CN114174333A - 新型cthrc1特异性抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种结合CTHRC1的新型抗体及其用途。

Description

新型CTHRC1特异性抗体及其用途
技术领域
本发明涉及一种结合CTHRC1的新型抗体及其用途。
背景技术
当前在临床应用中的抗癌药物可以分类为化学治疗剂和生物治疗剂。在过去积极开发的化学治疗剂是对癌细胞显示出毒性的药物，并且这些药物具有这样的问题：它们对正常细胞和癌细胞有毒性并且还遭受耐受性。因此，开发和使用这些药物存在限制。因此，近年来，正在积极开发可以恢复或增加人体的免疫功能且从而弱化癌细胞的活性的生物治疗剂作为替代方案。当前处于使用中或研发下的生物治疗剂的实例包括细胞因子、重组抗体(例如，单克隆抗体)、核酸分子治疗剂、血管生成抑制剂等。
在生物治疗剂中，治疗性单克隆抗体的特征在于由于其对靶标的高反应特异性而具有低副作用。抗体通过各种机制表现出治疗效果；例如，它们可以特异性结合相应抗原以通过交联抑制信号转导或诱导细胞凋亡，并且另外可以通过激活体内免疫系统表现出治疗效果。因此，作为抗癌剂的单克隆抗体可以特异性追踪癌细胞并且抑制其活性以及诱导免疫应答且从而有效去除癌细胞。因此，使用单克隆抗体的治疗变为主流癌症治疗。就这一点而言，已经开发了单克隆抗体诸如雷莫芦单抗(ramucirumab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)等并且将其用于胃癌、乳腺癌、肝癌等的治疗中。
同时，已知含胶原三螺旋重复序列1(collagen triple helix repeatcontaining-1，CTHRC1)作为参与血管重塑、骨形成和发育性形态发生的分泌蛋白。
根据最近研究，已经报道CTHRC1过表达于各种类型的癌细胞(诸如胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤等)中，并且由此与癌症的增殖或转移相关。因此，这些结果暗指CTHRC1在侵袭性肿瘤中具有重要作用。还已知CTHRC1不仅诱导癌细胞的增殖和转移，而且还刺激肿瘤微环境中的内皮细胞且从而参与血管生成(Park等人,Carcinogenesis(2013)34:694；Lee等人,ExpMolMed(2016)48:e261)。作为人肿瘤cDNA阵列分析的结果，发现CTHRC1主要表达于人实体瘤中，并且作为转录物组分析的结果，确认在乳腺小叶癌与正常导管和小叶细胞之间存在表达差异。还发现CTHRC1表达于侵入性原发性黑色素瘤和转移性黑色素瘤中，但未表达于良性痣或非侵入性样品中。另外，对CTHRC1表达的抑制降低体外黑色素瘤细胞系的迁移。CTHRC1在隆突性皮纤维肉瘤(其是经常转移的局部侵袭性赘生物)中鉴定出，但未在皮肤肉瘤或典型的良性纤维组织细胞肿瘤中鉴定出。此外，已经报道CTHRC1表达相比于正常组织或前体病变在乳腺癌组织中显著更高，并且与骨转移的风险相关联。然而，仍需要开发改善对CTHRC1蛋白的结合和亲和力并且同时在诊断和治疗各种类型的癌症方面具有优异效果的抗体。
发明内容
技术问题
一直持续需要开发特异性结合CTHRC1的抗体以用于治疗各种癌症，包括难治癌症。因此，本发明人已经开发了一种具有高亲和力和特异性的新型抗体，并且已经确认所述抗体在各种癌症中具有抗癌作用，从而完成本发明。
技术方案
本发明的一个目的是提供一种特异性结合含胶原三螺旋重复序列1(CTHRC1)蛋白的抗体。
本发明的另一个目的是提供一种编码特异性结合CTHRC1蛋白的所述抗体的多核苷酸；一种包含所述多核苷酸的表达载体；以及一种包含所述表达载体的宿主细胞。
本发明的还另一个目的是提供一种用于检测特异性结合CTHRC1蛋白的所述抗体的组合物和试剂盒。
本发明的甚至另一个目的是提供一种包含所述抗体的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
本发明的又另一个目的是提供一种用于使用所述抗体治疗癌症的方法。
本发明的进一步另一个目的是提供一种包含所述抗体的用于诊断癌症或预测癌症预后的组合物。
本发明的还进一步另一个目的是提供一种提供用于诊断癌症的信息的方法，其包括：使用所述抗体通过抗原-抗体反应检测从疑似患有癌症的受试者分离的生物样品中的CTHRC1蛋白。
本发明的还进一步另一个目的是提供一种提供用于预测癌症预后的信息的方法，其包括：使用所述抗体通过抗原-抗体反应检测从罹患癌症的受试者分离的生物样品中的CTHRC1蛋白。
本发明的还进一步另一个目的是提供一种用于诊断癌症或预测癌症预后的试剂盒，其包括用于诊断癌症或预测癌症预后的所述组合物。
本发明的还进一步另一个目的是提供一种用于检测样品中的CTHRC1蛋白的方法，其包括使用特异性结合CTHRC1蛋白的所述抗体检测CTHRC1抗原-抗体复合物。
有益效果
本发明的新型抗体可以检测痕量的CTHRC1并且还可以检测CTHRC1缀合物疫苗，并且由此可以有效地用于定量CTHRC1和CTHRC1缀合物疫苗。
附图说明
图1是对CTHRC1具有高结合亲和力的4H5和9E6小鼠抗体的间接ELISA的结果(敏感性：4H5、9E6>>1D1>6C1)。
图2是确认4H5和9E6小鼠抗体具有不同表位的结果，其表明它们可以通过不同机制诱导抗癌作用。
图3是确认cCMAb45和cCMAb96不仅对CTHRC1蛋白具有高结合亲和力，而且还与其特异性结合的结果。
图4是确认cCMAb45和cCMAb96对体外胰腺癌迁移的抑制性作用的结果。
图5是确认cCMAb45和cCMAb96对体外乳腺癌迁移的抑制性作用的结果。
图6是确认cCMAb45和cCMAb96对体外卵巢癌迁移的抑制性作用的结果。
图7是确认cCMAb45和cCMAb96对体外膀胱癌迁移的抑制性作用的结果。
图8是确认cCMAb45和cCMAb96对体外胰腺癌侵入性的抑制性作用的结果。
图9是确认cCMAb45和cCMAb96对体外患者来源胰腺癌细胞侵入性的抑制性作用的结果。
图10是确认cCMAb45和cCMAb96对体外乳腺癌侵入性的抑制性作用的结果。
图11是确认cCMAb45和cCMAb96对体外卵巢癌侵入性的抑制性作用的结果。
图12是确认cCMAb45和cCMAb96对体外膀胱癌侵入性的抑制性作用的结果。
图13是4H5和9E6人源化候选抗体的产生的结果。
图14是测量4H5和9E6人源化候选抗体的结合亲和力的结果。
图15是使用胰腺癌细胞系Panc-1验证4H5和9E6人源化候选抗体的功效的结果。
图16是重新测量选择为一抗的4H5和9E6人源化候选抗体的结合亲和力的结果。
图17是重新验证首选的4H5和9E6人源化候选抗体的功效的结果。
图18是确认hCMAb45和hCMAb96特异性结合CTHRC1蛋白的结果。
图19是确认hCMAb45和hCMAb96对体外胰腺癌迁移的抑制性作用的结果。
图20是确认hCMAb45和hCMAb96对体外卵巢癌迁移的抑制性作用的结果。
图21是确认hCMAb45和hCMAb96对体外乳腺癌迁移的抑制性作用的结果。
图22是确认hCMAb45和hCMAb96对体外膀胱癌、肺癌和黑色素瘤迁移的抑制性作用的结果。
图23是确认hCMAb45和hCMAb96对体外胰腺癌侵入性的抑制性作用的结果。
图24是确认hCMAb45和hCMAb96对体外卵巢癌侵入性的抑制性作用的结果。
图25是确认hCMAb45和hCMAb96对体外乳腺癌侵入性的抑制性作用的结果。
图26是确认hCMAb45和hCMAb96对体外膀胱癌、肺癌和黑色素瘤侵入性的抑制性作用的结果。
图27是确认hCMAb45和hCMAb96的体内抗癌作用的结果。使用胰腺癌细胞系BxPC-3的模型相比于对照组显示出降低的肿瘤体积。
具体实施方式
将在下文详细描述本发明。同时，本文公开的每个描述和实施方案可以分别应用于其他描述和实施方案。即，本文公开的各种元件的所有组合都落入本申请的范围内。此外，本发明的范围不受下文所述的具体描述的限制。
贯穿本发明的公开文本，使用了天然存在的氨基酸的常规1字母代码和3字母代码。另外，根据本公开文本的缩写中提及的氨基酸根据IUPAC-IUB命名法描述。
丙氨酸 Ala、A 精氨酸 Arg、R
天冬酰胺 Asn、N 天冬氨酸 Asp、D
半胱氨酸 Cys、C 谷氨酸 Glu、E
谷氨酰胺 Gln、Q 甘氨酸 Gly、G
组氨酸 His、H 异亮氨酸 Ile、I
亮氨酸 Leu、L 赖氨酸 Lys、K
甲硫氨酸 Met、M 苯丙氨酸 Phe、F
脯氨酸 Pro、P 丝氨酸 Ser、S
苏氨酸 Thr、T 色氨酸 Trp、W
酪氨酸 Tyr、Y 缬氨酸 Val、V
本发明的一个方面提供了一种特异性结合含胶原三螺旋重复序列1(CTHRC1)蛋白的抗体。
如本文所用，术语“CTHRC1(含胶原三螺旋重复序列1)”是参与血管重塑、骨形成和形态发生的水溶性蛋白，并且已知蛋白质表达于受损动脉中且从而促进细胞迁移，并且具有通过抑制纤维母细胞和平滑肌细胞中的胶原合成而重塑受损主动脉的功能。还已知内皮细胞中CTHRC1的表达调控转化生长因子-β(TGF-β)且因此抑制TGF-β靶基因(包括胶原)的表达。另外，CTHRC1转基因小鼠增加成骨细胞的成骨性骨形成，以及骨祖细胞的分化和矿化，并且还与Wnt5a相互作用以激活平面细胞极性途径。基于这些，可以确认在发育期间CTHRC1在调控形态发生中的作用。
本发明的CTHRC1蛋白可以通过常规方法通过重组获得或可以商业购买。本发明的CTHRC1可以呈分离蛋白质的形式或呈与其他蛋白质或多糖结合的形式，并且具体地，其可以呈与细菌外毒素结合的形式，但所述形式不限于此。
特异性识别CTHRC1蛋白的抗体可用于诊断、预防或治疗过表达CTHRC1的疾病，诸如癌症。就这一点而言，本发明人已经开发了以高亲和力结合人和小鼠CTHRC1蛋白的抗体。本发明的抗体以高亲和力结合所有的人CTHRC1蛋白，且由此可以有效地用于诊断过表达CTHRC1蛋白的疾病的领域中，以及预防或治疗癌症的领域中。
如本文所用，术语“抗体”是指充当能够特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，包括对特定抗原具有免疫学反应性的免疫球蛋白分子。所述术语可以包括多克隆抗体、单克隆抗体、全抗体和抗体片段中的全部。出于本发明的目的，抗体可以是特异性结合含胶原三螺旋重复序列1(CTHRC1)蛋白的抗体。另外，所述术语包括嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和二价或双特异性分子(例如，双特异性抗体)、双抗体、三抗体和四抗体。另外，所述术语进一步包括对新生儿Fc受体(FcRn)具有结合功能的单链抗体、scab(单链抗体)、抗体恒定区的衍生物和基于蛋白质支架的人工抗体。全抗体具有包含两条全长轻链和两条全长重链的结构，其中每条轻链通过二硫键连接至重链。全抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG，其中IgG包括作为亚型的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。抗体片段是指具有抗原结合功能的片段，并且包括Fd、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv等。Fd是指包括在Fab片段中的重链部分。Fab具有由轻链和重链的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1结构域)构成的结构，并且具有一个抗原结合位点。Fab′与Fab的不同之处在于它具有铰链区，所述铰链区包含重链CH1结构域的C末端处的至少一个半胱氨酸残基。F(ab′)2抗体是在Fab′的铰链区中的半胱氨酸残基形成二硫键时产生。可变片段(Fv)是指仅具有重链可变区和轻链可变链的最小抗体片段。二硫化物稳定的Fv(dsFv)抗体片段的特征在于重链可变区和轻链可变区由二硫键连接，而单链Fv(scFv)的特征通常在于重链可变区和轻链可变区由通过肽接头的共价键连接。这些抗体片段可以使用蛋白酶获得(例如，Fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性消化全抗体来获得，并且F(ab′)2片段可以通过用胃蛋白酶消化全抗体来获得)。优选地，抗体片段可以通过基因重组技术构建。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本相同的抗体的群体获得、具有单一分子组成的抗体分子。此类单克隆抗体对特定表位显示出单一结合特异性和亲和力。
一般来讲，免疫球蛋白具有重链和轻链，并且重链和轻链中的每一者包含恒定区和可变区(这些区还已知为“结构域”)。轻链和重链的可变区包括三个称为互补决定区(在下文中，“CDR”)的高变区和四个框架区。CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3(从N末端开始依次编号)，并且还由特定CDR所位于的链来标识。
如本文所用，术语“人抗体”是指来源于人免疫球蛋白的分子，其中抗体(包括互补决定区和框架区)的全长氨基酸序列由人免疫球蛋白的氨基酸序列组成。人抗体通常用于治疗人疾病，并且可以具有三种或更多种有效的优点。第一，人抗体可以更容易地与人免疫系统相互作用，使得靶细胞可以通过例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)更高效地裂解。第二，存在人免疫系统不识别抗体作为外来抗体的优点。第三，存在甚至当药物以更小量以更低频率施用时其在人循环系统中的半衰期类似于天然存在的抗体的半衰期的优点。
另外，当本发明的抗体包含恒定区时，所述抗体可以包含来源于IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的恒定区或其组合或杂合体。
如本文所用，术语“组合”意指将编码相同来源的单链免疫球蛋白恒定区的多肽连接至不同来源的单链多肽以形成二聚体或多聚体。例如，二聚体或多聚体可以由选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM恒定区组成的组的两个或更多个恒定区形成。
如本文所用，术语“杂合体”意指对应于不同来源的两个或更多个免疫球蛋白重链恒定区的序列存在免疫球蛋白重链恒定区的单链中。例如，可能的杂合结构域可以由选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH1、CH2、CH3和CH4组成的组的一至四个结构域构成。
如本文所用，术语“特异性结合含胶原三螺旋重复序列1(CTHRC1)蛋白的抗体”是指能够通过结合CTHRC1蛋白而抑制CTHRC1蛋白的活性的抗体。
本发明的特异性结合CTHRC1的抗体的特征在于其以高亲和力结合人CTHRC1蛋白。
抗体可以包含(a)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1或11的重链CDR1、SEQ ID NO:2或12的重链CDR2和SEQ ID NO:3或13的重链CDR3；和(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4或14的轻链CDR1、SEQ ID NO:5或15的轻链CDR2和SEQ IDNO:6或16的轻链CDR3。
另外，本发明的抗体可以包括但不限于由SEQ ID NO:7、17、21或25的氨基酸序列组成的重链可变区；和由SEQ ID NO:9、19、23或27的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在本发明的一个实例中，对CTHRC1蛋白具有改善亲和力和特异性的本发明的抗体可以具体地包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ ID NO:3的重链CDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR1、SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:6的轻链CDR3；或者
重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:11的重链CDR1、SEQ ID NO:12的重链CDR2和SEQ ID NO:13的重链CDR3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14的轻链CDR1、SEQ ID NO:15的轻链CDR2和SEQ ID NO:16的轻链CDR3；但不限于此。
在本发明的一个实施方案中，将包含由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的轻链可变区的抗体命名为“4H5”或“cCMAb45”，并且将包含由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成的轻链可变区的抗体命名为“9E6”或“cCMAb96”。
另外，将包含由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成的轻链可变区的抗体命名为“4H5”或“hCMAb45”，并且将包含由SEQ IDNO:25的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的轻链可变区的抗体命名为“9E6”或“hCMAb96”。
在本发明的一个实施方案中，通过筛选结合CTHRC1蛋白的B淋巴细胞来选择对抗原具有最高亲和力的四种新型4H5、9E6、6C1和1D1抗体，并且作为确认四种抗体中4H5和9E6的表位的结果，确认4H5和9E6以高亲和力特异性结合CTHRC1蛋白，从而提供以上两种新型抗体。
这些结果表明本发明的结合CTHRC1蛋白的抗体可以有效地用于需要识别CTHRC1蛋白的领域中，例如用于诊断或治疗过表达CTHRC1蛋白的疾病中。
本发明的另一个方面提供了一种用于制备所述抗体的方法。
本发明的抗体可以通过常规抗体产生技术容易地制备。例如，用于制备单克隆抗体的方法可以通过使用获自免疫动物的B淋巴细胞产生杂交瘤进行(Koeher和Milstein,1976,Nature,256:495)或者可以使用噬菌体展示技术进行，但不限于此。用于制备多克隆抗体的方法可以使用常规抗体产生技术容易地制备。
使用噬菌体展示技术的抗体文库是在不制备杂交瘤的情况下在具有直接获自B淋巴细胞的抗体基因的噬菌体的表面上表达抗体的方法。与通过B细胞永生化产生单克隆抗体相关联的许多困难可以通过噬菌体展示技术克服。常规噬菌体展示包括以下步骤：1)将具有随机序列的寡核苷酸插入至与噬菌体外壳蛋白pIII(或pIV)的N末端对应的区域中；2)表达由天然外壳蛋白的一部分和由具有随机序列的以上寡核苷酸编码的多肽组成的融合蛋白；3)处理可以结合由寡核苷酸编码的多肽的物质；4)在低pH下或使用具有结合竞争性的分子洗脱与以上物质结合的肽-噬菌体颗粒；5)通过淘选扩增宿主细胞中的洗脱噬菌体；6)重复以上步骤以获得所需量的噬菌体；以及7)从通过淘选选择的噬菌体克隆的DNA序列中确定活性抗体的序列。
用于制备本发明的单克隆抗体的方法可以通过噬菌体展示技术进行。本发明所属领域中的技术人员可以参考熟知的噬菌体展示技术容易地进行以上步骤，所述熟知的噬菌体展示技术公开于例如Barbas等人(METHODS:A Companion to Methods in Enzymology2:119,1991J.Virol.2001年7月；75(14):6692-9)和Winter等人(Ann.Rev.Immunol.12:433,1994)中。可用于构建抗体文库的噬菌体的实例包括但不限于丝状噬菌体，诸如fd、M13、fl、If1、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pf1和Pf3。另外，可用于在丝状噬菌体的表面上表达异源基因的载体的实例包括但不限于噬菌体载体(诸如fUSE5、fAFF1、fd-CAT1或fdtetDOG)或噬菌粒载体(诸如pHEN1、pComb3、pComb8或pSEX)。此外，可用于提供为成功再感染重组噬菌体所需的天然外壳蛋白的辅助噬菌体的实例包括但不限于M13K07或VSCM13。
编码本发明的单克隆抗体克隆的多核苷酸可以使用常规程序容易地分离和测序，例如通过使用被设计来从噬菌体模板DNA特异性扩增感兴趣的重链区和轻链区的寡核苷酸引物来进行。一旦分离多核苷酸，就可以将其置于表达载体中，然后将所述表达载体引入至合适的宿主细胞中，并且可以由转化的宿主细胞(即转化体)制备所需的单克隆抗体。因此，用于制备人单克隆抗体的方法可以包括在包含编码人单克隆抗体的多核苷酸的表达载体中扩增编码人单克隆抗体的多核苷酸的步骤，但不限于此。
本发明的还另一个目的提供了一种编码所述抗体的多核苷酸；一种包含所述多核苷酸的表达载体；以及一种引入有所述表达载体的宿主细胞。
所述抗体如上所述。
包含编码根据本发明的抗体的多核苷酸的表达载体没有特别限制，但可以是能够在真核细胞或原核细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体，所述真核细胞或原核细胞包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(例如，大肠杆菌)。优选地，它可以是这样的载体，其包含至少一种选择性标记物，并且可操作地连接至合适的启动子，使得核苷酸可以在宿主细胞中表达。例如，载体可以呈将多核苷酸引入至噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体等中的形式。
包含编码抗体的多核苷酸的表达载体可以是包含编码抗体的重链或轻链的多核苷酸中的每一种的表达载体或包含编码抗体的重链或轻链的多核苷酸中的全部的表达载体。
表达载体所引入至的宿主细胞可以是但并非特别限于引入有表达载体的转化体，例如，细菌细胞诸如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyce)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)等；酵母细胞；真菌细胞诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等；昆虫细胞诸如果蝇属(Drosophila)、灰翅夜蛾属(Spodoptera)、Sf9细胞等；动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、人类淋巴母细胞、COS(猴肾纤维母细胞)、NSO(小鼠骨髓瘤)、293T、Bowes黑色素瘤细胞、HT-1080、BHK(幼仓鼠肾细胞)、HEK(人胚胎肾细胞)、PERC.6(人视网膜细胞)等；以及植物细胞。
如本文所用，术语“引入”是指将包含编码抗体的多核苷酸的载体递送至宿主细胞中。这种引入可以通过本领域已知的各种方法进行，所述各种方法诸如磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体介导的转染、脂质体融合、脂质转染和原生质体融合。另外，转染意指通过使用病毒颗粒的感染将所需物质递送至细胞中。此外，载体可以通过基因轰击等引入至宿主细胞中。在本发明中，引入可以与转染互换使用。
本发明的又另一个方面提供了一种包含所述抗体的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
抗体以高亲和力结合CTHRC1蛋白(其过表达于癌症中并且已知在癌细胞的生长和转移中起重要作用)，导致CTHRC1蛋白的抑制、中和和/或细胞毒性反应，并且从而使得预防或治疗过表达CTHRC1蛋白的疾病。所述抗体如上所述。
如本文所用，术语“癌症”非限制地是指可以通过本发明的抗体预防或治疗的任何种类的癌症。其实例可以包括但不限于胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、宫颈癌、胃癌、肺癌、结直肠癌、口腔癌和膀胱癌。如本文所用，术语“预防”是指通过施用组合物来抑制或延迟癌症发生的所有行为，并且术语“治疗”是指通过施用组合物来恢复或有益地改变癌症症状的所有行为。
药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不对生物体引起刺激并且不消除所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。可用于配制呈液体溶液形式的组合物的药学上可接受的载体的实例包括盐水溶液、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水溶液、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及其一种或多种的混合物。如果需要，则组合物还可以含有其他常规添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等。此外，组合物可以另外含有稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，以便将组合物配制成可注射配制品，诸如水性溶液、悬浮液和乳液等、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。
药物组合物可以呈各种口服或肠胃外配制品的形式。药物组合物使用常规稀释剂或赋形剂来配制，所述常规稀释剂或赋形剂包括填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。用于口服施用的固体配制品包括片剂、丸剂、粉末、颗粒剂、胶囊等。这些固体配制品可以通过以下方式制备：将至少一种化合物与一种或多种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等混合。除了简单赋形剂之外，还可以使用润滑剂，诸如硬脂酸镁、滑石等。另外，用于口服施用的液体配制品包括悬浮液、内用溶液、乳液和糖浆等。除了水(常用作简单稀释剂)和液体石蜡之外，可以包含各种赋形剂，例如，润湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的配制品包括灭菌的水性溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳液、冷冻干燥剂、栓剂等。丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油、可注射酯诸如油酸乙酯等可用作非水性溶剂和悬浮剂。用于栓剂的基质可以包括witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂精脂、甘油化明胶等。
药物组合物可以具有选自由以下组成的组的任一种配制品：片剂、丸剂、粉末、颗粒剂、胶囊、悬浮液、内用溶液、乳液、糖浆、灭菌的水性溶液、非水性溶液、冷冻干燥剂和栓剂。
本发明的组合物可以以药学有效量施用。
如本文所用，术语“药学有效量”是指足以以适用于任何医学治疗的合理效益/风险比治疗疾病的量。组合物的有效剂量水平可以根据以下确定：受试者类型、疾病严重程度、受试者年龄和性别、癌症类型、药物活性、药物敏感性、施用时间、施用途径、排泄率、治疗持续时间、包括与组合物组合使用的药物的因素以及医学领域中已知的其他因素。本发明的组合物可以单独地或与其他治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂依序或同时施用。另外，组合物可以在单剂型或多剂型中施用。重要的是，鉴于所有上述因素，以可以表现出最大效果而不引起副作用的最小量施用组合物，并且最小量可以由本领域技术人员容易地确定。
本发明的甚至另一个方面提供了一种用于使用所述抗体治疗癌症的方法。
所述抗体和癌症如上所述。
用于治疗癌症的方法可以是包括以下步骤的用于治疗癌症的方法：将包含抗体和药学上可接受的载体的药物组合物施用至患有癌症或疑似患有癌症的受试者。在本文中，药学上可接受的载体如上所述。用于治疗癌症的方法可以具体地是包括以下步骤的用于治疗癌症的方法：将包含抗体的组合物施用至患有癌症的受试者。
受试者的实例包括哺乳动物，包括牛、猪、羊、鸡、狗、人等和鸟。受试者可以是其中癌症待通过施用本发明的组合物治疗的任何受试者。
特别地，组合物可以在单剂型或多剂型中以药学有效量施用。在本文中，组合物可以以液体、粉末、气溶胶、胶囊、肠溶包衣片剂或胶囊、或栓剂的形式施用。此外，组合物可以腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内或直肠内施用，但不限于此。然而，当口服施用组合物时，肽在胃中被消化，并且为此，口服组合物应被配制为使得活性成分被包衣或保护而免于在胃中分解。此外，药物组合物可以使用能够将活性成分递送至靶细胞的任何装置施用。
本发明的进一步另一个方面提供了一种提供用于诊断癌症的信息的方法，其包括使用所述抗体通过抗原-抗体反应检测从疑似患有癌症的受试者分离的生物样品中的CTHRC1蛋白。另外，所述方法可以是用于诊断癌症的方法。
本发明的还进一步另一个方面提供了一种提供用于预测癌症预后的信息的方法，其包括使用所述抗体通过抗原-抗体反应检测从罹患癌症的受试者分离的生物样品中的CTHRC1蛋白。此外，所述方法可以是用于预测癌症预后的方法。所述抗体、癌症、受试者和CTHRC1蛋白如上所述。因为已知CTHRC1蛋白过表达于各种癌症中，所以本发明的抗体可以有效地用于诊断已知过表达CTHRC1蛋白的癌症。此外，还已经报道CTHRC1蛋白的过表达诱导与转移相关的上皮-间质转化(EMT)且由此与不良癌症预后相关联。因此，根据本发明的抗体可以有效地用于预测癌症预后。
提供用于诊断癌症或预测癌症预后的信息的方法能够通过以下方式实现对CTHRC1蛋白的检测：使本发明的对CTHRC1具有特异性的人单克隆抗体与从疑似患有癌症或罹患癌症的受试者分离的生物样品反应，并且检测抗原-抗体复合物的形成，从而提供用于诊断癌症或预测癌症预后的信息。
具体地，所述方法可以是包括以下步骤的提供用于诊断癌症的信息的方法或用于诊断癌症的方法：(a)用抗体处理从疑似患有癌症的受试者分离的生物样品，以通过抗原-抗体反应检测CTHRC1蛋白；和(b)将步骤(a)中检测的CTHRC1蛋白的水平与对照组中的所述水平进行比较，并且如果生物样品中CTHRC1蛋白的水平高于对照组中的所述水平，则将受试者判断为癌症患者。
具体地，所述方法可以是包括以下步骤的提供用于预测癌症预后的信息的方法或用于预测癌症预后的方法：(a)用抗体处理从罹患癌症的受试者分离的生物样品，以通过抗原-抗体反应检测CTHRC1蛋白；和(b)将步骤(a)中检测的CTHRC1蛋白的水平与对照组中的所述水平进行比较。
如本文所用，术语“生物样品”意指包括组织、细胞、全血、血清、血浆、组织解剖样品(脑、皮肤、淋巴结、脊髓等)、细胞培养上清液、破裂的真核细胞和细菌表达系统等，但不限于此。可以使这些生物样品与操纵或非操纵状态下的抗体反应，以便确定CTHRC1蛋白的存在或者癌症的存在或不存在。
如本文所用，术语“抗原-抗体复合物”是指样品中的CTHRC1蛋白抗原与本发明的识别CTHRC1蛋白抗原的单克隆抗体之间的缀合物。这种抗原-抗体复合物的形成可以通过选自由以下组成的组的任何方法来检测：比色法、电化学法、荧光法、发光法、颗粒计数法、视觉评估和闪烁计数法，但不限于此，并且可以使用各种方法。
在本发明中，可以使用各种标记来检测抗原-抗体复合物。标记的具体实例包括但不限于酶、荧光材料、配体、发光材料、微粒和放射性同位素。
可用作检测标记的酶的实例包括乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、βD-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、β-内酰胺酶等。荧光材料的实例包括荧光素、Eu3+、Eu3+螯合物、穴状化合物等。配体的实例包括生物素衍生物等，并且发光材料的实例包括吖啶酯、异鲁米诺衍生物等。此外，微粒的实例包括胶体金、有色胶乳等，并且放射性同位素的实例包括57Co、3H、125I和125I-巴顿亨特(Bonton Hunter)试剂等。
优选地，抗原-抗体复合物可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测。ELISA的实例包括各种ELISA，诸如直接ELISA，其使用识别附接至固相支持物的抗原的标记抗体；间接ELISA，其使用识别抗体复合物中的捕获抗体的标记二抗，所述捕获抗体识别附接至固相支持物的抗原；直接夹心ELISA，其使用识别附接至固相支持物的抗原-抗体复合物中的抗原的另一标记抗体；间接夹心ELISA，其涉及使抗原与附接至固相支持物的抗原-抗体复合物中的另一种抗体反应并且使用识别另一种抗体的标记二抗；以及竞争性ELISA，其涉及具有相同抗体结合位点的不同抗原之间的竞争；等等。
单克隆抗体可以具有检测标记。如果单克隆抗体不具有检测标记，则其可以通过用具有检测标记的另一种抗体处理而被捕获和检测。
本发明的仍进一步另一个方面提供了一种用于诊断癌症或预测癌症预后的组合物。
所述抗体和癌症与上述相同。通过使用包含本发明的对CTHRC1蛋白具有特异性的抗体的用于诊断癌症或预测癌症预后的组合物可以诊断与CTHRC1蛋白的表达或表达水平相关的疾病(诸如癌症)、或预测癌症预后。
本发明的还进一步另一个方面提供了一种用于诊断癌症或预测癌症预后的试剂盒，其包括用于诊断癌症或预测癌症预后的所述组合物。
所述组合物和癌症与上述相同。此外，用于诊断癌症的试剂盒可以进一步包括具有适于测定方法的一种或多种其他组分的组合物、溶液或装置。
本发明的还进一步另一个方面提供了一种用于检测CTHRC1蛋白的组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒包括特异性结合含胶原三螺旋重复序列1(CTHRC1)蛋白的抗体。
本发明的还进一步另一个方面提供了一种用于检测样品中的CTHRC1蛋白的方法，其包括使用特异性结合CTHRC1的所述抗体检测CTHRC1抗原-抗体复合物。所述检测方法可以用于定量缀合物疫苗。
如本文所用，术语“抗原-抗体复合物”是指样品中的相关抗原与识别抗原的抗体之间的缀合物。抗原-抗体复合物的检测可以使用本领域熟知的任何方法进行，所述任何方法例如光谱学法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、电法、吸收光谱法、化学法以及其他方法。具体地，其可以通过选自由以下组成的组的任何方法来检测：比色法、电化学法、荧光法、发光法、颗粒计数法、视觉评估和闪烁计数法，以及蛋白质印迹法、ELISA法、放射免疫测定法、放射免疫扩散法、Ouchterlony免疫扩散法、火箭免疫电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法、补体固定测定法、流式细胞术(FACS)法、蛋白芯片法等，但所述方法不限于此。
在本发明中，可以使用各种标记来检测抗原-抗体复合物。标记的具体实例包括但不限于酶、荧光材料、配体、发光材料、微粒和放射性同位素。
可用作检测标记的酶的实例包括乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、βD-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、β-内酰胺酶等。荧光材料的实例包括荧光素、Eu3+、Eu3+螯合物、穴状化合物等。配体的实例包括生物素衍生物等，并且发光材料的实例包括吖啶酯、异鲁米诺衍生物等。此外，微粒的实例包括胶体金、有色胶乳等，并且放射性同位素的实例包括57Co、3H、125I和125I-巴顿亨特试剂等。这些材料不限于此。
本发明的试剂盒可以呈酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒的形式。具体地，试剂盒可以包括上述抗体作为捕获抗体，并且ELISA可以包括(i)结合CTHRC1的多克隆抗体；(ii)呈特异性结合含胶原三螺旋重复序列1(CTHRC1)蛋白的抗体的形式的捕获抗体；以及(iii)与检测标记IgG Fc结合的抗体；但不限于此。
如本文所用，术语“酶联免疫吸附测定(ELISA)”还称为酶免疫测定法，并且是一种用于通过使酶与用于形成抗原-抗体复合物的抗体结合，经由酶与底物的反应使用吸光度定量的方法。ELISA的实例包括各种ELISA，诸如直接ELISA，其使用识别附接至固相支持物的抗原的标记抗体；间接ELISA，其使用识别抗体复合物中的捕获抗体的标记二抗，所述捕获抗体识别附接至固相支持物的抗原；直接夹心ELISA，其使用识别附接至固相支持物的抗原-抗体复合物中的抗原的另一标记抗体；间接夹心ELISA，其涉及使抗原与附接至固相支持物的抗原-抗体复合物中的另一种抗体反应并且使用识别另一种抗体的标记二抗；以及竞争性ELISA，其涉及具有相同抗体结合位点的不同抗原之间的竞争；等等。
非常痕量的CTHRC1蛋白可以使用以下来检测：本发明的特异性结合CTHRC1蛋白的抗体；包含所述抗体的用于检测的组合物；试剂盒；以及用于使用所述抗体检测CTHRC1蛋白的方法。待检测的蛋白质的量可以具体地小于1mg、小于100μg，并且更具体地小于10μg、小于1μg、小于100ng、小于10ng且小于1ng。
在本发明的一个实施方案中，确认可以通过使用特异性结合CTHRC1的4H5和9E6抗体作为捕获抗体进行间接ELISA检测数ng水平的CTHRC1蛋白，并且也可以通过ELISA检测缀合物疫苗。
如上所述，相比于用于检测CTHRC1蛋白的常规试剂盒，可以通过使用本发明的抗体检测非常小量的CTHRC1蛋白。因此，本发明的抗体可以有效地用于定量CTHRC1蛋白和使用所述蛋白的疫苗。
[进行本发明的模式]
在下文中，将通过实施例和实验实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例和实验实施例仅出于说明性目的而给出，并且本发明的范围不旨在限于这些实施例和实验实施例或受其限制。
<实施例1：小鼠抗体cCMAb45和cCMAb96>
实施例1-1：4H5和9E6的发现
为了开发靶向CTHRC1蛋白的抗体，发现了结合CTHRC1蛋白的小鼠单克隆抗体。具体地，一旦通过将CTHRC1蛋白注射至小鼠中产生针对CTHRC1蛋白的抗体，就将B淋巴细胞从小鼠的脾脏中分离。将分离的淋巴细胞稀释，使得仅允许一个B淋巴细胞进入包被有CTHRC1蛋白的96孔板的每个孔。然后，使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠抗体筛选结合CTHRC1蛋白的B淋巴细胞。
结果是，发现了四种抗CTHRC1小鼠单克隆抗体(4H5、9E6、6C1和1D1)。
实施例1-2：对CTHRC1的亲和力的确认
进行间接ELISA以便在实施例1-1中发现的四种抗CTHRC1小鼠单克隆抗体中鉴定对CTHRC1蛋白具有最高亲和力的抗体。
将包被有CTHRC1-Fc和CTHRC1-His的免疫板用不同浓度的四种抗体(4H5、9E6、6C1和1D1)处理并且反应2小时，并且使用HRP标记的抗小鼠抗体作为二抗来测量OD(光密度)值。特别地，更高的OD值指示抗体以更高的亲和力结合CTHRC1。
结果是，确认尽管所有四种抗体的OD值根据CTHRC1蛋白的浓度增加，但两种抗体(4H5和9E6)相比于其他抗体以更高的亲和力结合CTHRC1蛋白(图1)。
实施例1-3：表位的确认
为了确认四种抗CTHRC1小鼠抗体中具有高亲和力的4H5和9E6的表位，进行竞争性ELISA。特别地，表位是指抗原的由抗体识别的位置。
用CTHRC1蛋白包被免疫板，并且然后以1:0、1:3、1:6、1:12.5、1:25、1:50和1:100的比率向其中添加生物素标记的4H5和9E6抗体和未用生物素标记的抗体。使用链霉亲和素-HRP作为二抗测量每种抗体的OD值。特别地，当两种抗体(4H5和9E6)具有相同表位时，OD值随着未标记抗体的浓度增加而降低，而当两种抗体的表位彼此不同时，甚至当增加未标记抗体的浓度时OD值不改变。
结果是，确认4H5和9E6彼此具有不同的表位(图2)。
实施例1-4：嵌合抗体cCMAb45和cCMAb96的制备
为了最小化对CTHRC1具有特异性并且具有高亲和力的4H5和9E6小鼠抗体的免疫原性，制备嵌合抗体，其中保留小鼠抗体的可变区并且仅将其恒定区用人来源蛋白替代。将所得抗体命名为cCMAb45和cCMAb96。
实施例1-5：亲和力分析(间接ELISA)
验证了在实施例1-3中制备的作为抗CTHRC1嵌合抗体的cCMAb45和cCMAb96对CTHRC1蛋白的亲和力。进行间接ELISA以测试抗原和抗体的亲和力。
将100μL CTHRC1以5μg/mL的浓度分配至免疫板上并且在4℃下包被过夜。第二天，弃置包被的CTHRC1溶液并且封闭2小时。此后，将cCMAb45和cCMAb96抗体以不同浓度处理并且在室温下反应2小时，并且弃置抗体以去除未结合的抗体，并且然后洗涤板。使用抗人Fc-HRP作为识别人恒定区的二抗来测量OD值。特别地，更高的OD值指示CTHRC1与抗体之间的更高亲和力。
结果是，cCMAb45显示出5.2×10-10M的KD值，并且cCMAb96显示出4.3×10-10M的KD值。确认两种抗体对CTHRC1蛋白显示出非常高的亲和力(图3)。
实施例1-6：特异性分析(间接ELISA)
进行间接ELISA以确认cCMAb45和cCMAb96是否特异性结合CTHRC1。如在亲和力分析中，将免疫板用CTHRC1蛋白和多种非特异性抗原性蛋白包被。第二天，弃置包被溶液并且封闭，并且将cCMAb45和cCMAb96以0μg/mL、1μg/mL和5μg/mL的浓度添加至其中，并且反应2小时。此后，弃置含有抗体的溶液并洗涤以去除未结合的抗体。使用抗人κ轻链-HRP作为二抗以测量OD值。
结果是，确认cCMAb45和cCMAb96对CTHRC1显示出高特异性(图3)。
实施例1-7：对癌细胞迁移的抑制性作用的确认
为了验证cCMAb45和cCMAb96的治疗性功效，使用胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和膀胱癌细胞系确认对迁移的抑制性作用。
具体地，将cCMAb45和cCMAb96以1μg/mL和5μg/mL或1μg/mL和10μg/mL的浓度制备，与细胞系一起稀释于无血清培养基中，并且分配至Transwell的上部腔室中。将含有血清的培养基放置于下部腔室中以产生细胞可以迁移的环境。通过将抗体在每种细胞系中培养适当时间来测量迁移细胞数。
结果是，确认相比于对照IgG组，在用cCMAb45和cCMAb96处理的组中癌细胞的迁移程度显著降低(图4至7)。
实施例1-8：对癌细胞侵入性的抑制性作用的确认
以与实施例1至7中相同的方式，为了验证cCMAb45和cCMAb96的功效，确认对癌细胞侵入性的抑制性作用。使用胰腺癌、患者来源胰腺癌细胞系、乳腺癌、卵巢癌和膀胱癌进行实验。
将Transwell的上部腔室用可以人工模拟细胞外基质的Matrigel包被，并且观察癌细胞的侵入性能力。将cCMAb45和cCMAb96以1μg/mL和5μg/mL或1μg/mL和10μg/mL的浓度制备，与细胞系一起稀释于无血清培养基中，并且分配至Transwell的上部腔室中。将含有血清的培养基放置于下部腔室中。在将抗体培养一定时间段之后，测量通过侵入Matrigel迁移的细胞数。
结果是，确认相比于对照IgG组，在用cCMAb45和cCMAb96处理的组中癌细胞的侵入性能力降低(图8至12)。
<实施例2：人源化hCMAb45和hCMAb96抗体>
实施例2-1：人源化抗体文库的构建
为了降低作为抗CTHRC1嵌合抗体的cCMAb45和cCMAb96的免疫原性，制备人源化抗体，其中除了作为抗原结合的最重要部分的CDR区以外，将保持CDR区的框架区(在下文中称为“FR”)用人的框架区替代。
使用CDR移植技术构建具有包括cCMAb45和cCMAb96的CDR区的各种FR区的人源化抗体文库。
实施例2-2：人源化抗体的选择和IgG转化
从以上构建的人源化抗体文库中选择对CTHRC1具有特异性并且具有高亲和力的克隆。在HEK293F细胞上进行IgG瞬时表达测试以针对4H5和9E6纯化八种抗体中的每一种，并且通过SDS-PAGE确认纯度。
结果是，4H5人源化抗体的产量测量为15mg/L至67.3mg/L，并且9E6人源化抗体的产量测量为3.1mg/L至33.3mg/L(图13)。
实施例2-3：对人源化抗体的亲和力的分析
对实施例2-2中制备的4H5的八种候选克隆进行间接ELISA以分析亲和力。将免疫板用CTHRC1-His包被，并且第二天，将八种人源化候选抗体和cCMAb45的浓度从500ng/mL的最大浓度按1/3逐步稀释，并且添加至板。使用抗人Fc-HRP作为二抗来测量OD值。将亲和力表达为KD值。低KD值指示高亲和力。
结果是，人源化抗体的KD值测量为与cCMAb45的KD值相似或比其更低。
作为以与上文相同的方式分析9E6人源化抗体的八种候选克隆的结果，9E6人源化抗体的KD值测量为与cCMAb96的KD值相似或比其稍微更高。
具体地，确认4H5人源化抗体的亲和力测量为0.82×10-10M至2.5×10-10M，并且9E6人源化抗体的亲和力测量为1.61×10-10M至4.8×10-10M(图14)。
实施例2-4：人源化抗体的功效测试
为了测试4H5和9E6人源化抗体的候选克隆的疗效，使用胰腺癌细胞系Panc-1进行迁移测定。将5μg/mL的每种抗体和5×104个细胞用无血清培养基稀释，并且分配至Transwell的上部腔室中。然后，将含有血清的培养基放置于下部腔室中以产生细胞可以迁移的环境。通过将抗体培养24小时来测量迁移细胞数，并且评价候选抗体的功效。
结果是，确认相比于对照IgG，在用cCMAb45和cCMAb96处理的组中癌细胞的迁移程度显著降低(图4至7)。
结果是，相比于对照IgG，4H5人源化抗体的候选克隆将细胞迁移能力降低30％至50％，并且9E6人源化抗体的候选克隆将细胞迁移能力降低30％至40％。总之，确认4H5和9E6人源化抗体的所有候选物具有与cCMAb45和cCMAb96相似或比其更高的功效(图15)。
实施例2-5：人源化抗体的选择以及亲和力和功效的重新评价
通过基于以下三个标准评价4H5和9E6人源化抗体的候选克隆来选择抗体：亲和力、功效和产量。对于4H5人源化抗体选择SA2759、SA2761、SA2762，并且对于9E6人源化抗体选择SA2768、SA2769和SA2770。
为了重新评价基于以上标准选择的抗体的亲和力和功效，将间接ELISA用于评价亲和力，并且将迁移测定用于评估功效。实验方法与实施例2-3和2-4中所述的相同。
结果是，关于亲和力，确认KD值测量为与cCMAb45和cCMAb96的KD值相似或比其更低，这类似于第一测量，并且还将细胞迁移能力降低30％至50％。具体地，确认选择的4H5人源化抗体具有数pM的亲和力并且将细胞迁移能力降低40％，并且9E6人源化抗体具有数十pM的亲和力并且将细胞迁移能力降低50％(图16和17)。
最终，将SA2765命名为hCMAb45，并且将SA2770命名为hCMAb96。
实施例2-6：对hCMAb45和hCMAb96的特异性的分析
进行间接ELISA以确定hCMAb45和hCMAb96是否特异性结合CTHRC1。将免疫板用CTHRC1-His和多种非特异性抗原包被。第二天，使hCMAb45和hCMAb96以0μg/mL、1μg/mL和5μg/mL的浓度与抗原反应，并且然后使用抗人κ轻链-HRP作为二抗来测量OD值。
结果是，确认hCMAb45和hCMAb96特异性结合CTHRC1(图18)。
实施例2-7：对癌细胞迁移的抑制性作用的确认
为了验证hCMAb45和hCMAb96的治疗性功效，确认对癌细胞迁移的抑制性作用。使用胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌和恶性黑色素瘤，并且实验方法与实施例1-7中所述的实验方法相同。
结果是，确认相比于对照IgG，在用hCMAb45和hCMAb96处理的组中癌细胞的迁移能力显著降低(图19至22)。
实施例2-8：对癌细胞侵入性的抑制性作用的确认
以与实施例1-8中所述的实验方法相同的方式，确认hCMAb45和hCMAb96对癌细胞侵入性的抑制性作用。
结果是，相比于对照IgG，在用hCMAb45和hCMAb96处理的组中癌细胞的侵入性能力显著降低(图23至26)。
实施例2-9：在胰腺癌动物模型中的体内抗癌作用的确认
通过实施例2-7和2-8体外确认了特异性结合CTHRC1蛋白的hCMAb45和hCMAb96人源化抗体对癌细胞迁移和侵入性的抑制性作用。因此，确认是否在体内同一地观察到抗癌作用。具体地，使用过表达CTHRC1的胰腺癌细胞系BxPC-3制备皮下异种移植小鼠模型。将1×106个细胞皮下移植在小鼠的右腿中，并且在6天之后，选择发展有大小为73mm3至77mm3的肿瘤的小鼠并且将其分组。将药物注射至尾静脉中，并且将对照IgG以及hCMAb45和hCMAb96实验组每周两次以10mg/kg的剂量施用，持续共4周，并且使用卡尺每周两次测量肿瘤的大小。在抗体治疗之后，在第28天(治疗8)终止实验，并且相对于对照IgG的肿瘤大小比较肿瘤大小。
结果是，确认与用与对照IgG施用的组相比，用hCMAb45和hCMAb96施用的组中肿瘤的大小减少(图27)。特别地，确认与用hCMAb45治疗的组相比，用hCMAb96治疗的组具有优异的抗癌作用。
通过以上实施例，确认了特异性结合CTHRC1的hCMAb45和hCMAb96人源化抗体的体内抗癌作用，并且验证了它们作为延迟或抑制肿瘤生长的物质的潜力。
根据前述，本发明所属领域的技术人员将能够理解，在不改变本发明的技术概念或基本特征的情况下，本发明可以实施为其他具体形式。就这一点而言，本文公开的示例性实施方案仅出于说明性目的并且不应理解为限制本发明的范围。本发明的范围因此是由所附权利要求而不是由前述描述来指示。处于权利要求的等效意义和范围内的所有改变都应涵盖在本发明的范围内。
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<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4H5-VH-CDR1
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Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ile
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4H5-VH-CDR2
<400> 2
Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 4H5-VH-CDR3
<400> 3
Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4H5-VL-CDR1
<400> 4
Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 4H5-VL-CDR2
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Leu Val Ser
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<223> 4H5-VL-CDR3
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Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr
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<220>
<223> cCMAb45-重链
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cCMAb45-重链
<400> 8
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tgctctgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggaaat attaatcctt actatggtag tactagctac 180
aatctgaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag cacagcctac 240
atgcagctca acagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatcgggc 300
tatggttacg acgagagtgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 9
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly
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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser
85 90 95
Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cCMAb45-轻链
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gatgttttga tgacccaaac tccactctct ctgcctgtca atattggaga tcaagcctct 60
atctcttgca agtctactaa gagtcttctg aatagtgatg gattcactta tttggactgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctaatat atttggtttc taatcgattt 180
tctggagttc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct tccagagtaa ctatcttcct 300
ctcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336
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<220>
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<223> 9E6-VH-CDR3
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<213> 人工序列
<220>
<223> 9E6-VL-CDR1
<400> 14
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Lys Ala Ser
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<220>
<223> cCMAb96-重链
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Thr Glu Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
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<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cCMAb96-重链
<400> 18
caggtccaac tgcagcagcc tgggtctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacattcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggaaat atttatccta gtagtggtac tactaactac 180
gatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca catcctccac cacagcctac 240
atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aacagagtct 300
tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cCMAb96-轻链
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cCMAb96-轻链
<400> 20
gacattgtga tgacccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60
atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120
ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180
aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atcctctgac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCMAb45-重链
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Ile Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Val Tyr Gly Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Gly Ser Met Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCMAb45-重链
<400> 22
caggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg cttctggtta ttcattcact gactacatca tattatgggt gcggcaggcg 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagca attaatcctt actatggtag tactgtgtac 180
gggcagaagt tccagggcag actcaccatt accgcggacg ggtctatgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac actgcagtct attactgtgc aagatcgggc 300
tatggttacg acgagagtgc tatggactac tggggtcaag gaaccctagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCMAb45-轻链
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser
85 90 95
Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCMAb45-轻链
<400> 24
gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctct 60
atctcttgcc ggtctagtaa gagtcttctg aatagtgatg gattcactta tttggactgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctaatat atttggtttc taatcgattt 180
tctggagttc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattattgct tccagagtaa ctatcttcct 300
ctcacgttcg gccaggggac aaagttggaa ataaaa 336
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<212> PRT
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<220>
<223> hCMAb96-重链
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Pro Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Glu Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> hCMAb96-重链
<400> 26
caggtccaac tggtacagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtc 60
tcctgtaagg cttctggcta cacattcacc agctactgga tgcactgggt ccgtcaagct 120
ccgggacaag ggctggagtg gattggatat atttatccta gtagtggtac tactaactac 180
aaccaaaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gccccctgag atctgaggac acagcggtct attactgtac aacagagtct 300
tactggggcc agggaaccac tgtcaccgtc tcctca 336
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCMAb96-轻链
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCMAb96-轻链
<400> 28
gacattcaga tgacccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60
atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacagtgg cgtcccatca 180
aggtttagtg gcagtggatc tggaacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atcctctgac gttcggccag 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321

Claims (18)

1.一种特异性结合含胶原三螺旋重复序列1(CTHRC1)蛋白的抗体，其包含：(a)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1或11的重链CDR1、SEQ ID NO:2或12的重链CDR2和SEQ ID NO:3或13的重链CDR3；以及
(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4或14的轻链CDR1、SEQ ID NO:5或15的轻链CDR2和SEQ ID NO:6或16的轻链CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ ID NO:3的重链CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的轻链CDR1、SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:6的轻链CDR3。
3.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:11的重链CDR1、SEQ ID NO:12的重链CDR2和SEQ ID NO:13的重链CDR3；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14的轻链CDR1、SEQ ID NO:15的轻链CDR2和SEQ ID NO:16的轻链CDR3。
4.如权利要求1所述的抗体，其中所述重链可变区由SEQ ID NO:7、17、21或25的氨基酸序列组成；并且所述轻链可变区由SEQ ID NO:9、19、23或27的氨基酸序列组成。
5.一种多核苷酸，其编码如权利要求1至4中任一项所述的抗体。
6.一种表达载体，其包含如权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其包含如权利要求6所述的表达载体。
8.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含如权利要求1至4中任一项所述的抗体。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、肺癌、结肠直肠癌、口腔癌、宫颈癌和膀胱癌。
10.一种提供用于诊断癌症的信息的方法，其包括使用如权利要求1至4中任一项所述的抗体通过抗原-抗体反应检测从疑似患有癌症的受试者分离的生物样品中的CTHRC1蛋白。
11.一种提供用于预测癌症预后的信息的方法，其包括使用如权利要求1至4中任一项所述的抗体通过抗原-抗体反应检测从罹患癌症的受试者分离的生物样品中的CTHRC1蛋白。
12.一种用于诊断癌症或预测癌症预后的组合物，其包含如权利要求1至4中任一项所述的抗体。
13.一种用于诊断癌症或预测癌症预后的试剂盒，其包括如权利要求12所述的组合物。
14.一种用于检测CTHRC1的试剂盒，其包括如权利要求1至4中任一项所述的抗体。
15.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒呈ELISA的形式。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述抗体是捕获抗体。
17.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述ELISA是间接ELISA，其包括：
(i)结合CTHRC1的多克隆抗体；
(ii)呈如权利要求1至4中任一项所述的抗体的形式的捕获抗体；以及
(iii)与检测标记IgG Fc结合的抗体。
18.一种用于检测样品中的CTHRC1蛋白的方法，其包括使用如权利要求1至4中任一项所述的抗体检测CTHRC1抗原-抗体复合物。
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