JP2022538531A - Ｃｔｈｒｃ１に特異的な新規抗体及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＣＴＨＲＣ１に結合する新規な抗体及びその使用に関する。

Description

本発明は、ＣＴＨＲＣ１に結合する新規な抗体及びその使用に関する。
現在、臨床で用いられている抗癌剤は、化学療法剤と生物療法剤に分類される。従来から活発に開発されている化学療法剤は、癌細胞に毒性を示す薬剤であるが、癌細胞のみでなく、正常細胞にも毒性を示し、また耐性をもたらすという問題があるので、開発及び使用に限界がある。よって、最近は、人体の免疫機能を回復又は増加させることにより癌細胞の活動力を低下させる生物療法剤がその代案として活発に開発されている。現在、使用又は開発されている生物療法剤としては、サイトカイン類、モノクローナル抗体（monoclonal antibody）などの組換え抗体、核酸分子治療剤、新生血管形成抑制剤などが挙げられる。
前述した生物療法剤のうち、治療用モノクローナル抗体は、標的に対する反応特異性が高く、副作用が低いことを特徴とする。抗体は、様々な機序により治療効果を発揮するが、当該抗原と特異的に結合してシグナル伝達を阻害したり、交差結合（cross-linking）による細胞死を誘導することができ、また生体内の免疫システムを活性化してその効果を発揮することもできる。よって、抗癌剤としてのモノクローナル抗体は、癌細胞を特異的に追跡し、その活性を抑制するだけでなく、免疫反応を引き起こして癌細胞を効果的に除去することができるので、癌治療の主流として定着している。これに関連して、ラムシルマブ（ramucirumab）、リツキシマブ（rituximab）、トラスツズマブ（trastuzumab）などのモノクローナル抗体が開発されており、胃癌、乳癌、肝癌などの治療に用いられている。
一方、ＣＴＨＲＣ１（Collagen triple helix repeat containing-1）は、血管再形成、骨形成及び発達形態形成に関与する分泌タンパク質として知られている。
最近の研究によれば、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫などの各種癌細胞においてＣＴＨＲＣ１が過剰発現し、癌の増殖や転移に関与することが報告されており、これは、攻撃的な腫瘍（aggressive tumor）においてＣＴＨＲＣ１が重要な役割を果たすことを示唆するものである。また、ＣＴＨＲＣ１は、癌細胞自体の増殖及び転移を誘導するだけでなく、腫瘍微小環境における血管細胞(endothelial cells)を刺激して新生血管生成にも関与することが知られている（非特許文献１）。ヒト腫瘍のｃＤＮＡアレイ分析によりＣＴＨＲＣ１がヒト固形癌（solid tumor）において主に発現することが確認され、トランスクリプトーム解析（transcriptome analysis）により小葉性乳癌（breast lobular carcinoma）と一般の膵管細胞（ductal cell）や小葉細胞（lobular cell）では発現に差異があることが確認された。ＣＴＨＲＣ１は、侵襲性原発性黒色腫（primary melanomas）及び転移性黒色腫（metastatic melanomas）においては発現したが、良性母斑（benign nevi）や非侵襲性試料においては発現しなかった。また、ＣＴＨＲＣ１発現を抑制すると、黒色腫細胞株の遊走が試験管内で減少した。ＣＴＨＲＣ１は、隆起性皮膚線維肉腫（dermatofibrosarcoma protuberans）、頻繁に転移する局部的に攻撃的な新生腫瘍（neoplasms）であることが確認され、皮膚肉腫（dermatosarcomas）、一般的な良性線維性組織球性腫瘍（benign fibrohistiocytic tumor）ではないことが確認された。ＣＴＨＲＣ１発現は、一般組織や前駆体病変（precursor lesions）と比較して、乳癌組織において有意に高く、骨転移（bone metastasis）の危険性に関連していることが報告されている。しかし、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に対する結合力及び親和性を向上させると共に、各種癌診断及び治療に優れた効果を有する抗体の開発が依然として求められている実情である。
Park et al, Carcinogenesis (2013) 34:694, Lee et al, ExpMolMed (2016) 48:e261 Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495 METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9 Ann. Rev.Immunol. 12:433, 1994
難治性癌を含む様々な癌の治療のために、ＣＴＨＲＣ１に特異的に結合する抗体の開発が継続して求められている中で、本発明者らは、高い親和性及び特異性を有する新たな抗体を開発し、前記抗体が様々な癌に抗癌効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明は、ＣＴＨＲＣ１（Collagen triple helix repeat containing-1）タンパク質に特異的に結合する抗体を提供することを目的とする。
また、本発明は、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチド、それを含む発現ベクター、及びそれを含む宿主細胞を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に特異的に結合する抗体を含む検出用組成物及びキットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記抗体を含む、癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記抗体を用いて癌を治療する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記抗体を含む、癌診断又は予後予測用組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記抗体を用いて、癌の疑いのある個体の分離された生物学的試料のＣＴＨＲＣ１タンパク質を抗原抗体反応により検出するステップを含む、癌の診断のための情報の提供方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記抗体を用いて、癌を発症している個体の分離された生物学的試料のＣＴＨＲＣ１タンパク質を抗原抗体反応により検出するステップを含む、癌の予後予測のための情報の提供方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記癌診断又は予後予測用組成物を含む、癌診断又は予後予測用キットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、ＣＴＨＲＣ１抗原抗体複合体を検出するステップを含む、試料内のＣＴＨＲＣ１タンパク質を検出する方法を提供することを目的とする。
本発明の新規な抗体は、微量のＣＴＨＲＣ１を検出することができ、ＣＴＨＲＣ１コンジュゲートワクチンも検出することができるので、ＣＴＨＲＣ１及びＣＴＨＲＣ１コンジュゲートワクチンの定量化に有用である。
ＣＴＨＲＣ１への結合力が高いマウス抗体４Ｈ５及び９Ｅ６に対するＩｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡの結果を示す図である（Sensitivity : 4H5,9E6 >> 1D1 > 6C1）。 マウス抗体４Ｈ５及び９Ｅ６はエピトープが異なることを確認した結果を示す図であり、これは異なるメカニズムにより抗癌作用を引き起こすことを示唆するものである。 ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６はＣＴＨＲＣ１タンパク質への結合力が高いだけでなく、特異的に結合することを確認した結果を示す図である。 ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の膵臓癌遊走（Migration）抑制効果を試験管内（in vitro）で確認した結果を示す図である。 ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の乳癌遊走抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の卵巣癌遊走抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の膀胱癌遊走抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の膵臓癌浸潤（Invasion）抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の患者由来膵臓癌細胞浸潤抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の乳癌浸潤抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の卵巣癌浸潤抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の膀胱癌浸潤抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ４Ｈ５及び９Ｅ６ヒト化候補抗体の生産結果を示す図である。 ４Ｈ５及び９Ｅ６ヒト化候補抗体の結合親和性測定結果を示す図である。 膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１を用いて４Ｈ５及び９Ｅ６ヒト化候補抗体の効能を検証した結果を示す図である。 １次選定した４Ｈ５及び９Ｅ６ヒト化候補抗体の結合親和性を再測定した結果を示す図である。 １次選定した４Ｈ５及び９Ｅ６ヒト化候補抗体の効能を再検証した結果を示す図である。 ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６がＣＴＨＲＣ１タンパク質に特異的に結合することを確認した結果を示す図である。 ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の膵臓癌遊走抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の卵巣癌遊走抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の乳癌遊走抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の膀胱癌、肺癌、黒色腫遊走抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の膵臓癌浸潤抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の卵巣癌浸潤抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の乳癌浸潤抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の膀胱癌、肺癌、黒色腫浸潤抑制効果を試験管内で確認した結果を示す図である。 ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の生体内（in vivo）抗癌効果を確認した結果を示す図である。膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３を用いたモデルにおいて、対照群グループに比べて腫瘍の体積が減少した。
以下、これらを具体的に説明する。なお、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
本明細書全体を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられる。また、本明細書において略語で言及したアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に従って記載したものである。
アラニン Ａｌａ，Ａ
アルギニン Ａｒｇ，Ｒ
アスパラギン Ａｓｎ，Ｎ
アスパラギン酸 Ａｓｐ，Ｄ
システイン Ｃｙｓ，Ｃ
グルタミン酸 Ｇｌｕ，Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ，Ｑ
グリシン Ｇｌｙ，Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ，Ｈ
イソロイシン Ｉｌｅ，Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ，Ｌ
リシン Ｌｙｓ，Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ，Ｍ
フェニルアラニン Ｐｈｅ，Ｆ
プロリン Ｐｒｏ，Ｐ
セリン Ｓｅｒ，Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ，Ｔ
トリプトファン Ｔｒｐ，Ｗ
チロシン Ｔｙｒ，Ｙ
バリン Ｖａｌ，Ｖ
本発明の一態様は、ＣＴＨＲＣ１（Collagen triple helix repeat containing-1）タンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。
本発明における「ＣＴＨＲＣ１（Collagen triple helix repeat containing-1）」は、血管リモデリング（vascular remodeling）、骨形成（bone formation）及び形態形成（morphogenesis）に作用する水溶性タンパク質であり、損傷した動脈において発現し、細胞遊走を促進し、線維芽細胞（fibroblasts）及び平滑筋細胞（smooth muscle cell）においてコラーゲン合成を抑制し、損傷した大動脈をリモデリングする機能を有することが知られている。血管細胞(endothelial cells)におけるＣＴＨＲＣ１の発現は、形質転換増殖因子β（transforming growth factor-β; TGF-β）を調節することにより、コラーゲンを含むＴＧＦ－β標的遺伝子の発現を抑制することが知られている。また、ＣＴＨＲＣ１遺伝子導入マウス（transgenic mice）は、骨芽細胞の骨形成（osteoblastic bone formation）、骨前駆細胞（osteoprogenitor cells）の分化及び無機化（mineralization）を増加させると共に、Ｗｎｔ５ａと相互結合して平面内細胞極性（planar cell polarity）経路を活性化するので、発達過程中の形態形成の調節におけるＣＴＨＲＣ１の役割が確認された。
本発明のＣＴＨＲＣ１タンパク質は、通常の方法で組換えにより得たものであってもよく、通常の市販元から購入したものであってもよい。本発明のＣＴＨＲＣ１は、分離されたタンパク質の形態であるか、他のタンパク質又は多糖類に結合した形態であり、具体的には、細菌由来の外毒素に結合した形態であってもよいが、これらに限定されるものではない。
ＣＴＨＲＣ１タンパク質を特異的に認知する抗体は、ＣＴＨＲＣ１が過剰発現する癌などの疾患の診断、予防又は治療に用いられ、本発明者らは、ヒト及びマウスＣＴＨＲＣ１タンパク質に高親和的に結合する抗体を開発した。本発明の抗体は、ヒトＣＴＨＲＣ１タンパク質の全てに高親和的に結合するので、ＣＴＨＲＣ１タンパク質が過剰発現する疾患の診断分野において有用であるだけでなく、癌の予防又は治療分野においても有用である。
本発明における「抗体」とは、免疫学的に特定抗原との反応性を有する免疫グロブリン分子をはじめとする、抗原を特異的に認識する受容体の役割を果たすタンパク質分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全（whole）抗体及び抗体断片が全て含まれる。本発明の目的上、前記抗体はＣＴＨＲＣ１（Collagen triple helix repeat containing-1）タンパク質に特異的に結合する抗体であってもよい。また、前記抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二価（bivalent）又は二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディが含まれる。前記抗体には、さらにＦｃＲｎに対する結合機能を有する単鎖抗体、スキャブ (scabs; single-chain antibodys)、抗体定常領域の誘導体、及びタンパク質スキャホールドに基づく人工抗体が含まれる。全抗体は２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する構造であり、各軽鎖は重鎖とジスルフィド結合により連結されている。前記全抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧが含まれ、ＩｇＧは亜型（subtype）であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれる。前記抗体断片とは、抗原結合機能を有する断片を意味し、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどが含まれる。前記Ｆｄとは、Ｆａｂ断片に含まれる重鎖部分を意味する。前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、並びに軽鎖の定常領域及び重鎖の第１定常領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造であり、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基を含むヒンジ領域（hinge region）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を形成することにより生成される。Ｆｖ（variable fragment）とは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有する最小の抗体断片を意味する。二重ジスルフィドＦｖ（dsFv）はジスルフィド結合により重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（scFv）は一般にペプチドリンカーを介して重鎖可変領域と軽鎖可変領域が共有結合により連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで特異的に切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、具体的には、遺伝子組換え技術により作製することができる。
本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に同じ抗体の集団から得られる単一分子組成の抗体分子を意味し、このようなモノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和性を示す。
典型的には、免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれは定常領域及び可変領域（これらの部位をドメインともいう）を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域（complementarity-determining region, 以下、「ＣＤＲ」という）という３つの多変可能な領域と、４つのフレームワーク領域（framework region）とを含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（epitope）に結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にはＮ末端から順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また、特定のＣＤＲが位置する鎖により識別される。
本発明における「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンに由来する分子であって、相補性決定領域、フレームワーク領域をはじめとして抗体を構成するアミノ酸配列の全体がヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列で構成されるものを意味する。通常、ヒト抗体はヒトの疾病の治療に用いられるが、それは少なくとも３つの潜在的な利点を有する。第一に、それはヒト免疫系とより良好に相互作用し、例えば補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity, CDC）又は抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）により標的細胞をより効率的に破壊することができる。第二に、ヒト免疫系が前記抗体を外来のものとして認識しないという利点がある。第三に、より少ない量、より低い頻度の薬物を投与した場合でも、ヒト循環系内半減期が天然の抗体と同等であるという利点がある。
また、このような本発明の抗体が定常領域を含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来のもの、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）による定常領域を含んでもよい。
本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリン定常領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの定常領域からなる群から選択される少なくとも２つの定常領域から二量体又は多量体を形成することができる。
本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、単鎖の免疫グロブリン重鎖定常領域内に、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリン重鎖定常領域に相当する配列が存在することを意味し、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ～４つのドメインのハイブリッドが可能である。
本発明における「ＣＴＨＲＣ１（Collagen triple helix repeat containing-1）に特異的に結合する抗体」とは、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に結合してＣＴＨＲＣ１タンパク質の活性を阻害する抗体を意味する。
本発明のＣＴＨＲＣ１に特異的に結合する抗体は、ヒトＣＴＨＲＣ１タンパク質に高親和性で結合するという特性を有する。
前記抗体は、（ａ）配列番号１又は１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２又は１２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３又は１３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号４又は１４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５又は１５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６又は１６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むものであってもよい。
また、本発明の抗体は、配列番号７、１７、２１又は２５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号９、１９、２３又は２７のアミノ酸配列からなる前記軽鎖可変領域とを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の一例として、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に対する親和性及び特異性が向上した本発明の抗体は、具体的には、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むものであるか、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の一実施例においては、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む抗体を「４Ｈ５」又は「ｃＣＭＡｂ４５」と命名し、配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号１９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む抗体を「９Ｅ６」又は「ｃＣＭＡｂ９６」と命名した。
また、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む抗体を「４Ｈ５」又は「ｈＣＭＡｂ４５」と命名し、配列番号２５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む抗体を「９Ｅ６」又は「ｈＣＭＡｂ９６」と命名した。
本発明の一実施例においては、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に結合するＢリンパ球をスクリーニングして最も抗原結合活性が高い４つの新規な４Ｈ５、９Ｅ６、６Ｃ１及び１Ｄ１を選択し、それらのうち４Ｈ５、９Ｅ６のエピトープを確認した結果、ＴＨＲＣ１タンパク質に高い親和性で特異的に結合することが確認されたので、前述した２つの新規な抗体を提供することにした。
これは、本発明のＣＴＨＲＣ１タンパク質に結合する抗体が、ＣＴＨＲＣ１タンパク質の認知が必要な分野、例えばＣＴＨＲＣ１タンパク質が過剰発現する疾患の診断や治療などに有用であることを示唆するものである。
本発明の他の態様は、前記抗体を製造する方法を提供する。
本発明の抗体は、公知の抗体製造技術により容易に製造することができる。例えば、モノクローナル抗体を製造する方法は、免疫した動物から得たＢリンパ球を用いてハイブリドーマを作製することにより行うことができ（非特許文献２）、ファージディスプレイ（phage display）技術などを用いることにより行うことができるが、これらに限定されるものではない。ポリクローナル抗体は、公知の抗体製造技術により容易に製造することができる。
ファージディスプレイ技術を用いる抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを作製せずにＢリンパ球から直接抗体遺伝子を得て、ファージ（phage）表面に抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ技術を用いると、Ｂ細胞不死化（immortalization）によりモノクローナル抗体の生成に関する従来の多くの困難を克服することができる。一般に、ファージディスプレイ技術は、１）ファージの外被タンパク質（coat protein）pＩＩＩ（又はｐＩＶ）のＮ末端に相当する遺伝子部位にランダム配列のオリゴヌクレオチド（oligonucleotide）を挿入するステップと、２）天然の外被タンパク質の一部と前記ランダム配列のオリゴヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの融合タンパク質を発現させるステップと、３）前記オリゴヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに結合する物質を処理するステップと、４）前記物質に結合された抗体・ファージ粒子を低いｐＨや結合競争力のある分子を用いて溶出させるステップと、５）パニング（panning）により溶出したファージを宿主細胞内で増幅するステップと、６）所望の量を得るために前記方法を繰り返すステップと、７）パニングにより選択されたファージクローンのＤＮＡ配列から活性のある抗体の配列を決定するステップとから構成される。
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、ファージディスプレイ技術を用いることにより行うことができる。当業者であれば、公知のファージディスプレイ技術、例えばＢａｒｂａｓら（非特許文献３及び４）、Ｗｉｎｔｅｒら（非特許文献５）の論文などに開示されている方法を参照することにより、前述した本発明の製造方法の各ステップを容易に行うことができる。抗体ライブラリーを構築するために用いられるファージは、例えば線状ファージ（filamentous phage）として、ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｚｊ／Ｚ、Ｆｆ、Ｘｆ、Ｐｆ１又はＰｆ３ファージが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、前記線状ファージの表面上に異種遺伝子を発現させるために用いられるベクターとしては、例えばｆＵＳＥ５、ｆＡＦＦ１、ｆｄ－ＣＡＴ１、ｆｄｔｅｔＤＯＧなどのファージベクター、ｐＨＥＮ１、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣｏｍｂ８、ｐＳＥＸなどのファージミドベクターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、増幅のための組換えファージを再感染させるのに必要な野生型外被タンパク質を提供するために用いられるヘルパーファージとしては、例えばＭ１３Ｋ０７、ＶＳＣＭ１３などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明のモノクローナル抗体クローンをコードするポリヌクレオチドは、通常の手順を用いて容易に単離することができ、配列分析を行うことができる。例えば、ファージ鋳型ＤＮＡから当該重鎖及び軽鎖コード領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。前記ポリヌクレオチドが単離されると、それを発現ベクター内に組み込むことができ、その後前記発現ベクターを好適な宿主細胞に導入し、形質転換された宿主細胞（すなわち、形質転換体）から所望のモノクローナル抗体を生産することができる。よって、本発明の前記ヒトモノクローナル抗体の製造方法は、ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターから前記ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを増幅するステップを含む、ヒトモノクローナル抗体の製造方法であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の態様は、前記抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記ベクターが導入された宿主細胞を提供する。
前記抗体については前述した通りである。
本発明において提供する、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特にこれらに限定されるものではないが、哺乳類細胞（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞又はバクテリア細胞（例えば、大腸菌など）を含む真核又は原核細胞において、前記ポリヌクレオチドを複製及び／又は発現するベクターであってもよく、具体的には、宿主細胞において前記ヌクレオチドが発現するように適切なプロモーターに作動可能に連結され、少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターである。例えば、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルス、レトロウイルスベクターなどに前記ポリヌクレオチドが導入された形態が挙げられる。
前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、前記抗体の重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターであってもよく、重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドの全てを含む発現ベクターであってもよい。
本発明において提供する、前記発現ベクターが導入された宿主細胞は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現ベクターが導入されて形質転換された大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞であるか、酵母細胞であるか、ピキア・パストリスなどの菌類細胞であるか、ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞であるか、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞，chinese hamster ovary cells）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（human lymphoblastoid）、ＣＯＳ（サル腎臓線維芽細胞）、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボウズメラノーマ（Bowes melanoma）細胞、ＨＴ－１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞，baby hamster kidney cells）、ＨＥＫ（ヒト胎児性腎臓細胞，human embryonic kidney cells）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞であるか、又は植物細胞である。
本発明における「導入」とは、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に送達する方法を意味する。前記導入は、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラン－媒介トランスフェクション法、ポリブレン－媒介トランスフェクション法、電子衝撃法、微量注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン、原形質体融合法などの当該分野で公知の様々な方法で行うことができる。また、形質導入とは、感染（infection）を手段とし、ウイルス粒子を用いて目的物を細胞内に送達することを意味する。さらに、遺伝子ボンバードメント（bombardment）などによりベクターを宿主細胞に導入することができる。本発明における導入は、形質転換と混用されてもよい。
本発明のさらに他の態様は、前記抗体を含む、癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
前記抗体は、癌において過剰発現し、癌細胞の成長及び転移に重要な役割を果たすことが知られている、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に高親和性で結合するので、ＣＴＨＲＣ１タンパク質の活性の抑制、中和又は／及び細胞毒性反応を引き起こし、ＣＴＨＲＣ１タンパク質が過剰発現する疾患の予防又は治療を行うことができる。前記抗体については前述した通りである。
本発明における「癌」は、本発明の抗体により予防又は治療できる癌であればいかなる種類のものでもよく、例えば膵臓癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肝癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、大腸癌、口腔癌及び膀胱癌が挙げられる。本発明における「予防」とは、前記組成物の投与により癌の発症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味し、前記「治療」とは、前記組成物の投与により癌の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
前記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。
本発明における「薬学的に許容される担体」とは、生物体を刺激することなく、投与される化合物の生物学的活性及び特性を損なわない担体又は希釈剤を意味する。液状溶液として製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体適合性に優れた、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、グルコース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノール及びこれらの成分の少なくとも１つを混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑沢剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。
前記薬学的組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口用固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、少なくとも１つの化合物に少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）又はラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も用いられる。経口用液体製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが含まれ、通常用いられる通常の希釈剤である水、流動パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口用製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有する。
前記本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与する。
本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、癌の種類、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時用いられる薬物が含まれる要素、並びにその他医学分野で公知の要素により決定される。本発明の組成物は、単独で又は他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤と順次又は同時に投与してもよい。また、単一又は多重投与してもよい。前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大限の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定される。
本発明のさらに他の態様は、前記抗体を用いて癌を治療する方法を提供する。
前記抗体及び癌については前述した通りである。
前記癌を治療する方法は、抗体及び薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物を癌が発症した固体、又は発症の疑いのある個体に投与するステップを含む、癌を治療する方法であってもよく、前記薬学的に許容される担体については前述した通りである。前記癌を治療する方法は、具体的には、抗体を含む組成物を癌が発症した個体に投与するステップを含む、癌を治療する方法であってもよい。
前記個体には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ヒトなどの哺乳動物、鳥類などが含まれ、本発明の前記組成物の投与により癌が治療される個体であればいかなるものでもよい。
ここで、前記組成物は、薬学的に有効な量で単一又は多重投与してもよい。ここで、組成物は、液剤、散剤、エアゾール、カプセル剤、腸溶コーティング錠剤もしくはカプセル剤、又は坐剤の形態で投与してもよい。投与経路には、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが含まれるが、これらに限定されるものではない。しかし、経口投与の場合はペプチドが消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化しなければならない。また、製薬組成物は、活性物質を標的細胞に送達することのできる任意の装置により投与することができる。
本発明のさらに他の態様は、前記抗体を用いて、癌の疑いのある個体の分離された生物学的試料のＣＴＨＲＣ１タンパク質を抗原抗体反応により検出するステップを含む、癌の診断のための情報の提供方法を提供する。また、その方法は、癌を診断する方法であってもよい。
本発明のさらに他の態様は、前記抗体を用いて、癌を発症している個体の分離された生物学的試料のＣＴＨＲＣ１タンパク質を抗原抗体反応により検出するステップを含む、癌の予後予測のための情報の提供方法を提供する。また、その方法は、癌を予後予測する方法であってもよい。前記抗体、癌、個体及びＣＴＨＲＣ１タンパク質については前述した通りである。ＣＴＨＲＣ１タンパク質は様々な癌で過剰発現することが知られているので、本発明の抗体はＣＴＨＲＣ１タンパク質が過剰発現することが知られている癌の診断に有用である。また、ＣＴＨＲＣ１タンパク質の過剰発現が転移に関連するＥＭＴ（epithelial-mesenchymal transition）を誘導し、癌の不良予後に関連することも報告されているので、本発明による抗体は癌の予後予測に有用である。
前記癌の診断のための情報の提供方法又は癌の予後予測のための情報の提供方法は、本発明のＣＴＨＲＣ１に特異的なヒトモノクローナル抗体を癌の疑いのある個体又は癌を発症している個体の分離された生物学的試料と反応させて抗原抗体複合体形成を検出することによりＣＴＨＲＣ１タンパク質を検出することができ、それにより癌の診断又は予後予測のための情報を提供することができる。
具体的には、（ａ）前記抗体で癌の疑いのある個体の分離された生物学的試料を処理し、ＣＴＨＲＣ１タンパク質を抗原抗体反応により検出するステップと、（ｂ）前記（ａ）で検出したＣＴＨＲＣ１タンパク質のレベルを対照群と比較し、対照群に比べてＣＴＨＲＣ１タンパク質レベルが高ければ癌患者であると判定するステップとを含む、癌の診断のための情報の提供方法又は癌の診断方法であってもよい。
具体的には、（ａ）前記抗体で癌を発症している個体の分離された生物学的試料を処理し、ＣＴＨＲＣ１タンパク質を抗原抗体反応により検出するステップと、（ｂ）前記（ａ）で検出したＣＴＨＲＣ１タンパク質のレベルを対照群と比較するステップとを含む、癌の予後予測のための情報の提供方法又は癌の予後予測方法であってもよい。
本発明における「生物学的試料」とは、組織、細胞、全血、血清、血漿、組織剖検試料（脳、皮膚、リンパ節、脊髄など）、細胞培養上清、破裂した真核細胞、細菌発現系などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これら生物学的試料を操作した状態又は操作していない状態で本発明の抗体と反応させることにより、ＣＴＨＲＣ１タンパク質の存在又は癌の有無を確認することができる。
本発明における「抗原抗体複合体」とは、試料中のＣＴＨＲＣ１タンパク質抗原と、それを認知する本発明によるモノクローナル抗体の結合物を意味し、この抗原抗体複合体の形成は、比色法（colorimetric method）、電気化学法（electrochemical method）、蛍光法（fluorimetric method）、発光法（luminometry）、粒子計数法（particle counting method）、視覚的評価（visual assessment）及びシンチレーション計数法（scintillation counting method）からなる群から選択される任意の方法で検出することができる。しかし、必ずしもこれらに限定されるものではなく、様々な応用及び適用が可能である。
本発明においては、抗原抗体複合体を検出するものとして、様々な標識体を用いることができる。具体例としては、酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、微小粒子、放射性同位元素からなる群から選択されるものが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
検出標識体に用いられる酵素としては、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β－ラクタマーゼなどが挙げられ、蛍光物質としては、フルオレセイン、Ｅｕ３＋、Ｅｕ３＋キレート、クリプテートなどが挙げられ、リガンドとしては、ビオチン誘導体などが挙げられ、発光物質としては、アクリジニウムエステル、イソルミノール誘導体などが挙げられ、微小粒子としては、金コロイド、着色ラテックスなどが挙げられ、放射性同位元素としては、５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ、１２５Ｉ－ボルトン（Bolton）ハンター（Hunter）試薬などが挙げられる。
具体的には、抗原抗体複合体を酵素免疫測定法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）により検出することができる。ＥＬＩＳＡには、固体支持体に付着した抗原を認知する標識された抗体を用いる直接ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認知する抗体の複合体から捕獲抗体を認知する標識された二次抗体を用いる間接ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体から抗原を認知する標識された他の抗体を用いる直接サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体から抗原を認知する他の抗体と反応させ、その後その抗体を認知する標識された二次抗体を用いる間接サンドイッチＥＬＩＳＡ、同じ抗体結合部位を有する抗原同士を競合させる競合ＥＬＩＳＡなど、様々なＥＬＩＳＡ方法が含まれる。
前記モノクローナル抗体は、検出標識を有してもよく、検出標識を有さない場合はこれらモノクローナル抗体を捕獲し、検出標識を有する他の抗体で処理して確認してもよい。
本発明のさらに他の態様は、前記抗体を含む、癌診断又は予後予測用組成物を提供する。
前記抗体及び癌については前述した通りである。本発明のＣＴＨＲＣ１タンパク質に特異的な抗体を含む、診断又は予後予測用組成物を用いて、ＣＴＨＲＣ１タンパク質の発現の有無や発現の程度に関連する疾患、例えば癌の診断又は予後予測を行うことができる。
本発明のさらに他の態様は、前記癌診断又は予後予測用組成物を含む、癌診断又は予後予測用キットを提供する。
前記組成物及び癌については前述した通りである。また、前記癌診断用キットは、分析方法に適した１種類又はそれ以上の他の構成成分を有する組成物、溶液又は装置をさらに含んでもよい。
本発明のさらに他の態様は、ＣＴＨＲＣ１（Collagen triple helix repeat containing-1）タンパク質に特異的に結合する抗体を含むＣＴＨＲＣ１タンパク質検出用組成物及びキットを提供する。
本発明のさらに他の態様は、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、ＣＴＨＲＣ１抗原抗体複合体を検出するステップを含む、試料内のＣＴＨＲＣ１タンパク質を検出する方法を提供する。前記検出する方法は、コンジュゲートワクチンの定量に用いることができる。
本発明における「抗原抗体複合体」とは、試料中の当該タンパク質抗原と、それを認知する抗体の結合物を意味する。前記抗原抗体複合体の検出は、当該技術分野で公知の方法、例えば分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電気的、吸光的、化学的及びその他の方法により行うことができ、具体的には比色法（colorimetric method）、電気化学法（electrochemical method）、蛍光法（fluorimetric method）、発光法（luminometry）、粒子計数法（particle counting method）、視覚的評価（visual assessment）及びシンチレーション計数法（scintillation counting method）からなる群から選択される任意の方法で検出することができ、ウェスタンブロッティング（western blotting）、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定法（radioimmunoassay）、放射免疫拡散法（radioimmunodiffusion）、オクタロニー（Ouchterlony）免疫拡散法、ロケット（Rocket）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿法（immunoprecipitation assay）、補体固定分析法（complement fixation assay）、ＦＡＣＳ（flow cytometry）、プロテインチップ（protein chip）などの方法を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明においては、抗原抗体複合体を検出するものとして、様々な標識体を用いることができる。具体例としては、酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、微小粒子、放射性同位元素からなる群から選択されるものが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
検出標識体に用いられる酵素としては、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β－ラクタマーゼなどが挙げられ、蛍光物質としては、フルオレセイン、Ｅｕ３＋、Ｅｕ３＋キレート、クリプテートなどが挙げられ、リガンドとしては、ビオチン誘導体などが挙げられ、発光物質としては、アクリジニウムエステル、イソルミノール誘導体などが挙げられ、微小粒子としては、金コロイド、着色ラテックスなどが挙げられ、放射性同位元素としては、５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ、１２５Ｉ－ボルトン（Bolton）ハンター（Hunter）試薬などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明のキットは、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）キットの形態であってもよく、具体的には、前記キットは、前述した抗体を捕獲抗体として含むものであり、前記ＥＬＩＳＡは、（ｉ）ＣＴＨＲＣ１に結合するポリクローナル抗体と、（ｉｉ）本発明のＣＴＨＲＣ１（Collagen triple helix repeat containing-1）タンパク質に特異的に結合する抗体の形態である捕獲抗体と、（ｉｉｉ）検出標識が結合されたＩｇＧ Ｆｃに結合された抗体とを含むものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明における「ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）」とは、酵素免疫測定法ともいい、抗体に酵素を結合させて抗原抗体複合体を形成し、その酵素と基質の反応により吸光度を用いて定量する方法を意味する。前記ＥＬＩＳＡには、固体支持体に付着した抗原を認知する標識された抗体を用いる直接ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認知する抗体の複合体から捕獲抗体を認知する標識された二次抗体を用いる間接ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体から抗原を認知する標識された他の抗体を用いる直接サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体から抗原を認知する他の抗体と反応させ、その後その抗体を認知する標識された二次抗体を用いる間接サンドイッチＥＬＩＳＡ、同じ抗体結合部位を有する抗原同士を競合させる競合ＥＬＩＳＡなどが含まれる。
本発明のＣＴＨＲＣ１タンパク質に特異的に結合する抗体と、それを含む検出用組成物と、キットと、それを用いてＣＴＨＲＣ１タンパク質を検出する方法とにより、極微量のＣＴＨＲＣ１タンパク質を検出することができ、検出することのできるタンパク質の量は、具体的には１ｍｇ未満、１００ｕｇ未満であってもよく、より具体的には１０ｕｇ未満、１ｕｇ未満、１００ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、１ｎｇ未満である。
本発明の一実施例においては、ＣＴＨＲＣ１に特異的に結合する４Ｈ５、９Ｅ６抗体を捕獲抗体として用いる間接ＥＬＩＳＡを行うことにより、数ｎｇレベルのＣＴＨＲＣ１タンパク質を検出できることが確認され、前記ＥＬＩＳＡを行うことにより、コンジュゲートワクチンも検出できることが確認された。
このように、本発明の抗体を用いることにより、従来のＣＴＨＲＣ１タンパク質検出用キットに比べてはるかに少量のＣＴＨＲＣ１タンパク質を検出することができるので、本発明の抗体は、ＣＴＨＲＣ１タンパク質及びそれを用いたワクチンの定量化に有用である。
以下、実施例及び実験例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
＜マウス抗体ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６＞
実施例１－１：４Ｈ５及び９Ｅ６の選択
ＣＴＨＲＣ１タンパク質をターゲットとする抗体を開発するために、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に結合するマウスモノクローナル抗体を選択した。具体的には、ＣＴＨＲＣ１タンパク質をマウスに注射し、ＣＴＨＲＣ１に対する抗体が生成されたら、マウスの脾臓からＢリンパ球を分離した。分離したＢリンパ球をＣＴＨＲＣ１タンパク質がコーティングされた９６ウェルプレート（well plate）にリンパ球が１つのみ入るように希釈した。その後、ＨＲＰ（Horseradish peroxidase）が標識された抗マウス（anti-mouse）抗体を用いて、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に結合するＢリンパ球をスクリーニングした。
その結果、４Ｈ５、９Ｅ６、６Ｃ１、１Ｄ１の４種の抗ＣＴＨＲＣ１マウスモノクローナル抗体が選択された。
実施例１－２：ＣＴＨＲＣ１に対する親和性の確認
実施例１－１で選択した抗ＣＴＨＲＣ１マウスモノクローナル抗体４種の抗体のうちＣＴＨＲＣ１タンパク質に対して親和性が最も高い抗体を選択するために、間接（indirect）ＥＬＩＳＡを行った。
ＣＴＨＲＣ１－ＦｃとＣＴＨＲＣ１－Ｈｉｓタンパク質をコーティングした免疫（Immuno）プレートを各濃度の４Ｈ５、９Ｅ６、６Ｃ１、１Ｄ１の４種の抗体で処理して２時間反応させ、その後ＨＲＰが標識されたａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ抗体を二次抗体として用いて吸光度を測定した。ここで、吸光度（Optical density, O.D）が高いほど、ＣＴＨＲＣ１に強力に結合することを意味する。
その結果、４種の抗体の全てにおいてＣＴＨＲＣ１タンパク質の濃度に応じてＯ．Ｄ値が増加したが、他の抗体に比べて４Ｈ５及び９Ｅ６の２種の抗体がＣＴＨＲＣ１により高い親和性で結合することが確認された（図１）。
実施例１－３：エピトープ（Epitope）の確認
４種のａｎｔｉ－ＣＴＨＲＣ１マウス抗体のうち親和性が高い４Ｈ５及び９Ｅ６のエピトープを確認するために、競合（Competitive）ＥＬＩＳＡを行った。ここで、エピトープとは、抗体が認識する抗原の位置を意味する。
免疫プレートにＣＴＨＲＣ１タンパク質をコーティングし、その後ビオチン（biotin）が標識された４Ｈ５、９Ｅ６と、ビオチンが標識されていない非標識４Ｈ５、９Ｅ６抗体を１：０、１：３、１：６、１：１２．５、１：２５、１：５０、１：１００の比で入れた。二次抗体としてストレプトアビジン（Streptavidin）－ＨＲＰを用いて、各抗体のＯ．Ｄ値を測定した。ここで、４Ｈ５、９Ｅ６が類似したエピトープを有すると、非標識抗体の濃度が増加するにつれてＯ．Ｄ値が低くなるが、エピトープが異なると、非標識抗体の濃度が増加してもＯ．Ｄ値は変わらない。
よって、４Ｈ５と９Ｅ６はエピトープが異なることが確認された（図２）。
実施例１－４：キメラ（Chimeric）抗体ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の作製
ＣＴＨＲＣ１に特異的であり、高い親和性を有する４Ｈ５及び９Ｅ６マウス抗体の免疫原性を最小限に抑えるために、マウス抗体の可変領域は維持し、定常領域のみヒト由来のタンパク質に置換したキメラ抗体を作製した。これらをｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６と命名した。
実施例１－５：親和性分析（Affinity: 間接ＥＬＩＳＡ）
実施例１－３で作製した抗ＣＴＨＲＣ１キメラ抗体であるｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６のＣＴＨＲＣ１タンパク質に対する親和性を検証した。抗原と抗体の親和性テストのために、間接ＥＬＩＳＡを行った。
５μｇ／ｍｌの濃度で１００ｕｌずつＣＴＨＲＣ１を免疫プレートに分注し、４℃で一晩コーティングした。その翌日、コーティングしたＣＴＨＲＣ１溶液を捨ててブロッキング（blocking）を２時間行った。その後、各濃度のｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６抗体で処理し、次いで常温で２時間反応させ、結合していない抗体を除去するために、抗体を捨ててプレートを洗浄した。二次抗体として、ヒトの定常領域を認識する抗ヒトＦｃ－ＨＲＰを用いて、Ｏ．Ｄ値を測定した。ここで、Ｏ．Ｄ値が高いほど、ＣＴＨＲＣ１と抗体の親和性が高いことを意味する。
その結果、ｃＣＭＡｂ４５のＫＤ値は５．２×１０－１０Ｍ、ｃＣＭＡｂ９６のＫＤ値は４．３×１０－１０Ｍであった。両抗体のどちらもＣＴＨＲＣ１タンパク質に対して非常に高い親和性を有することが確認された（図３）。
実施例１－６：特異性の分析（Specificity: 間接ＥＬＩＳＡ）
ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６がＣＴＨＲＣ１に特異的に結合するか否かを確認するために、間接ＥＬＩＳＡを行った。親和性の分析と同様に、免疫プレートにＣＴＨＲＣ１タンパク質と複数の不特定抗原タンパク質をコーティングした。その翌日、コーティング溶液を捨ててブロッキングし、その後ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６を０、１、５μｇ／ｍｌの濃度で入れて２時間反応させた。その後、抗体を含む溶液を捨て、次いで結合していない抗体を排除するために、洗浄過程を行った。二次抗体として抗ヒトκ軽鎖－ＨＲＰ（kappa light chain-HRP）を用いて、Ｏ．Ｄ値を測定した。
その結果、ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６は、ＣＴＨＲＣ１に高い特異性を有することが確認された（図３）。
実施例１－７：癌細胞遊走（Migration）抑制効果の確認
ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の治療効能を検証するために、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌の細胞株を用いて遊走抑制効果を確認した。
具体的には、１、５μｇ／ｍｌ又は１、１０μｇ／ｍｌのｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６を作製し、細胞株と共に無血清培地で希釈し、トランスウェル（transwell）の上部チャンバに分注した。下部チャンバには血清を含む培地を設け、細胞が遊走できる環境を造成した。各細胞株に応じて所定時間培養し、遊走した細胞の数を測定した。
その結果、対照群として用いたＩｇＧに比べて、ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６で処理したグループにおいて、癌細胞の遊走の程度が大幅に減少することが確認された（図４～図７）。
実施例１－８：癌細胞浸潤（Invasion）抑制効果の確認
実施例１－７と同様に、ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の効能検証のために、癌細胞浸潤抑制効果を確認した。それを膵臓癌、患者由来膵臓癌細胞株、乳癌、卵巣癌、膀胱癌において行った。
細胞外基質を人為的に摸したマトリゲル（Matrigel）をトランスウェルの上部チャンバにコーティングし、癌細胞の浸潤能を確認できるようにした。１、５μｇ／ｍｌ又は１、１０μｇ／ｍｌのｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６を作製し、細胞株と共に無血清培地で希釈し、トランスウェルの上部チャンバに分注し、下部チャンバには血清を含む培地を設けた。所定時間培養し、その後マトリゲルを浸潤して遊走した細胞の数を測定した。
その結果、ＩｇＧの対照群に比べて、ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６で処理したグループにおいて、癌細胞の浸潤能力が減少することが確認された（図８～図１２）。
＜ヒト化抗体ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６＞
実施例２－１：ヒト化抗体ライブラリーの構築
Ａｎｔｉ－ＣＴＨＲＣ１ ｃｈｉｍｅｒｉｃ抗体であるｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６の免疫原性を低下させるために、抗原との結合に最も重要な部分であるＣＤＲ領域を除いて、ＣＤＲ領域を支えるフレームワーク領域（Framework region, 以下、「ＦＲ」という）をヒトのものに交換したヒト化抗体を作製した。
ＣＤＲグラフティング（grafting）法を用いて、ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６のＣＤＲ領域をはじめとする様々なＦＲ領域を有するヒト化抗体ライブラリーを構築した。
実施例２－２：ヒト化抗体の選択及びＩｇＧ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
作製したヒト化抗体ライブラリーから、ＣＴＨＲＣ１に特異的であり、高い親和性を有するクローンを選択した。ＩｇＧ臨時発現テストをＨＥＫ２９３Ｆ細胞において行い、４Ｈ５及び９Ｅ６に対する８種の抗体をそれぞれ精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより純度を確認した。
その結果、４Ｈ５ヒト化抗体の生産性は１５～６７．３ｍｇ／Ｌであり、９Ｅ６ヒト化抗体の生産性は３．１～３３．３ｍｇ／Ｌであった（図１３）。
実施例２－３：ヒト化抗体親和性の分析
実施例２－２で生産した４Ｈ５の８個の候補クローンの親和性の分析のために、間接ＥＬＩＳＡを行った。免疫プレートにＣＴＨＲＣ１－Ｈｉｓをコーティングし、その翌日、８個のヒト化候補抗体とｃＣＭＡｂ４５の濃度を最高５００ｎｇ／ｍｌから１／３ずつ段階希釈して入れた。二次抗体として抗ヒトＦｃ－ＨＲＰを用いて、Ｏ．Ｄ値を測定した。親和性をＫＤ値で示した。ＫＤ値が低ければ低いほど、高い親和性を有することを意味する。
その結果、測定されたヒト化抗体のＫＤ値はｃＣＭＡｂ４５と同等又はそれより低かった。
前記方法と同様に、９Ｅ６ヒト化抗体の８個の候補クローンに対しても親和性を分析した結果、測定された９Ｅ６ヒト化抗体のＫＤ値はｃＣＭＡｂ９６と同等又はやや高かった。
具体的には、４Ｈ５ヒト化抗体の親和性は０．８２×１０－１０Ｍ～２．５×１０－１０Ｍであり、９Ｅ６ヒト化抗体の親和性は１．６１×１０－１０Ｍ～４．８×１０－１０Ｍであることが確認された（図１４）。
実施例２－４：ヒト化抗体の効能テスト
４Ｈ５及び９Ｅ６ヒト化抗体候補クローンの効能をテストするために、膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１を用いて、遊走分析を行った。各抗体５μｇ／ｍｌと５×１０４個の細胞を無血清培地で希釈し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上部チャンバに分注した。次に、血清を含む培地を下部チャンバに設け、細胞が遊走できる環境を造成した。２４時間培養し、その後遊走した細胞の数を測定して候補抗体の効能を評価した。
その結果、４Ｈ５ヒト化抗体候補クローンは、対照群ＩｇＧに比べて細胞遊走能力を３０～５０％減少させ、９Ｅ６ヒト化抗体候補は、細胞遊走能を３０～４０％減少させることが確認された。結論として、４Ｈ５及び９Ｅ６ヒト化抗体候補はどちらも、ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６と同等又はより優れた効能を有することが確認された（図１５）。
実施例２－５：ヒト化抗体の選択及び親和性と効能の再評価
４Ｈ５及び９Ｅ６ヒト化抗体候補クローンを親和性、効能及び収率の３つの項目で評価し、抗体を選択した。４Ｈ５ヒト化抗体においてはＳＡ２７５９、ＳＡ２７６１、ＳＡ２７６２を選択し、９Ｅ６ヒト化抗体においてはＳＡ２７６８、ＳＡ２７６９、ＳＡ２７７０を選択した。
前述したように選択した抗体の親和性及び効能を再評価するために、親和性は間接ＥＬＩＳＡを用い、効能評価は遊走分析を用いた。実験方法は、実施例２－３及び２－４と同様である。
その結果、親和性は、最初の測定と同様に、ｃＣＭＡｂ４５及びｃＣＭＡｂ９６と同等又はそれより低いＫＤ値を示し、細胞遊走能も３０～５０％減少させることが確認された。具体的には、選択した４Ｈ５ヒト化抗体は、数ｐＭの親和性を示し、細胞遊走能を４０％まで減少させ、９Ｅ６ヒト化抗体は、数十ｐＭの親和性を示し、細胞遊走能を５０％まで減少させることが確認された（図１６及び図１７）。
最終的に、ＳＡ２７６５をｈＣＭＡｂ４５と命名し、ＳＡ２７７０をｈＣＭＡｂ９６と命名した。
実施例２－６：ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の特異性分析
ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６がＣＴＨＲＣ１に特異的に結合するか否かを確認するために、間接ＥＬＩＳＡを行った。免疫プレートにＣＴＨＲＣ１－Ｈｉｓと複数の不特定抗原をコーティングした。その翌日、ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６を０、１、５μｇ／ｍｌの濃度で抗原と反応させ、その後二次抗体として抗ヒトκ軽鎖－ＨＲＰを用いて、Ｏ．Ｄ値を測定した。
その結果、ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６は、ＣＴＨＲＣ１に特異的に結合することが確認された（図１８）。
実施例２－７：癌細胞遊走（Migration）抑制効果の確認
ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の治療効能の検証のために、癌細胞の遊走抑制効果を確認した。膵臓癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、悪性黒色腫を用いた。実験方法は、実施例１－７と同様である。
その結果、対照群ＩｇＧに比べて、ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６で処理したグループにおいて、癌細胞の遊走能が大幅に減少することが確認された（図１９～図２２）。
実施例２－８：癌細胞浸潤（Invasion）抑制効果の確認
実施例１－８の実験方法と同様に、ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の癌細胞浸潤抑制効果を確認した。
その結果、対照群ＩｇＧに比べて、ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６で処理したグループにおいて、癌細胞の浸潤能が大幅に減少した（図２３～図２６）。
実施例２－９：膵臓癌動物モデルにおける生体内（in vivo）抗癌効果の確認
実施例２－７、２－８により、ＣＴＨＲＣ１タンパク質に特異的に結合するヒト化抗体ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の癌細胞遊走及び浸潤抑制能を試験管内（in vitro）で確認した。よって、生体内でも同様の抗癌効果を発揮するか否かを確認した。具体的には、ＣＴＨＲＣ１が過剰発現する膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３を用いて、ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルを作製した。１×１０６個の細胞をマウスの右脚皮下に移植し、６日後に形成された腫瘍の大きさが７３～７７ｍｍ３のマウスを選択してグループに分けた。薬物は尾静脈に注入した。対照群ＩｇＧグループと実験群ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１週間に２回ずつ計４週間投与し、腫瘍の大きさは、カリパスを用いて１週間に２回測定した。抗体での処理を開始して２８日目（８回処理）に実験を終了し、対照群ＩｇＧの腫瘍大きさと比較した。
その結果、対照群ＩｇＧを投与したグループに比べて、ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６を投与したグループにおいて、腫瘍の大きさが減少することが確認された（図２７）。特に、ｈＣＭＡｂ４５で処理したグループより、ｈＣＭＡｂ９６で処理したグループにおいて、抗癌効果がより優れることが確認された。
前記実施例により、ＣＴＨＲＣ１に特異的に結合するヒト化抗体ｈＣＭＡｂ４５及びｈＣＭＡｂ９６の生体内抗癌効果を確認し、腫瘍の増殖遅延又は抑制物質としての可能性を検証した。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
実施例２－５：ヒト化抗体の選択及び親和性と効能の再評価
４Ｈ５及び９Ｅ６ヒト化抗体候補クローンを親和性、効能及び収率の３つの項目で評価し、抗体を選択した。４Ｈ５ヒト化抗体においてはＳＡ２７５９、ＳＡ２７６１、ＳＡ２７６２、ＳＡ２７６５を選択し、９Ｅ６ヒト化抗体においてはＳＡ２７６８、ＳＡ２７６９、ＳＡ２７７０を選択した。

Claims (18)

  1. （ａ）配列番号１又は１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２又は１２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３又は１３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
    （ｂ）配列番号４又は１４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５又は１５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６又は１６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
    ＣＴＨＲＣ１（Collagen triple helix repeat containing-1）タンパク質に特異的に結合する抗体。
  2. 前記抗体は、
    配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
    配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
    請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体は、
    配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
    配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、
    請求項１に記載の抗体。
  4. 前記重鎖可変領域は、配列番号７、１７、２１又は２５のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域は、配列番号９、１９、２３又は２７のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の抗体。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  6. 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  7. 請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  8. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体を含む、癌の予防又は治療用薬学的組成物。
  9. 前記癌は、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肝癌、胃癌、肺癌、大腸癌、口腔癌、子宮頸癌及び膀胱癌からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
  10. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体を用いて、癌の疑いのある個体の分離された生物学的試料のＣＴＨＲＣ１タンパク質を抗原抗体反応により検出するステップを含む、癌の診断のための情報の提供方法。
  11. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体を用いて、癌を発症している個体の分離された生物学的試料のＣＴＨＲＣ１タンパク質を抗原抗体反応により検出するステップを含む、癌の予後予測のための情報の提供方法。
  12. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体を含む、癌診断又は予後予測用組成物。
  13. 請求項１２に記載の組成物を含む、癌診断又は予後予測用キット。
  14. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体を含むＣＴＨＲＣ１検出用キット。
  15. 前記キットはＥＬＩＳＡの形態である、請求項１４に記載のキット。
  16. 前記抗体は捕獲抗体である、請求項１５に記載のキット。
  17. 前記ＥＬＩＳＡは、
    （ｉ）ＣＴＨＲＣ１に結合するポリクローナル抗体と、
    （ｉｉ）請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体の形態である捕獲抗体と、
    （ｉｉｉ）検出標識が結合されたＩｇＧ Ｆｃに結合された抗体とを含む、
    間接ＥＬＩＳＡである、請求項１５に記載のキット。
  18. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体を用いて、ＣＴＨＲＣ１抗原抗体複合体を検出するステップを含む、試料内のＣＴＨＲＣ１タンパク質を検出する方法。
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