CN109890844B

CN109890844B - 抗ninj-1抗体及其用途

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Publication number: CN109890844B
Application number: CN201780066566.6A
Authority: CN
Inventors: 慎英基; 李世炯; 宋京; 李智慧
Original assignee: SNU R&DB Foundation; Abion Inc
Current assignee: SNU R&DB Foundation; Abion Inc
Priority date: 2016-08-26
Filing date: 2017-08-28
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2037-08-28
Also published as: KR20180023875A; JP7316592B2; KR102497298B1; JP7138883B2; JP2022036962A; EP3517547A1; JP2019533431A; US11286296B2; CN109890844A; US20190248878A1; EP3517547A4; WO2018038583A1

Abstract

本发明提供了：一种特异性结合人NINJ‑1的抗体；及其片段。根据本发明的抗体或其片段对人NINJ‑1或该蛋白质的同源结合位点具有非常高的结合亲和力和结合特异性，并且不表现出与源自其它生物并具有高蛋白质相似性的NINJ‑1蛋白的交叉反应性。因此，本发明不仅在诊断与NINJ‑1蛋白有关的疾病方面，而且在抑制涉及NINJ‑1蛋白的病理学状态方面提供了关于准确性和灵敏度等的显著优点。具体地，根据本发明提供的抗体具有抑制免疫细胞与人脑内皮细胞之间附着的显著作用，并且因此具有治疗多发性硬化的作用。

Description

抗NINJ-1抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种抗NINJ-1(Ninjurin-1)抗体及其用途。更具体地，本发明涉及一种结合人NINJ-1的抗体或其片段、其制备方法，以及包含其的组合物，用于预防或治疗多发性硬化或癌症。

背景技术

本申请要求于2016年8月26日提交的韩国专利申请号10-2016-0109557的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

Ninjurin-1(NINJ-1)于1996年由Toshiyuki Araki等人首次报道(Araki,T. 和Milbrandt,J.,Neuron 17,353-361,1996)。其在寻找一种基因的过程中被发现，该基因在由于坐骨神经远端部分的横切或挤压引起的损伤后在施旺细胞中表达增加。

据报道，系统发生树使用从GenBank已知的蛋白质信息发现与Ninjurin具有同源性的蛋白质。在脊椎动物中，分别已知两种Ninjurin蛋白，如Ninjurin1 (NINJ1)和Ninjurin-2(NINJ-2)。已在脊椎动物(如人、小鼠和大鼠)中发现了NINJA-1和NINJA-2。在无脊椎动物中，Ninjurin蛋白可以分为三种类型，如 A型、B型和C型，同时在果蝇和蚊子等中发现。人NINJ-1和小鼠NINJ-1蛋白彼此90％相同，而人NINJ-1和人NINJ-2 55％相同。

人NINJ-1位于染色体9q22中，并且由152个氨基酸构成。小鼠NINJ-1位于13号染色体中，并且由152个氨基酸构成。在NINJ-1的氨基酸序列中，怀疑可能存在两个跨膜结构域。通过实验还已知NINJ-1是位于细胞膜中的蛋白质 (Araki,T.和Milbrandt,J.,Neuron 17,353-361,1996)。该事实表明NINJ-1的N- 末端区域可以延伸出细胞。通过实验已知NINJ-1结合同源蛋白质，同时已知 NINJ-1表达率在炎性环境或多发性硬化动物模型中增加，并且主要参与癌症和免疫细胞的运动和跨内皮迁移。具体地，已知NINJ-1的细胞外部分中P26与N37之间的残基区域是同源结合的关键结构域，同时已报道了当针对该位置施用中和抗体或片段结合肽时的疾病缓解(Ifergan I等人,Ann Neurol. 70(5):751-763,2011；Ahn BJ等人,J Biol Chem.289(6):3328-3338,2014；Odoardi F.等人,Nature.488(7413):675-679,2012)。

NINJ-1在各种组织中表达。例如，据报道在RNA水平方面，其在心脏、大脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、血液、肾上腺和背根神经节(DRG)中表达，而在蛋白质相方面，其分别在肝脏、肾脏、胸腺、子宫、肾上腺、视网膜和DRG中表达。

此外，目前已知NINJ-1的功能与细胞粘附、神经突向外生长、细胞衰老和癌症有关(参见Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica.110(23),pp.9362-9367(2013.06.04.))。

然而，尽管人NINJ-1作为生物标志物很重要，但还没有能够以高灵敏度和准确度检测人NINJ-1的技术。具体地，人NINJ-1蛋白在蛋白质结构的许多方面与小鼠NINJ-1具有相似性，并且因此通过本领域已知的常规方法通过动物免疫反应获得的抗体具有一些问题，如其中发生与小鼠NINJ-1结合的交叉反应，并且在许多情况下未能产生针对人NINJ-1的高灵敏度抗体。

发明内容

技术问题

因此，本发明人已进行研究以开发一种特异性结合人NINJ-1蛋白或该蛋白质的同源结合位点的抗体。在研究期间，证实了本文公开的具有独特CDR序列结构的抗体及其片段特异性结合人NINJ-1蛋白而与其它NINJ-1蛋白(特别是小鼠NINJ-1蛋白)没有交叉反应性，从而完成了本发明。

因此，本发明的一个方面是提供一种特异性结合人源Ninjurin-1(NINJ-1) 蛋白的抗体或其片段。

本发明的另一个方面是提供一种编码该抗体或其片段的多核苷酸。

本发明的另一个方面是提供一种包含该多核苷酸的载体。

本发明的另一个方面是提供一种包含该载体的细胞。

本发明的另一个方面是提供一种用于使用该细胞制备特异性结合人NINJ-1 蛋白的抗体或其片段的方法。

本发明的另一个方面是提供一种特异性检测人NINJ-1的方法，该方法包括以下步骤：

使本发明的特异性结合人源NINJ-1蛋白的抗体或其片段与样品接触；并且

检测该抗体或其片段。

本发明的另一个方面是提供一种用于预防或治疗多发性硬化的药物组合物，该组合物包含本发明的特异性结合人源NINJ-1蛋白的抗体或其片段作为活性成分。

本发明的另一个方面是提供一种用于预防或治疗癌症并且用于抑制癌症转移的药物组合物，该组合物包含本发明的特异性结合人源NINJ-1蛋白的抗体或其片段作为活性成分。

技术方案

根据本发明一个方面的实施方式提供了一种特异性结合人源Ninjurin-1 (NINJ-1)蛋白的抗体或其片段。

根据本发明另一方面的实施方式提供了一种编码该抗体或其片段的多核苷酸。

根据本发明另一方面的实施方式提供了一种包含该多核苷酸的载体。

根据本发明另一方面的实施方式提供了一种包含该载体的细胞。

根据本发明另一方面的实施方式提供了一种用于制备特异性结合人NINJ-1 蛋白的抗体或其片段的方法，该方法包括以下步骤：在表达多核苷酸的条件下培养细胞，从而产生包含轻链可变区和重链可变区的多肽；并且从细胞或其中已培养有该细胞的培养基回收多肽。

根据本发明另一方面的实施方式提供了一种特异性检测人NINJ-1的方法，该方法包括以下步骤：使特异性结合人源NINJ-1蛋白的抗体或其片段与样品接触；并且检测该抗体或其片段。

根据本发明另一方面的实施方式提供了一种用于预防或治疗多发性硬化的药物组合物，该组合物包含本发明的特异性结合人源NINJ-1蛋白的抗体或其片段作为活性成分。

根据本发明另一方面的实施方式提供了一种用于预防或治疗癌症并且用于抑制癌症转移的药物组合物，该组合物包含本发明的特异性结合人源NINJ-1蛋白的抗体或其片段作为活性成分。

在下文中，将详细描述本发明。

本发明提供了一种特异性结合人源Ninjurin-1(NINJ-1)蛋白的抗体或其片段。

如本文所用，术语“抗体”也称为免疫球蛋白(Ig)，并且是通过选择性作用于抗原而参与生物免疫的蛋白质的通用术语。在自然界中发现的全抗体通常由两对轻链(LC)和重链(HC)构成，其是由几个结构域组成的多肽，或这些 HC/LC结构中的两对作为基本单元。存在构成哺乳动物抗体的五种类型的重链：希腊字母α、δ、ε、γ和μ。取决于重链的类型，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM分别构成不同类型的抗体。存在构成哺乳动物抗体的两种类型的轻链，由λ和κ表示。

根据氨基酸序列的可变性，抗体的重链和轻链在结构上分为可变区和恒定区。取决于抗体的类型，重链的恒定区由3个或4个重链恒定区(如CH1、CH2 和CH3(IgA、IgD和IgG抗体)和CH4(IgE和IgM抗体))构成，而轻链由一个恒定区CL构成。重链和轻链可变区分别由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的一个结构域构成。轻链和重链通过一个共价二硫键连接，其中每个可变区和恒定区并排排列，并且与轻链结合的两个分子的重链通过两个共价二硫键连接以形成完整抗体。全抗体通过重链和轻链的可变区特异性结合抗原。全抗体由两条重链和轻链对(HC/LC)构成，使得全抗体的一个分子具有通过两个可变区与两个相同抗原二价结合的单一特异性。

包含抗体与抗原结合的位点的可变区被细分为具有低序列可变性的框架区 (FR)和互补决定区(CDR)，其是具有高序列可变性的高变区。CDR-L1适当地定位于轻链可变区中的残基24-34处，CDR-L2适当地定位于残基50-56处，并且CDR-L3适当地定位于残基89-97处；并且CDR-H1适当地定位于重链可变区中的残基31-35处，CDR-H2适当地定位于残基50-65处，并且CDR-H3适当地定位于残基95-102处。三个CDR和四个FR的VH和VL分别以 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序排列在N-末端至C-末端的方向上。这是抗体可变区内具有最高序列可变性的CDR直接与抗原结合的位点，同时是抗体抗原特异性的最重要位点。

术语“Ninjurin-1(NINJ-1)”是一种细胞膜蛋白，并且如本文所用的人NINJ-1 意在包括天然和重组人NINJ-1两者。野生型人NINJ-1的蛋白质序列在本领域中称为NCBI(基因库)参考序列：NP_004139.2(SEQ ID NO:25)。作为编码上述蛋白质的多核苷酸序列，NCBI(基因库)参考序列：NM_004148.3(SEQ ID NO:26)是已知的，并且本领域技术人员可以相应地获得重组蛋白质。

本发明人开发了抗体及其片段，其特异性结合由SEQ ID NO:25所定义的人源NINJ-1蛋白质序列中的第26位至第37位氨基酸残基。通过这些抗体的独特可变区CDR序列结构，证实了它们特异性结合人NINJ-1蛋白的效果是显著的，而没有显示出与其它来源的NINJ-1蛋白(特别是小鼠NINJ-1蛋白)的任何交叉反应性。

具体地，本发明的抗体或其片段包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其包含如下的特定CDR序列：

该抗体或其片段包含抗体轻链可变区(VL)，其包含含有由SEQ ID NO:1 定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L1、含有由SEQ ID NO:2定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L2，和含有由SEQ ID NO:3定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L3；和

抗体重链可变区(VH)，其包含含有由SEQ ID NO:4定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、含有由SEQ ID NO:5定义的氨基酸序列的互补决定区 (CDR)H2，和含有由SEQID NO:6定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR) H3，

该抗体或其片段包含抗体轻链可变区(VL)，其包含含有由SEQ ID NO:7 定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L1、含有由SEQ ID NO:8定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L2，和含有由SEQ ID NO:9定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L3；和

抗体重链可变区(VH)，其包含含有由SEQ ID NO:10定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、含有由SEQ ID NO:11定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H2，和含有由SEQID NO:12定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR) H3，

该抗体或其片段包含抗体轻链可变区(VL)，其包含含有由SEQ ID NO:13 定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L1、含有由SEQ ID NO:14定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L2，和含有由SEQ ID NO:15定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L3；和

抗体重链可变区(VH)，其包含含有由SEQ ID NO:16定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、含有由SEQ ID NO:17定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H2，和含有由SEQID NO:18定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR) H3，

该抗体或其片段包含抗体轻链可变区(VL)，其包含含有由SEQ ID NO:19 定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L1、含有由SEQ ID NO:20定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L2，和含有由SEQ ID NO:21定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L3；和

抗体重链可变区(VH)，其包含含有由SEQ ID NO:22定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、含有由SEQ ID NO:23定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H2，和含有由SEQID NO:24定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR) H3。

根据本发明特异性结合人NINJ-1蛋白的抗体不受限制，只要其具有上述 CDR组合。具体地，它可以选自由IgG、IgA、IgM、IgE和IgD组成的组，并且优选是IgG抗体。

此外，它可以是衍生自一种B细胞的单克隆抗体或衍生自多种B细胞的多克隆抗体，但优选是单克隆抗体，其是在抗体的重链和轻链中具有基本上相同的氨基酸序列的一组抗体。如本文所用，术语“单克隆”是指抗体作为从基本上同源的群体获得的抗体的此类特征，并且不被解释为需要通过特定方法产生抗体。例如，如本文所用的单克隆抗体可以通过最初由Kohler等人(1975)Nature 256:495描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法(参见美国专利号 4,816,567)制备。这些单克隆抗体还可以使用例如Clackson等人(1991)Nature 352:624-628；Marks等人(1991)J MoI.Biol.222:581-597；和Presta(2005)J. Allergy Clin.Immunol.116:731中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。

本发明的抗体可以包括所有形式的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等，其包含上述特异性CDR构建体并且优选人抗体。

此外，如本文所用的抗体片段是指保留全抗体的抗原特异性结合能力的抗体片段，并且具体地包括双抗体Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab’)2、Fv和scFv。

片段抗原结合(Fab)是抗体的抗原结合片段，其分别由重链和轻链中的一个可变结构域和一个恒定结构域组成。F(ab')2是通过胃蛋白酶水解抗体产生的片段，其中两个Fab在重链铰链处通过二硫键连接。F(ab')是单体抗体片段，其中将重链铰链加入到通过还原F(ab')2片段的二硫键获得的Fab中。Fv(可变片段)是仅分别由重链和轻链的可变区组成的抗体片段。单链可变片段(scFv)是重组抗体片段，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过柔性肽接头连接。双抗体是其中scFv的VH和VL通过非常短的接头连接并且彼此不结合，同时结合相同类型的其它scFv的VL和VH以形成二聚体的片段。

本文的抗体或其片段可以使用本领域已知的方法产生，例如噬菌体展示方法或酵母细胞表面表达系统。scFv可以通过美国专利号4,946,778和5,258,498 中描述的方法制备，而WO 92/22324等中描述的方法可用于Fab、Fab'和F(ab') 2片段的重组产生。

本发明的抗体可以与酶、荧光材料、放射性材料和蛋白质缀合，但不限于此。用于将上述材料与抗体缀合的方法是本领域熟知的。

本发明提供了一种编码该抗体或其片段的多核苷酸。

如本文所用，术语“多核苷酸”可以描述为寡核苷酸或核酸，并且包括使用核苷酸类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、其DNA或RNA类似物，及其杂合体。该多核苷酸可以是单链或双链的。

对本发明的多核苷酸的序列没有特别限制，只要其编码本发明的抗体或其片段即可。编码根据本发明一个方面的抗体或其片段的多核苷酸可以通过本领域已知的方法获得。例如，可以基于对应于本发明的抗体全长序列的氨基酸序列，或重链和轻链的一部分(特别是包含重链可变区和轻链可变区的区域)来分析密码子，并且可以通过这些密码子分析构建mRNA或cDNA。此类多核苷酸可以通过本领域已知的寡核苷酸合成方法合成，例如聚合酶链式反应(PCR) 方法。

本发明还提供了一种包含该多核苷酸的载体。

这种载体是重组表达载体。如本文所用，术语“重组”与“遗传操作”相容，并且意指使用分子克隆技术(如转化、切割和连接基因)制备一种在天然状态下不存在的基因。

如本文所用，术语“表达”意指在细胞中产生蛋白质或核酸。

如本文所用，术语“重组表达载体”是指能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白或核酸(RNA)的载体，并且表示含有可操作地连接以表达多核苷酸(基因) 插入的必需调节元件的基因构建体。术语“可操作地连接”是指编码靶蛋白或RNA的核酸序列与其表达控制序列的功能性连接，以便发挥其一般功能。这意味着基因以这样的方式连接，使得它可以由表达控制序列表达。术语“表达控制序列”是指控制可操作地连接的多核苷酸序列在特定宿主细胞中表达的DNA序列。这种表达控制序列包括用于驱动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列、用于控制转录和翻译终止的序列、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化A信号和增强子等。因此，根据本发明的重组表达载体是指如此可操作地连接的基因构建体，使得编码如上所述具有能够特异性结合人NINJ-1蛋白的独特CDR构型的本发明抗体的多核苷酸在合适的宿主细胞中表达。

对本发明的重组表达载体没有特别限制，只要其是克隆领域中常规使用的载体即可，并且包括例如质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体和病毒载体，但不限于此。具体地，质粒包括源自大肠杆菌(Escherichia coli)的质粒(pBR322、pBR325、pUC118和pUC119、pET-22b(+))、源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 的质粒(pUB110和pTP5)和源自酵母的质粒(YEp13、YEp24和YCp50)等，而病毒可以是动物病毒(如逆转录病毒、腺病毒或牛痘病毒)、昆虫病毒(如杆状病毒)和pcDNA等。

作为一种载体的质粒意指外部多核苷酸片段可以与其结合的线性或环状双链DNA分子。其它形式的载体可以是病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，并且如本文所用，可以将另外的DNA片段引入病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中进行自主复制(例如细菌载体，包括细菌来源载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在其引入到宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。

编码本发明抗体或其片段的重链和轻链(特别是包含重链可变区和轻链可变区的片段)的多核苷酸可以包含在不同的重组表达载体中或在一种重组表达载体中。

同时，本发明提供了包含本发明的载体的细胞。也就是说，本发明提供了一种用重组表达载体转化的细胞，该重组表达载体包含编码根据本发明的抗体或其片段的多核苷酸。

如本文所用，对该细胞(宿主细胞)没有特别限制，只要其是可以用于表达编码本发明重组表达载体中包含的抗体或其片段的多核苷酸的细胞即可。用本发明的重组表达载体转化的细胞(宿主细胞)可以是原核生物(例如大肠杆菌)、真核生物(例如酵母或其它真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、昆虫细胞) 或由其衍生的杂交瘤。

适用于本发明目的的原核生物包括但不限于革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌(Escherichia)(例如大肠杆菌)、肠杆菌(Enterobacter)、欧文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))和志贺氏菌(Shigella)，以及杆菌(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))、假单胞菌(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)) 和链霉菌(Streptomyces)。对本发明的细胞没有特别限制，只要它们可以表达本发明的载体即可，但优选大肠杆菌，例如大肠杆菌ER2537、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)、大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)或能够表达LacZ的大肠杆菌，但不限于此，并且更优选大肠杆菌ER2537。

适用于本发明目的的真核生物包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K. fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、沃尔蒂克鲁维酵母(K.waltii) (ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母 (Yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070)；假丝酵母(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

同时，根据本发明的细胞可以是动物细胞，尤其是脊椎动物细胞。培养物 (组织培养物)中脊椎动物细胞的增殖已成为常规程序，并且其技术可以广泛使用。可用的哺乳动物宿主细胞的实例可以包括由SV40转化的猴肾CV1株系 (COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾株系(293细胞或被亚克隆以在悬浮培养物中生长的293细胞(Graham等人,1977,J GenVirol.36:59))、幼小仓鼠肾细胞 (BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,1980, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216；例如DG44)、小鼠塞尔托利细胞(sertoli cell) (TM4,Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CVl ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI细胞(Mather等人,1982,Annals NY.Acad.Sci.383:44-68)、MRC 5细胞、FS4细胞、人肝癌细胞系(Hep G2)、人胚肾细胞(HEK 293细胞)和Expi293F^TM细胞，但不限于此，并且可以优选CHO细胞、人胚肾细胞(HEK 293细胞)或Expi293F^TM细胞。

本发明中提供的细胞是可以用本发明的多核苷酸或含有其的载体转化或转染的培养细胞，并且随后，多核苷酸或载体可以在宿主细胞中表达。重组细胞是指用待表达的多核苷酸转化或转染的细胞。

用于培养细胞的培养基组成、培养条件、培养时间等可以根据本领域常用的方法适当地选择。可商购的培养基，如Ham's F1O(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis, MO)、最低必需培养基(MEM，Sigma-Aldrich Co.)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.)和Dulbecco's改良Eagle's培养基(DMEM，Sigma-Aldrich Co.)可以适用于细胞培养。如果需要，则培养基可以进一步含有激素和/或其它生长因子、盐、缓冲剂、核苷酸、抗生素、微量元素和葡萄糖或其等同的能量来源。

同时，本发明提供了一种用于制备特异性结合人NINJ-1蛋白的抗体或其片段的方法，该方法包括以下步骤：

在表达多核苷酸的条件下培养细胞，从而产生包含轻链可变区和重链可变区的多肽；并且

从细胞或其中已培养有该细胞的培养基回收多肽

上述制备方法中的细胞如上所述，其含有编码根据本发明的抗体或其片段的多核苷酸。如上所述，由于本发明的抗体或其片段具有用于抗原识别和结合的重要区域(CDR和含有其的可变区)的氨基酸序列，因此本发明的抗体可以由本领域技术人员容易和重复地大量生产。

根据本发明的一个方面的制备方法中的多肽本身可以是本发明的抗体或其片段，而除了本发明的抗体或其片段之外的其它氨基酸序列可以进一步添加到该多肽中。在这些情况下，可以通过使用本领域技术人员熟知的方法从本发明的抗体或其片段中除去另外添加的氨基酸。

培养基可以取决于细胞的类型在培养基组成和培养条件方面有所变化，而根据细胞表达多核苷酸的条件可以由本领域技术人员适当地选择和控制。可以结合本发明的细胞培养基参考上述实例。

抗体分子可以在细胞质中积累，从细胞分泌，或通过适当的信号序列靶向周质或细胞外培养基(上清液)。优选地，抗体分子靶向周质或细胞外培养基。此外，优选地，通过本领域技术人员熟知的方法使产生的抗体分子重折叠，使得抗体分子具有功能性构象。此外，在产生IgG型抗体的情况下，重链和轻链可以在分开的细胞中表达，同时通过在单独的步骤中使重链与轻链接触来制备完整抗体。重链和轻链可以在相同的细胞中表达，以在细胞内形成完整抗体。

多肽的集合可以根据产生的抗体或其片段的特征、细胞表达模式的特征以及靶向的存在等而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择和控制。例如，分泌到培养基中的抗体或其片段可以通过获得宿主细胞培养基获得，并通过如过滤(如超滤)或离心的方法回收抗体以除去杂质。如果需要，则为了释放和回收存在于细胞外特定细胞内细胞器或细胞质中的抗体，细胞可以不影响抗体或其片段的功能性结构的量溶解。此外，为了除去杂质，可以使获得的抗体进一步经受色谱法、通过过滤器等过滤、透析等，随后浓缩。为了抑制蛋白水解，可以在任何前面的步骤中包括蛋白酶抑制剂(如PMSF)，同时可以包括抗生素以防止意外污染物的生长。

可以通过使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法来纯化从细胞制备的抗体。

本发明的抗体或其片段特异性结合人NINJ-1，并且因此例如在用于检测和定量人NINJ-1蛋白在特定细胞、组织或血清中的存在(或表达)的诊断分析中是有用的。如本文所用，术语“分析”可以优选地意指“测量”。定性分析可以指测量和确认目标物质的存在与否。定量分析可以指测量和鉴定目标物质的量的存在水平(表达水平)或其变化。在本文中，可以在没有限制的情况下进行分析或测量，包括定性和定量方法两者。

因此，本发明提供了一种特异性检测人NINJ-1的方法，该方法包括以下步骤：

使抗体或其片段与样品接触；并且

检测该抗体或其片段。

为了“检测”抗体或其片段，抗体或其片段通常可以用可检测部分标记。

例如，抗体或其片段可以使用Current Protocols in Immunology,第1和2卷,1991，Coligen等人编辑Wiley-lnterscience,纽约,N.Y.,Pubs中描述的技术，用放射性同位素或荧光标记来标记。放射性可以通过例如闪烁计数来测量，而荧光可以使用荧光计来定量。

此外，可以使用各种酶-底物标记。示例性酶促标记包括萤光素酶(如果蝇萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456))、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。酶与抗体的缀合优选描述于O'Sullivan等人, 1981,Methods for the Preparation of Enzyme-antibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods in Enzyme(J.Langone和H.Van Vunakis编辑), Academic press,N.Y.,73:147-166)中。

可以使用各种已知技术使标记与抗体间接缀合。例如，抗体可以与生物素缀合，并且与上文引用的三类广泛类别有关的任何标记可以与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素可以选择性地与抗生物素蛋白结合，并且因此，该标记可以这种间接方式与抗体缀合。可替代地，为了实现标记与抗体的间接缀合，可以使抗体与小半抗原(例如地高辛)缀合，并且可以使上述不同类型标记中的一种与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)缀合，从而导致标记与抗体的间接缀合。

本发明的抗体或其片段可以通过任何已知的分析方法使用，如竞争性结合分析、直接和间接夹心分析和免疫沉淀分析。具体地，在本文中，用于检测抗体或其片段的方法没有特别限制，只要其是使用本领域抗体的检测方法。例如，检测方法可以使用由蛋白质印迹或酶联免疫特异性测定(ELISA)、放射免疫测定、放射免疫沉淀、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫染色(包括免疫组织化学染色和免疫荧光染色)、免疫沉淀测定、补体结合测定、荧光激活细胞分选仪(FACS)或蛋白质芯片法组成的组中的一种。

本发明的抗体或其片段可以用于诊断试剂盒，即用于进行诊断分析的诊断试剂盒，其是以预定量与操作手册一起包装的试剂的组合。如果抗体用酶标记，则试剂盒可以含有底物和辅因子作为底物前体，从而提供酶所需的发色团或荧光团。试剂盒还可以含有其它添加剂，如稳定剂和缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)。各种试剂的相对量可以广泛变化，以便提供用于充分优化分析灵敏度的溶液中试剂浓度。这些试剂通常可以作为冷冻干燥或干燥的粉末提供，其包括媒介物，当试剂溶解时，通过该媒介物提供具有适当浓度的试剂溶液。

已知在患有多发性硬化的患者中NINJ-1水平上调。因此，已知NINJ-1可以在多发性硬化治疗之前和之后用作诊断、疾病进展和预后评估的诊断标志物。也就是说，可以通过检测生物样品中的NINJA-1蛋白来进行多发性硬化的诊断和预后评估。因此，本发明的人NINJ-1特异性检测方法可以用作通过测量从潜在患者收集的样品中人NINJ-1的表达水平来提供多发性硬化诊断所需信息的方法。

生物样品包括具有生物来源的血液和其它液体样品、活组织检查样品、固体组织样品(如组织培养物)，或由其衍生的细胞。更具体地，生物样品的实例可以包括但不限于组织(尤其是神经组织)、提取物、细胞裂解物、全血、血浆、血清、唾液、眼内液、脑脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、滑液和腹膜液等。样品可以从动物，优选哺乳动物，并且最优选人获得。样品可以在其用于检测之前预处理。例如，样品可以通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、干扰组分的失活和试剂添加等预处理。此外，从样品分离的核酸和蛋白质可用于检测。该检测如上所述。

在另一方面，免疫细胞与中枢神经系统上皮细胞的结合和免疫细胞向中枢神经系统的迁移是多发性硬化的重要病理，并且用于预防这种结合和迁移的治疗策略已被用于治疗现有的多发性硬化(例如

(那他珠单抗)等)。本领域已知NINJ-1在免疫细胞与中枢神经系统上皮细胞的结合和免疫细胞向中枢神经系统的迁移中充当粘附分子。因此，如果通过抑制NINJ-1的活性来抑制免疫细胞与中枢神经系统内皮细胞的结合和免疫细胞的迁移，则可以实现多发性硬化的预防和治疗。因此，本发明人发现本发明的抗体显著抑制免疫细胞系与人脑内皮细胞之间的粘附，从而证实了其对多发性硬化的预防和治疗作用。

因此，本发明提供了一种用于预防或治疗多发性硬化的药物组合物，该组合物包含抗体或其片段作为活性成分。

本发明还提供了一种用于预防或治疗多发性硬化的药物组合物，该组合物由作为活性成分的抗体或其片段组成。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗多发性硬化的药物组合物，该组合物基本上由作为活性成分的抗体或其片段组成。

此外，本发明提供了抗体或其片段在制备用于预防和治疗多发性硬化的药剂中的用途。

本发明还提供了一种用于预防和治疗受试者的多发性硬化的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含抗体或其片段作为活性成分的组合物。

此外，本发明提供了一种用于预防和治疗受试者的多发性硬化的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的由作为活性成分的抗体或其片段组成的组合物。

此外，本发明提供了一种用于预防和治疗受试者的多发性硬化的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的基本上由作为活性成分的抗体或其片段组成的组合物。

多发性硬化(MS)是中枢神经系统的脱髓鞘疾病中的一种，并且是主要发生在年轻组中的慢性炎性疾病。多发性硬化的原因是神经细胞轴突周围的髓鞘消失，这可能导致神经传导失败，从而导致神经症状。当髓鞘丢失时，发生瘢痕形成或硬化。此外，尽管已知髓鞘异常由于自身免疫、遗传因素等、病毒感染、环境因素而发生，但多发性硬化的确切原因尚未确定。在本发明中，多发性硬化包括复发性缓解性多发性硬化(RRMS)、继发性进行性多发性硬化 (SPMS)、原发性进行性多发性硬化(PPMS)和进行性复发性多发性硬化 (PRMS)。

此外，本发明的抗体或其片段具有通过抑制癌症转移来预防或治疗癌症的作用。因此，本发明提供了一种用于抑制癌症转移和预防或治疗癌症的药物组合物，该组合物包含抗体或其片段作为活性成分。

本发明还提供了一种用于抑制癌症转移和预防或治疗癌症的药物组合物，该组合物由抗体或其片段组成。

此外，本发明提供了一种用于抑制癌症转移和预防或治疗癌症的药物组合物，该组合物基本上由抗体或其片段组成。

根据本发明另一个方面的实施方式提供了抗体或其片段在制备用于抑制癌症转移和预防或治疗癌症的药剂中的用途

根据本发明另一个方面的实施方式提供了一种用于抑制受试者的癌症转移并且预防和治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含抗体或其片段作为活性成分的组合物。

本发明还提供了一种用于抑制受试者的癌症转移并且预防和治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的由作为活性成分的抗体或其片段组成的组合物。

此外，本发明提供了一种用于抑制受试者的癌症转移并且预防和治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的基本上由作为活性成分的抗体或其片段组成的组合物。

该抗体或包含本发明抗体的药物组合物或包含其的药物组合物抑制肿瘤细胞的转移，并且因此可以应用于各种癌症。例如，不受限制的癌症选自由结肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈癌、恶性黑素瘤、淋巴瘤和再生障碍性贫血组成的组。

根据本发明的药物组合物可以仅包含本发明的抗体或其片段，或者可以进一步包含至少一种药学上可接受的载体。如本文所用的术语“药学上有效量”是指与阴性对照组相比显示更有效反应的量，并且优选是指足以治疗癌症的量。

术语“药学上可接受的”组合物是指生理学上可接受、当向人施用时不抑制活性成分的作用，并且通常不引起过敏反应或类似反应(如胃肠问题和头晕)的无毒组合物。

在根据本发明的药物组合物中，抗体或其片段可以在临床施用时以各种形式的口服和肠胃外施用来施用。在制剂的情况下，其可以通过使用稀释剂或赋形剂(如通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、表面活性剂等)来制备。

例如，其可以配制成注射剂作为肠胃外施用的制剂。注射剂需要基本上进行灭菌，并且需要保护其免受微生物(如细菌和真菌)的污染。用于注射的合适载体的实例可以包括但不限于溶剂或分散介质，包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其混合物和/或植物油。更优选地，Hanks 溶液、Ringer溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或含有三乙醇胺的无菌注射用水或等渗溶液(如10％乙醇、40％丙二醇或5％右旋糖)可以用作合适载体。为了保护注射剂免受微生物污染，注射剂可以进一步含有各种抗生素和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。在大多数情况下，注射剂可以进一步含有等渗剂，如糖或氯化钠。这些制剂和其它药学上可接受的载体可以是文献(Remington'sPharmaceutical Science,第15版,1975,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania)中描述的那些，其是一种众所周知的药物化学形式。

本发明的药物组合物的总有效量可以通过分次治疗方案以单剂量或多剂量长期向患者施用。此外，活性成分的含量可以取决于施用目的而变化。考虑各种因素确定有效剂量，如施用途径、施用次数、患者年龄、体重、健康状况和性别、疾病严重程度、食物和排泄率。因此，考虑到这些各种因素，本领域技术人员可以根据施用目的确定适当的有效剂量。其还可以通过在施用根据本发明的抗体或其片段后使用熟知的体内测定或确定免疫细胞活性的测定监测治疗功效来确定。根据本发明的药物组合物对任何剂型、其施用途径和施用方法均没有特别限制，只要该组合物显示出本发明的效果。

如本文所用，“有效量”是指在向受试者施用时显示减轻、治疗和预防上述疾病的效果的量。“受试者”可以是动物，优选哺乳动物，尤其是包括人的动物，并且可以是源自动物的细胞、组织或器官等。受试者可以是需要所述效果的患者。

如本文所用，术语“组合物”或“药剂”可以是食品组合物、化妆品组合物和药物组合物等形式，优选如上所述的药物组合物。本文的组合物可以包含0.001重量％至99.999重量％的本发明抗体和99.999重量％至0.001重量％的合适载体，其可以含有合适的添加剂。

术语“包含”与“含有”或“被表征”同义使用，并且不排除组合物和方法中未提及的另外成分或步骤。术语“由......组成”排除未单独描述的另外元素、步骤或成分。术语“基本上由......组成”意指在组合物或方法的范围内，该术语包括基本上不影响组合物或方法的基本特征的任何材料或步骤，以及所述材料或步骤。

有益效果

因此，本发明提供了一种特异性结合人源Ninjurin-1(NINJ-1)蛋白的抗体或其片段。根据本发明的抗体或其片段对人NINJ-1具有显著高的结合亲和力和特异性，并且不显示与具有高蛋白质相似性的其它来源NINJ-1蛋白(特别是小鼠NINJ-1蛋白)的交叉反应性。因此，其不仅在诊断与NINJ-1蛋白有关的疾病方面，而且在抑制NINJ-1蛋白中涉及的病理学状态的准确性、高灵敏度等方面提供了显著的优点。具体地，本发明提供的抗体在抑制免疫细胞与人脑内皮细胞之间的粘附方面非常有效，并且因此对多发性硬化具有治疗作用。

附图说明

图1示出了人NINJ-1(Ninjurin-1)蛋白序列中每个结构域和对同源结合能力重要的结构域，并示出了使用对应于同源结合结构域的抗原在生物淘选过程中每次的菌落数。

图2示出了通过ELISA确认和筛选HBAg1(P26-N37区域)对通过第3轮生物淘选过程选择的噬菌体候选物的亲和力的结果。

图3A示出了引入pGEX-4T-1表达载体中的人NINJ-1细胞外结构域核酸序列和小鼠NINJ-1细胞外结构域核酸序列。

图3B是示出用于引入人NINJ-1细胞外结构域核酸序列或小鼠NINJ-1细胞外结构域核酸序列的载体的切割位点和最终制备的表达载体的示意图。

图4示出了转化的大肠杆菌中GST/huNINJ-1蛋白质表达和GST/musNINJ-1 蛋白质表达的SDS-PAGE分析结果(图4A：表达，图4B：超声处理，图4C：纯化)。

图5是对HBAg1显示出亲和力的候选物中对GST/HuNINJ-1和 GST/musNINJ-1具有高亲和力的四个亲和组(D9、D12、E4和G11)的最终选择结果，其显示出对每种抗体代表的GST(对照)、GST/huNINJ-1、GST/musNINJ-1的相对亲和力(将各候选组所示的430nm处的吸光度值标准化为B1(非结合活性对照)的值)。

图6是示出用于产生含有scFv的抗体重链可变区(VH)或抗体轻链可变区 (VL)的IgG表达载体的方法的示意图。

图7示出了关于每种测试组抗体对HBAg1(P26-N37区域)的亲和力的比较结果，证实了本发明的D12Ig抗体(图7a)对HBAg的亲和力显著高于其它公司出售的抗NINJ-1抗体(图7a，图7b)。

图8a示出了关于各种候选组中本发明的D9、D12、E4和G11Ig抗体在与正常细胞中表达的天然人NINJ-1蛋白结合方面具有非常高的特异性的比较结果。

图8b示出了证实本发明的D12Ig抗体不与购自其它公司的抗NINJ-1抗体 (R&D系统，目录号MAB51051，标记为R**)共享抗原识别位点的结果。

图9a是示出获得用于产生过表达多西环素诱导的人NINJ-1的成胶质细胞瘤细胞系的重组载体的程序的示意图。

图9b示出了根据多西环素的处理浓度检测U87MG pLVX NINJ-1成胶质细胞瘤细胞系中人NINJ-1的表达水平的蛋白质印迹结果。

图10示出了比较本发明的D9、D12E4和G11Ig抗体与两种抗NINJ-1抗体(BDbioscience目录号BD610776(标记为B**)，和SantaCruz目录号sc-136295 (标记为S**))对U87MG pLVX NINJ-1成胶质细胞瘤细胞系中表达的人NINJ-1 蛋白的亲和力的结果。

图11示出了证实本发明的D9、D12、E4和G11Ig抗体是否抑制免疫细胞与人脑内皮细胞之间粘附的结果，以确认该抗体是否可用作多发性硬化的治疗剂。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明。

然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明不限于以下实施例。

实施例1：使用人NINJ-1蛋白的P26-N37区域鉴定抗体

1-1.生物淘选

为了鉴定对人NINJ-1(Ninjurin-1，SEQ ID NO:25)的P26-N37区域特异的抗体，使用基于人scFv文库的噬菌体展示技术进行以下实验。在下文中将 P26-N37区域的片段肽称为HBAg1。

合成HBAg1末端处的生物素缀合的肽，随后与Dynabeads M-270链霉抗生物素蛋白(GE Healthcare Life Science)结合。随后，将文库的scFv噬菌体在37℃下反应1小时30分钟。

然后，获得具有特异性结合的scFv噬菌体，并用培养至在OD600下为0.5 至0.7的ER2537大肠杆菌(NEB)感染(输入)，并且然后加入辅助噬菌体并在37℃下在固体培养基中培养12至16个小时。对于一些，在液体培养基中在 37℃和160rpm下进行摇动培养12至16小时。此后，测量固体培养基上的菌落数并确认输出。将聚乙二醇(PEG，Sigma aldrich)加入到培养溶液中以沉淀噬菌体，并且进一步重复相同的实验两次以进行最后的第三轮淘选。

与第一轮相比，第二轮中噬菌体的菌落数量减少，而在第三轮中则增加。该结果示于图1中。

1-2.人NINJ-1scFv候选物的选择

在用实施例1-1的第3轮生物淘选中回收的噬菌体感染宿主细胞(ER2537， NEB)后，在LB固体培养基上选择95个菌落，并且然后在室温下以700rpm在液体培养基中培养。然后，用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)处理各孔至最终浓度为1mM，并在30℃下以200rpm培养12-16小时。将培养液以 3000rpm离心20分钟以除去上清液，并通过TES缓冲液进行渗透细胞裂解以获得细胞内噬菌体颗粒。在预先用链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(Thermo scientific，目录号436014)中用浓度为10ug/ml的HBAg1或磷酸盐缓冲盐水(PBS，对照)包被板，并且将每个50μl回收的噬菌体颗粒加入到包被的板中，随后在室温下反应1小时。然后，加入与辣根过氧化物酶缀合的抗HA(血凝素) 二抗(Santa cruzbiotechnology)并在室温下再次反应1小时。然后，诱导使用 TMB溶液的显色反应5分钟，并用1N H₂SO₄溶液终止反应，并在430nm下测量吸光度。

当比较对照和HBAg1包被的板的结果时，如图2所示，进行了其中仅在 HBAg1中观察到反应的孔的菌落的DNA序列分析。这导致许多scFv候选物(在图2中用绿色表示)可以特异性结合人NINJ-1，特别是HBAg1。

实施例2：NINJ-1重组蛋白的表达和纯化

2-1.制备用于产生NINJ-1细胞外结构域蛋白的表达载体

为了确认实施例1中获得的scFv候选物是否可以在结构上结合人NINJ-1 蛋白的P26-N37区域并且可以结合NINJ-1的细胞外结构域部分，将含有人 NINJ-1或小鼠NINJ-1基因的细胞外结构域部分中的两个转录终止密码子的核苷酸序列插入pGEX-4T-1表达载体中的多克隆位点BamHI与XhoI之间，以分别构建重组蛋白表达载体。具体的核苷酸序列如图3A所示，特异性克隆区域如图 3B所示，并且各表达载体分别命名为pGST/huNINJ1和pGST/musNINJ1。将表达载体转染到大肠杆菌DH5a(enzynomics)中并培养。在MIDI制备后，最终通过DNA测序确认GST/huNINJ-1和GST/musNINJ-1的插入。

2-2.NINJ-1细胞外结构域蛋白的表达和纯化

使用实施例2-1中制备的表达载体pGST/huNINJ-1或pGST/musNINJ-1转化的大肠杆菌DH5a经受MIDI制备。在回收足够的质粒DNA后，进行以下实验以在大肠杆菌中表达和纯化重组蛋白。分别用pGST/huNINJ-1或 pGST/musNINJ1质粒DNA转化大肠杆菌BL21DE3，并在LB培养基中培养。然后，在含有氨苄青霉素的5ml LB液体培养基中培养单个菌落，使得OD600 值为0.6至0.8。然后，用0mM、0.5mM和1mM IPTG处理培养基，分别在37℃下培养3小时，并以8000rpm离心10分钟以仅回收细胞。对细胞裂解物进行 SDS-PAGE，并通过用考马斯染色(Sigma Aldrich)处理来确认表达(图4A)。

收集已用0.5mM和1.0mM IPTG诱导表达的细胞裂解物并离心以回收细胞。将细胞用1ml PBS匀浆，并使用超声波发生器(BRANSON)裂解。然后，将溶解的细胞离心以分离包涵体和水溶性蛋白质，并使分离的样品经受SDS-PAGE 和考马斯染色处理以确认重组蛋白质的水溶性(图4B)。然后，使水溶性蛋白质部分与谷胱甘肽琼脂糖凝胶TM 4B树脂(GEhealthcare Life Sciences)在4℃下反应1小时，离心分离与树脂结合的蛋白质。然后，使用50mM Tris-HCl，10mM 还原型谷胱甘肽和pH 8.0缓冲液仅回收GST标记的重组蛋白。对回收的蛋白质进行SDS-PAGE，并使用考马斯染色通过相同的方法进行纯化以确认回收蛋白质的大小(图4C)。

实施例3：通过ELISA进行的GST/huNINJ-1和GST/musNINJ-1的亲和力测量

为了筛选能够特异性结合实施例2中获得的重组蛋白GST/huNINJ-1和GST/musNINJ-1的scFv候选物，进行以下实验。进行实验以证实特异性显示对实施例1中的HBAg1和GST/huNINJ-1和GST/musNINJ-1的结合活性的scFv 候选组的亲和力，使用其中未观察到特异性结合HBAg1的B1作为对照。将重组蛋白GST/huNINJ-1、GST/musNINJ-1或GST分别以10ug/ml的浓度包被在 96孔板(康宁3690平底，半面积板)中。通过与实施例1-2中相同的实验方法，将细胞中的scFv噬菌体颗粒与实施例1中选择的scFv候选组分离。然后，使用包被的板进行ELISA。

将每个候选组指示的430nm处的吸光度值标准化为B1(非结合活性对照) 的值，并且最后，在对HBAg1显示出亲和力的候选者中选择了4个对 GST/HuNINJ-1和GST/musNINJ-1具有高亲和力的候选物(D9、D12、E4和G11)。如图5所示，人和小鼠NINJ-1的亲和力在四个候选组中得到证实，并且这些候选组的CDR序列示于下表1中。

[表1]

实施例4：制备用于人抗NINJ-1抗体产生和抗体产生的表达载体

为了表达含有所选四种scFv(D9、D12、E4和G11)的VH和VL核苷酸序列的分子量为160kDa的免疫球蛋白G(IgG)抗体，进行以下克隆。

如图6所示，使用下表2中所示的引物将每种scFv的VH和VL核苷酸序列插入IgG表达载体(修饰的pOptiVEC(IgG VL-LCκ表示法，包含的轻链恒定区；Thermo FisherScientific，pOptiVEC-TOPO TA克隆试剂盒，目录号 12744-017)、修饰的pcDNA3.3TOPO(IgG VH-HC表示法，包含的重链恒定区；Thermo Fisher Scientific，pcDNA3.3-TOPO TA克隆试剂盒，目录号K830001) ClaI和NheI区域中以制备重链表达载体(IgG VH-HC)和轻链表达载体(IgG VL-LCκ)(参见图6)。然后，将载体转化到大肠杆菌中，在液体培养基上培养，并通过midi制备提取质粒DNA。根据Freestyle 293表达系统(Thermo Fisher Scientific)中提供的实验方法将提取的质粒DNA共转染到FreeStyle 293F细胞系中，以诱导免疫球蛋白G型抗体的表达。将细胞培养物离心以分离细胞，并且然后使用MabSelect SuReTM蛋白A(GEHealthcare Life Sciences)通过亲和色谱法分离和纯化抗体。

[表2]

引物信息

实施例5：人抗NINJ-1IgG对HBAg1的亲和力测量

将D12用作实施例4中制备的代表性Ig抗体，并且使用可从其它公司商购的NINJ-1抗体(MAB51051、BD610776、SC-136295)作为对照，测量对P26-N37 区域的亲和力。

具体地，以10ug/ml的浓度将HBAg1包被在涂有链霉抗生物素蛋白的96 孔板(Thermo scientific，目录号436014)上，在4℃下过夜。在用含有0.05％吐温20的TBS缓冲液洗涤三次后，将3％牛血清白蛋白(BSA)再次溶解在相同的缓冲液中，并且然后在室温下反应1小时。将可从其它公司商购的各种抗 NINJ-1抗体和本发明的Ig抗体以5ug/ml或25ug/ml的浓度稀释2倍，在每个孔中在室温下反应1小时，并且然后加入与辣根过氧化物酶缀合的二抗并反应1 小时。在与TMB反应20分钟后，用1N H₂SO₄终止反应，并在430nm下测量吸光度。

因此，如图7A和7B所示，证实了发现本发明的D12Ig抗体对人P26-N37 肽的亲和力显著高于可从其它公司商购的抗NINJ-1抗体。

实施例6：基于正常细胞的抗NINJ-1IgG筛选

确认了以上选择的四个候选组和属于实施例1-2的候选组但稍后排除的实验组是否特异性结合实际人细胞系中表达的NINJ-1蛋白。另外，通过使用流式细胞仪确认了可从其它公司商购的抗NINJ-1抗体的抗原识别位点是否相同。

将人脑微血管内皮细胞系(hCMEC/D3)用10％胎牛血清(Hyclone)在4℃下处理20分钟，并且然后将小鼠来源的抗NINJ-1抗体(R&D系统，MAB51051)、同种型对照(R&D系统，MAB002)和选定的人抗NINJ-1抗体(D9、D12、 E4、G11和8种另外抗体，均以Ig形式测试)在4℃下以1ug/10000个细胞的浓度反应90分钟。在反应完成后，用PBS洗涤细胞三次，并且然后使小鼠来源的抗体与抗小鼠IgG与缀合有FITC的二抗反应，使人源抗体(本发明的抗体)与缀合有FITC的抗人IgG二抗在4℃下反应1小时。使用流式细胞术(BD FACS Calibur^TM)进行该测定。

如图8A所示，显示本发明的四种抗体特异性结合细胞中表达的人NINJ-1，而四种所选抗体中的D9、D12和G11显示出特别高的结合能力。

此外，使用候选组的D12，确认其是否与可从其它公司商购的抗NINJ-1抗体(R&D系统)共享抗原识别位点。在永生化-人脑微血管内皮细胞系(HBMEC) 中以1ug/10000个细胞的相同浓度处理每种抗体，并且然后，与缀合有FITC的抗人IgG二抗在4℃下反应1小时。该测定使用流式细胞仪(BD FACS CaliburTM) 证实结合。如图8B所示，证实了本发明的抗体D12不与可从其它公司商购的抗 NINJ-1抗体(R&D系统)共享抗原识别位点。

实施例7：确认NINJ-1的诊断特异性

在多西环素的治疗中，使用过表达NINJ-1的成胶质细胞瘤细胞系验证通过实施例3和实施例4测试的四个候选组(D9、D12、E4、G11)对人NINJ-1蛋白的特异性结合能力。

7-1.构建用于多西环素诱导型人NINJ-1过表达细胞系的表达载体和稳定表达细胞

为了构建人NINJ-1过表达细胞系，从CDS 21至476(ATGGACTC至 AGCAGTAG)选择NINJ-1(韩国人类基因库，hMU007113)的cDNA序列中的克隆位置，并且在pLVX-Tet-On puro载体的MCS部分中使用BamHI和EcoRI 制备克隆引物。

使用正向引物5’-TATGGATCCCTACTGCTGGGGTGCCATG-3’和反向引物 5’-TATGAATTCATGGACTCGGGAACCGAGG-3’进行PCR(95℃/5分钟(95℃ /30秒、60℃/45秒、72℃/30秒)30次，72℃/10分钟)，并且然后在0.7％琼脂糖凝胶上电泳以仅回收特异性片段，并且将载体和PCR产物与BamHI和EcoRI 在37℃下反应1小时。在反应完成后，回收并纯化样品，并通过T4连接酶完成诱导型表达载体(该过程如图9A所示)。将诱导型表达载体转染到成胶质细胞瘤细胞系(U87MG)中，并以1ug/ml的浓度重复处理嘌呤霉素3天以建立稳定的细胞系。将1、5、10和50ng/ml多西环素加入稳定细胞的生长培养基中，并且通过蛋白质印迹确认NINJ-1表达率的增加(参见图9B)。结果显示，NINJ1 蛋白的表达水平根据多西环素的浓度而增加(参见图9B)。在下文中将这些细胞系称为U87MG pLVX NINJ1。

7-2.基于多西环素诱导型人NINJ-1过表达细胞系的结合能力的测量

为了比较与实施例4中最终选择的人抗NINJ-1IgG候选组(D9、D12、E4、G11)和由另一家公司(BD bioscience，SantaCruz)开发和销售的抗NINJ-1抗体的结合能力，使用其中人NINJ-1过表达由实施例7-1中制备的多西环素诱导的成胶质细胞瘤细胞系(U87MG pLVXNINJ1)进行以下实验。

预先通过在37℃下处理最终浓度为50ng/ml的U87MG pLVX NINJ-1成胶质细胞瘤细胞系24小时来制备细胞系。基于从实施例3排除的F4(对照)，根据与实施例6中相同的实验方法，使用流式细胞术分析仪分析本发明的四种候选物和其它公司(BD bioscience，SantaCruz)的两种抗NINJ-1抗体。

如图10所示，证实了与其它公司销售的抗体相比，4-候选组对NINJ-1具有高结合能力(图10A和10B)。

实施例8：在用本发明的抗NINJ-1IgG处理后抑制脑血管内皮细胞与免疫细胞的粘附

免疫细胞与中枢神经系统内皮细胞的结合和免疫细胞向中枢神经系统的迁移是多发性硬化的重要病理，并且用于预防这种结合和迁移的现有治疗策略(例如

(那他珠单抗)等)已用于治疗多发性硬化。本领域已知NINJ-1在免疫细胞与中枢神经系统内皮细胞的结合和免疫细胞向中枢神经系统的迁移中充当粘附分子。因此，如果抑制NINJ-1的活性并且因此抑制免疫细胞与中枢神经系统内皮细胞的结合和免疫细胞的迁移，则可以实现多发性硬化的预防和治疗。

为了证实通过本发明制备的人NINJ-1Ig抗体是否可以抑制免疫细胞系与人脑内皮细胞之间的粘附，进行了以下实验。

将胶原蛋白I大鼠尾巴蛋白质以50ug/ml的浓度包被在96孔板中，并且在 37℃和5％CO₂下在每个孔中培养1.0x10⁴个hCMEC/D3细胞系72小时。然后，将200IU/ml TNFα和IFNγ或1μg/ml PMA处理16小时。然后，用不含镁和钙的 DPBS洗涤细胞两次，以除去残留在细胞中的炎症诱导物。此后，向孔中加入 10ug/ml的每种抗体并反应。在该程序结束时，通过再次用DPBS洗涤两次除去剩余的抗体。然后，加入表达绿色荧光蛋白(GFP)的1.0x10⁴个U937细胞系 (淋巴母细胞)作为免疫细胞，并在37℃和5％CO₂下诱导粘附90分钟后用 DPBS洗涤细胞三次。使用实时细胞图像分析仪(IncuCyte^TM ZOOM)进行所有程序以测量绿色标记细胞的数量。将最终保留在每个孔中的细胞数除以初始细胞数，并且然后基于用PMA(SigmaAldrich)处理进行标准化。

如图11所示，在用人NINJ-1抗体(1μg/ml PMA+D12，1μg/ml PMA+G11) 处理的组中，免疫细胞系与人脑内皮细胞之间的粘附性降低。因此，证实了由本发明制备的抗体通过它们对P26-N37区域的特异性结合能力来抑制免疫细胞与人脑内皮细胞之间的粘附。因此，显然本发明中制备的抗体可以对多发性硬化表现出治疗效果。

工业实用性

如上所述，本发明提供了一种特异性结合人NINJ-1和该蛋白质的同源结合位点的抗体或其片段。根据本发明的抗体或其片段对人NINJ-1具有非常高的结合亲和力和特异性，并且不显示与具有高蛋白质相似性的其它来源NINJ-1蛋白 (特别是小鼠NINJ-1蛋白)的交叉反应性。因此，其不仅在诊断与NINJ-1蛋白有关的疾病方面，而且在抑制NINJ-1蛋白中涉及的病理学状态的准确性、高灵敏度等方面提供了显著的优点。具体地，本发明提供的抗体在抑制免疫细胞与人脑内皮细胞之间的粘附方面非常有效，并且因此对多发性硬化具有治疗作用。因此，本发明在工业上高度适用于其中靶向特征重要的诊断和治疗工业。

<110> 瑷备恩有限公司和首尔大学校产学协力团

<120> 抗NINJ-1抗体及其用途

<130> OP19-0032/PCT/CN

<150> KR 10-2016-0109557

<151> 2016-08-26

<150> PCT/KR2017/009377

<151> 2017-08-28

<160> 31

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D9的VL-CDR1

<400> 1

Arg Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D9的VL-CDR2

<400> 2

Ala Asp Ser His Arg Pro Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D9的VL-CDR3

<400> 3

Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Asn Ala

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D9的VH-CDR1

<400> 4

Asp Tyr Ser Met Ser

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D9的VH-CDR2

<400> 5

Gly Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D9的VH-CDR3

<400> 6

Asp Pro Val His Cys Glu Arg Ser Val Cys Tyr Tyr Ala Asp Ala Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D12的VL-CDR1

<400> 7

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Thr

1 5 10

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D12的VL-CDR2

<400> 8

Ser Asp Ser Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D12的VL-CDR3

<400> 9

Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Asn Ala

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D12的VH-CDR1

<400> 10

Asn Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D12的VH-CDR2

<400> 11

Trp Ile Ser Pro Asp Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 D12的VH-CDR3

<400> 12

Tyr Arg Ile Thr Pro Met Ser Trp Leu Ser Tyr Tyr Asp Asp Ala Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 E4的VL-CDR1

<400> 13

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asn Val Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 E4的VL-CDR2

<400> 14

Asp Asn Ser Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 E4的VL-CDR3

<400> 15

Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala

1 5

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 E4的VH-CDR1

<400> 16

Asp Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 E4的VH-CDR2

<400> 17

Gly Ile Tyr His Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 E4的VH-CDR3

<400> 18

Asp Pro Met His Ser Glu Arg Ile Thr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 G11的VL-CDR1

<400> 19

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 G11的VL-CDR2

<400> 20

Asp Asn Ser Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 G11的VL-CDR3

<400> 21

Gly Ala Trp Asp Ala Ser Leu Asn Gly

1 5

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 G11的VH-CDR1

<400> 22

Asp Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 G11的VH-CDR2

<400> 23

Ala Ile Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NINJ1 G11的VH-CDR3

<400> 24

Asp Pro Met Thr Ser Leu Ala Leu Thr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 25

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Ninjurin 1蛋白

<400> 25

Met Asp Ser Gly Thr Glu Glu Tyr Glu Leu Asn Gly Gly Leu Pro Pro

1 5 10 15

Gly Thr Pro Gly Ser Pro Asp Ala Ser Pro Ala Arg Trp Gly Trp Arg

20 25 30

His Ser Pro Ile Asn Val Asn His Tyr Ala Ser Lys Lys Ser Ala Ala

35 40 45

Glu Ser Met Leu Asp Ile Ala Leu Leu Met Ala Asn Ala Ser Gln Leu

50 55 60

Lys Ala Val Val Glu Gln Gly Pro Ser Phe Ala Phe Tyr Val Pro Leu

65 70 75 80

Val Val Leu Ile Ser Ile Ser Leu Val Leu Gln Ile Gly Val Gly Val

85 90 95

Leu Leu Ile Phe Leu Val Lys Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Ala Lys His

100 105 110

Ala Lys Leu Asp Phe Leu Asn Asn Leu Ala Thr Gly Leu Val Phe Ile

115 120 125

Ile Val Val Val Asn Ile Phe Ile Thr Ala Phe Gly Val Gln Lys Pro

130 135 140

Leu Met Asp Met Ala Pro Gln Gln

145 150

<210> 26

<211> 1297

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 智人ninjurin 1 (NINJ1)

<400> 26

cgcagctgga gcctgcggct gaggctcggg cgcgctcagg cccggatcct ggcggcctgg 60

gcggccgcac catggactcg ggaaccgagg agtacgagct caacggcggc ctgcctccgg 120

gcacacccgg ctccccggac gcctcgccgg cccgctgggg ctggaggcac gggcccatca 180

acgtgaacca ttacgccagc aagaagagcg cagccgagag catgctggac atcgcgctgc 240

tgatggccaa cgcgtcccag ctgaaggccg tcgtggaaca gggccccagc ttcgccttct 300

atgtgcccct ggtggtcctc atctccatct cccttgtgct gcagatcggc gtgggggtgc 360

tgctcatctt ccttgtcaag tacgacctta acaacccggc caagcacgcc aagctggact 420

tcctcaacaa cctggccacg ggcctggtgt tcatcatcgt ggtagtcaac atcttcatca 480

cggccttcgg ggtccagaag cccttgatgg acatggcacc ccagcagtag gacacccagg 540

accctggatg ctgcctgccc tgcaactcag ctgcccgacc ccaggagtcg ccatacctgt 600

gaggtgtcca cctccctgca catggcacta cccagactgc cagagcccag gctggcctca 660

tctgcaccat gtccccggac cagcccttgc tctgactgcg gccaagcacc acgcaggagg 720

ccactcttgt ctctcagcag ctgttcccag gaggcagctc cctcctggca catgggggct 780

ggccacaata gcccagaggg tcagaactgg acagctgcag agacctgtgc ccagagaagg 840

gtctcgaccc actcaaggac acacagcagg tccgtggatg ggctggatga gtgaccaggg 900

ccagcctctg tctcaggaca ttccagaagg acaaggagat gtctctccct ctcccaaagc 960

accagcgtcc ctgcctcccg tgggccctgt ccgggttgcc ctggtgaccc cagcctctgt 1020

ccacttccta acccagggac cctgcacagc cagaactgcc tttggcccta cggatggcca 1080

ctggctctgg tcttaagtgc ctgggcttgg tggccatcaa gagggagcca gtcaggcctg 1140

tgagggccgt agaccttgta tataccctgc accagcagtg accgggcaga gcccaacccc 1200

ctccacgggg gtcccagcac ccacttttct aatcatgaat gaacaataaa gcccacgctc 1260

tttgtcaggc tccacatgcc aaaaaaaaaa aaaaaaa 1297

<210> 27

<211> 1132

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小家鼠ninjurin 1 (Ninj1)

<400> 27

cccgggcggc cgcaccatgg agtcgggcac tgaggagtat gagctcaacg gcgacctgcg 60

cccgggctcc cccggttccc ccgacgcctt gccaccccgc tggggtttgc ggaaccggcc 120

catcaatgta aaccattatg ccaacaagaa gagcgctgcg gagagcatgc tggacatcgc 180

gctgctcatg gccaacgcgt cgcagctgaa ggccgtggtg gagcagggca atgatttcgc 240

cttcttcgtg ccccttgtgg tcctcatctc tatctccctc gtgctgcaga taggagtggg 300

cgtgctgctc atcttcctgg tcaagtatga cctcaacaac ccggccaagc acgccaagct 360

ggactttctt aacaacctgg ccacgggact ggttttcatc atcgtcgtgg tcaacatctt 420

cattacggcc ttcggggtcc agaagcctgt aatggacgtg gcgccccggc agtagaacgc 480

ccagagactt taagggtacc ggacctgcag cccagctgac cagacccctg caactgctgt 540

acccccaagg tatccctctc ctgtgtgcag agcccaaggt ggccaccgct ggaccatggt 600

cagggacgga cttccgtcca actgtgaccg ctgtgtgggc ggccacctga gacatgtggg 660

aaccggatgc agggccatga agatcagaac tggacagctc catagaaacc caagtccaga 720

gaatggtcac tgcccaccca aggacatgca gcaaatccat gattggactt gacgaggggc 780

cagcactggc ctctgtctca ggacattcca gaaggaccag gatatgcccc tccctttgct 840

gatacaccag tgaccctact tctcatggag cctgcccagg tcaccctgga gactgctgcc 900

tttgttgttt cttgacccag ggaccttgga cagccatcag tatctgctgg ctccagcctc 960

agtgcctggg cttggcagcc atcaagaggc agccatgccc gtgggggctg caggtcatgc 1020

tggtacttcc tgccagtggt gacctgggta gagccccagc cctcaactca ggggttcagg 1080

ccccactttt ctaatcagga acgacaataa agcttatgtg cttccctgct gg 1132

<210> 28

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG_VH-HC正向引物

<400> 28

attcgatcga tatggagaca gacacactcc tgctatgggt actgctgctc tgggttccag 60

gttccacgtg ggaggtgcag ctgttggagt ct 92

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG_VH-HC反向引物

<400> 29

cttggtgcta gctgagctca cggtgaccag tgt 33

<210> 30

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG_VL-LC反向引物

<400> 30

attcgatcga tatggagaca gacacactcc tgctatgggt actgctgctc tgggttccag 60

gttccacgtg gcagtctgtg ctgactcagc ca 92

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG_VL-LC反向引物

<400> 31

agccaccgta cgtaggaccg tcagcttggt gcc 33

Claims

1.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性结合由SEQ ID NO:25所定义的人源NINJ-1蛋白质序列中的第26位与第37位之间的残基区域，

其中，所述抗体或其片段包含：抗体轻链可变区(VL)，其包含由SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L1、由SEQ ID NO:2定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L2，和由SEQ ID NO:3定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L3；和

抗体重链可变区(VH)，其包含由SEQ ID NO:4定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、由SEQ ID NO:5定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H2，和由SEQ ID NO:6定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H3；或者

其中，所述抗体或其片段包含：抗体轻链可变区(VL)，其包含由SEQ ID NO:7定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L1、由SEQ ID NO:8定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L2，和由SEQ ID NO:9定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L3；和

抗体重链可变区(VH)，其包含由SEQ ID NO:10定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、由SEQ ID NO:11定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H2，和由SEQ ID NO:12定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H3；或者

其中，所述抗体或其片段包含：抗体轻链可变区(VL)，其包含由SEQ ID NO:13定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L1、由SEQ ID NO:14定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L2，和由SEQ ID NO:15定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L3；和

抗体重链可变区(VH)，其包含由SEQ ID NO:16定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、由SEQ ID NO:17定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H2，和由SEQ ID NO:18定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H3；或者

其中，所述抗体或其片段包含：抗体轻链可变区(VL)，其包含由SEQ ID NO:19定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L1、由SEQ ID NO:20定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L2，和由SEQ ID NO:21定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L3；和

抗体重链可变区(VH)，其包含由SEQ ID NO:22定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、由SEQ ID NO:23定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H2，和由SEQ ID NO:24定义的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述片段选自由双抗体、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv和scFv组成的组。

3.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的抗体或其片段。

4.一种载体，其包含根据权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种细胞，其包含根据权利要求4所述的载体。

6.一种用于制备特异性结合人NINJ-1蛋白的抗体或其片段的方法，所述方法包括以下步骤：

在表达多核苷酸的条件下培养根据权利要求5所述的细胞，从而产生包含轻链可变区和重链可变区的多肽；并且

从所述细胞或其中已培养有所述细胞的培养基回收所述多肽。

7.一种用于预防或治疗多发性硬化的药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1所述的抗体或其片段作为活性成分。

8.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1所述的抗体或其片段作为活性成分。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述组合物抑制癌症转移。

10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中，所述癌症选自由结肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、脑癌、头颈癌、恶性黑素瘤、淋巴瘤和再生障碍性贫血组成的组。

11.根据权利要求1所述的抗体或其片段在制备用于预防和治疗多发性硬化的药剂中的用途。

12.根据权利要求1所述的抗体或其片段在制备用于抑制癌症转移的药剂中的用途。

13.根据权利要求1所述的抗体或其片段在制备用于预防和治疗癌症的药剂中的用途。