KR20230117039A - Ninj1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents
Ninj1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 인간 유래 NINJ-1(Ninjurin-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편은 NINJ-1의 발현 수준을 측정하는데 이용될 수 있어, 동맥경화증 중증도 진단 등에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 NINJ1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 인간 NINJ-1에 결합하는 항체 또는 그 단편, 이의 생산 방법 및 이를 포함하는 동맥경화증 중증도 진단용 조성물에 관한 것이다.
최근 풍부하고 다양한 식생활 및 생활양식의 변화로 영양섭취는 불균형 상태가 되기 쉬우며 기계화된 현대 생활은 운동 부족을 초래하게 되었다. 그 결과 질병의 형태도 선진국형으로 변화하고 그에 따라 심혈관 질환의 이환율도 증가하고 있다. 심혈관 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환으로, 전세계적으로 가장 높은 사망의 원인이 되는 질환이다. 심혈관 질환에 속하는 주요 질병으로는 고혈압, 협심증, 심근경색증, 동맥경화증, 뇌졸중, 부정맥 등이 있다. 심혈관 질환과 관련된 위험인자는 연령, 성별, 흡연, 운동부족 및 비만 등을 원인으로 꼽힐 수 있다.
동맥경화(atherosclerosis)는 죽상경화증 또는 죽상동맥경화라고도 하며, 주로 혈관의 가장 안쪽을 덮고 있는 내막(endothelium)에 콜레스테롤이 침착하고 내피세포의 증식이 일어난 결과, "죽종(atheroma)"이 형성되는 혈관질환을 말한다. 장기간에 걸쳐 서서히 진행되고 관상동맥, 경동맥, 하복부 대동맥, 슬와동맥 등에 호발하며, 발생부위에 따라 협심증, 뇌경색, 뇌출혈, 신부전, 허혈성 사지질환, 뇌졸중 또는 심근경색 등의 치명적 질환을 유발할 수 있다.
동맥경화는 중증도에 따라 혈관이 좁아지고 막히게 되어 해당 혈관이 담당하는 부위에 혈액순환 장애가 생기고 좁아진 혈관에 의해 증상이 나타난다. 위험인자가 많을수록 동맥경화의 진전도 빨라지는 것으로 알려져 있으며, 주요 위험 인자로는 고콜레스테롤혈증, HDL 콜레스테롤 부족, LDL 콜레스테롤 과다, 높은 중성지방, 고혈압, 흡연, 당뇨병, 심혈관질환의 가족력, 연령증가, 운동부족, 과체중 및 복부비만 등이 있다. 그러나 상기 주요 위험 인자와 동맥경화의 중증도가 비례하지는 않는 바, 주요 위험 인자의 확인만으로 동맥경화의 중증도를 확인할 수 없다는 난점이 있다.
동맥경화 중증도는 치료 방법(예: 수술 방식 등)을 결정하는 중요한 요소이다. 더욱이, 중증도에 따라 주요 심 장 및 뇌혈관 질환 무병 생존율(MACCE(major adverse cardiac and cerebrovascular event)-free survival rate)이 결정되고, 뇌졸중 내지 심근경색증과 같은 매우 위험한 임상 증상발생 가능성이 급증한다. 이에, 동맥 경화 중증도를 진단하는 것은 매우 중요하다. 동맥경화 중증도 진단방법의 일환으로, 관동맥 협착의 정도를 확 인하는 방법이 있다. 그러나 관동맥 협착의 정도와 증상이 일치하지는 않는다는 점에서, 증상을 일으킬 만큼 협 착이 심하지 않거나 서서히 진행되는 관동맥 질환의 조기발견과 역학적 조사, 위험인자의 조절에 따른 관동맥 죽상경화증의 감소 등을 평가하는데 있어 관동맥 조영술의 한계점이 제기되고 있다.
이에, 동맥경화를 확인하고, 나아가 동맥경화 중증도를 정확히 진단하는 방법을 개발할 필요성이 대두되고 있다.
한편, 인간 NINJ1은 염색체 (chromosome) 9q22에 위치하고 있으며 152개의 아미노산으로 구성되어 있다. 마우스 NINJ1의 경우는 염색체 13에 위치하고 있으며 152 개의 아미노산으로 구성되어 있다. NINJ1의 아미노산 서열 (sequence)에서 두 곳의 막 통과 영역 (transmembrane domain)을 예측할 수 있다. 그리고 실험을 통하여 NINJ1이 세포막에 위치한 단백질임이 알려져 있다 (Araki, T. & Mi lbrandt, J., Neuron 17, 353-361, 1996). 이러한 사실을 통해 NINJ1의 N-말단 (terminal) 영역이 길게 세포 밖으로 뻗어 나와 있을 것으로 추측할 수 있다. NINJ1은 실험을 통하여 동종 단백질간의 결합함이 알려져 있다.
NINJ1에 대해 현재까지 연구된 바에 따르면, NINJ-1의 발현 내지 활성 정도가 동맥경화증 환자와 관상 동맥 질환 (coronary artery disease, CAD) 환자의 임상시료혈청에서 유의적으로 증가된다고 알려져 있다 (Jeon et al., Circulation 142, 736-1751, 2020; Fang, C. et al., Clinical Biochemistry 108, 50-55, 2022).
이에 본 발명자들은 인간 NINJ-1 단백질 또는 본 단백질의 동종 결합 부위에만 특이적으로 결합하는 항체를 개발하고자 연구하던 중, 본 발명에서 개시하는 특유의 CDR 서열 구성을 가지는 항체와 이의 단편이 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 인간 유래 NINJ-1 (Ninjurin-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 세포를 이용하여 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 인간 NINJ-1 특이적 검출 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 항체 또는 그 단편을 포함하는, 동맥경화증 중증도 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 바이오마커 조성물을 포함하는, 동맥경화증 중증도 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는, 동맥경화증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
1. 인간 유래 NINJ-1(NINJURIN-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
2. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL); 및
서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH);을 포함하는, 인간 유래 NINJ-1(NINJURIN-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
3. 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L1, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL); 및
서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH);을 포함하는, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
4. 위 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 동맥경화증 예방 또는 치료용인, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
5. 위 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab′, F(ab)2, F(ab′)2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 단편인 것을 특징으로 하는, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
6. 위 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 동맥경화증 중증도 진단용인, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
7. 위 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 인간 유래 NINJ-1(Ninjurin-1) 단백질은 수용성 단백질인, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
8. 위 1 내지 3 중 어느 하나의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
9. 위 8의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
10. 위 9의 벡터를 포함하는 세포.
11. 위 10의 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및
상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법.
12. 위 1 내지 3 중 어느 하나의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및
상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 인간 NINJ-1 특이적 검출 방법.
13. 위 1 내지 3 중 어느 하나의 항체 또는 그 단편을 포함하는, 동맥경화증 중증도 진단용 조성물.
14. 위 13에 있어서, 상기 동맥경화증은 세동맥 경화, 중막 경화, 내막성 동맥경화, 관상 동맥경화 및 죽상 경화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 동맥경화증 중증도 진단용 조성물.
15. 위 13의 조성물을 포함하는, 동맥경화증 중증도 진단용 키트.
본 발명은 인간 NINJ-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 그 단편은 인간 NINJ-1에 특이적으로 결합할 수 있어 동맥경화증의 중증도 진단, 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
도 1A는 human sNinj1 항체 제작을 위한 펩타이드 항원을 나타낸 도이다. 도 1B는 토끼 단일클론 항체 제작 과정 및 항체 유전자 증폭 방법을 나타낸 도이다.
도 2A는 GFP항체를 이용하여 Western blot을 통해 GFP-tagged Ninj1의 293T 세포에서의 과발현을 확인한 도이다. 도 2B는 GFP-tagged Ninj1가 과발현된 293T 세포에서 1차, 2차, 3차 면역 혈청에서 human sNinj1 특이적 항체의 생성 여부를 확인한 도이다.
도 3은 토끼 면역 Fab 라이브러리의 제작 모식도이다.
도 4는 면역된 토끼의 VH, Vkappa, Vlambda 유전자의 PCR 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 두 마리의 면역된 토끼 (토끼 면역 #1 및 #2)의 비장 cDNA로부터 구축된 면역 Fab 라이브러리 클론들의 PCR에 의한 검출 결과를 나타낸 도이다.
도 6a은 항 C12 Ninj1 항체를 protein A/G 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제한 결과를 나타낸 도이다. 도 6b는 항 B3 Ninj1 항체를 protein A/G 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제한 결과를 나타낸 도이다. 도 6c는 항 H5, C11 및 E6 Ninj1 항체를 protein A/G 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제한 결과를 나타낸 도이다 (표시된 번호는 protein A/G 친화도 크로마토그래피의 분획 번호이다).
도 7은 정제된 5종(B3, C11, E6, H5, C12)의 항 Ninj1 IgG 항체에 대하여, Ninj1을 과발현하는 세포주의 배양액에서 Ninj1을 검출할 수 있는지 Western blot으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8a는 sandwich ELISA 방법을 나타낸 도이다. 도 8b는 Ninj1을 정량분석하는 데 활용될 수 있는 항체를 확인하기 위하여 sandwich ELISA를 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 모노클로날 NINJ1 항체 C11, C12 및 rabbit polyserum을 이용한 sandwich ELISA를 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 인간 혈청(파란색) 및 PBS(오렌지색)에 희석된 NINJ1 펩타이드의 sandwich ELISA를 이용한 검출 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 C12의 친화도 최적화를 위한 경쇄 셔플링(light chain shuffling)을 수행하고, 상기 경쇄 셔플링 라이브러리의 패닝으로부터 얻어진 클론들의 경쇄 서열분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 C12에서 경쇄가 치환된 클론들인 E6, E9의 sandwich ELISA와 비특이적 결합을 확인한 도이다.
도 13은 이들 6종의 클론을 정제한 후 Sandwich ELISA 형식으로 평가하여 C12와 쌍으로 ELISA kit으로 개발될 가능성이 있는 항체를 선별한 결과를 나타낸 도이다. 상기 도출된 scFv 항체들의 sandwich ELISA 평가 결과 A4, B6 클론들이 민감도는 낮으나 hNINJ1을 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다.
도 13은 Detection antibody를 찾기 위한 패닝 과정의 모식도이다.
도 14는 도출된 scFv 항체들의 sandwich ELISA 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2A는 GFP항체를 이용하여 Western blot을 통해 GFP-tagged Ninj1의 293T 세포에서의 과발현을 확인한 도이다. 도 2B는 GFP-tagged Ninj1가 과발현된 293T 세포에서 1차, 2차, 3차 면역 혈청에서 human sNinj1 특이적 항체의 생성 여부를 확인한 도이다.
도 3은 토끼 면역 Fab 라이브러리의 제작 모식도이다.
도 4는 면역된 토끼의 VH, Vkappa, Vlambda 유전자의 PCR 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 두 마리의 면역된 토끼 (토끼 면역 #1 및 #2)의 비장 cDNA로부터 구축된 면역 Fab 라이브러리 클론들의 PCR에 의한 검출 결과를 나타낸 도이다.
도 6a은 항 C12 Ninj1 항체를 protein A/G 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제한 결과를 나타낸 도이다. 도 6b는 항 B3 Ninj1 항체를 protein A/G 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제한 결과를 나타낸 도이다. 도 6c는 항 H5, C11 및 E6 Ninj1 항체를 protein A/G 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제한 결과를 나타낸 도이다 (표시된 번호는 protein A/G 친화도 크로마토그래피의 분획 번호이다).
도 7은 정제된 5종(B3, C11, E6, H5, C12)의 항 Ninj1 IgG 항체에 대하여, Ninj1을 과발현하는 세포주의 배양액에서 Ninj1을 검출할 수 있는지 Western blot으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8a는 sandwich ELISA 방법을 나타낸 도이다. 도 8b는 Ninj1을 정량분석하는 데 활용될 수 있는 항체를 확인하기 위하여 sandwich ELISA를 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 모노클로날 NINJ1 항체 C11, C12 및 rabbit polyserum을 이용한 sandwich ELISA를 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 인간 혈청(파란색) 및 PBS(오렌지색)에 희석된 NINJ1 펩타이드의 sandwich ELISA를 이용한 검출 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 C12의 친화도 최적화를 위한 경쇄 셔플링(light chain shuffling)을 수행하고, 상기 경쇄 셔플링 라이브러리의 패닝으로부터 얻어진 클론들의 경쇄 서열분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 C12에서 경쇄가 치환된 클론들인 E6, E9의 sandwich ELISA와 비특이적 결합을 확인한 도이다.
도 13은 이들 6종의 클론을 정제한 후 Sandwich ELISA 형식으로 평가하여 C12와 쌍으로 ELISA kit으로 개발될 가능성이 있는 항체를 선별한 결과를 나타낸 도이다. 상기 도출된 scFv 항체들의 sandwich ELISA 평가 결과 A4, B6 클론들이 민감도는 낮으나 hNINJ1을 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다.
도 13은 Detection antibody를 찾기 위한 패닝 과정의 모식도이다.
도 14는 도출된 scFv 항체들의 sandwich ELISA 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 인간 유래 NINJ-1(Ninjurin-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다.
본 명세서에서, 상기 ‘닌주린 1 (Ninjurin-1, NINJ-1)’은 세포막 단백질의 일종으로, 본 발명에서 인간 NINJ-1은 천연형 또는 재조합 인간 NINJ-1을 모두 포함하는 의미하며, 당업계에 NCBI (genbank) Reference Sequence: NP_004139.2 등으로 그 천연형 단백질 서열이 공지되어있다. 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열로서 NCBI (genbank) Reference Sequence: NM_004148.3 등이 알려져있으며, 당업자는 이를 바탕으로 재조합 단백질을 수득가능하다.
NINJ-1의 아미노산 서열(sequence)에는 두 곳의 막 통과 영역(transmembrane domain)이 존재하며, NINJ-1는 세포막에 위치한 단백질임이 알려져 있다(Araki, T. & Milbrandt, J., Neuron 17, 353-361, 1996). 상기 NINJ-1의 N-말단(terminal) 영역은 길게 세포 밖으로 뻗어 나와 있으며, 상기 세포 밖으로 뻗어 나온 서열을 포함한 NINJ-1의 일부가 수용성 NINJ-1 (Soluble Ninjurin-1)으로 존재할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 인간 유래 NINJ-1단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편은 수용성 인간 유래 NINJ-1 (Ninjurin-1)단백질에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 단편은 상기 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 항체 또는 이의 단편은 가지는 특유의 가변부위 CDR 서열 구성을 통하여 다른 생물 유래 NINJ-1 단백질(특히 마우스 NINJ-1 단백질)과는 교차반응성을 보이지 않고 인간 NINJ-1 단백질에만 특이적으로 결합할 수 있어, 상기 결합에 의해 동맥경화증 중증도 진단에 이용할 수 있으며, 동맥경화증의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 항체(antibody)는 면역 글로불린(immunoglobulin, Ig)이라고도 불리며, 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자연에서 발견되는 전체 항체(whole antibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드인 경쇄(light chain, LC) 및 중쇄(heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이루어지거나, 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 한다. 포유류의 항체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 유형이 있으며, 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 등 다른 종류의 항체를 구성하게 된다. 포유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는 λ 및 κ로 표시되는 2가지 종류가 존재한다.
항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역과 불변영역으로 구분된다. 중쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변영역으로 구성되어 있으며, 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 각각 중쇄가변영역(VH) 또는 경쇄가변영역(VL)의 하나의 도메인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되어 1개의 공유 이황결합(disulfide bond)에 의해 연결되고, 경쇄와 결 합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍(HC/LC)으로 구성되어 있으므로, 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일 특이성을 갖게 된다.
항체가 항원에 결합하는 부위를 포함하는 가변영역은 서열 가변성이 적은 골격 부위(framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위(hypervariable region)인 상보성 결정부위(complementary determining region, CDR)로 세분된다. CDR-L1은 경쇄 가변 영역에서 대략 잔기 24-34에, CDR-L2는 대략 잔기 50-56에, CDR-L3은 대략 잔기 89-97에 위치하며; CDR-H1은 중쇄 가변 영역에서 대략 잔기 31-35에, CDR-H2는 대략 잔기 50-65에, CDR-H3은 대략 잔기 95-102에 위치한다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N-말단부터 C-말단의 방향으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로, 항체의 항원 특이성에 가장 중요하다.
일 실시예에서, 상기 항체 또는 그 단편은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL); 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH);을 포함할 수 있다. 이때, 상기 서열번호 6 또는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 항체 또는 그 단편은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L1, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL); 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH);을 포함할 수 있다. 이때, 상기 서열번호 7 내지 12로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 상기한 CDR의 조합의 구성을 갖는 것이라면, 그 종류에 제한이 없다. 구체적으로는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 특히 IgG 항체인 것이 바람직하다.
또한 1개의 B 세포에서 유래하는 단일클론(monoclonal, 모노클로날) 항체일 수도 있고, 복수의 B 세포에서 유래하는 다클론(polyclonal, 폴리클로날) 항체일 수도 있지만, 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 본 발명에서 '모노클로날'이라는 말은 항체가 실질적인 상동성 집단으로부터 수득되는 것과 같이 항체의 특성을 나타내는 말이며, 반드시 항체를 특정 방법에 의해 생산해야 한다는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al.(1975) Nature 256: 495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조: 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌[참조: Clackson et al.(1991) Nature 352: 624-628 및 Marks et al.(1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 및 Presta(2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731]에 기술된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 항체는 전술한 특유의 CDR 구성을 포함하는 한 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체 등의 형태를 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인간항체 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 항체의 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 구체적으로는 디아바디, Fab, Fab′, F(ab)2, F(ab′)2, Fv 및 scFv등의 형태일 수 있다.
Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.
본 발명의 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편은 동맥경화증 예방 또는 치료 용도일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체 또는 그 단편은 동맥경화증 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 명세서에서, "동맥경화(atherosclerosis)"는 죽종(atheroma)이 형성되는 것과 관련된 혈관질환을 말한다.
본 명세서에서 상기 동맥경화증은 세동맥 경화, 중막 경화, 내막성 동맥경화, 관상 동맥경화 및 죽상 경화를 포함할 수 있으며, 구체적으로, 말초 동맥 질환, 부정맥, 협심증, 심근경색증, 심부전증, 뇌졸중 등의 증상 또는 질환을 포함할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 명세서에서, "관상 동맥 질환 (coronary artery disease, CAD)"은 심장에 혈액을 공급하는 혈관, 특히 관상 동맥이 막히거나 좁아져 심장 근육에 혈액을 충분하게 공급하지 못하는 질환을 말한다.
본 발명의 명세서에서, "말초 동맥 질환 (peripheral artery disease, PAD)"은 관상 동맥과 대동맥을 제외한 전신의 말초 동맥에 발생하는 폐색질환을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 동맥경화증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 동맥경화증에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 항체 또는 그 단편은 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 구체예에서는, 수용성 NINJ-1에 결합함으로써 동맥경화증 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편은 동맥경화증 중증도 진단용인, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다.
본 발명의 명세서에서, "동맥경화의 중증도"는 동맥경화의 발병 위험의 증감 정도, 병변의 진행 정도 및 재발 위험의 증감 정도를 포함하는 의미일 수 있다. 상기 발병 위험의 증감 정도는 동맥경화가 발병할 위험이 있거나 발병한 가능성이 있는 정도를 포함하는 의미이다. 상기 병변의 진행 정도라 함은 동맥경화가 발병하여 병변이 진행되어 동맥경화가 경미한 정도 내지 심각한 정도를 포함하는 의미이다. 또한, 상기 재발 위험의 증감 정도라 함은 동맥경화 완치 판정 후 재발 위험이 있거나 재발된 가능성이 있는 정도를 포함하는 의미이다. 상기 동맥경화의 중증도는 정성적 및/또는 정량적으로 나타낼 수 있으며, 중증도는 그 정도에 따라 분류될 수 있다.
본 발명에 따른 동맥경화 중증도 진단방법은 당업계 공지된 중증도 진단방법에 대체하여 사용될 수도 있고, 당업계 공지된 중증도 진단방법과 병행하여 사용될 수도 있다. 예컨대, 관상 동맥 질환의 중증도 진단을 위해 씬택스 (SYNTAX, the Synergy between PCI with Taxus and Cardiac Surgery) 스코어를 측정하는 것이 당업계 공지되어 있으며, 씬택스 스코어가 높을수록 관상 동맥 질환의 중증도가 심각한 것으로 진단한다.
일 실시예에 따르면, Ninj1의 발현양과 씬택스 스코어는 정비례의 상관관계를 가지는 것으로 확인하였다.
또한, 예컨대, 말초 동맥 질환의 중증도 진단을 위해 TASC (Trans-Atlantic Inter-Society Consensus)를 측정하는 것이 당업계 공지되어 있으며, TASC로 분류된 비율이 높을수록 말초 동맥 질환의 중증도가 심각한 것으로 진단한다. 당업계에서는 TASC의 분류 중에서도, TASC A에서 TASC D 로 갈수록 심각한 것으로 판단한다.
일 실시예에 따르면, Ninj1의 발현양과 TASC로 분류된 비율은 정비례의 상관관계를 가지는 것으로 확인하였다.
본 발명의 명세서에서, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 상기 진단은 발병 여부뿐만 아니라 예후, 동맥경화의 경과, 병기 등을 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 목적상, 진단은 동맥경화의 중증도를 정확하게 구별하여 진단하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, " NINJ-1"은 동맥경화증 중증도 진단을 위한 바이오 마커로 사용될 수 있다. 상기 NINJ-1는 본 단백질을 갖는 동물의 NINJ-1이라면 한정하지 않으며, 예컨대 인간 또는 마우스의 NINJ-1을 칭할 수 있다. 또한, 본 발명의 목적 달성이 가능한, 상기 NINJ-1는 전체 및 이의 단편을 포함한다. 구체적으로, NINJ-1 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 여기서 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 NINJ-1 유래 펩티드는 NINJ-1 단백질을 조각내어 획득할 수 있으며, 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques) 또는 액상 합성 기술에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 명세서에서, "바이오 마커"라 함은 진단용 마커 또는 진단 마커로도 쓰일 수 있으며, 시료에서 동맥경화증 중증도를 구분하여 진단할 수 있는 물질을 말한다.
본 발명의 목적상, 본 발명의 동맥경화 진단용 바이오 마커는 정상 대조군에 비하여 동맥경화증 환자의 시료에서 NINJ-1 가 특이적으로 높은 수준의 발현 또는 활성 수준을 보이는 것; 동맥경화 중증도가 경미한 환자의 시료에 비하여 동맥경화 중증도가 심각한 환자의 시료에서 NINJ-1가 특이적으로 높은 수준의 발현 또는 활성 수준을 보이는 것; 또는 동맥경화 재발 가능성이 낮은 환자의 시료에 비하여 동맥경화 재발 가능성이 높은 환자의 시료에서 NINJ-1 가 특이적으로 높은 수준의 발현 또는 활성 수준을 보이는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서 용어‘폴리뉴클레오티드’는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를 들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(double-stranded)이 될 수 있다.
본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이라면, 그 서열이 특별히 제한되지 아니한다. 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 전술한 본 발명의 항체 전장 서열, 또는 중쇄 및 경쇄의 일부분(특히 중쇄가변부위 및 경쇄가변부위를 포함하는 영역)에 해당하는 아미노산 서열에 근거하여 코돈을 분석하고, 이들 코돈분석을 통해 mRNA 또는 cDNA 구성할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 올리고 뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 재조합 발현 벡터로서, 본 발명에서 '재조합(recombinant)'은 '유전자 조작(genetic manipulation)'과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다.
본 발명에서 발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
본 발명에서 '재조합 발현 벡터'란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. '작동가능하게 연결된(operably linked)'이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현조절서열(expression control sequence)'이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 따라서 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는, 전술한 바와 같이 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 특유의 CDR 구성을 갖는 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 의미한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, pcDNA 등을 사용할 수 있다.
벡터의 일종인 플라스미드(plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스성 벡터(viral vector; 예를 들어, 복제-결핍 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스들 및 아데노-연관 바이러스들(adenoassociated viruses))이며, 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러스성 게놈(viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 벡터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포(예를 들어, 박테리아 유래(bacterial origin) 및 에피좀의 포유류 벡터(episomal mammalian vectors)를 포함하는 박테리아성 벡터들(bacterial vectors)) 내에서의 자가복제(autonomous replication)를 할 수 있다. 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피좀의 포유동물 벡터들(non-episomal mammalian vectors))이 숙주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈 내로 통합(integrated)되고 그리고 그에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.
본 발명에 따른 항체의 중쇄와 경쇄, 또는 이들의 단편(특히 중쇄가변부위 및 경쇄가변부위를 포함하는 단편)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 각각 별개의 재조합 발현 벡터에 포함되어 있을 수도 있고, 하나의 재조합 발현 벡터에 포함되어 있을 수도 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 즉, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 세포(숙주세포)는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
본 목적에 적합한 원핵생물은 이에 제한되지 않으나, 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새(Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아(Escherichia), 예를 들어 E.coli, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 섭틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사(P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 벡터를 발현가능 한것이면, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이. 콜라이, 이에 한정되지 아니하나 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) ER2537, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537), 이. 콜라이 W3110(ATCC 27,325) 또는 LacZ가 발현 가능한 이. 콜라이일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 이. 콜라이 ER2537일 수 있다.
본 목적에 적합한 진핵생물은 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K.lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia(EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(nidulans) 및 에이. 니거(niger)가 사용 가능하다.
한편 본 발명의 세포는 동물세포 특히 척추동물(포유동물) 세포일 수 있다. 배양(조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었고 기술들이 폭넓게 이용가능하다. 이에 제한되지 아니하나, 유용한 포유동물 숙주 세포의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라이(현탁 배양으로부터 서브클로닝된 293 또는 293 세포[Graham 등, 1977, J Gen Virol. 36: 59]), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL10), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR"(CHO, Urlaub 등, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; 예를 들어, DG44), 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), 원숭이 신장 세포(CVl ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 경부 암세포(HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 랫트 간세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포(Hep G2, HB 8065), 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51), TRI 세포(Mather 등, 1982, Annals NY. Acad. Sci. 383: 44-68), MRC 5 세포, FS4 세포, 인간 간암 세포주(Hep G2), HEK 293 cell(human embryonic kidney cell) 및 Expi293FTM cell일 수 있으며, 바람직하게는 CHOcell, HEK 293 cell(human embryonic kidney cell) 또는 Expi293FTM cell일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 세포는 전술한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염(transfected)될 수 있는 배양된 세포이고, 이는 계속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세포는 발현되어야 할 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한다.
상기 세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등은 당업계에서 통상 사용되는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄(Ham's) F1O(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 최소 필수 배지(MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코(Dulbecco's) 개질 이글(Eagle's) 배지(DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양하기에 적합하다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 염, 완충액, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.
한편 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 파지 디스플레이 방법 또는 효모 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. scFv를 제조하는 방법으로는 미국특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호에 기재된 방법이 사용될 수 있으며, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하기 위한 방법으로는 WO 92/22324 등에 기재된 방법이 사용될 수 있다.
본 발명 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. 전술한 바와 같이 본 발명의 항체 또는 그 단편은 항원 인식과 결합에 중요한 부위(CDR 및 이를 포함하는 가변부위)의 아미노산 서열이 특정되어 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 본 발명의 항체를 용이하게 반복적으로 대량생산할 수 있다.
본 발명 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산 서열이 추가로 결합된 것일 수 있다. 이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다.
상기 배양은 상기 세포의 종류에 따라 배지조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며, 세포에 따른 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건은 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있으며, 본 발명 세포의 배양 배지와 관련하여 전술한 예시를 참조로 할 수 있다.
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지(supernatant)로 표적화(targeted)될 수 있으며, 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩(refolding)시키고 기능적 형태(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우, 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고, 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.
상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 항체 또는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 필터(한외여과 등) 또는 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 그 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 NINJ-1과 특이적으로 결합하므로 예를 들어, 특정 세포, 조직, 또는 혈청 내 인간 NINJ-1 단백질의 존재(또는 발현)을 검출하고 정량하기 위한 진단 분석에 유용하다.
본 발명에서 용어 ‘분석’은 바람직하게‘측정’을 의미하는 것일 수 있고, 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 인간 NINJ-1 특이적 검출 방법을 제공한다.
상기 항체 또는 그 단편을 '검출'하기 위하여, 항체 또는 그 단편은 일반적으로 검출가능 모이어티로 표지될 수 있다.
예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen 등, Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs]에 기술된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 방사능은, 예를 들어, 신틸레이션 계수(scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.
또는 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 제4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린(luciferin), 2,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게나제, 유라제(urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제(예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제(예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 예를 들어, 문헌 [O'Sullivan 등, 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym.(J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N. Y., 73: 147-166]에 기술되어 있다.
표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 바이오틴에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는, 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐(hapten)(예를 들어, 딕옥신 [digoxin])과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항-합텐 항체에 접합될 수 있다(예컨대, 항-딕옥신 항체). 따라서, 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 상기 항체 또는 그 단편의 검출 방법은, 당업계에 항체를 사용하는 검출 방법이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunospecific assay), 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역염색법(면역조직화학염색 및 면역형광염색 등 포함), 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 단백질 칩방법 중 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 진단 키트 즉, 진단 분석을 수행하기 위한 진단 키트, 즉 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에, 키트는 기질 및 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자(cofactor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액(예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 충분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 "동맥경화 중증도 진단용 키트"에는 NINJ-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성 수준을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
기존에 NINJ-1 은 동맥경화증 환자에서 그 수준이 상향 조절(up-regulation)되어 있는 것으로 알려져 있으며, 구체적으로 동맥경화 증상을 완화하기 위해 수용성 NINJ-1의 수준이 상향 조절될 수 있다. 따라서 NINJ-1 동맥경화증의 진단, 병의 진행 상태 및 치료 전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다. 즉, 동맥경화증의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에서 NINJ-1 단백질을 검출함으로써 수행될 수 있다. 따라서 전술한 본 발명의 인간 NINJ-1 특이적 검출 방법은 잠재 환자로부터 채취된 시료로부터 인간 NINJ-1의 발현 수준을 측정하여 다발성 경화증의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로 이용가능하다.
상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직(특히 신경조직), 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다. 상기 검출에 관하여는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 포함하는, 동맥경화증 중증도 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 NINJ-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편은 동맥경화증 중증도 진단을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 (a) 시료에서 NINJ-1의 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서의 발현 또는 활성 수준이 대조군에서의 NINJ-1의 발현 또는 활성 수준과 비교하여 증가된 경우, 동맥경화 중증도가 심각한 것으로 진단하는 단계;를 포함하는, 동맥경화증 중증도 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다. 단, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 하기 단계는 변형, 추가 내지 대체되어 실시될 수 있다.
본 발명의 명세서에서, "시료"는 동맥경화 중증도를 진단하기 위한 대상체(환자)의 NINJ-1 이 포함된 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 또는 타액 등을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, NINJ-1 의 발현 또는 활성 수준을 확인하기 위해, NINJ-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제가 사용된다.
상기 " NINJ-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제"는 NINJ-1의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하여, NINJ-1의 발현 또는 활성 수준을 확인함으로써 NINJ-1의 검출에 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예컨대, NINJ-1에 특이적으로 결합하는 올리고펩티드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 명세서에 있어서, " NINJ-1의 발현 또는 활성 수준을 측정"이란, 동맥경화를 진단하기 위하여 시료에서 NINJ-1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 존재 여부와 발현 정도 또는 활성 정도를 확인하는 과정일 수 있으며, 예컨대 상기 NINJ-1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA에 대하여 특이적으로 결합하는 분자를 이용하여 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 양 또는 활성 수준을 확인하는 방법이 적용될 수 있다.
NINJ-1 단백질의 발현 또는 활성 수준을 확인하기 위한 방법으로는, 예컨대 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, NINJ-1 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 또는 활성 수준을 확인하기 위한 방법으로는, 예컨대, 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응 (competitive RT-PCR), 실시간중합효소반응(real time RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 유전자 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계에 있어서, 용어 "대조군"에는 동맥경화가 아닌 정상 대조군, 동일 환자에게서 다른 시기에 채취한 시료군 또는 다른 동맥경화 환자에게서 채취한 시료군이 포함된다.
본 발명의 명세서에 있어서, "동맥경화 중증도가 심각(하다)"은 동맥경화 중증도가 상위 수준인 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 대조군과 비교하여 NINJ-1의 발현 또는 활성 수준이 증가된 경우, 동맥경화 중증도가 심각한 것으로 진단한다. 예컨대, 대조군 별로, 동맥경화가 아닌 정상 대조군에 비하여 동맥경화증 환자의 시료에서 NINJ-1의 발현 또는 활성 수준이 증가된 경우, 동맥경화 중증도가 심각한 것으로 진단한다. 또한, 동일 환자에게서 다른 시기에 채취한 시료군에 비하여 본 방법 실시 시에 채취한 시료군에서 NINJ-1의 발현 또는 활성 수준이 증가된 경우, 동맥경화 중증도가 심각한 것으로 진단한다. 여기서, 용어 "다른 시기"에는 동맥경화 환자의 치료 시작 전, 치료 중, 치료 후 완치 후, 완치 후 재발 가능성이 있는 시기 등이 포함될 수 있다. 또한, 다른 동맥경화 환자에게서 채취한 시료군에 비하여 본 방법 실시 시에 채취한 시료군에서 NINJ-1의 발현 또는 활성 수준이 증가된 경우, 동맥경화 중증도가 심각한 것으로 진단한다.
또한, 본 발명은 (a) 후보물질 처리 후 NINJ-1의 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서의 발현 또는 활성 수준이 하향된 경우, 후보물질을 동맥경화 예방 또는 치료용 물질로 선택하는 단계;를 포함하는 동맥경화증 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 단, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 하기 단계는 변형, 추가 내지 대체되어 실시될 수 있다.
본 방법에 따르면, 동맥경화 중증도에 따라, 치료 또는 예방 물질을 적절히 선별할 수 있다.
본 발명의 명세서에 있어서, "후보물질"은 뉴클레오티드, DNA, RNA, 아미노산, 압타머, 단백질, 화합물, 천연물, 천연추출물 등일 수 있으며, 동맥경화 예방 또는 치료용으로 사용가능한 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 명세서에서, NINJ-1의 발현 또는 활성 수준이 하향되면, 동맥경화 중증도가 경미해진(하향된) 것으로 볼 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 NINJ-1에 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편의 동맥경화증 예방 또는 치료용 제제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 동맥경화증 표적 치료제로서의 Ninjurin-1 항체 개발
실시예 1.1. Human Ninj1 extracellular domain peptide를 이용한 토끼의 면역
Human Ninjurin1의 extracellular domain 부분인 수용성 Ninj1 (soluble Ninjurin1, sNinj1; 아미노산 1-56, N-mdsgteeyel ngglppgtpg spdasparwg wrhgpinvnh yaskksaaes mldial-C)을 합성하고, C말단의 시스테인 잔기 곁사슬을 통하여 carrier protein인 KLH (keyhole limpet hemocyanin)에 conjugation하여 토끼 2마리에 면역 반응을 수행하였다 (도 1 참조).
면역 반응을 수행한 토끼의 혈청에서 생성된 항 Ninj1 항체를 Western blot으로 확인하였다. GFP-hNinj1을 형질도입(transfection)한 293T cell lysate에서 예상되는 분자량에 나타나는 밴드를 확인하였으며, 밴드의 세기가 약하게 관찰되었다 (도 2A 참조). 상기 결과는 낮은 친화도를 가지는 항체가 생성되었거나 혈청 내의 항 Ninj1 항체의 농도가 낮기 때문인 것으로 확인하였다.
또한, GFP-tagged Ninj1가 과발현된 293T 세포에서 1차, 2차, 3차 면역 혈청에서 인간 sNinj1 특이적 항체가 생성됨을 확인하였으나 (도 2B 참조), 같은 혈청을 사용하여 인간 혈청 내의 Ninj1을 Western blot으로 검출하고자 시도하였을 때는 검출되지 않았다.
실시예 1.2. 토끼 면역 Fab 항체 라이브러리의 구축
인간 Ninj1 펩타이드를 이용하여 면역화된 토끼의 비장을 균질화(Homogenization)한 뒤, 트리졸을 이용하여 균질화된 비장 조직으로부터 전체 RNA를 분리하였다. Oligo(dT) 프라이머를 이용하여 상기 전체 RNA를 주형가닥으로 하는 역전사 PCR을 수행하여 cDNA를 얻었다. 그 후, 토끼의 항체 가변부위에 맞게 설계된 프라이머 조합을 이용하여 VH, VL 유전자를 PCR을 통해 증폭하는 방식으로 토끼 면역 Fab 라이브러리를 제작하였다 (도 3 참조).
overlap extension PCR을 통해 인간 항체의 CH1, Ckappa 유전자와 상기 PCR을 통해 증폭된 VH, VL 유전자를 연결하고, 이로부터 얻어진 각각의 Fd, LC를 다시 overlap extension PCR로 연결하여 Fab 절편 라이브러리를 수득하였다 (도 4 참조). 이때, 수득된 DNA 산물의 형태는 LC-ribosome binding site (RBS)-pelB signal sequence-Fd의 순서로 구성되어 있도록 하였다. 또한, 상기 수득된 DNA 산물을 클로닝할 pComb3X 에는 LC의 periplasmic export를 위한 ompA signal sequence와 정제, 검출을 위한 His6, HA tag 및 amber stop codon (TAG)가 포함될 수 있도록 하였다.
SfiI 제한효소를 이용하여 상기 제작된 Fab 절편 라이브러리 및 pComb3X 파지미드 벡터를 절단한 뒤에, 상기 벡터에 Fab 절편 라이브러리를 라이게이션하였다. 이후, Fab 절편 라이브러리가 포함된 벡터를 TG-1 대장균에 형질도입하고 107 이상 수준 (토끼 #1: 3x107, 토끼 #2: 4x107)의 토끼 면역 Fab 라이브러리를 획득하였다. 그런 다음, 파지 디스플레이된 Fab 라이브러리를 표준 프로토콜을 사용하여 레스큐(Rescue)하였다. pComb3X 파지미드 벡터 서열에 annealing 하는 프라이머 쌍을 이용하여 전기영동을 수행한 뒤에 밴드를 확인하였다 (도 5 참조).
그 결과, Fab을 포함하는 ~2,000 bp에 해당하는 밴드들이 모든 클론들에서 검출되어 형질도입된 라이브러리는 Fab 유전자가 잘 클로닝되어 있음을 확인하였다.
실시예 1.3. 토끼 면역 Fab 라이브러리로부터 항 Ninj1 항체의 선별
실시예 1.3.1. hNinj1-BSA을 이용한 패닝
면역된 토끼 #2로부터 획득한 라이브러리를 사용하여, hNinj1 펩타이드를 BSA에 conjugation 한 항원을 immunotube에 코팅한 후 패닝을 통하여 항 Ninj1 항체의 선별을 시도하였다.
4차에 걸쳐 패닝을 수행하였으나 output titer가 지속적으로 감소하는 패턴을 보였으며 4차 패닝으로부터 도출된 클론들을 ELISA로 스크리닝하였을 때 유효한 결합 신호가 나타나는 클론은 확인되지 않았다.
그 결과를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
| Immune | input | 10 -5 |
| 1st | 1.39x1014 | 1.91x108 |
| 2nd | 1.14x1013 | 9.70x106 |
| 3rd | 4.90x1012 | 7.60x106 |
| 4th | 1.31x1013 | 3.60x106 |
| Ratio | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 0.96 | 1.06 | 0.65 | 0.86 | 1.11 | 0.90 | 0.89 | 0.91 | 0.59 | 0.68 | 0.89 | 0.85 |
| B | 0.96 | 0.95 | 0.98 | 0.98 | 0.98 | 0.99 | 1.00 | 0.96 | 0.78 | 0.67 | 1.02 | 1.06 |
| C | 0.98 | 0.99 | 0.57 | 0.76 | 0.95 | 0.94 | 1.00 | 0.99 | 0.98 | 0.71 | 0.95 | 0.95 |
| D | 0.99 | 1.29 | 1.02 | 0.45 | 1.58 | 1.06 | 0.97 | 1.00 | 1.02 | 0.98 | 1.00 | 0.96 |
| E | 0.95 | 0.96 | 0.97 | 0.97 | 0.76 | 0.89 | 0.98 | 0.95 | 0.99 | 0.95 | 0.98 | 0.99 |
| F | 1.00 | 1.02 | 1.02 | 1.00 | 0.91 | 1.02 | 0.97 | 0.95 | 0.74 | 0.99 | 0.76 | 1.03 |
| G | 1.03 | 1.02 | 0.98 | 0.72 | 0.77 | 1.03 | 0.99 | 1.04 | 1.00 | 1.00 | 0.99 | 1.00 |
| H | 1.06 | 1.05 | 1.04 | 1.03 | 0.98 | 1.04 | 1.01 | 1.01 | 0.90 | 1.03 | 1.04 | 1.06 |
표 2는 4차 패닝 output으로부터 96개의 클론들을 ELISA 스크리닝하여 얻어진 시그널 비율((hNinj1 /control ratio)을 나타낸다.
실시예 1.3.2. Biotinylated hNinj1펩타이드를 이용한 면역 토끼 Fab 라이브러리 패닝
면역된 토끼 #1, #2로부터 획득한 항체 라이브러리를 하나로 합하여 hNinj1에 대한 패닝을 다시 진행하였다. Immunotube에 항원을 코팅하는 방식으로 항체를 획득하는 데 실패하였기 때문에, hNinj1 extracellular domain의 C 말단에 lysine 잔기를 추가하고 여기에 biotinylation한 항원을 새로 제작하였다 (N-mdsgteeyel ngglppgtpg spdasparwg wrhgpinvnh yaskksaaes mldialk-biotin-C). Streptavidin-conjugated magnetic beads (Bioneer 사)를 사용하여 beads 표면에 biotinylation된 항원을 포획하고, 여기에 결합하는 파지 항체 클론을 magnet을 이용하여 분리하는 방식으로 선별을 진행하였다.
5차에 걸쳐 패닝을 진행하였으며 4차 이후 output titer가 증가한 양상을 보였다. 그러나 4차 및 5차 패닝의 output clone들을 대상으로 효소결합면역흡착분석(ELISA)을 진행하였을 때 역시 hNinj1 특이적 결합을 나타내는 클론은 발견되지 않았다 (표 3 및 표 4 참조).
| Immune | input | output |
| 1st | 2.93x1012 | 1.03x107 |
| 2nd | 1.29x1013 | 1.20x106 |
| 3rd | 1.74x1012 | 6.00x105 |
| 4th | 4.20x1011 | 5.64x107 |
| 5th | 5.50x1011 | 2.71x107 |
| Ratio | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1.06 | 1.02 | 1.04 | 1.08 | 1.01 | 1.05 | 1.05 | 1.05 | 1.05 | 1.09 | 1.01 | 1.09 |
| B | 1.00 | 1.00 | 1.02 | 1.02 | 1.04 | 1.02 | 1.08 | 1.02 | 1.34 | 1.04 | 1.38 | 0.87 |
| C | 0.99 | 1.02 | 1.05 | 1.03 | 1.03 | 1.04 | 1.05 | 1.04 | 1.05 | 1.14 | 1.12 | 1.07 |
| D | 0.98 | 1.02 | 1.02 | 1.02 | 0.98 | 0.98 | 1.02 | 1.01 | 1.03 | 1.05 | 1.03 | 0.96 |
| E | 0.95 | 1.02 | 0.99 | 0.98 | 0.99 | 1.02 | 1.05 | 0.99 | 1.03 | 1.06 | 1.01 | 1.01 |
| F | 0.99 | 1.00 | 0.99 | 0.94 | 1.00 | 1.02 | 1.00 | 1.00 | 1.03 | 1.01 | 1.00 | 1.05 |
| G | 1.02 | 0.99 | 1.01 | 1.00 | 1.03 | 1.01 | 1.08 | 1.02 | 1.02 | 1.05 | 1.04 | 1.14 |
| H | 1.11 | 1.04 | 1.02 | 1.02 | 0.99 | 1.02 | 1.00 | 1.01 | 1.04 | 1.03 | 1.07 | 1.26 |
실시예 1.3.3. Biotinylated hNinj1 펩타이드와 M280-streptavidin beads를 이용한 면역 토끼 Fab 라이브러리 패닝
Magnetic beads를 M280-streptavidin (Thermo 사)로 교체하여 동일한 패닝을 다시 수행하였음. Output titer가 1-3차에서 계속 증가하며 4차에서 유지되는 패턴을 보였으며, 4차 패닝의 ELISA 스크리닝 결과 6개의 클론들(A4, C12, E5, F2, G2, H7)이 blank control 대비 높은 시그널을 보였다 (표 5 및 6 참조).
| Immune | input | 10 -5 |
| 1st | 1.64x1012 | 4.00x105 |
| 2nd | 3.40x1011 | 1.50x106 |
| 3rd | 5.50x1011 | 8.83x107 |
| 4th | 4.30x1011 | 4.47x107 |
| Ratio | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 0.87 | 1.00 | 0.94 | 28.16 | 0.90 | 0.82 | 0.55 | 0.65 | 0.71 | 1.01 | 0.81 | 0.79 |
| B | 0.95 | 0.84 | 1.00 | 0.72 | 0.97 | 0.84 | 0.67 | 0.98 | 1.04 | 1.02 | 1.04 | 0.90 |
| C | 0.90 | 0.97 | 0.99 | 1.02 | 0.99 | 1.02 | 0.97 | 0.98 | 1.03 | 1.02 | 1.01 | 5.09 |
| D | 0.68 | 0.92 | 1.00 | 1.02 | 1.41 | 0.81 | 0.87 | 1.04 | 1.04 | 1.07 | 1.08 | 1.23 |
| E | 0.82 | 0.94 | 0.71 | 0.98 | 5.15 | 1.13 | 2.03 | 1.21 | 2.09 | 2.18 | 2.19 | 1.86 |
| F | 0.99 | 25.63 | 0.99 | 0.97 | 1.71 | 2.65 | 3.09 | 2.98 | 3.37 | 3.56 | 3.22 | 2.53 |
| G | 0.96 | 10.60 | 1.01 | 1.50 | 2.64 | 4.58 | 6.09 | 5.35 | 5.37 | 5.76 | 5.60 | 3.88 |
| H | 0.83 | 1.00 | 1.06 | 1.52 | 2.25 | 3.48 | 10.85 | 3.94 | 5.69 | 4.32 | 2.52 | 2.39 |
biotinylated hNinj1 펩타이드와 M280-streptavidin beads를 이용한 면역 토끼 Fab 라이브러리 4차 패닝을 통해 높은 signal을 보이는 6개의 클론들(A4, C12, E5, F2, G2, H7)을 서열분석 하였으며, 이 중 3개의 클론 (C12, G2, H7)의 서열의 전부 혹은 일부를 스크리닝할 수 있었다. C12와 G2는 동일 서열로 나타났으며 이는 패닝이 정상적으로 이루어졌고, 이러한 결과는 이들이 hNinj1에 특이적으로 결합하는 항체임을 시사한다. H7은 중쇄 가변부위의 서열만 스크리닝되었으나 나머지 두 클론과는 상이함을 확인할 수 있었다 (표 7 참조).
C12 및 G2의 서열에서 CDR-L2는 특이하게 10개의 아미노산으로 이루어짐을 확인하였고, 거의 모든 항체에서 CDR-L2의 길이가 7개임을 감안하였을 때 이는 드물게 관찰되는 서열에 해당한다. 상기 서열에 대한 확인 결과, 토끼의 IGVL5S10 유래인 것으로 나타났으며, N 말단 부위는 PCR 증폭시의 mispriming으로 인한 서열 변화가, CDR과 FR3 부위는 somatic hypermutation에 의한 변화가 일어난 것으로 확인되었다. 항 hNinj1 항체인 G2 아미노산 서열 (서열번호 16)와 토끼의 IGVL5S10 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 17) alignment는 다음과 같았다.
실시예 2. 합성 항체 라이브러리에서의 항 Ninj1 항체의 도출
N 말단에 biotinylation 된 hNinj1 (2-56) 펩타이드를 포획하고, 이에 대하여 합성 인간항체 scFv 라이브러리를 3회에 걸쳐 패닝하였다. 항체 라이브러리로 OPAL, OPALS-K, OPALS-L 및 VH3VL1 4종을 사용하였고, 패닝의 결과값(output)에 대하여 ELISA 스크리닝을 실시하였다. 상기 OPAL 항체 라이브러리 (표 8 및 9), OPALS-K 항체 라이브러리 (표 10 및 11), OPALS-L 항체 라이브러리 (표 12 및 13) 및 VH3VL1 항체 라이브러리 (표 14 및 15)의 hNinj1 펩타이드에 대한 패닝 및 스크리닝 결과는 하기와 같았다.
| OPAL | input | 10 -5 | 10 -6 |
| 1st | 7.80x1011 | 9.10x106 | 1.00x106 |
| 2nd | 3.10x1011 | 1.91x108 | 4.52x108 |
| 3rd | 1.60x1011 | >108 | 1.02x109 |
| Ratio | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 2.52 | 1.19 | 1.35 | 1.40 | 1.27 | 1.32 | 1.12 | 0.92 | 2.44 | 16.21 | 1.07 | 1.10 |
| B | 3.83 | 1.02 | 1.06 | 1.01 | 2.06 | 1.01 | 1.10 | 0.93 | 16.12 | 0.87 | 1.05 | 0.97 |
| C | 0.90 | 1.09 | 1.06 | 1.52 | 1.41 | 1.08 | 1.02 | 15.32 | 0.82 | 1.06 | 1.07 | 1.19 |
| D | 0.91 | 1.00 | 1.23 | 1.42 | 1.09 | 1.16 | 2.08 | 2.00 | 0.94 | 1.03 | 1.50 | 0.95 |
| E | 0.98 | 1.15 | 1.00 | 15.30 | 2.61 | 1.05 | 1.09 | 1.18 | 1.03 | 2.22 | 1.12 | 1.12 |
| F | 0.79 | 1.02 | 1.28 | 1.55 | 9.80 | 1.00 | 1.92 | 0.96 | 2.75 | 1.11 | 1.13 | 5.46 |
| G | 3.41 | 1.57 | 1.15 | 1.20 | 1.89 | 4.84 | 1.03 | 2.12 | 3.24 | 2.93 | 1.89 | 0.82 |
| H | 0.62 | 0.79 | 0.99 | 1.22 | 1.35 | 4.65 | 1.24 | 1.30 | 2.12 | 2.23 | 1.43 | 1.01 |
| OPALS-Κ | input | 10 -5 | 10 -6 |
| 1st | 1.12x1012 | 3.30x106 | 6.00x106 |
| 2nd | 6.10x1011 | 7.60x106 | 1.00x106 |
| 3rd | 4.00x1010 | >108 | 1.47x107 |
| Ratio | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1.04 | 1.46 | 1.73 | 5.89 | 2.58 | 1.28 | 1.35 | 10.29 | 11.05 | 11.12 | 6.12 | 10.38 |
| B | 10.37 | 15.33 | 3.15 | 1.20 | 1.57 | 4.06 | 12.21 | 9.50 | 12.64 | 13.60 | 11.08 | 10.13 |
| C | 9.00 | 9.73 | 6.53 | 1.25 | 1.20 | 1.17 | 13.77 | 13.69 | 9.82 | 8.43 | 5.79 | 15.60 |
| D | 6.17 | 1.25 | 1.07 | 1.06 | 1.03 | 13.78 | 10.59 | 15.49 | 12.09 | 3.85 | 7.56 | 1.44 |
| E | 11.27 | 9.95 | 8.96 | 0.92 | 1.06 | 3.36 | 5.27 | 1.04 | 16.79 | 13.27 | 17.18 | 14.94 |
| F | 2.65 | 3.59 | 3.57 | 6.97 | 1.14 | 1.29 | 8.38 | 6.62 | 6.97 | 10.73 | 3.32 | 16.62 |
| G | 1.80 | 3.32 | 14.42 | 17.13 | 7.80 | 5.54 | 2.95 | 2.00 | 14.39 | 15.79 | 7.89 | 2.21 |
| H | 1.27 | 8.09 | 8.71 | 1.34 | 10.31 | 10.41 | 7.40 | 17.10 | 1.57 | 9.53 | 7.43 | 7.95 |
| OPALS-λ | input | 10 -5 | 10 -6 |
| 1st | 1.43x1012 | 1.20x106 | 0 |
| 2nd | 7.00x1010 | 1.92x107 | 8.00x106 |
| 3rd | 1.30x1011 | >108 | 5.37x108 |
| 4th | 1.20x1011 | 1.10x108 | 1.00x106 |
| Ratio | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1.63 | 2.77 | 3.18 | 2.53 | 1.57 | 3.31 | 2.69 | 2.13 | 0.83 | 2.27 | 1.66 | 0.95 |
| B | 3.03 | 2.65 | 2.37 | 2.08 | 2.12 | 1.02 | 1.71 | 1.02 | 1.00 | 1.08 | 2.43 | 1.99 |
| C | 1.76 | 1.00 | 1.96 | 1.58 | 1.25 | 1.04 | 1.08 | 1.40 | 1.36 | 2.64 | 2.99 | 1.30 |
| D | 4.14 | 1.23 | 1.45 | 1.54 | 1.04 | 1.18 | 1.01 | 0.99 | 1.45 | 1.12 | 1.12 | 1.51 |
| E | 1.75 | 3.53 | 1.03 | 1.07 | 1.75 | 1.05 | 1.42 | 1.19 | 1.02 | 1.17 | 1.18 | 1.65 |
| F | 1.74 | 4.34 | 4.21 | 1.04 | 2.81 | 1.08 | 1.46 | 1.79 | 1.08 | 2.20 | 1.09 | 1.43 |
| G | 2.04 | 2.09 | 1.00 | 1.05 | 1.55 | 1.88 | 1.50 | 1.68 | 1.80 | 4.65 | 1.80 | 1.00 |
| H | 1.62 | 1.18 | 1.21 | 0.97 | 1.69 | 0.80 | 1.08 | 1.62 | 1.28 | 1.42 | 1.00 | 0.95 |
| VH3VL1 | input | 10 -5 | 10 -6 |
| 1st | 3.18x1012 | 1.33x108 | 1.05x108 |
| 2nd | 2.16x1014 | 1.99x107 | 1.90x107 |
| 3rd | 1.99x1012 | 1.50x108 | 4.83x108 |
| 4th | 1.19x1013 | 2.55x108 | 4.78x108 |
| Ratio | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 3.60 | 4.73 | 4.55 | 5.11 | 2.55 | 1.51 | 2.13 | 2.22 | 4.53 | 2.03 | 2.94 | 1.58 |
| B | 3.26 | 2.78 | 5.12 | 5.77 | 3.69 | 4.52 | 2.92 | 3.40 | 1.86 | 3.25 | 1.14 | 4.16 |
| C | 2.75 | 3.49 | 5.92 | 3.82 | 3.71 | 2.88 | 2.12 | 5.09 | 3.03 | 3.47 | 6.18 | 4.74 |
| D | 4.61 | 3.29 | 3.88 | 4.33 | 4.46 | 3.87 | 1.51 | 2.17 | 3.08 | 1.61 | 0.93 | 1.13 |
| E | 4.39 | 2.64 | 3.96 | 4.02 | 2.22 | 5.62 | 2.55 | 2.23 | 1.87 | 2.31 | 2.01 | 1.83 |
| F | 1.36 | 4.00 | 4.39 | 3.03 | 5.13 | 4.90 | 3.53 | 2.86 | 4.35 | 3.95 | 4.88 | 3.04 |
| G | 1.84 | 1.40 | 2.09 | 1.77 | 2.39 | 3.20 | 3.35 | 1.55 | 3.16 | 2.59 | 1.11 | 1.13 |
| H | 3.60 | 4.41 | 2.34 | 3.21 | 4.23 | 1.17 | 2.89 | 1.55 | 3.33 | 3.20 | 1.01 | 0.93 |
그 결과, 총 10종의 항 Ninj1 항체서열을 확보하였다. 상기 합성 인간항체 라이브러리로부터 도출된 클론들 중 VH3VL1으로부터 얻어진 3종(B3, C11, E6)에 대해서는 IgG로 변환하여 발현, 정제 후 추가적인 분석을 수행하였다.
또한, 두 라이브러리를 혼합하고 이를 합성 항체 라이브러리와 동일한 방식으로 패닝하고 ELISA 스크리닝을 하였으며, 그 결과 4차에서 모든 클론들이 ELISA 양성을 나타냄을 확인하였다. 따라서 면역항체 라이브러리로부터 2종의 Fab(C12, H5)를 선택하여 IgG로 전환하고 추가적인 분석을 수행하였다.
실시예 3. IgG 항체의 생산
Ninj1 항체 유전자가 클로닝된 발현벡터를 ExpiCHO 세포주에 co-transfection 하고, 8 내지 10일동안 배양 후 배양액으로 분비된 Ninj1 IgG 항체를 protein A/G 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
구체적으로, 면역 항체 라이브러리로부터 도출된 C12 및 H5 (서열번호 18 내지 21), 합성 항체 라이브러리(VH3VL1)로부터 도출된 B3 (서열번호 22 및 23), C11 (서열번호 24 및 25) 및 E6 (서열번호 26 및 27) 를 포함한 총 5종의 클론을 정제하였다 (도 6a 내지 6c 참조).
실시예 4. 항 Ninj1 항체의 특성 분석 (1)
정제된 5종(B3, C11, E6, H5, C12)의 항 Ninj1 IgG 항체에 대하여, Ninj1을 과발현하는 세포주의 배양액에서 Ninj1을 검출할 수 있는지 Western blot으로 확인하였다. 그 결과, B3에서 Ninj1가 검출되었다 (도 7 참조).
NINJ1에 정량분석하는데 활용될 수 있는 항체를 확인하기 위하여 특이적으로 결합하며 sandwich ELISA의 capture antibody로 사용될 수 있는 2종의 토끼 모노클로날 항체(C11, C12)를 선별하였으며, rabbit polyserum을 detection antibody로 사용하였을 때 시료 내의 NINJURIN-1을 검출할 수 있음을 확인하였다 (도 8A 참조).
그 결과, C12는 약 30 ng/Ml 이상의 농도, C11은 약 100 ng/mL 이상의 농도에서 Ninj1 펩타이드가 검출되었으며, 이 중 C12 항체가 더 우수한 검출능을 보임을 확인하였다 (도 8B 참조). 또한, 토끼의 혈청에 대해 C12 항체가 농도에 의존적인 검출 효과를 보일 수 있음을 알 수 있었다 (도 9 참조).
실시예 5. 항 Ninj1 항체의 특성 분석 (2)
검출되는 NINJ1의 EC50 ~ 30 ng/mL 수준으로서 보다 민감한 검출이 필요하다고 판단되었으며, 이를 개선하기 위하여 1) C12 항체의 친화도 최적화, 2) detection antibody로 사용될 수 있는 신규 모노클로날 항체의 도출 연구를 수행하였다.
우선 C12 항체가 혈액 샘플 내의 NINJ1을 검출하는 데 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, 인간 혈청에 NINJ1 펩타이드를 가하여 sandwich ELISA 실험을 진행하고 이를 PBS 버퍼에 희석한 NINJ1의 sandwich ELISA 결과와 비교하였다 (도 10 참조). 그 결과, C12가 capture antibody로 사용되었을 때, 인간 혈청 및 PBS에 희석된 Ninj-1을 동일한 감도로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
C12의 친화도 최적화를 위한 경쇄 셔플링(light chain shuffling)을 수행하고, 이로부터 C12와 동일한 중쇄를 가지며 경쇄 부위에만 NINJ1 펩타이드로 면역된 토끼의 경쇄 다양성이 도입된 4x107 수준의 라이브러리를 제작하였다. 상기 제작된 경쇄 셔플링 라이브러리를 4회에 걸쳐 패닝하고 이로부터 2종의 상이한 경쇄 서열(E6, E9)을 확인하였다 (도 11 참조). 이들을 IgG 형태로 전환하여 발현 및 정제하고 sandwich ELISA를 수행하였으며, 그 결과 비특이적 결합이 관찰되었다 (도 12 참조).
따라서, 해당 항체들을 사용하지 않는 것으로 결정하였으며, C12 항체가 면역된 토끼로부터 얻어지는 항체들 중에 최적의 중쇄-경쇄 조합을 가지고 있는 것으로 판단하였다.
실시예 6. 신규 단일 클론 항체 제작 (1)
Detection antibody로 사용될 수 있는 신규 모노클로날 항체를 제작하기 위하여, 본 연구진이 제작, 활용중인 합성 인간항체 라이브러리를 NINJ1 펩타이드에 대하여 패닝하였다. 4회에 걸친 패닝 결과 다수의 NINJ1 결합 항체들을 확인하였으며, 서열분석 결과 3종의 클론을 확보하였다.
상기 도출된 NINJ1 항체들을 scFv 형태로 대장균에서 발현하고 이들의 페리플라즘 추출물(periplasmic extract)을 detection antibody로 이용하여 C12 IgG를 capture antibody로 사용하는 sandwich ELISA를 수행하였다. 그 결과, F9 클론이 Signal/background 비율이 높은 결합 신호를 나타내었다 (표 16, 녹색 칸 참조).
F9을 IgG로 전환하여 발현, 정제하고 이를 sandwich ELISA로 확인하는 연구에 활용하였다 (서열번호 28 및 29).
[NINJ1 항체 클론 C12의 CDR 염기서열]
(1) C12 light chain nucleotide (서열번호 1)
gagctgacac agccgccctc cctgtctgcg tctctggaca caacagccag actcacctgc
accctgagca ctgactacag tgttggcgaa taccctttag tgtggctcca acaggtgcca
gggaggcctc ccaggtatct gttaggctac cacacagatg atattaaaca ccagggcccc
ggggtcccca gccgcttctc tggatccaag gatcactcga ctaatacagg cgtcctgacc
atctctgggc tgcagcccga ggacgaggcc gactattact gtgcagtggg agttgtgttc
ggcggaggga cccagctgac cgtcacaggc cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc
catcagggcc tgagcttgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t
(2) C12 light chain amino acid (서열번호 2)
eltqppslsa sldttarltc tlstdysvge yplvwlqqvp grppryllgy htddikhqgp
gvpsrfsgsk dhstntgvlt isglqpedea dyycavgvvf gggtqltvtg rtvaapsvfi
fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd skdstyslss
tltlskadye khkvyacevt hqglslpvtk sfnrgec
(3) C12 heavy chain nucleotide (서열번호 3)
caggagcagc tgaaggagac cgggggaggc ctggtccagc ctgggggatc cctgaaactc
tcctgcaaag cctctggaat cgacttcaat acctatacag tgagctgggt ccgccaggct
ccagggaagg ggctggagtt gatcggatac gttgatcctg tttttgatga cacatactac
gcgacctggg tgaatggccg attcaccatc tccagccaca acgcccagaa cactgtgtat
ctacaactga acagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagattgggg
gcatatgata gtagtagtgg ttatcccaat tttagcttgt ggggcccagg caccctggtc
accatctctt cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag
agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag
aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact agtggccagg ccggccagca ccatcaccat
caccatggcg catacccgta cgacgttccg gactacgctt ct
(4) C12 heavy chain amino acid (서열번호 4)
qeqlketggg lvqpggslkl sckasgidfn tytvswvrqa pgkgleligy vdpvfddtyy
atwvngrfti sshnaqntvy lqlnsltaad tatyfcarlg aydsssgypn fslwgpgtlv
tissastkgp svfplapssk stsggtaalg clvkdyfpep vtvswnsgal tsgvhtfpav
lqssglysls svvtvpsssl gtqtyicnvn hkpsntkvdk kvepkscdkt sgqagqhhhh
hhgaypydvp dyas
(5) C12 CDR-L1 amino acid 서열 (서열번호 7): TLSTDYSVGEYPLV
(6) C12 CDR-L2 amino acid 서열 (서열번호 8): HTDDIKHQGP
(7) C12 CDR-L3 amino acid 서열 (서열번호 9): CAVGVV
(8) C12 CDR-H1 amino acid 서열 (서열번호 10): TYTVS
(9) C12 CDR-H2 amino acid 서열 (서열번호 11): VDPVFDDTYYATWVNG
(10) C12 CDR-H3 amino acid 서열 (서열번호 12): CARLGAYDSSSGYPNFNL
실험예 6. 신규 단일 클론 항체 제작 (2)
Sandwich ELISA의 검출 민감도를 향상시키고 검증 및 재현이 용이한 단일클론 항체를 detection antibody로 사용하기 위하여, C12와 쌍을 이루어 hNINJ1을 검출할 수 있는 단일클론 항체를 파지 디스플레이를 이용하여 제작하였다 (도 13 참조).
합성 인간항체 라이브러리로부터 표면에 고정된 C12-hNINJ1 (1-52) 복합체에 결합하는 scFv 항체 6종(A4, B6, C1, E7, E12, F9)을 도출하였다. C12-hNinj1(1-52) 복합체에 대한 항체라이브러리 패닝 결과 (표 17 참조) 및 도출된 항체의 CDR-H3 서열은 다음과 같다 (표 18 참조).
상기 6종의 클론을 정제한 후 Sandwich ELISA 형식으로 평가하여 C12와 쌍으로 ELISA kit으로 개발될 가능성이 있는 항체를 선별하였다. 그 결과, A4, B6 2종의 클론이 비특이적 결합을 보이지 않으며 높은 hNINJ1 농도에서 C12-hNINJ1 복합체와 결합함을 확인하였다 (도 14 참조).
A4, B6 클론들의 친화도가 낮은 것으로 평가되나 친화도 최적화를 통하여 ELISA kit로 개발가능한 수준의 고품질 항체를 확보하기 위해 상기 A4, B6 클론을 이용하여 affinity maturation을 진행하였다.
A4, B6 scFv의 VL 부위를 합성 인간항체 라이브러리의 VL 다양성으로 치환하는 light chain shuffled library를 제작하고, 이들을 표면에 고정된 C12 IgG-hNinj1 복합체에 높은 선택압 조건에서 패닝하여 향상된 친화도를 가지는 클론들을 도출하는 연구를 수행하였다.
람다 경쇄를 가지는 합성 인간항체 라이브러리인 OPAL의 DNA로부터 경쇄 가변부위 유전자를 PCR로 증폭하고, 이를 A4 및 B6의 중쇄 가변부위 유전자와 각각 overlap extension PCR을 통해 연결한 후 SfiI restriction endonuclease와 T4 DNA ligase를 이용하여 pComb3X phagemid vector에 클로닝하였다. 최종적으로 3.6x108 (A4) 및 2.6x108 (B6)개의 다양성을 가지는 light chain shuffled library를 제작하였다.
이들 라이브러리의 패닝으로부터, parental clone 대비 ELISA 신호가 2배가량 증가한 클론들이 발견되었으며, 이들의 서열분석을 통해 각 2종씩의 신규 서열을 확인하였다 (표 19 및 표 20 참조). 그 결과, Parental clone (wells H9 & H10, 연홍색) 대비 1.5~2배 정도 높은 ELISA 신호를 나타내는 클론들을 확인하고, 일부에 대해 서열을 분석하였다.
Claims (15)
- 인간 유래 NINJ-1(NINJURIN-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
- 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL); 및
서열번호 6로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH);을 포함하는, 인간 유래 NINJ-1(NINJURIN-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
- 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR) L1, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL); 및
서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH);을 포함하는, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 동맥경화증 예방 또는 치료용인, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab′, F(ab)2, F(ab′)2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 단편인 것을 특징으로 하는, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 동맥경화증 중증도 진단용인, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 인간 유래 NINJ-1(Ninjurin-1) 단백질은 수용성 단백질인, 인간 유래 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 8의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 청구항 9의 벡터를 포함하는 세포.
- 청구항 10의 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및
상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 인간 NINJ-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및
상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 인간 NINJ-1 특이적 검출 방법.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 항체 또는 그 단편을 포함하는, 동맥경화증 중증도 진단용 조성물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 동맥경화증은 세동맥 경화, 중막 경화, 내막성 동맥경화, 관상 동맥경화 및 죽상 경화로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 동맥경화증 중증도 진단용 조성물.
- 청구항 13의 조성물을 포함하는, 동맥경화증 중증도 진단용 키트.
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