KR101914227B1 - 아세틸화된 인간 BubR1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그 용도 - Google Patents

아세틸화된 인간 BubR1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

항-BubR1 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 아세틸화된 인간 BubR1에 특이적으로 결합하는 항-BubR1 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 및 상기 항체의 용도가 제공된다.

Description

아세틸화된 인간 BubR1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그 용도{Antibody Specifically Binding to Acetylated Human BubR1 and Use thereof}
항-BubR1 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 아세틸화된 인간 BubR1에 특이적으로 결합하는 항-BubR1 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 및 상기 항체의 용도와 관련된 것이다.
세포분열에 있어 가장 중요한 것은 모세포와 동일한 유전정보를 딸세포로 정확하게 전달하는데 있다. 특히 유전정보가 복제된 후 각각의 딸세포로 이동하는 염색체 분리시기, 즉 세포분열 중기에서 후기로 전환되는 시기는 세포분열의 정점을 이루며, 딸세포로의 완전한 유전체의 전달을 위해서 방추체 조립 체크포인트(Spindle Assembly Checkpoint, SAC)의 정상적 작동을 필요로 한다.
정상적인 경우, 세포분열은 통상 30분 내에 종료하지만, 한 개의 염색체라도 방추사에 정상적으로 적절하게 부착되지 않는 경우 길게는 16시간까지 세포분열이 지연된다. 이를 조절하는 것이 SAC로, 활성화된 SAC는 세포분열 후기의 진행에 필요한 후기진행 복합체(Anaphase Promoting Complex, APC/C)를 억제한다. APC/C는 다중복합체를 이루고 있는 E3 라이게이즈로 세큐린과 사이클린 B를 파괴한다. SAC가 제대로 작동하지 않는 경우, 세포는 죽거나 이수배수체를 생성하게 되는데, 이수배수체는 암세포의 중요한 특징으로 알려져 있다. 또한, SAC가 정상적으로 작용하지 못하는 경우, 진행이 빠르고 치료가 어려운 염색체 불안정성 암(Chromosomal Instability Cancer, CIN)이 생길 수 있다.
암세포는 무제한으로 분열하기 때문에 세포분열을 조절하는 것이 암치료의 지름길이며, 이를 위해서는 세포분열 체크포인트에서 여러 인자들의 상호작용 및 이들 간의 조절기전 그리고 이러한 체크포인트의 활성도를 체크할 수 있는 물질의 개발이 중요하다. 세포분열 체크포인트인 SAC를 구성하는 인자 중 APC/C에 직접 결합하여 APC/C를 억제하는데 중요한 것으로 알려진 BubR1이다. 그러나 이러한 BubR1 단백질의 정확한 APC/C 조절기작 및 이를 특이적으로 인식하는 물질에 대하여는 알려진 바가 없다. 특히, 인간 아세틸 BubR1 단백질을 검출할 수 있는 물질은 전혀 알려진 바 없다.
인간 아세틸 BubR1 단백질을 인지할 수 있는 물질의 개발이 요구된다.
일 예는 아세틸화된 사람 BubR1을 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사람 BubR1의 아세틸화 부위에서의 아세틸화를 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 한다. 예컨대, 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 사람 BubR1 (예컨대, 서열번호 15) 중에서, 아세틸화된 250번째 아미노산 잔기 K(Lys) 또는 상기 아세틸화된 250번째 아미노산 잔기 K (Lys)을 포함하는 연속하는 2 내지 30개, 2 내지 25개, 2 내지 20개, 5 내지 30개, 5 내지 25개, 5 내지 20개, 10 내지 30개, 10 내지 25개, 또는 10 내지 20개의 아미노산 부위 (예컨대, 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 2 내의 서열번호 1을 포함하는 연속하는 14 내지 20개 아미노산을 포함하는 아미노산 부위)를 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 것을 특징으로 한다.
상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 3 (GFSLSTRYS)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 4 (IDTGSGSK)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및 서열번호 5 (ERNGSM) 또는 서열번호 24 (ERSGSM)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 (Complementarity Determining　Regions; CDRs) 또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 6 (QSVYNNNE)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 7 (PPAT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및 서열번호 8 (AGGYSGNIWA)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 아세틸화된 사람 BubR1에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.
다른 예는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 예는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 BubR1의 아세틸화도 측정, 세포분열 체크포인트의 활성도 측정, 세포분열 이상과 관련된 질병의 진단 등에 사용하기 위한 용도 (조성물, 키트, 및/또는 방법)를 제공한다.
본 명세서에서는 아세틸화된 사람 BubR1을 특이적으로 인지하는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 및 이의 용도가 제공된다. 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체는 아세틸화된 사람 BubR1와 아세틸화 부위를 인지하여 상기 부위가 아세틸화된 사람 BubR1에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
BubR1 (mitotic checkpoint protein kinase BUB1B)은 방추체 체크포인트 및 염색체 분리에 수반되는 키나아제로서, 세포분열 체크포인트의 중요한 인자 중 하나이며, anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C)의 억제, 세포분열 후기 진입 지연, 및 적절한 염색체 분리에 중요한 역할을 한다.
본 명세서에서 제공되는 항체의 항원으로 작용하는 사람 BubR1은 GenBank Accession No. AAD11941.1 (서열번호 15), NP_001202.4 (암호화 mRNA: NM_001211.5)) 등의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 　 "아세틸화된 사람 BubR1"은 하나 이상의 아세틸화 부위에서 아세틸화된 사람 BubR1 단백질을 의미하는 것으로, 예컨대, 사람 BubR1 단백질 (예컨대, 서열번호 15) 중에서, 250번째 아미노산 잔기 K(Lys)가 아세틸화된 사람 BubR1 단백질을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "항체"라 함은, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 총칭하는 것으로서, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지거나, 합성적 또는 재조합적으로 생성될 수 있고, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 항체는 비자연적으로 생성된 것, 예컨대, 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체 (마우스를 항원으로 면역화시켜 얻어진 항체), 토끼 항체 (토끼를 항원으로 면역화시켜 얻어진 항체, 등), 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단일클론 항체일 수 있다.
또한 본 명세서에서 항체는, 특별한 언급이 없는 한, 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편도 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 "상보성　결정부위 (Complementarity-determining regions, CDR)"는 항체의 가변 부위 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. 앞서 설명한 항체의 항원 결합 단편은 전장 항체 중 상기 상보성 결정부위를 하나 이상 포함하는 단편일 수 있다.
본 발명의 일 예는 아세틸화된 사람 BubR1을 특이적으로 인식 또는 아세틸화된 사람 BubR1에 특이적으로 결합하는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 사람 BubR1 (예컨대, 서열번호 15) 중에서, 아세틸화된 250번째 아미노산 잔기 K (Lys) 또는 상기 아세틸화된 250번째 아미노산 잔기 K(Lys)을 포함하는 연속하는 2 내지 30개, 2 내지 25개, 2 내지 20개, 5 내지 30개, 5 내지 25개, 5 내지 20개, 10 내지 30개, 10 내지 25개, 또는 10 내지 20개의 아미노산 부위 (예컨대, 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 2 내의 서열번호 1을 포함하는 연속하는 14 내지 20개 아미노산을 포함하는 아미노산 부위)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 중쇄(Heavy chain)의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)로서, 서열번호 3 (GFSLSTRYS)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 4 (IDTGSGSK)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및 서열번호 5 (ERNGSM) 또는 서열번호 24 (ERSGSM)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 경쇄(Light chain)의 상보성 결정 부위로서, 서열번호 6 (QSVYNNNE)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 7 (PPAT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및 서열번호 8 (AGGYSGNIWA)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함할 수 있다.
따라서, 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 3 (GFSLSTRYS)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 4 (IDTGSGSK)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및 서열번호 5 (ERNGSM) 또는 서열번호 24 (ERSGSM)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 (Complementarity Determining　Regions; CDRs) 또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 6 (QSVYNNNE)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 7 (PPAT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및 서열번호 8 (AGGYSGNIWA)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
동물 유래 항체는 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체, 토끼 항체 등), 키메릭 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체, 토끼-인간 키메릭 항체) 또는 인간화 항체일 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변영역은 중쇄 불변영역과 경쇄 불변영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 명세서에서 제공되는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 면역글로불린 (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 등), IgM, IgA, IgD, 또는 IgE)을 기본 골격으로 하는 것일 수 있다. 즉, 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 앞서 설명한 CDR들 또는 중쇄/경쇄 가변영역을 제외한 부위는 면역글로불린 (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 등), IgM, IgA, IgD, 또는 IgE) 및/또는 카파(κ) 및 람다(λ) 불변영역 유래의 것일 수 있다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
"항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조 중 일부 (단편)으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 항체의 scFv (single-chain Fv), (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
"힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
다른 예는 아세틸화된 사람 BubR1에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 일 예에서, 상기 하이브리도마는 hAcBubR1-SNU130-11 (수탁번호: KCLRF-BP-00409)일 수 있다.
다른 예는 상기 하이브리도마 hAcBubR1-SNU130-11 (수탁번호: KCLRF-BP-00409)에서 생산되는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 단클론 항체를 제공한다.
다른 예는 상기 하이브리도마가 생산하는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 단클론 항체의 중쇄 상보성결정부위 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 또는 이들의 조합), 경쇄 상보성결정부위 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, 또는 이들의 조합), 또는 이들의 조합; 또는 상기 하이브리도마가 생산하는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 단클론 항체의 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다. 이 때, 상기 상보성결정부위는 통상적인 모든 방법에 의하여 결정될 수 있으며, 예컨대, IMGT definition (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/) 또는 Cabat definition (http://www.bioinf.org.uk/abs/)에 의하여 결정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아세틸화된 사람 BubR1에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 아세틸화된 사람 BubR1를 검출 또는 확인하거나, 사람 BubR1의 아세틸화 정도를 측정하거나, 사람 BubR1의 아세틸화와 관련된 증상 및/또는 질병을 진단하거나, 상기 증상 및/또는 질병의 치료제의 스크리닝에 사용될 수 있다.
이에, 다른 예는 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 아세틸화된 사람 BubR1의 검출용 조성물 또는 키트 또는 사람 BubR1의 아세틸화 정도 측정용 조성물 또는 키트를 제공한다. 다른 예는 생물 시료에 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부 또는 정도를 확인 또는 측정하는 단계를 포함하는, 아세틸화된 사람 BubR1의 검출 방법 또는 사람 BubR1의 아세틸화 정도 측정 방법을 제공한다. 상기 검출 방법에서, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우, 상기 생물 시료에 아세틸화된 사람 BubR1이 존재하는 것으로 판단(결정)할 수 있으며, 항원-항체 반응 정도에 따라서 (비례하여) 사람 BubR1의 아세틸화 정도를 판단(결정)할 수 있다. 따라서, 상기 아세틸화된 사람 BubR1의 검출 방법 또는 사람 BubR1의 아세틸화 정도 측정 방법은 상기 확인 또는 측정하는 단계 이후에, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우, 상기 생물 시료에 아세틸화된 사람 BubR1이 존재하는 것으로 결정하는 단계 또는 항원-항체 반응 정도에 따라서 사람 BubR1의 아세틸화 정도를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 측정 대상인 아세틸화된 사람 BubR1는 세포 내에 존재하는 (endogenous) 것일 수 있다.
사람 BubR1의 아세틸화 여부 또는 정도는 세포분열 체크포인트 중 하나인 BubR1의 활성화 여부 또는 정도를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 세포분열 체크포인트 중 하나인 BubR1의 활성화는 세포분열의 활성화를 의미할 수 있다. 따라서, 상기 조성물 또는 방법은 세포분열 확인에 적용될 수 있다.
다른 예는 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포분열 확인용 조성물 또는 키트 또는 세포분열 이상과 관련된 질병의 진단용 조성물 또는 키트를 제공한다.
다른 예는 (1) 생물 시료 (시험 시료)에 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 (2) 항원-항체 반응을 확인 또는 측정하는 단계를 포함하는, 세포분열 확인 (또는 모니터링) 방법 (또는 세포 분열 확인에 정보를 제공하는 방법) 또는 세포분열 이상과 관련된 질병의 진단 방법 (또는 세포분열 이상과 관련된 질병의 진단에 정보를 제공하는 방법)을 제공한다. 상기 확인 또는 진단 방법은, 상기 확인 또는 측정하는 단계 (단계 (2)) 이후에, (3) 상기 생물 시료 (시험 시료)에서 확인 또는 측정된 항원-항체 반응 정도 (수준)을 기준 시료에서의 항원-항체 반응 정도 (수준)과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이를 위하여, 상기 확인 또는 진단 방법은, 상기 비교하는 단계 (단계 (3)) 이전에, (1') 기준 시료에 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 (2') 항원-항체 반응을 확인 또는 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 기준 시료에서의 항원-항체 반응 확인 또는 측정하는 단계 (단계 (1') 및 (2'))는 상기 시험 시료에서의 항원-항체 반응 확인 또는 측정하는 단계 (단계 (1) 및 (2))와 동시에 수행되거나, 순서에 상관없이 이시적으로 수행될 수 있다.
상기 세포분열 확인은 세포분열의 정도 또는 이상 여부 (비정상적 촉진 또는 비정상적인 억제)를 확인하는 것일 수 있다. 상기 확인 방법에서, 상기 생물 시료 (시험 시료)에서 측정된 항원-항체 반응 정도가 기준 시료보다 높은 경우, 상기 기준 시료 또는 기준 시료가 유래한 환자와 비교하여, 상기 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래한 환자에서의 세포분열이 촉진 (활성화)되어 있는 것으로 판단(또는 결정)하거나, 및/또는 상기 생물 시료 (시험 시료)에서 측정된 항원-항체 반응 정도가 기준 시료보다 낮은 경우, 상기 기준 시료 또는 기준 시료가 유래한 환자와 비교하여, 상기 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래한 환자에서의 세포분열이 억제 (불활성화)되어 있는 것으로 판단(또는 결정)할 수 있다. 따라서, 상기 확인 방법은, 상기 비교하는 단계 (단계 (3)) 이후에, (4) 상기 생물 시료 (시험 시료)에서 측정된 항원-항체 반응 정도가 기준 시료보다 높은 경우, 상기 기준 시료 또는 기준 시료가 유래한 환자와 비교하여, 상기 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래한 환자에서의 세포분열이 촉진 (활성화)되어 있는 것으로 판단(또는 결정)하거나, 및/또는 상기 생물 시료 (시험 시료)에서 측정된 항원-항체 반응 정도가 기준 시료보다 낮은 경우, 상기 기준 시료 또는 기준 시료가 유래한 환자와 비교하여, 상기 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래한 환자에서의 세포분열이 억제 (불활성화)되어 있는 것으로 판단(또는 결정)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 기준 시료는 세포분열이 정상인 (즉, 세포 분열의 비정상적 촉진 또는 비정상적인 억제가 없는) 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 시험 시료와 동일 또는 유사한 종류 세포일 수 있다.
상기 세포분열 이상과 관련된 질병은 비정상적인 (과다한) 세포분열 촉진 또는 비정상적인 세포 분열 억제와 관련된 모든 질병일 수 있다. 일 예에서, 상기 세포분열 이상과 관련된 질병은 암, 뇌질환 (예컨대, 소두증(microcephaly) 등), 노화, 불임 등에서 선택된 것일 수 있다. 상기 암은 유방암, 췌장암, 위암, 대장암, 방광암 등에서 선택된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포분열 이상과 관련된 질병의 진단 방법에서, 상기 생물 시료 (시험 시료)에서 측정된 항원-항체 반응 정도가 정상 기준 시료보다 높거나 질병 기준 시료와 동등 이상인 경우, 상기 기준 시료 또는 기준 시료가 유래한 환자는 세포분열 이상과 관련된 질병을 갖거나 상기 질병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판단(또는 결정)할 수 있다. 따라서, 상기 확인 방법은, 상기 비교하는 단계 (단계 (3)) 이후에, (4) 상기 생물 시료 (시험 시료)에서 측정된 항원-항체 반응 정도가 정상 기준 시료보다 높거나 질병 기준 시료와 동등 이상인 경우, 상기 기준 시료 또는 기준 시료가 유래한 환자는 세포분열 이상과 관련된 질병을 갖거나 상기 질병에 걸릴 위험이 높은 것으로 판단(또는 결정)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정상 기준 시료는 세포분열 이상과 관련된 질병을 갖지 않는 세포 또는 세포분열 이상과 관련된 질병 갖지 않는 환자로부터 유래한 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 시험 시료와 동일 또는 유사한 종류 세포일 수 있다. 상기 질병 기준 시료는 세포분열 이상과 관련된 질병을 갖는 세포 또는 세포분열 이상과 관련된 질병을 갖는 환자로부터 유래한 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 시험 시료와 동일 또는 유사한 종류 세포일 수 있다.
상기 생물 시료는 포유류, 예컨대 인간으로부터 얻은 (분리된) 세포, 조직, 체액, 이들의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Immunofluorescence assay; IFA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 마이크로어레이 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 앞서 설명한 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다. 상기 폴리펩타이드 분자는 항체의 전구체로서 항체 제작에 사용될 수 있을 뿐 아니라 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체 (protein scaffold; 예컨대, 펩티바디, 나노바디, 등), 이중 특이 항체, 및/또는 다중 특이 항체의 구성 성분으로 포함될 수 있다.
다른 예는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pDH10B, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 LT 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 핵산 분자는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 항체의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 배양하는 단계, 및 임의로 배양 배지로부터 항체를 분리 및/또는 정제하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 단일클론항체는 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 특이성과 반응성이 매우 우수하여, BubR1에 대한 아세틸화 정도 측정, 세포분열 이상 또는 이와 관련된 질병의 진단 등에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 사람 BubR1 단백질의 모식도이다.
도 2는 노코다졸(nocodazole)을 처리한 HeLa 세포(Noc)와 처리하지 않은 HeLa 세포(Asn)에 대하여 실시예 1에서 제조된 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 단일클론항체(#130-11) 또는 BubR1 항체 (BD, 대조항체)를 이용하여 웨스텐블랏(western blot)을 수행한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 3은 사람 BubR1이 과발현된 293FT 세포에 대하여 실시예 1에서 제조된 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 단일클론항체 (#130-11)를 이용하여 웨스턴블랏을 수행한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 4는 노코다졸(nocodazole)을 처리한 293FT 세포(Noc)와 처리하지 않은 293FT 세포(Asn)에 대하여 실시예 1에서 제조된 아세틸화된 사람 BubR1에 대한 단일클론항체 (#130-11)를 이용하여 웨스텐블랏(western blot)을 수행한 결과 다클론항체의 결과와 비교하여 보여주는 전기영동 사진이다.
도 5는 Ac-hBubR1#130-11단일클론항체의 중쇄 아미노산 서열 alignment 결과를 보여준다.
도 6은 Ac-hBubR1#130-11단일클론항체의 경쇄 아미노산 서열 alignment 결과를 보여준다.
도 7은 하이브리도마 세포 집락 및 이로부터 선정된 단일클론 하이브리도마 배양액에 대한 웨스턴블랏 결과를 보여준다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1: 아세틸화된 인간 BubR1에 특이적으로 결합하는 항체의 제조
아세틸화된 사람 BubR1 (AAD11941.1의 250번째 아미노산 잔기 K가 아세틸화됨)에 특이적으로 결합하는 항체는 하기의 표 1의 정보와 서열을 이용하여 제조되었다. 효율적인 항체의 제조를 위하여 라이신(K) 잔기가 중간에 위치하도록 좌우의 서열을 선택하여 하기 항체 제작을 위한 타켓 펩타이드 (서열번호 1)를 선정하였다 (표 1).
Homo sapiens BubR1 단편 아미노산 서열 (N'→C')
인간 BubR1 250번째 아미노산 잔기 (라이신; K) 주변 서열 (AAD11941.1의 aa 241-260) PIIRVGGALKAPSQNRGLQN (서열번호 2)
항체 제작 타겟 펩타이드 cRVGGAL-(Ac)K-APSQNRG (서열번호 1)
(Homo sapiens BubR1: GenBank Accession No. AAD11941.1 (서열번호 15)(도 1 참조);R: Arginine; V: Valine; G:Glycine; A:Alanine; L:Leucine; K:Lysine; A: Alanine ; P:Proline; S:Serine; Q:Glutamine; N: Asparagine; K: 아세틸레이션 부위)
상기 서열번호 1의 타겟 펩타이드를 사용하여 다음의 방법으로 단일클론항체 생산을 위한 하이브리도마를 제작하였다:
우선, 토끼에 항원으로서 상기 서열번호 1의 타겟 펩타이드를 주사하여 면역화시켰다. 상기 면역화된 토끼의 비장을 적출하고, 세포 부유액을 만들었다. 상기 비장 세포 부유액에는 면역화된 토끼의 타겟 펩타이드에 대한 항체생산세포 (lymphocyte, B cells)가 포함되어 있다. 상기 비장 세포 부유액에 포함된 항체생산세포의 사멸을 막기 위하여, 상기 비장 세포와 골수종세포 (myeloma, 240E-W2, Abcam®)를 2:1의 비율로 PEG 4000 at (Sigma P7181)를 사용하여 융합시켜 불멸화시켰다. 상기 불멸화시킨 세포들을 96-웰 플레이트(96-well plate)에 분주하고 37℃, 5% CO2가 공급되는 배양기에서 2주 동안 배양하였다. 그 후, 배양 상청액을 취하여 ELASA 실험을 수행하여, 면역활성이 있는 것으로 확인된 mutiple cell types 또는 multiclones 상태의 하이브리도마 세포 집락을 수득하였다.
상기 수득한 하이브리도마 집락 세포 중 in vitro acetylation 실험을 통하여 아세틸화된 사람 BubR1만을 특이적으로 인식하는 하이브리도마 세포를 선정하였다. 상기 시험에 사용하기 위하여 GST-tagged human BubR1 (서열번호 15의 57-574 아미노산) 재조합 단백질을 제작하였다. 상기 GST- tagged human BubR1 (57-574 아미노산) 재조합 단백질에 Acetyl-CoA를 첨가한 후 두 그룹으로 나누어, 두 그룹 중 한 그룹은 GST-P/CAF HAT domain을 더하고, 다른 그룹은 배제한 후, 모두 30℃서 1시간 동안 반응시켜 각 'GST- tagged human BubR1 (57-574 아미노산) 재조합 단백질을 아세틸화한 그룹(Ac)'과 'GST- tagged human BubR1 (57-574 아미노산) 재조합 단백질을 아세틸화하지 않은 그룹 (NonAcetylated; NAc)'을 제조하였다. 상기 두 그룹에 하이브리도마세포 배양액을 웨스턴블랏을 실시하였다 (도 7 참조).
웨스턴블랏 실시 결과 (도 7 참조), 상기 수득한 하이브리도마 세포 집락 중 hAcBubR1-130로 명명된 집락이 250번째 잔기가 아세틸화된 라이신 잔기를 포함하는 BubR1을 특이적으로 인식하는 항체로서의 우수성을 보이는 하이브리도마 세포 집락으로 선정되었다. 이후 hAcBubR1-130 하이브리도마 세포 집락으로부터 아세틸화된 사람 BubR1만을 높은 특이적으로 인식하는 130-11 단일클론 하이브리도마를 선정하여 hAcBubR1-SNU130-11라고 명명하였다.
상기와 같이 선정된 아세틸화된 사람 BubR1에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 세포주(hAcBubR1-SNU130-11)를 2017년 9월 6일자로 대한민국 서울시 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주연구재단 (Korean Cell Line Research Foundation; KCLRF)에 기탁하여, accession number KCLRF-BP-00409을 부여 받았다.
상기 하이브리도마 hAcBubR1-SNU130-11를 RPMI 1640 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기 세포주 배양액을 제균여과하여, 아세틸화된 인간 BubR1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 회수하였다. 상기와 같이 제조된 아세틸화된 사람 BubR1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 Ac-hBubR1#130-11라고 명명하였다.
상기 하이브리도마 hAcBubR1-SNU130-11로부터 mRNA를 추출하여 얻어진 cDNA의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 분석(Fusion Antibodies Plc.에 의뢰하여 수행함)하여 그 결과를 도 5 (중쇄가변영역) 및 도 6 (경쇄가변영역)에 나타내고, 이 중에서 선정된 항체 서열을 표 2에 정리하였다:
중쇄가변영역
아미노산 서열 (N'→C') 핵산 서열 (5'→3')
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGDLVKPGASLTLTCTAS GFSLSTRYS LYWVRQAPGKGLEWIGY IDTGSGSK SYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTPADTATYFC ERNGSM WGPGTLVTVSSASTKGPS (서열번호 11) (밑줄: 중쇄가변영역 (서열번호 9); 굵은체: N'→C' 방향으로 순서대로 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3) ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCAGATACTCGTTGTATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATATATTGATACTGGGAGTGGTAGTAAATCCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTGACTCTACAAATGACCAGTCTGACACCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGAGAGAAATGGGAGTATGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCG (서열번호 13)
경쇄가변영역
아미노산 서열 (N'→C') 핵산 서열 (5'→3')
MRAPTQLLGLLLLWLPGAICDPVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQAS QSVYNNNE LAWFQQKPGQPPKLLIY PPAT TLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISDLECDDAAAYYC AGGYSGNIWA FGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVC (서열번호 12) (밑줄: 경쇄가변영역 (서열번호 10); 굵은체: N'→C' 방향으로 순서대로 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3) ATGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCATATGTGACCCTGTGCTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAATAATAACGAATTAGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAACTCCTGATCTATCCGCCAGCCACCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGACTTGGAGTGTGACGATGCTGCCGCTTACTATTGTGCAGGCGGTTATAGTGGTAATATTTGGGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGT (서열번호 14)
(CDR은 IMGT numbering system (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999))을 참조하여 결정함;상기 표에 제시된 전체 서열은 서열 분석시 사용된 프라이머 부위의 코딩 아미노산 서열을 가변영역의 양 말단에 포함하는 형태임)
실시예 2: 단일클론항체의 아세틸화된 인간 BubR1와의 결합 시험 ( HeLa 세포)
HeLa 세포 (ATCC, CCL-2?)에 노코다졸 (nocodazole, 200ng/ml)을 처리한 후, 신크로나이즈(synchronize) 시키고 세포배양용기를 부드럽게 쳐서 중기의 세포를 떼어내었다 (mitotic shake off; 'Noc'로 표시). 대조군으로 노코다졸을 처리하지 않은 세포('Asn'로 표시)를 사용하였다. 이어서, 상기 떼어낸 세포에 ETN buffer [150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8.0), 0.5% NP-40]를 처리하여 세포 추출물을 준비하고, 항-BubR1 항체 (BD Biosciences)를 처리하여 면역침강 실험 (IP)을 수행한 후, 상기 실시예 1에서 준비된 토끼 면역성 사람 아세틸 BubR1 단일클론항체 Ac-hBubR1#130-11 (하이브리도마 hAcBubR1-SNU130-11의 배양 상청액)와 BubR1 항체(BD Biosciences; 대조항체)를 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였다.
상기 얻어진 웨스턴블랏 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 나타난 바와 같이, 아세틸화된 사람 BubR1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 Ac-hBubR1#130-11는 아세틸화된 사람 BubR1 단백질 (화살표로 표시)에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
실시예 3: 단일클론항체의 아세틸화된 인간 BubR1와의 결합 시험 ( BubR1 과발현 293FT 세포)
293FT 세포 (Thermo Fisher scinctific, R7007)에 Myc-tagged human BubR1 [Myc tagged-BubR1 WT (야생형 BubR1), Myc tagged-BubR1 K250Q (BubR1 acetylation 모사: 서열번호 15의 250번째 아미노산 잔기인 K를 Q로 치환), 및 Myc tagged-BubR1 K250R (BubR1 acetylation 저해: 서열번호 15의 250번째 아미노산 잔기인 K를 R로 치환)]의 암호화 유전자를 각각 pDH10B(Thermo Fisher scinctific, 18297010)에 클로닝하여 얻어진 재조합 플라즈미드를 각각 트랜스펙션하여 BubR1 과발현 사람 세포를 준비하였다 (Myc tag: 3xMyc (3x(N-EQKLISEEDL-C)).
Human BubR1이 아세틸화되는 시점을 정확하게 알아내기 위하여 상기 세포에 노코다졸 (nocodazole, 200ng/ml)을 처리 한 후, 신크로나이즈(synchronize) 시키고 세포배양용기를 부드럽게 쳐서 중기의 세포를 떼어내었다 (mitotic shake off). 이어서, 상기 떼어낸 세포에 NETN buffer [150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8.0), 0.5% NP-40]를 처리하여 세포 추출물을 준비하고, 항-9E10 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc., c-Myc (9E10); sc-40)를 처리하여 면역침강 실험 (IP)을 수행한 후, 상기 실시예 1에서 준비된 토끼 면역성 사람 아세틸 BubR1 단일클론항체 Ac-hBubR1#130-11 (하이브리도마 hAcBubR1-SNU130-11의 배양 상청액)를 사용하여 웨스턴블랏을 수행하였다.
상기 얻어진 웨스턴블랏 결과를 도 3에 나타내었다. 도 에 나타난 바와 같이, 대조항체로 사용된 항-BubR1 항체 (BD Biosciences)와 비교하여, 아세틸화된 사람 BubR1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 Ac-hBubR1#130-11는 아세틸화된 사람 BubR1 단백질 과발현 세포에서 아세틸화된 사람 BubR1 단백질 (화살표로 표시)에 보다 특이적으로 결합함을 확인하였다.
실시예 4: 단일클론항체와 다클론항체의 아세틸화된 인간 BubR1와의 결합 비교
293FT 세포에 human BubR1 [BubR1 WT (야생형: 서열번호 15); BubR1 K250Q (BubR1 acetylation모사: 서열번호 15의 250번째 아미노산 잔기인 K를 Q로 치환); BubR1 K250R (BubR1 acetylation 저해: 서열번호 15의 250번째 아미노산 잔기인 K를 R로 치환)의 암호화 유전자를 각각 pDH10B(Thermo Fisher scinctific, 18297010)에 클로닝하여 얻어진 재조합 플라즈미드를 트랜스펙션하였다.
Human BubR1이 아세틸화되는 시점을 정확하게 알아내기 위하여 상기 세포에 노코다졸 (nocodazole, 200ng/ml)을 처리 한 후, 신크로나이즈(synchronize) 시키고 세포배양용기를 부드럽게 쳐서 중기의 세포를 떼어내었다 (mitotic shake off). 이어서, 상기 떼어낸 세포에 NETN buffer [150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8.0), 0.5% NP-40]를 처리하여 세포 추출물을 준비하고, 여기에 상기 실시예 1에서 수득한 단일클론항체 Ac-hBubR1#130-11를 첨가하여 웨스턴블랏 실험을 수행하였다. 비교를 위하여, 인간 아세틸 BubR1 단백질에 대한 다클론항체 (Choi E, Choe H, Min J, Choi JY, Kim J & Lee H, (2009) BubR1 acetylation at prometaphase is required for modulating APC/C activity and timing of mitosis. EMBO J 28, 2077-2089 참조하여 제작; 약술하면, K250이 아세틸화된 합성 펩타이드 (-CGGAL(AcK)APSQ-C (Peptron, Korea); 사람 BubR1의 aa 245-254에 해당)를 래빗에 주입하고, Anti-Ac-K250 antiserum을 수집하여 준비함)를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.
상기 얻어진 웨스턴블랏 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, Ac-hBubR1 다클론항체는 인간 아세틸 BubR1단백질에 매우 약하게 결합하는 반면, Ac-hBubR1#130-11 단일클론항체는 인간 아세틸 BubR1 단백질에 높은 특이성 및 결합력으로 결합하는 것을 확인할 수 있다.
상기 단일클론항체 Ac-hBubR1#130-11 및 hAcBubR1 다클론항체 (대조항체)의 아세틸화된 사람 BubR1 단백질에 대한 특이적 결합력을 Multi Gauge V3.0 software(Fuji photo film Co, Ltd. Japan)를 이용하여 제조자 매뉴얼에 따라서 측정하여 (신호 강도의 비율로 측정함), 그 결과를 표 3 (Ac-hBubR1#130-11 단일클론 항체의 결과) 및 표 4 (다클론항체의 BubR1-WT의 결과를 1.00로 한 단일클론항체 및 다클론항체의 결과) 에 나타내었다:
Figure 112018057076301-pat00001
hAcBubR1 단일클론항체 Ac-hBubR1#130-11 hAcBubR1 다클론항체
BubR1-WT BubR1-250Q BubR1-R BubR1-WT BubR1-250Q BubR1-R
2.47 104.76 1.15 1.00 2.50 0.65
표 3 및 4에서 확인되는 바와 같이, 단일클론항체 Ac-hBubR1#130-11는, (1) BubR1-WT 및 BubR1-250R (아세틸화 억제)와 비교하여, BubR1-250Q (아세틸화 모사)에 대하여 현저하게 우수한 결합력 (BubR1-WT 대비 약 43.6배, BubR1-250R 대비 약 87.2배)을 나타내었으며,
(2) 대조항체(hAcBubR1 다클론항체)와 비교하여, BubR1-WT에 대하여 약 2.47배, BubR1-250Q (아세틸화 모사)에 대하여 약 41.9배 높은 결합력을 나타내었다.
이러한 결과는 단일클론항체 Ac-hBubR1#130-11가 아세틸화된 인간 BubR1에 매우 높은 특이성 및 결합력으로 결합함을 보여준다.
한국세포주연구재단 KCLRF000409 20170906
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Antibody Specifically Binding to Acetylated Human BubR1 and Use thereof <130> DPP20181181KR <150> KR 10-2017-0072526 <151> 2017-06-09 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide for anti-acetylated hBubR1 antibody, wherein the 7th amino acid residue, K, is a acetylation site <400> 1 Arg Val Gly Gly Ala Leu Lys Ala Pro Ser Gln Asn Arg Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen fragment <400> 2 Pro Ile Ile Arg Val Gly Gly Ala Leu Lys Ala Pro Ser Gln Asn Arg 1 5 10 15 Gly Leu Gln Asn 20 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 3 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 4 Ile Asp Thr Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 5 Glu Arg Asn Gly Ser Met 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 6 Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Glu 1 5 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 7 Pro Pro Ala Thr 1 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 <400> 8 Ala Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Trp Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 9 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Arg Tyr 20 25 30 Ser Leu Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Thr Gly Ser Gly Ser Lys Ser Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Glu 85 90 95 Arg Asn Gly Ser Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 10 Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Glu Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Pro Pro Ala Thr Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp 65 70 75 80 Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser 85 90 95 Gly Asn Ile Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region-containing heavy chain fragment <400> 11 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser 35 40 45 Thr Arg Tyr Ser Leu Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Thr Gly Ser Gly Ser Lys Ser Tyr Ala 65 70 75 80 Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr 85 90 95 Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Phe Cys Glu Arg Asn Gly Ser Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 <210> 12 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region-containing light chain fragment <400> 12 Met Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Cys Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser 20 25 30 Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Tyr Asn Asn Asn Glu Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 50 55 60 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Pro Pro Ala Thr Thr Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110 Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val 115 120 125 Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys 145 150 155 <210> 13 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding variable region-containing heavy chain fragment <400> 13 atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60 tcgttggagg agtccggggg agacctggtc aagcctgggg catccctgac actcacctgc 120 acagcctctg gattctccct cagtaccaga tactcgttgt attgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtggat cggatatatt gatactggga gtggtagtaa atcctacgcg 240 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc aagacctcgt cgaccacggt gactctacaa 300 atgaccagtc tgacacccgc ggacacggcc acctatttct gtgagagaaa tgggagtatg 360 tggggcccag gcaccctggt caccgtctct tcagcctcca ccaagggccc atcg 414 <210> 14 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding variable region-containing light chain fragment <400> 14 atgagggccc ccactcagct gctggggctc ctgctgctct ggctcccagg tgccatatgt 60 gaccctgtgc tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 120 atcaattgcc aggccagtca gagtgtttat aataataacg aattagcctg gtttcagcag 180 aaaccagggc agcctcccaa actcctgatc tatccgccag ccaccactct ggcatctggg 240 gtcccatcgc ggttcagcgg cagtggatct gggacacagt tcactctcac catcagtgac 300 ttggagtgtg acgatgctgc cgcttactat tgtgcaggcg gttatagtgg taatatttgg 360 gctttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaaggtgatc cagttgcacc tactgtcctc 420 atcttcccac cagctgctga tcaggtggca actggaacag tcaccatcgt gtgt 474 <210> 15 <211> 1050 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human BubR1 (AAD11941.1) <400> 15 Met Ala Ala Val Lys Lys Glu Gly Gly Ala Leu Ser Glu Ala Met Ser 1 5 10 15 Leu Glu Gly Asp Glu Trp Glu Leu Ser Lys Glu Asn Val Gln Pro Leu 20 25 30 Arg Gln Gly Arg Ile Met Ser Thr Leu Gln Gly Ala Leu Ala Gln Glu 35 40 45 Ser Ala Cys Asn Asn Thr Leu Gln Gln Gln Lys Arg Ala Phe Glu Tyr 50 55 60 Glu Ile Arg Phe Tyr Thr Gly Asn Asp Pro Leu Asp Val Trp Asp Arg 65 70 75 80 Tyr Ile Ser Trp Thr Glu Gln Asn Tyr Pro Gln Gly Gly Lys Glu Ser 85 90 95 Asn Met Ser Thr Leu Leu Glu Arg Ala Val Glu Ala Leu Gln Gly Glu 100 105 110 Lys Arg Tyr Tyr Ser Asp Pro Arg Phe Leu Asn Leu Trp Leu Lys Leu 115 120 125 Gly Arg Leu Cys Asn Glu Pro Leu Asp Met Tyr Ser Tyr Leu His Asn 130 135 140 Gln Gly Ile Gly Val Ser Leu Ala Gln Phe Tyr Ile Ser Trp Ala Glu 145 150 155 160 Glu Tyr Glu Ala Arg Glu Asn Phe Arg Lys Ala Asp Ala Ile Phe Gln 165 170 175 Glu Gly Ile Gln Gln Lys Ala Glu Pro Leu Glu Arg Leu Gln Ser Gln 180 185 190 His Arg Gln Phe Gln Ala Arg Val Ser Arg Gln Thr Leu Leu Ala Leu 195 200 205 Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Val Phe Glu Ser Ser Val Pro Gln Arg 210 215 220 Ser Thr Leu Ala Glu Leu Lys Ser Lys Gly Lys Lys Thr Ala Arg Ala 225 230 235 240 Pro Ile Ile Arg Val Gly Gly Ala Leu Lys Ala Pro Ser Gln Asn Arg 245 250 255 Gly Leu Gln Asn Pro Phe Pro Gln Gln Met Gln Asn Asn Ser Arg Ile 260 265 270 Thr Val Phe Asp Glu Asn Ala Asp Glu Ala Ser Thr Ala Glu Leu Ser 275 280 285 Lys Pro Thr Val Gln Pro Trp Ile Ala Pro Pro Met Pro Arg Ala Lys 290 295 300 Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Pro Trp Asn Thr Gly Arg Ser Leu Glu 305 310 315 320 His Arg Pro Arg Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ile Ala Val Pro Ala Val 325 330 335 Leu Pro Ser Phe Thr Pro Tyr Val Glu Glu Thr Ala Arg Gln Pro Val 340 345 350 Met Thr Pro Cys Lys Ile Glu Pro Ser Ile Asn His Ile Leu Ser Thr 355 360 365 Arg Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gly Asp Pro Leu Gln Arg Val Gln Ser 370 375 380 His Gln Gln Ala Ser Glu Glu Lys Lys Glu Lys Met Met Tyr Cys Lys 385 390 395 400 Glu Lys Ile Tyr Ala Gly Val Gly Glu Phe Ser Phe Glu Glu Ile Arg 405 410 415 Ala Glu Val Phe Arg Lys Lys Leu Lys Glu Gln Arg Glu Ala Glu Leu 420 425 430 Leu Thr Ser Ala Glu Lys Arg Ala Glu Met Gln Lys Gln Ile Glu Glu 435 440 445 Met Glu Lys Lys Leu Lys Glu Ile Gln Thr Thr Gln Gln Glu Arg Thr 450 455 460 Gly Asp Gln Gln Glu Glu Thr Met Pro Thr Lys Glu Thr Thr Lys Leu 465 470 475 480 Gln Ile Ala Ser Glu Ser Gln Lys Ile Pro Gly Met Thr Leu Ser Ser 485 490 495 Ser Val Cys Gln Val Asn Cys Cys Ala Arg Glu Thr Ser Leu Ala Glu 500 505 510 Asn Ile Trp Gln Glu Gln Pro His Ser Lys Gly Pro Ser Val Pro Phe 515 520 525 Ser Ile Phe Asp Glu Phe Leu Leu Ser Glu Lys Lys Asn Lys Ser Pro 530 535 540 Pro Ala Asp Pro Pro Arg Val Leu Ala Gln Arg Arg Pro Leu Ala Val 545 550 555 560 Leu Lys Thr Ser Glu Ser Ile Thr Ser Asn Glu Asp Val Ser Pro Asp 565 570 575 Val Cys Asp Glu Phe Thr Gly Ile Glu Pro Leu Ser Glu Asp Ala Ile 580 585 590 Ile Thr Gly Phe Arg Asn Val Thr Ile Cys Pro Asn Pro Glu Asp Thr 595 600 605 Cys Asp Phe Ala Arg Ala Ala Arg Phe Val Ser Thr Pro Phe His Glu 610 615 620 Ile Met Ser Leu Lys Asp Leu Pro Ser Asp Pro Glu Arg Leu Leu Pro 625 630 635 640 Glu Glu Asp Leu Asp Val Lys Thr Ser Glu Asp Gln Gln Thr Ala Cys 645 650 655 Gly Thr Ile Tyr Ser Gln Thr Leu Ser Ile Lys Lys Leu Ser Pro Ile 660 665 670 Ile Glu Asp Ser Arg Glu Ala Thr His Ser Ser Gly Phe Ser Gly Ser 675 680 685 Ser Ala Ser Val Ala Ser Thr Ser Ser Ile Lys Cys Leu Gln Ile Pro 690 695 700 Glu Lys Leu Glu Leu Thr Asn Glu Thr Ser Glu Asn Pro Thr Gln Ser 705 710 715 720 Pro Trp Cys Ser Gln Tyr Arg Arg Gln Leu Leu Lys Ser Leu Pro Glu 725 730 735 Leu Ser Ala Ser Ala Glu Leu Cys Ile Glu Asp Arg Pro Met Pro Lys 740 745 750 Leu Glu Ile Glu Lys Glu Ile Glu Leu Gly Asn Glu Asp Tyr Cys Ile 755 760 765 Lys Arg Glu Tyr Leu Ile Cys Glu Asp Tyr Lys Leu Phe Trp Val Ala 770 775 780 Pro Arg Asn Ser Ala Glu Leu Thr Val Ile Lys Val Ser Ser Gln Pro 785 790 795 800 Val Pro Trp Asp Phe Tyr Ile Asn Leu Lys Leu Lys Glu Arg Leu Asn 805 810 815 Glu Asp Phe Asp His Phe Cys Ser Cys Tyr Gln Tyr Gln Asp Gly Cys 820 825 830 Ile Val Trp His Gln Tyr Ile Asn Cys Phe Thr Leu Gln Asp Leu Leu 835 840 845 Gln His Ser Glu Tyr Ile Thr His Glu Ile Thr Val Leu Ile Ile Tyr 850 855 860 Asn Leu Leu Thr Ile Val Glu Met Leu His Lys Ala Glu Ile Val His 865 870 875 880 Gly Asp Leu Ser Pro Arg Cys Leu Ile Leu Arg Asn Arg Ile His Asp 885 890 895 Pro Tyr Asp Cys Asn Lys Asn Asn Gln Ala Leu Lys Ile Val Asp Phe 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45 Thr Arg Tyr Ser Leu Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Thr Gly Tyr Ile Asp Thr Gly Ser Gly Ser Lys Ser Tyr Ala 65 70 75 80 Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr 85 90 95 Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Phe Cys Glu Arg Asn Gly Ser Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser 130 135 <210> 17 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain fragment <400> 17 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser 35 40 45 Thr Arg Tyr Ser Leu Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Thr Gly Ser Gly Ser Lys Ser Tyr Ala 65 70 75 80 Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr 85 90 95 Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Phe Cys Glu Arg Ser Gly Ser Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Ile Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 <210> 18 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain fragment <400> 18 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser 35 40 45 Thr Arg Tyr Ser Leu Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Thr Gly Ser Gly Ser Lys Ser Tyr Ala 65 70 75 80 Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr 85 90 95 Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Phe Cys Glu Arg Asn Gly Ser Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Ile Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 <210> 19 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain fragment <400> 19 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser 35 40 45 Thr Arg Tyr Ser Leu Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Thr Gly Ser Gly Ser Lys Ser Tyr Ala 65 70 75 80 Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr 85 90 95 Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110 Phe Cys Glu Arg Asn Gly Ser Met Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser 130 135 <210> 20 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain fragment <400> 20 Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Arg Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ile Cys Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala 20 25 30 Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val 35 40 45 Tyr Asn Asn Asn Glu Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Pro Pro Ala Thr Thr Leu Ala Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala Gly 100 105 110 Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val 115 120 125 Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala 130 135 140 Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys 145 150 155 <210> 21 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain fragment <400> 21 Met Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Cys Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser 20 25 30 Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Gly Gln Ser 35 40 45 Val Tyr Asn Asn Asn Glu Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 50 55 60 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Pro Pro Ala Thr Thr Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110 Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val 115 120 125 Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys 145 150 155 <210> 22 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain fragment <400> 22 Met Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Cys Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser 20 25 30 Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Tyr Asn Asn Asn Glu Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 50 55 60 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Pro Pro Ala Thr Thr Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Gly Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110 Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val 115 120 125 Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys 145 150 155 <210> 23 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain fragment <400> 23 Met Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Cys Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser 20 25 30 Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Tyr Asn Asn Asn Glu Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln 50 55 60 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Pro Pro Ala Thr Thr Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110 Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Ile Trp Ala Phe Gly Gly Gly 115 120 125 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of SEQ ID NO: 17 <400> 24 Glu Arg Ser Gly Ser Met 1 5

Claims (18)

  1. 다음의 상보성 결정부위 (complementarity determining region; CDRs)를 포함하는, 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 5 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3,
    서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
    서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
    을 포함하는, 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 기탁번호 KCLRF-BP-00409의 하이브리도마로부터 생산된 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아세틸화된 사람 BubR1는 BubR1의 250번째 아미노산 잔기 K(Lys)이 아세틸화된 것인, 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 또는 인간화 항체인, 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2인, 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 기탁번호 KCLRF-BP-00409인 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 생산을 위한 하이브리도마.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 아세틸화된 사람 BubR1의 검출용 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 사람 BubR1의 아세틸화 측정용 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 세포분열 확인용 조성물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 세포분열 이상과 관련된 질병의 진단용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포분열 이상과 관련된 질병은 암, 소두증, 노화 또는 불임인, 세포분열 이상과 관련된 질병의 진단용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 암은 유방암, 췌장암, 위암, 대장암, 또는 방광암인, 세포분열 이상과 관련된 질병의 진단용 조성물.
  14. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변영역을 암호화하는 핵산 분자.
  15. 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변영역을 암호화하는 핵산 분자.
  16. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변영역을 암호화하는 핵산 분자 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변영역을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  17. 제16항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  18. 제17항의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 아세틸화된 사람 BubR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
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