KR20180109645A

KR20180109645A - 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체

Info

Publication number: KR20180109645A
Application number: KR1020170118890A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 심현보; 권남훈; 한대영
Original assignee: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2018-10-08
Also published as: KR20180109752A; KR102114191B1

Abstract

본 발명은 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체와 이의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR(상보성 결정부위) 서열을 가지며 라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편과, 상기 항체 또는 단편의 암전이 억제 용도 및 암 진단 용도에 대한 것이다.
본 발명에 따른 항체 또는 그 단편들은 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적 결합능력이 매우 우수하기 때문에, KRS의 특이적 행태를 수반하는 질병(예를들어, 암)으로서 알려진 질병의 진단에 이용가능하다. 또한 in vivo 상에서도 KRS N-말단 영역에 특이적으로 타겟팅되므로 라미닌 수용체와 KRS N-말단 영역의 상호작용을 억제하여 암 전이를 억제하는 효과가 탁월하므로 치료제로서 이용될 수 있어, 산업상 이용가능성이 크다.

Description

세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체{Antibody specifically binding to the N-terminal region of lysyl- tRNA synthethase exposed at cell outer membrane}

본 발명은 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체와 이의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR(상보성 결정부위) 서열을 가지며 라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편과, 상기 항체 또는 단편의 암전이 억제 용도 및 암 진단 용도에 대한 것이다.

최근 연구를 통해 일반적으로 세포질(cytosol)에 존재하는 인간 KRS(라이실-tRNA 합성효소, lysyl- tRNA synthethase)가 원형질막(세포막)으로 이동(translocation)되어 원형질 막에 존재하는 67LR(67-kDa 라미닌 수용체)과 상호작용함으로써 종양(또는 암) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이(metastasis)에 영향을 미친다는 것이 규명되었다(Dae Gyu Kim et al., Chemical inhibition of prometastatic lysyl-tRNA synthetaselaminin receptor interaction, Nat Chem Biol. 2014 Jan; 10(1): 2934, Dae Gye Kim et. al. Interaction of two translational components, lysyl-tRNA synthetase and p40/37LRP, in plasma membrane promotes laminin-dependent cell migration, FASEB J. (2012)26, 4142-4159). 인간 KRS(Genbank Accession No . NP_005539.1 등)는 N-말단 연장 (N-terminal extension, 1-72), 안티코돈 결합 도메인(anticodon-binding domain, 73-209) 및 촉매 도메인 (catalytic domain, 220-597)을 포함한다. 인간 KRS는 단백질 합성에 필수적인 효소이며 일반적으로 세포질에서 다중 tRNA 합성효소 복합체 (multi-tRNA synthetase complex, MSC) 내에 존재한다. 그러나 라미닌(laminin) 신호 후, p38 MAPK는 T52 잔기에서 KRS를 인산화시키고, KRS는 세포막으로 이동하여 유비퀴틴 매개 분해로부터 67LR을 보호한다. 또한 세포막으로 이동된 KRS 는 암전이와 관련된 67LR을 안정화시키고 이와 상호작용을 함으로서 암 전이(cancer metastasis)를 촉진한다고 보고되었다.

이때, N-terminal extension(N-ext)의 말단 잔기 40개가 결실 된 Myc-KRS41-597(ΔN)이 원형질막에 위치(localize)되지 않는 다는 사실은 KRS N-ext 영역이 KRS가 세포막으로 이동(translocation) 하는데 있어서 필수적인 영역임을 나타낸다. 또한 암 전이와 관련하여, 67LR과의 상호작용에 있어서 구체적으로 KRS N-ext 영역이 이들의 결합에 관여함이 알려졌다. 이러한 사실을 치료 또는 진단 목적으로 이용하기 위해서는, KRS 단백질을 이루는 여러 도메인 영역의 특성에 따라서 단백질 내의 목적하는 특정 위치(특히 KRS N-ext)를 특이적으로 타겟팅(targeting)하는 것이 필요한 실정이다.

그러나 KRS를 비롯한 ARS(aminoacyl trna synthetase)들에 대한 바이오마커로서의 중요성에도 불구하고 ARS들은 단백질 구조상 유사한 점이 많아 동물로부터 면역반응으로 얻어지는 항체는 다른 ARS에도 결합하는 교차 반응을 보이고 아예 고감도의 항체가 생성되지 않는 경우가 많다.

이에 본 발명자들은 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 제작하고자 연구하던 중, 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR(상보성 결정부위) 서열을 가지는 항체들이 KRS N-말단 영역에 매우 높은 결합특이성(specificity) 및 결합친화력(affinity)을 나타낼 뿐만 아니라, in vivo 상에서 암 전이를 억제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, (a) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단계; 및 (c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단계; 및 (c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 "세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소(KRS) N-말단 영역" 은 세포 내에서 생성된 KRS가 이동하여 세포막(또는 원형질막)에 위치될 때 세포 외(extracellular) 영역으로 또는 세포막 표면에 노출되는 특정 서열을 의미하는 것으로서, 통상 KRS N-말단의 1 내지 72개의 아미노산 영역의 일부 또는 전장 서열을 의미하는 것일 수 있다. 또한 KRS N-말단 영역은 종간 서열유사성이 존재하며 특히 서열번호 97로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 인간에서는 서열번호 75로 표시되는 서열을 포함하며, 마우스(mouse)에서는 서열번호 113으로 표시되는 서열을 포함하며, 렛(rat)에서는 서열번호 114로 표시되는 서열을 포함한다.

본 발명에서 "KRS"는 라이실 티알엔에이 합성효소로 알려져 있는 전장(全長) 폴리펩티드 또는 N-말단 영역(N-terminal extention)을 포함하는 임의의 KRS 단편서열을 의미한다. 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편들은 전술한 바와 같이 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역을 특이적으로 검출하므로, 전술한 KRS 전장 폴리펩타이드 또는 N-말단 영역을 포함하는 임의의 KRS 단편 서열 또한 검출할 수 있다. 상기 KRS의 구체적 서열은, 서열번호 75로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로서 당업계에 라이실 티알엔에이 합성 효소로서 알려진 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 일례로 본 발명의 KRS는 인간(homo sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_005539.1 등으로 공지된 것을 포함하고, 마우스(Mus musculus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_444322.1 등으로 공지된 것을 포함하며, 랫(Rattus norvegicus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. XP_006255692.1 등으로 공지된 것을 포함하며, 이외 에도 하기의 서열정보를 참조로 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다: XP_005004655.1(guinea-pig: Cavia porcellus), XP_021503253.1(gerbil, Meriones unguiculatus), XP_002711778.1(rabbit, Oryctolagus cuniculus), XP_536777.2(dog, Canis lupus familiaris), XP_003126904.2(swine, Sus scrofa), XP_011755768.1(monkey, Macaca nemestrina), XP_008984479.1 (marmoset, Callithrix jacchus), XP_019834275.1 (cow, Bos indicus), XP_511115.2 (chimpanzee, Pan troglodytes). 가장 바람직하게는 서열번호 76(Genbank Accession No . NP_005539.1)으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 일 수 있다.

본 발명에서 항체(antibody)는 면역 글로불린(immunoglobulin, Ig)이라고도 불리며, 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자연에서 발견되는 전체 항체(whole antibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드인 경쇄(light chain, LC) 및 중쇄(heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이루어지거나, 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 한다. 포유류의 항체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 유형이 있으며, 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 등 다른 종류의 항체를 구성하게 된다. 포유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는λ 및 κ로 표시되는 2가지 종류가 존재한다.

항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역과 불변영역으로 구분된다. 중쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변영역으로 구성되어 있으며, 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역(VH) 또는 경쇄가변영역(VL)의 하나의 도메인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되어 1개의 공유 이황결합(disulfide bond)에 의해 연결되고, 경쇄와 결합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍(HC/LC)으로 구성되어 있으므로, 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일특이성을 갖게 된다.

항체가 항원에 결합하는 부위를 포함하는 가변영역은 서열 가변성이 적은 골격 부위(framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위(hypervariable region)인 상보성 결정부위(complementary determining region, CDR)로 세분된다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N-말단부터 C-말단의 방향으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로, 항체의 항원 특이성에 가장 중요하다.

본 발명은 라이실- tRNA 합성효소( KRS , Lysyl - tRNA synthetase ) N-말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다.

본 발명에서 ‘에피토프(epitope)’는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 대체로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면기로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특성 및 특이적 전하 특성을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에서 입체형태적 에피토프에 대한 결합은 손실되지만 비-입체형태적 에피토프에 대해서는 손실되지 않는다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관련되는 아미노산 잔기(에피토프의 면역원성 성분으로도 칭해짐) 및 결합에 직접 관련되지 않는 기타 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기(즉, 아미노산 잔기가 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트 (footprint) 내에 존재함)를 포함할 수 있다.

바람직하게는 KRS N-말단 서열로부터 유래된 본 발명의 N3 단클론 항체가 결합하는 부위로, 서열번호 97로 표시되는 아미노산(klsknelkrrlka)을 포함하는 연속되는 영역이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으며, 통상 서열번호 97의 아미노산 서열 포함하여 13 내지 52개, 더욱 바람직하게 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42 개의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 상기 에피토프는, 인간 KRS N-말단에서 유래된 것인 서열번호 75, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100 및 서열번호 101로 표시되는 아미노산 서열일 수 있으며, 마우스 KRS N-말단에서 유래된 것인 서열번호 113, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105 및 서열번호 106로 표시되는 아미노산 서열일 수 있으며, 랫 KRS N-말단에서 유래된 것으로 서열번호 114, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110 및 서열번호 111로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다. 보다 바람직하게는 서열번호 75로 표시되는 인간 KRS N-말단 영역의 15 내지 29 아미노산 서열을 포함하는 서열(서열번호 75, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100 및 서열번호 101)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 75로 표시되는 인간 KRS N-말단 영역의 15 내지 42 아미노산 서열(서열번호 101)일 수 있다.

본 발명에서 제공하는‘세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편’은

서열번호 1, 서열번호 13, 서열번호 25 및 서열번호 37로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1( CDR1 ); 서열번호 3, 서열번호 15, 서열번호 27 및 서열번호 39로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2( CDR2 ); 서열번호 5, 서열번호 17, 서열번호 29 및 서열번호 41로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역(VH) 및

서열번호 7, 서열번호 19, 서열번호 31 및 서열번호 43으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1( CDR1 ); 서열번호 9, 서열번호 21, 서열번호 33 및 서열번호 45로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2( CDR2 ); 서열번호 11, 서열번호 23, 서열번호 35 및 서열번호 47로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역(VL); 을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 CDR 서열로 구성된 항체들은 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 능력이 뛰어나다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다. 본 발명의 실시예에서는 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 scFv 단편을 제작하기 위하여, scFv phage library 스크리닝을 통한 1차 선별을 시작으로, indirect ELISA(2차 선별). 웨스턴 블롯(3차 선별), 면역침전(4차 선별), 면역형광염색(5차 선별)의 총 5단계의 실험을 거쳐 KRS N-말단 결합에 있어서 높은 결합특이성 및 결합친화력을 보이는 scFv 단편을 선별하였다. scFv phage library 스크리닝을 통한 1차 선별 시 총 1920개의 scFv 클론이 선별되었으나, 상기 5단계의 선별을 거치면서 최종적으로 가장 특이성이 높은 N3 scFv, N5 scFv, N7 scFv, N9scFv 단편 4종을 선별해 내었다. 또한 상기 scFv를 IgG로 전환하여 N3 IgG, N5 IgG, N7 IgG, N9 IgG 의 항체를 제작하였으며, 상기 항체 또한 KRS N-말단 결합에 있어서 높은 결합 특이성을 보이는 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편은, 바람직하게 아래와 같은 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 CDR 구성을 포함하는 항체로서 하기 (i), (ii), (iii) 및 (iv)는 각각 실시예의 N3, N5, N7 및 N9 항체의 CDR 조합을 나타낸다:

(i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역;

(ii)서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역;

(iii) 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역; 및

(iv) 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역; 으로 이루어진 군에서 선택된 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.

가장 바람직하게 본 발명에 따른 상기 항체 또는 그 단편은, 아래와 같은 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 한다: 상기 항체 또는 그 단편에 있어서, 상기 중쇄가변영역은 서열번호 49(N3 VH), 서열번호 53(N5 VH), 서열번호 57(N7 VH) 및 서열번호 61(N9 VH)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가변영역은 서열번호 51(N3 VL), 서열번호 55(N5 VL), 서열번호 59(N7 VL) 및 서열번호 63(N9 VL)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열.

상기 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체는 구체적으로는 서열번호 77, 서열번호 81, 서열번호 85 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 79, 서열번호 83, 서열번호 87 및 서열번호 91로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄로 이루어진 것을 특징으로 하는 항체일 수 있다.

가장 바람직하게는 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 91로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;를 포함하는 항체이다.

본 발명에 따른‘세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체’는 상기한 CDR 조합이나, VH 및 VL 조합을 갖는 것이라면 그 종류가 제한되지 않는다. 구체적 일례로 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다.

본 발명의 항체는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 상기한 CDR 조합이나, VH 및 VL 조합을 갖는 것이라면 단일클론(monoclonal) 항체일 수도 있고, 다클론(polyclonal) 항체일 수도 있지만, 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직하다.

본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이거나, 인간에서 유래한 항체의 부분과 다른 종의 동물에서 유래한 항체의 부분을 포함하는 키메릭(chimeric) 항체일 수 있다. 즉, 본 발명은 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함하며 바람직하게는 인간항체 일 수 있다.

또한 본 발명에서 항체의 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 바람직하게 상기 단편은 모항체의 KRS N-말단 결합 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다.

Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.

본 발명의 목적상 항체의 단편은 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않지만, 바람직하게 scFv일 수 있다. 본 발명에 따른 scFv는 상기한 KRS N-말단 영역에 특이적인 CDR 구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 것으로서 VH의 C-말단과 VL의 N-말단이 링커를 통해 연결된 것이라면 그 서열이 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커는 당업계에 scFv에 적용되는 링커로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 바람직하게 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 일 수 있다. 이에 따라 본 발명의 scFv는 구체적으로 서열번호 67(N3 scFv ), 서열번호 69(N5 scFv ), 서열번호 71(N7 scFv ) 및 서열번호 73(N9 scFv ) 으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환(항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다.

또한 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

또한 본 발명은, 전술한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 명세서에서 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를 들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(double stranded)이 될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기한 KRS N-말단 영역에 특이적인 CDR 구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체를 암호화하는 염기서열을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이면 그 서열이 특별히 제한되지 아니하는 것으로서, 앞서 설명한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 CDR 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 2(중쇄 CDR1), 서열번호 4(중쇄 CDR2), 서열번호 6(중쇄 CDR3), 서열번호 8(경쇄 CDR1), 서열번호 10(경쇄 CDR2), 서열번호 12(경쇄 CDR3), 서열번호 14(중쇄 CDR1), 서열번호 16(중쇄 CDR2), 서열번호 18(중쇄 CDR3), 서열번호 20(경쇄 CDR1), 서열번호 22(경쇄 CDR2), 서열번호 24(경쇄 CDR3), 서열번호 26(중쇄 CDR1), 서열번호 28(중쇄 CDR2), 서열번호 30(중쇄 CDR3), 서열번호 32(경쇄 CDR1), 서열번호 34(경쇄 CDR2), 서열번호 36(경쇄 CDR3), 서열번호 38(중쇄 CDR1), 서열번호 40(중쇄 CDR2), 서열번호 42(중쇄 CDR3), 서열번호 44(경쇄 CDR1), 서열번호 46(경쇄 CDR2) 또는 서열번호 48(경쇄 CDR3)로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 VH와 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 50(VH), 서열번호 52(VL), 서열번호 54(VH), 서열번호 56(VL), 서열번호 58(VH), 서열번호 60(VL), 서열번호 62(VH) 또는 서열번호 64(VL)으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한 상기 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 본 발명에 따른 scFv를 암호화하는 서열번호 68, 서열번호 70, 서열번호 72 및 서열번호 74로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 재조합(recombinant)은 유전자 조작(genetic manipulation)과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다.

본 발명에서 발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.

본 발명에서 재조합 발현 벡터란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.작동가능하게 연결된(operably linked)이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 발현조절서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 전술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 의미한다.

본 발명에 따른 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 각각 별개의 재조합 발현 벡터에 포함되어 있을 수도 있고, 하나의 재조합 발현 벡터에 포함되어 있을 수도 있다.

본 발명은 전술한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 세포는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.

본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새(Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli), 예를 들어, 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를들어 피.애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 벡터를 발현가능 한 것이면, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이. 콜라이일 수 있다.

본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K.lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K.wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스 ((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia (EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) 및 에이. 니거 (niger)가 사용가능 하다.

상기 용어 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.

본 발명에 따른 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질전환할 수 있다.

본 발명은, (a) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;

(b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단계; 및

(c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소( KRS , Lysyl - tRNA synthetase ) N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법을 제공한다.

(a) 단계는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 생산하기 위하여 숙주세포를 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계이다.

통상의 기술자는 선택된 숙주세포와 재조합 발현 벡터에 따라 앞서 서술한 바와 같이 적절한 형질전환 방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 동일한 숙주세포에 공동형질전환하여 중쇄와 경쇄가 하나의 세포에서 발현되도록 할 수도 있고, 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 각각 별개의 숙주세포에 형질전환하여 중쇄와 경쇄가 따로 발현되도록 할 수도 있다.

(b) 단계는 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 본 발명에 따른 항체의 중쇄, 경쇄 또는 항체 단편의 폴리펩티드가 생산되도록 하는 단계이다.

상기 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등은 당업계에서 통상 사용되는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 숙주세포에서 생산되는 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화(targeted)되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체가 KRS N-말단에 대한 결합특이성을 유지하도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩(refolding)시키고 기능성 구조(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우, 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고, 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.

(c) 단계는 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계이다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 항체 또는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 그 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.

본 발명 제조(생산) 방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다. 이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 KRS N-말단과 특이적으로 결합하므로 예를 들어, 특정 세포, 조직, 또는 혈청 내 KRS 단백질을 검출하고 정량하기 위한 진단 분석에 유용하다. 특히 세포를 용해시키지 않고도 세포 외막으로 노출된 KRS N-말단을 특이적으로 검출 가능하다. 따라서 본 발명은, 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단의 특이적 검출 방법.

본 발명의 상기 검출 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키기 전에, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 이용하여 KRS(또는 세포 외막으로 노출된 KRS N-말단 펩타이드)의 유무와 농도를 측정하기 위한 시료를 준비하는 단계((1) 단계)를 포함할 수 있다.

통상의 기술자는 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 공지의 방법을 적절하게 선택하고, 선택된 방법에 적합하게 시료를 준비할 수 있다. 또한 시료는 암(특히 유방암 또는 폐암) 또는 암전이 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 등일 수도 있다. 상기 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 방법이란 여기 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 웨스턴 블랏, 면역 블랏, 닷 블랏, 면역조직화학염색(immunohistochemistry), 효소면역분석(ELISA), 방사능면역검정법(radioimmunoassay), 경쟁적 결합 분석, 면역침전 등이 있다. 예를 들어 웨스턴 블랏을 실시하기 위하여서는 시료 또는 세포의 용해물에 전기영동에 적합한 버퍼를 첨가하여 끓이는 등의 방법으로 준비할 수 있으며, 면역조직화학염색을 위해서는 세포나 조직의 절편을 고정하고 블락킹(blocking)하는 등의 전처리를 할 수 있다.

다음으로 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 전술한 단계에서 준비한 시료와 접촉시키는 단계((2) 단계)를 수행한다.

본 발명에 따른 항체는 앞서 서술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 가지며 KRS N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편으로서, 그 구체적 종류와 서열 구성에 대해서는 전술한바와 같다.

상기 항체 또는 그 단편은 이의 '검출'을 위하여, 일반적으로 검출가능 모이어티(moiety)로 표지될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen 등, Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs]에 기술된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 또는 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린 (luciferin), 2,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게나제, 유라제 (urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 예를 들어, 문헌 [O'Sullivan 등, 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N. Y., 73: 147-166]에 기술되어 있다. 표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 바이오틴(biotin)에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘(avidin)에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는, 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐 (hapten) (예를 들어, 딕옥신 [digoxin])과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항-합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대, 항-딕옥신 항체). 따라서, 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.

본 발명에서 "접촉(contacting)"이라 함은 이의 일반적인 의미로 사용되는 것으로서, 2개 이상의 물질을 혼합, 결합, 또는 서로 맞닿게 하는 것을 의미한다. 상기 접촉은 시험관 내(in vitro) 또는 다른 컨테이너(container) 상에서 수행될 수 있고, 또한 인 시투(in situ), 생체 내, 개체 내, 조직 내, 세포 내에서 수행 될 수 있다.

다음으로는 상기(2) 단계 수행 후의 시료에서 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계((3) 단계)를 수행한다.

상기‘검출’은 시료 내에서 형성된 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편과 항원의 복합체를 대상으로 하는 것으로서, KRS N-말단 영역의 펩타이드(또는 이를 포함하는 단백질, 예를 들어 KRS)의 존재 유무의 감지 또는 상기 펩타이드의 수준을 측정(정성적 또는 정량적 측정을 모두 포함)하는 것을 의미한다. 따라서 상기 (2) 단계 수행 후 후술하는 검출 단계((3) 단계) 전에, KRS N-말단 영역과 복합체를 형성하지 않은 여분의 항체 또는 그 단편들을 제거하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.

전술한 (2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 형광, 방사성 동위원소, 효소 등으로 직접 표지되는 등의 검출가능한 모이어티를 포함하는 경우에는 해당 모이어티를 검출하는 당업계에 공지된 방법에 따라 검출을 수행할 수 있다. 일례로 방사능은, 예를 들어, 신틸레이션 계수(scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.

또한 전술한 (2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 자체로서 전술한 검출 모이어티를 포함하지 않는 경우에는, 당업계에 알려진 바와 같이 형광, 방사능, 효소 등으로 표지된 2차 항체를 이용하여 간접적으로 감지할 수 있다. 상기 2차 항체는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편(1차 항체)에 결합한다.

최근 연구를 통해 일반적으로 세포질(cytosol)에 존재하는 인간 KRS(라이실-tRNA 합성효소, lysyl- tRNA synthethase)가 원형질막(세포막)으로 이동(translocation)되어 원형질 막에 존재하는 67LR(67-kDa 라미닌 수용체)과 상호작용함으로써 종양(또는 암) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이(metastasis)에 영향을 미친다는 것이 규명되었다(Dae Gyu Kim et al., Chemical inhibition of prometastatic lysyl-tRNA synthetaselaminin receptor interaction, Nat Chem Biol. 2014 Jan; 10(1): 2934.). 이때 KRS terminal extension(N-ext) 영역이 KRS가 세포막으로 이동(translocation) 하는데 있어서 필수적인 것으로 알려졌다. 또한 암 전이와 관련하여, 67LR과의 상호작용에 있어서 구체적으로 KRS N-ext 영역이 이들의 결합에 관여함이 알려졌다.

본 발명에 따른 항체 및 그 단편들은 상기 KRS N-ext 영역에 특이적 결합능력이 뛰어나며, 실제 KRS N-ext 영역에 결합됨에 따라 라미닌 수용체와의 결합(상호작용)을 저해하여 암의 전이를 억제하는 능력이 탁월하다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다. 본 명세서 실시예에서는 암을 유발한 in vivo 암 전이 마우스 모델에 대하여 본 발명에 따른 항체를 투여한 결과, 농도 의존적으로 탁월한 암 전이 효능을 보임을 확인하였다. 특히 기존에 라미닌 수용체(67LR)와 KRS의 상호작용을 저해하여 암 전이를 억제하는 것으로 알려진 YH16899 화합물과 비교하여도 암전이 억제 효능이 매우 우수한 것으로 나타났다.

따라서 본 발명은, 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물, 및 암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 암은 당업계에 악성 종양으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게 본 발명에서 상기 암은 유방암 또는 폐암일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 상기 화학식 1의 아릴 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 본 발명의 치료용 조성물을 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, l9th Edition, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co.(Easton, PA: 1995))와 바람직한 순도를 갖는 항체를 혼합하여 저장하기 위해 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 제조할 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충용액, 예를 들어 인산, 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.

본 발명의 항체는 암 투병 중인 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기에서“약학적으로 유효한 양”이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 암을 치료하기에 충분한 양 또는 암 전이를 억제하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 항체 또는 그 단편의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편의 인체에 대한 투여량은 일반적으로 0.01 - 100 mg/kg/week이며, 바람직하게는 0.1 - 20 mg/kg/week이며, 더욱 바람직하게는 5 - 10 mg/kg/week일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암 전이 억제제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 공지된 항체 투여 방법, 예를 들어 정맥내, 복강내, 뇌내, 피하, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 기재된 서방성 (sustained release) 시스템에 의한 주사 또는 주입일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 일례로 본 발명의 항체는 전신으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 암 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물 학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 암(또는 암 전이)의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에서 KRS 단백질(특히, 세포 외막에 노출된 KRS N-말단 영역)을 검출함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에서 용어‘진단’은, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 진단은 암 또는/및 암 전이의 발병 여부, 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.

‘검출’에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 진단 키트로서 제공될 수 있으며, 상기 키트는 당업계에 항체 또는 특정 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 구성품으로 제공하는 분석 키트로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA, 방사성면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케이트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩용 키트 등을 포함한다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 상기 키트 즉, 진단 분석을 수행하기 위한 진단 키트에서 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에, 키트는 기질 및 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자 (cofactor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액 (예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 충분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편들은 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR(상보성 결정부위) 서열을 가지며 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적 결합능력이 매우 우수하다. 또한 in vivo 상에서도 KRS N-말단 영역에 특이적으로 타겟팅되므로 라미닌 수용체와 KRS N-말단 영역의 상호작용을 억제하여 암 전이를 억제하는 효과가 탁월하다.

도 1은 웨스턴 블롯(WB)을 통하여 KRS 전장 서열 또는 KRS N-말단 단편에 결합하는 scFv phage clone을 선별한 결과를 나타낸다.
도 2는 면역침전법(IP)을 통하여 KRS 전장 서열 또는 KRS N-말단 단편에 결합하는 scFv phage clone을 선별한 결과를 나타낸다.
도 3A는 myc-KRS T52D(Active mutant) 발현을 통해 세포막에 KRS-N 말단 영역을 노출된 세포를 제작하고, 각각 N3, N5, N7 및 N9의 scFv clone이 상기 노출 영역에 결합하는지를 확인한 결과를 나타낸다(KRS: myc-KRS T52D를 의미함).
도 3B는 Inactive mutant(myc-KRS T52A) 또는 WT-KRS(laminin untreated) 발현 군에서는 세포막에 KRS-N 말단 영역의 노출이 일어나지 않아, N3, N5, N7 및 N9의 scFv clone을 처리하여도 검출 신호가 나타나지 않음을 보여준다.
도 3C는 myc이 표지된 WT-KRS, T52D, T52A로 형질전환시킨 세포에 라미닌을 처리한 다음 scFv를 염색하였을 때, WT-KRS의 라미닌에 의한 membrane localization과 T52D mutant가 유사한 위치에 염색이 되고, 형질 전환된 myc도 동일한 위치에 염색이 되었으나, T52A에서는 염색이 되지 않는 것을 보여준다(scFv: 초록색, myc: 빨간색).
도 4는 Full length KRS(F로 표시, 서열번호 76), N-말단의 1~71번째 아미노산이 결실된 KRS 단편(1로 표시), 및 N-말단의 1~200번째 아미노산으로 이루어지는 KRS 단편(2로 표시)을 사용하여, N3, N5, N7 및 N9의 scFv clone이 KRS N-terminus에 특이적으로 바인딩하는지를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5A는 본 발명의 항체들 중, 대표적으로 N3 IgG 및 N5 IgG의 KRS에 대한 결합능을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5B는 본 발명의 항체들 중, 대표적으로 N3 IgG 및 N5 IgG의 KRS에 대한 결합능을 면역침전으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6A는 SPR 방법을 통하여 N3 IgG의 KRS N-말단에 대한 결합력을 정량적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6B는 SPR 방법을 통하여 N5 IgG의 KRS N-말단에 대한 결합력을 정량적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7A는 WT-KRS를 발현하도록 형질전환한 세포에 라미닌을 처리하여 KRS의 N-말단 영역이 세포 외막으로 노출되도록 한 후, 본 발명의 항체 N3 IgG를 처리하여 상기 노출 영역에 대한 결합을 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7B는 T52D-KRS(active mutant, myc tagged KRS) 발현을 통해 세포막에 KRS-N 말단 영역을 노출된 세포를 제작하고, 본 발명의 항체 N3 IgG를 처리하여 상기 노출 영역에 대한 결합을 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다. 또한 세포막에 투과성을 부여한 실험에서, 본 발명의 항체가 세포 내부로 들어가 세포 내부에 존재하는 KRS 단백질과도 결합가능함을 확인하였다.
도 7C는 WT-KRS를 발현하도록 형질전환한 세포에 라미닌을 처리하여 KRS의 N-말단 영역이 세포 외막으로 노출되도록 한 후, 본 발명의 항체 N5 IgG를 처리하여 상기 노출 영역에 대한 결합을 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다(N5 IgG: 초록색).
도 8은 본 발명 항체 N3 IgG가 세포 독성이 없음을 MTT assay 방법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9A는 본 발명 항체 N3 IgG 처리에 의하여 세포 이동(cell migration)이 억제됨을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9B는 본 발명 항체 N3 IgG가 농도 의존적으로 현저하게 세포 이동(cell migration)을 억제시키는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 in vivo 암전이 모델을 이용한 실험에서, 마우스 암 전이 모델의 제작과 치료물질 투여(항체 또는 YH16899) 일정, 및 상기 마우스 모델로부터 폐 전이를 관찰하는 실험 스케줄을 도식적으로 나타낸다.
도 11은 in vivo 암전이 모델에서 본 발명 항체 N3 IgG의 투여에 의하여 암의 폐 전이가 현저히 억제되었음을 확인할 수 있는, 마우스 폐 표본을 보여준다. 폐 시료에 나타나는 결절의 개수 및 상태 등으로 암 전이의 진행도 및 심각도를 평가할 수 있다.
도 12는 in vivo 암전이 모델에서 본 발명 항체 N3 IgG의 투여에 의하여 대조군 대비 폐 결절의 생성이 현저히 억제(즉, 암의 폐 전이가 현저히 억제됨)됨을 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 대조군과 N3 IgG의 처리군에서의 폐조직을 대조적으로 보여주며, 대조군에서는 본 발명의 항체 처리군에 비하여 라미닌 수용체가 전이된 결절 부위에 상당히 많이 발현된 것을 확인하였다.
도 14는 각각 대조군, YH16899 처리군, N3 IgG의 처리군에서의 폐 표본을 보여주는 것으로서, YH16899 처리군 및 N3 IgG의 처리군에서 대조군 대비 폐 결절의 생성이 현저히 억제된 결과를 나타낸다.
도 15는 YH16899 처리군, N3 IgG의 처리군에서 상기 암 전이 억제제 물질들의 처리 농도에 따른 폐전이 억제 효율(폐 결절 생성 억제 효율)을 나타낸다.
도 16은 SPR 방법을 통하여 N3 IgG의 사람(human, h) KRS N-말단의 펩타이드 조각(F1, F2, F3, F4, F5)에 대한 결합력을 정량적으로 확인한 결과를 나타낸다(서열 하단의 회색 막대는 해당 영역(F1 내지 F5)에 대한 N3 항체의 결합력을 나타내는 것으로, 막대의 색이 진할수록 높은 결합강도를 나타내는 것을 표시함).
도 17은 SPR 방법을 통하여 N3 IgG의 사람(human, h), 마우스(mouse, m), 랫(rat, r) KRS N-말단의 펩타이드 조각(F1, F3, F5) 대한 결합력을 정량적으로 확인한 결과를 나타낸다(서열 하단의 회색 막대는 해당 영역(F1 내지 F5)에 대한 N3 항체의 결합력을 나타내는 것으로, 막대의 색이 진할수록 높은 결합강도를 나타내는 것을 표시함).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

scFv library 스크리닝

<1-1> scFv phage 선별_ 1차

KRS 전장 서열(서열번호 76) 중에서, 라미닌 신호에 의해 세포막으로 이동되었을 때 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단(서열번호 75) 영역에만 특이적으로 결합하는 scFv를 선별하기 위하여, HA tag으로 표지된 인간의 B 세포에서 유래한 scFv phage library를 이용한 phage display panning 실험을 실시하였다. 본 실험에 사용한 scFv display phage library(Library size: app. 7.6 x 10^9,Library produced by prof. Hyunbo Shim)에 대해서는 대한민국 등록특허 10-0961392호에 기재되어 있다. 하기 표 1에서 보는 바와 같이, KRS 전장 서열 및 N-말단 위치의 서로 다른 특정 영역의 KRS 단편들이 phage display panning 실험을 위한 항원단백질로서 사용되었다.

1ml의 1X PBS 용액을 포함하는 Immuno-튜브에 1~10μg의 항원 단백질을 첨가하고 37℃, 200rpm으로 1시간 동안 반응시켜 튜브 안쪽 표면에 항원을 코팅하였다. 항원 용액을 따라내고 수돗물로 1회 세척하여 코팅되지 않은 항원을 제거하였다. 항원 단백질과 phage간 비특이적 결합을 막기 위하여 immuno-튜브와 scFv library를 각각 3% 탈지유가 포함된 1X PBST(0.05% tween20을 포함하는 PBS)로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. Immuno-튜브에서 탈지유를 제거한 후, scFv library를 첨가하여 37℃, 150rpm으로 1시간 동안 반응시켜 항원에 scFv phage가 결합하도록 하였다. scFv phage를 튜브에서 반응시킨 후, 1X PBST로 2~5번 세척하여 결합하지 않은 scFv phage를 제거하였다.

각각의 KRS 항원에 특이적으로 결합한 scFv phage는 상온에서 triethylamine(100mM) 1ml을 첨가하여 10분 이내에 분리해내고, Tris(1M, pH 7.4)로 중화시켰다. 여과한 phage scFv를 OD<1으로 배양한 ER2537 E. coli에 첨가하여 37℃, 120rpm으로 1시간 30분 동안 배양하면서 감염시켰다. phage에 감염된 E.coli는 원심분리하여 배양 상층액을 일부 제거한 후 재분산하여 암피실린과 포도당(2%)을 포함하는 지름 15cm의 아가로즈 플레이트에 도포하였다. 다음날 5ml SB 배지를 도포하여 플레이트에서 자란 세포들을 모두 수득하고, glycerol(50%)을 전체 부피의 0.5배가 되도록 첨가하여 혼합하고 1ml씩 분주하여 -80℃에 보관하였다(scFv panning stock). 상기 제조한 stock 20μl를 20ml SB 용액에 접종하여 배양하고, helper phage를 이용하여 다음 단계의 phage panning을 위한 scFv phage library(1ml)로 제작하였다. 항원에 특이적인 scFv를 발현하는 phage를 분리하기 위한 상기 과정을 2~3회 반복하였다.

<1-2> ELISA를 통한 결합특이적 scFv 항체 선별_2차 선별

실시예 <1-1>에서 선별된 phage가 발현하는 scFv가 전술한 KRS 전장 또는 N-말단 단편들에 결합하는지 indirect ELISA를 실시하여 조사하였다.

Panning을 3회 반복하여 수득한 scFv 결과물을 희석하여 지름 10cm의 아가로즈 플레이트에 도포하고, 다음날 각각의 콜로니(colony)를 선별하여 200μl의 SB 배지가 포함된 96 well 플레이트에서 각각 배양하였다. 전체적으로 증식이 잘된 것을 확인하고, IPTG(1mM)를 첨가하고 30℃로 16시간 동안 배양하여 scFv의 생산을 유도하였다. 다음날 96 well 플레이트를 원심분리하여 세포만 분리한 뒤, TES 용액을 이용하여 세포를 용해시키고, 다시 원심분리하여 상층액만 분리하였다. 수득한 상층액으로 indirect ELISA를 실시하여 상기 항원에 특이적으로 결합하는 scFv를 선별하였다. 상기 KRS 전장 또는 N-말단 단편 항원별로 각각 플레이트를 코팅하고, scFv를 포함하는 배양 상층액을 반응시킨 후, 2차 항체로 항-HA-HRP 항체(Roche Applied Science)와 반응시켰다. Tetramethylbenzimidine(TMB, Thermo scientific)을 이용하여 발색 반응한 후, H₂SO₄(1M)을 이용하여 발색 반응을 중지시키고 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. control(blank)과 전술한 항원(Ag)에 대하여 동시에 ELISA를 수행하여 positive 값을 얻은 colony만 선별하는 작업을 수행하였다. ELISA에 수행된 colony는 총 1920개, 그 중 positive로 선별된 것은 93개이다(표 1 참조).

	Antigen (KRS fragment)
	Full	1-20	13-36	31-46	1-29	5-34	10-38	15-42	24-49	Total
Panning Outcomes	288	384	384	192	192	192	96	96	96	1920
HITS	51	8	20	2	1	1	0	8	2	93

<1-3> 서열분석

상기 실시예 <1-2>에서 ELISA screening을 통하여 선별된 93개의 colony중에서 중복된 CDR 서열을 가진 동일 Ab를 걸러내기 위하여 sequence를 분석하였다. 구체적으로 서열분석은 다음과 같은 방법으로 수행되었다: scFv clone을 보유하고 있는 E. coli를 배양한 다음, miniprep으로 phagemid를 확보하였다. 이를 Omp primer(Hye young Yang, et. al., 2009, Mol. Cells 27, 225-235)를 사용하여 sequence를 확인하였다. 이와 같이 확보된 sequence를 Bioedit 프로그램을 사용하여 phagemid의 CDR region의 서열을 확인하였다. 이 중 중복된 CDR 서열을 가진 clone을 제거하여, 각각 독립된 CDR 서열의 scFv clone을 확인하였다.

	Antigen (KRS fragment)
	Full	1-20	13-36	31-46	1-29	5-34	10-38	15-42	24-49	Total
HITS	51	8	20	2	1	1	0	8	2	93
Different Clones	10	8	11	1	1	1	0	4	2	38

서열분석을 통해 중복된 CDR 서열의 항체를 선별한 결과, 상기 표 2에서 보는 바와 같이 각기 다른 CDR 서열의 scFv clone은 38개였다.

<1-4> western blot을 통한 결합특이적 scFv 항체 선별_3차 선별

상기 실시예 <1-3>에서 분리한 38개의 scFv clone을 대상으로, 이들이 KRS와 특이적으로 결합하는지 western blot으로 확인하였다.

상기 scFv 양성 단일 콜로니 클론을 카나마이신을 함유하는 SB 배지(Bactotrytone 30g, yeast extract 20g,MOPS buffer 10g/L)에 5 ml에 배양하여 seed culture를 시작하여 overnight 배양후 500ml 카나마이신함유 SB배지에 옮겨 OD 600 = 0.5 정도 되었을? IPTG를 1mM되게 넣어 30도에서 overnight 배양하여 scFv 단백질을 대장균의 페리플라즘(periplasm)에서 발현하였다. 다음날 원심분리하여 수득한 대장균을 1X TES buffer에 (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20% Sucrose, pH 8.0) 현탁한 후 0.2 X TES를 1.5배 첨가하여 섞어주고 원심분리하여 상등액을 취함으로서 페리플라즘을 추줄하였다.

페리플라즘에서 추출한 scFv 항체에 최종 5 mM MgSO4를 가하고 이를 미리 PBS에 평형시킨 Ni-NTA bead 와 섞어 1시간 동안 냉장에서 교반하여 Ni-NTA bead에 결합시킨후 친화도 크로마토그래피를 수행하여 결합하지 않은 단백질을 PBS로 충분히 씻어내었다. 5 mM Imidazole이 함유된 buffer로 더 충분히 씻어 준 다음 결합한 scFv 항체는 200 mM Imidazole buffer를 이용하여 용출하였다. 용출된 항체는 투석하여 전기이동을 통해 순도를 확인하고 BCA 방법으로 단백질 정량을 하여 정제된 항체양을 기록한 후 일정양을 분주하여 냉동 보관하였다.

전술한 바와 같이 페리플라즘에서 추출한 scFv 항체는 웨스턴블롯(western blot) 기법을 사용하여, KRS 전장 또는 각각의 KRS N-말단 단편에 scFv 항체가 결합하는지 여부를 확인하는 데 사용하였다. 30ug의 HCT116 cell lysate를 SDS PAGE를 통해 전기 이동한 후 PVDF membrane에 옮겨 3% skim milk로 blocking 한 후 추출한 scFv 항체를 1.0㎍/㎕씩 첨가하여 1시간동안 결합시켰다. 결합하지 않은 scFv 항체를 제거하고, 검출을 위해서 항원과 결합한 scFv에 HRP(horseradish peroxidase)가 연결된 Anti-HA 이차 항체를 반응시킨 후, 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 KRS 전장 및 각각의 단편의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다.

상기 Western blot을 수행하여서 너무 약한 band(faint band), non-specific band(double band) 등의 결과를 얻은 scFv clone을 제거하였다. 이렇게 선별된 scFc 클론은 13개로서, 이러한 결과를 도 1 에서 보여준다.

<1-5> 면역침전을 통한 결합특이적 scFv 항체 선별_4차 선별

상기 실시예 <1-4>에서 선별된 scFv clone이 실제 native KRS에 binding하는지 확인하기 위하여 면역침강(immunoprecipitation)을 수행하였다. 정제된 scFv clone을 HCT116 cell lysate와 Ag-Ab binding 반응시키고, scFv의 HA-tag을 활용하여 immunoprecipitation을 수행하였다.

구체적으로, HCT116세포를 150mM NaCl, 0.5% 트리톤 X-100, 0.1% SDS 및 단백질 분해효소 저해제를 포함하는 20mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.4, 용해버퍼)로 용해하였다. 500㎍의 HCT116 세포 용해물에 각각의 scFv를 5㎍씩 첨가한 후 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. anti-HA agarose bead 30㎕을 첨가하고 4℃에서 4시간동안 배양하였다. 원심분리를 통해 상등액을 제거하였다. 이렇게 수득한 침전물을 SDS-샘플 버퍼에 녹이고 7분동안 끓이는 과정을 두 번 반복하였다.

전술한 과정을 통해 준비된 면역침전 시료들을 각각 SDS PAGE를 통해 전기 이동한 후, PVDF membrane에 옮겨 3% skim milk로 blocking 한 후, KRS polyclonal antibody(rabbit, Neomics, Co. Ltd. #NMS-01-0005) 항체를 첨가하여 1시간동안 결합시켰다. 결합하지 않은 항체를 제거하고, anti-rabbit 2차 항체(ThermoFisher Scientific, #31460)를 첨가하여 반응시켰다. 이차 항체를 반응시킨 후, 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 KRS 전장 및 각각의 단편의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다.

이렇게 선별된 scFc 클론은 12개로서, 이러한 결과를 도 2 에서 보여준다.

<1-6> 면역형광법을 통한 결합특이적 scFv 항체 선별_5차 선별

상기 실시예 <1-5>에서 선별된 scFv clone이 실제 cell membrane에 노출된 KRS N-말단 영역에 binding하는지 확인하기 위하여 면역형광염색(immunofluorescence)을 수행하였다. 이때 KRS가 membrane에 노출되는 현상을 만들기 위하여 KRS-T52D mutant(active mutant)를 사용하였다. 구체적으로 glass coverslip에 A549 세포를 분주한 뒤(1 x 10⁵cell, 12 well plate 기준), 24시간 후 각각 myc-KRS WT/ myc-KRS T52D(Active mutant)/ myc-KRS T52A(Inactive mutant)을 과발현시켰다. 이후 24시간 배양, 무혈청 배지(RPMI 1640 media)를 이용하여, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 그 후, 10㎍/ml 라미닌(L2020; Sigma)을 처리하여 37℃에서 1시간동안 방치하여 샘플을 준비하였다. 각각의 myc-KRS T52D(Active mutant) 및 myc-KRS T52A(Inactive mutant) 벡터들은 pCDNA3-myc-KRS WT 벡터를 backbone으로 하여 site-directed mutagenesis(QuikChange Ⅱ Site-Directed Mutagenesis kit, Agilent, #200523)를 통해 제작하였다.

상기 준비된 샘플을 PBS(4℃)로 세척한 뒤 10분 동안 4% paraformaldehyde 처리하여 고정시키고 세척하였다. 10분동안 CAS block을 수행하고, 상기 scFv 및 Myc antibody를 2시간동안 처리하였다. 그 후 비결합 항체들을 제거하고, 암실에서 1시간동안 2차 항체와 반응시켰다. DAPI 염색을 10분동안 수행하여 마운팅하였다.

실험결과 도 3에서 보는 바와 같이, Inactive mutant(T52A)와 WT-KRS(laminin untreated)에는 결합하지 않고 active mutant의 cell에만 결합하는 scFv clone은 총 4개(N3, N5, N7 및 N9) 선별되었다. 또한 WT-KRS의 membrane localization을 유도하기 위해 laminin을 처리한 다음 scFv를 염색하였을 때, T52D mutant와 유사한 위치에 염색되는 것을 확인하였다.

이들 클론들은 세포의 표면(tip)에서 특이적으로 결합되어있음을 확인하였다.

<1-7> KRS N-말단에 대한 특이적 결합능의 확인

상기 실시예 <1-6>을 통해 최종 선별된 scFv clone들(N3, N5, N7 및 N9)이 실제 KRS N-terminus에 binding 하는지 확인하기 위하여, Full length KRS(F로 표시, 서열번호 76), N-말단의 1~71번째 아미노산이 결실된 KRS 단편(1로 표시), 및 N-말단의 1~200번째 아미노산으로 이루어지는 KRS 단편(2로 표시)을 사용하여 웨스턴블롯을 진행하였다.

상기 Full length KRS와 KRS 단편들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 상기 실시예 <1-6>에 기재된 것과 같은 방법으로 각각 A549 세포를 형질전환 하였다. 그 후 세포를 용해키고, 상기 실시예 <1-4>기재된 것과 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과 도 4에서 보는 바와 같이, 선별된 scFv colne(N3, N5, N7 및 N9) 모두 N-terminus 1~72 amino acid가 없는 fragment 1에서는 band를 보이지 않고 KRS 1~200 amino acid를 갖고 있는 fragment에서만 band를 보이는 것을 확인하였다. 이로서 N3, N5, N7 및 N9의 scFv colne들은 모두 KRS N-terminus에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

<1-8> KRS N-말단 결합특이적 scFv colne의 서열 분석

상기 실시예 <1-6>을 통해 최종 선별된 scFv clone들(N3, N5, N7 및 N9)에 대하여 이들의 CDR 구성, 및 VH와 VL 서열 분석이 이루어졌다. 서열분석은 전술한 실시예 <1-3>과 동일한 방법으로 수행되었다.

서열분석결과 N3 scFv는 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, 상기 서열은 중간에 서열번호 65의 링커서열을 포함하고 있었다. 이에 따라 N3의 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, N3의 VL은 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었다. 상기 N3의 VH 및 VL에 포함된 각각의 CDR 서열을 분석한 결과, 상기 N3의 VH는 서열번호 1로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하며, 상기 N3의 VL은 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하고 있었다.

N5 scFv는 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, 상기 서열은 중간에 서열번호 65의 링커서열을 포함하고 있었다. 이에 따라 N5의 VH는 서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, N5의 VL은 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었다. 상기 N5의 VH는 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 17로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하며, N5의 VL은 서열번호 19로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하고 있었다.

N7 scFv는 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, 상기 서열은 중간에 서열번호 65의 링커서열을 포함하고 있었다. 이에 따라 N7의 VH는 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, N7의 VL은 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었다. 상기 N7의 VH는 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 27로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 29로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하며, N7의 VL은 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 35로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하고 있었다.

N9 scFv는 서열번호 73으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, 상기 서열은 중간에 서열번호 65의 링커서열을 포함하고 있었다. 이에 따라 N9의 VH는 서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, N9의 VL은 서열번호 63으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었다. 상기 N9의 VH는 서열번호 37로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 39로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 41로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하며, N9의 VL은 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR 1, 서열번호 45로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 47로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하고 있었다.

<실시예 2>

scFv 항체의 IgG로의 전환 및 특이적 결합력 평가

<2-1> scFv 항체의 IgG로의 전환

먼저 클론 N3, N5, N7 및 N9 phage의 유전체에서 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 PCR로 증폭하였다. 상기 scFv의 VH 영역의 유전자를 증폭하는데 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: Forward(AGA GAG TGT ACA CTC C CA GGC GGC CGA GGT GCA G, 서열번호 93), Reverse(CGC CGC TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GCT CAC GGT GAC CAG, 서열번호 94) scFv의 VL 영역의 유전자를 증폭하는데 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:Forward(AAG CGG CCG CCA CCA TGG GAT GGA GCT GTA TCA TCC TCT TCT TGG TAG CAA CAG CTA CAG GTG TAC ACT CCC AGT CTG TGC TGA CTC AG, 서열번호 95), Reverse(CGC CGC CGT ACG TAG GAC CGT CAG CTT GGT, 서열번호 96)

각각의 phage DNA(50ng)를 주형으로 하여 상기 프라이머(각각 10pmol)를 이용하여 95℃/3min; 95℃/30sec, 60℃/30sec, 72℃/30sec, 30 cycles; 72℃/5min의 조건으로 PCR을 수행하여 N3, N5, N7 또는 N9 scFv의 VH 또는 VL 유전자를 증폭하였다. PCR 산물은 제한효소를 이용하여 IgG 생산에 사용되는 벡터인 pcDNA3.4 벡터에 삽입하였다. IgG의 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)의 단백질은 별개의 플라스미드에서 개별적으로 발현되도록 하였다.

상기에서 제조된, scFv의 가변영역을 포함하는 IgG(이하 각각 N3 IgG, N5 IgG, N7 IgG, N9 IgG로 지칭)의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터는 freestyle 293F 세포에 공동형질전환시켜 경쇄와 중쇄가 세포 안에서 함께 발현되도록 하였다. 형질전환된 293F 세포를 37℃, 8% CO₂조건에서 7일 동안 배양하여 상층액을 수득하였다. 상층액은 cellulose acetate membrane filter(pore size 0.22μm, Corning)로 여과하고 CaptivA™ PriMAB protein A column(Repligen, USA)을 사용하여 정제하였다. 수득한 항체 농도는 BCA kit (Pierce, 23225)를 이용하여 측정하였고, Bioanalyzer(Agilent 2100 Bioanalyzer)를 이용하여 환원과 비환원 조건에서 생산된 IgG 항체 단백질을 분석하였다.

<2-2> 전환된 IgG의 KRS 결합력 검증 _ 웨스턴 블롯 및 면역침전

상기 실시예 <2-1>에서 제작된 IgG 들의 KRS에 대한 결합력을 웨스턴블롯(WB) 및 면역침전(IP) 방식으로 검증하였다. 상기 실시예 <1-4>에 기재된 것과 같은 방식으로 웨스턴 블롯을 수행하였으며, 상기 실시예 <1-5>에 기재된 것과 같은 방식으로 면역침전을 수행하였다.

그 결과 본 발명에서 제작된 IgG들은 KRS에 결합하는 것을 검증하였으며, 도 5에서는 이러한 결과를 N3 IgG 및 N5 IgG를 대표로하여 보여준다.

<2-3> 전환된 IgG의 KRS N-말단 특이적 결합력 검증 _ SPR

정제한 항체 단백질(N3 IgG 및 N5 IgG)과 항원(KRS 1-207 aa)에 대한 정량적인 결합력을 Biacore2000 SPR(Surface Plasmon Resonance)(GE healthcare, 미국) 바이오센서를 이용하여 측정하였다. KRS를 센서칩 (sensor chip CM5)(GE healthcare, 미국)에 고정시킨 후, HES 완충용액(10 mM HEPES, pH7.4 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20)에 순차적으로 희석한 항체 단백질(6.25 ~ 100 nM)을 3분 동안 30 ㎕/min 속도로 흘려주고, 1M NaCl / 20mM NaOH를 3분 동안 30 ㎕/min 속도로 흘려줌으로써 항원에 결합된 단백질 해리를 유도하였다. 대조군으로서 mock IgG를 사용하였다. 구체적인 실험 조건은 다음과 같다;

Immobilized Antigen : KRS

Immobilized level : 185 RU

Antibody : N3 IgG, N5 IgG

Running buffer : HBS-N buffer

Regeneration : 2 M NaCl, 20 mM NaOH (flow 30 ul / min 1 min)

	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
N3 IgG	1.09E+05	0.009055	8.34E-08
N5 IgG	3.13E+06	0.003282	1.05E-09

상기 표 3은 Biacore 2000 SPR을 이용하여 측정한 N3 IgG, N5 IgG의 운동속도 상수와 평형 해리상수를 나타낸 것이다. BIA evaluation ver.3.2 소프트웨어를 이용하여 친화도를 운동속도 상수 (ka 및 kd)와 평형해리상수(KD)로 얻었다. 도 6은 각각 N3 IgG, N5 IgG의 SPR 그래프 결과를 나타낸다. 도 6 및 표 3으로부터 본 발명의 N3 IgG, N5 IgG는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 높은 결합력을 가짐을 확인하였다. 대조군인 mock IgG에서는 binding signal이 없었다.

<2-4> 전환된 IgG의 KRS N-말단 특이적 결합력 검증_면역형광 염색

본 발명에서 제작한 IgG이 실제 cell membrane에 노출된 KRS 영역에 binding하는지 확인하기 위하여 면역형광염색(immunofluorescence)을 수행하였다. 대표적으로 N3 IgG와 N5 IgG를 사용하여, 상기 실시예 <1-6>에 기재된 것과 같은 방법으로 면역형광 염색을 수행하였다.

그 결과 도 7A에서 보는 바와 같이, laminin을 처리하여 WT-KRS의 membrane localization을 유도한 경우에 있어서, N3 IgG이 세포 외막으로 노출된 KRS N-말단 부분에 특이적으로 잘 결합한 것을 확인하였다. 도 7B에서 보는 바와 같이, T52D-KRS(active mutant, myc tagged KRS)를 이용한 실험에서도, 본 발명의 항체는 세포 외막으로 노출된 KRS N-말단부분에 특이적으로 잘 결합하였으며, 실험 세포에 세포막 투과성을 부과하였을 때 세포내에 존재하는 KRS 단백질을 높은 감도로 검출해내었다. 또한 도 7C에서 보는 바와 같이, laminin을 처리하여 WT-KRS의 membrane localization을 유도한 경우에 N5 IgG이 세포 외막으로 노출된 KRS N-말단 부분에 특이적으로 잘 결합한 것을 확인하였다.

이로써 본 발명에서 제공하는 항체들은 세포 외막으로 노출된 KRS N-말단부분에 결합 특이성이 높은 것을 확인하였다.

<실시예 3>

암 전이 억제 효능 확인

<3-1> 세포 독성 평가

대표적으로 N3 IgG를 이용하여 MTT assay를 수행하였다. A549 cell을 (5,000 cell/well) 96-well plate에 분주하고 배양하였다. 무혈청 배지를 사용하여 상기 세포들을 세척한 뒤, human mock IgG 및 N3 IgG을 각각 0, 50, 100, 500nM의 농도(in serum free media)로 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 MTT solution을 50ug/well씩 첨가하여 4시간 동안 처리하였다. MTT solution을 제거한 후, DMSO 100ul을 처리하고 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험 결과 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 항체는 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

<3-2> 세포 이동(cell migration) 분석

세포 이동은 선행 문헌(Park, S. G. et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 6356-6361 (2005))에 기재한 바와 같이 폴리카보네이트 막(8.0μm 공극 싸이즈, Costar)를 가진 24-웰 트랜스웰 챔버로 측정하였다. 상기 트렌스웰 쳄버에서 lower well을 10ug Laminin(in gelatin)으로 코팅하고, UV로 건조하였다. 그 후 A549 세포를 무혈청(serumfree) RPMI 배지에 현탁한 다음 각 웰당 1 x 10⁵세포의 농도로 상위 챔버에 넣었다. N3 IgG 또는 human mock IgG(대조군)를 100nM 또는 500nM로 상기 챔버에 처리하고 24시간동안 배양하였다. 그 후, PBS로 2회 세척하고 70% MeOH(in PBS)를 30분동안 처리하였다. 다시 PBS로 2회 세척하고 Hematoxylin solution을 30분동안 처리하였다. 상기 챔버를 DW로 3회 세척하였고, 챔버내의 막(membrane)을 자르고 slide glass위에 마운팅하였다.

실험결과 도 9A에서 보는 바와 같이, N3 IgG는 A549세포의 이동을 현저하게 억제하는 효과를 나타냈다. 또한 이러한 세포 이동 억제효과는 농도 의존적임을 나타내었다(도 9B 참조).

<3-3> in vivo 암 전이 모델에서, 암 전이 억제 효능 평가

KRS가 암 전이와 관련된 67LR을 통해 세포 이동을 촉진할 수 있기 때문에, 폐로 전이가 잘되는 마우스 유방암 4T-1 세포(한국세포주은행)를 사용하여 종양(암) 동물 모델을 제작하였다. 7주령 BALB/cAnCr mice(두열 바이오텍) 6마리에 4 x 10⁴cells4T1 세포를 마우스의 fat pad에 주입하여 동소이식 유방암 동물모델 (orthotopic model)을 제작하였다.

Mammmary Fat pad에 암을 주입하고 10일 뒤(day10), fat pad에서 암조직을 제거하였다. 1일 후(day11), N3 IgG를 3일 간격, 주 2회, 2주 동안(총 4회, day11, 14, 18, 21) 10 mg/kg씩 꼬리 혈관 정맥 주사(tail vein i.v. injection) 방법으로 투여하였고 control mock IgG(Thermo #31154)도 동일 용량으로 투여하였다. 모든 항체 투여 일정 종료 후, 일주일 후, 암을 주입한지 28일 후에 쥐를 희생시켜서 폐 조직을 얻었다. 폐 조직 부검 시 기관지에 주사기를 이용하여 식염수를 주입, 폐를 부풀린 후 채취, Bouin‘s solution(Sigma #HT10132)에 24시간 동안 보관하였다. 이후 현미경을 통하여 폐의 각 엽에서 전이된 결절(metastasis nodule)의 개수를 확인하였다.

실험 결과 도 11 및 도 12에서 보는 바와 같이, 대조군에서는 암 전이에 의하여 폐에 많은 결절이 생긴 것을 확인할 수 있었으며 N3 IgG의 처리군에서는 이러한 결절이 현저히 억제된 것을 확인하였다. 도 13은 대조군과 N3 IgG의 처리군에서의 폐조직을 대조적으로 보여주며, 대조군에서는 본 발명의 항체 처리군에 비하여 전이된 결절 부위에서 라미닌 수용체가 상당히 많이 발현된 것을 확인하였다.

<3-4> in vivo 암 전이 모델에서, 항-암전이 화합물(YH16899)과 효능 비교

기존에‘Dae Gyu Kim et al.,(2014)’의 문헌에서 YH16899라는 화합물이 67LR와 KRS의 상호작용을 억제하여 암전이 억제에 효과가 있는 것으로 알려졌다. 이에 YH16899와 본 발명 항체 N3 IgG의 암전이 억제효능을 비교하였다. in vivo 종양 모델의 제작과 폐 전이 상태의 관찰은 상기 실시예 <3-3>과 동일한 방법으로 수행되었다. YH16899는 100mpk씩 매일 경구투여 되었다. N3 IgG는 각각 농도별로(1mpk, 10mpk) 마우스 꼬리를 통해 정맥 주사되었다.

실험 결과 도 14 및 도 15에서 보는 바와 같이, N3 IgG 처리군에서 농도 의존적으로 폐 결절의 수가 현저하게 감소되는 것을 확인하였으며, YH16899 100mpk처리 군과 비교하여 1mpk의 용량으로 N3 IgG을 처리하는 것만으로도 암전이가 현저히 억제되는 것을 확인하였다.

<실시예 4>

KRS 항체의 결합위치 확인

<4-1> KRS 단클론 항체의 인간 KRS에 결합하는 위치

상기에서 제조한 KRS 항체들 중 N3 IgG가 인간 KRS에 결합하는 위치를 확인하기 위하여 다음과 같이 SPR(Surface Plasmon Resonance)실험을 실시하였다.

먼저, 아민 커플링 키트(GE Healthcare)를 이용하여 N3 IgG 항체를 Series S 센서 칩 CM5(GE Healthcare)가 장착된 Biacore T200(GE Healthcare)에 고정하였다. 그 다음 하기 표 4에 기재된 펩타이드를 PBS 용액에 해당 농도로 녹여 60초 동안 흘려주었다. 그 다음 5분 동안 PBS를 흘려주었다. 그 다음 Biacore T200 Evaluation 소프트웨어 v2.0 (GE Healthcare)으로 결합력을 분석하였다.

펩타이드 정보

명칭	서열정보	Species	MW	서열번호
F1 (1-29)	MAAVQAAEVKVDGSEPKLSKNELKRRLKA	H	3168	98
F2 (5-34)	QAAEVKVDGSEPKLSKNELKRRLKAEKKVA	H	3351	99
F3 (10-38)	KVDGSEPKLSKNELKRRLKAEKKVAEKEA	H	3310	100
F4 (15-42)	EPKLSKNELKRRLKAEKKVAEKEAKQKE	H	3337	101
F5 (24-49)	KRRLKAEKKVAEKEAKQKELSEKQLS	H	3084	102
mF1 (1-28)	MATLQESEVKVDGEQKLSKNELKRRLKA	M	3230	103
mF2 (3-34)	QESEVKVDGEQKLSKNELKRRLKAEKKLA	M	3383	104
mF3 (10-37)	KVDGEQKLSKNELKRRLKAEKKLAEKEA	M	3268	105
mF4 (15-41)	QKLSKNELKRRLKAEKKLAEKEAKQKE	M	3253	106
mF5 (24-48)	RRLKAEKKLAEKEAKQKELSEKQLN	M	2997	107
rF1 (1-28)	MATLREGEVKLDGEPKLSKNELKRRLKA	R	3211	108
rF2 (3-34)	REGEVKLDGEPKLSKNELKRRLKAEKKLA	R	3364	109
rF3 (10-37)	KLDGEPKLSKNELKRRLKAEKKLAEKEA	R	3251	110
rF4 (15-41)	PKLSKNELKRRLKAEKKLAEKEAKQKE	R	3222	111
rF5 (24-48)	RRLKAEKKLAEKEAKQKELSEKQLN	R	2997	112

그 결과 도 16에 나타난 바와 같이, 에피토프 F1, F2, F3, F4에서는 N3 IgG 항체가 결합하는 것으로 나타났으나, F5에서는 N3 IgG 항체가 결합하지 않는 것으로 나타났다. 또한, 에피토프 F4의 경우에 결합력이 가장 강한 것으로 나타났고, F3, F2, F1 순서로 결합력이 강한 것으로 나타났다.

이를 통해, N3 IgG 항체가 주로 결합하는 위치는 KRS N-말단 영역의 15 내지 29 아미노산 부위인 것을 확인할 수 있었다.

<4-2> KRS 단클론 항체의 다른 종간 교차 반응성(cross activity)

상기의 실시예에서 KRS 항체인 N3 IgG가 인간 KRS에 결합하는 위치를 확인하였고, N3 IgG가 다른 종인 마우스(m), 랫(r)과 교차 반응성을 나타내는지 확인하기 위하여 다음과 같이 SPR(Surface Plasmon Resonance)실험을 실시하였다.

상기 실시예 4-1에 기재되어 있는 실험 방법과 동일하게 아민 커플링 키트(GE Healthcare)를 이용하여 N3 IgG 항체를 칩에 고정하였고, 상기 표 4에 기재된 펩타이드를 PBS 용액에 해당 농도로 녹여 60초 동안 흘려준 다음 5분 동안 PBS를 흘려주었다. 그 다음 Biacore T200 Evaluation 소프트웨어 v2.0 (GE Healthcare)으로 결합력을 분석하였다.

그 결과 도 17에 나타난 바와 같이, N3 IgG 항체가 사람(h), 마우스(m), 랫(r)의 에피토프 F1, F2, F3, F4와 결합하고, F5와는 결합하지 않는 것으로 나타났다. 또한, 에피토프 F3가 F1에 비해 결합력이 강한 것도 사람, 마우스, 랫에서 동일하게 나타났다(F2, F4 데이터 미도시).

이를 통해, N3 IgG 항체가 종간의 교차 반응이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편들은 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR(상보성 결정부위) 서열을 가지며 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적 결합능력이 매우 우수하기 때문에, KRS의 특이적 행태를 수반하는 질병(예를들어, 암)으로서 알려진 질병의 진단에 이용가능하다. 또한 in vivo 상에서도 KRS N-말단 영역에 특이적으로 타겟팅되므로 라미닌 수용체와 KRS N-말단 영역의 상호작용을 억제하여 암 전이를 억제하는 효과가 탁월하므로 치료제로서 이용될 수 있어, 산업상 이용가능성이 크다.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Antibody specifically binding to the N-terminal region of lysyl- tRNA synthethase exposed at cell outer membrane <130> NP17-0004P <150> KR 10-2017-0038775 <151> 2017-03-27 <160> 114 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH CDR1 <400> 1 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH CDR1 <400> 2 agttatgata tgagc 15 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH CDR2 <400> 3 Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH CDR2 <400> 4 gcgatctctt atgataatgg taatacatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH CDR3 <400> 5 Met Ala Leu Asp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 VH CDR3 <400> 6 atggcgcttg atttcgacta c 21 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720 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020 cagccccgag aaccacaggt gtataccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320 tccctgtccc cgggtaaa 1338 <210> 91 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N9 IgG light chain <400> 91 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Pro Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Phe Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Tyr Gln 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ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatt taatattggc agtaatgctg tctactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tataatagtc agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggc tcttgggatg ctagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta ctaggccagc ccaaggccaa ccccactgtc 360 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctc caagccaaca aggccacact agtgtgtctg 420 atcagtgact tctacttggg agctgtgaca gtggcctgga aggcagatgg cagccccatc 480 aaggcgggag tggagaccac caaaccctcc aaacagagca acaacaagta cgcggccagc 540 agctacctga gcctgacgcc cgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600 acgcatgacg ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgtag c 651 <210> 93 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv VH primer Forward <400> 93 agagagtgta cactcccagg cggccgaggt gcag 34 <210> 94 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv VH primer Reverse <400> 94 cgccgctggg cccttggtgg aggctgagct cacggtgacc ag 42 <210> 95 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv VL primer Forward <400> 95 aagcggccgc caccatggga tggagctgta tcatcctctt cttggtagca acagctacag 60 gtgtacactc ccagtctgtg ctgactcag 89 <210> 96 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv VL primer Reverse <400> 96 cgccgccgta cgtaggaccg tcagcttggt 30 <210> 97 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> main binding site of N3 Ab <400> 97 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala 1 5 10 <210> 98 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 epitope F1 <400> 98 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala 20 25 <210> 99 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 epitope F2 <400> 99 Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys 1 5 10 15 Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala 20 25 30 <210> 100 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 epitope F3 <400> 100 Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg 1 5 10 15 Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala 20 25 <210> 101 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 epitope F4 <400> 101 Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu 1 5 10 15 Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 20 25 <210> 102 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 epitope F5 <400> 102 Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys 1 5 10 15 Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser 20 25 <210> 103 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse N3 epitope F1(mF1) <400> 103 Met Ala Thr Leu Gln Glu Ser Glu Val Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys 1 5 10 15 Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala 20 25 <210> 104 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse N3 epitope F2(mF2) <400> 104 Gln Glu Ser Glu Val Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys Leu Ser Lys Asn 1 5 10 15 Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala 20 25 <210> 105 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse N3 epitope F3(mF3) <400> 105 Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 1 5 10 15 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala 20 25 <210> 106 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse N3 epitope F4(mF4) <400> 106 Gln Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys 1 5 10 15 Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 20 25 <210> 107 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse N3 epitope F5(mF5) <400> 107 Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln 1 5 10 15 Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn 20 25 <210> 108 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat N3 epitope F1(rF1) <400> 108 Met Ala Thr Leu Arg Glu Gly Glu Val Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys 1 5 10 15 Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala 20 25 <210> 109 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat N3 epitope F2(rF2) <400> 109 Arg Glu Gly Glu Val Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn 1 5 10 15 Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala 20 25 <210> 110 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat N3 epitope F3(rF3) <400> 110 Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 1 5 10 15 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala 20 25 <210> 111 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat N3 epitope F4(rF4) <400> 111 Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys 1 5 10 15 Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 20 25 <210> 112 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat N3 epitope F5(rF5) <400> 112 Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln 1 5 10 15 Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn 20 25 <210> 113 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lysyl-tRNA synthetase N-term(mouse) <400> 113 Met Ala Thr Leu Gln Glu Ser Glu Val Lys Val Asp Gly Glu Gln Lys 1 5 10 15 Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu 20 25 30 Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn 35 40 45 <210> 114 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lysyl-tRNA synthetase N-term(rat) <400> 114 Met Ala Thr Leu Arg Glu Gly Glu Val Lys Leu Asp Gly Glu Pro Lys 1 5 10 15 Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Leu 20 25 30 Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Asn 35 40 45

Claims

라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
제1항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 75, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 113 및 서열번호 114로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 서열번호 1, 서열번호 13, 서열번호 25 및 서열번호 37로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 3, 서열번호 15, 서열번호 27 및 서열번호 39로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 5, 서열번호 17, 서열번호 29 및 서열번호 41로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역(VH) 및
서열번호 7, 서열번호 19, 서열번호 31 및 서열번호 43으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 9, 서열번호 21, 서열번호 33 및 서열번호 45로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 11, 서열번호 23, 서열번호 35 및 서열번호 47로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역(VL)
을 포함하는, 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
제3항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역;
서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역;
서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역; 및
서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역;
으로 이루어진 군에서 선택된 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제3항에 있어서, 상기 중쇄가변영역은 서열번호 49, 서열번호 53, 서열번호 57 및 서열번호 61로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가변영역은 서열번호 51, 서열번호 55, 서열번호 59 및 서열번호 63으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제3항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제6항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71 및 서열번호 73으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제9항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포.
(a) 제9항의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;
(b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단계; 및
(c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법.
제1항의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소(KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단의 특이적 검출 방법.
제1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제13항에 있어서, 상기 암은 유방암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.