KR20240034954A - SIRPα 변이체에 특이적으로 결합하는 항체 - Google Patents
SIRPα 변이체에 특이적으로 결합하는 항체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 SIRPα 변이체에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 이용한 시료 내 SIRPα 변이체 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체를 발현하여 정제하고 이를 연구하는 과정 중 SIRPα 변이체의 존재 여부를 정확하게 확인하고 정량할 수 있는 효과를 나타낸다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체를 발현하여 정제하고 이를 연구하는 과정 중 SIRPα 변이체의 존재 여부를 정확하게 확인하고 정량할 수 있는 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 SIRPα 변이체에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 이용한 시료 내 SIRPα 변이체 검출 방법에 관한 것이다.
SIRPα(Signal-regulatory protein alpha)는, 매크로파지, 수상 세포, 호중구 등의 미엘로이드 세포, 및 글리아 세포에 존재하는 Ig 슈퍼패밀리의 1 회 막관통형 분자이다. 세포외 영역은 1 개의 IgV 도메인과 2 개의 IgC 도메인으로 이루어지고, CD47 과의 결합 부위인 IgV 도메인에 대해서는, 인간에서는 10 종류의 변이체가 보고되어 있다. 한편, 세포내 영역은 immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs (ITIM)를 포함하고, CD47 과의 결합에 의해 티로신 탈인산화 효소인 SHP-1, 및 SHP-2 에 대한 결합이 유도되고 억제성의 시그널이 전달된다.
SIRPα-CD47 상호 작용에 의한 생리 현상으로는, 매크로파지 상의 SIRPα 에 적혈구 상의 CD47 이 결합하고 “Don't eat me” 시그널을 전달함으로써, 적혈구의 불필요한 탐식을 회피하는 것이 개시되어 있다. 한편, 종양 미소 환경하에 있어서도, 매크로파지나 수상 세포 상의 SIRPα에 종양 세포에 고발현하는 CD47 이 결합함으로써, 종양 세포에 대한 탐식능을 억제하는 것이 시사되어 있다. 탐식능의 억제는, 그 후의 T 세포에 대한 종양 항원 제시의 억제, 나아가서는 종양 면역 응답의 억제로 이어지는 것이 예상된다.
지금까지, SIRPα의 리간드인 CD47에 대한 항체로 SIRPα-CD47 상호 작용을 저해함으로써, 종양 세포에 대한 탐식능을 증강시키는 것이 보고되어 있고, 이것은 항-SIRPα 항체를 사용한 경우에도, 종양 세포를 면역 세포에 끌어들이는 이펙터 활성을 가지는 항암 항체 병용 조건하에서는 동일한 현상이 나타나고 있다. 또, 항-CD47 항체를 사용한 동종 마우스 담암 모델에서는, 항종양 효과뿐만 아니라, 종양 면역을 유도하는 시사된 바 있다.
한편, 종양 세포 상에서 높은 CD47 발현이 급성 골수성 백혈병(AML) 및 몇몇 고형 암에서, 생존을 위한 음성 예후 인자로 작용함이 발견된 이후, CD47와 SIRPα 간 상호작용을 파괴하는데 집중하는 전략, 예컨대 CD47 또는 SIRPα를 차폐하는 작용제의 투여가 잠재적인 항암 요법으로 검토되었다.
이러한 요법의 일환으로 야생형의 SIRPα과 비교하여 CD47에 대한 친화도가 현저히 향상된 다양한 SIRPα 변이체들이 개발되어, CD47-SIRPα 결합에 대한 경쟁적 길항제로서 그 효과가 확인되고 있다.
따라서, SIRPα 변이체들을 발현하여 정제하고 이를 연구하는 과정 중 SIRPα 변이체의 존재 여부를 정확하게 확인하고 정량할 수 있는 수단으로서 SIRPα 변이체 특이적인 항체에 대한 요구가 증가하고 있다.
이에, 본 발명자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위하여 연구를 거듭하였고, 특정 CDR(상보성 결정부위) 서열을 갖는 항체들이 SIRPα 변이체에 매우 높은 결합특이성(specificity) 및 결합친화력(affinity)를 나타내어 그 활용도가 매우 높음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 시료 내에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다:
(a) 상기 시료를 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합을 검출하는 단계.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 생산방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 시료 내에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 시료를 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합을 검출하는 단계.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명에서 상기 SIRPa(혹은 SIRP-알파, SIRPα, CD172a 또는 SHPS-1로도 칭함)는 단핵구, 조직 대식세포의 대부분의 하위 집단, 과립구, 림프 조직의 DC 하위 집합, 일부의 골수 전구 세포에서 발현되고 뉴런에도 다양한 수준으로 발현되는 단백질로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 SIRPα의 아미노산 서열은 NCBI accession No. AAH33092, NP_001317657, NP_001035112, NP_001035111, NP_542970, XP_024307604, XP_005260727, XP_047295872, XP_047295871, XP_011527475 등으로 공지되어 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 제공하는 상기 항체는 SIRPα 변이체, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 SIRPα 또는 이의 단편에는 결합하지 않고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 높은 결합 특이도를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 “SIRPα 변이체”란 상기 reference number에 따른 야생형 SIRPα의 아미노산 서열에서 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 제외한 나머지 아미노산 서열이 상기 서열번호 2의 C-말단에 연결된 단백질을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 “단편”이란 상기 서열번호 2의 아미노산 서열 및 상기 reference number에 따른 야생형 SIRPα의 아미노산 서열에서 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 제외한 나머지 아미노산 서열 중 일부가 상기 서열번호 2의 C-말단에 연결된 단백질을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 “항체(antibody)”는 면역글로불린(immunoglobulin, Ig)이라고도 불리며, 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자연에서 발견되는 전체 항체(whole antibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드인 경쇄(light chain, LC) 및 중쇄(heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이루어지거나, 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 구성된다. 포유류의 항체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 유형이 있으며, 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 등 다른 종류의 항체를 구성하게 된다. 포유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는 λ 및 κ로 표시되는 2가지 종류가 존재한다.
항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역과 불변영역으로 구분된다. 중쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변영역으로 구성되어 있으며, 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역(VH) 또는 경쇄가변영역(VL)의 하나의 도메인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되어 1개의 공유 이황결합(disulfide bond)에 의해 연결되고, 경쇄와 결합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍(HC/LC)으로 구성되어 있으므로, 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일특이성을 갖게 된다. 항원에 결합하는 항체 가변영역을 항체의 항원결합부위(antigen-binding site)라고 하고, 항원의 표면에서 항체에 의해 인식되는 부분을 항원결정부(epitope)라고 한다.
항원결합부위(antigen-binding site)를 포함하고 있는 항체의 가변영역은 서열 가변성이 적은 골격 부위(framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위(hypervariable region)인 상보성 결정부위(complementary determining region, CDR)로 세분된다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N-말단부터 C-말단의 방향으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로, 항체의 항원특이성에 가장 중요하다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 바람직하게는 (i) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 바람직하게는 (i) 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편은 상기한 CDR, VH와 VL, 또는 경쇄와 중쇄의 구성을 갖는 것이라면 그 종류에 제한이 없으며, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 형태의 항체일 수 있다. 바람직하게는 IgG 형태의 항체일 수 있다.
또한 본 발명에서 항체의 항원 결합 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적인 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다. Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변영역과 불변영역으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 VH와 VL이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.
또한 본 발명에 따른 항체는 단일한 B 세포에서 유래하는 단일클론(monoclonal) 항체일 수도 있고, 복수의 B 세포에서 유래하는 다클론(polyclonal) 항체일 수도 있으며, 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편은 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물에서 유래한 것일 수 있으며, 상이한 종의 항체 서열을 함께 가지고 있는 키메라(chimera) 항체 또는 항체의 단편일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서 '폴리뉴클레오티드'는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(doublestranded)이 될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기한 서열번호 2의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 특이적인 CDR구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체를 암호화하는 염기서열을 의미한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당 업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당 분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 '벡터(vector)'는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며, 일반적으로 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시퀀스, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다.
벡터의 일종인 플라스미드(plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스성 벡터(viral vector; 예를 들어, 복제-결핍 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스들 및 아데노-연관 바이러스들 (adenoassociated viruses))이며, 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러스성 게놈(viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 벡터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포(예를 들어, 박테리아 유래(bacterial origin) 및 에피좀의 포유류 벡터(episomal mammalian vectors)를 포함하는 박테리아성 벡터들(bacterialvectors)) 내에서의 자가복제(autonomous replication)를 할 수 있다. 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피좀의 포유동물 벡터들(non-episomal mammalian vectors))이 숙주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈내로 통합(integrated)되고 그리고 그에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.
본 발명에서 상기 '벡터'는 '발현벡터(expression vector)'와 동일한 의미로 이해될 수 있으며, 이는 상기 폴리뉴클레오티드의 발현할 수 있는 벡터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우, 상기 조절 시퀀스(regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결"된다. 상기 조절 시퀀스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시퀀스는, 예를 들어, 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들(예를 들어, 상기 조절 시퀀스 및/또는 상기 핵산에 결합하는 폴리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도록 할 수 있다. 상기 조절 시퀀스에는 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 포함된다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 pOptiVEC™-TOPO 및 pcDNA™3.3-TOPO일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 세포는 본 발명의 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새(Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이(E.coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 섭틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피.애루기노사(P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 벡터를 발현 가능한 것이면, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이. 콜라이일 수 있다.
본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K.lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미(K.wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K.drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K.marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesei(EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa);쉬바니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 필라멘트성진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 사용가능하다.
상기 “형질전환(transformation)”은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
상기 재조합 발현 벡터는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질 전환할 수 있다
또한, 본 발명의 상기 세포는 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염(transfected)될 수 있는 배양된 세포이고, 이는 계속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세포는 발현되어야 할 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한다. 본 발명의 세포는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되도록 상기 세포 내로 도입되지 않는 한 이를 원하는 수준으로 발현하지 않는 세포가 될 수 있다.
본 발명의 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄(Ham's) F1O(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 최소 필수 배지(MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코(Dulbecco's) 개질 이글(Eagle's) 배지(DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양하기에 적합하다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 염, 완충액, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.
본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. 상기 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다.
이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다. 상기 배양은 상기 세포의 종류에 따라 배지 조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지(supernatant)로 표적화(targeted)될 수 있으며, 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩(refolding)시키고 기능적 형태(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 폴리펩타이드의 특성 및 세포의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 만약 폴리펩타이드가 세포 내에서 생산되면, 이 세포는 제1단계로서 단백질을 방출하기 위하여 파괴될 수 있다. 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다. 세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 본 발명의 항체는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 시료 내에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 시료를 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합을 검출하는 단계.
SIRPα 변이체 및 항체의 결합은 당업자라면 입수가능한 다양한 검정법들에 의해 검출되고/거나 정량되고/거나 결정될 수 있다. 검정법들을 수행하는 임의의 적합한 수단들이 본 발명의 범주 내에 포함되기는 하지만, 상세하게 형광 활성화 세포 선별법 (FACS), 엘라이자, 웨스턴 블럿팅 및 면역조직화학법 (IHC)이 언급될 수 있다. 바람직한 방법들로는 IHC 및 FACS를 포함한다.
본 발명에서 상기 시료는 생물학적 시료일 수 있다. "생물학적 시료"는 개체로부터 채취할 수 있는 임의의 시료일 수 있다.
바람직한 생물학적 시료들은 암이 액체 종양인 경우라면, 혈액 시료, 혈장 시료 또는 림프 시료와 같은 시료들을 포함한다.
바람직한 생물학적 시료들은 암이 고체 종양인 경우라면, 생검 시료 또는 수술적 절제 요법으로부터 채취한 시료와 같은 시료들을 포함한다.
바람직하게, 생물학적 시료는 인간 기원의 혈청, 전혈 세포들, 조직 시료 또는 생검과 같은 생물학적 액체이다. 시료는 예를 들면 생검된 조직을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체를 발현하여 정제하고 이를 연구하는 과정 중 SIRPα 변이체의 존재 여부를 정확하게 확인하고 정량할 수 있는 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 제조한 2종 항체가 SIRPα 변이체를 검출할 수 있는지 여부를 ELISA assay로 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 제조한 2종 항체가 SIRPα 변이체를 검출할 수 있는지 여부를 웨스턴 블로팅으로 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 제조한 2종 항체가 SIRPα 변이체를 검출할 수 있는지 여부를 웨스턴 블로팅으로 평가한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
1. SIRPα 변이체 (vSIRPα) 특이적인 단일클론 항체의 제작
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체에 특이적인 단일클론 항체를 다음과 같은 단계에 따라 제작하였다:
- 서열번호 2의 단백질을 Balb/c mice에 접종 후 splenocyte fusion을 통해 hybridoma 제작
- Subcloning 통해 monoclonality 확보
상기 방법에 따라 2종의 항체를 선별하였다.
2. 항- vSIRPα 항체를 이용한 indirect ELISA assay
상기 방법에 따라 제작된 2종의 항체를 이용해 서열번호 2에 따른 vSIRPα를 검출할 수 있는지를 indirect ELISA assay로 확인하였다.
실험 조건은 다음과 같다:
- Coating: 1.0 ug/ml, 100 ul vSIRPα antigen (서열번호 2) in PBS
- 1차 항체: 개발한 항체 2종
- 2차 항체: Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Fragment Specific (min X Hu,Bov,Hrs Sr Prot)
이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 제작된 2종 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 vSIRPα를 검출하는 것으로 확인되었다.
3. 항체 서열 분석
상기 제작된 2종 항체의 서열을 확인한 결과 parental clone을 공유하는 2개 항체가 동일한 항체로 확인되어, 1종류의 항체인 것으로 확인되었다. 이에 대한 서열 정보를 아래 표 1에 나타내었다.
5. 항- vSIRPα항체를 이용한 웨스턴 블로팅
본 발명에서 제작한 상기 2종 항체가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 vSIRPα를 특이적으로 검출할 수 있는지를 웨스턴 블로팅으로 확인하였다. 야생형의 SIRPα에 대한 항체를 비교군으로 사용하였다.
이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 2종 항체 모두 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 vSIRPα 잘 검출하지만 야생형의 SIRPα(wtSIRPα)는 검출하지 못하는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체를 발현하여 정제하고 이를 연구하는 과정 중 SIRPα 변이체의 존재 여부를 정확하게 확인하고 정량할 수 있는 효과를 나타내므로, 산업상 이용가능성이 매우 높다.
Claims (11)
- 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα(Signal-regulatory protein alpha) 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역
을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체의 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제8항의 벡터로 형질 전환된 세포.
- 제9항의 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 생산방법.
- 하기 단계를 포함하는, 시료 내에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα 변이체를 검출하는 방법:
(a) 상기 시료를 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시료와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합을 검출하는 단계.
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