JP2022524175A

JP2022524175A - Ｅｌｔｄ１に対するモノクローナル抗体及びその使用

Info

Publication number: JP2022524175A
Application number: JP2021525172A
Authority: JP
Inventors: レアルタウナー; ジュンホチュン
Original assignee: Seoul National University R&DB Foundation; Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: SNU R&DB Foundation; Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2022-04-28
Also published as: KR20210108363A; US20220195024A1; WO2020092969A8; JP2023159355A; WO2020092969A1; EP3873514A4; EP4219550A1; EP3873514A1

Abstract

本開示は、ＥＬＴＤ１に結合する新規モノクローナル抗体、及びがん、多発性硬化症、網膜症の検出及び治療、または組織再生の促進を含むその使用方法を対象とする。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、概して、多発性硬化症、網膜症、組織再生の治療、ならびにがんの検出及び治療に使用され得るＥＬＴＤｌに対する抗体の分野に関する。

連邦政府支援の研究に関する声明
該当なし

コンパクトディスクで出願された資料の参照による組み込み
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されており、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、ＯＭＲＦ２０１３ＷＯ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前が付けられおり、バイトのサイズである。

本発明の範囲を限定することなく、その背景は、ＥＧＦ、ラトロフィリン、及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）に関連して説明される。

ＥＬＴＤ１は、接着Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーのラトロフィリン様オーファン受容体である。ヒトでは、ＥＬＴＤ１遺伝子はＥＬＴＤｌをコードする。ＥＬＴＤｌは、血管新生（生理学的及び病理学的の両方）、ならびに膠芽腫において役割を果たすようである。しかしながら、他の疾患におけるその役割はほとんど調査されていない。

一実施形態では、本発明は、多発性硬化症を有するか、または有する疑いのある対象を治療する方法であって、対象に、ＥＧＦ、ラトロフィリン、及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）に対する結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントを送達することを含む、方法を含む。一態様では、抗体は、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である。別の態様では、抗体断片は、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である。別の態様では、抗体または抗体断片は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である。別の態様では、抗体または抗体断片は、ＦｃＲ相互作用を改変（排除または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害もしくは補体活性化などのエフェクター機能を増加もしくは低下させるように変異したＦｃ部分を含む。別の態様では、抗体軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する。別の態様では、抗体は、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、１２９の軽鎖可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、抗体は、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達（genetic delivery）に適合している。別の態様では、本方法は、コルチコステロイド、血漿交換（プラズマフェレーシス）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｖｕｓ）、ベータインターフェロン、グラチラマー酢酸塩（Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｇｌａｔｏｐａ）、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ）、フマル酸ジメチル（Ｔｅｃｆｉｄｅｒａ）、テリフルノミド（Ａｕｂａｇｉｏ）、シポニモド（Ｍａｙｚｅｎｔ）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｖｕｓ）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ、Ｌｅｍｔｒａｄａ）、ミトキサントロン、またはそれらの機能性誘導体から選択される多発性硬化症の症状を治療または軽減する活性薬剤を提供することをさらに含む。別の態様では、本方法は、ＥＬＴＤ１の非侵襲性インビボ検出のためにプローブを抗体または抗体断片に付加することをさらに含む。

別の実施形態では、本発明は、網膜症を有するか、または有する疑いのある対象を治療する方法であって、対象に、ＥＧＦ、ラトロフィリン、及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）に対する結合親和性を有する抗体または抗体断片を送達することを含む、方法を含む。一態様では、抗体は、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である。別の態様では、抗体断片は、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である。別の態様では、抗体または抗体断片は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である。別の態様では、抗体または抗体断片は、ＦｃＲ相互作用を改変（排除または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害もしくは補体活性化などのエフェクター機能を増加もしくは低下させるように変異したＦｃ部分を含む。別の態様では、抗体軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する。別の態様では、抗体は、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、抗体は、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている。別の態様では、本方法は、コルチコステロイド、ＶＥＧＦ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、または成長ホルモン阻害剤から選択される網膜症の症状を治療または軽減する活性薬剤を提供することをさらに含む。

別の実施形態では、本発明は、ＥＧＦ、ラトロフィリン、及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）に結合するポリクローナル抗血清または１つ以上のモノクローナル抗体もしくは抗体断片を含む医薬製剤を含む。一態様では、抗体は、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である。別の態様では、抗体断片のうちの少なくとも１つは、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である。別の態様では、抗体または抗体断片は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である。別の態様では、抗体または抗体断片は、ＦｃＲ相互作用を改変（排除または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害もしくは補体活性化などのエフェクター機能を増加もしくは低下させるように変異したＦｃ部分を含む。別の態様では、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の少なくとも一方は、それぞれ、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する。別の態様では、抗体は、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、抗体は、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている。別の態様では、抗体または抗体断片のうちの少なくとも１つは、細胞透過性ペプチドをさらに含む及び／またはイントラボディ（intrabody）である。

別の実施形態では、本発明は、組織再生を促進する方法であって、細胞または組織を、ＥＬＴＤ１に対して結合親和性を有するポリクローナル抗血清または抗体もしくは抗体断片と接触させることを含む、方法を含む。一態様では、抗体は、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である。別の態様では、抗体断片は、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＦｖ断片である。別の態様では、抗体または抗体断片は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である。別の態様では、抗体または抗体断片は、ＦｃＲ相互作用を改変（排除または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害もしくは補体活性化などのエフェクター機能を増加もしくは低下させるように変異したＦｃ部分を含む。別の態様では、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する。別の態様では、抗体は、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、抗体は、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている。別の態様では、細胞は、インビトロで接触する。別の態様では、細胞は、インビボで接触する。別の態様では、細胞は、心臓細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、肺細胞、膀胱細胞、腸細胞、毛包細胞、網膜細胞、角膜細胞、胃細胞、神経細胞、内皮細胞、膵臓細胞、甲状腺細胞、表皮細胞、ニューロン細胞、ミクログリア細胞、星状細胞、乳房細胞である。別の態様では、組織再生には、神経再生、血管再生、または骨再生のうちの少なくとも１つが含まれる。

別の実施形態では、本発明は、がんを有するか、または有する疑いのある対象を治療する方法であって、対象に、ＥＬＴＤｌに対する結合親和性を有する抗体または抗体断片を送達することを含む、方法を含む。別の態様では、抗体は、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である。別の態様では、抗体断片は、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＦｖ断片である。別の態様では、抗体または抗体断片は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である。別の態様では、抗体または抗体断片は、ＦｃＲ相互作用を改変（排除または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害もしくは補体活性化などのエフェクター機能を増加もしくは低下させるように変異したＦｃ部分を含む。別の態様では、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する。別の態様では、抗体は、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、抗体は、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている。別の態様では、対象は、転移性結腸直腸癌、第一選択（ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ）非扁平上皮非小細胞肺癌、再発性多形性膠芽腫、転移性腎細胞癌、持続性、再発性、または転移性子宮頸癌、及び上皮性卵巣癌、卵管癌、または原発性腹膜癌を有する。別の態様では、本方法は、放射線、化学療法、免疫療法、毒素療法、または外科手術などの第２のがん療法で対象を治療することをさらに含む。別の態様では、抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列またはベクターを用いた遺伝子送達による投与に適合されている。別の態様では、抗体または抗体断片は、投与中に出血の減少を示すか、または出血を全く示さない。別の態様では、がんは、転移性結腸直腸癌、第一選択非扁平上皮非小細胞肺癌、再発性多形性膠芽腫、転移性腎細胞癌、持続性、再発性、または転移性子宮頸癌、及び上皮性卵巣癌、卵管癌、または原発性腹膜癌である。

別の実施形態では、本発明は、それぞれ、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むＥＬＴＤ１に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその結合断片を含む。一態様では、抗体は、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である。別の態様では、結合断片は、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＦｖ断片である。別の態様では、抗体または抗体断片は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である。別の態様では、抗体または抗体断片は、ＦｃＲ相互作用を改変（排除または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害もしくは補体活性化などのエフェクター機能を増加もしくは低下させるように変異したＦｃ部分を含む。別の態様では、抗体はｓｃＦｖであり、配列番号１、５、９、１３、１７、または２１のうちの少なくとも１つの核酸によってコードされる。別の態様では、モノクローナル抗体またはその結合断片は、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、モノクローナル抗体またはその結合断片は、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、モノクローナル抗体またはその結合断片は、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の少なくとも一方、またはそれらの両方を有する。一態様では、抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている。別の態様では、モノクローナル抗体は、抗体または抗体断片に結合したプローブをさらに含む。

別の実施形態では、本発明は、対象におけるＥＬＴＤｌを検出する方法であって、対象から生体試料を得ることと、生体試料をＥＬＴＤ１に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその結合断片と接触させることであって、モノクローナル抗体またはその結合断片が、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の少なくとも一方、またはそれらの両方を有する、接触させることと、モノクローナル抗体またはその結合断片の試料への結合を検出することと、を含む、方法を含む。一態様では、抗体は、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である。

別の実施形態では、本発明は、標的細胞と接触したときにＮｏｔｃｈ１及びＶＥＧＦＲ２の両方を下方制御する、ＥＬＴＤｌに対する結合親和性を有する二重機能モノクローナル抗体もしくはその抗体断片またはポリクローナル血清を含む。別の態様では、抗体は、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である。別の態様では、抗体断片は、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＦｖ断片である。別の態様では、抗体または抗体断片は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である。別の態様では、抗体または抗体断片は、ＦｃＲ相互作用を改変（排除または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害もしくは補体活性化などのエフェクター機能を増加もしくは低下させるように変異したＦｃ部分を含む。別の態様では、抗体はｓｃＦｖであり、配列番号１、５、９、１３、１７、または２１のうちの少なくとも１つの核酸によってコードされる。別の態様では、モノクローナル抗体は、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する。別の態様では、モノクローナル抗体またはその結合断片は、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、モノクローナル抗体またはその結合断片は、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、モノクローナル抗体またはその結合断片は、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の少なくとも一方、またはそれらの両方を有する。別の態様では、抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている。別の態様では、モノクローナル抗体またはその抗体断片は、インビトロで、増殖を阻害するか、または細胞死を開始するか、またはそれらの両方である。別の態様では、抗体ががん細胞に結合すると、抗体は、ナトリウムチャネルタンパク質５型サブユニットアルファまたはＬ１細胞接着分子の少なくとも一方の発現を減少させる。別の態様では、抗体ががん細胞に結合すると、抗体は、ＥＬＴＤ１を発現する全ての腫瘍における、ＡＤＡ、ＳＣＮ５Ａ、Ｌ１ＣＡＭ、ＢＭＰ２、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）、ＴＲＰＭ８のうちの少なくとも１つの発現を増加させる。別の態様では、抗体ががん細胞に結合すると、抗体は、ＳＥＬＥＮＢＰ１の発現を減少させる。別の態様では、抗体が肝細胞癌に結合すると、ＶＷＡ１が減少する。別の態様では、抗体が肺癌細胞に結合すると、ＳＣＵＢＥ３の発現が減少する、ＰＬＣＨ１の発現が増加する、ＣＨＲＮＡ１の発現が増加する、またはＣＤＨ２の発現が増加する、のうちの少なくとも１つである。別の態様では、抗体が乳癌細胞に結合すると、ＩＦＩＴＭ１０が減少し、ＤＣＤＣ２が増加し、ＣＨＳＴ９が増加し、ＣＤＨ２が増加する。別の態様では、抗体ががん細胞に結合すると、抗体は、ＣＤ７４の発現を増加させる。別の態様では、抗体が網膜細胞に結合すると、抗体は、アデノシンデアミナーゼまたはアペリンの少なくとも一方の発現を減少させる。別の態様では、抗体が網膜細胞に結合すると、抗体は、骨ガンマ－カルボキシグルタミン酸タンパク質、マトリリン２、またはフォン・ヴィレブランド因子Ａドメイン含有１の発現を増加させる。別の態様では、抗体が多発性硬化症を有する対象に提供されると、抗体は、ナトリウムチャネルタンパク質５型サブユニットアルファ、アデノシンデアミナーゼ、アペリン、スピンスターホモログ２、または骨形態形成タンパク質２のうちの少なくとも１つの発現を減少させる。別の態様では、抗体が多発性硬化症を有する対象に提供されると、抗体は、ＣＤ７４またはＩＫＡＲＯＳファミリー亜鉛フィンガー１（Ｉｋａｒｏｓ）の少なくとも一方の発現を増加させる。別の態様では、抗体が組織再生を必要とする部位で対象に提供されると、抗体は、骨ガンマ－カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）タンパク質、マトリリン２、またはフォン・ヴィレブランド因子Ａドメイン含有１のうちの少なくとも１つの発現を増加させる。別の態様では、抗体は、転移性結腸直腸癌、第一選択非扁平上皮非小細胞肺癌、再発性多形性膠芽腫、転移性腎細胞癌、持続性、再発性、または転移性子宮頸癌、及び上皮性卵巣癌、卵管癌、または原発性腹膜癌から選択されるがんを治療するのに十分な量で提供される。

別の実施形態では、本発明は、抗ＥＧＦ、ラトロフィリン、及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）抗体またはその断片を用いて対象における疾患または状態を治療する方法であって、疾患または状態の治療を必要とする対象を特定することと、疾患もしくは状態の症状を軽減するか、または疾患もしくは状態を治療するのに十分な、ＥＬＴＤ１に特異的に結合する抗体またはその結合断片の有効量を提供することと、を含み、疾患または状態が、多発性硬化症、網膜症、がん、または組織再生から選択される、方法を含む。一態様では、抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、またはそれらの断片である。別の態様では、抗体は、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である。別の態様では、モノクローナル抗体またはその結合断片は、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＦｖ断片である。別の態様では、モノクローナル抗体または抗体断片は、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である。別の態様では、抗体または抗体断片は、ＦｃＲ相互作用を改変（排除または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害もしくは補体活性化などのエフェクター機能を増加もしくは低下させるように変異したＦｃ部分を含む。別の態様では、抗体はｓｃＦｖであり、配列番号１、５、９、１３、１７、または２１のうちの少なくとも１つの核酸によってコードされる。別の態様では、モノクローナル抗体は、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する。別の態様では、モノクローナル抗体またはその結合断片は、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、モノクローナル抗体またはその結合断片は、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。別の態様では、モノクローナル抗体またはその結合断片は、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７；３１、３２、及び３３；３７、３８、及び３９；４３、４４、及び４５；４９、５０、及び５１；５５、５６、及び５７；６１、６２、及び６３；６７、６８、及び６９；７３、７４、及び７５；７９、８０、及び８１；８５、８６、及び８７；９１、９２、及び９３；９７、９８、及び９９；１０３、１０４、及び１０５；１０９、１１０、及び１１１；１１５、１１６、及び１１７；１２１、１２２、及び１２３；または１２７、１２８、及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、または、それぞれ、配列番号２８、２９、及び３０；３４、３５、及び３６；４０、４１、及び４２；４６、４７、及び４８；５２、５３、及び５４；５８、５９、及び６０；６４、６５、及び６６；７０、７１、及び７２；７６、７７、及び７８；８２、８３、及び８４；８８、８９、及び９０；９４、９５、及び９６；１００、１０１、及び１０２；１０６、１０７、及び１０８；１１２、１１３、及び１１４；１１８、１１９、及び１２０；１２４、１２５、及び１２６；または１３０、１３１、及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のうちのいずれか一方、またはそれらの両方を有する。別の態様では、抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている。別の態様では、抗体が結合すると、抗体は、ネスチンを下方制御する。別の態様では、二重機能モノクローナル抗体は、プローブをさらに含む。別の態様では、二重機能モノクローナル抗体は、ＭＲＩにより検出可能なプローブをさらに含む。別の態様では、抗体ががん細胞に結合すると、抗体は、ナトリウムチャネルタンパク質５型サブユニットアルファまたはＬ１細胞接着分子の少なくとも一方の発現を減少させる。別の態様では、抗体ががん細胞に結合すると、抗体は、ＣＤ７４の発現を増加させる。別の態様では、抗体が網膜細胞に結合すると、抗体は、アデノシンデアミナーゼまたはアペリンの少なくとも一方の発現を減少させる。別の態様では、抗体が網膜細胞に結合すると、抗体は、骨ガンマ－カルボキシグルタミン酸タンパク質、マトリリン２、またはフォン・ヴィレブランド因子Ａドメイン含有１の発現を増加させる。別の態様では、抗体が多発性硬化症を有する対象に提供されると、抗体は、ナトリウムチャネルタンパク質５型サブユニットアルファ、アデノシンデアミナーゼ、アペリン、スピンスターホモログ２、または骨形態形成タンパク質２のうちの少なくとも１つの発現を減少させる。別の態様では、抗体が多発性硬化症を有する対象に提供されると、抗体は、ＣＤ７４またはＩＫＡＲＯＳファミリー亜鉛フィンガー１（Ｉｋａｒｏｓ）の少なくとも一方の発現を増加させる。別の態様では、抗体が組織再生を必要とする部位で対象に提供されると、抗体は、骨ガンマ－カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）タンパク質、マトリリン２、またはフォン・ヴィレブランド因子Ａドメイン含有１のうちの少なくとも１つの発現を増加させる。別の態様では、抗体がネスチンを下方制御するとき。別の態様では、抗体は、プローブをさらに含む。別の態様では、抗体は、ＭＲＩにより検出可能なプローブをさらに含む。

別の実施形態では、本発明は、抗ＥＧＦ、ラトロフィリン、及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）抗体またはその断片を用いて対象における疾患または状態を診断する方法であって、疾患または状態の治療を必要とする対象を特定することと、対象から生体試料を得ることと、試料を、検出可能なマーカーを含む抗ＥＧＦ、ラトロフィリン、及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）抗体またはその結合断片と接触させることと、を含み、疾患または状態が、多発性硬化症、網膜症、がん、または再生を必要とする組織から選択される、方法を含む。

本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、本発明の詳細な説明を添付の図とともに参照する。

膠芽腫（ＧＢＭ）を有するマウスにおける動物の生存率の上昇及び腫瘍体積（ＴＶ）の減少において、モノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理がポリクローナル抗ＥＬＴＤ１処理よりも効果的であることを示す。（図１Ａ）全ての処理群の生存率パーセント曲線。抗ＥＬＴＤ１ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）処理及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）処理は、未処理の（ＵＴ）対照と比較して腫瘍検出後に全生存率を有意に上昇させることができた。（図１Ｂ）腫瘍検出の９日後の各処理群の腫瘍体積（ＴＶ）。抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理及びｍＡｂ処理は、ＵＴと比較してＴＶを有意に減少させた（＊ｐ＝０．０３８４、＊＊ｐ＝０．００６７）。腫瘍に黄色で輪郭を描いた、腫瘍検出の９日後のＵＴ対照（図１Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理図１（Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図１Ｅ）の代表的な形態学的ＭＲ画像。膠芽腫（ＧＢＭ）を有するマウスにおける動物の生存率の上昇及び腫瘍体積（ＴＶ）の減少において、モノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理がポリクローナル抗ＥＬＴＤ１処理よりも効果的であることを示す。（図１Ａ）全ての処理群の生存率パーセント曲線。抗ＥＬＴＤ１ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）処理及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）処理は、未処理の（ＵＴ）対照と比較して腫瘍検出後に全生存率を有意に上昇させることができた。（図１Ｂ）腫瘍検出の９日後の各処理群の腫瘍体積（ＴＶ）。抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理及びｍＡｂ処理は、ＵＴと比較してＴＶを有意に減少させた（＊ｐ＝０．０３８４、＊＊ｐ＝０．００６７）。腫瘍に黄色で輪郭を描いた、腫瘍検出の９日後のＵＴ対照（図１Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理図１（Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図１Ｅ）の代表的な形態学的ＭＲ画像。膠芽腫（ＧＢＭ）を有するマウスにおける動物の生存率の上昇及び腫瘍体積（ＴＶ）の減少において、モノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理がポリクローナル抗ＥＬＴＤ１処理よりも効果的であることを示す。（図１Ａ）全ての処理群の生存率パーセント曲線。抗ＥＬＴＤ１ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）処理及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）処理は、未処理の（ＵＴ）対照と比較して腫瘍検出後に全生存率を有意に上昇させることができた。（図１Ｂ）腫瘍検出の９日後の各処理群の腫瘍体積（ＴＶ）。抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理及びｍＡｂ処理は、ＵＴと比較してＴＶを有意に減少させた（＊ｐ＝０．０３８４、＊＊ｐ＝０．００６７）。腫瘍に黄色で輪郭を描いた、腫瘍検出の９日後のＵＴ対照（図１Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理図１（Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図１Ｅ）の代表的な形態学的ＭＲ画像。膠芽腫（ＧＢＭ）を有するマウスにおける動物の生存率の上昇及び腫瘍体積（ＴＶ）の減少において、モノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理がポリクローナル抗ＥＬＴＤ１処理よりも効果的であることを示す。（図１Ａ）全ての処理群の生存率パーセント曲線。抗ＥＬＴＤ１ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）処理及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）処理は、未処理の（ＵＴ）対照と比較して腫瘍検出後に全生存率を有意に上昇させることができた。（図１Ｂ）腫瘍検出の９日後の各処理群の腫瘍体積（ＴＶ）。抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理及びｍＡｂ処理は、ＵＴと比較してＴＶを有意に減少させた（＊ｐ＝０．０３８４、＊＊ｐ＝０．００６７）。腫瘍に黄色で輪郭を描いた、腫瘍検出の９日後のＵＴ対照（図１Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理図１（Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図１Ｅ）の代表的な形態学的ＭＲ画像。膠芽腫（ＧＢＭ）を有するマウスにおける動物の生存率の上昇及び腫瘍体積（ＴＶ）の減少において、モノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理がポリクローナル抗ＥＬＴＤ１処理よりも効果的であることを示す。（図１Ａ）全ての処理群の生存率パーセント曲線。抗ＥＬＴＤ１ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）処理及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）処理は、未処理の（ＵＴ）対照と比較して腫瘍検出後に全生存率を有意に上昇させることができた。（図１Ｂ）腫瘍検出の９日後の各処理群の腫瘍体積（ＴＶ）。抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理及びｍＡｂ処理は、ＵＴと比較してＴＶを有意に減少させた（＊ｐ＝０．０３８４、＊＊ｐ＝０．００６７）。腫瘍に黄色で輪郭を描いた、腫瘍検出の９日後のＵＴ対照（図１Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理図１（Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図１Ｅ）の代表的な形態学的ＭＲ画像。ＧＢＭを有するマウスのモノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理が腫瘍内の血管系を正常化することを示す。各処理群：ＵＴ対照（図２Ａ～Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図２Ｃ～Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図２Ｅ～Ｆ）のそれぞれのＭＲ灌流マップを有する代表的な形態学的画像。（図２Ｇ）腫瘍相対脳血流（ｒＣＢＦ）差の定量分析。ｒＣＢＦ灌流レベルは、両方の抗ＥＬＴＤ１処理で有意に増加し、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂがＥＬＴＤ１ｐＡｂよりも有意に優れていた。ｍＡｂ処理は灌流レベルを正常化することもできた（＊＊＊ｐ＝０．０００１ＵＴ対ｐＡｂ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ＵＴ対ｍＡｂ）。ＧＢＭを有するマウスのモノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理が腫瘍内の血管系を正常化することを示す。各処理群：ＵＴ対照（図２Ａ～Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図２Ｃ～Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図２Ｅ～Ｆ）のそれぞれのＭＲ灌流マップを有する代表的な形態学的画像。（図２Ｇ）腫瘍相対脳血流（ｒＣＢＦ）差の定量分析。ｒＣＢＦ灌流レベルは、両方の抗ＥＬＴＤ１処理で有意に増加し、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂがＥＬＴＤ１ｐＡｂよりも有意に優れていた。ｍＡｂ処理は灌流レベルを正常化することもできた（＊＊＊ｐ＝０．０００１ＵＴ対ｐＡｂ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ＵＴ対ｍＡｂ）。ＧＢＭを有するマウスのモノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理が腫瘍内の血管系を正常化することを示す。各処理群：ＵＴ対照（図２Ａ～Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図２Ｃ～Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図２Ｅ～Ｆ）のそれぞれのＭＲ灌流マップを有する代表的な形態学的画像。（図２Ｇ）腫瘍相対脳血流（ｒＣＢＦ）差の定量分析。ｒＣＢＦ灌流レベルは、両方の抗ＥＬＴＤ１処理で有意に増加し、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂがＥＬＴＤ１ｐＡｂよりも有意に優れていた。ｍＡｂ処理は灌流レベルを正常化することもできた（＊＊＊ｐ＝０．０００１ＵＴ対ｐＡｂ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ＵＴ対ｍＡｂ）。ＧＢＭを有するマウスのモノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理が腫瘍内の血管系を正常化することを示す。各処理群：ＵＴ対照（図２Ａ～Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図２Ｃ～Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図２Ｅ～Ｆ）のそれぞれのＭＲ灌流マップを有する代表的な形態学的画像。（図２Ｇ）腫瘍相対脳血流（ｒＣＢＦ）差の定量分析。ｒＣＢＦ灌流レベルは、両方の抗ＥＬＴＤ１処理で有意に増加し、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂがＥＬＴＤ１ｐＡｂよりも有意に優れていた。ｍＡｂ処理は灌流レベルを正常化することもできた（＊＊＊ｐ＝０．０００１ＵＴ対ｐＡｂ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ＵＴ対ｍＡｂ）。ＧＢＭを有するマウスのモノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理が腫瘍内の血管系を正常化することを示す。各処理群：ＵＴ対照（図２Ａ～Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図２Ｃ～Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図２Ｅ～Ｆ）のそれぞれのＭＲ灌流マップを有する代表的な形態学的画像。（図２Ｇ）腫瘍相対脳血流（ｒＣＢＦ）差の定量分析。ｒＣＢＦ灌流レベルは、両方の抗ＥＬＴＤ１処理で有意に増加し、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂがＥＬＴＤ１ｐＡｂよりも有意に優れていた。ｍＡｂ処理は灌流レベルを正常化することもできた（＊＊＊ｐ＝０．０００１ＵＴ対ｐＡｂ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ＵＴ対ｍＡｂ）。ＧＢＭを有するマウスのモノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理が腫瘍内の血管系を正常化することを示す。各処理群：ＵＴ対照（図２Ａ～Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図２Ｃ～Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図２Ｅ～Ｆ）のそれぞれのＭＲ灌流マップを有する代表的な形態学的画像。（図２Ｇ）腫瘍相対脳血流（ｒＣＢＦ）差の定量分析。ｒＣＢＦ灌流レベルは、両方の抗ＥＬＴＤ１処理で有意に増加し、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂがＥＬＴＤ１ｐＡｂよりも有意に優れていた。ｍＡｂ処理は灌流レベルを正常化することもできた（＊＊＊ｐ＝０．０００１ＵＴ対ｐＡｂ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ＵＴ対ｍＡｂ）。ＧＢＭを有するマウスのモノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理が腫瘍内の血管系を正常化することを示す。各処理群：ＵＴ対照（図２Ａ～Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図２Ｃ～Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図２Ｅ～Ｆ）のそれぞれのＭＲ灌流マップを有する代表的な形態学的画像。（図２Ｇ）腫瘍相対脳血流（ｒＣＢＦ）差の定量分析。ｒＣＢＦ灌流レベルは、両方の抗ＥＬＴＤ１処理で有意に増加し、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂがＥＬＴＤ１ｐＡｂよりも有意に優れていた。ｍＡｂ処理は灌流レベルを正常化することもできた（＊＊＊ｐ＝０．０００１ＵＴ対ｐＡｂ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ＵＴ対ｍＡｂ）。抗ＥＬＴＤ１抗体療法が、ＧＢＭを有するマウスの微小血管密度（ＭＶＤ）を減少させるのに効果的であることを示す。未処理（図３Ａ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理（図３Ｂ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図３Ｃ）動物由来のＣＤ３４の代表的なＩＨＣ画像（２０倍）。スライドの暗赤褐色の染色は、矢印で強調表示した腫瘍領域の血管を表す。（図３Ｄ）全ての処理群のＭＶＤ分析。ｐＡｂ処理及びｍＡｂ処理は、ＭＶＤを有意に減少させることができた（いずれも＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。また、ｐＡｂと比較してｍＡｂのＭＶＤが有意に減少した（＊＊ｐ＜０．０１）。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブが有意に高いＧＢＭ腫瘍に対する結合特異性を有することを示す。（図４Ａ）分子プローブ構築物。Ｇｄ－ＤＴＰＡシグナルがＭＲイメージングによりプローブを検出するために使用された一方で、ビオチン標識は処分（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）後の腫瘍組織内における局在化を可能にした。（図４Ｂ）分子プローブの相対発現パーセントは、Ｇｄ－ＤＴＰＡ成分の存在に起因するＴ１緩和またはＳＩのいずれかの変化を示す。ｍＡｂ結合プローブは、ＩｇＧ対照よりも有意に高いシグナル強度及びＴ１緩和時間を有したＴ１：＊ｐ＝０．０３０７（ＩｇＧ対ｐＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、＊＊＊ｐ＝０．０００２（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、ＳＩ：＊＊ｐ＝０．００８（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ））。（図４Ｃ、図４Ｄ）抗ＥＬＴＤ１モノクローナル結合分子プローブ（図４Ｃ）及び非特異的ＩｇＧ結合分子プローブ（図４Ｄ）の局在化及びクラスター化。（図４Ｅ）抗体結合プローブ：非特異的ＩｇＧ対照、ＥＬＴＤ１に対するｐＡｂ、及びＥＬＴＤ１に対するｍＡｂの動態。（図４Ｆ～Ｈ）非特異的ＩｇＧ結合プローブ（図４Ｆ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ結合プローブ（図４Ｇ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブ（図４Ｈ）を局在化するためにＳＡ－ＨＲＰで染色した代表的な画像（２０倍）。ｐＡｂ結合プローブ及びｍＡｂ結合プローブに見られる茶色の染色は、局在化したプローブである。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブが有意に高いＧＢＭ腫瘍に対する結合特異性を有することを示す。（図４Ａ）分子プローブ構築物。Ｇｄ－ＤＴＰＡシグナルがＭＲイメージングによりプローブを検出するために使用された一方で、ビオチン標識は処分（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）後の腫瘍組織内における局在化を可能にした。（図４Ｂ）分子プローブの相対発現パーセントは、Ｇｄ－ＤＴＰＡ成分の存在に起因するＴ１緩和またはＳＩのいずれかの変化を示す。ｍＡｂ結合プローブは、ＩｇＧ対照よりも有意に高いシグナル強度及びＴ１緩和時間を有したＴ１：＊ｐ＝０．０３０７（ＩｇＧ対ｐＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、＊＊＊ｐ＝０．０００２（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、ＳＩ：＊＊ｐ＝０．００８（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ））。（図４Ｃ、図４Ｄ）抗ＥＬＴＤ１モノクローナル結合分子プローブ（図４Ｃ）及び非特異的ＩｇＧ結合分子プローブ（図４Ｄ）の局在化及びクラスター化。（図４Ｅ）抗体結合プローブ：非特異的ＩｇＧ対照、ＥＬＴＤ１に対するｐＡｂ、及びＥＬＴＤ１に対するｍＡｂの動態。（図４Ｆ～Ｈ）非特異的ＩｇＧ結合プローブ（図４Ｆ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ結合プローブ（図４Ｇ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブ（図４Ｈ）を局在化するためにＳＡ－ＨＲＰで染色した代表的な画像（２０倍）。ｐＡｂ結合プローブ及びｍＡｂ結合プローブに見られる茶色の染色は、局在化したプローブである。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブが有意に高いＧＢＭ腫瘍に対する結合特異性を有することを示す。（図４Ａ）分子プローブ構築物。Ｇｄ－ＤＴＰＡシグナルがＭＲイメージングによりプローブを検出するために使用された一方で、ビオチン標識は処分（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）後の腫瘍組織内における局在化を可能にした。（図４Ｂ）分子プローブの相対発現パーセントは、Ｇｄ－ＤＴＰＡ成分の存在に起因するＴ１緩和またはＳＩのいずれかの変化を示す。ｍＡｂ結合プローブは、ＩｇＧ対照よりも有意に高いシグナル強度及びＴ１緩和時間を有したＴ１：＊ｐ＝０．０３０７（ＩｇＧ対ｐＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、＊＊＊ｐ＝０．０００２（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、ＳＩ：＊＊ｐ＝０．００８（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ））。（図４Ｃ、図４Ｄ）抗ＥＬＴＤ１モノクローナル結合分子プローブ（図４Ｃ）及び非特異的ＩｇＧ結合分子プローブ（図４Ｄ）の局在化及びクラスター化。（図４Ｅ）抗体結合プローブ：非特異的ＩｇＧ対照、ＥＬＴＤ１に対するｐＡｂ、及びＥＬＴＤ１に対するｍＡｂの動態。（図４Ｆ～Ｈ）非特異的ＩｇＧ結合プローブ（図４Ｆ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ結合プローブ（図４Ｇ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブ（図４Ｈ）を局在化するためにＳＡ－ＨＲＰで染色した代表的な画像（２０倍）。ｐＡｂ結合プローブ及びｍＡｂ結合プローブに見られる茶色の染色は、局在化したプローブである。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブが有意に高いＧＢＭ腫瘍に対する結合特異性を有することを示す。（図４Ａ）分子プローブ構築物。Ｇｄ－ＤＴＰＡシグナルがＭＲイメージングによりプローブを検出するために使用された一方で、ビオチン標識は処分（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）後の腫瘍組織内における局在化を可能にした。（図４Ｂ）分子プローブの相対発現パーセントは、Ｇｄ－ＤＴＰＡ成分の存在に起因するＴ１緩和またはＳＩのいずれかの変化を示す。ｍＡｂ結合プローブは、ＩｇＧ対照よりも有意に高いシグナル強度及びＴ１緩和時間を有したＴ１：＊ｐ＝０．０３０７（ＩｇＧ対ｐＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、＊＊＊ｐ＝０．０００２（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、ＳＩ：＊＊ｐ＝０．００８（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ））。（図４Ｃ、図４Ｄ）抗ＥＬＴＤ１モノクローナル結合分子プローブ（図４Ｃ）及び非特異的ＩｇＧ結合分子プローブ（図４Ｄ）の局在化及びクラスター化。（図４Ｅ）抗体結合プローブ：非特異的ＩｇＧ対照、ＥＬＴＤ１に対するｐＡｂ、及びＥＬＴＤ１に対するｍＡｂの動態。（図４Ｆ～Ｈ）非特異的ＩｇＧ結合プローブ（図４Ｆ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ結合プローブ（図４Ｇ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブ（図４Ｈ）を局在化するためにＳＡ－ＨＲＰで染色した代表的な画像（２０倍）。ｐＡｂ結合プローブ及びｍＡｂ結合プローブに見られる茶色の染色は、局在化したプローブである。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブが有意に高いＧＢＭ腫瘍に対する結合特異性を有することを示す。（図４Ａ）分子プローブ構築物。Ｇｄ－ＤＴＰＡシグナルがＭＲイメージングによりプローブを検出するために使用された一方で、ビオチン標識は処分（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）後の腫瘍組織内における局在化を可能にした。（図４Ｂ）分子プローブの相対発現パーセントは、Ｇｄ－ＤＴＰＡ成分の存在に起因するＴ１緩和またはＳＩのいずれかの変化を示す。ｍＡｂ結合プローブは、ＩｇＧ対照よりも有意に高いシグナル強度及びＴ１緩和時間を有したＴ１：＊ｐ＝０．０３０７（ＩｇＧ対ｐＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、＊＊＊ｐ＝０．０００２（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、ＳＩ：＊＊ｐ＝０．００８（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ））。（図４Ｃ、図４Ｄ）抗ＥＬＴＤ１モノクローナル結合分子プローブ（図４Ｃ）及び非特異的ＩｇＧ結合分子プローブ（図４Ｄ）の局在化及びクラスター化。（図４Ｅ）抗体結合プローブ：非特異的ＩｇＧ対照、ＥＬＴＤ１に対するｐＡｂ、及びＥＬＴＤ１に対するｍＡｂの動態。（図４Ｆ～Ｈ）非特異的ＩｇＧ結合プローブ（図４Ｆ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ結合プローブ（図４Ｇ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブ（図４Ｈ）を局在化するためにＳＡ－ＨＲＰで染色した代表的な画像（２０倍）。ｐＡｂ結合プローブ及びｍＡｂ結合プローブに見られる茶色の染色は、局在化したプローブである。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブが有意に高いＧＢＭ腫瘍に対する結合特異性を有することを示す。（図４Ａ）分子プローブ構築物。Ｇｄ－ＤＴＰＡシグナルがＭＲイメージングによりプローブを検出するために使用された一方で、ビオチン標識は処分（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）後の腫瘍組織内における局在化を可能にした。（図４Ｂ）分子プローブの相対発現パーセントは、Ｇｄ－ＤＴＰＡ成分の存在に起因するＴ１緩和またはＳＩのいずれかの変化を示す。ｍＡｂ結合プローブは、ＩｇＧ対照よりも有意に高いシグナル強度及びＴ１緩和時間を有したＴ１：＊ｐ＝０．０３０７（ＩｇＧ対ｐＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、＊＊＊ｐ＝０．０００２（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、ＳＩ：＊＊ｐ＝０．００８（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ））。（図４Ｃ、図４Ｄ）抗ＥＬＴＤ１モノクローナル結合分子プローブ（図４Ｃ）及び非特異的ＩｇＧ結合分子プローブ（図４Ｄ）の局在化及びクラスター化。（図４Ｅ）抗体結合プローブ：非特異的ＩｇＧ対照、ＥＬＴＤ１に対するｐＡｂ、及びＥＬＴＤ１に対するｍＡｂの動態。（図４Ｆ～Ｈ）非特異的ＩｇＧ結合プローブ（図４Ｆ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ結合プローブ（図４Ｇ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブ（図４Ｈ）を局在化するためにＳＡ－ＨＲＰで染色した代表的な画像（２０倍）。ｐＡｂ結合プローブ及びｍＡｂ結合プローブに見られる茶色の染色は、局在化したプローブである。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブが有意に高いＧＢＭ腫瘍に対する結合特異性を有することを示す。（図４Ａ）分子プローブ構築物。Ｇｄ－ＤＴＰＡシグナルがＭＲイメージングによりプローブを検出するために使用された一方で、ビオチン標識は処分（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）後の腫瘍組織内における局在化を可能にした。（図４Ｂ）分子プローブの相対発現パーセントは、Ｇｄ－ＤＴＰＡ成分の存在に起因するＴ１緩和またはＳＩのいずれかの変化を示す。ｍＡｂ結合プローブは、ＩｇＧ対照よりも有意に高いシグナル強度及びＴ１緩和時間を有したＴ１：＊ｐ＝０．０３０７（ＩｇＧ対ｐＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、＊＊＊ｐ＝０．０００２（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、ＳＩ：＊＊ｐ＝０．００８（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ））。（図４Ｃ、図４Ｄ）抗ＥＬＴＤ１モノクローナル結合分子プローブ（図４Ｃ）及び非特異的ＩｇＧ結合分子プローブ（図４Ｄ）の局在化及びクラスター化。（図４Ｅ）抗体結合プローブ：非特異的ＩｇＧ対照、ＥＬＴＤ１に対するｐＡｂ、及びＥＬＴＤ１に対するｍＡｂの動態。（図４Ｆ～Ｈ）非特異的ＩｇＧ結合プローブ（図４Ｆ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ結合プローブ（図４Ｇ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブ（図４Ｈ）を局在化するためにＳＡ－ＨＲＰで染色した代表的な画像（２０倍）。ｐＡｂ結合プローブ及びｍＡｂ結合プローブに見られる茶色の染色は、局在化したプローブである。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブが有意に高いＧＢＭ腫瘍に対する結合特異性を有することを示す。（図４Ａ）分子プローブ構築物。Ｇｄ－ＤＴＰＡシグナルがＭＲイメージングによりプローブを検出するために使用された一方で、ビオチン標識は処分（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）後の腫瘍組織内における局在化を可能にした。（図４Ｂ）分子プローブの相対発現パーセントは、Ｇｄ－ＤＴＰＡ成分の存在に起因するＴ１緩和またはＳＩのいずれかの変化を示す。ｍＡｂ結合プローブは、ＩｇＧ対照よりも有意に高いシグナル強度及びＴ１緩和時間を有したＴ１：＊ｐ＝０．０３０７（ＩｇＧ対ｐＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、＊＊＊ｐ＝０．０００２（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ）、ＳＩ：＊＊ｐ＝０．００８（ＩｇＧ対ｍＡｂＥＬＴＤ１プローブ））。（図４Ｃ、図４Ｄ）抗ＥＬＴＤ１モノクローナル結合分子プローブ（図４Ｃ）及び非特異的ＩｇＧ結合分子プローブ（図４Ｄ）の局在化及びクラスター化。（図４Ｅ）抗体結合プローブ：非特異的ＩｇＧ対照、ＥＬＴＤ１に対するｐＡｂ、及びＥＬＴＤ１に対するｍＡｂの動態。（図４Ｆ～Ｈ）非特異的ＩｇＧ結合プローブ（図４Ｆ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ結合プローブ（図４Ｇ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブ（図４Ｈ）を局在化するためにＳＡ－ＨＲＰで染色した代表的な画像（２０倍）。ｐＡｂ結合プローブ及びｍＡｂ結合プローブに見られる茶色の染色は、局在化したプローブである。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理がＮｏｔｃｈ１レベルを有意に減少させることを示す。（図５Ａ～Ｄ）未処理動物（図５Ａ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図５Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図５Ｃ）、及び対側（contralateral）対照染色組織（図５Ｄ）における抗Ｎｏｔｃｈ１を有するＩＨＣ染色腫瘍の代表的な画像（２０倍）。（図５Ｅ）試料の定量的陽性Ｎｏｔｃｈ染色。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂで処理したマウスは、未治療の動物及び抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂで処理した動物の両方と比較して、Ｎｏｔｃｈレベルを有意に低下させた。未処理動物とｐＡｂ処理動物との間、及びｍＡｂ処理動物と対側（健常対照）組織との間に、有意差はなかった。対側（対照）組織Ｎｏｔｃｈレベルは、未処理動物及びｐＡｂ処理動物よりも有意に低かった（＊ｐ＝０．０３５７（ｍＡｂ対ｐＡｂ）、＊＊ｐ＝０．００１５（対照対ｐＡｂ）、＊＊＊ｐ＝０．０００６（ＵＴ対ｍＡｂ）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＵＴ対対照））。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理がＮｏｔｃｈ１レベルを有意に減少させることを示す。（図５Ａ～Ｄ）未処理動物（図５Ａ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図５Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図５Ｃ）、及び対側対照染色組織（図５Ｄ）における抗Ｎｏｔｃｈ１を有するＩＨＣ染色腫瘍の代表的な画像（２０倍）。（図５Ｅ）試料の定量的陽性Ｎｏｔｃｈ染色。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂで処理したマウスは、未治療の動物及び抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂで処理した動物の両方と比較して、Ｎｏｔｃｈレベルを有意に低下させた。未処理動物とｐＡｂ処理動物との間、及びｍＡｂ処理動物と対側（健常対照）組織との間に、有意差はなかった。対側（対照）組織Ｎｏｔｃｈレベルは、未処理動物及びｐＡｂ処理動物よりも有意に低かった（＊ｐ＝０．０３５７（ｍＡｂ対ｐＡｂ）、＊＊ｐ＝０．００１５（対照対ｐＡｂ）、＊＊＊ｐ＝０．０００６（ＵＴ対ｍＡｂ）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＵＴ対対照））。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理がＮｏｔｃｈ１レベルを有意に減少させることを示す。（図５Ａ～Ｄ）未処理動物（図５Ａ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図５Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図５Ｃ）、及び対側対照染色組織（図５Ｄ）における抗Ｎｏｔｃｈ１を有するＩＨＣ染色腫瘍の代表的な画像（２０倍）。（図５Ｅ）試料の定量的陽性Ｎｏｔｃｈ染色。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂで処理したマウスは、未治療の動物及び抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂで処理した動物の両方と比較して、Ｎｏｔｃｈレベルを有意に低下させた。未処理動物とｐＡｂ処理動物との間、及びｍＡｂ処理動物と対側（健常対照）組織との間に、有意差はなかった。対側（対照）組織Ｎｏｔｃｈレベルは、未処理動物及びｐＡｂ処理動物よりも有意に低かった（＊ｐ＝０．０３５７（ｍＡｂ対ｐＡｂ）、＊＊ｐ＝０．００１５（対照対ｐＡｂ）、＊＊＊ｐ＝０．０００６（ＵＴ対ｍＡｂ）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＵＴ対対照））。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理がＮｏｔｃｈ１レベルを有意に減少させることを示す。（図５Ａ～Ｄ）未処理動物（図５Ａ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図５Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図５Ｃ）、及び対側対照染色組織（図５Ｄ）における抗Ｎｏｔｃｈ１を有するＩＨＣ染色腫瘍の代表的な画像（２０倍）。（図５Ｅ）試料の定量的陽性Ｎｏｔｃｈ染色。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂで処理したマウスは、未治療の動物及び抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂで処理した動物の両方と比較して、Ｎｏｔｃｈレベルを有意に低下させた。未処理動物とｐＡｂ処理動物との間、及びｍＡｂ処理動物と対側（健常対照）組織との間に、有意差はなかった。対側（対照）組織Ｎｏｔｃｈレベルは、未処理動物及びｐＡｂ処理動物よりも有意に低かった（＊ｐ＝０．０３５７（ｍＡｂ対ｐＡｂ）、＊＊ｐ＝０．００１５（対照対ｐＡｂ）、＊＊＊ｐ＝０．０００６（ＵＴ対ｍＡｂ）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＵＴ対対照））。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理がＮｏｔｃｈ１レベルを有意に減少させることを示す。（図５Ａ～Ｄ）未処理動物（図５Ａ）、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物（図５Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理動物（図５Ｃ）、及び対側対照染色組織（図５Ｄ）における抗Ｎｏｔｃｈ１を有するＩＨＣ染色腫瘍の代表的な画像（２０倍）。（図５Ｅ）試料の定量的陽性Ｎｏｔｃｈ染色。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂで処理したマウスは、未治療の動物及び抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂで処理した動物の両方と比較して、Ｎｏｔｃｈレベルを有意に低下させた。未処理動物とｐＡｂ処理動物との間、及びｍＡｂ処理動物と対側（健常対照）組織との間に、有意差はなかった。対側（対照）組織Ｎｏｔｃｈレベルは、未処理動物及びｐＡｂ処理動物よりも有意に低かった（＊ｐ＝０．０３５７（ｍＡｂ対ｐＡｂ）、＊＊ｐ＝０．００１５（対照対ｐＡｂ）、＊＊＊ｐ＝０．０００６（ＵＴ対ｍＡｂ）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＵＴ対対照））。ＲＮＡ配列分析から得た、上方制御（赤色）から下方制御（青色）までの、ＧＢＭを有するＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理マウスを、ＧＢＭを有するＵＴマウスと比較した場合の遺伝子倍率変化を示す。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴ１ｍＡｂ処理後に抑制した遺伝子の遺伝子間相関性。赤色＝正の相関、緑色＝負の相関。公開されている共通点の観点から遺伝子群を分類するための文献分析ソフトウェアを使用して、それらは、大まかに４つのカテゴリー（発生遺伝子、ネスチン関連、細胞増殖／血管新生、及び星状細胞／ミクログリア炎症）に分類される。抗ＥＬＴＤ１処理が、ＧＭＢ腫瘍検出後の生存率パーセントの上昇、ならびに腫瘍体積の減少に成功したことを示す。（図７Ａ）ＥＬＴＤ１に対する抗体処理であるｍＡｂ（モノクローナル）処理（＊＊ｐ＝０．００５８）及びｓｃＦｖ断片（断片）処理（＊＊＊ｐ＝０．０００１）のいずれも、生存率パーセント曲線に示されるように、ＵＴ対照動物と比較して腫瘍生存率パーセントを有意に上昇させた。（図７Ｂ）ＧＢＭを有するマウスの腫瘍体積も、未処理の動物と比較して、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ（＊ｐ＝０．０００９）及びｓｃＦｖ断片（＊ｐ＝０．０１７）で有意に低いことが見出された。未処理（図７Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図７Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図７Ｅ）マウスの代表的な形態学的腫瘍画像によっても示される。抗ＥＬＴＤ１処理が、ＧＭＢ腫瘍検出後の生存率パーセントの上昇、ならびに腫瘍体積の減少に成功したことを示す。（図７Ａ）ＥＬＴＤ１に対する抗体処理であるｍＡｂ（モノクローナル）処理（＊＊ｐ＝０．００５８）及びｓｃＦｖ断片（断片）処理（＊＊＊ｐ＝０．０００１）のいずれも、生存率パーセント曲線に示されるように、ＵＴ対照動物と比較して腫瘍生存率パーセントを有意に上昇させた。（図７Ｂ）ＧＢＭを有するマウスの腫瘍体積も、未処理の動物と比較して、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ（＊ｐ＝０．０００９）及びｓｃＦｖ断片（＊ｐ＝０．０１７）で有意に低いことが見出された。未処理（図７Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図７Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図７Ｅ）マウスの代表的な形態学的腫瘍画像によっても示される。抗ＥＬＴＤ１処理が、ＧＭＢ腫瘍検出後の生存率パーセントの上昇、ならびに腫瘍体積の減少に成功したことを示す。（図７Ａ）ＥＬＴＤ１に対する抗体処理であるｍＡｂ（モノクローナル）処理（＊＊ｐ＝０．００５８）及びｓｃＦｖ断片（断片）処理（＊＊＊ｐ＝０．０００１）のいずれも、生存率パーセント曲線に示されるように、ＵＴ対照動物と比較して腫瘍生存率パーセントを有意に上昇させた。（図７Ｂ）ＧＢＭを有するマウスの腫瘍体積も、未処理の動物と比較して、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ（＊ｐ＝０．０００９）及びｓｃＦｖ断片（＊ｐ＝０．０１７）で有意に低いことが見出された。未処理（図７Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図７Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図７Ｅ）マウスの代表的な形態学的腫瘍画像によっても示される。抗ＥＬＴＤ１処理が、ＧＭＢ腫瘍検出後の生存率パーセントの上昇、ならびに腫瘍体積の減少に成功したことを示す。（図７Ａ）ＥＬＴＤ１に対する抗体処理であるｍＡｂ（モノクローナル）処理（＊＊ｐ＝０．００５８）及びｓｃＦｖ断片（断片）処理（＊＊＊ｐ＝０．０００１）のいずれも、生存率パーセント曲線に示されるように、ＵＴ対照動物と比較して腫瘍生存率パーセントを有意に上昇させた。（図７Ｂ）ＧＢＭを有するマウスの腫瘍体積も、未処理の動物と比較して、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ（＊ｐ＝０．０００９）及びｓｃＦｖ断片（＊ｐ＝０．０１７）で有意に低いことが見出された。未処理（図７Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図７Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図７Ｅ）マウスの代表的な形態学的腫瘍画像によっても示される。抗ＥＬＴＤ１処理が、ＧＭＢ腫瘍検出後の生存率パーセントの上昇、ならびに腫瘍体積の減少に成功したことを示す。（図７Ａ）ＥＬＴＤ１に対する抗体処理であるｍＡｂ（モノクローナル）処理（＊＊ｐ＝０．００５８）及びｓｃＦｖ断片（断片）処理（＊＊＊ｐ＝０．０００１）のいずれも、生存率パーセント曲線に示されるように、ＵＴ対照動物と比較して腫瘍生存率パーセントを有意に上昇させた。（図７Ｂ）ＧＢＭを有するマウスの腫瘍体積も、未処理の動物と比較して、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ（＊ｐ＝０．０００９）及びｓｃＦｖ断片（＊ｐ＝０．０１７）で有意に低いことが見出された。未処理（図７Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図７Ｄ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図７Ｅ）マウスの代表的な形態学的腫瘍画像によっても示される。相対脳血流（ｒＣＢＦ）がＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理で正常化されたことを示す。（図８Ａ）抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理は、未処理のマウスと比較してｒＣＢＦの減少を最小限に抑えるのに有意により効果的であった（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。未処理（図８Ｂ、８Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図８Ｄ、８Ｅ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図８Ｆ、８Ｇ）動物の代表的な形態学的画像及び灌流マップを示す。相対脳血流（ｒＣＢＦ）がＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理で正常化されたことを示す。（図８Ａ）抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理は、未処理のマウスと比較してｒＣＢＦの減少を最小限に抑えるのに有意により効果的であった（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。未処理（図８Ｂ、８Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図８Ｄ、８Ｅ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図８Ｆ、８Ｇ）動物の代表的な形態学的画像及び灌流マップを示す。相対脳血流（ｒＣＢＦ）がＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理で正常化されたことを示す。（図８Ａ）抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理は、未処理のマウスと比較してｒＣＢＦの減少を最小限に抑えるのに有意により効果的であった（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。未処理（図８Ｂ、８Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図８Ｄ、８Ｅ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図８Ｆ、８Ｇ）動物の代表的な形態学的画像及び灌流マップを示す。相対脳血流（ｒＣＢＦ）がＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理で正常化されたことを示す。（図８Ａ）抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理は、未処理のマウスと比較してｒＣＢＦの減少を最小限に抑えるのに有意により効果的であった（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。未処理（図８Ｂ、８Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図８Ｄ、８Ｅ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図８Ｆ、８Ｇ）動物の代表的な形態学的画像及び灌流マップを示す。相対脳血流（ｒＣＢＦ）がＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理で正常化されたことを示す。（図８Ａ）抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理は、未処理のマウスと比較してｒＣＢＦの減少を最小限に抑えるのに有意により効果的であった（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。未処理（図８Ｂ、８Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図８Ｄ、８Ｅ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図８Ｆ、８Ｇ）動物の代表的な形態学的画像及び灌流マップを示す。相対脳血流（ｒＣＢＦ）がＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理で正常化されたことを示す。（図８Ａ）抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理は、未処理のマウスと比較してｒＣＢＦの減少を最小限に抑えるのに有意により効果的であった（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。未処理（図８Ｂ、８Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図８Ｄ、８Ｅ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図８Ｆ、８Ｇ）動物の代表的な形態学的画像及び灌流マップを示す。相対脳血流（ｒＣＢＦ）がＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理で正常化されたことを示す。（図８Ａ）抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理は、未処理のマウスと比較してｒＣＢＦの減少を最小限に抑えるのに有意により効果的であった（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。未処理（図８Ｂ、８Ｃ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図８Ｄ、８Ｅ）、及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理（図８Ｆ、８Ｇ）動物の代表的な形態学的画像及び灌流マップを示す。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理が腫瘍関連血管系を有意に減少させたことを示す。ＭＶＤを処理群毎にＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを使用して分析した。未処理（図９Ａ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図９Ｂ）、及びｓｃＦｖ断片処理（図９Ｃ）動物のＣＤ３４染色の代表的なＩＨＣ画像（２０倍）を示す。矢印は、腫瘍領域で見つかった血管を指している。（図９Ｄ）ＥＬＴＤ１に対するｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理のいずれも腫瘍領域内の微小血管密度を有意に減少させた（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理が腫瘍関連血管系を有意に減少させたことを示す。ＭＶＤを処理群毎にＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを使用して分析した。未処理（図９Ａ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図９Ｂ）、及びｓｃＦｖ断片処理（図９Ｃ）動物のＣＤ３４染色の代表的なＩＨＣ画像（２０倍）を示す。矢印は、腫瘍領域で見つかった血管を指している。（図９Ｄ）ＥＬＴＤ１に対するｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理のいずれも腫瘍領域内の微小血管密度を有意に減少させた（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理が腫瘍関連血管系を有意に減少させたことを示す。ＭＶＤを処理群毎にＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを使用して分析した。未処理（図９Ａ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図９Ｂ）、及びｓｃＦｖ断片処理（図９Ｃ）動物のＣＤ３４染色の代表的なＩＨＣ画像（２０倍）を示す。矢印は、腫瘍領域で見つかった血管を指している。（図９Ｄ）ＥＬＴＤ１に対するｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理のいずれも腫瘍領域内の微小血管密度を有意に減少させた（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理が腫瘍関連血管系を有意に減少させたことを示す。ＭＶＤを処理群毎にＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを使用して分析した。未処理（図９Ａ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（図９Ｂ）、及びｓｃＦｖ断片処理（図９Ｃ）動物のＣＤ３４染色の代表的なＩＨＣ画像（２０倍）を示す。矢印は、腫瘍領域で見つかった血管を指している。（図９Ｄ）ＥＬＴＤ１に対するｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理のいずれも腫瘍領域内の微小血管密度を有意に減少させた（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理がＮｏｔｃｈ１レベルを減少させたことを示す。Ｎｏｔｃｈ１陽性を処理群毎にＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを用いて分析し（図１０Ａ）、全ての処理群にＮｏｔｃｈ１陽性染色を行った。対側正常組織は、ＵＴ動物と比較してＮｏｔｃｈ１染色が有意に減少した。両方の抗ＥＴＬＤ１処理は、Ｎｏｔｃｈ１レベルを減少させ、対側組織で見られるＮｏｔｃｈ１レベルに正常化することに成功した。未処理マウス（図１０Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理マウス（図１０Ｃ）、ｓｃＦｖ断片処理マウス（図１０Ｄ）、及び対側対照組織（図１０Ｅ）由来の腫瘍組織のＮｏｔｃｈ１染色の代表的なＩＨＣ画像（２０倍）（＊＊＊ｐ＝０．０００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理がＮｏｔｃｈ１レベルを減少させたことを示す。Ｎｏｔｃｈ１陽性を処理群毎にＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを用いて分析し（図１０Ａ）、全ての処理群にＮｏｔｃｈ１陽性染色を行った。対側正常組織は、ＵＴ動物と比較してＮｏｔｃｈ１染色が有意に減少した。両方の抗ＥＴＬＤ１処理は、Ｎｏｔｃｈ１レベルを減少させ、対側組織で見られるＮｏｔｃｈ１レベルに正常化することに成功した。未処理マウス（図１０Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理マウス（図１０Ｃ）、ｓｃＦｖ断片処理マウス（図１０Ｄ）、及び対側対照組織（図１０Ｅ）由来の腫瘍組織のＮｏｔｃｈ１染色の代表的なＩＨＣ画像（２０倍）（＊＊＊ｐ＝０．０００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理がＮｏｔｃｈ１レベルを減少させたことを示す。Ｎｏｔｃｈ１陽性を処理群毎にＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを用いて分析し（図１０Ａ）、全ての処理群にＮｏｔｃｈ１陽性染色を行った。対側正常組織は、ＵＴ動物と比較してＮｏｔｃｈ１染色が有意に減少した。両方の抗ＥＴＬＤ１処理は、Ｎｏｔｃｈ１レベルを減少させ、対側組織で見られるＮｏｔｃｈ１レベルに正常化することに成功した。未処理マウス（図１０Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理マウス（図１０Ｃ）、ｓｃＦｖ断片処理マウス（図１０Ｄ）、及び対側対照組織（図１０Ｅ）由来の腫瘍組織のＮｏｔｃｈ１染色の代表的なＩＨＣ画像（２０倍）（＊＊＊ｐ＝０．０００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理がＮｏｔｃｈ１レベルを減少させたことを示す。Ｎｏｔｃｈ１陽性を処理群毎にＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを用いて分析し（図１０Ａ）、全ての処理群にＮｏｔｃｈ１陽性染色を行った。対側正常組織は、ＵＴ動物と比較してＮｏｔｃｈ１染色が有意に減少した。両方の抗ＥＴＬＤ１処理は、Ｎｏｔｃｈ１レベルを減少させ、対側組織で見られるＮｏｔｃｈ１レベルに正常化することに成功した。未処理マウス（図１０Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理マウス（図１０Ｃ）、ｓｃＦｖ断片処理マウス（図１０Ｄ）、及び対側対照組織（図１０Ｅ）由来の腫瘍組織のＮｏｔｃｈ１染色の代表的なＩＨＣ画像（２０倍）（＊＊＊ｐ＝０．０００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＧＢＭを有するマウスの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理がＮｏｔｃｈ１レベルを減少させたことを示す。Ｎｏｔｃｈ１陽性を処理群毎にＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを用いて分析し（図１０Ａ）、全ての処理群にＮｏｔｃｈ１陽性染色を行った。対側正常組織は、ＵＴ動物と比較してＮｏｔｃｈ１染色が有意に減少した。両方の抗ＥＴＬＤ１処理は、Ｎｏｔｃｈ１レベルを減少させ、対側組織で見られるＮｏｔｃｈ１レベルに正常化することに成功した。未処理マウス（図１０Ｂ）、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理マウス（図１０Ｃ）、ｓｃＦｖ断片処理マウス（図１０Ｄ）、及び対側対照組織（図１０Ｅ）由来の腫瘍組織のＮｏｔｃｈ１染色の代表的なＩＨＣ画像（２０倍）（＊＊＊ｐ＝０．０００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。抗ＥＬＴＤ１Ａｂ結合プローブが腫瘍領域に到達して浸潤することに成功したことを示す。（図１１Ａ）非特異的ＩｇＧ、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ、または抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片のいずれかに結合した分子標的プローブの構築物。（図１１Ｃ）ｍＡｂ結合プローブの９０分にわたる結合、及び（図１１Ｄ）ｓｃＦｖ断片結合プローブの１８０分にわたる結合。（図１１Ｂ）シグナル強度は、モノクローナル及び断片抗ＥＬＴＤ１結合プローブによって有意に増加した（＊＊ｐ＝０．００３８、＊＊＊ｐ＝０．０００７）。抗ＥＬＴＤ１Ａｂ結合プローブが腫瘍領域に到達して浸潤することに成功したことを示す。（図１１Ａ）非特異的ＩｇＧ、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ、または抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片のいずれかに結合した分子標的プローブの構築物。（図１１Ｃ）ｍＡｂ結合プローブの９０分にわたる結合、及び（図１１Ｄ）ｓｃＦｖ断片結合プローブの１８０分にわたる結合。（図１１Ｂ）シグナル強度は、モノクローナル及び断片抗ＥＬＴＤ１結合プローブによって有意に増加した（＊＊ｐ＝０．００３８、＊＊＊ｐ＝０．０００７）。抗ＥＬＴＤ１Ａｂ結合プローブが腫瘍領域に到達して浸潤することに成功したことを示す。（図１１Ａ）非特異的ＩｇＧ、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ、または抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片のいずれかに結合した分子標的プローブの構築物。（図１１Ｃ）ｍＡｂ結合プローブの９０分にわたる結合、及び（図１１Ｄ）ｓｃＦｖ断片結合プローブの１８０分にわたる結合。（図１１Ｂ）シグナル強度は、モノクローナル及び断片抗ＥＬＴＤ１結合プローブによって有意に増加した（＊＊ｐ＝０．００３８、＊＊＊ｐ＝０．０００７）。抗ＥＬＴＤ１Ａｂ結合プローブが腫瘍領域に到達して浸潤することに成功したことを示す。（図１１Ａ）非特異的ＩｇＧ、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ、または抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片のいずれかに結合した分子標的プローブの構築物。（図１１Ｃ）ｍＡｂ結合プローブの９０分にわたる結合、及び（図１１Ｄ）ｓｃＦｖ断片結合プローブの１８０分にわたる結合。（図１１Ｂ）シグナル強度は、モノクローナル及び断片抗ＥＬＴＤ１結合プローブによって有意に増加した（＊＊ｐ＝０．００３８、＊＊＊ｐ＝０．０００７）。抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片結合分子プローブが、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）では見られないびまん性腫瘍領域に到達してそれを標的とすることに成功したことを示す。（Ａ、Ｂ）上部ボクセル：バルク腫瘍（Ｈ＆Ｅによって検証、Ａ）は、ＳＡ－ＨＲＰ（Ｂ）により示されるように、抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片結合分子プローブの痕跡を有した。（Ｃ、Ｄ）下部ボクセル：抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片結合分子プローブは、Ｈ＆Ｅ画像（Ｃ）及びＳＡ－ＨＲＰ画像（Ｄ）により示されるように、びまん性腫瘍領域に到達することに成功した。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理がＧ５５神経膠腫において抗ＶＥＧＦｍＡｂ（アバスチン）処理よりも少ない出血（陽性パーセントの測定）と関連していることを示す。未処理のマウス、または抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ、もしくはアバスチンのいずれかで処理したマウスのいずれかのＧ５５腫瘍由来の組織学鉄染色組織切片。アバスチンで処理したマウスの高レベルの出血（増加したレベルの鉄染色）に留意されたい。他の群と比較してアバスチン処理マウス由来の組織の出血が有意に増加した（全てｐ＜０．０１）。Ｇ５５神経膠腫において抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理及びｓｃＦｖ断片処理が抗ＶＥＧＦｍＡｂ（アバスチン）処理よりも低いＮｏｔｃｈレベル（陽性パーセントの測定）を有することを示す。未処理のマウス、または抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ、抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片、もしくはアバスチンのいずれかで処理したマウスのいずれかのＧ５５腫瘍由来のＮｏｔｃｈ染色組織切片。アバスチンで処理したマウスのＮｏｔｃｈレベルが高いことに留意されたい。未処理（対側）マウスまたはアバスチン処理（アバスチン対側）マウス由来の対側組織を比較のために含めた。他の群と比較してアバスチン処理組織のＮｏｔｃｈレベルが有意に増加した（全てｐ＜０．０５）。未処理（ＵＴ）のＮｏｔｃｈレベルも他の群と比較して有意に高かった（全てｐ＜０．０１）。対照動物と比較した疾患進行後２７日目の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスの頸髄の変化を示すＴ２ＭＲＩスキャンを示す。対照動物と比較した疾患進行後１０日目（ＥＡＥ－Ｅ）の早期及び２６日目（ＥＡＥ－Ｌ）の後期に取得したＧｄ－ＤＴＰＡＭＲＩ造影剤を使用して得た造影像及びＴ１強調ＭＲＩスキャンを示す。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブを示す。ＥＬＴＤ１の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、Ｇｄ－ＤＴＰＡ及びビオチンが構築物に結合したアルブミンにコンジュゲートした。非選択的対照ＭＲＩ造影剤と比較してｍＡｂ抗ＥＬＴＤ１ＭＲＩプローブが多発性硬化症（ＭＳ）のＥＡＥマウスモデルにおける様々な脳領域に効率的に結合することを示す。ｐ＜０．０００１。抗ＥＬＴＤ１プローブを対照ＩｇＧ造影剤と比較した場合のＴ１緩和率パーセントの変化。非選択的対照ＭＲＩ造影剤と比較してｍＡｂ抗ＥＬＴＤ１ＭＲＩプローブが多発性硬化症（ＭＳ）のＥＡＥマウスモデルにおける様々な脳領域に効率的に結合することを示す。ｐ＜０．０００１。抗ＥＬＴＤ１プローブを対照ＩｇＧ造影剤と比較した場合のＴ１緩和率パーセントの変化。非選択的対照ＭＲＩ造影剤と比較してｍＡｂ抗ＥＬＴＤ１ＭＲＩプローブが多発性硬化症（ＭＳ）のＥＡＥマウスモデルにおける様々な脳領域に効率的に結合することを示す。ｐ＜０．０００１。抗ＥＬＴＤ１プローブを対照ＩｇＧ造影剤と比較した場合のＴ１緩和率パーセントの変化。（図１９Ａ）ｍＡｂ抗ＥＬＴＤ１ＭＲＩプローブがＭＳのＥＡＥマウスモデルの脳内の内皮細胞に効率的に結合することを示す。ＥＬＴＤ１の分子標的ＭＲイメージング（ストレプトアビジン－ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）が抗ＥＬＴＤ１プローブのビオチン部分に結合する）。（図１９Ｂ）ＥＬＴＤ１の免疫組織化学染色は、ＥＡＥマウスの内皮細胞において高レベルを示す。

本発明の様々な実施形態の作成及び使用が以下で詳細に考察されるが、本発明が、多種多様な特定の状況で具体化され得る多くの適用可能な発明概念を提供することを理解されたい。本明細書で考察される特定の実施形態は、本発明を作成及び使用するための特定の方法の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語が以下に定義される。本明細書で定義される用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの用語は、単一の実体のみを指すようには意図されておらず、特定の例が説明に使用され得る一般的なクラスを含む。本明細書の専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説される場合を除いて、本発明を限定するものではない。

上で考察されたように、ＥＬＴＤｌは、血管新生に関与することが知られており、膠芽腫に関連している。生物学及び疾患におけるその役割については他にほとんど知られていない。ここで、本発明者らは、ＥＬＴＤ１が多発性硬化症及び網膜症を含む他の疾患の診断及び治療に有用であり、より一般的には、組織再生において重要である可能性があることを示した。本発明者らは、ＥＬＴＤｌに対する本明細書で教示される抗体を使用した。

本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗体ペプチド（複数可）」という用語は、インタクトな抗体、または特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその結合断片を指す。結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的または化学的切断によって生成される。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体が含まれる。「二重特異性」または「二機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位が各々同一であると理解されている。抗体は、過剰な抗体が対抗受容体に結合した受容体の量を少なくとも約２０％、４０％、６０％、または８０％、より一般的には約８５％超（インビトロ競合結合アッセイで測定される）減少させた場合、受容体の対抗受容体への接着を実質的に阻害する。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長抗体または他の二価のＦｃ領域含有抗体、例えば、二価のｓｃＦｖＦｃ融合抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ）を包含する。抗体（Ａｂ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体が特定の抗原に対して結合特異性を示す一方で、免疫グロブリンには、抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで産生され、骨髄腫によって増加したレベルで産生される。本発明は、完全に組換えである、言い換えれば、相補性決定領域（ＣＤＲ）が、しばしば抗体のベニアリングと称されるヒト抗体骨格に遺伝的にスプライシングされるモノクローナル抗体（及びその結合断片）を含む。したがって、ある特定の態様では、モノクローナル抗体は、完全に合成された抗体である。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体（及びその結合断片）は、植物細胞を含む細菌細胞または真核細胞において作製され得る。

本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、全長抗体の一部、一般に、抗原結合または可変領域を指し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片を含む。抗体のパパイン消化により、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する名称である残りの「Ｆｃ」断片とが得られる。ペプシン処理により、抗原を架橋することができる２つの抗原結合断片を有するＦ（ａｂ’）_２断片と、他の残りの断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。本明細書で使用される場合、抗体に関する「機能性断片」とは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、及びＦ（ａｂ’）_２断片を指す。

本明細書で使用される場合、「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合性会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ二量体）からなる。この立体配置で、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶ_Ｈ－Ｖ_Ｌ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。集合的に、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含むＦｖの半分）でさえも、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。

Ｆ（ａｂ）とも命名されるＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端への数個の残基の付加だけ、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における命名である。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）_２ペプシン消化産物のヒンジシステインでのジスルフィド結合の切断によって生成される。抗体断片の追加の化学的カップリングが当業者に既知である。

天然抗体及び免疫グロブリンは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に結合している。一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。重鎖及び軽鎖は各々、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、その後にいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し、その他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている（Ｃｌｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，６５１－６６，１９８５）、ＮｏｖｏｔｎｙａｎｄＨａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２４５９２－４５９６（１９８５）（関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。

本明細書で使用される場合、「単離された」抗体とは、それが産生された環境の成分から特定及び分離及び／または回収されたものである。その産生環境の混入成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する材料であり、これらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。ある特定の実施形態では、抗体は、１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定される、５０重量％超、例えば、７５重量％超、または８５重量％超、または９５重量％超、または９９重量％超の抗体になるまで、２）回転カップ配列決定装置の使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１０個の残基、例えば、配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度になるまで、３）クマシーブルー、または好ましくは、銀染色を使用した還元または非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥにより同種になるまで、少なくとも３つの異なる方法によって測定可能なものとして精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。

本明細書で使用される場合、「抗体変異体」という用語は、アミノ酸残基のうちの１つ以上が修飾されている抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。かかる変異体は、必然的に、抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列と１００％未満の配列同一性または類似性を有する。

抗体の可変ドメインとの関連で「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が抗体間で配列の点で広範に異なり、かつその特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。それは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域という別名でも知られている相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。ＣＤＲを決定するための技法が少なくとも２つ存在し、これらは、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７）、及び（２）抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔａｌ．（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７）、またはＣｈｏｔｈｉａ＋Ｋａｂａｔであるそれらの両方である。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ領域を含み、主にβシート立体配置を採用し、３つのＣＤＲによって接続されており、これらは、βシート構造を接続し、ある場合には、βシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域によってごく接近して一緒に保持され、他方の鎖由来のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．を参照のこと）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。

任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明らかに異なる種類の一方に割り当てられ得る。

それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、「免疫グロブリン」が異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、及びＩｇＧ４；ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象としている。さらに、異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象としている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンが混入されていないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、開示され、かつ特許請求される本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９５（１９７５）（関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）によって最初に説明されたハイブリドーマ法によって作製され得る。

開示され、かつ特許請求される本発明に従って利用される全てのモノクローナル抗体は、（１）本明細書の以下でより詳細に説明される計画的免疫化プロトコルの結果、または（２）疾患またはがんの過程で自然に抗体の産生をもたらす免疫応答の結果のいずれかである。

開示され、かつ特許請求される本発明のモノクローナル抗体の使用は、ヒトなどの対象へのかかるまたは同様のモノクローナル抗体の投与を必要とし得る。しかしながら、モノクローナル抗体がげっ歯類またはニワトリなどの非ヒト動物で産生される場合、ヒト患者へのかかる抗体の投与は、通常、免疫応答を誘発し、免疫応答は抗体自体に向けられる。かかる反応は、かかる療法の期間及び有効性を制限する。かかる問題を打開するために、開示され、かつ特許請求される本発明のモノクローナル抗体を「ヒト化」することができ、すなわち、抗体は、その抗原性部分が除去され、それ故に、ヒト抗体の同様の部分が置換されるが、特定のＥＬＴＤｌに対する抗体の親和性が保持されるように操作される。この操作は、少数のアミノ酸のみを必要とする場合もあれば、抗体のフレームワーク領域全体を含み、抗体の相補性決定領域のみをそのまま残す場合もある。抗体をヒト化するいくつかの方法が当該技術分野で知られており、２００１年１月３０日にＱｕｅｅｎらに発行された米国特許第６，１８０，３７０号、２０００年４月２５日にＢｒｉｃｋｅｌｌに発行された米国特許第６，０５４，９２７号、１９９９年２月９日にＳｔｕｄｎｉｃｋａに発行された米国特許第５，８６９，６１９号、１９９９年１月１９日にＬｉｎに発行された米国特許第５，８６１，１５５号、１９９８年１月２７日にＲｏｄｒｉｑｕｅｚらに発行された米国特許第５，７１２，１２０号、及び１９８９年３月２８日にＣａｂｉｌｌｙらに発行された米国特許第４，８１６，５６７号（関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または抗体の他の抗原結合部分配列など）であり、主にヒト免疫グロブリンの配列で構成され、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び同僚（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，１９８６、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，１９８８、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，１９８８）の方法に従って、非ヒト（すなわち、げっ歯類、ニワトリ）ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって行われ得る。（米国特許５，２２５，５３９号も参照のこと）。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦ_ｖフレームワーク残基が、ドナー抗体由来の対応する非ヒト残基に置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体内にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列内にも見られない残基も含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。

開示され、かつ特許請求される本発明は、ＥＬＴＤｌに対する完全ヒトモノクローナル抗体の使用をさらに含む。完全ヒト抗体は、本質的に、ＣＤＲを含む軽鎖及び重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子に関連している。かかる抗体は、本明細書で「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，ｅｔａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，２：７（１９８３）を参照のこと）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，ｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ８２：８５９（１９８５）を参照のこと）によって調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、開示され、かつ特許請求される本発明の実施に利用され得、ヒトハイブリドーマを使用して（Ｃｏｔｅ，ｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ８０：２０２６（１９８３）を参照のこと）またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタインバーウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅ，ｅｔａｌ．，１９８５を参照のこと）（関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）産生され得る

加えて、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによって作製され得る。惹起時に、遺伝子再配置、アセンブリ、及び抗体レパートリーを含む全ての点でヒトにおいて見られるものと極めて類似するヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、ならびにＭａｒｋｓｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７，（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、及びＬｏｎｂｅｒｇａｎｄＨｕｓｚａｒ，ＩｎｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．１３：６５（１９９５）（関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているが、これらに限定されない。

ヒト抗体などの目的とする抗体を産生するための方法は、１９９９年６月２９日にＨｏｒｉらに発行された米国特許第５，９１６，７７１号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを培養下のある哺乳動物宿主細胞に導入することと、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入することと、これらの２つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成することとを含む。ハイブリッド細胞は、重鎖及び軽鎖を含む抗体を発現する。

本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、治療的処置及び予防的手段または予防手段の両方を指す。治療を必要とする者には、障害をすでに有する者、ならびに障害が予防されるべき者が含まれる。

本明細書で使用される場合、「障害」という用語は、ポリペプチドでの治療から利益を得るであろう任意の状態を指す。これには、哺乳動物を問題となっている障害にかかりやすくする感染性または病理学的状態を含む慢性及び急性障害または疾患が含まれる。

抗体または抗体断片は、動物モデルにおけるビーズベースもしくは細胞ベースのアッセイまたはインビボ試験によって測定される、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、抗体依存性好中球食作用（ＡＤＮＰ）、または抗体依存性補体沈着（ＡＤＣＤ）機能において好ましいレベルの活性を与えるように操作された配列またはグリコシル化状態で生成され得る。

あるいは、または加えて、アミノ酸修飾を、ＩＬ－２３ｐ１９結合分子のＦｃ領域の補体成分Ｃｌｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）機能を改変する１つ以上のさらなるアミノ酸修飾と組み合わせることが有用であり得る。特に興味深い結合ポリペプチドは、Ｃｌｑに結合し、かつ補体依存性細胞傷害を示すものであり得る。既存のＣｌｑ結合活性を有し、任意にＣＤＣを媒介する能力をさらに有するポリペプチドは、これらの活性の一方または両方が増強されるように修飾され得る。Ｃｌｑを変更する及び／またはその補体依存性細胞傷害機能を修飾するアミノ酸修飾は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷ０／００４２０７２に記載されている。

抗体のＦｃ領域は、例えば、Ｃｌｑ結合及び／またはＦｃγＲ結合を修飾し、それにより、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性及び／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を変化させることによって、エフェクター機能を改変するように設計され得る。これらの「エフェクター機能」は、（例えば、対象における）生物学的活性の活性化または減少に関与する。エフェクター機能の例には、Ｃｌｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。かかるエフェクター機能は、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせられることを必要とする場合があり、様々なアッセイ（例えば、Ｆｃ結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、ＣＤＣアッセイなど）を使用して評価され得る。

例えば、改善されたＣｌｑ結合及び改善されたＦｃγＲＩＩＩ結合を有する（例えば、改善されたＡＤＣＣ活性及び改善されたＣＤＣ活性の両方を有する）抗体のバリアントＦｃ領域を生成することができる。あるいは、エフェクター機能が低下または除去されることが所望される場合、バリアントＦｃ領域は、低下したＣＤＣ活性及び／または低下したＡＤＣＣ活性で操作され得る。他の実施形態では、これらの活性のうちの１つのみが増加し得、任意に、他の活性も低下し得る（例えば、改善されたＡＤＣＣ活性を有するが、低下したＣＤＣ活性を有するＦｃ領域バリアント、及び改善されたＣＤＣ活性を有するが、低下したＡＤＣＣ活性を有するＦｃ領域バリアントを生成するために）。

一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖可変領域と軽鎖可変領域の融合であり、短い（通常、セリン、グリシン）リンカーで一緒に連結されている。このキメラ分子は、定常領域の除去及びリンカーペプチドの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。この修飾は、通常、特異性を不変のまま残す。これらの分子は、単一のペプチドとして抗原結合ドメインを発現させることが非常に便利なファージディスプレイを容易にするために歴史的に作製された。あるいは、ｓｃＦｖは、ハイブリドーマまたはＢ細胞に由来するサブクローン化された重鎖及び軽鎖から直接作製され得る。一本鎖可変断片は、完全な抗体分子に見られる定常Ｆｃ領域を欠いており、それ故に、抗体を精製するために使用される共通の結合部位（例えば、タンパク質Ａ／Ｇ）を欠いている。これらの断片は、多くの場合、プロテインＬがカッパ軽鎖の可変領域と相互作用するため、プロテインＬを使用して精製／固定化され得る。

可動性リンカーは、一般に、アラニン、セリン、及びグリシンなどのヘリックスを促進するアミノ酸残基及びターンを促進するアミノ酸残基で構成されている。しかしながら、他の残基も機能することができる。ファージディスプレイを使用して、タンパク質リンカーライブラリから一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）用に調整されたリンカーを迅速に選択することができる。重鎖及び軽鎖可変ドメインの遺伝子が可変組成の１８アミノ酸ポリペプチドをコードするセグメントによって連結されたランダムリンカーライブラリが構築された。ｓｃＦｖレパートリー（およそ５×１０^６個の異なるメンバー）が繊維状ファージにディスプレイされ、ハプテンでの親和性選択に供される。選択されたバリアントの集団は、結合活性の有意な増加を示したが、かなりの配列多様性を保持していた。その後、１０５４個の個々のバリアントをスクリーニングして、可溶性形態で効率的に産生された触媒的に活性なｓｃＦｖが得られた。配列分析により、ＶＨＣ末端の２残基後のリンカーに保存されたプロリン、ならびに選択されたテザーの唯一の共通の特徴として他の位置に豊富なアルギニン及びプロリンが明らかになった。ある特定の実施形態では、抗体断片は、当該技術分野で知られているように、改変されたＦｃ領域または様々な定常領域への変異を使用することによって、その血清半減期を増加させるようにさらに改変される。

多発性硬化症。多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（脳及び脊髄）の最も一般的な疾患のうちの１つである。これは、脱ミエリン形成またはミエリン鞘の喪失に関連する炎症状態である。神経を覆う脂肪性物質であるミエリンは、神経がある点から別の点にインパルスを伝達することを可能にするインスレーターとして機能する。ＭＳでは、ミエリンの喪失は、脳への及び脳からの電気インパルスを伝導する神経の能力の崩壊を伴い、これは、視覚障害、筋協調障害、強度障害、感覚障害、発話及び嚥下障害、膀胱制御障害、性機能障害、ならびに認知機能障害などのＭＳの様々な症状を引き起こす。ミエリンが喪失したプラークまたは病変は、硬化した瘢痕のような領域として現れる。これらの瘢痕が様々な時点で脳及び脊髄の様々な領域に現れるため、「多発性」硬化症という用語は、文字通り、多くの瘢痕を意味する。

現在、ＭＳの決定的な診断を提供する臨床検査、症状、または身体所見は存在しない。厄介なことには、ＭＳの症状は、急性播種性脳脊髄炎、ライム病、ＨＩＶ関連脊髄症、ＨＴＬＶ－Ｉ関連脊髄症、神経梅毒、進行性多病巣性白質脳症、全身性エリテマトーデス、結節性多発性動脈炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、サルコイドーシス、腫瘍随伴症候群、亜急性連合性脊髄変性症、亜急性脊髄視神経障害、副腎脊髄神経障害、脊髄小脳症候群、遺伝性痙性対麻痺／原発性側索硬化症、脳卒中、腫瘍、動静脈奇形、くも膜嚢胞、アーノルド・キアリ奇形、及び頸部脊椎症などの多種多様の他の疾患と容易に混同される場合がある。したがって、ＭＳの診断は、ＭＳと一致する所見を示し、かつ他の原因も除外するプロセスによって行われなければならない。

網膜症。網膜症は、目の網膜に対する任意の損傷であり、視力障害を引き起こす可能性がある。網膜症は、多くの場合、網膜血管疾患、または異常な血流によって引き起こされる網膜に対する損傷を指す。加齢性黄斑変性症は、厳密には網膜症という包括的用語に含まれるが、別の実体として考察されることが多い。網膜症、または網膜血管疾患は、増殖型と非増殖型に大きく分類され得る。多くの場合、網膜症は、糖尿病または高血圧症に見られるような全身性疾患の眼症状である。糖尿病は、２００８年時点で米国において網膜症の最も一般的な原因である。糖尿病性網膜症は、労働年齢の人々の失明の主な原因である。これは、世界的に失明の約５％を占めており、世界保健機関によって優先眼疾患に指定されている。

多くの人々は、疾患経過のかなり後期まで症状がないことが多い。不可逆的損傷が起こると、患者に症状が現れることが多い。症状は、通常、痛みを伴わず、症状には、硝子体出血、視野内を漂う「浮遊物」または小さい物体、視力の低下、及び目の上の「カーテン落下」などが含まれ得る。

網膜症の発症は、増殖型と非増殖型に分類され得る。どちらのタイプも、異なるメカニズムにより網膜への正常な血流を変化させることによって疾患を引き起こす。網膜は、網膜中心動脈から小さい血管分岐によって供給される。増殖性網膜症は、異常な血管増殖によって引き起こされる損傷を指す。通常、血管新生は、自然な組織増殖及び形成の一環である。血管新生の速度が異常に高いまたは速い場合、新血管形成と呼ばれる血管の異常増殖が存在する。非増殖型では、血管自体の直接損傷及び障害により、網膜への異常な血流が起こる。網膜症の多くの原因は、増殖型及び非増殖型の両方の原因になり得るが、いくつかの原因は１つのタイプにより関連している。

組織再生。ヒトにおける再生は、損傷に応答して喪失した組織または臓器の再生である。これは、瘢痕で損傷部位を閉じることを伴う創傷治癒とは対照的である。皮膚及び肝臓を含む大きい臓器などのいくつかの組織は非常に容易に再生するが、他の組織は再生能力がほとんどまたは全くないと考えられている。しかしながら、特に心臓及び肺における現在進行中の研究は、様々な組織及び臓器が最終的に再生可能になるという希望があることを示唆している。

組織再生には、自然再生と誘導再生の２種類がある。前者は、心臓、子宮内膜、指（指先）、腎臓、肝臓、足指などの外部の介入なしに自然に再生する能力を示す組織を伴う。後者は、損傷部位細胞の脱分化、幹細胞の移植、実験室で成長させた組織の移植、及びバイオ人工組織の移植などの再生をもたらすまたは強調するための外部の影響を伴う。

がん。がんは、身体の他の部分に侵入するまたは広がる可能性のある異常な細胞増殖を伴う疾患群である。これらは、身体の他の部分には広がらない良性腫瘍とは対照的である。考えられる兆候及び症状には、しこり、異常出血、長引く咳、原因不明の体重減少、及び排便の変化が含まれる。これらの症状はがんを示し得るが、他の原因がある可能性がある。１００種類を超えるがんがヒトを冒す。

非ＥＬＴＤ１血管新生標的に対する抗体は、転移性結腸直腸癌、第一選択非扁平上皮非小細胞肺癌、再発性多形性膠芽腫、転移性腎細胞癌、持続性、再発性、または転移性子宮頸癌、及び上皮性卵巣癌、卵管癌、または原発性腹膜癌を含む様々ながんの治療用に、ヒトにおける使用が認可されている。

説明として、本明細書で教示される抗体、断片、及びｓｃＦｖ抗体は、腫瘍血管新生を阻止することによるがん療法に使用され得る。本発明の抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及びそれらの結合断片）は、腫瘍（またはがん）における新血管形成を、対応する対照組織の血管新生レベルよりも少なくとも１０％低いレベルに、いくつかの事例では、同等の対照組織における血管新生レベルよりも少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低いレベルに低下させることによって、血管新生を阻害する。血管新生レベルの低下は、血管新生の完全な不在を意味するのではなく、むしろ、新血管形成の程度またはレベルの減少が十分であるという意味である。血管新生は、本明細書及び実施例で考察されるように、血管の数及び／または血管分岐点の数を数えることを含む、例えば、インビトロ及びインビボモデルを含む、当業者に知られている方法を使用して決定され得る。したがって、治療効果が増強された新規の抗ＥＬＴＤｌヒト化抗体は、がん患者に利益をもたらすであろう。

がんは、転移として知られる、局所的広がり、局所リンパ節へのリンパ性広がり、または血液を介した遠位部位への血行性広がりによって、元の部位から広がる可能性がある。がんが血行性経路により広がる場合、がんは、通常、全身に広がる。しかしながら、がんの「種子」は、がん転移の土壌及び種子の仮説で仮定されるように、ある特定の選択された部位（「土壌」）でのみ増殖する。転移性がんの症状は、腫瘍の位置によって異なり、その症状には、リンパ節の腫大（皮下で感じることができるか、または皮下で見ることができることもあり、通常は硬い）、腹部で感じることができる肝臓の腫大または脾臓の腫大、罹患した骨の痛みまたは骨折、及び神経学的症状が含まれ得る。

がんには多くの治療選択肢が存在する。主なものには、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的療法、及び緩和ケアが含まれる。どの治療が使用されるかは、がんの種類、場所、及びグレード、ならびに患者の健康状態及び好みによって異なる。治療の意図は、治癒的である場合とそうでない場合がある。

本開示の治療法（予防的治療を含む）は、概して、哺乳動物、特にヒトを含む、それを必要とする対象への、本明細書に記載の組成物の治療有効量の投与を含む。かかる治療は、好適には、がんに罹患している、がんを有する、がんにかかりやすい、またはがんのリスクがある、またはその症状を有する対象、特にヒトに投与されるであろう。「リスクがある」対象の決定は、診断検査または対象もしくはヘルスケア提供者の意見（例えば、遺伝子検査、酵素またはタンパク質マーカー、マーカー（本明細書で定義される）、家族歴など）による任意の客観的または主観的決定によって行われ得る。

がんは、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、またはセミノーマであり得る。いくつかの実施形態では、がんは、膀胱癌、血液癌、骨癌、脳癌、乳癌、中枢神経系癌、頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、胃腸管癌、生殖器癌、尿生殖路癌、頭部癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、筋肉組織癌、頸部癌、口腔または鼻粘膜癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脾臓癌、小腸癌、大腸癌、胃癌、睾丸癌、または甲状腺癌である。いくつかの実施形態では、がんは、白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、ＣＮＳ癌、黒色腫、卵巣癌、腎癌、乳癌、または前立腺癌である。

一実施形態では、本開示は、治療の進行を監視する方法を提供する。この方法は、がん（例えば、白血病）に関連する障害またはその症状に罹患しているか、またはそれにかかりやすい対象における、血液学的パラメータの変化のレベルを決定するステップ、及び／または診断的マーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、及びＣＤ１１７を含み得るが、これらに限定されない）として細胞表面タンパク質を用いたがん幹細胞（ＣＳＣ）分析、または診断的測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）を含み、対象は、本明細書に記載の組成物の治療量を投与されている。この方法で決定されたマーカーレベルが、健常な正常対照または他の罹患している患者のいずれかの既知のマーカーレベルと比較されて、対象の疾患状態を確立することができる。好ましい実施形態では、対象における第２のマーカーレベルは、第１のレベルの決定よりも後の時点で決定され、これらの２つのレベルが比較されて、疾患の経過または治療の有効性を監視する。ある特定の実施形態では、対象における治療前のマーカーレベルは、本明細書に記載の方法に従って治療開始前に決定される。その後、この治療前のマーカーレベルが、治療開始後の対象におけるマーカーレベルと比較されて、治療の有効性を決定することができる。

本開示の方法及び組成物を使用してがんを治療するために、一般に、腫瘍細胞または対象を化合物及び少なくとも１つの他の療法と接触させるであろう。これらの療法は、１つ以上の疾患パラメータの減少を達成するのに有効な組み合わせられた量で提供される。このプロセスは、例えば、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤を使用して細胞／対象を両方の薬剤／療法と同時に接触させること、または細胞／対象を２つの別個の組成物または製剤と同時に接触させること（この場合、一方の組成物は化合物を含み、他方はもう一方の薬剤を含む）を含み得る。

あるいは、抗体は、数分間から数週間の範囲の間隔で、他の治療に先行する場合も他の治療に続く場合もある。一般に、送達間にかなりの期間が経過しないことを確実にし、これにより、療法が細胞／対象に有利に組み合わせられた効果を依然として発揮することができるようになるであろう。かかる事例では、互いに約１２～２４時間以内に、互いに約６～１２時間以内に、またはわずか約１２時間の遅延時間で、細胞を両方のモダリティと接触させるであろうことが企図される。いくつかの状況では、治療期間を著しく延長させることが望ましい場合があるが、それぞれの投与間で数日間（２、３、４、５、６、または７日間）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する場合である。

抗体コンジュゲート。本開示の抗体は、抗体コンジュゲートを形成するために少なくとも１つの薬剤に連結され得る。診断薬または治療薬としての抗体分子の有効性を増加させるために、少なくとも１つの所望の分子または部分に連結するか、共有結合するか、または複合体形成することが慣習的である。かかる分子または部分は、少なくとも１つのエフェクター分子またはレポーター分子であり得るが、これらに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に結合したエフェクター分子の非限定的な例には、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射性核種、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、成長因子、及びオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出され得る任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされたレポーター分子の非限定的な例には、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色粒子、またはビオチンなどのリガンドが挙げられる。

抗体コンジュゲートは、診断薬として使用されることが多い。抗体診断は、概して、様々な免疫測定法などのインビトロ診断で使用するためのもの及び一般に「抗体指向性イメージング」として既知のインビボ診断プロトコルで使用するためのものの２つのクラスに分類される。造影剤を抗体に結合させるための方法と同様に、多くの適切な造影剤が当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号、同第４，９３８，９４８号、及び同第４，４７２，５０９号を参照のこと）。使用される造影成分は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、ＮＭＲ検出可能物質、及びＸ線造影剤であり得る。

実施例１
最初に、Ｇｌｕ２０からＬｅｕ４５５（５７４ａａ）までの残基をコードするマウスＥＬＴＤ１遺伝子の細胞外ドメインを、ｂＥｎｄ３（マウス脳内皮ポリオーマミドルＴ抗原形質転換細胞）由来のＲＮＡを使用した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって増幅することに成功した。ヒトＥＬＴＤｌ遺伝子の細胞外ドメインを、ＨＵＶＥＣから調製されたＲＮＡを使用したＲＴ－ＰＣＲによって増幅した。これら２つの遺伝子の配列を、サンガーシーケンシングによって確認した。本発明者らは、これらの２つの遺伝子を哺乳動物発現ベクターにクローン化して、ＥＬＴＤｌ断片Ｇｌｕ２０－Ｌｅｕ４５５（５７４ａａ）（Ｆａｖａｒａｅｔａｌ．，“ＡｒｅｖｉｅｗｏｆＥＬＴＤ１，ａｐｒｏ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｄｈｅｓｉｏｎＧＰＣＲ”，ＢｉｏｃｈｅｍＳｏｃＴｒａｎｓ（２０１４）４２（６）：１６５８－１６６４）及びＣ_Ｋ（ヒト免疫グロブリンκ軽鎖定常ドメイン）と融合したヒトＥＬＴＤ１断片のマウス組換えタンパク質を発現させることに成功した。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｆ過剰発現系にトランスフェクトした後、組換えタンパク質を、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した親和性クロマトグラフィーによって精製した。

タンパク質をニワトリに免疫した。その後、記載されているように、免疫したニワトリを使用してニワトリｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）ライブラリを生成した。その後、マウスＥＬＴＤ１の細胞外ドメインに特異的な抗体を、ニワトリｓｃＦｖライブラリのみならず、ヒトナイーブライブラリ及び合成ライブラリからも選択した（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，２００１）。ｍＲＮＡをＢ細胞から調製し、抗体を選択したクローンの各群由来の２羽のニワトリから得たライブラリから構築した。

モノクローナル抗体を用いてＥＬＴＤｌを標的とすることにより、多発性硬化症（ＭＳ）、網膜症、または組織再生のいずれかと関連しているいくつかの遺伝子に影響が及ぼされる。ＲＮＡ－ｓｅｑデータを、未処理の腫瘍組織またはＥＬＴＤ１の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体で処理した腫瘍組織のいずれか由来のヒト膠芽腫（ＧＢＭ）異種移植ヌードマウスモデルから最初に取得した。

抗体結合手順は以下の通りであった：マイクロタイタープレート上のＡｇコーティングｎＭＮ－ｈＣｋ－対照：０．５μｇ／ｍＬＮ－ｈＣｋ－対照（２５ｋＤａ）１５ｎＭＮ－ｈＣｋ－ｍＥＬＴＤｌ：１μｇ／ｍＬＮ－ｈＣｋ－マウスＥＬＴＤｌ（６０ｋＤａ）１５ｎＭＮ－ｈＣｋ－ｈＥＬＴＤｌ：１μｇ／ｍＬＮ－ｈＣｋ－ヒトＥＬＴＤｌ（６５ｋＤａ）ＰＢＳ抗体希釈液中３％ＢＳＡでブロック：１００ｎＭ～０．００１ｎＭ、１／１０連続希釈、６点第２の抗体：ａ－ウサギＦｃ－ＨＲＰ基質：ＡＢＴＳ４０５ｎｍで読み取り。

Ｎ１７クローンを、ヒトＥＬＴＤｌＥＣＤ組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体を生成するために選択した（図３）。Ｎ１７クローンはヒトＥＬＴＤｌ及びマウスＥＬＴＤｌの両方に結合するが、親和性はヒトＥＬＴＤ１に対してより高い（図４）。

ＥＬＴＤ１ヒトＣκ融合タンパク質の組換え細胞外ドメインの調製。ヒトＥＬＴＤ１及びマウスＥＬＴＤ１発現ベクターの細胞外ドメインを構築するために、ヒトＥＬＴＤ１（Ｇｌｕ２０－Ｌｅｕ４０６）及びマウスＥＬＴＤ１（Ｇｌｕ２０－Ｌｅｕ４５５）をコードする遺伝子を化学合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）。以前に報告されたように、遺伝子を、５’領域でＣ_κドメイン（ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常ドメイン）をコードする修飾ｐＣＥＰ４ベクターにサブクローン化した［ＬｅｅＹ，ＫｉｍＨ，ＣｈｕｎｇＪ．ＡｎａｎｔｉｂｏｄｙｒｅａｃｔｉｖｅｔｏｔｈｅＧｌｙ６３－Ｌｙｓ６８ｅｐｉｔｏｐｅｏｆＮＴ－ｐｒｏＢＮＰｅｘｈｉｂｉｔｓＯ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇ．ＥｘｐＭｏｌＭｅｄ．２０１４；４６：ｅ１１４］。

以前に報告されたように、ヒトＥＬＴＤ１及びマウスＥＬＴＤ１の細胞外ドメインをコードする発現ベクターを、２５ｋＤａの線状ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にトランスフェクトした［ＢｏｕｓｓｉｆＯ，Ｌｅｚｏｕａｌｃ’ｈＦ，ＺａｎｔａＭＡ，ＭｅｒｇｎｙＭＤ，ＳｃｈｅｒｍａｎＤ，ＤｅｍｅｎｅｉｘＢ，ｅｔａｌ．Ａｖｅｒｓａｔｉｌｅｖｅｃｔｏｒｆｏｒｇｅｎｅａｎｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｔｏｃｅｌｌｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｎｖｉｖｏ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９５；９２（１６）：７２９７－３０１］。ヒトＥＬＴＤ１及びマウスＥＬＴＤ１Ｃ_κ融合タンパク質を、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造業者の指示に従って使用した親和性クロマトグラフィーによって培養上清から精製した。

抗ＥＬＤＴ１抗体の生成。白色レグホーンニワトリに、ヒトＥＬＴＤ１Ｃ_κ融合タンパク質を免疫した。その後、ファージディスプレイされたニワトリ一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ライブラリを、以前に説明されたように、免疫したニワトリの骨髄、脾臓、及びファブリキウス嚢から単離した全ＲＮＡを使用して構築した［Ａｎｄｒｉｓ－ＷｉｄｈｏｐｆＪ，ＲａｄｅｒＣ，ＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒＰ，ＦｕｌｌｅｒＲ，ＢａｒｂａｓＣＦ，３ｒｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｃｋｅｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔｓｂｙｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．２０００；２４２（１－２）：１５９－８１］。以前に説明されたように、陽性クローンをバイオパニングによって濃縮し、ファージ酵素免疫測定法でスクリーニングした［Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．２００１．ＰｈａｇｅＤｉｓｐｌａｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ］。ヒトＥＬＴＤ１及びマウスＥＬＴＤ１に対する交差反応性を示すファージクローンを選択し、それらのヌクレオチド配列をサンガーシーケンシングによって決定した。

選択したｓｃＦｖクローンの遺伝子を、以前に報告されたように、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域及び３’領域のウサギＩｇＧのＣＨ２－ＣＨ３ドメインをコードする修飾哺乳動物発現ベクターにサブクローン化した［ＨａｎＪ，ＬｅｅＪＨ，ＰａｒｋＳ，ＹｏｏｎＳ，ＹｏｏｎＡ，ＨｗａｎｇＤＢ，ｅｔａｌ．Ａｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ－ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｒｅａｃｔｓｔｏＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩｂｏｕｎｄｔｏｅｘｏｎｓ．ＥｘｐＭｏｌＭｅｄ．２０１６；４８（１１）：ｅ２７１］。ジスルフィド結合により二量体化された２つのｓｃＦｖ分子を有する抗ＥＬＴＤ１二価ｓｃＦｖＦｃ融合をコードする発現ベクターを、上記のようにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。二価ｓｃＦｖＦｃ融合タンパク質を、プロテインＡセファロースカラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って使用して、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の培養上清から精製した。一例では、モノクローナル抗体は二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体であり、ｓｃＦｖは同じであっても異なっていてもよい。

酵素免疫測定法。９６ウェルマイクロタイタープレート（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）のウェルに、コーティング緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ３，ｐＨ８．６）中ヒトＥＬＴＤ１またはマウスＥＬＴＤ１Ｃ_κ融合タンパク質をコーティングし、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロックした。連続１０倍希釈抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ－ｒＦｃ融合タンパク質（０．０１～１００ｎＭ）とインキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を各ウェルに添加した。ＰＢＳ中０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、ＡＢＴＳＨＲＰ基質溶液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加し、ＭｕｌｔｉｓｋａｎＡｓｃｅｎｔマイクロプレートリーダー（ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて吸光度を４０５ｎｍで測定した。

以下の配列には、モノクローナル抗体の様々な軽鎖及び重鎖の核酸及びアミノ酸配列が含まれおり、これらの特定の事例では、ｓｃＦｖになっている。さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）を、Ｋａｂａｔ法則を使用してＩＭＧＴ．ｏｒｇから入手可能なソフトウェアを使用して決定した。以下の表は、Ｋａｂａｔ法則、Ｃｌｏｔｈｉａ法則、及びＩＭＧＴ法則を比較する代替のＣＤＲ配列を含み、これらを全て本発明とともに使用して、本明細書に開示されるＣＤＲで抗体骨格（例えば、ヒト抗体）を修飾することができる。

抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ５、ヌクレオチド配列、配列番号１、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（下線）。

抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ５、アミノ酸配列、配列番号２、３、及び４、それぞれ、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（斜字）を含む。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３には二重下線を引いており、アミノ末端からカルボキシ末端の順に列記している。

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抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ７、ヌクレオチド配列、配列番号５、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（下線）。

抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ７、アミノ酸配列、配列番号６、７、８、それぞれ、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（斜字）を含む。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３には二重下線を引いている。

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抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ１１、ヌクレオチド配列、配列番号９、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（下線）。

抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ１１、アミノ酸配列、配列番号１０、１１、１２、それぞれ、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（斜字）。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３には二重下線を引いている。

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抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ１５、ヌクレオチド配列、配列番号１３、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（下線）。

抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ１５、アミノ酸配列、配列番号１４、１５、１６、それぞれ、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（斜字）。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３には二重下線を引いている。

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抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ１６、ヌクレオチド配列、配列番号１７、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（下線）。

抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ１６、アミノ酸配列、配列番号１８、１９、２０、それぞれ、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（斜字）。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３には二重下線を引いている。

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抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ１７、ヌクレオチド配列、配列番号２１、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配列（下線）。

抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖＮ１７、アミノ酸配列、配列番号２２、２３、２４、それぞれ、可変軽鎖配列、リンカー（太字）、及び可変重鎖配（斜字）。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３には二重下線を引いている。

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実施例２．Ｇ５５異種移植マウスモデルにおける膠芽腫（ＧＢＭ）のＥＬＴＤ１に対する最適化されたモノクローナル抗体処理。

膠芽腫は成人に見られる侵攻性の脳腫瘍であり、利用可能な治療アプローチは患者の生存率を有意に上昇させていない。最近、本発明者らは、血管新生バイオマーカーであるＥＬＴＤ１がヒト神経膠腫で高度に発現されることを発見した。ポリクローナル抗ＥＬＴＤ１処理は神経膠腫前臨床モデルで効果的であったが、ｐＡｂ結合は潜在的に偶然であり、製造が困難であり、薬剤開発及び承認を考慮する際に好ましい分子ではない。したがって、この実施例の目的は、Ｇ５５異種移植神経膠腫モデルにおける最適化されたモノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理の効果を決定することであった。磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して、動物の生存率、腫瘍体積、灌流速度、及び結合特異性に対する処理の効果を評価した。免疫組織化学及び組織学を実施して、微小血管密度及びＮｏｔｃｈ１レベルを確認及び特徴付けし、分子プローブを特定した。ＲＮＡシーケンシングを使用して、ｍＡｂ処理の効果を分析した。モノクローナル抗ＥＬＴＤ１処理は、対照マウス及びポリクローナル処理マウスの両方と比較して、動物の生存率を有意に上昇させ、腫瘍体積を減少させ、血管系を正常化し、腫瘍内でより高い結合特異性を示した。Ｎｏｔｃｈ１陽性染色及びＲＮＡ－ｓｅｑの結果は、ＥＬＴＤ１がＮｏｔｃｈ１シグナル伝達と相互作用して中断する能力を有することを示唆する。ＥＬＴＤ１について、特にそのリガンド及び経路についてはほとんど知られていないが、これらのデータは、モノクローナル抗ＥＬＴＤ１抗体を膠芽腫における抗血管新生療法に使用することができることを示す。

米国では、成人で診断された全ての悪性神経膠腫のうち、８２％が膠芽腫（ＧＢＭ）として特徴付けられ、１０万人あたり３．１９人の発生率を示す［１、２］。この高悪性度神経膠腫は、無秩序な血管新生を起こし、侵襲性であり、血管が多く、かつアポトーシスに耐性があることを特徴とする［３］。現在の治療計画は、外科的切除の後に、テモゾロミドまたは抗血管新生ｍＡｂベバシズマブでの放射線療法と化学療法との併用が続く［４、５］。しかしながら、治療したとしても、患者の生存期間の中央値は検出後わずか１２～１４ヶ月であり、５％未満の患者しか診断後５年以上生き延びていない［２、６］。ＧＢＭは上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体の遺伝子増幅及び／または変異を起こし、より高いＥＧＦＲレベルが、遊走、腫瘍成長、及び血管新生を促進することが示された［７］。神経膠腫は腫瘍成長について血管新生に大きく依存しており、新たな血管は酸素及び栄養素を腫瘍部位に供給するための鍵である。何年にもわたって、血管新生促進性因子のうちの主な焦点は、がんにおける血管新生を増加させるその役割のための血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であった。腫瘍が発生する間、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）などの他の微小血管系増殖因子に加えて、ＶＥＧＦ－Ａをさらに増加させる血管新生促進性サイトカインが上方制御される［８］。上方制御されると、ＶＥＧＦ－Ａは、内皮細胞上のＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）に結合し、新たな血管の形成を促進するシグナル伝達経路のカスケードを開始する［９］。ベバシズマブは、他の複数のがんに加えてＧＢＭ治療薬として承認されたＶＥＧＦ－Ａに対するモノクローナル療法である。しかしながら、この化学療法薬は、ＧＢＭに罹患している患者の生存率を有意に上昇させていない。さらに、ベバシズマブには、最大５倍の頻度で発生する重度の／致命的な出血などの重篤な副作用がある［１０］。ベバシズマブが患者の生存率を上昇させることができなかったため、焦点をＶＥＧＦからＧＢＭ中に存在する他の血管新生因子にシフトさせることが極めて重要であった。ある特定の態様では、本発明は、神経膠腫、乳癌、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、卵巣癌、転移性結腸直腸癌、子宮頸癌、腎細胞癌、膠芽腫、または非扁平上皮非小細胞肺癌から選択される１つ以上のがんを治療するために使用することができる。

染色体上の上皮成長因子、ラトロフィリン、及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）、あるいは別名、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｌ４（ＡＤＧＲＬ４）は、心筋細胞の発達において最初に発見された［１１］。脳血管新生の新規調節因子であるＥＬＴＤ１が腫瘍成長及び転移を促進することが見出された［１２］。本発明者らは、ＥＬＴＤ１が高悪性度神経膠腫で高度に発現され、内皮細胞及び腫瘍細胞の両方で発現されたことを以前に報告した［１１］。さらに、ＥＬＴＤ１発現は、ＶＥＧＦがＥＬＴＤ１発現を増加させ、ＤＬＬ４－Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が正常な血管系におけるＥＬＴＤ１発現を減少させる、２つの主要な血管新生経路によって制御されることが示された［１２］。ＥＬＴＤ１のさらなる調査は、ＶＥＧＦ－Ａからのシグナル伝達の増加により内皮細胞におけるＥＬＴＤ１発現の増加がもたらされ、ＥＬＴＤ１を標的とすることにより神経膠腫モデルにおけるＶＥＧＦＲ２発現が減少したことを示した［１３、１４］。

毎年およそ１７，０００人が新たにＧＢＭと診断され、新たなより効果的ながん治療薬の必要性が高まっている［１］。直交異方性ＧＬ２６１及びヒトＧ５５異種移植神経膠腫前臨床モデルにおけるＥＬＴＤ１に対するポリクローナル抗体（ｐＡｂ）処理は、未処理（ＵＴ）対照と比較して、腫瘍体積（ＴＶ）の減少、生存率の上昇、及び微小血管密度レベル（ＭＶＤ）の減少に成功したことが以前に見出された［１５］。しかしながら、バッチ間の変動、ならびにｐＡｂの選択性の欠如は、患者の長期治療として特異性についての懸念を引き起こした。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同種の抗体を可能にする単一のＢ細胞クローンから産生され、様々ながん及び慢性炎症性疾患の標的治療の成功を収めたクラスとして確立されている［１６］。新たなｍＡｂ処理は、腫瘍で過剰発現している成長因子に結合して、下流のシグナル伝達効果を破壊し、腫瘍細胞の成長、増殖、及び遊走を減少させる［１７］。

以前の研究は、ＥＬＴＤ１に対するｐＡｂ処理がＧＢＭ前臨床モデルにおいて効果的な治療であることを示している。この例では、Ｇ５５神経膠腫前臨床モデルに対するより特異的かつ著明な効果を得ることを期待して、ｐＡｂ処理によって設定された制限を打開する、受容体の外部領域（４３０ＡＡ）にのみ結合することによってより高い特異性を有するＥＬＴＤ１に対する最適化されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した。

ＥＬＴＤ１ヒトＣκ融合タンパク質の組換え細胞外ドメインの調製、モノクローナル抗体の生成、及び免疫測定法は、上記の通りである。

Ｇ５５異種移植モデル及び処理。全ての動物実験を、ＮＩＨガイドラインに従うＯｋｌａｈｏｍａＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ方針の承認（プロトコル１７～４８）を得て実施した。ヒトＧ５５異種移植細胞を、以前に説明されたように、２月齢の雄マウスに脳内移植した（Ｈｓｄ：胸腺欠損ヌードＦｏｘｎ１ｎｕマウス、ＨａｒｌａｎＩｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）［１３、１５］。動物を３つの群：ＵＴ群、ｐＡｂ群、及びｍＡｂ抗ＥＬＴＤ１処理群に分けた。腫瘍が６～７ｍｍ３に達した時点で（ＭＲＩによる測定）、マウスをＵＴのままにするか、または２ｍｇ／ｋｇのポリクローナル抗ＥＬＴＤ１（Ｂｉｏｓｓ、ＥＴＬ／ＥＬＴＤ１ＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ、ｂｓ－１３１１１Ｒ）または最適化されたＥＬＴＤ１に対するｍＡｂのいずれかで３～４日毎に処理した（月曜日／木曜日、火曜日／金曜日、水曜日／土曜日に処理した）。腫瘍が１５０ｍｍ３以上に達したときに、全てのマウスを安楽死させた。

インビボ磁気共鳴（ＭＲ）技法。形態学的イメージング。マウスを麻酔し、クレードル内に配置した。７Ｔｅｓｌａ（ＢｒｕｋｅｒＢｉｏＳｐｉｎＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で動作する３０ｃｍのＢｒｕｋｅｒＢｉｏｓｐｉｎ水平ボア磁石を使用した。以前に説明されたように、ＢＡ６勾配セット及びマウスヘッドコイルを使用して、全てのＭＲＩ実験を行った［１５］。全ての動物を、Ｇ５５移植手術の１０日後から開始して本研究の終了まで２～３日毎に画像化した。

灌流イメージング。以前に説明されたように、灌流イメージングである動脈スピンラベリングを使用した［２３］。灌流マップを、腫瘍が最大断面を有した吻側－尾側軸の点に位置する脳の単一の軸方向スライスで得た。腫瘍周辺の５つの関心領域（ＲＯＩ）に手動で輪郭を描き、比較のために脳の対側から適切なＲＯＩを採取した。（ｒＣＢＦ）値の差を計算するために、腫瘍ｒＣＢＦ値を腫瘍後期（処分前）及び早期（腫瘍検出時）に取得し、対応する動物の対側脳領域のｒＣＢＦ値に正常化した。

分子標的ＭＲイメージング（ｍｔ－ＭＲＩ）。造影剤であるビオチン－ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）－Ｇｄ（ガドリニウム）－ＤＴＰＡを、Ｄａｆｎｉらによって開発された方法の修正に基づいて［２４、２５］、本発明者らによって以前に説明されたように調製した［１５］。ｐＡｂ抗ＥＬＴＤ１（Ｂｉｏｓｓ）またはｍＡｂ抗ＥＬＴＤを、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎのプロトコルに従って、スルホ－ＮＨＳ－ＥＤＣ結合を介してアルブミン部分にコンジュゲートした［２６］。腫瘍体積が約１３０～１８０ｍｍ３になったときｍｔ－ＭＲＩを行った。ビオチン－アルブミン－Ｇｄ－ＤＴＰＡ構築物を抗ＥＬＴＤ１抗体に結合させた分子プローブを、マウスに尾静脈カテーテルを介して注射した。非特異的マウス免疫グロブリンＩｇＧＡｂ（ＡｌｐｈａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を、陰性対照として、ビオチン－アルブミン－Ｇｄ－ＤＴＰＡ構築物とともに使用した。ＭＲＩを以前に説明されたように行った［１３、２４］。相対プローブ濃度を計算して、各動物におけるＥＬＴＤ１及び非特異的ＩｇＧ造影剤レベルを評価した。差分造影像を、画素毎に造影後画像と造影前画像との間のＴ１緩和時間の差をコンピュータ計算することによって、目的とするスライスの造影前データセット及び造影後（９０分）データセットから作成した。差分造影画像から、抗ＥＴＬＤ１プローブ注射後、各動物の腫瘍実質及び対側脳において、ＴＲ８００ミリ秒で最も高いＴ１緩和を有する領域内に等しいサイズ（０．０５ｃｍ^２）の１０個のＲＯＩを得た。腫瘍領域内のＲＯＩから得たＴ１値を、対応する対側に正規化した。指定したＲＯＩのＴ１緩和値を、以下の式を使用してＲＯＩ内の全ての画素からコンピュータ計算した（ＰａｒａＶｉｓｉｏｎ５．０，Ｂｒｕｋｅｒによる処理）：Ｓ（ＴＲ）＝Ｓ０（１－ｅ－ＴＲ／Ｔ１）（式中、ＴＲは繰り返し時間であり、Ｓ０はＴＲでのシグナル強度（整数機械単位）であり、Ｔ１及びＴＥ＝０であり、Ｔ１は縦緩和時間の定数である）［２７］。差分造影像とＴ１強調画像とのオーバーレイを、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（バージョンＣ．Ｓ６）を使用して生成した。

免疫組織化学及び標準染色。最後のＭＲＩ検査後、全てのマウスを安楽死させた。各動物の脳を取り出し、１０％中性緩衝ホルマリン中に保存し、通例通りに処理した。ヘマトキシリン－エオシン染色：組織を１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、脱水し、パラフィンに包埋した。標準のプロトコルに従って、切片を脱パラフィン処理し、再水和し、染色した。いくつかの試薬を、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓＩｎｃ．（ＶＬＩ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によって製造されたものであった。

パラフィンに包埋し、ＨｉｓｔｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｐｌｕｓスライド（ＳｔａｔｌａｂＭｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）にマウントした組織切片（５μｍ）を再水和し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。切片を、ＩｍｍＰＲＥＳＳ（商標）ＶＲＲｅａｇｅｎｔＡｎｔｉ－ＲａｂｂｉｔＩｇＧＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＶＬＩカタログ番号ＭＰ－６４０１）を使用して処理した。抗原回収（ｐＨ６クエン酸抗原アンマスキング溶液（ＶＬＩカタログ番号Ｈ－３３００）を、蒸し器内で２０分間、その後、室温で３０分間冷却することによって達成した。切片を、ペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｂｌｏｘａｌｌ、ＶＬＩカタログ番号ＳＰ－６０００）、その後、２．５％正常ウマ血清で処理して、非特異的結合を阻害した。ウサギ抗ＣＤ３４抗体（ａｂｃａｍ８１２８９、５．２８μｇ／ｍＬ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）またはウサギ抗ＮＯＴＣＨ１（ａｂｃａｍ５２６２７、１１μｇ／ｍＬ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を各切片に適用し、加湿チャンバ内で一晩（４℃）インキュベートした後、切片をＰＢＳ中で洗浄し、ＩｍｍＰＲＥＳＳＶＲ試薬を製造業者の指示に従って適用した。

微小血管密度（ＭＶＤ）及びＮｏｔｃｈ発現レベルを特徴付けるために、デジタルでキャプチャした５つのＲＯＩ（２０倍）をいずれの場合でも特定した。壊死及び／または重大なアーチファクトを有する領域を除いて、腫瘍組織を含む領域のみを分析した。正の画素数を、分析した領域内の総画素数（負及び正）で割った。ＲＯＩを、ＡｐｅｒｉｏＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＢｕｆｆａｌｏＧｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して分析及び画像化した。

ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ－ＨＲＰ）の切片を、すぐに使用できるＳｔｒｐ－ＨＲＰ（ＶＬＩカタログ番号ＳＡ－５７０４）と一晩インキュベートしたことを除いて、上記のように処理した。適切な洗浄をＰＢＳ中で行った。スライドを可視化のためにＮｏｖａＲｅｄ（登録商標）（ＶＬＩカタログ番号ＳＫ－４８０５）色素原とインキュベートした。対比染色を、ＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎＱＳＮｕｃｌｅａｒＣｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ（ＶＬＩ）を用いて行った。適切な陽性及び陰性組織対照を使用した。

ＲＮＡの分離及び調製。最後のＭＲＩ検査後、マウスを安楽死させた。脳を取り出し、急速凍結し、－８０℃で保存した。全ての群からの腫瘍組織由来の全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、分光光度法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）によって定量化した。

ＲＮＡの濃度を確認し、ＲＮＡの全体的な品質を検証した。シーケンシングライブラリを、製造業者のプロトコルに従って生成した（ＬｅｘｏｇｅｎＱｕａｎｔｓｅｑＦＷＤｌｉｂｒａｒｙｐｒｅｐｋｉｔ）。簡潔には、ｃＤＮＡの第１の鎖を５′標識ポリＴオリゴマープライマーを使用して生成し、ＲＮａｓｅ消化後、第２の鎖を５’標識ランダムプライマーを使用して生成した。追加のプライマーを用いたその後のＰＣＲステップは、最初の５′標識に完全なアダプター配列を付加し、試料の逆多重化のために一意のインデックスを付加し、ライブラリを増幅した。各試料の最終ライブラリを適切なサイズ及び量について分析した（ＡｇｉｌｅｎｔＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ）。これらのライブラリを等モル量でプールした（蛍光分析）。最終プールを、ｑＰＣＲ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｌｌｕｍｉｎａＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ試薬を備えたＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０機器）を使用して完全に定量化した。シーケンシングを、高出力化学反応及び７５ｂｐのシングルエンドリードを使用して行った（ＩｌｌｕｍｉｎａＮｅｘｔｓｅｑ５００機器）。

バイオインフォマティクス分析。ペアエンドｆａｓｔｑファイルを、ｍｕｌｔｉＱＣを使用して品質について確認し［２８］、以下の平均（標準偏差）記述値は５４００万個のリード（１２）、６８．８％（２．８％）重複リード、及び５１．３（０．７％）のＧＣ含有量であった。インデックス作成及びアライメントを、ｋａｌｌｉｓｔｏ［２９］を用いてＧｅｎｏｍｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍからのヒト参照ゲノムのビルド３８（ＧＲＣｈ３８）に対して行った。エクソン特徴へのカウントの割り当て及び正規化を、ｂｉｏｊｕｐｉｅｓパイプライン４を用いてアライメントとともに行い、カウントマトリックスを得た。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整ｐ値＜０．０５及び絶対対数倍数変化＞１．３の両方を有する遺伝子について、重要な差次的遺伝子をＤＥＳｅｑ２［３０］によって決定した。遺伝子セット濃縮分析を、ｅｎｒｉｃｈＲ［３１］を用いて特定した差次的遺伝子に対して行った（ｇｓｅａｐｙＡＰＩ）。

統計分析。カプラン・マイヤー曲線を使用して生存曲線を分析した。腫瘍体積、灌流変化、及び免疫組織化学タンパク質レベル、及び分子標的ＭＲＩデータを分析し、多重比較（それぞれ、テューキーまたはシダック）を用いて一元配置ＡＮＯＶＡまたは二元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。データを平均±標準偏差で表し、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１のいずれかのｐ値を統計的に有意であるとみなした。

以前の研究は、対照群としての非特異的ＩｇＧ抗体処理が未処理とは異ならなかったことを示し、したがって、この実施例では、本発明者らは、対照群として未処理の動物のみを利用した［１５］。Ｇ５５神経膠腫を有するマウスをＥＬＴＤ１に対するＡｂで処理した。図１Ａに示されるように、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ（ｐ＝０．０２０７）及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ（ｐ＝０．００２４）はいずれも、未処理のマウスと比較して生存率を有意に上昇させた（未処理の動物の平均生存期間は腫瘍検出後約９日であった）。形態学的イメージング及び分析は、腫瘍検出の９日後の腫瘍体積（ＭＲＩによって証明される）が対照と比較してｍＡｂＥＬＴＤ１処理（ｐ＝０．００６７）及びｐＡｂＥＬＴＤ１処理（ｐ＝０．０３８４）で有意に低いことを示した（図１Ｂ）。全ての処理群からの腫瘍を有するマウスの代表的な画像を図１Ｃに示す。

ＭＲＩ灌流は、相対脳血流（ｒＣＢＦ）を測定し、腫瘍の血管新生に関連する微小血管系の変化を評価するために使用することができる。健常な正常組織は設定されたｒＣＢＦを有するが、腫瘍が成長するにつれて、血管系を破壊し、それ故に、灌流速度を低下させる。ｒＣＢＦの違いは、未処理のマウスでは腫瘍領域内のｒＣＢＦが減少し、血管新生が増加したことを示した一方で、抗ＥＬＴＤ１処理動物では灌流値が正常化した。代表的な形態学的ＭＲＩを対応する脳灌流マップとともに図２Ａ～２Ｆに示す。２Ｂ、２Ｄ、２Ｆにおいて黄色の破線で輪郭を描いた腫瘍の結果としての灌流の減少（正常化されたｒＣＢＦの減少として示されている）を暗領域で示す。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理及び抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理は、血管新生を減少させ、それ故に、腫瘍領域内の灌流を増加させることに成功した。抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理は、ＵＴマウスと比較して、ｒＣＢＦの減少を最小限に抑えることができた（ｐ＜０．０００１）。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理は、ｐＡｂ処理動物（ｐ＝０．０００１）及びＵＴ動物（ｐ＜０．０００１）の両方と比較して、ｒＣＢＦの減少に有意により効果的であり（図２Ｇ）、腫瘍領域内のｒＣＢＦを対側レベルに正常化した。

ＥＬＴＤ１は病理学的血管新生と関連付けられている。したがって、本発明者らは、微小血管密度（ＭＶＤ）を分析して、抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理が腫瘍血管系を変化させるかを決定した。各処理群の代表的なＣＤ３４ＩＨＣ画像を図３Ａ～３Ｃに示す。ＣＤ３４分析は、抗ＥＬＴＤ１処理が未処理の動物と比較してＭＶＤレベルを有意に低下させた（ｐ＜０．０００１）ことを示した（図３Ｄ）。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理は、ポリクローナル抗ＥＬＴＤ１処理と比較して、ＭＶＤレベルをさらに低下させ（ｐ＝０．００１３）、ＭＶＤをほぼ正常なレベルに戻すことができた。

Ａｂがインビボでどこに局在していたかを決定するために、本発明者らは、非特異的ＩｇＧ、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ、または抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂのいずれかに結合したビオチン－ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）－Ｇｄ－ＤＴＰＡプローブを合成した（図４Ａ）。分子プローブを未処理のＧ５５神経膠腫を有するマウスに尾静脈カテーテルを介して注射し、Ｔ１緩和時間及びシグナル強度をＭＲＩにより計算した。Ｔ１緩和は、本発明の分子プローブの存在下で減少するＭＲＩ造影パラメータである。図４Ｂに示される結果は、Ｔ１緩和への影響のため、相対発現パーセントとして分子プローブの存在を示す。Ｔ１（ｐ＝０．０００２）及びシグナル強度（ｐ＝０．００８）はいずれも、非特異的ＩｇＧ結合プローブと比較して、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブで有意に増加した。抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ結合プローブはＴ１緩和を大幅に増加させた（ｐ＝０．０３０７）が、シグナル強度には大きな影響を及ぼさなかった（ｐ＝０．０６０２）。

代表的な抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブ及び非特異的ＩｇＧプローブデータの分子標的ＭＲＩを、未処理のＧ５５腫瘍を有する動物の形態学的画像に重ね合わせた。図４Ｃは、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブが増加した腫瘍領域に対する結合特異性を有したことを示す。非特異的ＩｇＧプローブのバックグラウンド結合は、主に血管の周りにクラスター化していた（図４Ｄ）。分子プローブの発現を監視した後、本発明者らは、非特異的ＩｇＧ結合プローブ及び抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ結合プローブの両方と比較して、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブがより著明かつ持続的な効果を有することを理解した（図４Ｅ）。

分子プローブは、それを組織内にさらに局在化するために結合したビオチン標識を有する。分子標的が終了した時点で、動物を処分し、組織学のために組織を採取した。腫瘍組織をＳＡ－ＨＲＰで染色することにより、本発明者らは分子標的結果を確認した。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ及びｐＡｂ結合プローブが処分後に腫瘍組織内に局在した一方で、組織内に非特異的ＩｇＧ結合プローブの痕跡はなかった。（図４Ｆ～Ｈ）。このデータは、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブが、ｐＡｂ結合プローブ及びＩｇＧプローブの両方よりも有意に高い腫瘍領域に対する結合特異性を有することを示す。

Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達は、細胞の分化、増殖、ならびに腫瘍の血管新生に重要であり、正常な血管系では、ＥＬＴＤ１発現を減少させることが示される［３２］。したがって、本発明者らは、ＧＢＭを有するマウスの組織におけるＮｏｔｃｈ１レベルが抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理により変化したかを調べた。染色した試料の陽性分析は、未処理の神経膠腫腫瘍試料が最も多い量のＮｏｔｃｈ１を有することを示した。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理は、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理（ｐ＝０．０３５７）及び未処理の対照動物（ｐ＝０．０００６）と比較して、Ｎｏｔｃｈ１発現レベルを有意に低下させ、発現を対側レベルに下げた（図５Ｅ）。

インビボデータが、ＥＬＴＤ１に対する抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理がＧ５５異種移植モデルにおいてより効果的であることを示したため、本発明者らは、（未処理と比較して）抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理が腫瘍領域内の遺伝子に及ぼした影響を調べた。図６Ａに見られる全ての遺伝子のうち、ＡＤＡ、ＳＣＮ５Ａ、Ｌ１ＣＡＭ、ＢＭＰ２、ＡＬＰＬ、ＴＲＰＭ８（全て腫瘍の増加）、ＳＥＬＥＮＢＰ１（腫瘍の減少）が神経膠腫と直接関連していた。一方で、他の遺伝子は、肝細胞癌（ＶＷＡ１－減少［３３］）、肺癌（ＳＣＵＢＥ３－減少［３４］、ＰＬＣＨ１－増加［３５］、ＣＨＲＮＡ１－増加［３６］、ＣＤＨ２－増加）［３７］、及び乳癌（ＩＦＩＴＭ１０－減少［３８］、ＤＣＤＣ２－増加［３９］、ＣＨＳＴ９－増加［４０］、ＣＤＨ２－増加［４１］）などの他の様々ながんと関連していた。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理時に下方制御された遺伝子のうちのいくつかが他の実験で同様に共制御されたかを確認するために、発明者らは、最初に、ＮＣＢＩのＧＥＯデータベースの一部として公的に入手可能なマイクロアレイプラットフォームＧＰＬ５７０からの実験を使用して遺伝子－遺伝子間のピアソン相関を計算した。図６Ｂは、ＧＰＬ５７０データを使用して下方制御された遺伝子のクラスター化された遺伝子－遺伝子間の相関を示す。大まかに、４つのクラスター（発生遺伝子、ネスチン関連、細胞増殖／血管新生、星状細胞ミクログリア炎症）は明らかであり、これらの研究で差次的に発現されたと見られる遺伝子の群が他の実験で観察されたものと一致することを示す。

以下の表は、本発明の新規抗体を使用して異なる疾患または状態に引き起こされる発現の変化を要約する。

グローバルマイクロアレイメタ分析（ＧＡＭＭＡ）［４２］により、本発明者らは、血管新生マーカーであるＥＬＴＤ１が高悪性度神経膠腫で高度に発現されることを特定し、他の集団は、高いＥＬＴＤ１発現レベルが神経膠腫の侵襲性と相関する可能性があることを示唆した［３２、４３］。以前の研究は、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理がマウスＧＬ２６１及びヒトＧ５５異種移植神経膠腫モデルにおいて有効であることを示している［１５］。他の集団は、マイクロＲＮＡ－１３９－５ｐがＥＬＴＤ１に直接結合してそれを標的とし、神経膠腫における細胞増殖を阻害することも発見した［４４］。

この実施例は、侵襲性ヒトＧ５５異種移植神経膠腫マウスモデルにおけるＥＬＴＤ１に対する最適化されたｍＡｂ療法に焦点を当てる。データは、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ及び抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂの両方での反復ＩＶ処理が、腫瘍体積の有意な減少及び生存率の上昇をもたらしたことを示す。本発明者らによる以前の研究は、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理で７～１０日の生存期間の延長を示したが、この現在の研究は、平均５日の増加しか示さなかった［１５］。研究間の不一致は、Ｇ５５細胞間の倍加時間が異なるためである。２０１７年の研究では、未処理のマウスの倍加時間が２．５日であり、平均生存期間が１８日であった高継代のＧ５５細胞を使用した。しかしながら、この実施例では、倍加期間が２日とより速く、平均生存期間が１０日であるため、より侵襲性に見える低継代のＧ５５細胞を使用した。しかしながら、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理は、このより侵襲性の神経膠腫モデルにおいてさえ、倍加時間をおよそ２．７日に延長することができた。

最適化された抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理は、灌流レベルを正常に戻し、腫瘍領域内の血管系の正常化を示すのみならず、微小血管密度（ＭＶＤ）レベルを有意に低下させるのにも効果的であった。まとめると、これらのデータは、本発明のｍＡｂ、及びＥＬＴＤ１に対するｍＡｂ療法におけるその使用が、未処理の動物及び抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理動物の両方と比較して、腫瘍関連微小血管系により著明な影響を及ぼしたことを示す。

ヒトＧ５５細胞を使用した以前の研究は、アバスチン処理を受けているマウス及び患者に抗ＶＥＧＦ療法を使用した際に出血の増加を示している［１０、１５］。本発明者らは、ＭＲ画像上でも、プルシアンブルーで染色した場合でも、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂまたは抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂで処理した腫瘍領域内でいかなる出血も観察しなかった。したがって、これは、抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理が診療所での使用により安全である可能性があることを示す。

まとめると、これらのデータは、ＥＬＴＤ１が高悪性度神経膠腫における重要な血管新生マーカーであることを示した。加えて、マウスにおけるＧＢＭに対して最適化されたＥＬＴＤ１に対するｍＡｂ処理を使用することにより、本発明者らは、生存率を有意に上昇させ、腫瘍体積を減少させ、腫瘍関連血管系を正常化することができた。これらのデータは、最適化されたＥＬＴＤ１に対するｍＡｂが、分子標的及び組織学によって確認される、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂと比較してより高い結合特異性を有したことを示す。

以前の研究は、ＥＬＴＤ１発現が正常な血管系においてＶＥＧＦによって増加するが、Ｎｏｔｃｈ／ＤＬＬ４相互作用によって抑制されることを提示している一方で、本発明者らは、この関係が腫瘍環境下ではより複雑である可能性があることを実証する［１２］。本発明者らは、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理により、腫瘍内のＮｏｔｃｈ１タンパク質レベルを対側正常組織のレベルに近いレベルに有意に低下させることができた。さらに、ＲＮＡシーケンシングデータは、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理の影響を受けた遺伝子のうちの３つ（ＳＣＮ５Ａ、Ｌ１ＣＡＭ、ＢＭＰ２）が神経膠腫と直接関連しており、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に影響を及ぼし、かつそれと相互作用することが知られていることを示した。したがって、ＥＬＴＤ１は、Ｎｏｔｃｈ１と以前に理解されていたよりも複雑な関係がある。

Ｎｏｔｃｈとの関係の可能性は別として、ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理がどの経路を標的としているかについてのさらなる洞察を与えた。ＡＤＡ及びＢＭＰ２発現は、神経膠腫患者の予後不良と相関しており［４５、４６］、いずれも抗ＥＴＬＤ１処理で下方制御された。さらに、抗ＥＬＴＤ１処理は、ＳＣＮ５Ａ、ＴＲＰＭ８、及びＢＭＰ２を下方制御するよう働き、これらは全て、神経膠腫細胞の増殖、遊走、及び浸潤を増加させることを示した［４７～４９］。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）は、腫瘍内の壊死領域周辺で高度に発現される幹細胞マーカーであり、ＡＬＰＬ及びＣＤ１３３（別の幹細胞マーカー）の高発現は患者の予後不良と関連している［５０］。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ療法は、ＡＬＰＬの下方制御に成功した。ＣＤ１３３＋神経膠腫細胞は、ニューロスフェア様の成長を示し、腫瘍形成を促進し、標準療法に耐性がある［５１］。抗ＥＬＴＤ１処理によって下方制御される遺伝子であるＬ１ＣＡＭは、ＧＢＭ及びＣＤ１３３＋神経膠腫細胞で過剰発現され、神経細胞の発生中の成長、遊走、及び生存を制御する［５２、５３］。さらに、ＣＤ１３３＋神経膠腫細胞におけるＬ１ＣＡＭの標的及び阻害が、神経膠腫異種移植モデルにおける腫瘍増殖を抑制し、生存率を上昇させた［５４］。神経膠腫幹細胞（ＧＳＣ）は、処理後のＧＢＭ再発の主な原因であり、ＣＤ１３３を特徴とする［５５］。しかしながら、最近の報告では、ＣＤ１３３がＧＳＣの強力なマーカーではない可能性があり、ＧＳＣ特性を有するＣＤ１３３－細胞が侵襲性腫瘍を引き起こす可能性があることが示されている［５５、５６］。ネスチンは、最初に神経幹細胞マーカーとみなされ、ＣＤ１３３陽性細胞及び
ＣＤ１３３陰性細胞の両方の表面上に見られ、ＧＢＭでより効率的なＧＳＣマーカーとして機能する可能性がある［５５、５６］。さらに、ネスチンは、ＧＢＭ及び他のがんの増殖、移動、生存において重要な役割を果たすことが示されている［５７～５９］。興味深いことに、抗ＥＬＴＤ１処理によって下方制御された遺伝子からの遺伝子－遺伝子間のクラスター分析は、ネスチン関連経路の下方制御応答があることを示唆する。

これらのデータは、最適化された抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂがＧＢＭに対する潜在的な抗血管新生療法であることを示す。２００１年に発見されたが、ＥＬＴＤ１には、その作用機序及びそのリガンドなどの様々な未知の要素が存在する。

実施例３
本実施例では、抗ＥＬＴＤ１一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を生成し、Ｇ５５神経膠腫異種移植前臨床モデルにおいてＥＬＴＤ１の４３０ＡＡ外部領域の結合を維持することを示した。本発明者らは、形態学的ＭＲＩを使用して腫瘍体積を評価し、灌流イメージングを使用して、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理と比較した抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ処理後の腫瘍領域内の血管変化を測定した。動物の生存も、抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ処理または抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理後に決定した。ｍｔ－ＭＲイメージングを使用することにより、本発明者らは、プローブとしての抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片の結合親和性及び特異性も評価した。

ＥＬＴＤ１ヒトＣκ融合タンパク質の組換え細胞外ドメインの調製は、上の実施例２に記載される通りであった。抗ＥＬＤＴ１Ａｂの生成は、上記の通りであった。酵素免疫測定法は、上記の通りであった。Ｇ５５異種移植モデル及び処理は、上記の通りであった。インビボ磁気共鳴（ＭＲ）技法は、上記の通りであった。免疫組織化学及び標準染色は、上記の通りであった。統計分析は、上記の通りであった。

本発明者らは、ヒトＧ５５細胞を２月齢の雄胸腺欠損ヌードマウスに脳内移植した。腫瘍成長を形態学的ＭＲイメージングにより監視し、腫瘍検出時（６～７ｍｍ^３）に、モノクローナル抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂまたは抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ（本明細書では断片とも呼ばれる）のいずれかでの処理を３～４日毎に尾静脈を介して投与した。Ｇ５５神経膠腫を有するマウスの腫瘍検出後の生存率パーセントは、図７Ａに示されるように、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理（＊ｐ＝０．００５８）及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ処理（＊＊＊ｐ＝０．０００１）の両方で有意に高かった。未処理群の平均生存期間が９日であったため、本発明者らは、腫瘍検出後９日目の腫瘍体積を比較した。腫瘍検出後９日目の腫瘍体積は、未処理の対照と比較して、抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理マウス（ｍＡｂ）で有意に低かった（ｍＡｂ＊＊＊ｐ＝０．０００９、ｓｃＦｖ断片＊ｐ＝０．０１７）（図７Ｂ）。全ての処理群からのＧ５５腫瘍を有するマウスの代表的なＭＲＩを図７Ｃ～７Ｅに示す。

抗ＥＬＴＤ１処理が血管新生を標的とするため、本発明者らは、これらの処理が微小血管系に影響を及ぼしたかを調べた。腫瘍血管新生に関連する腫瘍微小血管の変化は、相対脳血流（ｒＣＢＦ）の減少により測定することができる。腫瘍領域内の血管系が成長するにつれて、それは指数関数的により無秩序になり、それ故に、灌流速度が低下する。ＭＲＩを用いて行った灌流スキャンは、未処理の動物の腫瘍領域内のｒＣＢＦの特徴的な減少を示した（図８Ａ）。抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理で処理したマウスの灌流値は、未処理の動物と比較して有意に改善された（いずれもｐ＜０．０００１）。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理は灌流値の正常化を示したが、抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理動物は灌流のわずかな増加を示した（図８Ａ）。図８Ｃ、８Ｅ、８Ｇは、各群の代表的な灌流スキャンを示す。未処理の灌流スキャン（図８Ｃ）は、腫瘍領域内にのみ明確な暗領域（黄色の破線で輪郭を描いた領域）を有し、その領域内で灌流の減少を示す。しかしながら、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理マウス（図８Ｅ）及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理マウス（図８Ｇ）の灌流スキャンにおける腫瘍領域は、対側組織と相同である。さらに、腫瘍関連血管系への抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理の効果を決定した。いずれの抗ＥＬＴＤ１Ａｂ療法も、未処理の動物と比較して、腫瘍領域内の微小血管密度レベル（ＭＶＤ）を有意に低下させる（ｐ＜０．０００１）（図９Ｄ）。全ての処理群の代表的なＣＤ３４ＩＨＣ画像を図９Ａ～９Ｃに示す。

正常な血管系において、ＥＬＴＤ１発現がＶＥＧＦによって上方制御され、Ｎｏｔｃｈ／ＤＬＬ４によって下方制御されることが示されている［３３］。以前の研究では、本発明者らは、ＶＥＧＦとＥＬＴＤ１との間の関係を調べ、神経膠腫モデルにおいて、ＥＬＴＤ１を標的とすることにより、ＶＥＧＦＲ２（ＶＥＧＦ受容体）レベルが減少したことを発見した［３１］。したがって、この実施例では、本発明者らは、抗ＥＬＴＤ１Ａｂ処理がＮｏｔｃｈ１に影響を及ぼしたかを再度決定した。各群からの神経膠腫を有するマウス由来の組織をＮｏｔｃｈ１について染色し、陽性を分析した。本発明者らは、腫瘍領域内の組織と対側正常組織との間のＮｏｔｃｈ１陽性レベルの差の特徴付けに努めた。図１０Ａは、対側組織内の陽性レベルが未処理の動物の腫瘍領域内のレベルと比較して有意に低かった（ｐ＜０．０００１）ことを示す。さらに、我々の抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理は、腫瘍領域内のＮｏｔｃｈ１レベルを有意に低下させることに成功し（それぞれ、ｐ＝０．０００１及びｐ＜０．０００１）、それらを対側正常組織のレベルと同様のレベルにすることができた（図１０Ａ）。図１０Ｂ～１０Ｅに示される代表的な組織画像は、抗ＥＬＴＤ１Ａｂで処理した腫瘍領域内の減少したＮｏｔｃｈ１染色を示す。

抗体処理が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しており、上に示されるこれまでの結果に関与するかを決定するために、本発明者らは、非特異的ＩｇＧ、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ、または抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片のいずれかを、上で説明され（アルブミン－ビオチン－Ｇｄ－ＤＴＰＡ）、かつ図１１Ａに示される分子プローブに結合させた［２８］。分子プローブを未処理の神経膠腫を有する動物に尾静脈を介して注射し、ＭＲ分子標的イメージングにより監視した。分子プローブに結合したＧｄ－ＤＴＰＡにより、プローブが結合している場所の決定が可能になり、腫瘍領域内のシグナル強度の測定が可能になる。図１０Ｂは、シグナル強度が９０分後にベースラインであったため、非特異的ＩｇＧ結合プローブが好適な対照であったことを示す。しかしながら、シグナル強度の差は、図１１Ｂに示されるように、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合分子プローブ及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片結合分子プローブで有意に高かった（それぞれ、ｐ＝０．０００７及びｐ＝０．００３８）。さらに、図１１Ｃは、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ結合プローブが９０分間にわたって腫瘍領域内にどのように局在したかを示す。注射の９０分後に抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片結合プローブのシグナル強度がわずかに減少したため、本発明者らは、最大１８０分間にわたって分子プローブの結合を調べた。図１１Ｄは、断片結合プローブが腫瘍領域に結合して腫瘍領域内に局在するのにより長い時間を必要とすることを示す。

抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片結合プローブは、ＭＲＩにより見られるバルク腫瘍内に局在したのみならず、図１１Ｃの最後のフレームに見られるように、最初は腫瘍組織ではないと考えられた他の領域の周辺にも結合した。その後、神経膠腫組織を、分子プローブに結合したビオチン標識に結合するＳＡ－ＨＲＰで染色し、プローブが結合した領域をさらに調べた。抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片結合プローブは、図１２の上部ボクセルに示されるＳＡ－ＨＲＰ染色により示されるように、バルク腫瘍に到達することに成功した。さらに、組織のＨ＆Ｅ分析は、図１２Ｃの最後のフレームに示されるように、プローブが結合することに成功した脳の外側皮質領域に沿って極めてびまん性の腫瘍領域が存在したことを発見した。図１２の右下ボクセルに見られるように、分子プローブをびまん性腫瘍領域におけるＳＡ－ＨＲＰ染色によっても見つけた。

実施例４．網膜症
網膜症モデルに本発明の抗体を使用して、以下のＲＮＡ発現の変化を決定した。

実施例５．組織再生
組織再生モデルに本発明の抗体を使用して、以下のＲＮＡ発現の変化を決定した。

概要
抗体は、重要かつ確立されたクラスの薬剤である。ごく最近になって、研究は、より大きな全抗体分子の代替案として一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に焦点を合わせている。それ故に、様々ながんのための様々な標的に対するｓｃＦｖが開発されている［３４～３７］。さらに、ＭＲＩ及び生物発光イメージングを使用した潜在的な治療的及び診断的適用の開発のためにｓｃＦｖを分子標的部分に結合させている［３７～４０］。

上に示されるように、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理は、マウスＧＬ２６１モデル及びヒトＧ５５異種移植神経膠腫モデルの両方で、腫瘍体積を減少させ、動物の生存率を上昇させた［２６］。ｐＡｂが現在実行可能な療法ではないため、本特許の目的は、ＥＬＴＤ１に対するモノクローナル抗体療法を開発して最適化することであった。本発明者らは、ＥＴＬＤ１の外部領域に対する抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片を開発した。ＥＬＴＤ１に対するモノクローナル抗体の生成をニワトリで達成した。この宿主の選択は、げっ歯類よりもヒトとさらにかけ離れているため、親和性がより高く、かつ種にわたって反応する可能性のある抗体の生成を可能にするという事実に由来する。

ＧＢＭを有するマウスにおける処理反応に関して、両方のＥＬＴＤ１に対するモノクローナル抗体（抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片）が生存率を上昇させ、腫瘍体積を減少させることに成功した。抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理が成功したように見えたが、群内の腫瘍体積及び腫瘍検出後の生存率に大きなばらつきが見られた。

抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片はいずれも、腫瘍領域内の灌流レベルを正常化することに成功した。さらに、これらの抗ＥＬＴＤ１処理はいずれも、腫瘍領域内の微小血管密度（ＭＶＤ）レベルを低下させるのみならず、正常化することにも成功した。これらの結果は、ＥＬＴＤ１を標的とすることにより、腫瘍領域内の腫瘍関連血管系を正常化することが可能であることを示す。ＧＢＭにおけるＥＬＴＤ１とＶＥＧＦＲ２との関係は、上に示した通りである。これらのデータは、ＧＢＭ腫瘍を有するマウスを抗ＥＬＴＤ１Ａｂで処理することにより、腫瘍組織内のＶＥＧＦＲ２レベルが低下することを示した。本発明では、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理と別の重要な血管新生マーカーであるＮｏｔｃｈとの間の関係をいくらか解明するための実験を行った［３１］。未処理のＧ５５腫瘍が、対側正常組織と比較してＮｏｔｃｈ１タンパク質発現の増加を有することが見出された。しかしながら、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片の両方での反復処理により、Ｎｏｔｃｈ１タンパク質の発現レベルが腫瘍内で減少した。Ｎｏｔｃｈ１が、ＶＥＧＦＲ２と同様に、血管新生の促進に重要な役割を果たすことが示されている。したがって、抗ＥＬＴＤ１Ａｂ療法が血管新生に重要な２つの異なる分子を増加させるという発見は、重要な発見である。実際には、これらの実験では、ＧＢＭ腫瘍を有するマウスの抗ＶＥＧＦｍＡｂアバスチンでの処理により、ＶＥＧＦＲ２が減少したが、Ｎｏｔｃｈ１は減少しなかった。腫瘍内のＮｏｔｃｈ１の減少は、腫瘍内の血管系の正常化をさらに説明し、支持し得るが、本発明を限定するものではない。

非特異的ＩｇＧ、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ、または抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片のいずれかに結合したビオチン－アルブミン－Ｇｄ－ＤＴＰＡ分子プローブを構築することにより、抗体をインビボで局在化し、かつ腫瘍領域内のプローブによって生成されるシグナル強度を定量化することができた。これにより、発明者らは、抗ＥＬＴＤ１モノクローナル結合プローブ及び抗ＥＬＴＤ１断片結合プローブの両方が腫瘍領域内に局在することに成功したと決定することができた。さらに、分子標的データは、抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片結合プローブが、以前はＭＲＩでは検出不能であったびまん性腫瘍領域に結合することができたことを示した。この発見は、抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片を使用してびまん性腫瘍を局在化することができ、腫瘍組織の範囲を特定するための新たな検出ツールを提供する可能性があることを示す。

赤血球中のヘモグロビンの鉄を染色することにより、抗ＥＬＴＤ１ｐＡｂ処理またはｍＡｂ処理と比較したＧ５５ヒトＧＢＭ異種移植組織切片におけるＶＥＧＦに対する抗体（アバスチン）療法に関連する出血の影響を評価することも可能であった（図１３）。がんにおけるアバスチン療法の最も重篤な生命を脅かす有害事象のうちの１つが出血であることを考慮して、抗ＥＬＴＤ１Ａｂ療法も出血を引き起こしたかを知ることが重要であった。本発明では、アバスチン療法が出血を示した一方で、抗ＥＬＴＤ１Ａｂ療法は出血を示さなかった。

抗ＥＬＴＤ１は、Ｎｏｔｃｈタンパク質レベルを有意に低下させることが見出され、これは、未処理のＧ５５腫瘍では高く、抗ＶＥＧＦ（アバスチン）処理、すなわち、抗ＥＬＴＤ１処理（ｐＡｂ、ｍＡｂ、またはｍＡｂのｓｃＦｖ断片）の影響を受けないことが示され、Ｎｏｔｃｈを有意に低下させた一方で、アバスチン処理は影響を及ぼさなかったことが見出された（図１４）。

結論として、これらの分子標的データは、ＭＲイメージングでは検出不能なびまん性腫瘍を区別するための抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ及び抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片の診断的使用を示す。さらに、いずれの抗ＥＴＬＤ１処理も、生存率を上昇させ、腫瘍体積を減少させ、腫瘍関連血管系を正常化させることに成功した。正常な血管系においてＥＬＴＤ１がＮｏｔｃｈ／ＤＬＬ４経路を介して下方制御されることが示されたが、この研究は、ＧＢＭ腫瘍におけるＥＬＴＤ１とＮｏｔｃｈ１との関係を示している。抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂ処理または抗ＥＬＴＤ１ｓｃＦｖ断片処理が、一般にアバスチン処理に関連する出血を引き起こさなかったことも示された。この実施例は、ＥＬＴＤ１に対するモノクローナル抗体療法及びｓｃＦｖ抗体療法の両方が効果的であり、ＧＢＭ腫瘍に対する抗血管新生療法（複数可）に使用することができることを示した。

実施例４．多発性硬化症の新たなバイオマーカー標的ＥＬＴＤ１：実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスモデルにおけるＥＬＴＤ１の分子標的ＭＲＩ検出

多発性硬化症（ＭＳ）は、脳への及び脳からのシグナルを伝達する神経系の能力に影響を与える自己免疫疾患である。炎症は、神経細胞を取り囲む保護カバーであるミエリンに損傷を与え、神経インパルスを遅くし、時には遮断する。この疾患は、視力障害、震え、麻痺、痛みを伴うけいれん、不均衡、認知変化などの様々な症状を伴う。膠芽腫（ＧＢＭ）において、本発明者らは、ＥＬＴＤ１（染色体１上の上皮成長因子、ラトロフィリン、及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１）の過剰発現を検出し、ＥＬＴＤ１を標的とする抗体が動物の生存率を上昇させ、腫瘍体積を減少させる可能性があることを見出した。抗ＥＬＴＤ１処理動物由来の腫瘍組織のＲＮＡ－ｓｅｑ分析から、我々は、抗ＥＬＴＤ１抗体の影響を受けた遺伝子のうちのいくつかがＭＳとも関連していることを発見した。ＥＬＴＤ１の分子標的ＭＲイメージングを使用して、ＭＳ（ＥＡＥ、または実験的自己免疫性脳脊髄炎）マウスモデルにおけるＥＬＴＤ１レベルを評価した。

インビボでのＥＬＴＤ１レベルを、抗ＥＬＴＤ１Ａｂをガドリニウム（Ｇｄ）ベースのＭＲＩ造影剤とカップリングすることにより、分子標的ＭＲＩ（ｍｔＭＲＩ）を使用して評価した。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウス（２～３月齢、雌、ｎ＝１０、抗ＥＬＴＤ１－アルブミン－Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ビオチン（抗ＥＬＴＤ１プローブ）（抗ＥＬＴＤ１プローブではｎ＝５、非特異的ＩｇＧ造影剤ではｎ＝５）を、ＭＲＩスキャンのためにイソフルラン（２～３％）で麻酔した。ＥＬＴＤ１の標的造影剤プローブ（２０μｇ）を使用して、ＥＬＴＤ１発現画像を取得した。ＭＲＩ実験をＢｒｕｋｅｒＢｉｏｓｐｅｃ７．０Ｔｅｓｌａ／３０ｃｍ水平ボアイメージングシステムで行った。スピンエコーマルチスライスを使用して、複数の脳領域１ＨＭＲ画像スライスを取得した（繰り返し時間（ＴＲ）０．８秒、エコー時間（ＴＥ）２３ミリ秒、１２８×１２８マトリックス、取得毎に４ステップ、３×４ｃｍ２の視野、１ｍｍのスライス厚）。ラットの脳を、０分（造影前）及び２０分時点で画像化し、造影剤注入後の間隔は最大９０分であった。Ｔ１強調画像を、可変ＴＲ（繰り返し時間）スピンエコーシーケンスを使用して取得した。画素毎の緩和マップを、非線形２パラメータフィッティング手順を使用して一連のＴ１強調画像から再構築した。指定した関心領域（ＲＯＩ）のＴ１値を、特定されたＲＯＩ内の全ての画素からコンピュータ計算した。

図１５Ａ～１５Ｃは、対照と比較した疾患進行後２７日目のＥＡＥマウスの頸髄の変化を示すＴ２ＭＲＩスキャンを示す。

図１６Ａ～１６Ｃは、疾患進行後１０日目（ＥＡＥ－Ｅ）及び２６日目（ＥＡＥ－Ｌ）に取得したＧｄ－ＤＴＰＡＭＲＩ造影剤を使用して得た造影像及びＴ１強調ＭＲＩスキャンを示す。

図１７は、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブを示す。ＥＬＴＤ１の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、Ｇｄ－ＤＴＰＡ及びビオチンが構築物に結合したアルブミンにコンジュゲートした。

図１８Ａ～１８Ｃは、非選択的対照ＭＲＩ造影剤と比較して抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂＭＲＩプローブがＭＳのＥＡＥマウスモデルにおける様々な脳領域に効率的に結合することを示す。ｐ＜０．０００１。抗ＥＬＴＤ１プローブを対照ＩｇＧ造影剤と比較した場合のＴ１緩和率パーセントの変化。

図１９Ａ及び１９Ｂは、（図１９Ａ）抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂＭＲＩプローブがＭＳのＥＡＥマウスモデルの脳内の内皮細胞に効率的に結合することを示す。ＥＬＴＤ１の分子標的ＭＲイメージング（ストレプトアビジン－ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）が抗ＥＬＴＤ１プローブのビオチン部分に結合する）。（図１９Ｂ）ＥＬＴＤ１の免疫組織化学染色は、ＥＡＥマウスの内皮細胞において高レベルを示す。

したがって、ｍｔＭＲＩを使用して、本発明者らは、非特異的ＩｇＧ造影剤を投与したＥＡＥマウスと比較して、抗ＥＬＴＤ１ｍＡｂプローブを投与したＥＡＥマウス（ＭＳのモデル）において有意に増加したＥＬＴＤ１レベルを実証することができた。図１５Ａ～１５Ｃのデータは、ＭＳのＥＡＥマウスモデルにおけるＥＬＴＤ１レベルインビボｍｔＭＲイメージングにおける本発明の使用を実証する。ｍｔＭＲＩは、初めて、ＭＳのマウスモデルにおけるＥＬＴＤ１の非侵襲性インビボ検出を示す。

表５：ＧＢＭモデルにおける抗ＥＬＴＤ－１ｍＡｂ療法によって改変された２３個の遺伝子のうちの７個が同様にＭＳと関連していることを示すＲＮＡシーケンシングデータ。

本明細書で考察されるいずれの実施形態も、本発明のいずれかの方法、キット、試薬、または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。

本明細書に記載の特定の実施形態が本発明を限定するものではなく、例示として示されていることが理解されよう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態で用いられてもよい。当業者であれば、通例の実験のみを使用して、本明細書に記載の特定の手順の多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる等価物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、添付の特許請求の範囲によって包含される。

本明細書で言及される全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物及び特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が参照により具体的かつ個別に組み込まれることが示されているのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

「ａ」または「ａｎ」という用語の使用は、特許請求の範囲及び／または本明細書における「含む」という用語と組み合わせて使用される場合、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つまたは２つ以上の」という意味とも一致する。特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すよう明示的に示されない限り、または代替物が相互排他的でない限り、「及び／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／または」を指す定義を支持する。本明細書を通じて、「約」という用語は、値が、その値を決定するために用いられる装置、方法の誤差の固有のばらつき、または試験対象間で存在するばらつきを含むことを示すために使用される。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などの有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形式）、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形式）という単語は、包括的または無制限であり、追加の列挙されていない特徴、要素、成分、群、整数、及び／またはステップを除外しないが、他の述べられていない特徴、要素、成分、群、整数、及び／またはステップの存在を除外しない。本明細書で提供される組成物及び方法のうちのいずれかの実施形態では、「含む」は、「から本質的になる」または「からなる」と置き換えられてもよい。本明細書で使用される場合、「からなる」という用語は、列挙された整数（例えば、特徴、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップ、または制限）または一群の整数（例えば、特徴（複数可）、要素（複数可）、特徴（複数可）、特性（複数可）、方法／プロセスステップ、または制限（複数可））の存在のみを示すために使用される。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という語句は、指定された特徴、要素、成分、群、整数、及び／またはステップを必要とするが、他の述べられていない特徴、要素、成分、群、整数、及び／またはステップ、ならびに特許請求される本発明の基本的な及び新規の特徴（複数可）及び／または機能に実質的に影響を及ぼさないものの存在を除外しない。

本明細書で使用される「またはそれらの組み合わせ」という用語は、その用語に先行する列記された項目の全ての順列及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうちの少なくとも１つを含み、かつ特定の文脈で順序が重要な場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、またはＣＡＢのうちの少なくとも１つを含むよう意図されている。引き続きこの例では、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１つ以上の項目または用語の繰り返しを含む組み合わせが明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から明らかでない限り、典型的には、任意の組み合わせにおいて項目または用語の数に制限がないことを理解するであろう。

本明細書で使用される場合、例えば、「約」、「実質的」、または「実質的に」であって、これらに限定されない近似を示す単語は、そのように修飾された場合に、必ずしも絶対的または完全ではないことが理解されるが、当業者であればその条件を存在しているものと指定するのを保証するのに十分に近いとみなすであろう条件を指す。記述にばらつきがあり得る範囲は、どのくらい大きな変化が策定され得るかに依存し、当業者に、修飾された特徴を、修飾されていない特徴の必要とされる特徴及び能力を依然として有するものとして依然として認識させる。一般ではあるが、前述の考察に従って、「約」などの近似を示す単語によって修飾される本明細書の数値は、述べられた値から少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２、または１５％異なってもよい。

本明細書に開示され、かつ特許請求される組成物及び／または方法は全て、本開示に照らして、過度の実験なしに作製及び実行され得る。本発明の組成物及び方法が好ましい実施形態に関して記載されているが、変形が、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物及び／または方法に、かつ本明細書に記載の方法のステップまたはステップの順序において適用されてもよいことが当業者には明らかであろう。当業者に明らかな全てのかかる同様の代替物及び修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあるとみなされる。

特許庁及び本出願で取得されるいずれかの特許のいずれかの読者が添付の特許請求の範囲を解釈することを支援するために、出願者は、「のための手段」または「のためのステップ」という言語が特定の特許請求の範囲で明示的に使用されない限り、その出願日に存在するものとして、添付の特許請求の範囲のいずれも米国特許法第１１２条第６項、米国特許法第１１２条第（ｆ）項、または等価物に訴えることを意図しないことに言及することを望む。

請求項の各々について、各従属請求項は、先行する請求項が請求項の用語または要素に適切な根拠を提供する限り、ありとあらゆる請求項の独立請求項及び先行する従属請求項の各々の両方に従属することができる。

参考文献－実施例２
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３２．ＳｅｒｂａｎＦ，ＤａｉａｎｕＯ，ＴａｔａｒａｎｕＬＧ，ＡｒｔｅｎｅＳＡ，ＥｍａｍｉＧ，ＧｅｏｒｇｅｓｃｕＡＭ，ＡｌｅｘａｎｄｒｕＯ，ＰｕｒｃａｒｕＳＯ，ＴａｃｈｅＤＥ，ＤａｎｃｉｕｌｅｓｃｕＭＭ，ＳｆｒｅｄｅｌＶ，ＤｒｉｃｕＡ．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎａｎｄｓｅｖｅｎｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１（ＥＬＴＤ１）ｖｉａｓｉＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．ＪＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．２０１７；３８：２１－３３．
３３．ＺｏｕＱ，ＸｉａｏＺ，ＨｕａｎｇＲ，ＷａｎｇＸ，ＷａｎｇＸ，ＺｈａｏＨ，ＹａｎｇＸ．Ｓｕｒｖｅｙｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓｈｉｆｔｓｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｗｉｔｈｒｉｂｏｓｏｍｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０１９；９：４１４１－５５．
３４．ＺｈａｏＣ，ｑｉｎＱ，ＷａｎｇＱ，ＺｈａｎｇＪ，ＸｕＹ，ＬｉＷ，ＧｕＭ，ＣｈｅｎＳ，ＤｅｎｇＡ．ＳＣＵＢＥ３ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｓｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓｉｎｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ．ＢｉｏｓｃｉＴｒｅｎｄｓ．２０１３；７：２６４－９．
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３６．ＣｈａｎｇＰＭ，ＹｅｈＹＣ，ＣｈｅｎＴＣ，ＷｕＹＣ，ＬｕＰＪ，ＣｈｅｎｇＨＣ，ＬｕＨＪ，ＣｈｅｎＭＨ，ＣｈｏｕＴＹ，ＨｕａｎｇＣＹ．ＨｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＨＲＮＡ１ｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｒｅｄｕｃｅｄｓｕｒｖｉｖａｌｉｎｅａｒｌｙｓｔａｇｅｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａａｆｔｅｒｃｏｍｐｌｅｔｅｒｅｓｅｃｔｉｏｎ．ＡｎｎＳｕｒｇＯｎｃｏｌ．２０１３；２０：３６４８－５４．
３７．ＺｈｕｏＨ，ＺｈａｏＹ，ＣｈｅｎｇＸ，ＸｕＭ，ＷａｎｇＬ，ＬｉｎＬ，ＬｙｕＺ，ＨｏｎｇＸ，ＣａｉＪ．Ｔｕｍｏｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄｃａｄｈｅｒｉｎ－２ｐｒｏｍｏｔｅｓａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｈａｓｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｆｏｒｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＭｏｌＣａｎｃｅｒ．２０１９；１８：３４．
３８．ＶａｒｌｅｙＫＥ，ＧｅｒｔｚＪ，ＲｏｂｅｒｔｓＢＳ，ＤａｖｉｓＮＳ，ＢｏｗｌｉｎｇＫＭ，ＫｉｒｂｙＭＫ，ＮｅｓｍｉｔｈＡＳ，ＯｌｉｖｅｒＰＧ，ＧｒｉｚｚｌｅＷＥ，ＦｏｒｅｒｏＡ，ＢｕｃｈｓｂａｕｍＤＪ，ＬｏＢｕｇｌｉｏＡＦ，ＭｙｅｒｓＲＭ．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈｆｕｓｉｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓＴｒｅａｔ．２０１４；１４６：２８７－９７．
３９．ＣａｉＹ，ＬｉＷＦ，ＳｕｎＹ，ＬｉｕＫ．ＤｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡ－６４５ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｍｅｔａｓｔａｓｉｓｖｉａｔａｒｇｅｔｉｎｇＤＣＤＣ２．ＥｕｒＲｅｖＭｅｄＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ．２０１７；２１：４１２９－３６．
４０．ＹｕａｎＪ，ＺｈａｎｇＮ，ＺｈｕＨ，ＬｉｕＪ，ＸｉｎｇＨ，ＭａＦ，ＹａｎｇＭ．ＣＨＳＴ９ｒｓ１４３６９０４ｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｎｔｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．ＳｃｉＲｅｐ．２０１７；７：１１８０２．
４１．ＬｅｅＪＷ，ＧｕａｎＷ，ＨａｎＳ，ＨｏｎｇＤＫ，ＫｉｍＬＳ，ＫｉｍＨ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－７０８－３ｐｍｅｄｉａｔｅｓｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｎｄｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｈｒｏｕｇｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｔｏ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．２０１８；１０９：１４０４－１３．
４２．ＷｒｅｎＪＤ．Ａｇｌｏｂａｌｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｔｏｐｒｅｄｉｃｔｕｎｋｎｏｗｎｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｅｓｔｉｍａｔｅｔｈｅｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ－ｄａｔａｄｉｖｉｄｅ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９；２５：１６９４－７０１．
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４６．ＹａｎｇＸ，ＬｉＤ，ＣｈｅｎｇＳ，ＦａｎＫ，ＳｈｅｎｇＬ，ＺｈａｎｇＪ，ＦｅｎｇＢ，ＸｕＺ．Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ２ｗｉｔｈｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓｉｎｇｌｉｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓ．ＴｕｍｏｕｒＢｉｏｌ．２０１４；３５：１１０９１－５．
４７．ＧｕｏＭ，ＪｉａｎｇＺ，ＺｈａｎｇＸ，ＬｕＤ，ＨａＡＤ，ＳｕｎＪ，ＤｕＷ，ＷｕＺ，ＨｕＬ，ＫｈａｄａｒｉａｎＫ，ＳｈｅｎＪ，ＬｉｎＺ．ｍｉＲ－６５６ｉｎｈｉｂｉｔｓｇｌｉｏｍａｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＭＰＲ１Ａ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１４；３５：１６９８－７０６．
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［３１］ＺｉｅｇｌｅｒＪ，ＺａｌｌｅｓＭ，ＳｍｉｔｈＮ，ＳａｕｎｄｅｒｓＤ，ＬｅｒｎｅｒＭ，ＦｕｎｇＫＭ，ＰａｔｅｌＭ，ＷｒｅｎＪＤ，ＬｕｐｕＦ，ＢａｔｔｉｓｔｅＪａｎｄＴｏｗｎｅｒＲＡ．ＴａｒｇｅｔｉｎｇＥＬＴＤ１，ａｎａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｍａｒｋｅｒｆｏｒｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ（ＧＢＭ），ａｌｓｏａｆｆｅｃｔｓＶＥＧＦＲ２：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄＭＲＩａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．ＡｍＪＮｕｃｌＭｅｄＭｏｌＩｍａｇｉｎｇ２０１９；９：９３－１０９．
［３２］ＨａａｃｋｅＥ．Ｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅｉｍａｇｉｎｇ：ｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｓｉｇｎ．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，１９９９．
［３３］ＳｅｒｂａｎＦ，ＤａｉａｎｕＯ，ＴａｔａｒａｎｕＬＧ，ＡｒｔｅｎｅＳＡ，ＥｍａｍｉＧ，ＧｅｏｒｇｅｓｃｕＡＭ，ＡｌｅｘａｎｄｒｕＯ，ＰｕｒｃａｒｕＳＯ，ＴａｃｈｅＤＥ，ＤａｎｃｉｕｌｅｓｃｕＭＭ，ＳｆｒｅｄｅｌＶａｎｄＤｒｉｃｕＡ．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎａｎｄｓｅｖｅｎｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１（ＥＬＴＤ１）ｖｉａｓｉＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．ＪＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ２０１７；３８：２１－３３．
［３４］ＫｕａｎＣＴ，ＳｒｉｖａｓｔａｖａＮ，ＭｃＬｅｎｄｏｎＲＥ，ＭａｒａｓｃｏＷＡ，ＺａｌｕｔｓｋｙＭＲａｎｄＢｉｇｎｅｒＤＤ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆｈｕｍａｎｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎＭＲＰ３ｆｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇｍａｌｉｇｎａｎｔｇｌｉｏｍａｓ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ２０１０；１２７：５９８－６１１．
［３５］ＺｈｕＸ，ＢｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒＳ，ＨａｓｈｉｚｕｍｅＲ，ＪａｍｅｓＣＤ，ＢｅｒｇｅｒＭＳａｎｄＬｉｕＢ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇｈｕｍａｎｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔａｒｇｅｔｉｎｇｂｒａｉｎｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅｃｅｌｌｓ．ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ２０１０；９：２１３１－２１４１．
［３６］ＰａｔｉｌＳＳ，ＲａｉｌｋａｒＲ，ＳｗａｉｎＭ，ＡｔｒｅｙａＨＳ，ＤｉｇｈｅＲＲａｎｄＫｏｎｄａｉａｈＰ．ＮｏｖｅｌａｎｔｉＩＧＦＢＰ２ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｓｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ．ＪＮｅｕｒｏｏｎｃｏｌ２０１５；１２３：２２５－２３５．
［３７］ＬｕＺ，ＫａｍａｔＫ，ＪｏｈｎｓｏｎＢＰ，ＹｉｎＣＣ，ＳｃｈｏｌｌｅｒＮａｎｄＡｂｂｏｔｔＫＬ．ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆａＦｕｌｌｙＨｕｍａｎｓｃＦｖｔｈａｔｂｉｎｄｓＴｕｍｏｒ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＧｌｙｃｏｆｏｒｍｓ．ＳｃｉＲｅｐ２０１９；９：５１０１．
［３８］ＭａｚｚｏｃｃｏＣ，ＦｒａｃａｓｓｏＧ，Ｇｅｒｍａｉｎ－ＧｅｎｅｖｏｉｓＣ，Ｄｕｇｏｔ－ＳｅｎａｎｔＮ，ＦｉｇｉｎｉＭ，ＣｏｌｏｍｂａｔｔｉＭ，ＧｒｅｎｉｅｒＮａｎｄＣｏｕｉｌｌａｕｄＦ．Ｉｎｖｉｖｏｉｍａｇｉｎｇｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｕｓｉｎｇａｎａｎｔｉ－ＰＳＭＡｓｃＦｖｆｒａｇｍｅｎｔａｓａｐｒｏｂｅ．ＳｃｉＲｅｐ２０１６；６：２３３１４．
［３９］ＹａｎｇＬ，ＭａｏＨ，ＷａｎｇＹＡ，ＣａｏＺ，ＰｅｎｇＸ，ＷａｎｇＸ，ＤｕａｎＨ，ＮｉＣ，ＹｕａｎＱ，ＡｄａｍｓＧ，ＳｍｉｔｈＭＱ，ＷｏｏｄＷＣ，ＧａｏＸａｎｄＮｉｅＳ．Ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｉｎｖｉｖｏｔｕｍｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇａｎｄｉｍａｇｉｎｇ．Ｓｍａｌｌ２００９；５：２３５－２４３．
［４０］ＬａｒｉｖｉｅｒｅＭ，ＬｏｒｅｎｚａｔｏＣＳ，ＡｄｕｍｅａｕＬ，ＢｏｎｎｅｔＳ，ＨｅｍａｄｏｕＡ，Ｊａｃｏｂｉｎ－ＶａｌａｔＭＪ，ＮｏｕｂｈａｎｉＡ，ＳａｎｔａｒｅｌｌｉＸ，ＭｉｎｄｅｒＬ，ＤｉＰｒｉｍｏＣ，ＳａｎｃｈｅｚＳ，ＭｏｒｎｅｔＳ，Ｌａｒｏｃｈｅ－ＴｒａｉｎｅａｕＪａｎｄＣｌｏｆｅｎｔ－ＳａｎｃｈｅｚＧ．Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍａｇｉｎｇｏｆａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄｗｉｔｈｓｃＦｖｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆａｎａｎｔｉ－ａｌｐｈａＩＩｂｂｅｔａ３ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１９；２２：１０２０８２．

Claims

多発性硬化症を有するか、または有する疑いのある対象の治療方法であって、ＥＧＦ、ラトロフィリン及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）に対する結合親和性を有する抗体または抗体断片を、前記対象に送達することを含む、前記治療方法。
前記抗体が、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である、請求項１に記載の方法。
前記抗体断片が、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変領域断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である、請求項１に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、ＦｃＲ相互作用を改変（除去または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害または補体活性化などのエフェクター機能を増加または減少させるように変異導入したＦｃ部分を含む、請求項１、２または３のいずれかに記載の方法。
前記抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；または１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；または１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片をコードするＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
コルチコステロイド、オクレリズマブ（オクレバス）、βインターフェロン、酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ，Ｇｌａｔｏｐａ）、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ）、ジメチルフマル酸塩（Ｔｅｃｆｉｄｅｒａ）、テリフルノミド（Ａｕｂａｇｉｏ）、シポニモド（Ｍａｙｚｅｎｔ）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｖｕｓ）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ、Ｌｅｍｔｒａｄａ）、ミトキサントロン、またはその機能的誘導体から選択される、多発性硬化症を治療するか、または症状を軽減する活性薬剤を提供することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
ＥＬＴＤ１の非侵襲性ｉｎｖｉｖｏ検出のために、抗体または抗体断片にプローブを付加することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
網膜症を有しているか、または有している疑いがある対象の治療方法であって、ＥＧＦ、ラトロフィリン及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）に対する結合親和性を有する抗体または抗体断片を、前記対象に送達することを含む、前記治療方法。
前記抗体が、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である、請求項１２に記載の方法。
前記抗体断片が、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変領域断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である、請求項１２に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である、請求項１２または１３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、ＦｃＲ相互作用を改変（除去または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害または補体活性化などのエフェクター機能を増加または減少させるように変異導入したＦｃ部分を含む、請求項１２、１３、または１５のいずれかに記載の方法。
抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；または１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；または１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片をコードするＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
コルチコステロイド、ＶＥＧＦ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、または成長ホルモン阻害剤から選択される、網膜症を治療するか、または症状を軽減する活性薬剤を提供することをさらに含む、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
ＥＧＦ、ラトロフィリン、及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）に結合するポリクローナル抗血清または１つ以上のモノクローナル抗体もしくは抗体断片を含む、医薬製剤。
前記抗体が、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である、請求項２２に記載の医薬製剤。
前記抗体断片の少なくとも１つが、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変領域断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である、請求項２２に記載の医薬製剤。
前記抗体または抗体断片が、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である、請求項２２または２３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記抗体または抗体断片が、ＦｃＲ相互作用を改変（除去または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害または補体活性化などのエフェクター機能を増加または減少させるように変異導入したＦｃ部分を含む、請求項２２、２３、または２５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の少なくとも１つが、それぞれ、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記抗体が、それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；または１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記抗体が、それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；または１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片をコードするＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記抗体または抗体断片の少なくとも１つが、細胞透過性ペプチドをさらに含み、及び／またはイントラボディである、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
細胞または組織を、ＥＬＴＤ１に対する結合親和性を有するポリクローナル抗血清または抗体もしくは抗体断片と接触させることを含む、組織再生の促進方法。
前記抗体が、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である、請求項３２に記載の方法。
前記抗体断片が、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変領域断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である、請求項３２に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である、請求項３２～３３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、ＦｃＲ相互作用を改変（除去または増強）して半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害または補体活性化などのエフェクター機能を増加または減少させるように変異導入したＦｃ部分を含む、請求項３２、３３または３５のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；または１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；または１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片をコードするＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞を、ｉｎｖｉｔｒｏで接触させる、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞を、ｉｎｖｉｖｏで接触させる、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、心臓細胞、肝細胞、筋細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、肺細胞、膀胱細胞、腸細胞、毛包細胞、網膜細胞、角膜細胞、胃細胞、神経細胞、内皮細胞、膵臓細胞、甲状腺細胞、表皮細胞、神経細胞、ミクログリア細胞、星状細胞、及び乳房細胞である、請求項３２～４２のいずれか一項に記載の方法。
組織再生が、神経再生、血管再生、または骨再生の少なくとも１つを含む、請求項３２に記載の方法。
がんを有しているか、または有している疑いのある対象の治療方法であって、ＥＬＴＤ１に対する結合親和性を有する抗体または抗体断片を前記対象に送達することを含む、前記治療方法。
前記抗体が、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である、請求項４５に記載の方法。
前記抗体断片が、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変領域断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である、請求項４５に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である、請求項４５～４６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、ＦｃＲ相互作用を改変（除去または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害または補体活性化などのエフェクター機能を増加または減少させるように変異導入したＦｃ部分を含む、請求項４５、４６または４８のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、それぞれ、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；または１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；または１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または前記抗体断片が、前記抗体または前記抗体断片をコードするＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、転移性結腸直腸癌、第一選択（ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ）非扁平上皮非小細胞肺癌、再発性多形性膠芽腫、転移性腎細胞癌、持続性、再発性、または転移性子宮頸癌、及び上皮性卵巣癌、卵管癌、または原発性腹膜癌を有する、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の方法。
前記対象を、放射線、化学療法、免疫療法、毒素療法または手術などの第２のがん療法で治療することをさらに含む、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片をコードするＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列またはベクターによる遺伝子送達による投与に適合されている、請求項４５～５５のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、投与中に出血の減少を示すか、または出血を全く示さない、請求項４５～５５のいずれか一項に記載の方法。
前記がんが、転移性結腸直腸癌、第一選択（ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ）非扁平上皮非小細胞肺癌、再発性多形性膠芽腫、転移性腎細胞癌、持続性、再発性、または転移性子宮頸癌、及び上皮性卵巣癌、卵管癌、または原発性腹膜癌である、請求項４５～５５のいずれか一項に記載の方法。
それぞれ、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、ＥＬＴＤ１に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその結合断片。
前記抗体が、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である、請求項５９に記載のモノクローナル抗体。
前記結合断片が、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変領域断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＦｖ断片である、請求項５９に記載のモノクローナル抗体。
前記抗体または抗体断片が、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である、請求項５９または６０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
前記抗体または抗体断片が、ＦｃＲ相互作用を改変（除去または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害または補体活性化などのエフェクター機能を増加または減少させるように変異導入したＦｃ部分を含む、請求項５９、６０または６２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
前記抗体が、ｓｃＦｖであり、配列番号１、５、９、１３、１７、または２１の少なくとも１つの核酸によってコードされる、請求項５９に記載のモノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体またはその結合断片が、それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；または１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項５９～６６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体またはその結合断片が、それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；または１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項５９、６４、または６５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体またはその結合断片が：
それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；もしくは１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；もしくは１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の少なくとも一方；または両方を有する、請求項５９～６６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
前記抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片をコードするＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている、請求項５９～６６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
前記抗体または抗体断片に結合させたプローブをさらに含む、請求項５９～６６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
前記対象から生体試料を採取し、
前記生体試料を、ＥＬＴＤ１に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその結合断片と接触させ、その場合、前記モノクローナル抗体またはその結合断片が、
それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；もしくは１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、または
それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；もしくは１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の少なくとも一方；または両方を有し；さらに、
前記モノクローナル抗体またはその結合断片の前記試料への結合を検出することを含む、対象におけるＥＬＴＤｌの検出方法。
前記抗体が、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である、請求項７０に記載の方法。
標的細胞と接触させる場合に、Ｎｏｔｃｈ１及びＶＥＧＦＲ２の両方を下方制御する、ＥＬＴＤ１に対する結合親和性を有する、二機能性モノクローナル抗体もしくはその抗体断片、またはポリクローナル血清。
前記抗体が、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である、請求項７１に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体断片が、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変領域断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＦｖ断片である、請求項７１に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体または抗体断片が、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である、請求項７１または７３に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体または抗体断片が、ＦｃＲ相互作用を改変（除去または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害または補体活性化などのエフェクター機能を増加または減少させるように変異導入したＦｃ部分を含む、請求項７１、７３、または７５に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、ｓｃＦｖであり、配列番号１、５、９、１３、１７、または２１の少なくとも１つの核酸によってコードされる、請求項７１に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体が、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する、請求項７１～７７のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体またはその結合断片が、それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；または１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体またはその結合断片が、それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；または１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体またはその結合断片が：それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；もしくは１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；もしくは１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の少なくとも一方；または両方を有する、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片をコードするＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記モノクローナル抗体またはその抗体断片が、ｉｎｖｉｔｒｏで、増殖を阻害するか、細胞死を開始させるか、またはその両方を行う、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、がん細胞に結合する場合に：ナトリウムチャネルタンパク質５型サブユニットα、またはＬ１細胞接着分子の少なくとも一方の発現を低下させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、がん細胞に結合する場合に、ＥＬＴＤ１を発現するすべての腫瘍において：ＡＤＡ、ＳＣＮ５Ａ、Ｌ１ＣＡＭ、ＢＭＰ２、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）、ＴＲＰＭ８の少なくとも１つの発現を増加させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、がん細胞に結合する場合に、ＳＥＬＥＮＢＰ１の発現を減少させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、肝細胞癌に結合する場合に：ＶＷＡ１を減少させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、肺癌細胞に結合する場合に、以下の少なくとも１つの発現、すなわち：ＳＣＵＢＥ３を減少させるか、ＰＬＣＨ１を増加させるか、ＣＨＲＮＡ１を増加させるか、またはＣＤＨ２を増加させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、乳癌細胞に結合する場合に：ＩＦＩＴＭ１０を減少させ、ＤＣＤＣ２を増加させ、ＣＨＳＴ９を増加させ、及びＣＤＨ２を増加させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、がん細胞に結合する場合に：ＣＤ７４の発現を増加させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、網膜細胞に結合する場合に：アデノシンデアミナーゼまたはアペリンの少なくとも一方の発現を減少させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、網膜細胞に結合する場合に：骨γカルボキシグルタミン酸タンパク質、マトリリン２、またはフォンヴィルブランド因子Ａドメイン含有１の発現を増加させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体を、多発性硬化症の対象に提供する場合に：ナトリウムチャネルタンパク質５型サブユニットα、アデノシンデアミナーゼ、アペリン、ｓｐｉｎｓｔｅｒホモログ２、または骨形成タンパク質２の少なくとも１つの発現を減少させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体を、多発性硬化症の対象に提供する場合に：ＣＤ７４またはＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガー１（Ｉｋａｒｏｓ）の少なくとも一方の発現を増加させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体を、組織再生が必要な部位で対象に提供する場合に：骨γ－カルボキシグルタメート（ｇｌａ）タンパク質、マトリリン２、またはフォンヴィルブランド因子Ａドメイン含有１の少なくとも１つの発現を増加させる、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体を、転移性結腸直腸癌、第一選択（ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ）非扁平上皮非小細胞肺癌、再発性多形性膠芽腫、転移性腎細胞癌、持続性、再発性、または転移性子宮頸癌、及び上皮性卵巣癌、卵管癌、または原発性腹膜癌から選択されるがんを治療するのに十分な量で提供する、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
抗ＥＧＦ、ラトロフィリン及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）抗体またはその断片による、対象における疾患または病態の治療方法であって：
前記疾患または病態を治療する必要がある対象を特定し；そして
前記疾患または病態に由来する症状を軽減するか、または前記疾患または病態を治療するのに十分な、有効量のＥＬＴＤ１特異的結合抗体またはその結合断片を提供することを含み、前記疾患または病態が、多発性硬化症、網膜症、がん、または組織再生から選択される、前記治療方法。
前記抗体が、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはその断片である、請求項９７に記載の方法。
前記抗体が、組換え二価ｓｃＦｖＦｃ融合抗体である、請求項９７または９８に記載の方法。
前記モノクローナル抗体またはその結合断片が、組換えｓｃＦｖ（一本鎖可変領域断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である、請求項９７または９８に記載の方法。
前記モノクローナル抗体または抗体断片が、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または二重特異性である、請求項９７または１００に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、ＦｃＲ相互作用を改変（除去または増強）して、半減期を増加させるように及び／または抗体依存性細胞傷害または補体活性化などのエフェクター機能を増加または減少させるように変異導入したＦｃ部分を含む、請求項９７、１００または１０１のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、ｓｃＦｖであり、配列番号１、５、９、１３、１７、または２１の少なくとも１つの核酸によってコードされる、請求項９７または１００～１０２のいずれか一項に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、配列番号２及び４、６及び８、１０及び１２、１４及び１６、１８及び２０、または２２及び２４のアミノ酸配列を有する、請求項９７または１００～１０２のいずれか一項に記載の方法。
前記モノクローナル抗体またはその結合断片が、それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；または１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項９７または１００～１０２のいずれか一項に記載の方法。
前記モノクローナル抗体またはその結合断片が、それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；または１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項９７または１００～１０２のいずれか一項に記載の方法。
前記モノクローナル抗体またはその結合断片が：
それぞれ、配列番号２５、２６及び２７；３１、３２及び３３；３７、３８及び３９；４３、４４及び４５；４９、５０及び５１；５５、５６及び５７；６１、６２及び６３；６７、６８及び６９；７３、７４及び７５；７９、８０及び８１；８５、８６及び８７；９１、９２及び９３；９７、９８及び９９；１０３、１０４及び１０５；１０９、１１０及び１１１；１１５、１１６及び１１７；１２１、１２２及び１２３；もしくは１２７、１２８及び１２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
それぞれ、配列番号２８、２９及び３０；３４、３５及び３６；４０、４１及び４２；４６、４７及び４８；５２、５３及び５４；５８、５９及び６０；６４、６５及び６６；７０、７１及び７２；７６、７７及び７８；８２、８３及び８４；８８、８９及び９０；９４、９５及び９６；１００、１０１及び１０２；１０６、１０７及び１０８；１１２、１１３及び１１４；１１８、１１９及び１２０；１２４、１２５及び１２６；もしくは１３０、１３１及び１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の少なくとも一方；または両方を有する、請求項９７または１００～１０２のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗体断片が、前記抗体または抗体断片をコードするＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列またはベクターを用いた投与または遺伝子送達に適合されている、請求項９７または１００～１０２のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、ネスチンを下方制御する、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
プローブをさらに含む、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
ＭＲＩを介して検出可能なプローブをさらに含む、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の二機能性モノクローナル抗体。
前記抗体が、がん細胞に結合する場合に：ナトリウムチャネルタンパク質５型サブユニットα、またはＬ１細胞接着分子の少なくとも一方の発現を減少させる、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、がん細胞に結合する場合に：ＣＤ７４の発現を増加させる、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、網膜細胞に結合する場合に：アデノシンデアミナーゼまたはアペリンの少なくとも一方の発現を減少させる、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、網膜細胞に結合する場合に：骨γ－カルボキシグルタミン酸タンパク質、マトリリン２、またはフォンヴィルブランド因子Ａドメイン含有１の発現を増加させる、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体を、多発性硬化症の対象に提供する場合に：ナトリウムチャネルタンパク質５型サブユニットα、アデノシンデアミナーゼ、アペリン、ｓｐｉｎｓｔｅｒホモログ２、または骨形成タンパク質２の少なくとも１つの発現を減少させる、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体を、多発性硬化症の対象に提供する場合に：ＣＤ７４またはＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガー１（Ｉｋａｒｏｓ）の少なくとも一方の発現を増加させる、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体を、組織再生が必要な部位で対象に提供する場合に：骨γ－カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）タンパク質、マトリリン２、またはフォンヴィルブラント因子Ａドメイン含有１の少なくとも１つの発現を増加させる、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、ネスチンを下方制御する、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
プローブをさらに含む、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
ＭＲＩを介して検出可能なプローブをさらに含む、請求項９７～１０８のいずれか一項に記載の方法。
抗ＥＧＦ、ラトロフィリン及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）抗体またはその断片による、対象における疾患または病態の診断方法であって：
前記疾患または病態の治療を必要とする対象を特定し；
前記対象から生体試料を採取し；そして
前記試料を、検出可能なマーカーを含む、抗ＥＧＦ、ラトロフィリン及び７回膜貫通ドメイン含有タンパク質１（ＥＬＴＤ１）抗体またはその結合断片と接触させることを含み、前記疾患または病態が、多発性硬化症、網膜症、がん、または再生が必要な組織から選択される、前記診断方法。