Ala Ser Gly Gly Lys Leu Ile Phe
130 135 140
Tyr Asp Leu Arg Gly Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Met Ala Asn Ser
145 150 155 160
Arg Asn Tyr Lys Ser Glu Glu Glu Phe Ile His Ile Asn Asn Lys Leu
165 170 175
Arg Arg Gly Asp Ile Ile Gly Val Gln Gly Asn Pro Gly Lys Thr Lys
180 185 190
Lys Gly Glu Leu Ser Ile Ile Pro Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Ser Pro
195 200 205
Cys Leu His Met Leu Pro His Leu His Phe Gly Leu Lys Asp Lys Glu
210 215 220
Thr Arg Tyr Arg Gln Arg Tyr Leu Asp Leu Ile Leu Asn Asp Phe Val
225 230 235 240
Arg Gln Lys Phe Ile Ile Arg Ser Lys Ile Ile Thr Tyr Ile Arg Ser
245 250 255
Phe Leu Asp Glu Leu Gly Phe Leu Glu Ile Glu Thr Pro Met Met Asn
260 265 270
Ile Ile Pro Gly Gly Ala Val Ala Lys Pro Phe Ile Thr Tyr His Asn
275 280 285
Glu Leu Asp Met Asn Leu Tyr Met Arg Ile Ala Pro Glu Leu Tyr His
290 295 300
Lys Met Leu Val Val Gly Gly Ile Asp Arg Val Tyr Glu Ile Gly Arg
305 310 315 320
Gln Phe Arg Asn Glu Gly Ile Asp Leu Thr His Asn Pro Glu Phe Thr
325 330 335
Thr Cys Glu Phe Tyr Met Ala Tyr Ala Asp Tyr His Asp Leu Met Glu
340 345 350
Ile Thr Glu Lys Met Val Ser Gly Met Val Lys His Ile Thr Gly Ser
355 360 365
Tyr Lys Val Thr Tyr His Pro Asp Gly Pro Glu Gly Gln Ala Tyr Asp
370 375 380
Val Asp Phe Thr Pro Pro Phe Arg Arg Ile Asn Met Val Glu Glu Leu
385 390 395 400
Glu Lys Ala Leu Gly Met Lys Leu Pro Glu Thr Asn Leu Phe Glu Thr
405 410 415
Glu Glu Thr Arg Lys Ile Leu Asp Asp Ile Cys Val Ala Lys Ala Val
420 425 430
Glu Cys Pro Pro Pro Arg Thr Thr Ala Arg Leu Leu Asp Lys Leu Val
435 440 445
Gly Glu Phe Leu Glu Val Thr Cys Ile Asn Pro Thr Phe Ile Cys Asp
450 455 460
His Pro Gln Ile Met Ser Pro Leu Ala Lys Trp His Arg Ser Lys Glu
465 470 475 480
Gly Leu Thr Glu Arg Phe Glu Leu Phe Val Met Lys Lys Glu Ile Cys
485 490 495
Asn Ala Tyr Thr Glu Leu Asn Asp Pro Met Arg Gln Arg Gln Leu Phe
500 505 510
Glu Glu Gln Ala Lys Ala Lys Ala Ala Gly Asp Asp Glu Ala Met Phe
515 520 525
Ile Asp Glu Asn Phe Cys Thr Ala Leu Glu Tyr Gly Leu Pro Pro Thr
530 535 540
Ala Gly Trp Gly Met Gly Ile Asp Arg Val Ala Met Phe Leu Thr Asp
545 550 555 560
Ser Asn Asn Ile Lys Glu Val Leu Leu Phe Pro Ala Met Lys Pro Glu
565 570 575
Asp Lys Lys Glu Asn Val Ala Thr Thr Asp Thr Leu Glu Ser Thr Thr
580 585 590
Val Gly Thr Ser Val
595
<210> 77
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3 IgG重链
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ala Arg Met Ala Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 78
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3 IgG重链
<400> 78
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttatg ataatggtaa tacatattac 180
gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagaatggcg 300
cttgatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtataccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtccc cgggtaaa 1338
<210> 79
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3 IgG轻链
<400> 79
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 80
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3 IgG轻链
<400> 80
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattatg tcacctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gataatagta atcggccaag cggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct tcttgggatg atagcctgag tgcttatgtc 300
ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 81
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N5 IgG重链
<400> 81
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Gly Leu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 82
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N5 IgG重链
<400> 82
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaaag ggctggagtg ggtctcatgg atctattctg gtagtggtaa taaatattac 180
gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaatgggt 300
ttggatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtataccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtccc cgggtaaa 1338
<210> 83
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N5 IgG轻链
<400> 83
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 84
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N5 IgG轻链
<400> 84
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgtactg gctcttcatc taatattggc aataattatg tctcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gatgataatc agcggccaag cggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt acttgggatg atagcctgag tgcttatgtc 300
ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 85
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N7 IgG重链
<400> 85
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Gly Thr Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ala Arg Pro Pro Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 86
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N7 IgG重链
<400> 86
gaggtgcagc tgttggagtc ggggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattattata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctattctg gtactggtag tatatattac 180
gctgattctg tagaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagacctccg 300
tatcatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtataccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtccc cgggtaaa 1338
<210> 87
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N7 IgG轻链
<400> 87
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 88
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N7 IgG轻链
<400> 88
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattatg tcacctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagta atcggccaag cggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggacg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatt atagcctgag tggttatgtc 300
ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 89
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N9 IgG重链
<400> 89
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ser
85 90 95
Ala Arg Glu Thr Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 90
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N9 IgG重链
<400> 90
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgata tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatgg atctattctg gtgatagtag taaatattac 180
gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactctgc gagagagacg 300
cggacgttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtataccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtccc cgggtaaa 1338
<210> 91
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N9 IgG轻链
<400> 91
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Phe Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ala Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 92
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N9 IgG轻链
<400> 92
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgtactg gctcttcatt taatattggc agtaatgctg tctactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tataatagtc agcggccaag cggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtggc tcttgggatg ctagcctgag tggttatgtc 300
ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 93
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv VH正向引物
<400> 93
agagagtgta cactcccagg cggccgaggt gcag 34
<210> 94
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv VH反向引物
<400> 94
cgccgctggg cccttggtgg aggctgagct cacggtgacc ag 42
<210> 95
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv VL正向引物
<400> 95
aagcggccgc caccatggga tggagctgta tcatcctctt cttggtagca acagctacag 60
gtgtacactc ccagtctgtg ctgactcag 89
<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv VL反向引物
<400> 96
cgccgccgta cgtaggaccg tcagcttggt 30
<210> 97
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3 Ab的主要结合位点
<400> 97
Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala
1 5 10
<210> 98
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3抗原表位F1
<400> 98
Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro
1 5 10 15
Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala
20 25
<210> 99
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3抗原表位F2
<400> 99
Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys
1 5 10 15
Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala
20 25 30
<210> 100
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3抗原表位F3
<400> 100
Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg
1 5 10 15
Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala
20 25
<210> 101
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3抗原表位F4
<400> 101
Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu
1 5 10 15
Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu
20 25
<210> 102
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N3抗原表位F5
<400> 102
Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys
1 5 10 15
Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser
20 25
<210> 103
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 小鼠N3抗原表位F1(mF1)
<400> 103
Met Ala Thr Leu Gln Glu Ser Glu Val Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys
1 5 10 15
Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala
20 25
<210> 104
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 小鼠N3抗原表位F2(mF2)
<400> 104
Gln Glu Ser Glu Val Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys Leu Ser Lys Asn
1 5 10 15
Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala
20 25
<210> 105
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 小鼠N3抗原表位F3(mF3)
<400> 105
Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg
1 5 10 15
Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala
20 25
<210> 106
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 小鼠N3抗原表位F4(mF4)
<400> 106
Gln Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys
1 5 10 15
Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu
20 25
<210> 107
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 小鼠N3抗原表位F5(mF5)
<400> 107
Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln
1 5 10 15
Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn
20 25
<210> 108
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 大鼠N3抗原表位F1(rF1)
<400> 108
Met Ala Thr Leu Arg Glu Gly Glu Val Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys
1 5 10 15
Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala
20 25
<210> 109
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 大鼠N3抗原表位F2(rF2)
<400> 109
Arg Glu Gly Glu Val Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn
1 5 10 15
Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala
20 25
<210> 110
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 大鼠N3抗原表位F3(rF3)
<400> 110
Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg
1 5 10 15
Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala
20 25
<210> 111
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 大鼠N3抗原表位F4(rF4)
<400> 111
Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys
1 5 10 15
Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu
20 25
<210> 112
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 大鼠N3抗原表位F5(rF5)
<400> 112
Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln
1 5 10 15
Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn
20 25
<210> 113
<211> 48
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 赖氨酰tRNA合成酶N端(小鼠)
<400> 113
Met Ala Thr Leu Gln Glu Ser Glu Val Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys
1 5 10 15
Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu
20 25 30
Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn
35 40 45
<210> 114
<211> 48
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 赖氨酰tRNA合成酶N端(大鼠)
<400> 114
Met Ala Thr Leu Arg Glu Gly Glu Val Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys
1 5 10 15
Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu
20 25 30
Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn
35 40 45
<210> 115
<211> 1823
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 层粘连蛋白亚基α-4（智人）的氨基酸序列
<400> 115
Met Ala Leu Ser Ser Ala Trp Arg Ser Val Leu Pro Leu Trp Leu Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ala Ala Cys Ser Arg Ala Ala Ser Gly Asp Asp Asn Ala Phe
20 25 30
Pro Phe Asp Ile Glu Gly Ser Ser Ala Val Gly Arg Gln Asp Pro Pro
35 40 45
Glu Thr Ser Glu Pro Arg Val Ala Leu Gly Arg Leu Pro Pro Ala Ala
50 55 60
Glu Lys Cys Asn Ala Gly Phe Phe His Thr Leu Ser Gly Glu Cys Val
65 70 75 80
Pro Cys Asp Cys Asn Gly Asn Ser Asn Glu Cys Leu Asp Gly Ser Gly
85 90 95
Tyr Cys Val His Cys Gln Arg Asn Thr Thr Gly Glu His Cys Glu Lys
100 105 110
Cys Leu Asp Gly Tyr Ile Gly Asp Ser Ile Arg Gly Ala Pro Gln Phe
115 120 125
Cys Gln Pro Cys Pro Cys Pro Leu Pro His Leu Ala Asn Phe Ala Glu
130 135 140
Ser Cys Tyr Arg Lys Asn Gly Ala Val Arg Cys Ile Cys Asn Glu Asn
145 150 155 160
Tyr Ala Gly Pro Asn Cys Glu Arg Cys Ala Pro Gly Tyr Tyr Gly Asn
165 170 175
Pro Leu Leu Ile Gly Ser Thr Cys Lys Lys Cys Asp Cys Ser Gly Asn
180 185 190
Ser Asp Pro Asn Leu Ile Phe Glu Asp Cys Asp Glu Val Thr Gly Gln
195 200 205
Cys Arg Asn Cys Leu Arg Asn Thr Thr Gly Phe Lys Cys Glu Arg Cys
210 215 220
Ala Pro Gly Tyr Tyr Gly Asp Ala Arg Ile Ala Lys Asn Cys Ala Val
225 230 235 240
Cys Asn Cys Gly Gly Gly Pro Cys Asp Ser Val Thr Gly Glu Cys Leu
245 250 255
Glu Glu Gly Phe Glu Pro Pro Thr Gly Met Asp Cys Pro Thr Ile Ser
260 265 270
Cys Asp Lys Cys Val Trp Asp Leu Thr Asp Ala Leu Arg Leu Ala Ala
275 280 285
Leu Ser Ile Glu Glu Gly Lys Ser Gly Val Leu Ser Val Ser Ser Gly
290 295 300
Ala Ala Ala His Arg His Val Asn Glu Ile Asn Ala Thr Ile Tyr Leu
305 310 315 320
Leu Lys Thr Lys Leu Ser Glu Arg Glu Asn Gln Tyr Ala Leu Arg Lys
325 330 335
Ile Gln Ile Asn Asn Ala Glu Asn Thr Met Lys Ser Leu Leu Ser Asp
340 345 350
Val Glu Glu Leu Val Glu Lys Glu Asn Gln Ala Ser Arg Lys Gly Gln
355 360 365
Leu Val Gln Lys Glu Ser Met Asp Thr Ile Asn His Ala Ser Gln Leu
370 375 380
Val Glu Gln Ala His Asp Met Arg Asp Lys Ile Gln Glu Ile Asn Asn
385 390 395 400
Lys Met Leu Tyr Tyr Gly Glu Glu His Glu Leu Ser Pro Lys Glu Ile
405 410 415
Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Gln Lys Met Leu Glu Glu Ile Arg Ser
420 425 430
Arg Gln Pro Phe Phe Thr Gln Arg Glu Leu Val Asp Glu Glu Ala Asp
435 440 445
Glu Ala Tyr Glu Leu Leu Ser Gln Ala Glu Ser Trp Gln Arg Leu His
450 455 460
Asn Glu Thr Arg Thr Leu Phe Pro Val Val Leu Glu Gln Leu Asp Asp
465 470 475 480
Tyr Asn Ala Lys Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Leu Asp Gln Ala Leu
485 490 495
Asn Tyr Val Arg Asp Ala Glu Asp Met Asn Arg Ala Thr Ala Ala Arg
500 505 510
Gln Arg Asp His Glu Lys Gln Gln Glu Arg Val Arg Glu Gln Met Glu
515 520 525
Val Val Asn Met Ser Leu Ser Thr Ser Ala Asp Ser Leu Thr Thr Pro
530 535 540
Arg Leu Thr Leu Ser Glu Leu Asp Asp Ile Ile Lys Asn Ala Ser Gly
545 550 555 560
Ile Tyr Ala Glu Ile Asp Gly Ala Lys Ser Glu Leu Gln Val Lys Leu
565 570 575
Ser Asn Leu Ser Asn Leu Ser His Asp Leu Val Gln Glu Ala Ile Asp
580 585 590
His Ala Gln Asp Leu Gln Gln Glu Ala Asn Glu Leu Ser Arg Lys Leu
595 600 605
His Ser Ser Asp Met Asn Gly Leu Val Gln Lys Ala Leu Asp Ala Ser
610 615 620
Asn Val Tyr Glu Asn Ile Val Asn Tyr Val Ser Glu Ala Asn Glu Thr
625 630 635 640
Ala Glu Phe Ala Leu Asn Thr Thr Asp Arg Ile Tyr Asp Ala Val Ser
645 650 655
Gly Ile Asp Thr Gln Ile Ile Tyr His Lys Asp Glu Ser Glu Asn Leu
660 665 670
Leu Asn Gln Ala Arg Glu Leu Gln Ala Lys Ala Glu Ser Ser Ser Asp
675 680 685
Glu Ala Val Ala Asp Thr Ser Arg Arg Val Gly Gly Ala Leu Ala Arg
690 695 700
Lys Ser Ala Leu Lys Thr Arg Leu Ser Asp Ala Val Lys Gln Leu Gln
705 710 715 720
Ala Ala Glu Arg Gly Asp Ala Gln Gln Arg Leu Gly Gln Ser Arg Leu
725 730 735
Ile Thr Glu Glu Ala Asn Arg Thr Thr Met Glu Val Gln Gln Ala Thr
740 745 750
Ala Pro Met Ala Asn Asn Leu Thr Asn Trp Ser Gln Asn Leu Gln His
755 760 765
Phe Asp Ser Ser Ala Tyr Asn Thr Ala Val Asn Ser Ala Arg Asp Ala
770 775 780
Val Arg Asn Leu Thr Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Asp Gln Leu Arg
785 790 795 800
Thr Val Glu Gln Lys Arg Pro Ala Ser Asn Val Ser Ala Ser Ile Gln
805 810 815
Arg Ile Arg Glu Leu Ile Ala Gln Thr Arg Ser Val Ala Ser Lys Ile
820 825 830
Gln Val Ser Met Met Phe Asp Gly Gln Ser Ala Val Glu Val His Ser
835 840 845
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850 855 860
Met Lys Pro Pro Val Lys Arg Pro Glu Leu Thr Glu Thr Ala Asp Gln
865 870 875 880
Phe Ile Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Asn Ala Lys Lys Glu Tyr Met Gly
885 890 895
Leu Ala Ile Lys Asn Asp Asn Leu Val Tyr Val Tyr Asn Leu Gly Thr
900 905 910
Lys Asp Val Glu Ile Pro Leu Asp Ser Lys Pro Val Ser Ser Trp Pro
915 920 925
Ala Tyr Phe Ser Ile Val Lys Ile Glu Arg Val Gly Lys His Gly Lys
930 935 940
Val Phe Leu Thr Val Pro Ser Leu Ser Ser Thr Ala Glu Glu Lys Phe
945 950 955 960
Ile Lys Lys Gly Glu Phe Ser Gly Asp Asp Ser Leu Leu Asp Leu Asp
965 970 975
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980 985 990
Leu Pro Thr Ser Leu Asn Leu Pro Gly Phe Val Gly Cys Leu Glu Leu
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Tyr Asn Met Asp Pro Ser Thr Ser Val Pro Cys Ala Arg Asp Lys Leu
1025 1030 1035 1040
Ala Phe Thr Gln Ser Arg Ala Ala Ser Tyr Phe Phe Asp Gly Ser Gly
1045 1050 1055
Tyr Ala Val Val Arg Asp Ile Thr Arg Arg Gly Lys Phe Gly Gln Val
1060 1065 1070
Thr Arg Phe Asp Ile Glu Val Arg Thr Pro Ala Asp Asn Gly Leu Ile
1075 1080 1085
Leu Leu Met Val Asn Gly Ser Met Phe Phe Arg Leu Glu Met Arg Asn
1090 1095 1100
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His Glu Ile Ser Ile Ile Tyr His Asn Asp Lys Lys Met Ile Leu Val
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1170 1175 1180
Ser Arg Ala Leu Arg Ala His Leu Pro Leu Asp Ile Asn Phe Arg Gly
1185 1190 1195 1200
Cys Met Lys Gly Phe Gln Phe Gln Lys Lys Asp Phe Asn Leu Leu Glu
1205 1210 1215
Gln Thr Glu Thr Leu Gly Val Gly Tyr Gly Cys Pro Glu Asp Ser Leu
1220 1225 1230
Ile Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Asn Gly Gln Ser Phe Ile Ala Ser Ile
1235 1240 1245
Gln Lys Ile Ser Phe Phe Asp Gly Phe Glu Gly Gly Phe Asn Phe Arg
1250 1255 1260
Thr Leu Gln Pro Asn Gly Leu Leu Phe Tyr Tyr Ala Ser Gly Ser Asp
1265 1270 1275 1280
Val Phe Ser Ile Ser Leu Asp Asn Gly Thr Val Ile Met Asp Val Lys
1285 1290 1295
Gly Ile Lys Val Gln Ser Val Asp Lys Gln Tyr Asn Asp Gly Leu Ser
1300 1305 1310
His Phe Val Ile Ser Ser Val Ser Pro Thr Arg Tyr Glu Leu Ile Val
1315 1320 1325
Asp Lys Ser Arg Val Gly Ser Lys Asn Pro Thr Lys Gly Lys Ile Glu
1330 1335 1340
Gln Thr Gln Ala Ser Glu Lys Lys Phe Tyr Phe Gly Gly Ser Pro Ile
1345 1350 1355 1360
Ser Ala Gln Tyr Ala Asn Phe Thr Gly Cys Ile Ser Asn Ala Tyr Phe
1365 1370 1375
Thr Arg Val Asp Arg Asp Val Glu Val Glu Asp Phe Gln Arg Tyr Thr
1380 1385 1390
Glu Lys Val His Thr Ser Leu Tyr Glu Cys Pro Ile Glu Ser Ser Pro
1395 1400 1405
Leu Phe Leu Leu His Lys Lys Gly Lys Asn Leu Ser Lys Pro Lys Ala
1410 1415 1420
Ser Gln Asn Lys Lys Gly Gly Lys Ser Lys Asp Ala Pro Ser Trp Asp
1425 1430 1435 1440
Pro Val Ala Leu Lys Leu Pro Glu Arg Asn Thr Pro Arg Asn Ser His
1445 1450 1455
Cys His Leu Ser Asn Ser Pro Arg Ala Ile Glu His Ala Tyr Gln Tyr
1460 1465 1470
Gly Gly Thr Ala Asn Ser Arg Gln Glu Phe Glu His Leu Lys Gly Asp
1475 1480 1485
Phe Gly Ala Lys Ser Gln Phe Ser Ile Arg Leu Arg Thr Arg Ser Ser
1490 1495 1500
His Gly Met Ile Phe Tyr Val Ser Asp Gln Glu Glu Asn Asp Phe Met
1505 1510 1515 1520
Thr Leu Phe Leu Ala His Gly Arg Leu Val Tyr Met Phe Asn Val Gly
1525 1530 1535
His Lys Lys Leu Lys Ile Arg Ser Gln Glu Lys Tyr Asn Asp Gly Leu
1540 1545 1550
Trp His Asp Val Ile Phe Ile Arg Glu Arg Ser Ser Gly Arg Leu Val
1555 1560 1565
Ile Asp Gly Leu Arg Val Leu Glu Glu Ser Leu Pro Pro Thr Glu Ala
1570 1575 1580
Thr Trp Lys Ile Lys Gly Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Ala Pro Gly
1585 1590 1595 1600
Lys Ala Val Lys Asn Val Gln Ile Asn Ser Ile Tyr Ser Phe Ser Gly
1605 1610 1615
Cys Leu Ser Asn Leu Gln Leu Asn Gly Ala Ser Ile Thr Ser Ala Ser
1620 1625 1630
Gln Thr Phe Ser Val Thr Pro Cys Phe Glu Gly Pro Met Glu Thr Gly
1635 1640 1645
Thr Tyr Phe Ser Thr Glu Gly Gly Tyr Val Val Leu Asp Glu Ser Phe
1650 1655 1660
Asn Ile Gly Leu Lys Phe Glu Ile Ala Phe Glu Val Arg Pro Arg Ser
1665 1670 1675 1680
Ser Ser Gly Thr Leu Val His Gly His Ser Val Asn Gly Glu Tyr Leu
1685 1690 1695
Asn Val His Met Lys Asn Gly Gln Val Ile Val Lys Val Asn Asn Gly
1700 1705 1710
Ile Arg Asp Phe Ser Thr Ser Val Thr Pro Lys Gln Ser Leu Cys Asp
1715 1720 1725
Gly Arg Trp His Arg Ile Thr Val Ile Arg Asp Ser Asn Val Val Gln
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Leu Asp Val Asp Ser Glu Val Asn His Val Val Gly Pro Leu Asn Pro
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Ser Leu Leu Thr Pro Arg Leu Ala Pro Ser Lys Pro Phe Thr Gly Cys
1780 1785 1790
Ile Arg His Phe Val Ile Asp Gly His Pro Val Ser Phe Ser Lys Ala
1795 1800 1805
Ala Leu Val Ser Gly Ala Val Ser Ile Asn Ser Cys Pro Ala Ala
1810 1815 1820
<210> 116
<211> 5472
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 层粘连蛋白亚基α-4（智人）的DNA序列
<400> 116
atggctttga gctcagcctg gcgctcggtt ctgcctctgt ggctcctctg gagcgctgcc 60
tgctcccgcg ccgcgtccgg ggacgacaac gcttttcctt ttgacattga agggagctca 120
gcggttggca ggcaagaccc gcctgagacg agcgaacccc gcgtggctct gggacgcctg 180
ccgcctgcgg ccgagaaatg caatgctgga ttctttcaca ccctgtcggg agaatgtgtg 240
ccctgcgact gtaatggcaa ttccaacgag tgtttggacg gctcaggata ctgtgtgcac 300
tgccagcgga acacaacagg agagcactgt gaaaagtgtc tggatggtta tatcggagat 360
tccatcaggg gagcacccca attctgccag ccgtgcccct gtcccctgcc ccacttggcc 420
aattttgcag aatcctgcta taggaaaaat ggagctgttc ggtgcatttg taacgaaaat 480
tatgctggac ctaactgtga aagatgtgct cccggttact atggaaaccc cttactcatt 540
ggaagcacct gtaagaaatg tgactgcagt ggaaattcag atcccaacct gatctttgaa 600
gattgtgatg aagtcactgg ccagtgtagg aattgcttac gcaacaccac cggattcaag 660
tgtgaacgtt gcgctcctgg ctactatggg gacgccagga tagccaagaa ctgtgcagtg 720
tgcaactgcg ggggaggccc atgtgacagt gtaaccggag aatgcttgga agaaggtttt 780
gaacccccta caggcatgga ctgcccaacc ataagctgtg ataagtgcgt ctgggacctg 840
actgatgacc tgcggttagc agcgctctcc atcgaggaag gcaaatccgg ggtgctgagc 900
gtatcctctg gggccgccgc tcataggcac gtgaatgaaa tcaacgccac catctacctc 960
ctcaaaacaa aattgtcaga aagagaaaac caatacgccc taagaaagat acaaatcaac 1020
aatgctgaga acacgatgaa aagccttctg tctgacgtag aggaattagt tgaaaaggaa 1080
aatcaagcct ccagaaaagg acaacttgtt cagaaggaaa gcatggacac cattaaccac 1140
gcaagtcagc tggtagagca agcccatgat atgagggata aaatccaaga gatcaacaac 1200
aagatgctct attatgggga agagcatgaa cttagcccca aggaaatctc tgagaagctg 1260
gtgttggccc agaagatgct tgaagagatt agaagccgtc aaccattttt cacccaacgg 1320
gagctcgtgg atgaggaggc agatgaggct tacgaactac tgagccaggc tgagagctgg 1380
cagcggctgc acaatgagac ccgcactctg tttcctgtcg tcctggagca gctggatgac 1440
tacaatgcta agttgtcaga tctccaggaa gcacttgacc aggcccttaa ctatgtcagg 1500
gatgccgaag acatgaacag ggccacagca gccaggcagc gggaccatga gaaacaacag 1560
gaaagagtga gggaacaaat ggaagtggtg aacatgtctc tgagcacatc tgcggactct 1620
ctgacaacac ctcgtctaac tctttcagaa cttgatgata taataaagaa tgcgtcaggg 1680
atttatgcag aaatagatgg agccaaaagt gaactacaag taaaactatc taacctaagt 1740
aacctcagcc atgatttagt ccaagaagct attgaccatg cacaggacct tcaacaagaa 1800
gctaatgaat tgagcaggaa gttgcacagt tcagatatga acgggctggt acagaaggct 1860
ttggatgcat caaatgtcta tgaaaatatt gttaattatg ttagtgaagc caatgaaaca 1920
gcagaatttg ctttgaacac cactgaccga atttatgatg cggtgagtgg gattgatact 1980
caaatcattt accataaaga tgaaagtgag aacctcctca atcaagccag agaactgcaa 2040
gcaaaggcag agtctagcag tgatgaagca gtggctgaca ctagcaggcg tgtgggtgga 2100
gccctagcaa ggaaaagtgc ccttaaaacc agactcagtg atgccgttaa gcaactacaa 2160
gcagcagaga gaggggatgc ccagcagcgc ctggggcagt ctagactgat caccgaggaa 2220
gccaacagga cgacgatgga ggtgcagcag gccactgccc ccatggccaa caatctaacc 2280
aactggtcac agaatcttca acattttgac tcttctgctt acaacactgc agtgaactct 2340
gctagggatg cagtaagaaa tctgaccgag gttgtccctc agctcctgga tcagcttcgt 2400
acggttgagc agaagcgacc tgcaagcaac gtttctgcca gcatccagag gatccgagag 2460
ctcattgctc agaccagaag tgttgccagc aagatccaag tctccatgat gtttgatggc 2520
cagtcagctg tggaagtgca ctcgagaacc agtatggatg acttaaaggc cttcacgtct 2580
ctgagcctgt acatgaaacc ccctgtgaag cggccggaac tgaccgagac tgcagatcag 2640
tttatcctgt acctcggaag caaaaacgcc aaaaaagagt atatgggtct tgcaatcaaa 2700
aatgataatc tggtatacgt ctataatttg ggaactaaag atgtggagat tcccctggac 2760
tccaagcccg tcagttcctg gcctgcttac ttcagcattg tcaagattga aagggtggga 2820
aaacatggaa aggtgttttt aacagtcccg agtctaagta gcacagcaga ggaaaagttc 2880
attaaaaagg gggaattttc gggagatgac tctctgctgg acctggaccc tgaggacaca 2940
gtgttttatg ttggtggagt gccttccaac ttcaagctcc ctaccagctt aaacctgcct 3000
ggctttgttg gctgcctgga actggccact ttgaataatg atgtgatcag cttgtacaac 3060
tttaagcaca tctataatat ggacccctcc acatcagtgc catgtgcccg agataagctg 3120
gccttcactc agagtcgggc tgccagttac ttcttcgatg gctccggtta tgccgtggtg 3180
agagacatca caaggagagg gaaatttggt caggtgactc gctttgacat agaagttcga 3240
acaccagctg acaacggcct tattctcctg atggtcaatg gaagtatgtt tttcagactg 3300
gaaatgcgca atggttacct acatgtgttc tatgattttg gattcagcgg tggccctgtg 3360
catcttgaag atacgttaaa gaaagctcaa attaatgatg caaaatacca tgagatctca 3420
atcatttacc acaatgataa gaaaatgatc ttggtagttg acagaaggca tgtcaagagc 3480
atggataatg aaaagatgaa aatacctttt acagatatat acattggagg agctcctcca 3540
gaaatcttac aatccagggc cctcagagca caccttcccc tagatatcaa cttcagagga 3600
tgcatgaagg gcttccagtt ccaaaagaag gacttcaatt tactggagca gacagaaacc 3660
ctgggagttg gttatggatg cccagaagac tcacttatat ctcgcagagc atatttcaat 3720
ggacagagct tcattgcttc aattcagaaa atatctttct ttgatggctt tgaaggaggt 3780
tttaatttcc gaacattaca accaaatggg ttactattct attatgcttc agggtcagac 3840
gtgttctcca tctcactgga taatggtact gtcatcatgg atgtaaaggg aatcaaagtt 3900
cagtcagtag ataagcagta caatgatggg ctgtcccact tcgtcattag ctctgtctca 3960
cccacaagat atgaactgat agtagataaa agcagagttg ggagtaagaa tcctaccaaa 4020
gggaaaatag aacagacaca agcaagtgaa aagaagtttt acttcggtgg ctcaccaatc 4080
agtgctcagt atgctaattt cactggctgc ataagtaatg cctactttac cagggtggat 4140
agagatgtgg aggttgaaga tttccaacgg tatactgaaa aggtccacac ttctctttat 4200
gagtgtccca ttgagtcttc accattgttt ctcctccata aaaaaggaaa aaatttatcc 4260
aagcctaaag caagtcagaa taaaaaggga gggaaaagta aagatgcacc ttcatgggat 4320
cctgttgctc tgaaactccc agagcggaat actccaagaa actctcattg ccacctttcc 4380
aacagcccta gagcaataga gcacgcctat caatatggag gaacagccaa cagccgccaa 4440
gagtttgaac acttaaaagg agattttggt gccaaatctc agttttccat tcgtctgaga 4500
actcgttcct cccatggcat gatcttctat gtctcagatc aagaagagaa tgacttcatg 4560
actctatttt tggcccatgg ccgcttggtt tacatgttta atgttggtca caaaaaactg 4620
aagattagaa gccaggagaa atacaatgat ggcctgtggc atgatgtgat atttattcga 4680
gaaaggagca gtggccgact ggtaattgat ggtctccgag tcctagaaga aagtcttcct 4740
cctactgaag ctacctggaa aatcaagggt cccatttatt tgggaggtgt ggctcctgga 4800
aaggctgtga aaaatgttca gattaactcc atctacagtt ttagtggctg tctcagcaat 4860
ctccagctca atggggcctc catcacctct gcttctcaga cattcagtgt gaccccttgc 4920
tttgaaggcc ccatggaaac aggaacttac ttttcaacag aaggaggata cgtggttcta 4980
gatgaatctt tcaatattgg attgaagttt gaaattgcat ttgaagtccg tcccagaagc 5040
agttccggaa ccctggtcca cggccacagt gtcaatgggg agtacctaaa tgttcacatg 5100
aaaaatggac aggtcatagt gaaagtcaat aatggcatca gagatttttc cacctcagtt 5160
acacccaagc agagtctctg tgatggcaga tggcacagaa ttacagttat tagagattct 5220
aatgtggttc agttggatgt ggactctgaa gtgaaccatg tggttggacc cctgaatcca 5280
aaaccaattg atcacaggga gcctgtgttt gttggaggtg ttccagaatc tctactgaca 5340
ccacgcttgg cccccagcaa acccttcaca ggctgcatac gccactttgt gattgatgga 5400
cacccagtga gcttcagtaa agcagccctg gtcagcggcg ccgtaagcat caactcctgt 5460
ccagcagcct ga 5472
<210> 117
<211> 1798
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 层粘连蛋白亚基β-2（智人）的氨基酸序列
<400> 117
Met Glu Leu Thr Ser Arg Glu Arg Gly Arg Gly Gln Pro Leu Pro Trp
1 5 10 15
Glu Leu Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ala Thr Leu Ala
20 25 30
Gln Ala Pro Ala Pro Asp Val Pro Gly Cys Ser Arg Gly Ser Cys Tyr
35 40 45
Pro Ala Thr Gly Asp Leu Leu Val Gly Arg Ala Asp Arg Leu Thr Ala
50 55 60
Ser Ser Thr Cys Gly Leu Asn Gly Pro Gln Pro Tyr Cys Ile Val Ser
65 70 75 80
His Leu Gln Asp Glu Lys Lys Cys Phe Leu Cys Asp Ser Arg Arg Pro
85 90 95
Phe Ser Ala Arg Asp Asn Pro His Ser His Arg Ile Gln Asn Val Val
100 105 110
Thr Ser Phe Ala Pro Gln Arg Arg Ala Ala Trp Trp Gln Ser Glu Asn
115 120 125
Gly Ile Pro Ala Val Thr Ile Gln Leu Asp Leu Glu Ala Glu Phe His
130 135 140
Phe Thr His Leu Ile Met Thr Phe Lys Thr Phe Arg Pro Ala Ala Met
145 150 155 160
Leu Val Glu Arg Ser Ala Asp Phe Gly Arg Thr Trp His Val Tyr Arg
165 170 175
Tyr Phe Ser Tyr Asp Cys Gly Ala Asp Phe Pro Gly Val Pro Leu Ala
180 185 190
Pro Pro Arg His Trp Asp Asp Val Val Cys Glu Ser Arg Tyr Ser Glu
195 200 205
Ile Glu Pro Ser Thr Glu Gly Glu Val Ile Tyr Arg Val Leu Asp Pro
210 215 220
Ala Ile Pro Ile Pro Asp Pro Tyr Ser Ser Arg Ile Gln Asn Leu Leu
225 230 235 240
Lys Ile Thr Asn Leu Arg Val Asn Leu Thr Arg Leu His Thr Leu Gly
245 250 255
Asp Asn Leu Leu Asp Pro Arg Arg Glu Ile Arg Glu Lys Tyr Tyr Tyr
260 265 270
Ala Leu Tyr Glu Leu Val Val Arg Gly Asn Cys Phe Cys Tyr Gly His
275 280 285
Ala Ser Glu Cys Ala Pro Ala Pro Gly Ala Pro Ala His Ala Glu Gly
290 295 300
Met Val His Gly Ala Cys Ile Cys Lys His Asn Thr Arg Gly Leu Asn
305 310 315 320
Cys Glu Gln Cys Gln Asp Phe Tyr Arg Asp Leu Pro Trp Arg Pro Ala
325 330 335
Glu Asp Gly His Ser His Ala Cys Arg Lys Cys Glu Cys His Gly His
340 345 350
Thr His Ser Cys His Phe Asp Met Ala Val Tyr Leu Ala Ser Gly Asn
355 360 365
Val Ser Gly Gly Val Cys Asp Gly Cys Gln His Asn Thr Ala Gly Arg
370 375 380
His Cys Glu Leu Cys Arg Pro Phe Phe Tyr Arg Asp Pro Thr Lys Asp
385 390 395 400
Leu Arg Asp Pro Ala Val Cys Arg Ser Cys Asp Cys Asp Pro Met Gly
405 410 415
Ser Gln Asp Gly Gly Arg Cys Asp Ser His Asp Asp Pro Ala Leu Gly
420 425 430
Leu Val Ser Gly Gln Cys Arg Cys Lys Glu His Val Val Gly Thr Arg
435 440 445
Cys Gln Gln Cys Arg Asp Gly Phe Phe Gly Leu Ser Ile Ser Asp Arg
450 455 460
Leu Gly Cys Arg Arg Cys Gln Cys Asn Ala Arg Gly Thr Val Pro Gly
465 470 475 480
Ser Thr Pro Cys Asp Pro Asn Ser Gly Ser Cys Tyr Cys Lys Arg Leu
485 490 495
Val Thr Gly Arg Gly Cys Asp Arg Cys Leu Pro Gly His Trp Gly Leu
500 505 510
Ser His Asp Leu Leu Gly Cys Arg Pro Cys Asp Cys Asp Val Gly Gly
515 520 525
Ala Leu Asp Pro Gln Cys Asp Glu Gly Thr Gly Gln Cys His Cys Arg
530 535 540
Gln His Met Val Gly Arg Arg Cys Glu Gln Val Gln Pro Gly Tyr Phe
545 550 555 560
Arg Pro Phe Leu Asp His Leu Ile Trp Glu Ala Glu Asp Thr Arg Gly
565 570 575
Gln Val Leu Asp Val Val Glu Arg Leu Val Thr Pro Gly Glu Thr Pro
580 585 590
Ser Trp Thr Gly Ser Gly Phe Val Arg Leu Gln Glu Gly Gln Thr Leu
595 600 605
Glu Phe Leu Val Ala Ser Val Pro Lys Ala Met Asp Tyr Asp Leu Leu
610 615 620
Leu Arg Leu Glu Pro Gln Val Pro Glu Gln Trp Ala Glu Leu Glu Leu
625 630 635 640
Ile Val Gln Arg Pro Gly Pro Val Pro Ala His Ser Leu Cys Gly His
645 650 655
Leu Val Pro Lys Asp Asp Arg Ile Gln Gly Thr Leu Gln Pro His Ala
660 665 670
Arg Tyr Leu Ile Phe Pro Asn Pro Val Cys Leu Glu Pro Gly Ile Ser
675 680 685
Tyr Lys Leu His Leu Lys Leu Val Arg Thr Gly Gly Ser Ala Gln Pro
690 695 700
Glu Thr Pro Tyr Ser Gly Pro Gly Leu Leu Ile Asp Ser Leu Val Leu
705 710 715 720
Leu Pro Arg Val Leu Val Leu Glu Met Phe Ser Gly Gly Asp Ala Ala
725 730 735
Ala Leu Glu Arg Gln Ala Thr Phe Glu Arg Tyr Gln Cys His Glu Glu
740 745 750
Gly Leu Val Pro Ser Lys Thr Ser Pro Ser Glu Ala Cys Ala Pro Leu
755 760 765
Leu Ile Ser Leu Ser Thr Leu Ile Tyr Asn Gly Ala Leu Pro Cys Gln
770 775 780
Cys Asn Pro Gln Gly Ser Leu Ser Ser Glu Cys Asn Pro His Gly Gly
785 790 795 800
Gln Cys Leu Cys Lys Pro Gly Val Val Gly Arg Arg Cys Asp Leu Cys
805 810 815
Ala Pro Gly Tyr Tyr Gly Phe Gly Pro Thr Gly Cys Gln Ala Cys Gln
820 825 830
Cys Ser His Glu Gly Ala Leu Ser Ser Leu Cys Glu Lys Thr Ser Gly
835 840 845
Gln Cys Leu Cys Arg Thr Gly Ala Phe Gly Leu Arg Cys Asp Arg Cys
850 855 860
Gln Arg Gly Gln Trp Gly Phe Pro Ser Cys Arg Pro Cys Val Cys Asn
865 870 875 880
Gly His Ala Asp Glu Cys Asn Thr His Thr Gly Ala Cys Leu Gly Cys
885 890 895
Arg Asp His Thr Gly Gly Glu His Cys Glu Arg Cys Ile Ala Gly Phe
900 905 910
His Gly Asp Pro Arg Leu Pro Tyr Gly Gly Gln Cys Arg Pro Cys Pro
915 920 925
Cys Pro Glu Gly Pro Gly Ser Gln Arg His Phe Ala Thr Ser Cys His
930 935 940
Gln Asp Glu Tyr Ser Gln Gln Ile Val Cys His Cys Arg Ala Gly Tyr
945 950 955 960
Thr Gly Leu Arg Cys Glu Ala Cys Ala Pro Gly His Phe Gly Asp Pro
965 970 975
Ser Arg Pro Gly Gly Arg Cys Gln Leu Cys Glu Cys Ser Gly Asn Ile
980 985 990
Asp Pro Met Asp Pro Asp Ala Cys Asp Pro His Thr Gly Gln Cys Leu
995 1000 1005
Arg Cys Leu His His Thr Glu Gly Pro His Cys Ala His Cys Lys Pro
1010 1015 1020
Gly Phe His Gly Gln Ala Ala Arg Gln Ser Cys His Arg Cys Thr Cys
1025 1030 1035 1040
Asn Leu Leu Gly Thr Asn Pro Gln Gln Cys Pro Ser Pro Asp Gln Cys
1045 1050 1055
His Cys Asp Pro Ser Ser Gly Gln Cys Pro Cys Leu Pro Asn Val Gln
1060 1065 1070
Gly Pro Ser Cys Asp Arg Cys Ala Pro Asn Phe Trp Asn Leu Thr Ser
1075 1080 1085
Gly His Gly Cys Gln Pro Cys Ala Cys His Pro Ser Arg Ala Arg Gly
1090 1095 1100
Pro Thr Cys Asn Glu Phe Thr Gly Gln Cys His Cys Arg Ala Gly Phe
1105 1110 1115 1120
Gly Gly Arg Thr Cys Ser Glu Cys Gln Glu Leu His Trp Gly Asp Pro
1125 1130 1135
Gly Leu Gln Cys His Ala Cys Asp Cys Asp Ser Arg Gly Ile Asp Thr
1140 1145 1150
Pro Gln Cys His Arg Phe Thr Gly His Cys Ser Cys Arg Pro Gly Val
1155 1160 1165
Ser Gly Val Arg Cys Asp Gln Cys Ala Arg Gly Phe Ser Gly Ile Phe
1170 1175 1180
Pro Ala Cys His Pro Cys His Ala Cys Phe Gly Asp Trp Asp Arg Val
1185 1190 1195 1200
Val Gln Asp Leu Ala Ala Arg Thr Gln Arg Leu Glu Gln Arg Ala Gln
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Gln Thr Gly Val Leu Gly Ala Phe Glu Ser Ser Phe Trp
1220 1225 1230
His Met Gln Glu Lys Leu Gly Ile Val Gln Gly Ile Val Gly Ala Arg
1235 1240 1245
Asn Thr Ser Ala Ala Ser Thr Ala Gln Leu Val Glu Ala Thr Glu Glu
1250 1255 1260
Leu Arg Arg Glu Ile Gly Glu Ala Thr Glu His Leu Thr Gln Leu Glu
1265 1270 1275 1280
Ala Asp Leu Thr Asp Val Gln Asp Glu Asn Phe Asn Ala Asn His Ala
1285 1290 1295
Leu Ser Gly Leu Glu Arg Asp Arg Leu Ala Leu Asn Leu Thr Leu Arg
1300 1305 1310
Gln Leu Asp Gln His Leu Asp Leu Leu Lys His Ser Asn Phe Leu Gly
1315 1320 1325
Ala Tyr Asp Ser Ile Arg His Ala His Ser Gln Ser Ala Glu Ala Glu
1330 1335 1340
Arg Arg Ala Asn Thr Ser Ala Leu Ala Val Pro Ser Pro Val Ser Asn
1345 1350 1355 1360
Ser Ala Ser Ala Arg His Arg Thr Glu Ala Leu Met Asp Ala Gln Lys
1365 1370 1375
Glu Asp Phe Asn Ser Lys His Met Ala Asn Gln Arg Ala Leu Gly Lys
1380 1385 1390
Leu Ser Ala His Thr His Thr Leu Ser Leu Thr Asp Ile Asn Glu Leu
1395 1400 1405
Val Cys Gly Ala Pro Gly Asp Ala Pro Cys Ala Thr Ser Pro Cys Gly
1410 1415 1420
Gly Ala Gly Cys Arg Asp Glu Asp Gly Gln Pro Arg Cys Gly Gly Leu
1425 1430 1435 1440
Ser Cys Asn Gly Ala Ala Ala Thr Ala Asp Leu Ala Leu Gly Arg Ala
1445 1450 1455
Arg His Thr Gln Ala Glu Leu Gln Arg Ala Leu Ala Glu Gly Gly Ser
1460 1465 1470
Ile Leu Ser Arg Val Ala Glu Thr Arg Arg Gln Ala Ser Glu Ala Gln
1475 1480 1485
Gln Arg Ala Gln Ala Ala Leu Asp Lys Ala Asn Ala Ser Arg Gly Gln
1490 1495 1500
Val Glu Gln Ala Asn Gln Glu Leu Gln Glu Leu Ile Gln Ser Val Lys
1505 1510 1515 1520
Asp Phe Leu Asn Gln Glu Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ile Glu Met Val
1525 1530 1535
Ala Thr Arg Val Leu Glu Leu Ser Ile Pro Ala Ser Ala Glu Gln Ile
1540 1545 1550
Gln His Leu Ala Gly Ala Ile Ala Glu Arg Val Arg Ser Leu Ala Asp
1555 1560 1565
Val Asp Ala Ile Leu Ala Arg Thr Val Gly Asp Val Arg Arg Ala Glu
1570 1575 1580
Gln Leu Leu Gln Asp Ala Arg Arg Ala Arg Ser Trp Ala Glu Asp Glu
1585 1590 1595 1600
Lys Gln Lys Ala Glu Thr Val Gln Ala Ala Leu Glu Glu Ala Gln Arg
1605 1610 1615
Ala Gln Gly Ile Ala Gln Gly Ala Ile Arg Gly Ala Val Ala Asp Thr
1620 1625 1630
Arg Asp Thr Glu Gln Thr Leu Tyr Gln Val Gln Glu Arg Met Ala Gly
1635 1640 1645
Ala Glu Arg Ala Leu Ser Ser Ala Gly Glu Arg Ala Arg Gln Leu Asp
1650 1655 1660
Ala Leu Leu Glu Ala Leu Lys Leu Lys Arg Ala Gly Asn Ser Leu Ala
1665 1670 1675 1680
Ala Ser Thr Ala Glu Glu Thr Ala Gly Ser Ala Gln Gly Arg Ala Gln
1685 1690 1695
Glu Ala Glu Gln Leu Leu Arg Gly Pro Leu Gly Asp Gln Tyr Gln Thr
1700 1705 1710
Val Lys Ala Leu Ala Glu Arg Lys Ala Gln Gly Val Leu Ala Ala Gln
1715 1720 1725
Ala Arg Ala Glu Gln Leu Arg Asp Glu Ala Arg Asp Leu Leu Gln Ala
1730 1735 1740
Ala Gln Asp Lys Leu Gln Arg Leu Gln Glu Leu Glu Gly Thr Tyr Glu
1745 1750 1755 1760
Glu Asn Glu Arg Ala Leu Glu Ser Lys Ala Ala Gln Leu Asp Gly Leu
1765 1770 1775
Glu Ala Arg Met Arg Ser Val Leu Gln Ala Ile Asn Leu Gln Val Gln
1780 1785 1790
Ile Tyr Asn Thr Cys Gln
1795
<210> 118
<211> 5397
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 层粘连蛋白亚基β-2（智人）的DNA序列
<400> 118
atggagctga cctcaaggga aagagggagg ggacagcctc tgccctggga acttcgactg 60
ggcctactgc taagcgtgct ggctgccaca ctggcacagg cccctgcccc ggatgtgcct 120
ggctgttcca ggggaagctg ctaccccgcc acgggcgacc tgctggtggg ccgagctgac 180
agactgactg cctcatccac ttgtggcctg aatggccccc agccctactg catcgtcagt 240
cacctgcagg acgaaaagaa gtgcttcctt tgtgactccc ggcgcccctt ctctgctaga 300
gacaacccac acagccatcg catccagaat gtagtcacca gctttgcacc acagcggcgg 360
gcagcctggt ggcagtcaga gaatggtatc cctgcggtca ccatccagct ggacctggag 420
gctgagtttc atttcacaca cctcattatg accttcaaga catttcgccc tgctgccatg 480
ctggtggaac gctcagcaga ctttggccgc acctggcatg tgtaccgata tttctcctat 540
gactgtgggg ctgacttccc aggagtccca ctagcacccc cacggcactg ggatgatgta 600
gtctgtgagt cccgctactc agagattgag ccatccactg aaggcgaggt catctatcgt 660
gtgctggacc ctgccatccc tatcccagac ccctacagct cacggattca gaacctgttg 720
aagatcacca acctacgggt gaacctgact cgtctacaca cgttgggaga caacctactc 780
gacccacgga gggagatccg agagaagtac tactatgccc tctatgagct ggttgtacgt 840
ggcaactgct tctgctacgg acacgcctca gagtgtgcac ccgccccagg ggcaccagcc 900
catgctgagg gcatggtgca cggagcttgc atctgcaaac acaacacacg tggcctcaac 960
tgcgagcagt gtcaggattt ctatcgtgac ctgccctggc gtccggctga ggacggccat 1020
agtcatgcct gtaggaagtg tgagtgccat gggcacaccc acagctgcca cttcgacatg 1080
gccgtatacc tggcatctgg caatgtgagt ggaggtgtgt gtgatggatg tcagcataac 1140
acagctgggc gccactgtga gctctgtcgg cccttcttct accgtgaccc aaccaaggac 1200
ctgcgggatc cggctgtgtg ccgctcctgt gattgtgacc ccatgggttc tcaagacggt 1260
ggtcgctgtg attcccatga tgaccctgca ctgggactgg tctccggcca gtgtcgctgc 1320
aaagaacatg tggtgggcac tcgctgccag caatgccgtg atggcttctt tgggctcagc 1380
atcagtgacc gtctgggctg ccggcgatgt caatgtaatg cacggggcac agtgcctggg 1440
agcactcctt gtgaccccaa cagtggatcc tgttactgca aacgtctagt gactggacgt 1500
ggatgtgacc gctgcctgcc tggccactgg ggcctgagcc acgacctgct cggctgccgc 1560
ccctgtgact gcgacgtggg tggtgctttg gatccccagt gtgatgaggg cacaggtcaa 1620
tgccactgcc gccagcacat ggttgggcga cgctgtgagc aggtgcaacc tggctacttc 1680
cggcccttcc tggaccacct aatttgggag gctgaggaca cccgagggca ggtgctcgat 1740
gtggtggagc gcctggtgac ccccggggaa actccatcct ggactggctc aggcttcgtg 1800
cggctacagg aaggtcagac cctggagttc ctggtggcct ctgtgccgaa ggctatggac 1860
tatgacctgc tgctgcgctt agagccccag gtccctgagc aatgggcaga gttggaactg 1920
attgtgcagc gtccagggcc tgtgcctgcc cacagcctgt gtgggcattt ggtgcccaag 1980
gatgatcgca tccaagggac tctgcaacca catgccaggt acttgatatt tcctaatcct 2040
gtctgccttg agcctggtat ctcctacaag ctgcatctga agctggtacg gacaggggga 2100
agtgcccagc ctgagactcc ctactctgga cctggcctgc tcattgactc gctggtgctg 2160
ctgccccgtg tcctggtgct agagatgttt agtgggggtg atgctgctgc cctggagcgc 2220
caggccacct ttgaacgcta ccaatgccat gaggagggtc tggtgcccag caagacttct 2280
ccctctgagg cctgcgcacc cctcctcatc agcctgtcca ccctcatcta caatggtgcc 2340
ctgccatgtc agtgcaaccc tcaaggttca ctgagttctg agtgcaaccc tcatggtggt 2400
cagtgcctgt gcaagcctgg agtggttggg cgccgctgtg acctctgtgc ccctggctac 2460
tatggctttg gccccacagg ctgtcaagcc tgccagtgca gccacgaggg ggcactcagc 2520
agtctctgtg aaaagaccag tgggcaatgt ctctgtcgaa ctggtgcctt tgggcttcgc 2580
tgtgaccgct gccagcgtgg ccagtgggga ttccctagct gccggccatg tgtctgcaat 2640
gggcatgcag atgagtgcaa cacccacaca ggcgcttgcc tgggctgccg tgatcacaca 2700
gggggtgagc actgtgaaag gtgcattgct ggtttccacg gggacccacg gctgccatat 2760
gggggccagt gccggccctg tccctgtcct gaaggccctg ggagccaacg gcactttgct 2820
acttcttgcc accaggatga atattcccag cagattgtgt gccactgccg ggcaggctat 2880
acggggctgc gatgtgaagc ttgtgcccct gggcactttg gggacccatc aaggccaggt 2940
ggccggtgcc aactgtgtga gtgcagtggg aacattgacc caatggatcc tgatgcctgt 3000
gacccccaca cggggcaatg cctgcgctgt ttacaccaca cagagggtcc acactgtgcc 3060
cactgcaagc ctggcttcca tgggcaggct gcccgacaga gctgtcaccg ctgcacatgc 3120
aacctgctgg gcacaaatcc gcagcagtgc ccatctcctg accagtgcca ctgtgatcca 3180
agcagtgggc agtgcccatg cctccccaat gtccagggcc ctagctgtga ccgctgtgcc 3240
cccaacttct ggaacctcac cagtggccat ggttgccagc cttgtgcctg ccacccaagc 3300
cgggccagag gccccacctg caacgagttc acagggcagt gccactgccg tgccggcttt 3360
ggagggcgga cttgttctga gtgccaagag ctccactggg gagaccctgg gttgcagtgc 3420
catgcctgtg attgtgactc tcgtggaata gatacacctc agtgtcaccg cttcacaggt 3480
cactgcagct gccgcccagg ggtgtctggt gtgcgctgtg accagtgtgc ccgtggcttc 3540
tcaggaatct ttcctgcctg ccatccctgc catgcatgct tcggggattg ggaccgagtg 3600
gtgcaggact tggcagcccg tacacagcgc ctagagcagc gggcgcagga gttgcaacag 3660
acgggtgtgc tgggtgcctt tgagagcagc ttctggcaca tgcaggagaa gctgggcatt 3720
gtgcagggca tcgtaggtgc ccgcaacacc tcagccgcct ccactgcaca gcttgtggag 3780
gccacagagg agctgcggcg tgaaattggg gaggccactg agcacctgac tcagctcgag 3840
gcagacctga cagatgtgca agatgagaac ttcaatgcca accatgcact aagtggtctg 3900
gagcgagata ggcttgcact taatctcaca ctgcggcagc tcgaccagca tcttgacttg 3960
ctcaaacatt caaacttcct gggtgcctat gacagcatcc ggcatgccca tagccagtct 4020
gcagaggcag aacgtcgtgc caatacctca gccctggcag tacctagccc tgtgagcaac 4080
tcggcaagtg ctcggcatcg gacagaggca ctgatggatg ctcagaagga ggacttcaac 4140
agcaaacaca tggccaacca gcgggcactt ggcaagctct ctgcccatac ccacaccctg 4200
agcctgacag acataaatga gctggtgtgt ggggcaccag gggatgcacc ctgtgctaca 4260
agcccttgtg ggggtgccgg ctgtcgagat gaggatgggc agccgcgctg tgggggcctc 4320
agctgcaatg gggcagcggc tacagcagac ctagcactgg gccgggcccg gcacacacag 4380
gcagagctgc agcgggcact ggcagaaggt ggtagcatcc tcagcagagt ggctgagact 4440
cgtcggcagg caagcgaggc acagcagcgg gcccaggcag ccctggacaa ggctaatgct 4500
tccaggggac aggtggaaca ggccaaccag gaacttcaag aacttatcca gagtgtgaag 4560
gacttcctca accaggaggg ggctgatcct gatagcattg aaatggtggc cacacgggtg 4620
ctagagctct ccatcccagc ttcagctgag cagatccagc acctggcggg tgcgattgca 4680
gagcgagtcc ggagcctggc agatgtggat gcgatcctgg cacgtactgt aggagatgtg 4740
cgtcgtgccg agcagctact gcaggatgca cggcgggcaa ggagctgggc tgaggatgag 4800
aaacagaagg cagagacagt acaggcagca ctggaggagg cccagcgggc acagggtatt 4860
gcccagggtg ccatccgggg ggcagtggct gacacacggg acacagagca gaccctgtac 4920
caggtacagg agaggatggc aggtgcagag cgggcactga gctctgcagg tgaaagggct 4980
cggcagttgg atgctctcct ggaggctctg aaattgaaac gggcaggaaa tagtctggca 5040
gcctctacag cagaagaaac ggcaggcagt gcccagggtc gtgcccagga ggctgagcag 5100
ctgctacgcg gtcctctggg tgatcagtac cagacggtga aggccctagc tgagcgcaag 5160
gcccaaggtg tgctggctgc acaggcaagg gcagaacaac tgcgggatga ggctcgggac 5220
ctgttgcaag ccgctcagga caagctgcag cggctacagg aattggaagg cacctatgag 5280
gaaaatgagc gggcactgga gagtaaggca gcccagttgg acgggttgga ggccaggatg 5340
cgcagcgtgc ttcaagccat caacttgcag gtgcagatct acaacacctg ccagtga 5397
<210> 119
<211> 1609
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 层粘连蛋白亚基γ-1（人）的氨基酸序列
<400> 119
Met Arg Gly Ser His Arg Ala Ala Pro Ala Leu Arg Pro Arg Gly Arg
1 5 10 15
Leu Trp Pro Val Leu Ala Val Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys
20 25 30
Ala Gln Ala Ala Met Asp Glu Cys Thr Asp Glu Gly Gly Arg Pro Gln
35 40 45
Arg Cys Met Pro Glu Phe Val Asn Ala Ala Phe Asn Val Thr Val Val
50 55 60
Ala Thr Asn Thr Cys Gly Thr Pro Pro Glu Glu Tyr Cys Val Gln Thr
65 70 75 80
Gly Val Thr Gly Val Thr Lys Ser Cys His Leu Cys Asp Ala Gly Gln
85 90 95
Pro His Leu Gln His Gly Ala Ala Phe Leu Thr Asp Tyr Asn Asn Gln
100 105 110
Ala Asp Thr Thr Trp Trp Gln Ser Gln Thr Met Leu Ala Gly Val Gln
115 120 125
Tyr Pro Ser Ser Ile Asn Leu Thr Leu His Leu Gly Lys Ala Phe Asp
130 135 140
Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe His Thr Ser Arg Pro Glu Ser Phe
145 150 155 160
Ala Ile Tyr Lys Arg Thr Arg Glu Asp Gly Pro Trp Ile Pro Tyr Gln
165 170 175
Tyr Tyr Ser Gly Ser Cys Glu Asn Thr Tyr Ser Lys Ala Asn Arg Gly
180 185 190
Phe Ile Arg Thr Gly Gly Asp Glu Gln Gln Ala Leu Cys Thr Asp Glu
195 200 205
Phe Ser Asp Ile Ser Pro Leu Thr Gly Gly Asn Val Ala Phe Ser Thr
210 215 220
Leu Glu Gly Arg Pro Ser Ala Tyr Asn Phe Asp Asn Ser Pro Val Leu
225 230 235 240
Gln Glu Trp Val Thr Ala Thr Asp Ile Arg Val Thr Leu Asn Arg Leu
245 250 255
Asn Thr Phe Gly Asp Glu Val Phe Asn Asp Pro Lys Val Leu Lys Ser
260 265 270
Tyr Tyr Tyr Ala Ile Ser Asp Phe Ala Val Gly Gly Arg Cys Lys Cys
275 280 285
Asn Gly His Ala Ser Glu Cys Met Lys Asn Glu Phe Asp Lys Leu Val
290 295 300
Cys Asn Cys Lys His Asn Thr Tyr Gly Val Asp Cys Glu Lys Cys Leu
305 310 315 320
Pro Phe Phe Asn Asp Arg Pro Trp Arg Arg Ala Thr Ala Glu Ser Ala
325 330 335
Ser Glu Cys Leu Pro Cys Asp Cys Asn Gly Arg Ser Gln Glu Cys Tyr
340 345 350
Phe Asp Pro Glu Leu Tyr Arg Ser Thr Gly His Gly Gly His Cys Thr
355 360 365
Asn Cys Gln Asp Asn Thr Asp Gly Ala His Cys Glu Arg Cys Arg Glu
370 375 380
Asn Phe Phe Arg Leu Gly Asn Asn Glu Ala Cys Ser Ser Cys His Cys
385 390 395 400
Ser Pro Val Gly Ser Leu Ser Thr Gln Cys Asp Ser Tyr Gly Arg Cys
405 410 415
Ser Cys Lys Pro Gly Val Met Gly Asp Lys Cys Asp Arg Cys Gln Pro
420 425 430
Gly Phe His Ser Leu Thr Glu Ala Gly Cys Arg Pro Cys Ser Cys Asp
435 440 445
Pro Ser Gly Ser Ile Asp Glu Cys Asn Ile Glu Thr Gly Arg Cys Val
450 455 460
Cys Lys Asp Asn Val Glu Gly Phe Asn Cys Glu Arg Cys Lys Pro Gly
465 470 475 480
Phe Phe Asn Leu Glu Ser Ser Asn Pro Arg Gly Cys Thr Pro Cys Phe
485 490 495
Cys Phe Gly His Ser Ser Val Cys Thr Asn Ala Val Gly Tyr Ser Val
500 505 510
Tyr Ser Ile Ser Ser Thr Phe Gln Ile Asp Glu Asp Gly Trp Arg Ala
515 520 525
Glu Gln Arg Asp Gly Ser Glu Ala Ser Leu Glu Trp Ser Ser Glu Arg
530 535 540
Gln Asp Ile Ala Val Ile Ser Asp Ser Tyr Phe Pro Arg Tyr Phe Ile
545 550 555 560
Ala Pro Ala Lys Phe Leu Gly Lys Gln Val Leu Ser Tyr Gly Gln Asn
565 570 575
Leu Ser Phe Ser Phe Arg Val Asp Arg Arg Asp Thr Arg Leu Ser Ala
580 585 590
Glu Asp Leu Val Leu Glu Gly Ala Gly Leu Arg Val Ser Val Pro Leu
595 600 605
Ile Ala Gln Gly Asn Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Thr Val Lys Tyr Val
610 615 620
Phe Arg Leu His Glu Ala Thr Asp Tyr Pro Trp Arg Pro Ala Leu Thr
625 630 635 640
Pro Phe Glu Phe Gln Lys Leu Leu Asn Asn Leu Thr Ser Ile Lys Ile
645 650 655
Arg Gly Thr Tyr Ser Glu Arg Ser Ala Gly Tyr Leu Asp Asp Val Thr
660 665 670
Leu Ala Ser Ala Arg Pro Gly Pro Gly Val Pro Ala Thr Trp Val Glu
675 680 685
Ser Cys Thr Cys Pro Val Gly Tyr Gly Gly Gln Phe Cys Glu Met Cys
690 695 700
Leu Ser Gly Tyr Arg Arg Glu Thr Pro Asn Leu Gly Pro Tyr Ser Pro
705 710 715 720
Cys Val Leu Cys Ala Cys Asn Gly His Ser Glu Thr Cys Asp Pro Glu
725 730 735
Thr Gly Val Cys Asn Cys Arg Asp Asn Thr Ala Gly Pro His Cys Glu
740 745 750
Lys Cys Ser Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Thr Ala Gly Thr Ser Ser
755 760 765
Asp Cys Gln Pro Cys Pro Cys Pro Gly Gly Ser Ser Cys Ala Val Val
770 775 780
Pro Lys Thr Lys Glu Val Val Cys Thr Asn Cys Pro Thr Gly Thr Thr
785 790 795 800
Gly Lys Arg Cys Glu Leu Cys Asp Asp Gly Tyr Phe Gly Asp Pro Leu
805 810 815
Gly Arg Asn Gly Pro Val Arg Leu Cys Arg Leu Cys Gln Cys Ser Asp
820 825 830
Asn Ile Asp Pro Asn Ala Val Gly Asn Cys Asn Arg Leu Thr Gly Glu
835 840 845
Cys Leu Lys Cys Ile Tyr Asn Thr Ala Gly Phe Tyr Cys Asp Arg Cys
850 855 860
Lys Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ala Asp Lys
865 870 875 880
Cys Lys Ala Cys Asn Cys Asn Leu Tyr Gly Thr Met Lys Gln Gln Ser
885 890 895
Ser Cys Asn Pro Val Thr Gly Gln Cys Glu Cys Leu Pro His Val Thr
900 905 910
Gly Gln Asp Cys Gly Ala Cys Asp Pro Gly Phe Tyr Asn Leu Gln Ser
915 920 925
Gly Gln Gly Cys Glu Arg Cys Asp Cys His Ala Leu Gly Ser Thr Asn
930 935 940
Gly Gln Cys Asp Ile Arg Thr Gly Gln Cys Glu Cys Gln Pro Gly Ile
945 950 955 960
Thr Gly Gln His Cys Glu Arg Cys Glu Val Asn His Phe Gly Phe Gly
965 970 975
Pro Glu Gly Cys Lys Pro Cys Asp Cys His Pro Glu Gly Ser Leu Ser
980 985 990
Leu Gln Cys Lys Asp Asp Gly Arg Cys Glu Cys Arg Glu Gly Phe Val
995 1000 1005
Gly Asn Arg Cys Asp Gln Cys Glu Glu Asn Tyr Phe Tyr Asn Arg Ser
1010 1015 1020
Trp Pro Gly Cys Gln Glu Cys Pro Ala Cys Tyr Arg Leu Val Lys Asp
1025 1030 1035 1040
Lys Val Ala Asp His Arg Val Lys Leu Gln Glu Leu Glu Ser Leu Ile
1045 1050 1055
Ala Asn Leu Gly Thr Gly Asp Glu Met Val Thr Asp Gln Ala Phe Glu
1060 1065 1070
Asp Arg Leu Lys Glu Ala Glu Arg Glu Val Met Asp Leu Leu Arg Glu
1075 1080 1085
Ala Gln Asp Val Lys Asp Val Asp Gln Asn Leu Met Asp Arg Leu Gln
1090 1095 1100
Arg Val Asn Asn Thr Leu Ser Ser Gln Ile Ser Arg Leu Gln Asn Ile
1105 1110 1115 1120
Arg Asn Thr Ile Glu Glu Thr Gly Asn Leu Ala Glu Gln Ala Arg Ala
1125 1130 1135
His Val Glu Asn Thr Glu Arg Leu Ile Glu Ile Ala Ser Arg Glu Leu
1140 1145 1150
Glu Lys Ala Lys Val Ala Ala Ala Asn Val Ser Val Thr Gln Pro Glu
1155 1160 1165
Ser Thr Gly Asp Pro Asn Asn Met Thr Leu Leu Ala Glu Glu Ala Arg
1170 1175 1180
Lys Leu Ala Glu Arg His Lys Gln Glu Ala Asp Asp Ile Val Arg Val
1185 1190 1195 1200
Ala Lys Thr Ala Asn Asp Thr Ser Thr Glu Ala Tyr Asn Leu Leu Leu
1205 1210 1215
Arg Thr Leu Ala Gly Glu Asn Gln Thr Ala Phe Glu Ile Glu Glu Leu
1220 1225 1230
Asn Arg Lys Tyr Glu Gln Ala Lys Asn Ile Ser Gln Asp Leu Glu Lys
1235 1240 1245
Gln Ala Ala Arg Val His Glu Glu Ala Lys Arg Ala Gly Asp Lys Ala
1250 1255 1260
Val Glu Ile Tyr Ala Ser Val Ala Gln Leu Ser Pro Leu Asp Ser Glu
1265 1270 1275 1280
Thr Leu Glu Asn Glu Ala Asn Asn Ile Lys Met Glu Ala Glu Asn Leu
1285 1290 1295
Glu Gln Leu Ile Asp Gln Lys Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Leu Arg Glu
1300 1305 1310
Asp Met Arg Gly Lys Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Leu Glu Lys Gly
1315 1320 1325
Lys Thr Glu Gln Gln Thr Ala Asp Gln Leu Leu Ala Arg Ala Asp Ala
1330 1335 1340
Ala Lys Ala Leu Ala Glu Glu Ala Ala Lys Lys Gly Arg Asp Thr Leu
1345 1350 1355 1360
Gln Glu Ala Asn Asp Ile Leu Asn Asn Leu Lys Asp Phe Asp Arg Arg
1365 1370 1375
Val Asn Asp Asn Lys Thr Ala Ala Glu Glu Ala Leu Arg Lys Ile Pro
1380 1385 1390
Ala Ile Asn Gln Thr Ile Thr Glu Ala Asn Glu Lys Thr Arg Glu Ala
1395 1400 1405
Gln Gln Ala Leu Gly Ser Ala Ala Ala Asp Ala Thr Glu Ala Lys Asn
1410 1415 1420
Lys Ala His Glu Ala Glu Arg Ile Ala Ser Ala Val Gln Lys Asn Ala
1425 1430 1435 1440
Thr Ser Thr Lys Ala Glu Ala Glu Arg Thr Phe Ala Glu Val Thr Asp
1445 1450 1455
Leu Asp Asn Glu Val Asn Asn Met Leu Lys Gln Leu Gln Glu Ala Glu
1460 1465 1470
Lys Glu Leu Lys Arg Lys Gln Asp Asp Ala Asp Gln Asp Met Met Met
1475 1480 1485
Ala Gly Met Ala Ser Gln Ala Ala Gln Glu Ala Glu Ile Asn Ala Arg
1490 1495 1500
Lys Ala Lys Asn Ser Val Thr Ser Leu Leu Ser Ile Ile Asn Asp Leu
1505 1510 1515 1520
Leu Glu Gln Leu Gly Gln Leu Asp Thr Val Asp Leu Asn Lys Leu Asn
1525 1530 1535
Glu Ile Glu Gly Thr Leu Asn Lys Ala Lys Asp Glu Met Lys Val Ser
1540 1545 1550
Asp Leu Asp Arg Lys Val Ser Asp Leu Glu Asn Glu Ala Lys Lys Gln
1555 1560 1565
Glu Ala Ala Ile Met Asp Tyr Asn Arg Asp Ile Glu Glu Ile Met Lys
1570 1575 1580
Asp Ile Arg Asn Leu Glu Asp Ile Arg Lys Thr Leu Pro Ser Gly Cys
1585 1590 1595 1600
Phe Asn Thr Pro Ser Ile Glu Lys Pro
1605
<210> 120
<211> 4830
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 层粘连蛋白亚基γ-1（智人）的DNA序列
<400> 120
atgagaggga gccatcgggc cgcgccggcc ctgcggcccc gggggcggct ctggcccgtg 60
ctggccgtgc tggcggcggc cgccgcggcg ggctgtgccc aggcagccat ggacgagtgc 120
acggacgagg gcgggcggcc gcagcgctgc atgcccgagt tcgtcaacgc cgccttcaac 180
gtgactgtgg tggccaccaa cacgtgtggg actccgcccg aggaatactg tgtgcagacc 240
ggggtgaccg gggtcaccaa gtcctgtcac ctgtgcgacg ccgggcagcc ccacctgcag 300
cacggggcag ccttcctgac cgactacaac aaccaggccg acaccacctg gtggcaaagc 360
cagaccatgc tggccggggt gcagtacccc agctccatca acctcacgct gcacctggga 420
aaagcttttg acatcaccta tgtgcgtctc aagttccaca ccagccgccc ggagagcttt 480
gccatttaca agcgcacacg ggaagacggg ccctggattc cttaccagta ctacagtggt 540
tcctgtgaga acacctactc caaggcaaac cgcggcttca tcaggacagg aggggacgag 600
cagcaggcct tgtgtactga tgaattcagt gacatttctc ccctcactgg gggcaacgtg 660
gccttttcta ccctggaagg aaggcccagc gcctataact ttgacaatag ccctgtgctg 720
caggaatggg taactgccac tgacatcaga gtaactctta atcgcctgaa cacttttgga 780
gatgaagtgt ttaacgatcc caaagttctc aagtcctatt attatgccat ctctgatttt 840
gctgtaggtg gcagatgtaa atgtaatgga cacgcaagcg agtgtatgaa gaacgaattt 900
gataagctgg tgtgtaattg caaacataac acatatggag tagactgtga aaagtgtctt 960
cctttcttca atgaccggcc gtggaggagg gcaactgcgg aaagtgccag tgaatgcctg 1020
ccctgtgatt gcaatggtcg atcccaggaa tgctacttcg accctgaact ctatcgttcc 1080
actggccatg ggggccactg taccaactgc caggataaca cagatggcgc ccactgtgag 1140
aggtgccgag agaacttctt ccgccttggc aacaatgaag cctgctcttc atgccactgt 1200
agtcctgtgg gctctctaag cacacagtgt gatagttacg gcagatgcag ctgtaagcca 1260
ggagtgatgg gggacaaatg tgaccgttgc cagcctggat tccattctct cactgaagca 1320
ggatgcaggc catgctcttg tgatccctct ggcagcatag atgaatgtaa tattgaaaca 1380
ggaagatgtg tttgcaaaga caatgtcgaa ggcttcaatt gtgaaagatg caaacctgga 1440
ttttttaatc tggaatcatc taatcctcgg ggttgcacac cctgcttctg ctttgggcat 1500
tcttctgtct gtacaaacgc tgttggctac agtgtttatt ctatctcctc tacctttcag 1560
attgatgagg atgggtggcg tgcggaacag agagatggct ctgaagcatc tctcgagtgg 1620
tcctctgaga ggcaagatat cgccgtgatc tcagacagct actttcctcg gtacttcatt 1680
gctcctgcaa agttcttggg caagcaggtg ttgagttatg gtcagaacct ctccttctcc 1740
tttcgagtgg acaggcgaga tactcgcctc tctgcagaag accttgtgct tgagggagct 1800
ggcttaagag tatctgtacc cttgatcgct cagggcaatt cctatccaag tgagaccact 1860
gtgaagtatg tcttcaggct ccatgaagca acagattacc cttggaggcc tgctcttacc 1920
ccttttgaat ttcagaagct cctaaacaac ttgacctcta tcaagatacg tgggacatac 1980
agtgagagaa gtgctggata tttggatgat gtcaccctgg caagtgctcg tcctgggcct 2040
ggagtccctg caacttgggt ggagtcctgc acctgtcctg tgggatatgg agggcagttt 2100
tgtgagatgt gcctctcagg ttacagaaga gaaactccta atcttggacc atacagtcca 2160
tgtgtgcttt gcgcctgcaa tggacacagc gagacctgtg atcctgagac aggtgtttgt 2220
aactgcagag acaatacggc tggcccgcac tgtgagaagt gcagtgatgg gtactatgga 2280
gattcaactg caggcacctc ctccgattgc caaccctgtc cgtgtcctgg aggttcaagt 2340
tgtgctgttg ttcccaagac aaaggaggtg gtgtgcacca actgtcctac tggcaccact 2400
ggtaagagat gtgagctctg tgatgatggc tactttggag accccctggg tagaaacggc 2460
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tgtgaccggt gcaaagacgg attttttgga aatcccctgg ctcccaatcc agcagacaaa 2640
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aaaccctgtg actgtcatcc tgagggatct ctttcacttc agtgcaaaga tgatggtcgc 3000
tgtgaatgca gagaaggctt tgtgggaaat cgctgtgacc agtgtgaaga aaactatttc 3060
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gatcgcctac agagagtgaa taacactctg tccagccaaa ttagccgttt acagaatatc 3360
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acagagcggt tgattgaaat cgcatccaga gaacttgaga aagcaaaagt cgctgctgcc 3480
aatgtgtcag tcactcagcc agaatctaca ggggacccaa acaacatgac tcttttggca 3540
gaagaggctc gaaagcttgc tgaacgtcat aaacaggaag ctgatgacat tgttcgagtg 3600
gcaaagacag ccaatgatac gtcaactgag gcatacaacc tgcttctgag gacactggca 3660
ggagaaaatc aaacagcatt tgagattgaa gagcttaata ggaagtatga acaagcgaag 3720
aacatctcac aggatctgga aaaacaagct gcccgagtac atgaggaggc caaaagggcc 3780
ggtgacaaag ctgtggagat ctatgccagc gtggctcagc tgagcccttt ggactctgag 3840
acactggaga atgaagcaaa taacataaag atggaagctg agaatctgga acaactgatt 3900
gaccagaaat taaaagatta tgaggacctc agagaagata tgagagggaa ggaacttgaa 3960
gtcaagaacc ttctggagaa aggcaagact gaacagcaga ccgcagacca actcctagcc 4020
cgagctgatg ctgccaaggc cctcgctgaa gaagctgcaa agaagggacg ggatacctta 4080
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aagacggccg cagaggaggc actaaggaag attcctgcca tcaaccagac catcactgaa 4200
gccaatgaaa agaccagaga agcccagcag gccctgggca gtgctgcggc ggatgccaca 4260
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accagcacca aggcagaagc tgaaagaact tttgcagaag ttacagatct ggataatgag 4380
gtgaacaata tgttgaagca actgcaggaa gcagaaaaag agctaaagag aaaacaagat 4440
gacgctgacc aggacatgat gatggcaggg atggcttcac aggctgctca agaagccgag 4500
atcaatgcca gaaaagccaa aaactctgtt actagcctcc tcagcattat taatgacctc 4560
ttggagcagc tggggcagct ggatacagtg gacctgaata agctaaacga gattgaaggc 4620
accctaaaca aagccaaaga tgaaatgaag gtcagcgatc ttgataggaa agtgtctgac 4680
ctggagaatg aagccaagaa gcaggaggct gccatcatgg actataaccg agatatcgag 4740
gagatcatga aggacattcg caatctggag gacatcagga agaccttacc atctggctgc 4800
ttcaacaccc cgtccattga aaagccctag 4830
<210> 121
<211> 3122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 层粘连蛋白亚基α-2（智人）的氨基酸序列
<400> 121
Met Pro Gly Ala Ala Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Gly
1 5 10 15
Leu Gly Gly Val Gln Ala Gln Arg Pro Gln Gln Gln Arg Gln Ser Gln
20 25 30
Ala His Gln Gln Arg Gly Leu Phe Pro Ala Val Leu Asn Leu Ala Ser
35 40 45
Asn Ala Leu Ile Thr Thr Asn Ala Thr Cys Gly Glu Lys Gly Pro Glu
50 55 60
Met Tyr Cys Lys Leu Val Glu His Val Pro Gly Gln Pro Val Arg Asn
65 70 75 80
Pro Gln Cys Arg Ile Cys Asn Gln Asn Ser Ser Asn Pro Asn Gln Arg
85 90 95
His Pro Ile Thr Asn Ala Ile Asp Gly Lys Asn Thr Trp Trp Gln Ser
100 105 110
Pro Ser Ile Lys Asn Gly Ile Glu Tyr His Tyr Val Thr Ile Thr Leu
115 120 125
Asp Leu Gln Gln Val Phe Gln Ile Ala Tyr Val Ile Val Lys Ala Ala
130 135 140
Asn Ser Pro Arg Pro Gly Asn Trp Ile Leu Glu Arg Ser Leu Asp Asp
145 150 155 160
Val Glu Tyr Lys Pro Trp Gln Tyr His Ala Val Thr Asp Thr Glu Cys
165 170 175
Leu Thr Leu Tyr Asn Ile Tyr Pro Arg Thr Gly Pro Pro Ser Tyr Ala
180 185 190
Lys Asp Asp Glu Val Ile Cys Thr Ser Phe Tyr Ser Lys Ile His Pro
195 200 205
Leu Glu Asn Gly Glu Ile His Ile Ser Leu Ile Asn Gly Arg Pro Ser
210 215 220
Ala Asp Asp Pro Ser Pro Glu Leu Leu Glu Phe Thr Ser Ala Arg Tyr
225 230 235 240
Ile Arg Leu Arg Phe Gln Arg Ile Arg Thr Leu Asn Ala Asp Leu Met
245 250 255
Met Phe Ala His Lys Asp Pro Arg Glu Ile Asp Pro Ile Val Thr Arg
260 265 270
Arg Tyr Tyr Tyr Ser Val Lys Asp Ile Ser Val Gly Gly Met Cys Ile
275 280 285
Cys Tyr Gly His Ala Arg Ala Cys Pro Leu Asp Pro Ala Thr Asn Lys
290 295 300
Ser Arg Cys Glu Cys Glu His Asn Thr Cys Gly Asp Ser Cys Asp Gln
305 310 315 320
Cys Cys Pro Gly Phe His Gln Lys Pro Trp Arg Ala Gly Thr Phe Leu
325 330 335
Thr Lys Thr Glu Cys Glu Ala Cys Asn Cys His Gly Lys Ala Glu Glu
340 345 350
Cys Tyr Tyr Asp Glu Asn Val Ala Arg Arg Asn Leu Ser Leu Asn Ile
355 360 365
Arg Gly Lys Tyr Ile Gly Gly Gly Val Cys Ile Asn Cys Thr Gln Asn
370 375 380
Thr Ala Gly Ile Asn Cys Glu Thr Cys Thr Asp Gly Phe Phe Arg Pro
385 390 395 400
Lys Gly Val Ser Pro Asn Tyr Pro Arg Pro Cys Gln Pro Cys His Cys
405 410 415
Asp Pro Ile Gly Ser Leu Asn Glu Val Cys Val Lys Asp Glu Lys His
420 425 430
Ala Arg Arg Gly Leu Ala Pro Gly Ser Cys His Cys Lys Thr Gly Phe
435 440 445
Gly Gly Val Ser Cys Asp Arg Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Gly Tyr Pro
450 455 460
Asp Cys Lys Ala Cys Asn Cys Ser Gly Leu Gly Ser Lys Asn Glu Asp
465 470 475 480
Pro Cys Phe Gly Pro Cys Ile Cys Lys Glu Asn Val Glu Gly Gly Asp
485 490 495
Cys Ser Arg Cys Lys Ser Gly Phe Phe Asn Leu Gln Glu Asp Asn Trp
500 505 510
Lys Gly Cys Asp Glu Cys Phe Cys Ser Gly Val Ser Asn Arg Cys Gln
515 520 525
Ser Ser Tyr Trp Thr Tyr Gly Lys Ile Gln Asp Met Ser Gly Trp Tyr
530 535 540
Leu Thr Asp Leu Pro Gly Arg Ile Arg Val Ala Pro Gln Gln Asp Asp
545 550 555 560
Leu Asp Ser Pro Gln Gln Ile Ser Ile Ser Asn Ala Glu Ala Arg Gln
565 570 575
Ala Leu Pro His Ser Tyr Tyr Trp Ser Ala Pro Ala Pro Tyr Leu Gly
580 585 590
Asn Lys Leu Pro Ala Val Gly Gly Gln Leu Thr Phe Thr Ile Ser Tyr
595 600 605
Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Thr Glu Arg Val Leu Gln Leu Met
610 615 620
Ile Ile Leu Glu Gly Asn Asp Leu Ser Ile Ser Thr Ala Gln Asp Glu
625 630 635 640
Val Tyr Leu His Pro Ser Glu Glu His Thr Asn Val Leu Leu Leu Lys
645 650 655
Glu Glu Ser Phe Thr Ile His Gly Thr His Phe Pro Val Arg Arg Lys
660 665 670
Glu Phe Met Thr Val Leu Ala Asn Leu Lys Arg Val Leu Leu Gln Ile
675 680 685
Thr Tyr Ser Phe Gly Met Asp Ala Ile Phe Arg Leu Ser Ser Val Asn
690 695 700
Leu Glu Ser Ala Val Ser Tyr Pro Thr Asp Gly Ser Ile Ala Ala Ala
705 710 715 720
Val Glu Val Cys Gln Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Ser Ser Cys Glu
725 730 735
Ser Cys Trp Pro Arg His Arg Arg Val Asn Gly Thr Ile Phe Gly Gly
740 745 750
Ile Cys Glu Pro Cys Gln Cys Phe Gly His Ala Glu Ser Cys Asp Asp
755 760 765
Val Thr Gly Glu Cys Leu Asn Cys Lys Asp His Thr Gly Gly Pro Tyr
770 775 780
Cys Asp Lys Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Gly Glu Pro Thr Lys Gly Thr
785 790 795 800
Ser Glu Asp Cys Gln Pro Cys Ala Cys Pro Leu Asn Ile Pro Ser Asn
805 810 815
Asn Phe Ser Pro Thr Cys His Leu Asp Arg Ser Leu Gly Leu Ile Cys
820 825 830
Asp Gly Cys Pro Val Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Arg Cys Ala
835 840 845
Glu Gly Tyr Phe Gly Gln Pro Ser Val Pro Gly Gly Ser Cys Gln Pro
850 855 860
Cys Gln Cys Asn Asp Asn Leu Asp Phe Ser Ile Pro Gly Ser Cys Asp
865 870 875 880
Ser Leu Ser Gly Ser Cys Leu Ile Cys Lys Pro Gly Thr Thr Gly Arg
885 890 895
Tyr Cys Glu Leu Cys Ala Asp Gly Tyr Phe Gly Asp Ala Val Asp Ala
900 905 910
Lys Asn Cys Gln Pro Cys Arg Cys Asn Ala Gly Gly Ser Phe Ser Glu
915 920 925
Val Cys His Ser Gln Thr Gly Gln Cys Glu Cys Arg Ala Asn Val Gln
930 935 940
Gly Gln Arg Cys Asp Lys Cys Lys Ala Gly Thr Phe Gly Leu Gln Ser
945 950 955 960
Ala Arg Gly Cys Val Pro Cys Asn Cys Asn Ser Phe Gly Ser Lys Ser
965 970 975
Phe Asp Cys Glu Glu Ser Gly Gln Cys Trp Cys Gln Pro Gly Val Thr
980 985 990
Gly Lys Lys Cys Asp Arg Cys Ala His Gly Tyr Phe Asn Phe Gln Glu
995 1000 1005
Gly Gly Cys Thr Ala Cys Glu Cys Ser His Leu Gly Asn Asn Cys Asp
1010 1015 1020
Pro Lys Thr Gly Arg Cys Ile Cys Pro Pro Asn Thr Ile Gly Glu Lys
1025 1030 1035 1040
Cys Ser Lys Cys Ala Pro Asn Thr Trp Gly His Ser Ile Thr Thr Gly
1045 1050 1055
Cys Lys Ala Cys Asn Cys Ser Thr Val Gly Ser Leu Asp Phe Gln Cys
1060 1065 1070
Asn Val Asn Thr Gly Gln Cys Asn Cys His Pro Lys Phe Ser Gly Ala
1075 1080 1085
Lys Cys Thr Glu Cys Ser Arg Gly His Trp Asn Tyr Pro Arg Cys Asn
1090 1095 1100
Leu Cys Asp Cys Phe Leu Pro Gly Thr Asp Ala Thr Thr Cys Asp Ser
1105 1110 1115 1120
Glu Thr Lys Lys Cys Ser Cys Ser Asp Gln Thr Gly Gln Cys Thr Cys
1125 1130 1135
Lys Val Asn Val Glu Gly Ile His Cys Asp Arg Cys Arg Pro Gly Lys
1140 1145 1150
Phe Gly Leu Asp Ala Lys Asn Pro Leu Gly Cys Ser Ser Cys Tyr Cys
1155 1160 1165
Phe Gly Thr Thr Thr Gln Cys Ser Glu Ala Lys Gly Leu Ile Arg Thr
1170 1175 1180
Trp Val Thr Leu Lys Ala Glu Gln Thr Ile Leu Pro Leu Val Asp Glu
1185 1190 1195 1200
Ala Leu Gln His Thr Thr Thr Lys Gly Ile Val Phe Gln His Pro Glu
1205 1210 1215
Ile Val Ala His Met Asp Leu Met Arg Glu Asp Leu His Leu Glu Pro
1220 1225 1230
Phe Tyr Trp Lys Leu Pro Glu Gln Phe Glu Gly Lys Lys Leu Met Ala
1235 1240 1245
Tyr Gly Gly Lys Leu Lys Tyr Ala Ile Tyr Phe Glu Ala Arg Glu Glu
1250 1255 1260
Thr Gly Phe Ser Thr Tyr Asn Pro Gln Val Ile Ile Arg Gly Gly Thr
1265 1270 1275 1280
Pro Thr His Ala Arg Ile Ile Val Arg His Met Ala Ala Pro Leu Ile
1285 1290 1295
Gly Gln Leu Thr Arg His Glu Ile Glu Met Thr Glu Lys Glu Trp Lys
1300 1305 1310
Tyr Tyr Gly Asp Asp Pro Arg Val His Arg Thr Val Thr Arg Glu Asp
1315 1320 1325
Phe Leu Asp Ile Leu Tyr Asp Ile His Tyr Ile Leu Ile Lys Ala Thr
1330 1335 1340
Tyr Gly Asn Phe Met Arg Gln Ser Arg Ile Ser Glu Ile Ser Met Glu
1345 1350 1355 1360
Val Ala Glu Gln Gly Arg Gly Thr Thr Met Thr Pro Pro Ala Asp Leu
1365 1370 1375
Ile Glu Lys Cys Asp Cys Pro Leu Gly Tyr Ser Gly Leu Ser Cys Glu
1380 1385 1390
Ala Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Leu Arg Ser Gln Pro Gly Gly Arg
1395 1400 1405
Thr Pro Gly Pro Thr Leu Gly Thr Cys Val Pro Cys Gln Cys Asn Gly
1410 1415 1420
His Ser Ser Leu Cys Asp Pro Glu Thr Ser Ile Cys Gln Asn Cys Gln
1425 1430 1435 1440
His His Thr Ala Gly Asp Phe Cys Glu Arg Cys Ala Leu Gly Tyr Tyr
1445 1450 1455
Gly Ile Val Lys Gly Leu Pro Asn Asp Cys Gln Gln Cys Ala Cys Pro
1460 1465 1470
Leu Ile Ser Ser Ser Asn Asn Phe Ser Pro Ser Cys Val Ala Glu Gly
1475 1480 1485
Leu Asp Asp Tyr Arg Cys Thr Ala Cys Pro Arg Gly Tyr Glu Gly Gln
1490 1495 1500
Tyr Cys Glu Arg Cys Ala Pro Gly Tyr Thr Gly Ser Pro Gly Asn Pro
1505 1510 1515 1520
Gly Gly Ser Cys Gln Glu Cys Glu Cys Asp Pro Tyr Gly Ser Leu Pro
1525 1530 1535
Val Pro Cys Asp Pro Val Thr Gly Phe Cys Thr Cys Arg Pro Gly Ala
1540 1545 1550
Thr Gly Arg Lys Cys Asp Gly Cys Lys His Trp His Ala Arg Glu Gly
1555 1560 1565
Trp Glu Cys Val Phe Cys Gly Asp Glu Cys Thr Gly Leu Leu Leu Gly
1570 1575 1580
Asp Leu Ala Arg Leu Glu Gln Met Val Met Ser Ile Asn Leu Thr Gly
1585 1590 1595 1600
Pro Leu Pro Ala Pro Tyr Lys Met Leu Tyr Gly Leu Glu Asn Met Thr
1605 1610 1615
Gln Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Pro Gln Arg Ala Pro Glu Arg Leu
1620 1625 1630
Ile Gln Leu Ala Glu Gly Asn Leu Asn Thr Leu Val Thr Glu Met Asn
1635 1640 1645
Glu Leu Leu Thr Arg Ala Thr Lys Val Thr Ala Asp Gly Glu Gln Thr
1650 1655 1660
Gly Gln Asp Ala Glu Arg Thr Asn Thr Arg Ala Lys Ser Leu Gly Glu
1665 1670 1675 1680
Phe Ile Lys Glu Leu Ala Arg Asp Ala Glu Ala Val Asn Glu Lys Ala
1685 1690 1695
Ile Lys Leu Asn Glu Thr Leu Gly Thr Arg Asp Glu Ala Phe Glu Arg
1700 1705 1710
Asn Leu Glu Gly Leu Gln Lys Glu Ile Asp Gln Met Ile Lys Glu Leu
1715 1720 1725
Arg Arg Lys Asn Leu Glu Thr Gln Lys Glu Ile Ala Glu Asp Glu Leu
1730 1735 1740
Val Ala Ala Glu Ala Leu Leu Lys Lys Val Lys Lys Leu Phe Gly Glu
1745 1750 1755 1760
Ser Arg Gly Glu Asn Glu Glu Met Glu Lys Asp Leu Arg Glu Lys Leu
1765 1770 1775
Ala Asp Tyr Lys Asn Lys Val Asp Asp Ala Trp Asp Leu Leu Arg Glu
1780 1785 1790
Ala Thr Asp Lys Ile Arg Glu Ala Asn Arg Leu Phe Ala Val Asn Gln
1795 1800 1805
Lys Asn Met Thr Ala Leu Glu Lys Lys Lys Glu Ala Val Glu Ser Gly
1810 1815 1820
Lys Arg Gln Ile Glu Asn Thr Leu Lys Glu Gly Asn Asp Ile Leu Asp
1825 1830 1835 1840
Glu Ala Asn Arg Leu Ala Asp Glu Ile Asn Ser Ile Ile Asp Tyr Val
1845 1850 1855
Glu Asp Ile Gln Thr Lys Leu Pro Pro Met Ser Glu Glu Leu Asn Asp
1860 1865 1870
Lys Ile Asp Asp Leu Ser Gln Glu Ile Lys Asp Arg Lys Leu Ala Glu
1875 1880 1885
Lys Val Ser Gln Ala Glu Ser His Ala Ala Gln Leu Asn Asp Ser Ser
1890 1895 1900
Ala Val Leu Asp Gly Ile Leu Asp Glu Ala Lys Asn Ile Ser Phe Asn
1905 1910 1915 1920
Ala Thr Ala Ala Phe Lys Ala Tyr Ser Asn Ile Lys Asp Tyr Ile Asp
1925 1930 1935
Glu Ala Glu Lys Val Ala Lys Glu Ala Lys Asp Leu Ala His Glu Ala
1940 1945 1950
Thr Lys Leu Ala Thr Gly Pro Arg Gly Leu Leu Lys Glu Asp Ala Lys
1955 1960 1965
Gly Cys Leu Gln Lys Ser Phe Arg Ile Leu Asn Glu Ala Lys Lys Leu
1970 1975 1980
Ala Asn Asp Val Lys Glu Asn Glu Asp His Leu Asn Gly Leu Lys Thr
1985 1990 1995 2000
Arg Ile Glu Asn Ala Asp Ala Arg Asn Gly Asp Leu Leu Arg Thr Leu
2005 2010 2015
Asn Asp Thr Leu Gly Lys Leu Ser Ala Ile Pro Asn Asp Thr Ala Ala
2020 2025 2030
Lys Leu Gln Ala Val Lys Asp Lys Ala Arg Gln Ala Asn Asp Thr Ala
2035 2040 2045
Lys Asp Val Leu Ala Gln Ile Thr Glu Leu His Gln Asn Leu Asp Gly
2050 2055 2060
Leu Lys Lys Asn Tyr Asn Lys Leu Ala Asp Ser Val Ala Lys Thr Asn
2065 2070 2075 2080
Ala Val Val Lys Asp Pro Ser Lys Asn Lys Ile Ile Ala Asp Ala Asp
2085 2090 2095
Ala Thr Val Lys Asn Leu Glu Gln Glu Ala Asp Arg Leu Ile Asp Lys
2100 2105 2110
Leu Lys Pro Ile Lys Glu Leu Glu Asp Asn Leu Lys Lys Asn Ile Ser
2115 2120 2125
Glu Ile Lys Glu Leu Ile Asn Gln Ala Arg Lys Gln Ala Asn Ser Ile
2130 2135 2140
Lys Val Ser Val Ser Ser Gly Gly Asp Cys Ile Arg Thr Tyr Lys Pro
2145 2150 2155 2160
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2195 2200 2205
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2210 2215 2220
Asp Asp Ser Tyr Trp Tyr Arg Ile Val Ala Ser Arg Thr Gly Arg Asn
2225 2230 2235 2240
Gly Thr Ile Ser Val Arg Ala Leu Asp Gly Pro Lys Ala Ser Ile Val
2245 2250 2255
Pro Ser Thr His His Ser Thr Ser Pro Pro Gly Tyr Thr Ile Leu Asp
2260 2265 2270
Val Asp Ala Asn Ala Met Leu Phe Val Gly Gly Leu Thr Gly Lys Leu
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Lys Lys Ala Asp Ala Val Arg Val Ile Thr Phe Thr Gly Cys Met Gly
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2340 2345 2350
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Ser Val His Val Glu Arg Thr Arg Gly Ile Phe Thr Val Gln Val Asp
2625 2630 2635 2640
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2645 2650 2655
Val Lys Lys Leu Phe Val Gly Gly Ala Pro Pro Glu Phe Gln Pro Ser
2660 2665 2670
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2675 2680 2685
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2725 2730 2735
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2740 2745 2750
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2770 2775 2780
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2820 2825 2830
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Lys Ile Lys Ile Met Arg Ser Lys Gln Glu Gly Ile Leu Tyr Val Asp
2850 2855 2860
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2865 2870 2875 2880
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2885 2890 2895
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2930 2935 2940
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2945 2950 2955 2960
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2965 2970 2975
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2980 2985 2990
Ile Asp Glu Lys Leu Met Phe His Val Asp Asn Gly Ala Gly Arg Phe
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 层粘连蛋白亚基α-5（智人）的氨基酸序列
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1330 1335 1340
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1380 1385 1390
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1395 1400 1405
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1410 1415 1420
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1540 1545 1550
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1955 1960 1965
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Pro Arg Cys Glu Ile Cys Ala Pro Gly Phe Tyr Gly Asn Ala Leu Leu
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2020 2025 2030
Cys Asp Pro His Ser Gly His Cys Leu Cys Lys Ala Gly Val Thr Gly
2035 2040 2045
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2050 2055 2060
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2085 2090 2095
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Met Gly Ser Arg Gln Ala Thr Gly Asp Tyr Met Gly Val Ser Leu Arg
2785 2790 2795 2800
Asp Lys Lys Val His Trp Val Tyr Gln Leu Gly Glu Ala Gly Pro Ala
2805 2810 2815
Val Leu Ser Ile Asp Glu Asp Ile Gly Glu Gln Phe Ala Ala Val Ser
2820 2825 2830
Leu Asp Arg Thr Leu Gln Phe Gly His Met Ser Val Thr Val Glu Arg
2835 2840 2845
Gln Met Ile Gln Glu Thr Lys Gly Asp Thr Val Ala Pro Gly Ala Glu
2850 2855 2860
Gly Leu Leu Asn Leu Arg Pro Asp Asp Phe Val Phe Tyr Val Gly Gly
2865 2870 2875 2880
Tyr Pro Ser Thr Phe Thr Pro Pro Pro Leu Leu Arg Phe Pro Gly Tyr
2885 2890 2895
Arg Gly Cys Ile Glu Met Asp Thr Leu Asn Glu Glu Val Val Ser Leu
2900 2905 2910
Tyr Asn Phe Glu Arg Thr Phe Gln Leu Asp Thr Ala Val Asp Arg Pro
2915 2920 2925
Cys Ala Arg Ser Lys Ser Thr Gly Asp Pro Trp Leu Thr Asp Gly Ser
2930 2935 2940
Tyr Leu Asp Gly Thr Gly Phe Ala Arg Ile Ser Phe Asp Ser Gln Ile
2945 2950 2955 2960
Ser Thr Thr Lys Arg Phe Glu Gln Glu Leu Arg Leu Val Ser Tyr Ser
2965 2970 2975
Gly Val Leu Phe Phe Leu Lys Gln Gln Ser Gln Phe Leu Cys Leu Ala
2980 2985 2990
Val Gln Glu Gly Ser Leu Val Leu Leu Tyr Asp Phe Gly Ala Gly Leu
2995 3000 3005
Lys Lys Ala Val Pro Leu Gln Pro Pro Pro Pro Leu Thr Ser Ala Ser
3010 3015 3020
Lys Ala Ile Gln Val Phe Leu Leu Gly Gly Ser Arg Lys Arg Val Leu
3025 3030 3035 3040
Val Arg Val Glu Arg Ala Thr Val Tyr Ser Val Glu Gln Asp Asn Asp
3045 3050 3055
Leu Glu Leu Ala Asp Ala Tyr Tyr Leu Gly Gly Val Pro Pro Asp Gln
3060 3065 3070
Leu Pro Pro Ser Leu Arg Arg Leu Phe Pro Thr Gly Gly Ser Val Arg
3075 3080 3085
Gly Cys Val Lys Gly Ile Lys Ala Leu Gly Lys Tyr Val Asp Leu Lys
3090 3095 3100
Arg Leu Asn Thr Thr Gly Val Ser Ala Gly Cys Thr Ala Asp Leu Leu
3105 3110 3115 3120
Val Gly Arg Ala Met Thr Phe His Gly His Gly Phe Leu Arg Leu Ala
3125 3130 3135
Leu Ser Asn Val Ala Pro Leu Thr Gly Asn Val Tyr Ser Gly Phe Gly
3140 3145 3150
Phe His Ser Ala Gln Asp Ser Ala Leu Leu Tyr Tyr Arg Ala Ser Pro
3155 3160 3165
Asp Gly Leu Cys Gln Val Ser Leu Gln Gln Gly Arg Val Ser Leu Gln
3170 3175 3180
Leu Leu Arg Thr Glu Val Lys Thr Gln Ala Gly Phe Ala Asp Gly Ala
3185 3190 3195 3200
Pro His Tyr Val Ala Phe Tyr Ser Asn Ala Thr Gly Val Trp Leu Tyr
3205 3210 3215
Val Asp Asp Gln Leu Gln Gln Met Lys Pro His Arg Gly Pro Pro Pro
3220 3225 3230
Glu Leu Gln Pro Gln Pro Glu Gly Pro Pro Arg Leu Leu Leu Gly Gly
3235 3240 3245
Leu Pro Glu Ser Gly Thr Ile Tyr Asn Phe Ser Gly Cys Ile Ser Asn
3250 3255 3260
Val Phe Val Gln Arg Leu Leu Gly Pro Gln Arg Val Phe Asp Leu Gln
3265 3270 3275 3280
Gln Asn Leu Gly Ser Val Asn Val Ser Thr Gly Cys Ala Pro Ala Leu
3285 3290 3295
Gln Ala Gln Thr Pro Gly Leu Gly Pro Arg Gly Leu Gln Ala Thr Ala
3300 3305 3310
Arg Lys Ala Ser Arg Arg Ser Arg Gln Pro Ala Arg His Pro Ala Cys
3315 3320 3325
Met Leu Pro Pro His Leu Arg Thr Thr Arg Asp Ser Tyr Gln Phe Gly
3330 3335 3340
Gly Ser Leu Ser Ser His Leu Glu Phe Val Gly Ile Leu Ala Arg His
3345 3350 3355 3360
Arg Asn Trp Pro Ser Leu Ser Met His Val Leu Pro Arg Ser Ser Arg
3365 3370 3375
Gly Leu Leu Leu Phe Thr Ala Arg Leu Arg Pro Gly Ser Pro Ser Leu
3380 3385 3390
Ala Leu Phe Leu Ser Asn Gly His Phe Val Ala Gln Met Glu Gly Leu
3395 3400 3405
Gly Thr Arg Leu Arg Ala Gln Ser Arg Gln Arg Ser Arg Pro Gly Arg
3410 3415 3420
Trp His Lys Val Ser Val Arg Trp Glu Lys Asn Arg Ile Leu Leu Val
3425 3430 3435 3440
Thr Asp Gly Ala Arg Ala Trp Ser Gln Glu Gly Pro His Arg Gln His
3445 3450 3455
Gln Gly Ala Glu His Pro Gln Pro His Thr Leu Phe Val Gly Gly Leu
3460 3465 3470
Pro Ala Ser Ser His Ser Ser Lys Leu Pro Val Thr Val Gly Phe Ser
3475 3480 3485
Gly Cys Val Lys Arg Leu Arg Leu His Gly Arg Pro Leu Gly Ala Pro
3490 3495 3500
Thr Arg Met Ala Gly Val Thr Pro Cys Ile Leu Gly Pro Leu Glu Ala
3505 3510 3515 3520
Gly Leu Phe Phe Pro Gly Ser Gly Gly Val Ile Thr Leu Asp Leu Pro
3525 3530 3535
Gly Ala Thr Leu Pro Asp Val Gly Leu Glu Leu Glu Val Arg Pro Leu
3540 3545 3550
Ala Val Thr Gly Leu Ile Phe His Leu Gly Gln Ala Arg Thr Pro Pro
3555 3560 3565
Tyr Leu Gln Leu Gln Val Thr Glu Lys Gln Val Leu Leu Arg Ala Asp
3570 3575 3580
Asp Gly Ala Gly Glu Phe Ser Thr Ser Val Thr Arg Pro Ser Val Leu
3585 3590 3595 3600
Cys Asp Gly Gln Trp His Arg Leu Ala Val Met Lys Ser Gly Asn Val
3605 3610 3615
Leu Arg Leu Glu Val Asp Ala Gln Ser Asn His Thr Val Gly Pro Leu
3620 3625 3630
Leu Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro Ala Pro Leu Tyr Leu Gly Gly Leu
3635 3640 3645
Pro Glu Pro Met Ala Val Gln Pro Trp Pro Pro Ala Tyr Cys Gly Cys
3650 3655 3660
Met Arg Arg Leu Ala Val Asn Arg Ser Pro Val Ala Met Thr Arg Ser
3665 3670 3675 3680
Val Glu Val His Gly Ala Val Gly Ala Ser Gly Cys Pro Ala Ala
3685 3690 3695
<210> 123
<211> 1786
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 层粘连蛋白亚基β-1（智人）的氨基酸序列
<400> 123
Met Gly Leu Leu Gln Leu Leu Ala Phe Ser Phe Leu Ala Leu Cys Arg
1 5 10 15
Ala Arg Val Arg Ala Gln Glu Pro Glu Phe Ser Tyr Gly Cys Ala Glu
20 25 30
Gly Ser Cys Tyr Pro Ala Thr Gly Asp Leu Leu Ile Gly Arg Ala Gln
35 40 45
Lys Leu Ser Val Thr Ser Thr Cys Gly Leu His Lys Pro Glu Pro Tyr
50 55 60
Cys Ile Val Ser His Leu Gln Glu Asp Lys Lys Cys Phe Ile Cys Asn
65 70 75 80
Ser Gln Asp Pro Tyr His Glu Thr Leu Asn Pro Asp Ser His Leu Ile
85 90 95
Glu Asn Val Val Thr Thr Phe Ala Pro Asn Arg Leu Lys Ile Trp Trp
100 105 110
Gln Ser Glu Asn Gly Val Glu Asn Val Thr Ile Gln Leu Asp Leu Glu
115 120 125
Ala Glu Phe His Phe Thr His Leu Ile Met Thr Phe Lys Thr Phe Arg
130 135 140
Pro Ala Ala Met Leu Ile Glu Arg Ser Ser Asp Phe Gly Lys Thr Trp
145 150 155 160
Gly Val Tyr Arg Tyr Phe Ala Tyr Asp Cys Glu Ala Ser Phe Pro Gly
165 170 175
Ile Ser Thr Gly Pro Met Lys Lys Val Asp Asp Ile Ile Cys Asp Ser
180 185 190
Arg Tyr Ser Asp Ile Glu Pro Ser Thr Glu Gly Glu Val Ile Phe Arg
195 200 205
Ala Leu Asp Pro Ala Phe Lys Ile Glu Asp Pro Tyr Ser Pro Arg Ile
210 215 220
Gln Asn Leu Leu Lys Ile Thr Asn Leu Arg Ile Lys Phe Val Lys Leu
225 230 235 240
His Thr Leu Gly Asp Asn Leu Leu Asp Ser Arg Met Glu Ile Arg Glu
245 250 255
Lys Tyr Tyr Tyr Ala Val Tyr Asp Met Val Val Arg Gly Asn Cys Phe
260 265 270
Cys Tyr Gly His Ala Ser Glu Cys Ala Pro Val Asp Gly Phe Asn Glu
275 280 285
Glu Val Glu Gly Met Val His Gly His Cys Met Cys Arg His Asn Thr
290 295 300
Lys Gly Leu Asn Cys Glu Leu Cys Met Asp Phe Tyr His Asp Leu Pro
305 310 315 320
Trp Arg Pro Ala Glu Gly Arg Asn Ser Asn Ala Cys Lys Lys Cys Asn
325 330 335
Cys Asn Glu His Ser Ile Ser Cys His Phe Asp Met Ala Val Tyr Leu
340 345 350
Ala Thr Gly Asn Val Ser Gly Gly Val Cys Asp Asp Cys Gln His Asn
355 360 365
Thr Met Gly Arg Asn Cys Glu Gln Cys Lys Pro Phe Tyr Tyr Gln His
370 375 380
Pro Glu Arg Asp Ile Arg Asp Pro Asn Phe Cys Glu Arg Cys Thr Cys
385 390 395 400
Asp Pro Ala Gly Ser Gln Asn Glu Gly Ile Cys Asp Ser Tyr Thr Asp
405 410 415
Phe Ser Thr Gly Leu Ile Ala Gly Gln Cys Arg Cys Lys Leu Asn Val
420 425 430
Glu Gly Glu His Cys Asp Val Cys Lys Glu Gly Phe Tyr Asp Leu Ser
435 440 445
Ser Glu Asp Pro Phe Gly Cys Lys Ser Cys Ala Cys Asn Pro Leu Gly
450 455 460
Thr Ile Pro Gly Gly Asn Pro Cys Asp Ser Glu Thr Gly His Cys Tyr
465 470 475 480
Cys Lys Arg Leu Val Thr Gly Gln His Cys Asp Gln Cys Leu Pro Glu
485 490 495
His Trp Gly Leu Ser Asn Asp Leu Asp Gly Cys Arg Pro Cys Asp Cys
500 505 510
Asp Leu Gly Gly Ala Leu Asn Asn Ser Cys Phe Ala Glu Ser Gly Gln
515 520 525
Cys Ser Cys Arg Pro His Met Ile Gly Arg Gln Cys Asn Glu Val Glu
530 535 540
Pro Gly Tyr Tyr Phe Ala Thr Leu Asp His Tyr Leu Tyr Glu Ala Glu
545 550 555 560
Glu Ala Asn Leu Gly Pro Gly Val Ser Ile Val Glu Arg Gln Tyr Ile
565 570 575
Gln Asp Arg Ile Pro Ser Trp Thr Gly Ala Gly Phe Val Arg Val Pro
580 585 590
Glu Gly Ala Tyr Leu Glu Phe Phe Ile Asp Asn Ile Pro Tyr Ser Met
595 600 605
Glu Tyr Asp Ile Leu Ile Arg Tyr Glu Pro Gln Leu Pro Asp His Trp
610 615 620
Glu Lys Ala Val Ile Thr Val Gln Arg Pro Gly Arg Ile Pro Thr Ser
625 630 635 640
Ser Arg Cys Gly Asn Thr Ile Pro Asp Asp Asp Asn Gln Val Val Ser
645 650 655
Leu Ser Pro Gly Ser Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg Pro Val Cys Phe
660 665 670
Glu Lys Gly Thr Asn Tyr Thr Val Arg Leu Glu Leu Pro Gln Tyr Thr
675 680 685
Ser Ser Asp Ser Asp Val Glu Ser Pro Tyr Thr Leu Ile Asp Ser Leu
690 695 700
Val Leu Met Pro Tyr Cys Lys Ser Leu Asp Ile Phe Thr Val Gly Gly
705 710 715 720
Ser Gly Asp Gly Val Val Thr Asn Ser Ala Trp Glu Thr Phe Gln Arg
725 730 735
Tyr Arg Cys Leu Glu Asn Ser Arg Ser Val Val Lys Thr Pro Met Thr
740 745 750
Asp Val Cys Arg Asn Ile Ile Phe Ser Ile Ser Ala Leu Leu His Gln
755 760 765
Thr Gly Leu Ala Cys Glu Cys Asp Pro Gln Gly Ser Leu Ser Ser Val
770 775 780
Cys Asp Pro Asn Gly Gly Gln Cys Gln Cys Arg Pro Asn Val Val Gly
785 790 795 800
Arg Thr Cys Asn Arg Cys Ala Pro Gly Thr Phe Gly Phe Gly Pro Ser
805 810 815
Gly Cys Lys Pro Cys Glu Cys His Leu Gln Gly Ser Val Asn Ala Phe
820 825 830
Cys Asn Pro Val Thr Gly Gln Cys His Cys Phe Gln Gly Val Tyr Ala
835 840 845
Arg Gln Cys Asp Arg Cys Leu Pro Gly His Trp Gly Phe Pro Ser Cys
850 855 860
Gln Pro Cys Gln Cys Asn Gly His Ala Asp Asp Cys Asp Pro Val Thr
865 870 875 880
Gly Glu Cys Leu Asn Cys Gln Asp Tyr Thr Met Gly His Asn Cys Glu
885 890 895
Arg Cys Leu Ala Gly Tyr Tyr Gly Asp Pro Ile Ile Gly Ser Gly Asp
900 905 910
His Cys Arg Pro Cys Pro Cys Pro Asp Gly Pro Asp Ser Gly Arg Gln
915 920 925
Phe Ala Arg Ser Cys Tyr Gln Asp Pro Val Thr Leu Gln Leu Ala Cys
930 935 940
Val Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg Cys Asp Asp Cys Ala Ser
945 950 955 960
Gly Tyr Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val Gly Gly Ser Cys Gln Pro Cys
965 970 975
Gln Cys His Asn Asn Ile Asp Thr Thr Asp Pro Glu Ala Cys Asp Lys
980 985 990
Glu Thr Gly Arg Cys Leu Lys Cys Leu Tyr His Thr Glu Gly Glu His
995 1000 1005
Cys Gln Phe Cys Arg Phe Gly Tyr Tyr Gly Asp Ala Leu Gln Gln Asp
1010 1015 1020
Cys Arg Lys Cys Val Cys Asn Tyr Leu Gly Thr Val Gln Glu His Cys
1025 1030 1035 1040
Asn Gly Ser Asp Cys Gln Cys Asp Lys Ala Thr Gly Gln Cys Leu Cys
1045 1050 1055
Leu Pro Asn Val Ile Gly Gln Asn Cys Asp Arg Cys Ala Pro Asn Thr
1060 1065 1070
Trp Gln Leu Ala Ser Gly Thr Gly Cys Asp Pro Cys Asn Cys Asn Ala
1075 1080 1085
Ala His Ser Phe Gly Pro Ser Cys Asn Glu Phe Thr Gly Gln Cys Gln
1090 1095 1100
Cys Met Pro Gly Phe Gly Gly Arg Thr Cys Ser Glu Cys Gln Glu Leu
1105 1110 1115 1120
Phe Trp Gly Asp Pro Asp Val Glu Cys Arg Ala Cys Asp Cys Asp Pro
1125 1130 1135
Arg Gly Ile Glu Thr Pro Gln Cys Asp Gln Ser Thr Gly Gln Cys Val
1140 1145 1150
Cys Val Glu Gly Val Glu Gly Pro Arg Cys Asp Lys Cys Thr Arg Gly
1155 1160 1165
Tyr Ser Gly Val Phe Pro Asp Cys Thr Pro Cys His Gln Cys Phe Ala
1170 1175 1180
Leu Trp Asp Val Ile Ile Ala Glu Leu Thr Asn Arg Thr His Arg Phe
1185 1190 1195 1200
Leu Glu Lys Ala Lys Ala Leu Lys Ile Ser Gly Val Ile Gly Pro Tyr
1205 1210 1215
Arg Glu Thr Val Asp Ser Val Glu Arg Lys Val Ser Glu Ile Lys Asp
1220 1225 1230
Ile Leu Ala Gln Ser Pro Ala Ala Glu Pro Leu Lys Asn Ile Gly Asn
1235 1240 1245
Leu Phe Glu Glu Ala Glu Lys Leu Ile Lys Asp Val Thr Glu Met Met
1250 1255 1260
Ala Gln Val Glu Val Lys Leu Ser Asp Thr Thr Ser Gln Ser Asn Ser
1265 1270 1275 1280
Thr Ala Lys Glu Leu Asp Ser Leu Gln Thr Glu Ala Glu Ser Leu Asp
1285 1290 1295
Asn Thr Val Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Glu Phe Ile Lys Asn Ser
1300 1305 1310
Asp Ile Arg Gly Ala Leu Asp Ser Ile Thr Lys Tyr Phe Gln Met Ser
1315 1320 1325
Leu Glu Ala Glu Glu Arg Val Asn Ala Ser Thr Thr Glu Pro Asn Ser
1330 1335 1340
Thr Val Glu Gln Ser Ala Leu Met Arg Asp Arg Val Glu Asp Val Met
1345 1350 1355 1360
Met Glu Arg Glu Ser Gln Phe Lys Glu Lys Gln Glu Glu Gln Ala Arg
1365 1370 1375
Leu Leu Asp Glu Leu Ala Gly Lys Leu Gln Ser Leu Asp Leu Ser Ala
1380 1385 1390
Ala Ala Glu Met Thr Cys Gly Thr Pro Pro Gly Ala Ser Cys Ser Glu
1395 1400 1405
Thr Glu Cys Gly Gly Pro Asn Cys Arg Thr Asp Glu Gly Glu Arg Lys
1410 1415 1420
Cys Gly Gly Pro Gly Cys Gly Gly Leu Val Thr Val Ala His Asn Ala
1425 1430 1435 1440
Trp Gln Lys Ala Met Asp Leu Asp Gln Asp Val Leu Ser Ala Leu Ala
1445 1450 1455
Glu Val Glu Gln Leu Ser Lys Met Val Ser Glu Ala Lys Leu Arg Ala
1460 1465 1470
Asp Glu Ala Lys Gln Ser Ala Glu Asp Ile Leu Leu Lys Thr Asn Ala
1475 1480 1485
Thr Lys Glu Lys Met Asp Lys Ser Asn Glu Glu Leu Arg Asn Leu Ile
1490 1495 1500
Lys Gln Ile Arg Asn Phe Leu Thr Gln Asp Ser Ala Asp Leu Asp Ser
1505 1510 1515 1520
Ile Glu Ala Val Ala Asn Glu Val Leu Lys Met Glu Met Pro Ser Thr
1525 1530 1535
Pro Gln Gln Leu Gln Asn Leu Thr Glu Asp Ile Arg Glu Arg Val Glu
1540 1545 1550
Ser Leu Ser Gln Val Glu Val Ile Leu Gln His Ser Ala Ala Asp Ile
1555 1560 1565
Ala Arg Ala Glu Met Leu Leu Glu Glu Ala Lys Arg Ala Ser Lys Ser
1570 1575 1580
Ala Thr Asp Val Lys Val Thr Ala Asp Met Val Lys Glu Ala Leu Glu
1585 1590 1595 1600
Glu Ala Glu Lys Ala Gln Val Ala Ala Glu Lys Ala Ile Lys Gln Ala
1605 1610 1615
Asp Glu Asp Ile Gln Gly Thr Gln Asn Leu Leu Thr Ser Ile Glu Ser
1620 1625 1630
Glu Thr Ala Ala Ser Glu Glu Thr Leu Phe Asn Ala Ser Gln Arg Ile
1635 1640 1645
Ser Glu Leu Glu Arg Asn Val Glu Glu Leu Lys Arg Lys Ala Ala Gln
1650 1655 1660
Asn Ser Gly Glu Ala Glu Tyr Ile Glu Lys Val Val Tyr Thr Val Lys
1665 1670 1675 1680
Gln Ser Ala Glu Asp Val Lys Lys Thr Leu Asp Gly Glu Leu Asp Glu
1685 1690 1695
Lys Tyr Lys Lys Val Glu Asn Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Glu Ser
1700 1705 1710
Ala Asp Ala Arg Arg Lys Ala Glu Met Leu Gln Asn Glu Ala Lys Thr
1715 1720 1725
Leu Leu Ala Gln Ala Asn Ser Lys Leu Gln Leu Leu Lys Asp Leu Glu
1730 1735 1740
Arg Lys Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Tyr Leu Glu Asp Lys Ala Gln Glu
1745 1750 1755 1760
Leu Ala Arg Leu Glu Gly Glu Val Arg Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ser
1765 1770 1775
Gln Lys Val Ala Val Tyr Ser Thr Cys Leu
1780 1785

Claims (22)

1.一种抗体或其片段，其特征在于，其与暴露于细胞外的赖氨酰-tRNA合成酶N末端区域特异性结合；
所述抗体或其片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区及轻链可变区选自由以下组成的群组：
包括重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的重链可变区以及包括轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的轻链可变区，所述重链互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述重链互补决定区2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述重链互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示，所述轻链互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，所述轻链互补决定区2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，所述轻链互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
包括重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的重链可变区以及包括轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的轻链可变区，所述重链互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示，所述重链互补决定区2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 15所示，所述重链互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示，所述轻链互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示，所述轻链互补决定区2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 21所示，所述轻链互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示；
包括重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的重链可变区以及包括轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的轻链可变区，所述重链互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示，所述重链互补决定区2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 27所示，所述重链互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 29所示，所述轻链互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 31所示，所述轻链互补决定区2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 33所示，所述轻链互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 35所示；以及
包括重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的重链可变区以及包括轻链互补决定区1、轻链互补决定区2以及轻链互补决定区3的轻链可变区，所述重链互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 37所示，所述重链互补决定区2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 39所示，所述重链互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 41所示，所述轻链互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 43所示，所述轻链互补决定区2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 45所示，所述轻链互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 47所示。
2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区及轻链可变区选自由以下组成的群组：
所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 49所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQID NO: 51所示的氨基酸序列；
所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 53所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQID NO: 55所示的氨基酸序列；
所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 57所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQID NO: 59所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 61所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQID NO: 63所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体选自由IgG、IgA、IgM、IgE及IgD组成的群组，所述片段选自由双链抗体、Fab、Fab'、F（ab）2、F（ab'）2、Fv组成的群组。
4.如权利要求3所述的抗体或其片段，其特征在于，所述Fv为scFv。
5. 如权利要求4所述的抗体或其片段，其特征在于，所述scFv包含选自SEQ ID NO:67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71及SEQ ID NO: 73组成的群组中的氨基酸序列。
6.一种编码如权利要求1~5中任一项所述的抗体或其片段的多核苷酸。
7.一种包含如权利要求6所述的多核苷酸的重组表达载体。
8.一种利用如权利要求7的重组表达载体转化的细胞。
9.一种制备与暴露于细胞外的赖氨酰-tRNA合成酶N末端特异性结合的抗体或其片段的方法，其特征在于，所述方法包括：
（a）利用如权利要求7所述的重组表达载体转化宿主细胞；
（b）培养转化的宿主细胞以生成抗体或其片段；以及
（c）获取在宿主细胞中生成的抗体或其片段。
10. 一种特异性检测暴露于细胞外的赖氨酰-tRNA合成酶N末端的方法，其特征在于，所述方法包括：
使如权利要求1所述的抗体或其片段与样本相接触；以及
检测所述抗体或其片段。
11.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1所述的抗体或其片段作为有效成分。
12.一种如权利要求1所述的抗体或其片段在制备用于抑制癌症转移的制剂中的用途，其特征在于，所述癌症选自由乳腺癌、大肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、血癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、肛门癌、输卵管癌、阴道癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性白血病或急性白血病、淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤组成的群组。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述癌症为乳腺癌或肺癌。
14.如权利要求12所述的用途，其中，
所述大肠癌为直肠癌或结肠癌；
所述肺癌为小细胞肺癌；
所述皮肤癌为皮肤或眼内黑色素瘤；
所述子宫癌为子宫内膜癌或宫颈癌；
所述阴道癌为外阴癌；
所述内分泌癌为甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌或垂体腺瘤；
所述肾癌为肾细胞癌；
所述中枢神经系统肿瘤为原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤或脑干胶质瘤。
15.如权利要求1所述的抗体或其片段在制备用于诊断癌症的制剂中的用途，其特征在于，所述癌症选自由乳腺癌、大肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、血癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、肛门癌、输卵管癌、宫颈癌、阴道癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性白血病或急性白血病、淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤组成的群组。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述癌症为乳腺癌或肺癌。
17.如权利要求15所述的用途，其中，
所述大肠癌为直肠癌或结肠癌；
所述肺癌为小细胞肺癌；
所述皮肤癌为皮肤或眼内黑色素瘤；
所述子宫癌为子宫内膜癌或宫颈癌；
所述阴道癌为外阴癌；
所述内分泌癌为甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌或垂体腺瘤；
所述肾癌为肾细胞癌；
所述中枢神经系统肿瘤为原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤或脑干胶质瘤。
18.如权利要求1所述的抗体或其片段在制备用于治疗免疫细胞迁移相关疾病的制剂中的用途，其特征在于，所述免疫细胞迁移相关疾病选自由心血管疾病、纤维化疾病、慢性炎症性疾病及奥尔波特综合征组成的群组。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病选自由肺动脉高压、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑血管病、动脉硬化及肠系膜硬化组成的群组。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述动脉硬化为动脉粥样硬化。
21.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述纤维化疾病选自由硬皮病、类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、骨髓纤维化、肺纤维化、肝纤维化、肝硬化、肾纤维化、肌纤维变性、心肌纤维化、系统性红斑狼疮、遗传性纤维化、感染性纤维化、刺激性纤维化、慢性自身免疫性纤维化、器官移植中抗原不相容引起的纤维化、高脂血症引起的纤维化、肥胖引起的纤维化、糖尿病纤维化、高血压引起的纤维化及支架植入过程中纤维化引起的闭塞组成的群组。
22.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述慢性炎症性疾病选自由哮喘、特应性皮炎、湿疹、银屑病、骨关节炎、痛风、银屑病性关节炎、肝硬化、非酒精性脂肪肝炎、慢性阻塞性肺病、鼻炎、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾功能衰竭、糖尿病神经病变及多发性硬化症组成的群组。
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