WO2019066617A2 - 항 c-met 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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이지혜
김영덕
이재구
이훈석
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서울대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-c-Met antibody and a use thereof, and more particularly to an antibody or a fragment thereof that specifically binds to a human-derived c-Met protein, a production method thereof, a c-Met- To a method for detecting circulating cancer cells (CTC) using the same, and a kit for detecting circulating cancer cells containing the same as an active ingredient.
  • CTC circulating cancer cells
  • c-Met is a typical RTK (Receptor Tyrosine Kinase) present on the surface of a cell, and binds to its ligand HGF / SF (Hepatocyte Growth Factor / Scattering Factor) And is also overexpressed in many kinds of cancer cells and is widely involved in cancer development, cancer metastasis, cancer cell migration, cancer cell infiltration, and neovascularization.
  • HGF / SF Hepatocyte Growth Factor / Scattering Factor
  • c-Met signaling through HGF / SF attenuates the cel1-cel1 contact of almost all epi-thelial tumors, leading to a typical early stage cancer protein that causes scatting (Nat Rev Cancer, 2012 Jan 24; 12 (2): 89-103).
  • c-Met contributes to various stages of cancer development from onset to progression through metastasis ([Comogl io et al. 2008 Nat Rev Drug Di scov 7: 504]; [Knudsen and Vande Woude 2008. Curr Opin Genet Dev 18: 87]).
  • c-Met is known to be involved in drug resistance in the mechanism of action of known anticancer drugs, Has become a target molecule attracted by many pharmaceutical companies in relation to anticancer drugs.
  • CTCs circulating cancer cells
  • Primary Tumor Cells a cancer cell that circulates through the blood, separated from the primary tumor (Primal Tumor Cells), and plays a key role in the transformation of cancer into other organs have. It is a useful means to monitor the efficacy and evaluation of a cancer drug as a therapeutic prognostic factor that can predict the recurrence of cancer. This can be used as a useful biomarker. DNA and protein can be extracted from circulating cancer cells and various downstream analysi techniques can be used for analysis, thus wider analysis data can be obtained.
  • the present inventors have sought results from the example, humans, specifically binding to c- Met to the c-Met as a target to develop the "antibody that represent the different physiological activity, while the c-Met as targets Human antibodies composed of the complementarity determining region (CDR) and the framework region (FR) derived from the human antibody exhibit similar activity to HGF and that the c-Met antibody binds to circulating cancer cells in the blood, thereby completing the present invention .
  • CDR complementarity determining region
  • FR framework region
  • Still another object of the present invention is to provide a method for detecting circulating cancer cells (CTC) using the antibody or a fragment thereof, a composition for detection, and a kit for detection.
  • CTC circulating cancer cells
  • CTC circulating cancer cells
  • the present invention provides a complementarity determining region (CDR) L1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a complementary crystal region including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: (CDR) L2 and an antibody light chain variable region (VL) comprising a complementary crystal region (CDR) L3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a complementary crystal region (CDR ) HI, an antibody heavy chain variable region (VH) comprising a complementary crystal region (CDR) H2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a complementary crystal region (CDR) H3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:
  • the present invention provides an antibody or a fragment thereof that specifically binds to a human-derived c-Met protein.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding said antibody or fragment thereof.
  • the present invention provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention provides a cell converted into the vector.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide comprising the steps of: culturing the cell under a condition that expresses a polynucleotide, producing a polypeptide comprising a light chain and a heavy chain variable region; And recovering the polypeptide from human c-Met, or a method for producing the antibody.
  • the present invention provides a c-Met specific detection method comprising contacting the antibody or a fragment thereof with a sample and detecting the antibody or fragment thereof.
  • the present invention provides a method for detecting a protein comprising the steps of: a ) contacting a sample obtained from an individual with the antibody; b) separating the complex formed by binding the antibody to the sample with the non-complexed portion; And c) obtaining a complex isolated in step b).
  • the method for detecting a circulating cancer cell (CTC) comprises the steps of:
  • the invention provides circulating cancer cells (Ci rculat ing Tumor Cel l, CTC) for detecting compositions ol comprising the antibody or the fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for detecting circulating cancer cells (CTC) comprising the antibody or a fragment thereof.
  • the present invention also provides a composition for detecting circulating cancer cells (CTC), which is essentially composed of the above antibody or a fragment thereof.
  • a kit for detecting circulating cancer cells (CTC) comprising the antibody or the fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a kit for detecting circulating cancer cells (CTC) comprising the above antibody or a fragment thereof.
  • the present invention also provides a kit for detecting circulating cancer cells (CTC) consisting essentially of the antibody or fragment thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising: (CDR) L1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a complementary crystal region (CDR) L2 including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a complementary crystal region including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: (CDR) H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, an antibody light chain variable region (VL) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR) L3, ) H2 and an antibody heavy chain variable region (VH) comprising a complementary crystal region (CDR) H3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or an antibody or fragment thereof .
  • CDR antibody light chain variable region
  • VH antibody heavy chain variable region
  • antibody anti-c-Met antibody
  • humanized anti-c-Met antibody and “modified humanized anti- (Monoclonal antibody, full-length monoclonal antibody), polyclonal antibody (polyclonal antibody), multispecific antibody (for example, , And antibody fragments (e. G., Other portions of the antibody that exhibit the variable region and the desired biological activity (e. G., Binding to c-Met)).
  • the antibody of the present invention is an antibody in which a specific amino acid sequence is contained in a light chain and a heavy chain CDR so as to be capable of selectively binding to c-Met, and includes both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies Lt; / RTI >
  • the antibody of the present invention includes both a chimeric antibody, a humanized antibody, and a human antibody, and may preferably be a human antibody.
  • a monoclonal antibody of the invention refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies bind to single antigen epitopes very specifically.
  • " monoclonal " in the present invention means that the antibody is obtained from a substantially homologous population and is a characteristic of the antibody, and does not necessarily mean that the antibody is produced by a specific method.
  • Lornal antibodies can be prepared by the hybridoma method first described in Kohler et al. (1975) Nature 256: 495), or by recombinant DNA methods (see U.S. Patent No. 4,816,567) . ≪ / RTI > (1991) Nature 352: 624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 and Presta (2005) J. Al can be isolated from the phage antibody library using techniques described in Langer, Cl.
  • the antibody of the present invention specifically includes a chimeric antibody, wherein a portion of the heavy chain and / or light chain originates from a particular species or is homologous or homologous to the corresponding sequence of a particular antibody, May be of the same species as or homologous to the consensus sequence of another antibody, as long as it exhibits the desired biological activity (e. G., Selective binding to NRS) (U.S. Patent No. 4,816,567 And Morr i son et al., (1984) Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
  • a chimeric antibody wherein a portion of the heavy chain and / or light chain originates from a particular species or is homologous or homologous to the corresponding sequence of a particular antibody, May be of the same species as or homologous to the consensus sequence of another antibody, as long as it exhibits the desired biological activity (e. G., Selective binding to NRS) (U.S. Patent No. 4,816,
  • Humanized antibodies are antibodies that comprise both human and non-human (e.g., rat, rat) antibody sequences. Generally, the remainder of the epitope binding site (CDR) is of human antibodies, (CDR) may comprise a non-human derived sequence.
  • CDR epitope binding site
  • a complete human antibody refers to an antibody comprising only a human immunoglobulin protein sequence and can be produced in a hybridoma originating from a mouse, mouse cell, or mouse cell, or produced by a phage display method.
  • Natural antibodies produced in vivo are typically about 150,000 daltons of heterotetrameric glycoproteins consisting of two identical light chains (L) and two identical heavy chains (H). Each light chain is linked to the heavy chain by one covalent disulfide bond, but the disulfide chain number varies between the heavy chains of the different immunoglobulin isoforms. Each heavy and light chain also has regularly spaced intra-chain disulfide bridges. Each heavy chain has a variable domain (VH) at one end followed by a number of constant domains.
  • VH variable domain
  • Each light chain has a variable domain (VL) at one end and a constant domain at the other end;
  • the constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain. It is believed that a particular amino acid residue forms an interface between the light chain variable domain and the heavy chain variable domain. Refers to the amino-terminal domain of the heavy or light chain of the antibody.
  • the variable region of the heavy chain is referred to as " VH ", and the variable region of the light chain is referred to as " VL " These dodecins are generally the most variable part of the antibody and include antigen binding sites.
  • " hypervariable " in the present invention means that several sequences within the variable region are broadly different in sequence between antibodies and are directly related to the binding and specificity of each particular antibody to its specific antigenic determinants ≪ / RTI > residues.
  • the hypervariability is focused on three segments known as complementarity determining regions (CDRs) or hypervariable loops (HVLs).
  • CDRs are restricted by sequence comparisons in the literature (Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Publications of National Institute of Health, Bethesda, silver Document (Chothia and Le or 1987, J. Mol Biol 196:. . 901-917) , such as disclosed is limited to a structure according to the 03-dimensional structure of the variable region.
  • the three CDRs within each of the heavy and light chains are separated by a haplotypes (FR), which contain sequences that tend to be less variable. From the amino terminus to the carboxy terminus of the heavy and light chain variable regions, the FRs and CDRs are arranged in the following order: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4.
  • FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4 The large sheet arrangement of the FR makes the CDRs inside each chain close to each other as well as from the other chain. All forms of CDR residues need not be directly involved in antigen binding, although the form produced contributes to the antigen binding site (see Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669).
  • the fragment is a fragment selected from the group consisting of diabodies, Fab, Fab ' ' F (ab) 2, F (ab ' ) 2, Fv and scFv.
  • a fragment of an antibody refers to a fragment of an antibody that retains the antigen-specific binding force of the whole antibody.
  • the fragment has at least 20%, 50%, 70% %, 80%, 90%, 95% or 1003 ⁇ 4> or more.
  • it may be in the form of Fab, F (ab) 2, Fab ', F (ab') 2, Fv, diabody, scFv and the like.
  • Fab fragment antigen-binding
  • F (ab ') 2 is a fragment produced by hydrolyzing an antibody to pepsin, and two Fabs are linked from a heavy chain hinge to a disulfide bond.
  • F (ab ') is a monomer antibody fragment in which a heavy chain hinge is added to a Fab obtained by reducing disulfide bonds of F (ab') 2 fragments.
  • FV variable fragment is an antibody fragment consisting of only variable regions of heavy and light chains, respectively.
  • a single chain variable fragment is a recombinant antibody fragment in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VU) are linked by a flexible peptide linker.
  • the diabody is a linker with a very short linker of VH and VL of scFv Means a fragment in which a dimer is formed by binding to VL and VH of other scFVs of the same type without binding to each other.
  • the fragment of the antibody is not limited in structure or form as long as it retains the binding specificity for the human-derived c-Met protein, but may be preferably scFv.
  • the scFv according to the present invention has a CDR structure specific to the aforementioned human-derived c-Met protein or a structure of VH and VL. If the C-terminus of VH and the N-terminus of VL are linked through a linker, It is not limited.
  • the kind of the linker is not particularly limited as long as it is known in the art as a linker applicable to scFV.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention may comprise conservative amino acid substitutions (referred to as conservative variants of the antibody) that do not substantially alter its biological activity.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention may be conjugated with an enzyme, a fluorescent substance, a radioactive substance and a protein, but is not limited thereto. Methods of conjugating such materials to antibodies are also well known in the art.
  • the antibody of the present invention may be derived from any animal including mammal, including birds, birds, and the like.
  • the antibody is human, mouse, donkey, sheep, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse. Or chicken, and most preferably human or mouse.
  • a human antibody is an antibody having the amino acid sequence of a human immunoglobulin, including an antibody isolated from a human immunoglobulin library or an antibody isolated from an animal that is transgenic for one or more human immunoglobulin and does not express an endogenous immunoglobulin Patent No. 5, 939, 598).
  • a 'polynucleotide' may be described as an oligonucleotide or a nucleic acid and may be expressed using DNA molecules (eg, cDNA or genomic DNA, RNA molecules (eg, mRNA), nucleotide analogs (E. G., Peptide nucleic acids and non-naturally occurring nucleotide analogs) and hybrids thereof.
  • the polynucleotides may be single-stranded or double-stranded
  • the polynucleotide means a nucleotide sequence coding for an antibody consisting of a heavy chain and light chain having a CDR structure specific to the KRS N-terminal region or a VH and VL structure .
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the antibody or fragment thereof of the present invention.
  • the polynucleotide encoding the above-described CDR sequence in the antibody according to the present invention described above has a particularly restricted sequence (Heavy chain CDR2), SEQ ID NO: 3 (heavy chain CDR3), SEQ ID NO: 4 (light chain CDR1), SEQ ID NO: 5 (light chain CDR2), SEQ ID NO: 6, light chain CDR3 ).
  • ≪ / RTI &gt The polynucleotide encoding VH and VL described above in the antibody according to the present invention is not particularly limited in its sequence.
  • Polynucleotides encoding the antibodies or fragments thereof of the present invention can be obtained by methods well known in the art. For example, oligonucleotide synthesis techniques well known in the art, for example, polymerase chain reaction (PCR), and the like, may be used, depending on the DNA sequence or a corresponding amino acid sequence encoding a part or all of the heavy and light chains of the antibody . ≪ / RTI >
  • the present invention provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the 'vector' of the present invention is used for the purpose of replication or expression of the polynucleotide of the present invention for recombinant production of the antibody or fragment thereof of the present invention, and generally includes a signal sequence, a replication origin, An enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence.
  • the vector of the present invention may preferably be an expression vector, and more preferably a vector comprising the polynucleotide of the present invention operably linked to the regulatory sequence, e.g., to a promoter.
  • a plasmid refers to a linear or circular double stranded DNA molecule to which external polynucleotide fragments can be ligated.
  • Other forms of vector are viral vectors (e. G., Replicate defect ive retroviruses, adenoviruses and adeno associated viruses) Of the DNA fragments may be introduced into the viral genome.
  • viral vectors e. G., Replicate defect ive retroviruses, adenoviruses and adeno associated viruses
  • Certain vectors are expressed in host cells (e. G., Bacterial vectors containing episomal mammalian vectors) and host cells into which they are introduced (e. G., Bacterial origin and episomal mammalian vectors) Autonomous replication can be done.
  • Other vectors e. G., Non-epi somal mammalian vectors
  • An expression vector in the present invention is a form of a vector capable of expressing a selected polynucleotide.
  • One polynucleotide sequence is " operably linked " to the regulatory sequence when the regulatory sequence affects the expression (e. G., Level, timing or location of expression) of the polynucleotide sequence.
  • the modulatory sequence is a sequence that affects the expression (e.g., level, timing, or location of expression) of the nucleic acid to which it is operatively linked. Such modulation may be effected, for example, by the action of a controlled nucleic acid directly or through the action of one or more other molecules (e.
  • the vectors of the invention are preferably pOptiVEC TM -TOPO and pcDNA TM 3.3-T0P0
  • the present invention provides cells transfected with the vector.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell that can be used to express an antibody or polynucleotide encoding the fragment contained in the expression vector of the present invention.
  • Cells (host cells) transformed with an expression vector according to the present invention can be transformed into a prokaryotic (e. G., E. coli), eukaryote (e. G., Yeast or other fungi), plant cells (e. (Eg, cells), animal cells (eg, human cells, monkey cells, hamster cells, rat cells, mouse cells, stromal cells or hybridomas derived therefrom). May be cells derived from mammals, including humans.
  • a prokaryotic e. G., E. coli
  • eukaryote e. G., Yeast or other fungi
  • plant cells e. (Eg, cells)
  • animal cells eg, human cells, monkey cells, hamster cells, rat cells, mouse cells, stromal cells or
  • Suitable prokaryotes for this purpose include gram-negative or gram-positive organisms, interspecific enterobacteria ( ⁇ ero ⁇ c / ⁇ / aceae), eg Escherichia 0 c /? Er / c /? / For this. E.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it is capable of expressing the vector of the present invention, Lt; / RTI >
  • eukaryotes are most commonly used in sarcoma cells (5 sc? ArOTyces cerevisiae).
  • many other genera, species and strains including, but not limited to, pombe) Cluyeberomyces host, eg. Lactis (/ ac / s), Kay. Plagallis (X fragilis) (NTCC 12,424), Kay. J. bujgaricus (MCC 16,045), Kay. Wickeramy (£. Wickerawii) ⁇ T, 24, 178), Kay. Walton (£. Waltii) ⁇ T £ 56,500), Kathryn Soil Pillar Room Of. drosoph J arm) (MCC 36,906), Kay.
  • the term 'transformation' refers to a modification of the genotype of a host cell by the introduction of a foreign polynucleotide, which means that the foreign polynucleotide has been introduced into the host cell irrespective of the method used for its transformation.
  • the exogenous polynucleotide introduced into the host cell may be maintained integrated or maintained in the genome of the host cell, but the present invention encompasses both.
  • the recombinant expression vector capable of expressing an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the human-derived c-Met protein according to the present invention can be produced by a method known in the art such as, but not limited to, transient transfection transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection, Introduced into cells to produce antibodies or fragments thereof by known methods for introducing polybrene-mediated transfection, electroporation, gene gun, and intracellular rhoch acid. Lt; / RTI >
  • cells of the present invention is a cultured cell that can be transformed with the polynucleotide or the vector or transfected (transfected) including the same of the invention, ⁇ which can be continuously expressed in the host cell.
  • Recombinant cells have to be expressed Quot; refers to a cell transformed or transfected with a polynucleotide.
  • Cells of the invention also include polynucleotides of the invention, but may be cells that do not express the desired levels of the polynucleotide unless the precursor is operably linked to the polynucleotide and is introduced into the cell.
  • the cells of the present invention can be cultured in various media.
  • Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), minimal essential medium (MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Si ma- , And Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma-Aldrich Co.) are suitable for culturing cells.
  • the medium may be supplemented with hormones and / or other growth factors, salts, buffers, nucleotides, antibiotics, trace elements and glucose or equivalent energy sources, if necessary.
  • the present invention relates to a method for producing a polypeptide comprising the steps of culturing the above cells under a condition that a polynucleotide is expressed to produce a polypeptide comprising a light chain and a heavy chain variable region and recovering the polypeptide from the cell or a culture medium in which the polypeptide is cultured
  • the cells of the production method in the present invention are as described above and include a polynucleotide encoding the antibody of the present invention.
  • the polypeptide of the above production method may be an antibody of the present invention or a fragment thereof itself, and may be further combined with an antibody or an amino acid sequence other than the fragment of the present invention. In this case, Can be removed from the antibody or fragment thereof of the present invention using well known methods.
  • the culture may vary in the composition of the medium and the culture conditions depending on the type of the cells, and can be appropriately selected and controlled by those skilled in the art.
  • the antibody molecule may be accumulated in the cytoplasm of the cell, secreted from the cell, or targeted to a periplasm or supernatant by an appropriate signal sequence, and targeted to a periplasm or extracellular medium To be desirable. It is also desirable to refold the produced antibody molecule using methods well known to those of ordinary skill in the art and to have conformat ion. The recovery of the polypeptide may vary depending on the characteristics of the produced polypeptide and the characteristics of the cells, and those skilled in the art can appropriately select and control the polypeptide.
  • the polypeptide may be produced intracellularly, in the periplasmic space, or directly secreted into the medium. If a polypeptide is produced in a cell, it can be destroyed to release the protein as a first step. Particulate debris, host cells, or lysed fragments are removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration. When the antibody is secreted into the medium, the supernatant from such an expression system is generally first concentrated using a commercially available protein concentration filter, e. G. Amicon or Mi l l ipore Pel l icon ultrafiltration unit. To inhibit proteolysis, a protease inhibitor, such as PMSF, may be included in any preceding step and antibiotics may be included to prevent the growth of contingent contaminants.
  • a protease inhibitor such as PMSF
  • Antibodies prepared from cells can be purified using, for example, hydropathic apatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis and affinity chromatography, and the antibodies of the invention can be purified, preferably, by affinity chromatography have.
  • the present invention provides a c-Met specific detection method comprising contacting the antibody or fragment thereof with a sample and detecting the antibody or fragment thereof.
  • the above detection method of the present invention is a method for detecting the presence or absence of KRS (or an KRS N-terminal peptide exposed to an extracellular membrane) using the antibody or fragment thereof according to the present invention, before contacting with the antibody according to the present invention or a fragment thereof. And preparing a sample for measuring the concentration (step (1)).
  • a person skilled in the art can appropriately select a known method for detecting a protein using an antibody and prepare a sample suitable for a selected method.
  • the sample may also be a cell or tissue, blood, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, etc. obtained by biopsy or the like collected from a subject to be diagnosed as cancer or metastasis.
  • the method of detecting a protein using the above antibody is not limited thereto, Immunohistochemistry, ELISA, radioimmunoassay, competitive binding assays, immunoprecipitation, and the like are included.
  • a buffer suitable for electrophoresis may be added to a sample or a cell lysate, followed by boiling.
  • immunohistochemical staining a cell or tissue section is fixed, It is possible to perform pre-processing such as blocking.
  • the antibody or the fragment thereof according to the present invention is contacted with the sample prepared in the above step (step (2)).
  • the antibody according to the present invention has the above-described CDR, or VH and VL, and specifically binds to a human-derived c-Met protein, or a fragment thereof.
  • the specific types and sequences of the antibody are as described above.
  • the antibody or fragment thereof can generally be labeled with a detectable moiety for its detection. See, for example, Current Protocol in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Co 1 i gen et al., Ed. Wi ley ⁇ Interscience, New York, N. Y. , ≪ / RTI > Pubs], using radioimmunoassay techniques.
  • enzymatic labels are luciferase, luciferin, luciferase such as Drosophila luciferase and bacterium luciferase (U.S. Patent No. 4,773,456), or various enzyme- , Alkaline phosphatase, beta -galactosidase, glucoamylase, glucoamylase, glucoamylase, glucuronidase, glucuronidase, (For example, free radicals and xanthine oxidases), lactose (for example, lactose), amylase, lysozyme, saccharide oxidase (for example, glucose oxidase, galactose oxidase and glucose-6-phosphate dehydrogenase) Peroxidase, microperoxidase, and the like.
  • enzyme- Alkaline phosphatase
  • beta -galactosidase glucoamylase
  • the label can be conjugated directly or indirectly to the antibody using a variety of known techniques.
  • the antibody can be conjugated to biotin and any of the labels in the three broad categories mentioned above can be conjugated to avidin, or vice versa. Biotin selectively binds to avidin, and thus this label can be conjugated to the antibody in this indirect manner.
  • the antibody may be conjugated to a small hapten (e. G., Digoxin) and one of the different types of labels mentioned above may be conjugated to the anti- (E. G., An anti-diphosine antibody).
  • a small hapten e. G., Digoxin
  • one of the different types of labels mentioned above may be conjugated to the anti- (E. G., An anti-diphosine antibody).
  • &quot contact ing &quot
  • contact is used in its ordinary sense, meaning that two or more materials are coalesced, bonded, or brought into contact with each other.
  • the contact can be carried out in vitro or another container and can also be performed in situ, in vivo, intracisternally, intracisternally, or intracellularly.
  • step ((3)) of detecting the antibody or the fragment thereof according to the present invention is carried out in the sample after the step (2).
  • the 'detection' refers to an antibody according to the present invention formed in the sample, or a complex of the fragment and an antigen thereof, and is used to detect the presence or absence of the peptide of human c-Met (or a protein containing the same) (Including both qualitative and quantitative measurements). Therefore, it may further include a step of removing extra antibodies or fragments thereof that did not form a complex with the human-derived c-Met protein well before the detecting step (3) to be described later after the step (2).
  • the antibody or fragment thereof used in the step (2) includes a detectable moiety such as a fluorescent moiety, a radioactive isotope, an enzyme, or the like, the moiety can be detected by a method known in the art The detection can be performed.
  • radioactivity can be measured, for example, by scintillation counting, and fluorescence can be quantified using a fluorimeter.
  • the secondary antibody labeled with fluorescence, radioactivity, or enzyme as known in the art may be used It can be detected indirectly.
  • the secondary antibody binds to an antibody according to the present invention or a fragment thereof (primary antibody).
  • HGF is overexpressed in lesions of these degenerative diseases and has a protective activity before the physiological defense period of tissue injury (Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery 7: 504-516, 2008).
  • the hyperactivity of HGF / c_Met signal transduction is associated with malignant tumorigenesis and angiogenesis of various cells of the endothelial lineage.
  • c-Met antibodies targeting c-Met can be used as anticancer agents (Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7: 504-516, 2008).
  • the c-Met antibody having one branch has a negative regulation of activation by c-Met dimerization of HGF, effectively inhibiting tumor growth in a transplanted mouse model (Jin et al, Cancer Research 68 (11): 4360-4368, 2008; Comoglio et al., Nature Review Drug Discovery. 7: 504-516, 2008).
  • T-cell gene manipulation that selectively recognizes cancer cell surface antigens has been used for tumor targeting for the connection of T cells to antigens that are over-expressed in cancer cells (Sadelain, The Cancer Journal 15 ): 451-455, 2009).
  • the present invention provides a method for detecting a protein comprising the steps of: a) contacting a sample obtained from an individual with the antibody; b) separating the complex formed by binding the antibody to the sample from the non-complexed portion; And c) obtaining a complex isolated in step b).
  • the method of detecting a circulating tumor cell (CTC) comprises the steps of:
  • step a) is characterized by bringing the above-mentioned antibody into contact with the sample obtained from the subject.
  • the term " subject " in the present invention means an animal to be diagnosed with cancer, and preferably it may be an animal including a mammal, particularly a human, more preferably a patient requiring treatment (pat ient) Lt; / RTI >
  • the 'sample' of the present invention may be selected from the group consisting of tissue, blood, serum, plasma, saliva, mucosal solution and urine, Blood, serum, plasma.
  • the antibody may be selected from the group consisting of beads, magnetic beads, and magnet materials.
  • the antibody binds to the sample to separate the complex from the non-complexed portion.
  • the 'complex' refers to a complex formed by specifically binding cells and antibodies having c_Met on the surface thereof.
  • the complex has a higher overall density than cells in a sample having the same or similar density as the target cell . More preferably by specifically binding to c-Met on purified tumor cells (CTC).
  • step c) is characterized in that the complex isolated in step b) is obtained.
  • a sample containing a complex formed in step is magnetic properties can separate the complex using, and wherein the said separation, the method automatically or manually using Only the complex can be extracted and used variously according to the purpose of the experimenter.
  • the 'Circulating Tumor Cell (CTC)' of the present invention is a malignant tumor patient and a tumor cell found in peripheral blood. It has been shown that the epithelial cells can be transferred to the epithelium through mesenchymal transitions (EMT), which is a change in the cell structure that can be transferred from the origin of the tumor cells to the blood vessels or lymphatic vessels, (Inflammatory or scarred surface) and digest between endothelial cells. At this time, the mesenchymal to epithelial transitions (MET) process is performed again.
  • EMT mesenchymal transitions
  • MET mesenchymal to epithelial transitions
  • the EMT process is known to be involved in the metastasis of malignant tumors, as the cells lose their epithelial cell phenotype and convert to a mesenchymal cell phenotype with high mobility. Circulating cancer cells are also involved in the EMT process and are transferred to new tumors and become cancerous in other tissues. However, it is difficult to detect circulating cancer cells because they exist in trace amounts in blood (1 to 10 cells per billion cells). Therefore, in order to detect circulating cancer cells in the blood of a patient, it is essential that advanced separation technology based on accuracy and quick separation technique be ensured. Such a circulating cancer cell separation technique is not limited to cancer treatment before metastasis, And is useful for diagnosis.
  • a method for detecting circulating cancer cells in the blood a method of separating using a cell-specific antibody (antibody-based), a method using a size-based method, a method using a charge (electrical charge-based method) Virus-based separation method and a separation method using microfluidics.
  • the inventors of the present invention confirmed that the c-Met protein is present in the tumor cell membrane, and thus the c-Met antibody of the present invention Were used to detect circulating cancer cells. .
  • the present invention provides a composition for detecting circulating tumor cells (CTC) comprising the antibody or fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for detecting circulating tumor cells (CTC) comprising the above antibody or fragment thereof.
  • the present invention also provides a composition for detecting circulating cancer cells (CTC) consisting essentially of the above antibody or a fragment thereof.
  • the antibody of the present invention may be provided in a labeled state and may be provided in combination with a detectable label to facilitate identification, detection, and quantification of the binding of the antibody of the present invention to circulating cancer cells (CTC).
  • detectable labels include, but are not limited to, magnetic materials (e.g., magnetic metal, thick metal oxide), chromogenic enzymes (e.g., peroxidase, alkaline phosphatase), radioisotopes, chromophore, Or fluorescent substances such as FITC, RITC, Green Fluorescent Protein (EGFP), Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), Red Fluorescent Protein (RFP), DsRed (Di scosoma sp. Red fluorescent protein) Fluorescent Protein), CGFP (Cyan Green Fluorescent Protein), YFP (Yel low Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 and Cy7.5).
  • magnetic materials e.g., magnetic metal, thick metal oxide
  • chromogenic enzymes e.g.
  • the present invention provides a kit for detecting a circulating cancer cell (CTC) comprising the antibody or fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a kit for detecting circulating cancer cells (CTC) comprising the antibody or a fragment thereof.
  • the present invention also relates to the above-mentioned antibody or fragment thereof,
  • a kit for detecting circulating cancer cells is provided.
  • the 'kit' of the present invention includes an antibody that specifically binds to c-Met protein and a magnetic bead that can bind to the antibody, and can detect circulating cancer cells (CTC) in blood through antigen-antibody binding reaction . More preferably, a complex due to antigen-antibody binding can be formed and detected by an electromagnetic induction method or a centrifugal separation method. Further, a filtration process using a filter can be further performed if necessary.
  • human scFv library screening is performed using human recombinant c-Met antibodies to obtain samples with increased output, followed by ELISA The binding force was confirmed by the method, and the samples showing the binding signal were selected and sequenced. Then, the hits having double different sequences were selected, and the binding force was confirmed by an ELISA method to select 10 hits that were most strongly binding, and converted to human IgG form (see Example 1, Figs. 1 and 2).
  • the patient's blood was placed in a test tube, reacted with a c-Met antibody (B10) and a magnetic bead complex, and then separated by a magnetic column. As a result, And it was confirmed that circulating cancer cells in the blood can be detected with the c-Met antibody (see Example 3).
  • the present invention provides anti-c-Met antibodies and uses thereof.
  • the method of the present invention can be usefully used to detect c-Met antibodies and to detect circulating cancer cells in blood using antibodies.
  • FIG. 1A and FIG. 1B show phage display (a) using human c-Met recombinant protein as an antigen and screen (b) screened by ELISA.
  • FIG. 2 shows the result of checking whether or not the selected heat is coupled according to the result of ELISA.
  • FIG. 3 shows the result of SDS-PAGE to confirm the heavy and light chain sizes of purified antibodies.
  • FIGS. 5A and 5B are graphs showing the results of (a) confirming the binding ability of 10 c-Met antibodies by flow cytometry using A549 cells and (f low cytometry) using A549 and SKBR-3 cells, (B) shows the result of confirming the binding force of c_Met antibody (A8, All, BIO, C8).
  • FIGS. 5A and 5B show the binding potency of c-Met antibody (B10) by FACS analysis using SNU5 cells, CAPAN2 cells, PC3 cells, A549 cells and MCF7 cells.
  • A549 cell line and MDA-MB231 cell line were purchased from ATCC (American Type Culture Collection, USA).
  • H596 cells and SKBR-3 cells were purchased from Klean Cell Line Bank (KCLB).
  • Adipose-derived mesenchymal cells were obtained from Xcel l Therapeutics (Seoul, Korea).
  • the medium for mesenchymal cell culture was purchased from Xcel l Therapeutics.
  • the antigen used for selection was a human c-Met recombinant protein containing 1-932 amino acids (aa) of the receptor, purchased from Sinobiologica K, China.
  • anti-c-Met antibody purchased from Abeam (USA) was used.
  • Phage Display Human recombinant c-Met protein was used as an antigen, and the human scFv library was used for screening of hits binding to the extracellular domain of c-Met.
  • the antigens were coated onto an immunoglobulin (Nunc, USA) at a concentration of 10 / zg / ⁇ and incubated at 0 / N for binding. Immunoblot and phage were blocked with blocking buffer (3% mi lk in PBST). The phage were immobilized in an immune fluid coated with an antigen and washed 1 hour with PBST and once with PBS.
  • the phages were eluted in lOOmM TEA for 7 to 8 minutes and then neutralized with a solution of Tris-HCKpH 8).
  • the eluted phages were infected with E. coli, and some of them were cultured in a solid LA plate at 0 / N to confirm the output titer.
  • the remaining phages were rescued using a helper phage and the same experiment was repeated three times.
  • Periplasmic extracts were obtained in lysed cells and inhibited anti-trophitis for 1 h using 6% skim milk on new plates. The solution was then added to the antigen-coated plate and the wells were incubated for 1 hour at room temperature and then washed three times with TBST.
  • the anti-HA Hrp secondary antibody was then added, incubated for 1 hour, and washed three times with TBST. Then, 30 ⁇ l of ⁇ was treated to initiate antagonism, followed by inhibition of antagonism using IN 3 ⁇ 4 SO 4 and detection at 450 nm.
  • sequence of the selected hits was analyzed by ELISA screening (Cosmogenetech, Korea). After sequencing and ELISA screening, the selected final hits were converted to human IgG. It was converted to scFv sequence to human light and heavy chain sequences were fused to p0pt iVEC TM -T0P0 and pcDNA TM 3.3-T0P0 (Theniiof isher , USA) vector by cloning. The plasmid was then amplified using the midi prep (Macherey Nagel, Germany).
  • the amplified plasmid was transiently expressed using the Freestyle Expression System (Invitrogen, USA). Freestyle cells were thawed and cultured in a Freestyle Expression Medium in an Erlenmeyer flask (Corning, USA). The cells were cultured until the cells reached a concentration of 3.0 ⁇ 10 6 cel / ml, and subcultured every 2 to 3 days. After 4 subcultures, the cells were treated with FreeStyle TM MAX Transfat ion reagent (Invitrogen, USA) Plasmid was transfected. Then> C0 2 (and the cells were incubated on a shaker in 37 ° C conditions.
  • Flow cytometric analysis was performed using A549, MDA-MP231, H596 and SKBR-3 cells.
  • Cells were detached with cell dissociation buffer (Hyclone, USA), washed with PBS, and then resuspended in 2.0 ⁇ 10 5 cells.
  • Commercial anti-c-Met antibodies were used as controls.
  • the cells were then washed twice and reacted with a secondary antibody conjugated with FITC for 40 minutes. After washing three times, they were analyzed using FACS BD Calibur (BD, USA).
  • H596 cells were cultured in RPMI (Wellgene) containing 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin (Hyclone). Cells were cultured in 6-well plates in order to observe whether the antibodies could induce phosphorylation signals. The cells were then cultured in RPMI medium without FBS overnight to remove signal interference by FBS. The next day, the medium was removed and the solution containing antibody or HGF at different concentrations was treated for 1 hour.
  • Example 1 Screening and Identification of scFv Binding to c-Met
  • a human recombinant c-Met antibody containing only the extracellular domain (aa, 1-932) was used as an antigen
  • screening of human scFv library was carried out according to the method described above. The antigen was bound to an immunotube and 4 cycles were repeated.
  • Example 2 Determination of natural c-Met binding in the form of human IgG.
  • the following experiment was conducted. First, 293F cells were transfected with the plasmid according to the above experimental method and cultured for 7 days. The cells were then harvested and the antibodies purified using Protein A beads and subjected to SDS-PAGE. As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the 10 hits most strongly binding in Example 1 were converted into human IgG form and expressed in cells, and the sizes of light and heavy chains were confirmed.
  • Example 3 Separation of Circulating Cancer Cells Using c-Met Antibody The antibody B10 specifically binding to c-Met prepared in the above example was used to separate only circulating cancer cells (CTC) in the blood.
  • CTC circulating cancer cells
  • the following experiment was conducted as follows. First, the patient's normal blood 4 obtained in compliance with the criteria of the clinical trial screening committee was put into a test tube, and 100 breast cancer cell lines MCF-7 cells were spiked. Then, the cells were specifically bound to c- B10 antibody was added thereto, followed by standing for 1 hour. Separation was then performed on a magnetic column. As a result, it was confirmed that circulating cancer cells bound with antibodies specifically binding to c-Met were attached to the magnetic column. As a result, it was confirmed that circulating cancer cells in the blood can be detected using c-Met antibody (data not shown).
  • Example 4 Confirmation of Binding Ability of c-Met Antibody An experiment for confirming the binding force of antibody c8 specifically binding to c-Met prepared in the above Example was performed as follows.
  • the cancer cell lines SNU5, CAPAN2, PC3, A549 and MCF7 were cultured and f low cytometry (FACS) was performed according to the above experimental method.
  • Control group c-Met antibodies that are currently available on the market (eBiosci ence) and secondary antibody (2 nd control) was used.
  • eBiosci ence c-Met antibodies that are currently available on the market
  • secondary antibody (2 nd control) was used.
  • the secondary antibody did not specifically bind to c-Met.
  • the B10 antibody of the present invention was found to be similar to the expression pattern of the conventional c-Met antibody (eBioscience) as a control group, and the binding shift was more active than the control group. As a result, it can be predicted that the B10 antibody of the present invention has a stronger binding force than the c-Met antibody in the locus, so that cancer cells can be more effectively detected.
  • the method of the present invention can be effectively used for detecting a c-Met antibody and detecting circulating cancer cells in blood by using an antibody.

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Abstract

본 발명은 항 c-Met 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편, 이의 생산방법, 이를 이용한 c-Met 특이적 검출 방법, 이를 이용한 순환암세포 (Circulating Tumor Cell, CTC) 검출 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 순환암세포 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 c-Met 항체를 검출하고, 항체를 이용하여 혈액 내의 순환암세포를 검출하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】 항 c-Met 항체 및 이의 용도
【기술분야】 본 출원은 2017년' 9월 29일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2017- 0128286호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 찰고문헌이다.
본 발명은 항 c-Met 항체 및 이의 용도에 관한 것으로， 보다 상세하게는 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편， 이의 생산방법, 이를 이용한 c-Met 특이적 검출 방법， 이를 이용한 순환암세포 (Ci rcul at ing Tumor Cel l , CTC) 검출 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 순환암세포 검출용 키트에 관한 것이다.
[배경기술] c-Met는 세포 표면에 존재하는 대표적인 RTK(Receptor Tyrosine Kinase)로써， 그 리간드인 HGF/SF(Hepatocyte Growth Factor/Scatter ing Factor)와 결합하여 세포 내 신호전달을 촉진시켜 세포의 성장을 촉진할 뿐 아니라 많은 종류의 암세포에 과 발현되어 암 발생， 암 전이， 암세포 이동， 암세포 침투， 신생 혈관 형성에도 광범위하게 관여한다. 또한 리간드의 이름이 의미하듯， HGF/SF를 통한 c-Met signal ing은 거의 모든 종류의 epi thel ial tumor의 cel l-cel l contact를 약화시켜 scat ter ing을 야기하는 대표적인 암 전이 초기단계의 단백질이다 (Nat Rev Cancer . 2012 Jan 24； 12(2) : 89-103) . 특히， c— Met 유전자의 upstream에는 hypoxiaresponse element들이 존재하여， 산소결핍 상황에서 그 유전자의 발현이 증가함은 잘 알려져 있다 (Oral Oncol . 2006 Jul ; 42(6)： 593-8) . 또한， c-Met는 개시로부터 진행을 통해 전이까지 암 발생의 여러 단계에 기여하기 때문에 , c-Met 및 그의 리간드 HGF는 표적화 암 요법을 위한 선도적인 후보가 되어 왔다 ( [Comogl io et al . 2008. Nat Rev Drug Di scov 7： 504]； [Knudsen and Vande Woude 2008. Curr Opin Genet Dev 18 :87] ) . 특히 c-Met는 기존에 알려진 항암제의 작용 기작에서 약물 내성에 관여됨이 알려지면서 더욱 더 개인맞춤형 치료에 중요성이 인식되고 있으며, c-Met는 항암제와 관련하여 다수의 제약사들이 주목하고 있는 표적 분자가 되고 있다.
한편， 순환암세포 (Ci rculat ing Tumor Cel l s , CTCs)는 일차 종양 (Pr imary tumor cel l s)으로부터 분리되어 혈액을 따라 신체를 순환하는 암세포로， 암이 다른 장기로 전이되는데 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있다. 암의 재발을 예측할 수 있는 치료 예후인자로써 활용이 가능하고, 치료제를 투여하면서 동시에 효능 및 평가를 모니터링 할 수 있는 유용한 수단이며， 임상작으로는 진단이 어려운 미세암전이 (Mi crometastasi s)의 확인이 가능한 유용한 바이오마커로써 활용이 가능하다. 순환암세포에서 DNA 및 단백질을 추출하여 , 다양한 Downstream Analysi s Technique를 활용하여 분석이 가능하기에， 보다 폭넓은 분석 Data를 확보할 수 있다. 하지만， 순환암세포는 혈액에 극미량으로 존재 (혈구 세포 10억개 당 1~10개)하기 때문에， 환자의 혈액에서 순환암세포를 검출하기 위해서는 정확성과 빠른 분리 기술을토대로 한 첨단 분리기술이 필수적으로 확보되어야 한다. 따라서， c-Met에 보다 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합할 수 있고， 인간 유래 서열로 이루어져 체내 투여 시 면역반웅 유발 가능성이 낮으며, 보다 다양한 활성을 나타내는 c-Met 항체에 대한 개발이 요구되며, 환자의 체내에 존재하는 혈중 종양 세포를 검출할 수 있는 높은 민감성을 나타내는 진단 방법에 대한 개발이 요구된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】 이에， 본 발명자들은 c-Met을 표적으로 하면서도 다양한 생리활성을 나타내는 '항체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과， c-Met을 표적으로 하도록， c- Met에 특이적으로 결합하는 인간으로부터 유래된 상보성 결정영역 (CDR)과 프레임 워크 영역 (FR)으로 구성된 인간항체가 HGF와 유사한 활성을 나타내며， 이러한 c-Met 항체가 혈액 내에서 순환암세포와 결합하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화 폴리뉴클레오티드, 백터 및 백터로 형질 전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간 c-Met에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법 및 c-Met 특이적 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 이용한 순환암세포 (Circulat ing Tumor Cel l , CTC) 검출 방법， 검출용 조성물 및 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 순환암세포 (Circulat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 제제를 제조하기 위한 상기 항체 또는 그 단편의 용도를 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L1 , 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역 (VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) HI , 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역 (VH)을 포함하는 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 백터로 전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 c-Met에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 c-Met 특이적 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 a) 개체로부터 수득한 시료와 상기의 항체를 접촉시키는 단계; b) 상기 시료에 상기의 항체가 결합하여 형성된 복합체 (complex)를 복합체가 형성되지 않은 .부분과 분리시키는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 분리한 복합체를 수득하는 단계를 포함하는 순환암세포 (Ci rculat ing Tumor Cel l , CTC) 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적올' 달성하기 위하여 , 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 순환암세포 (Ci rculat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 조성물올 제공한다. 또한 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 구성되는 순환암세포 (Ci rculat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 순환암세포( !" 113^ Tumor Cel l , CTC) 검출용 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 순환암세포 (Circulat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 구성되는 순환암세포 (Circulat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 순환암세포 (Circulat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 순환암세포 (Circulat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 제제를 제조하기 위한 상기 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다.
본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호. 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L1 , 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역 (VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) HI , 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역 (VH)을 포함하는 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다.
본 발명의 '항체' ， '항 c-Met 항체' ， '인간화 항 c— Met 항체' 및 '변형 인간화 항 c-Met 항체' ， 'ant i -c-Met ant ibody' 는 본 발명에서 가장 광의의 의미로 사용되며， 구체적으로 단일클론 항체 (모노클로날 항체， 완전 길이 단일클론항체 포함) , 다클론 항체 (폴리클로날 항체) , 다중특이 항체 (예를 들어 이중특이 항체)， 및 항체 단편 (예를 들어. 가변 영역 및 목적하는 생물 활성 (예를 들어 c-Met와의 결합)을 나타내는 항체의 다른부분)을 포함한다.
본 발명의 항체는 c-Met와 선택적으로 결합할 수 있도록 특정 아미노산 서열이 경쇄 및 중쇄 CDR에 포함되어 있는 항체로 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하며， 바람직하게는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 키메라 항체， 인간화된 항체， 인간항체를 모두 포함하며 바람직하게는 인간항체 일 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며， 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 에피토프에 매우 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 '모노클로날' 이라는 말은 항체가 실질적인 상동성 집단으로부터 수득되는 것과 항체의 특성을 나타내는 말이며， 반드시 항체를 특정 방법에 의해 생산해야 한다는 것은 아니다 .예를 들어， 본 발명의 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al . (1975) Nature 256： 495) )에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나， 또는 재조합 DNA 방법 (참조: 미국 특허 제 4, 816 , 567호)에 의해 제조할 수 있다. 또한， 예를 들어， 문헌 (참조: Clackson et al . ( 1991) Nature 352： 624-628 및 Marks et al . (1991) J . Mol . Biol . 222： 581- 597 및 Presta (2005) J . Al lergy Cl in. I隱 unol . 116 :731)에 기술된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 항체는 구체적으로 키메라 항체를 포함하며， 이 경우 중쇄 및 /또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 기원하거나 또는 특정 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 보이지만， 나머지 부분은 본 발명의 항체가 바람직한 생물학적 활성 (예를 들어 NRS와의 선택적 결합)을 나타내는 한, 다른 종으로부터 기원하거나 또는 다른 항체의 상웅하는 서열과 동일하거나 상동성을 나타내는 것이어도 무방하다 (미국 특허 제 4, 816 , 567호; 및 Morr i son et al . , (1984) Proc . Nat l . Acad. Sci . USA 81： 6851-6855) .
인간화된 항체는 인간 및 비 -인간 (예: 쥐， 랫트) 항체의 서열올 모두 포함하는 항체로 일반적으로， 에피토프와 결합하는 부위 (CDR)를 제외한 나머지 부분은 인간 항체의 것이며， 에피토프와 결합하는 부위 (CDR)는 비 -인간 유래의 서열을 포함할 수 있다. 완전한 인간항체는 사람 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 말하며, 마우스， 마우스 세포， 또는 마우스 세포로부터 기원한 하이브리도마에서 생산하거나, 파지 디스플레이 방법으로 생산할 수 있다.
생체에서 생산되는 천연 항체는 통상적으로， 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150 , 000 달톤의 이종-사량체성 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄와 연결되지만， 디설파이드 연쇄수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄들 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 또한 갖고 있다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)에 이어 수많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는데; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제 1 불변 도메인과 정렬되고， 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특별한 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 간에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. 항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인' '은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 -말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 영역은 "VH"로 기재하며, 경쇄의 가변 영역은 "VL"로 기재한다. 이들 도쩨인은 일반적으로， 항체의 가장 가변 부분이고， 항원 결합부위를 포함한다.
본 발명에서 '초가변성 (hypervar iable) ' 은 상기 가변 영역 내의 몇몇 서열들이 항체들간 서열에 있어서 광범위하게 상이하며 그의 특이적인 항원 결정인자들에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 직접적으로 관련되는 잔기들을 포함한다는 사실을 지칭한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두에 있어서 초가변성은 상보성 결정부위 (CDR) 또는 초가변성 루프 (HVL)로서 공지된 3 개의 분절들에 집중된다. CDR은 문헌 (Kabat 등， 1991， In: Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Publ i c Heal th Service , Nat ional Inst i tutes of Heal th, Bethesda, MDJ에서의 서열 비교에 의해 한정되는 반면， HVL은 문헌 (Chothia and Le나 1987， J. Mol. Biol. 196:901-917)에 개시된 바와 같0 상기 가변 영역의 3 차원 구조에 따라 구조적으로 한정된다.
상기 중쇄 및 경쇄 각각 내의 3 개의 CDR들은 를 부위 (FR)에 의해 분리되며， 상기 부위는 덜 가변적인 경향이 있는 서열들을 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지， 상기 FR 및 CDR은 하기의 순서로 배열된다: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 상기 FR의 큰 시트 배치는 상기각각의ᅳ쇄 내부의 CDR을 서로뿐만 아니라 다른 쇄로부터의 CDR에 가깝게 한다. 생성되는 형태는 항원 결합 부위에 기여하지만 (Kabat 등， 1991， NIH Publ . No. 91- 3242, Vol. I, pages 647-669 참조)， 모든 CDR 잔기들이 항원 결합에 직접 관여할 필요는 없다.
본 발명에서 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab' ' F(ab)2, F(ab' )2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 단편인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 항체의 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며， 바람직하게 상기 단편은 모항체의 인간 유래 c-Met 단백질 친화도의 적어도 20%， 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100¾> 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab' , F(ab')2, Fv, 디아바디 (diabody) , scFv 등의 형태일 수 있다.
Fab( fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로， 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 블변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로， 두 개의 Fab가 중쇄 경첩 (hinge)에서 이황결합 (disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. FV variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv( single chain variable fragment)는 중쇄가변영역 (VH)과 경쇄가변영역 (VU이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디 (diabody)는 scFV의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고， 동일한 형태의 다른 scFV의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다. 본 발명의 목적상 항체의 단편은 인간 유래 c— Met 단백질에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않지만, 바람직하게 scFv일 수 있다. 본 발명에 따른 scFv는 상기한 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적인 CDR 구성， 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 것으로서 VH의 C-말단과 VL의 N-말단이 링커를 통해 연결된 것이라면 그 서열이 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커는 당 업계에 scFV에 적용되는 링커로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환 (항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다.
또한 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소， 형광 물질， 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나， 이에 한정되지는 않는다. 또한， 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동블， 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는， 상기 항체는 인간, 생쥐， 당나귀， 양, 토끼， 염소, 기니피그， 낙타， 말. 또는 닭의 항체일 수 있으며， 가장 바람직하게는 인간또는 생쥐일 수 있다.
인간 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체로서， 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 형질 이식되고 내재적 면역글로불린은 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체가포함된다 (미국특허 제 5 , 939 , 598호 참조) .
본 발명의 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나， 이에 한정되지 않는다. 또한， 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. ' 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를
본 발명에서 '폴리뉴클레오티드' 는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며， DNA분자들 (예를 들어， cDNA 또는 유전체 (genomic DNA) , RNA 분자들 (예를 들어， mRNA) , 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA또는 RNA의 유사체들 (예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비 -자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일- 가닥 (single-stranded) 또는 이증 -가닥 (doubles tranded)이 될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기한 KRS N-말단 영역에 특이적인 CDR 구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체를 암호화하는 염기서열을 의미한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이면 그 서열이 특별히 제한되지 아니하는 것으로서， 앞서 설명한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 CDR 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 1(증쇄 CDR1) , 서열번호 2(중쇄 CDR2) , 서열번호 3(중쇄 CDR3) , 서열번호 4(경쇄 CDR1) , 서열번호 5(경쇄 CDR2) , 서열번호 6경쇄 CDR3)으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 VH와 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당 업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여， 당 분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법， 예를 들어 중합효소 연쇄 반웅 (PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공한다. 본 발명의 '백터 (vector)' 는 본 발명의 항체 또는 그 단편의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며， 일반적으로 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자， 인핸서 요소， 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 백터는 바람직하게는 발현백터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시뭔스, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터일 수 있다.
백터의 일종인 플라스미드 (plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 백터의 다른 형태는 바이러스성 백터 (viral vector ; 예를 들어， 복제 -결핍 레트로바이러스 (repl icat ion defect ive retroviruses) , 아데노바이러스들 및 아데노 -연관 바이러스들 (adeno associated viruses))이며， 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러스성 게놈 (viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 백터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포 (예를 들어, 박테리아 유래 (bacter ial origin) 및 에피좀의 포유류 백터 (episomal mammal ian vectors)를 포함하는 박테리아성 백터들 (bacterial vectors) ) 내에서의 자가복제 (autonomous repl icat ion)를 할 수 있다. 다른 백터들 (예를 들어， 비-에피좀의 포유동물 백터들 (non-epi somal mammal ian vectors) )이 숙주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈 내로 통합 ( integrated)되고 그리고 그에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.
본 발명에서 '발현백터 (expression vector)' 는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현할 수 있는 백터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는 조절 시뭔스가 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현 (예를 들어， 수준， 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우， 상기 조절 시퀀스 (regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결"된다. 상기 조절 시퀀스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현 (예를 들어， 수준， 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시뭔스는， 예를 들어, 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들 (예를 들어, 상기 조절 시퀀스 및 /또는 상기 핵산에 결합하는 폴리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도톡 할 수 있다. 상기 조절 시뭔스에는 프로모터 (promoters) , 인핸서 (enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 발명의 백터는 바람직하게는 pOptiVECTM-TOPO 및 pcDNATM3.3-T0P0일
본 발명은 상기 백터로 형질 전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 세포는 본 발명의 발현 백터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 발현 백터로 형질 전환된 세포 (숙주세포)는 원핵생물 (예를 들어， 대장균)， 진핵생물 (예를 들어， 효모 또는 다른 균류)， 식물 세포 (예를 들어， 담배 또는 토마토 식물 세포)， 동물 세포 (예를 들어， 인간 세포， 원숭이 세포, 햄스터 (hamster) 세포， 랫 세포 (rat cell), 마우스 세포 (mouse cell)ᅳ 곤층 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체， 예흩 들어 엔테로박테리아새 (^ ero^c/^ /aceae), 예를 들어 에스케리치아 0 c/?er/c/?/ )， 예를 들어 이. 콜라이， 엔테로박터 에르위니아 (£πτ/7/<3), 클랩시엘라 7ebs/e//a), 프로테우스 (/ /s)， 살모넬라 (5 /»o/2e//a)， 예를 들어， 살모넬라 티피무륨 (Sa//7¾¾7e//s typhimuriuni) , 세라티아 C¾ ra /a) , 예를 들어， 세라티아 마르세스칸스 (5e/ra /a marcescans) 및 시겔라 (5 / ， 및 바실리 C¾cv7//), 예를 들어， 비. 섭틸리스 09. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 ( . 1 i chen i form is) , 슈도모나스 (/¾«/cte /?as)， 예를 들어 피. 애루기노사 ( aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Sire iOTyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 백터를 발현가능 한 것이면， 특별히 제한되지 아니하나， 바람직하게는 이. 콜라이일 수 있다.
본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에 (5sc ?arOTyces cerevisiae)7} 가장 흔히 사용된다. 그러나， 많은 다른 속， 종 및 균주， 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베
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pombe) 클루이베로마이세스 숙주， 예를 들어 케이. 락티스 ( /ac /s), 케이. 프라길리스 (X fragilis)(NTCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (J. buJgaricus)(MCC 16,045), 케이. 위커라미 (£. wickerawii){ T , 24,178), 케이 . 왈티 (£. waltii){ T£ 56,500), 케이 드로소필라룸 Of. drosoph J arm) (MCC 36,906), 케이. 테르모를레란스 ( . thermotolerans) 및 케이 . 마르시아누스 Of. marxianus)； 야로위아 /7 r/ )(EP 402,226)； 피키아 파스토리스 pas tor is) ( ? 183,070)； 칸디다 ； 트리코데르마 레에시아 (7 ¾¾fe »a reesiaiW 244,234))； 뉴로스포라
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( Schwann iowyces) , 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occ/flfe7 a//s); 및 필라멘트성 진균， 예를 들어 뉴로스포라， 페니실리움 (/ /?/ 7// )， 를리포클라디움 (7b/j? c/ai//iffl7) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주， 예를 들어 에이. 니둘란스 및 에이. 니거 04. niger^7\사용가능 하다.
상기 용어 '형질전환 (transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나통합되지 않고 유지될 수 있는데， 본 발명은 양자 모두 포함한다.
본 발명에 따른 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 백터는 당 업계에 공지된 방법， 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염 (transient transfection) , 미세주사, 형질도입 (transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법， 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE dextran- mediated transfection) , 폴리브렌一매개된 형질감염 (polybrene一 mediated transfection), 전기천공법 (electroporation) , 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 첵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질 전환할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 백터로 형질전환되거나 또는 형질감염 (transfected)될 수 있는 배양된 세포이고，■ 이는 계속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세포는 발현되어야 할 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한다. 본 발명의 세포는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하나， 조절 시뭔스가 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되도톡 상기 세포 내로 도입되지 않는 한 이를 원하는 수준으로 발현하지 않는 세포가 될 수 있다.
본 발명의 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄 (Ham's) F10(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640(Si ma-Aldrich Co.), 및 둘베코 (Dulbecco's) 개질 이글 (Eagle's) 배지 (DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양하기에 적합하다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및 /또는 다른 성장 인자， 염， 완충액， 뉴클레오티드， 항생제， 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.
본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여， 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 c-Met에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며， 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. 상기 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며， 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다ᅳ 이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다. 상기 배양은 상기 세포의 종류에 따라 배지조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며， 이는 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나， 세포로부터 분비되거나， 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지 (supernatant)로 표적화 (targeted)될 수 '있으며， 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩 (refolding)시키고 기능적 형태 (conformat ion)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 폴리펩타이드의 특성 및 세포의 특성에 따라 달라질 수 있으며， 이는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 세포내， 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 만약 폴리펩타이드가 세포 내에서 생산되면， 이 세포는 제 1 단계로서 단백질을 방출하기 위하여 파괴될 수 있다. 입자형 파편， 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우， 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터， 예를 들어 Amicon 또는 Mi l l ipore Pel l icon 한외여과 유닛올 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제， 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다. 세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드톡시아파타이트 크로마토그래피， 겔 전기영동， 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고， 본 발명의 항체는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다.
본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 c-Met 특이적 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 검출 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편올 시료와 접촉시키기 전에, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 이용하여 KRS (또는 세포 외막으로 노출된 KRS N-말단 펩타이드)의 유무와 농도를 측정하기 위한 시료를 준비하는 단계 ( (1) 단계)를 포함할수 있다. 통상의 기술자는 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 공지의 방법을 적절하게 선택하고， 선택된 방법에 적합하게 시료를 준비할 수 있다. 또한 시료는 암 또는 암전이 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 생검 등으로 얻어진 세포나 조직， 혈액， 전혈， 혈청， 혈장， 타액， 뇌척수액 등일 수도 있다. 상기 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 방법이란 여기 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 웨스턴 블랏, 면역 블랏, 닷 블랏, 면역조직화학염색 ( immunohi stochemi stry) , 효소면역분석 (ELISA) , 방사능면역검정법 (radioimmunoassay) , 경쟁적 결합 분석， 면역침전 등이 있다. 예를 들어 웨스턴 블랏을 실시하기 위하여서는 시료 또는 세포의 용해물에 전기영동에 적합한 버퍼를 첨가하여 끓이는 등의 방법으로 준비할 수 있으며， 면역조직화학염색을 위해서는 세포나 조직의 절편을 고정하고 블락킹 (blocking)하는 등의 전처리를 할 수 있다.
다음으로 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 전술한 단계에서 준비한 시료와 접촉시키는 단계 ( (2) 단계)를 수행한다. 본 발명에 따른 항체는 앞서 서술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 가지며 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편으로서， 그 구체적 종류와서열 구성에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 항체 또는 그 단편은 이의 '검출 '을 위하여， 일반적으로 검출가능 모이어티 (moiety)로 표지될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Current Protocol s in Immunology, Volumes 1 and 2 , 1991， Co 1 i gen 등, Ed. Wi leyᅳ Interscience , New York, N . Y . , Pubs]에 기술된 기술을 이용하여， 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 또는 다양한 효소 -기질 표지가 이용가능하며， 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 제 4， 737， 456호)와 같은 루시퍼라제， 루시페린 ( luci fer in) , 2，3_다이하이드로프탈라진디오네스， 말레이트 디하이드로게나제, 유라제 (urase) , 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP0)와 같은 퍼옥시다제， 알칼라인 포스파타제， β -갈락토시다제， 글루코아밀라제， 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스옥시다제， 갈락토스 옥시다제， 및 글루코스 -6- 포스페이트 디하이드로게나제)， 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제)， 락토퍼옥시다제， 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 예를 들어, 문헌 [0 ' Sul l ivan 등, 1981， Methods for the Preparat ion of Enzyme一항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J . Langone & H . Van Vunaki s , eds . ) , Academi c press , N. Y.， 73： 147-166]에 기술되어 있다. 표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어， 항체는 바이오틴 (biot in)에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과， 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘 (avidin)에 선택적으로 결합하고， 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는， 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여， 항체는 작은 합텐 (hapten) (예를 들어， 딕옥신 [digoxin] )과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항 -합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대, 항-딕옥신 항체) . 따라서, 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.
본 발명에서 '접촉 (contact ing)' 이라 함은 이의 일반적인 의미로 사용되는 것으로서， 2개 이상의 물질을 흔합， 결합， 또는 서로 맞닿게 하는 것을 의미한다. 상기 접촉은 시험관 내 ( in vi tro) 또는 다른 컨테이너 (container) 상에서 수행될 수 있고， 또한 인 시투 ( in si tu) , 생체 내, 개체 내， 조직 내， 세포 내에서 수행 될 수 있다.
다음으로는 상기 (2) 단계 수행 후의 시료에서 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계 ( (3) 단계)를 수행한다.
상기 '검출' 은 시료 내에서 형성된 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편과 항원의 복합체를 대상으로 하는 것으로서， 인간 c-Met의 펩타이드 (또는 이를 포함하는 단백질)의 존재 유무의 감지 또는 상기 펩타이드의 수준을 측정 (정성적 또는 정량적 측정을 모두 포함)하는 것을 의미한다. 따라서 상기 (2) 단계 수행 후 후술하는 검출 단계 ( (3) 단계) 전에， 인간 유래 c-Met 단백잘과 복합체를 형성하지 않은 여분의 항체 또는 그 단편들을 제거하는 단계가 추가로 포함될 수 있다. 전술한 (2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 형광， 방사성 동위원소， 효소 등으로 직접 표지되는 등의 검출가능한 모이어티를 포함하는 경우에는 해당 모이어티를 검출하는 당 업계에 공지된 방법에 따라 검출을 수행할 수 있다. 일례로 방사능은， 예를 들어， 신틸레이션 계수 (scint i l lat ion count ing)에 의해 측정될 수 있으며， 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다. 또한 전술한 (2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 자체로서 전술한 검출 모이어티를 포함하지 않는 경우에는, 당업계에 알려진 바와 같이 형광, 방사능， 효소 등으로 표지된 2차 항체를 이용하여 간접적으로 감지할 수 있다. 상기 2차 항체는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편 ( 1차 항체)에 결합한다. 최근 연구를 통해, HGF/SF는 또한 신경계에도 작용을 하며 특히 운동신경세포 보호 기능에 대한 많은 연구들이 보고되어 있다 (Novak et al .， Journal of Neuroscience. 20 :326-337, 2000). 또한 심장 손상 회복 (Nakamura et al. , J Clin Invest . 106:1511-1519， 2000)등의 일반적인 장기 손상이후의 방어적 생리학적 기작에도 중요한 기능을 담당하고 있음이 제안되었고 실제로 HGF/MET 경로가 신경 경색， 진행성 신장염， 간경화와 폐섬유증의 과정에 관계하며 HGF가 이러한 퇴행성 질병의 병변에 과발현되어 조직손상의 생리학적 방어기전으로 보호활성을 나타냄이 입증되었다 (Comoglio et al . , Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008) . 또한, HGF/c_Met 신호전달의 과다활성이 내피계열의 다양한 세포의 악성종양화와 혈관형성에 관련되고， 이러한 관점에서 c-Met을 표적으로 하는 길항성 c-Met 항체가 항암제로서의 사용될 수 있을 것이라는 가능성이 제시되었다 (Comoglio et al. , Nature Review Drug Discovery. 7:504-516, 2008) . 예를 들어， 하나의 가지를 갖는 c-Met항체가 HGF의 c-Met 이량체화에 의한 활성화를 음성적으로 조절하여 이식 마우스 모델에서 효율적으로 종양 성장을 억제함이 보고된 바 있다 (Jin et al, Cancer Research 68(11)： 4360-4368, 2008; Comoglio et al. , Nature Review Drug Discovery. 7:504-516， 2008). 또한 T_세포 치료법에서 암세포 표면항원을 선택적으로 인식하는 T-세포 유전자조작에도 암세포에 과발현되는 항원에 대한 항체가 T 세포의 연결을 위한 종양 표적화에 활용되고 있다 (Sadelain, The Cancer Journal 15(6) :451-455， 2009).
본 발명은 a) 개체로부터 수득한 시료와상기의 항체를 접촉시키는 단계; b) 상기 시료에 상기의 항체가 결합하여 형성된 복합체 (complex)를 복합체가 형성되지 않은 부분과 분리시키는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 분리한 복합체를 수득하는 단계를 포함하는 순환암세포 (Circulating Tumor Cell, CTC) 검출 방법을 제공한다.
본 발명에서 a)단계는 개체로부터 수득한 시료와 상기의 항체를 접촉시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 용어 '개체 (subject ) ' 란 암 진단 대상이 되는 동물을 의미하는 것으로， 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 보다 바람직하게는 치료가 필요한 환자 (pat ient )일 수 있다.
본 발명의 '시료' 는 암이 의심되는 개체로부터 분리 수득되는 것으로서， 이에 제한되지는 않으나， 조직， 혈액， 혈청, 혈장， 타액， 점막액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 혈액， 혈청， 혈장일 수 있다.
본 발명에서 '상기의 항체' 는 비드， 마그네틱 비드 (magnet i c beads) 및 자성물질 (magnet ic material )로 이루어진 군에서 선택된 것이 부착된 것을 특징으로 한다. 항체에 결합하는 자성물질은 이에 제한되지는 않으나， 자성금속 또는 자성금속 산화물을 포함하는 물질일 수 있으며 , 바람직하게는 Co , Mn, Fe , Ni， Gd, 醒' 204 및 Mx0y(M 또는 M ' =Co , Fe , Ni , Mn, Zn, Gd 또는 Cr , x와 y는 정수를 나타낸다)일 수 있다.
본 발명에서 b)단계는 상기 시료에 상기의 항체가 결합하여 복합체 (complex)를 복합체가 형성되지 않은 부분과 분리시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 '복합체 (complex)' 는 표면에 c_Met가 있는 세포와 항체가 특이적으로 결합하여 생성되는 것으로， 표적 세포와 동일하거나 유사한 밀도를 갖는 시료 내의 세포들에 비해 전체적인 밀도가 증가하는 것올 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 순화종양세포 (CTC) 상의 c-Met에 특이적으로 결합하여 생성될 수 있다.
본 발명에서 c)단계는 상기 b) 단계에서 분리한 복합체를 수득하는 것을 특징으로 한다.
상기 b) 단계에서 형성된 복합체를 포함하는 시료는 자기적 성질을 이용하여 복합체를 분리할 수 있으며， 상기 분리 ,방법을 이용하여 자동 또는 수동으로 상기 복합체만을 추출하여 실험자의 목적에 따라 다양하게 사용될 수 있다.
본 발명의 '순환암세포 (Circulating Tumor Cell, CTC)' 는 악성 종양 환자와 말초혈액에서 발견되는 종양세포이다. 기원된 종양세포에서 떨어져 나와 종양세포가 전이될 수 있는 세포 구조 변화인 상피중간엽 전환 (Epithelial to Mesenchymal Transitions: EMT) 과정을 거쳐 혈류나 생체 유동에 의해 혈관이나 림프관을 돌아다니다가 특이한 관의 벽 (염증이 있거나 상처가 발생한 표면)에 부딪혀 내피 세포 사이를 파고든다. 이 때 다시 중간엽상피 전환 (Mesenchymal to Epithelial Transitions: MET) 과정을 거친다. EMT 과정은 세포가 상피 (epithelial)성 세포 표현형을 상실하고 이동성이 높은 중간엽 (mesenchymal )성 세포 표현형으로 전환하는 과정으로 악성 종양의 전이에 관여한다고 알려져 있다. 순환암세포는 EMT과정과도 관련이 있으며， 새로운 종양으로 전이되어서 다른 조직에서 암으로 자리 잡게 된다. 하지만， 순환암세포는 혈액에 극미량으로 존재 (혈구 세포 10억개 당 1~10개)하기 때문에 검출하기가 어렵다. 따라서， 환자의 혈액에서 순환암세포를 검출하기 위해서는 정확성과 빠른 분리 기술을 토대로 한 첨단 분리기술이 필수적으로 확보되어야 하며， 이러한 순환암세포 분리기술은 전이 발생 이전의 암치료뿐만 아니라 암환자의 임상적 관리와 진단에 있어서 유용하다.
혈액 내에서 순환암세포를 검출하기 위한 방법으로써， 세포의 특정 표지자 (antibody-based)를 이용한 분리법， 세포의 크기 (Size— based)를 이용한 분리법， 전하 (Electrical Charge— based)를 이용한 분리법, 바이러스 (Virus-based)를 이용한 분리법， 미세유체학 (Microfluidics)을 이용한 분리법 등이 있는데， 본 발명자들은 종양세포 세포막에 c-Met 단백질이 존재하는 것을 확인함을 바탕으로 하여， 본 발명의 c-Met 항체를 이용한 항원 -항체 결합반응 방법으로 순환암세포를 검출하였다. .
본 발명은 상기의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 순환암세포 (Circulating Tumor Cell, CTC) 검출용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기의 항체 또는 그 단편으로 구성되는 순환암세포 (Circulating Tumor Cell, CTC) 검출용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기의 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 순환암세포 (Circulat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 항체의 순환암세포 (CTC) 결합 여부 확인， 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여 본 발명의 항체는 표지된 상태로 제공될 수 있으며， 검출가능한 표지에 결합되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 이에 제한되지는 않으나， 자성물질 (예: 자성금속， 자겅금속 산화물) , 발색효소 (예： 퍼옥시다제， 알칼라인 포스파타제)， 방사성 동위원소， 크로모포어 (chromophore) , 발광물질 또는 형광물질 (예: FITC, RITC, 형광 단백질 (GFP(Green Fluorescent Protein)； EGFP( Enhanced Green Fluorescent Protein) , RFP(Red Fluorescent Protein)； DsRed(Di scosoma sp . red f luorescent protein)； CFP(Cyan Fluorescent Protein) , CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein) , YFP(Yel low Fluorescent Protein) , Cy3 , Cy5 및 Cy7.5)일 수 있다.
본 발명은 상기의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 순환암세포 (Ci rculat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 상기의 항체 또는 그 단편으로 구성되는 순환암세포 (Circulat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 상기의 항체 또는 그 단편으로 필수적으로
순환암세포 (Circulat ing Tumor Cel l , CTC) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 '키트' 는 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체와 결합할 수 있는 마그네틱 비드를 포함하고， 항원 -항체 결합반웅을 통하여 혈액 내의 순환암세포 (CTC)를 검출할 수 있다. 보다 바람직하게는 항원 -항체 결합으로 인한 복합체를 형성시켜 전자기 유도법 또는 원심분리법으로 검출할 수 있으며, 필요에 따라 필터를 이용한 여과 과정을 추가로 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 인간 재조합 c-Met 항체를 사용하여 인간 scFv 라이브러리 스크리닝을 실시하여 출력이 증가하는 샘플을 획득한 다음， ELISA 방법을 통해 결합력을 확인하여 결합신호를 나타내는 샘플을 선별하여 염기서열 분석을 실시하였다. 그 다음, 이중 상이한 서열을 갖는 hit를 선택하여 ELISA 방법으로 결합력을 확인하여 가장 강력하게 결합하는 10개 hit를 선별하여 인간 IgG 형태로 전환하였다 (실시예 1, 도 1 및 도 2 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서 인간 IgG가 천연 c-Met에 결합하는 것을 확인하기 위하여， 293F 세포에 플라스미드로 형질감염 시킨 후， 세포를 수득하여 단백질 A 비드로 항체를 정제하여 SDS-PAGE를 실시한 결과, 상기의 10개 hit가 인간 IgG 형태로 변환되어 세포에서 발현되는 것을 확인하였으며, 경쇄 및 중쇄의 크기를 확인할 수 있었다. 그 다음 c-Met 양성 세포를 이용하여 유동세포분석을 실시한 결과， 항체의 결합 패턴 (binding pattern)이 세포에서 나타나는 가장 높은 변화와 c-Met의 발현 수준이 일치하는 4가지 항체를 선별하였다 (실시예 2, 도 3 및 4 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서 환자의 혈액을 시험관에 넣고, c-Met 항체 (B10)와 마그네틱 비드 복합체를 넣어 반응시킨 뒤， 마그네틱 컬럼 (magnetic column)으로 분리한 결과， c-Met 항체가 순환암세포에 결합하는 것을 확인하였고， 이를 통해， c-Met 항체로 혈액 내 순환암세포를 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 순환암세포 (Circulating Tumor Cell, CTC) 검출용 제제를 제조하기 위한 상기 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 용어 '-을 포함하는 (comprising)' 이란 '함유하는' 또는 '특징으로 하는' 과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서， 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 '〜로 구성되는 (consisting of)' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소， 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 '필수적으로 구성되는 (essentially consisting of)' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것올 의미한다.
【발명의 효과】 따라서， 본 발명은 항 c-Met 항체 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 방법은 c-Met 항체를 검출하고, 항체를 이용하여 혈액 내의 순환암세포를 검출하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】 도 la 및 도 lb는 인간 c-Met 재조합 단백질을 항원으로 이용한 파지 디스플레이 (a) 및 ELISA에 의한 스크리닝한 결과 (b)를 나타낸 것이다. 도 2는 ELISA 결과에 따라 선택된 히트의 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 3은 정제한 항체의 중쇄 및 경쇄 크기를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 실시한 결과를 나타낸 것이다. 도 4a 및 도 4b는 A549 세포를 아용하여 유세포 분석 (f low cytometry)으로 10가지 c-Met 항체의 결합력을 확인한 결과 (a) 및 A549 및 SKBR-3 세포를 이용하여 유세포 분석 (f low cytometry)으로 c_Met 항체 (A8, All , BIO, C8)의 결합력을 확인한 결과 (b)를 나타낸 것이다. 도 5a 및 도 5b는 SNU5 세포, CAPAN2 세포， PC3 세포， A549 세포 및 MCF7 세포를 이용하여, FACS 분석 방법으로 c-Met 항체 (B10)의 결합력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
【발명의 실시를 위한 형태】 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 실험방법
1.ᅵ시약
A549 세포주， MDA-MB231 세포주는 ATCC(Amer ican Type Cul ture Col lect ion, USA)에서 구입하였고， H596 세포, SKBR-3 세포는 한국세포주은행 (Krean Cel l Line Bank, KCLB)에서 구입하였다. 지방 유래 중간엽 줄기세포 (adipose der ived mesenchymal cel l )는 Xcel l Therapeut ics (서울)에서 제공하였다. 또한 중간엽 즐기세포 배양을 위한 배양 배지는 Xcel l Therapeut ics에서 구입하였다. 선별에 사용된 항원은 수용체의 1-932 아미노산 (amino acid, aa)을 포함하는 인간 c-Met 재조합 단백질이며， SinobiologicaK중국)에서 구입하였다. 또한 대조군으로는 Abeam (미국)에서 구입한 항 -c-Met 항체를 사용하였다.
2. 파지 디스플레이 인간 재조합 c-Met 단백질을 항원으로 사용하였고， 인간 scFv 라이브러리는 c-Met 세포외 영역에 결합하는 히트 (hi ts) 스크리닝에 사용하였다. 항원을 농도 10/zg/^의 면역 류브 (Nunc , USA)에 코팅하고 0/N로 배양하여 결합시켰다. 면역튜브와 파지를 블로킹 버퍼 (3% mi lk in PBST)로 활성을 억제하였다. '파지를 항원이 코팅된 면역류브에 넣고 결합시켰으며， 1시간 후 PBST로 4번， PBS로 1번 세척하였다. 파지를 7~8분 동안 lOOmM TEA에 용출시킨 다음 Tr i s-HCKpH 8) 용액으로 중화시켰다. 용출된 파지를 대장균에 감염시켰고, 일부는 고형 LA 플레이트에서 0/N으로 배양하여 출력 역가 (output t i ter)를 확인하였다. 남은 파지는 헬퍼 파지 (helper phage)를 사용하여 구제하였고, 동일한 실험을 3번 반복하였다.
3. ELISA스크리닝
4번째 패닝 후， 단일 콜로니를 각각 96웰 플레이트에서 암피실린을 포함하는 SB 150μ1에 주입하였다. 그 다음 배지가 뿌옇게 될 때까지 37°C 진탕배양기에서 배양하였다. 배양 후， 배양액을 원판에 넣고 InM IPTG로 유도한 후 30°C에서 밤새 배양하였다. c-Met 재조합 단백질올 항원으로 사용하였고， ELISA 플레이트 (corning 3690)에 lug/ml 농도로 PBS에 녹여 코팅하였고 4°C에서 밤새 배양하였다. 그 다음 날， 클론이 주입된 플레이트를 15분 동안 3000 rpm에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하고， 펠렛을 37°C에서 IX TES 버퍼에서 5~7분 동안 재현탁시킨 다음 0.2X TES 버퍼를 첨가하여 4°C에서 30분동안 반응시켜 세포를 용해시켰다. 항원 코팅된 플레이트를 150μ1의 TBST로 3회 세척하고， 3% 스킴 밀크를 사용하며 반웅을 억제하였다. 페리플라스믹 (periplasmic) 추출물을 용해된 세포에서 수득하였고， 새 플레이트에서 6% 스킴 밀크를 이용하여 1시간 동안 반웅을 억제하였다. 그 다음 용액을 항원 코팅된 플레이트에 첨가하였고， 실온에서 1시간 동안 항은 배양한 뒤 TBST를 이용하여 3회 세척하였다. 그 다음 ant i-HA Hrp 2차 항체를 첨가하여 1시간 동안 배양한 뒤 TBST로 3회 세척하였다. 그 다음 30μ1의 ΤΜΒ를 처리하여 반웅을 시작한 다음， IN ¾S04를 사용하여 반웅을 억제하였으며， 450nm에서 검출하였다.
4. 염기서열 분석 및 IgG전환 상기 ELISA 스크리닝에서 선별된 hits의 서열을 분석하였다 (Cosmogenetech, Korea) . 서열분석 및 ELISA 스크리닝 후에 선별된 최종 hi ts를 인간 IgG로 변환시켰다. scFv 서열을 인간 경쇄 및 중쇄 서열로 전환하였고, 클로닝에 의한 p0pt iVEC™-T0P0 및 pcDNATM3.3-T0P0(Theniiof isher , USA) 백터에 융화시켰다. 그 다음 midi prep(Macherey Nagel , Germany)을사용하여 플라스미드를 증폭시켰다.
5. 과발현 및 항체 정제 증폭된 플라스미드를 Freestyle Expression System( Invitrogen, USA)을 이용하여 일시적으로 발현하였다. 삼각 플라스크 (Corning, USA)에서 프리스타일 발현 배지 (Freestyle Expression Medium)에서 프리스타일 세포 (Freestyle cel l )을 해동시켰고， 배양하였다. 세포가 3.0 X 106 cel ls/ml 농도가 될 때까지 배양하여 2~3일 마다 계대배양하였으며， 4번의 계대배양 후， FreeStyle™ MAX Trans feet ion 시약 ( Invitrogen, USA)를 사용하여 중쇄 및 경쇄 플라스미드를 형질감염시켰다. 그 다음 > C02 ( 37 °C 조건의 진탕기에서 세포를 배양하였다. 형질 감염 후 7일 째에 세포를 수득하였고， 상층액을 취득하여 여과하였다. 여과 후, 크로마토그래피 칼럼 (Bio-rad, USA)에서 상층액을 MabSelect SuRe protein A beads (GE healthcare. USA)에 적용하였다. 그 다음 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 (coomassie blue) 염색으로 크기를 확인하였다. 6. 유세포 분석
A549, MDA-MP231, H596 및 SKBR-3 세포를 이용하여 유세포 분석 (flow cytometric analysis)을 실시하였다. 세포들은 세포 해리 버퍼 (cell dissociation buffer, Hyclone, USA)로 세포를 떼어낸 뒤, PBS를 세척한 다음, 2.0X105 개의 세포로 분리하여 류브에 넣었다. 항체를 lyg/tube의 농도가 되도록 2% FBS가 함유된 DBPS(Well.gene)용액으로 희석하여， 세포에 첨가하였고, 1시간 동안 반웅시켰다. 대조군으로는 상업용 항 -c-Met 항체를 사용하였다. 그 다음 세포를 2번 세척하고, FITC가 결합된 2차 항체로 40분 동안 반응시켰다. 3회 세척한 후， FACS BD Calibur(BD, USA)를 사용하여 분석하였다.
7. 세포 배양 및 항체 치료
H596 세포를 10% FBS와 1% 페니실린 /스트렙토마이신 (Hyclone)을 포함하고 있는 RPMI(Wellgene)를 사용하여 배양하였다. 항체가 인산화 신호를 유도할 수 있는지 관찰하기 위하여， 6웰 플레이트에 세포를 배양하였다. 그 다음 FBS에 의한 신호의 간섭을 제거하기 위해， 하룻밤 동안 FBS가 포함되지 않은 RPMI 배지에서 배양하였다. 다음날， 배지를 제거하고， 항체 또는 HGF를 다른 농도로 함유된 용액을 1시간 동안 처리하였다.
8. 웨스턴 블랏 상기와 같이 세포를 배양한 다음， RIPA(Biosesang), 단백질 분해 효소 억제제 (protease inhibitor, Roche) 및 인산화 효소 억제제 (phosphatase inhibitor, Roche)를 함유하고 있는 용해 버퍼를 이용하여 세포를 수득하였고， 1ml 주사기를 이용하여 세포를 용해시켰다. 용해 후， 세포를 15분 동안 14000rpm으로 원심분리하였다. 그 다음 상층액을 수득하였고， BCA 분석 (Thermofisher) 방법올 통해 단백질을 정량하였다. 상층액을 5x 샘플 로딩 버퍼와 흔합한 다음 10분 동안 열을 가했다. 그 다음 SDS-PAGE를 실시한 다음， 활성화된 PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인 (Bk)-rad)에 단백질올 트랜스퍼 (transfer) 하였다. 5> BSA로 멤브레인의 활성을 억제하였고， 1차 항체로 반웅시킨 다음， Hrp가 결합된 2차 항체로 반웅시켰다. 그 다음 암실에서 ECL(Amersham)을사용하여 확인하였다. 실시예 1: c-Met에 결합하는 scFv의 스크리닝 및 동정 c-Met에 결합하는 항체를 확인하기 위하여， 항원으로서 세포외 도메인 (aa, 1-932)만 함유하는 인간 재조합 c-Met 항체를 사용하여， 상기에 기재된 방법에 따라 인간 scFv 라이브러리 스크리닝을 실시하였다. 항원을 면역류브 ( immunotube)에 결합시키고 4사이클을 반복하였다. 그 결과 도 la에서 나타난 바와 같이， 3번째와 4번째 싸이클에서 출력 (output )이 증가하는 것으로 나타났고， 3번째와 4번째 사이클에서 획득한 샘플은 ELISA 방법을 통해 결합력을 확인하였으며， 그 결과를 도 lb에 나타냈다. 또한， 대조군 플레이트와 비교하여 신호를 나타내는 것을 선택한 뒤, 염기서열을 분석 (sequencing)하였고， 이 중 상이한 서열을 갖는 31개 후보 (hit )들을 선택하였고, 다시 ELISA를 실시하여 결합력을 확인한 다음 가장 강력하게 결합하는 10개의 후보 (hit )를 선택하였다. 각 후보는 ELISA 결과를 토대로 A8, A9 , All , B8 , BIO, C8, C9, D7, D12, E10으로 명명하였다. 그 다음 상기 10개의 hit를 인간 IgG 형태로 전환하였다 (도 2) .
실시예 2: 인간 IgG형태의 천연 c-Met 결합 여부 확인 . 상기 실시예 1에서 제조한 인간 IgG가 천연 c-Met에 결합하는 것을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 먼저 상기 실험 방법에 따라 293F 세포에 플라스미드로 형질감염시켜 7일 동안 배양하였다. 그 다음 세포를 수득하여 단백질 A 비드를 사용하여 항체를 정제하였고, SDS-PAGE를 실시하였다. 그 결과 도 3에서 보이는 바와 같이， 상기 실시예 1에서 가장 강력하게 결합하는 10개의 hit가 인간 IgG 형태로 변환되어 세포에서 발현되는 것을 확인하였으며， 경쇄 및 중쇄의 크기를 확인할 수 있었다.
IgG가 전환된 것을 확인한 다음， CCLE의 정보를 기초로 하여 c-Met에 대해 양성인 세포를 선택하여, 상기 실험 방법에 따라 유동세포분석 (f low cytometry)을 실시하였다. 그 결과 도 4a에서 보이는 바와 같이， 항체의 결합 패턴 (binding pattern)은 A549 세포에서 나타나는 가장 높은 변화와 c-Met의 발현 수준이 일치하는 것으로 나타났으며， 이중 가장 비슷하게 나타난 4가지 항체를 선별하여 다른 세포주를 이용하여 동일한 실험을 실시하였다. 이 때 SKBR-3 세포주는 음성 대조군으로 사용하였다. 그 결과 도 4b에서 보이는 바와 같이, 4가지 항체 (A8 , All , BIO , C8)의 결합 패턴은 c-Met 발현 수준과 관계가 있는 것으로 나타났으며， c-Met 음성 세포주인 SKBR-3 세포주에서는 결합 이동이 잘 보이지 않는 것으로 나타났다. 이 중 B10은 A549 및 SKBR-3 세포주에서 대조군인 Ant i-c-Met 항체의 발현 패턴이 유사한 것을 확인하였고， 다른 항체들에 비해 신호가 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해， 4가지 항체는 c-Met 수용체에 대하여 특이성이 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3 : c-Met 항체를 이용한 순환암세포 분리 방법 상기 실시예에서 제조한 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체 B10이 혈액 내에서 순환암세포 (ci rcul at ing tumor cel l s , CTC)만을 분리하기 위한 실험을 다음과 같이 실시하였다. 먼저 임상 시험 심사 위원회 규정을 준수해서 얻은 환자의 정상 혈액 4 를 시험관에 넣고， 유방암 세포주 MCF-7 세포 100개를 스파이크 ( spiking)한 다음, 마그네틱 비드와 결합된， c-Met에 특이적으로 결합하는 항체인 B10을 첨가한 후 1시간 동안 방치하였다. 그 다음， 마그네틱 컬럼으로 분리를 수행하였다. 그 결과 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 순환암세포는 마그네틱 컬럼에 붙어 있음을 확인하였다. 이를 통해, c-Met 항체를 이용하여 혈액 내의 순환암세포를 검출할 수 있다는 것을확인할 수 있었다 (데이터 미도시) .
실시예 4 : c-Met 항체의 결합력 확인 상기 실시예에서 제조한 c-Met에 특이적으로 결합하는 항체ᅳ C8의 결합력을 확인하기 위한실험을 다음과 같이 실시하였다. 암 세포주인 SNU5 , CAPAN2 , PC3 , A549 , MCF7 세포주를 각각 배양하였고， 상기 실험 방법에 따라 유동세포분석 ( f low cytometry, FACS)을 실시하였다. 대조군으로는 현재 시중에서 판매되고 있는 c-Met 항체 (eBiosci ence)와 2차 항체 (2nd control )를 사용하였다. 그 결과 도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이， 2차 항체의 경우에는 c-Met에 특이적으로 결합하지 않는 것으로 나타났다. 또한， 본 발명의 B10 항체가 대조군인 기존의 c-Met 항체 (eBiosci ence)의 발현 패턴과 유사한 것으로 나타났으며， 대조군에 비해 결합 이동이 더 활발한 것으로 나타났다. 이를 통해， 본 발명의 B10 항체가 기촌의 c-Met 항체에 비하여 결합력이 높아， 보다유용하게 암세포를 검출할수 있다는 것을 예측할 수 있다.
【산업상 이용가능성】 이상 살펴본 바와 같이， 본 발명의 방법은 c-Met 항체를 검출하고, 항체 이용하여 혈액 내의 순환암세포를 검출하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L1 , 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열올 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역 (VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) HI , 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을
、 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역 (VH)을 포함하는 인간 유래 c-Met 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
【청구항 2】 제 1항에 있어서， 상기 단편은 디아바디， Fab, Fab' ， F(ab)2 , F(ab' )2， Fv 및 scFV로 이루어진 군에서 선택되는 단편인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
【청구항 3】 제 1항의 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 4】 제 3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터.
【청구항 5】 제 4항의 백터로 형질 전환된 세포.
【청구항 6] 제 5항의 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여， 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 c- Met에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법 .
【청구항 7] 제 1항의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 c-Met 특이적 검출 방법.
【청구항 8】 a) 개체로부터 수득한 시료와 제 1항의 항체를 접촉시키는 단계; b) 상기 시료에 계 1항의 항체가 결합하여 형성된 복합체 (complex)를 복합체가 형성되지 않은 부분과 분리시키는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 분리한 복합체를 수득하는 단계를 포함하는 순환암세포 (Circulating Tumor Cell, CTC) 검출 방법.
【청구항 9】 제 8항에 있어서, 상기 a) 단계의 시료는 조직， 혈액， 혈청， 혈장 점막액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
【청구항 10】 제 8항에 있어서, 상기 a) 단계의 항체는 추가적으로 비드， 마그네틱 비드 (magnetic beads) 및 자성물질 (magnetic material)로 이루어진 군에서 선택된 것이 부착된 것을 특징으로 하는 검출 방법.
【청구항 11】 제 10항에 있어서， 상기 자성물질은 Co, Mn, Fe, Ni , Gd, 麗' 204 및 Mx0y(M 또는 M'=Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr, x와 y는 정수를 나타낸다)로 이루어진 군에서 선택되는 것올 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
【청구항 12】 제 8항에 있어서， 상기 b) 단계의 복합체 (complex)는 시료 내에서 표면에 c_ Met가 있는 순환암세포와 항체가특이적으로 결합한 것을 특징으로 하는 검출 방법 .
【청구항 13】 제 1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 순환암세포 (Circulating Tumor Cell, CTC) 검출용 조성물.
【청구항 14] 제 1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 순환암세포 (Circulating Tumor Cell, CTC) 검출용 키트.
【청구항 15】 순환암세포 (Circulating Tumor Cell, CTC) 검출용 제제를 제조하기 위한 제 1항의 항체 또는 그 단편의 용도，
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