CN105658799A - 用于抗体表达的双顺反子表达载体以及用其生产抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于抗体表达的双顺反子表达载体、借助该表达载体转化的动物细胞和产生抗体的方法，包括培养该动物细胞的步骤，其中该表达载体包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“启动子-UTR-内含子-抗体轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“启动子-UTR-内含子-抗体重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。通过利用本发明的用于抗体表达的包含内含子的双顺反子表达载体，可以构建能够高效表达所需抗体的表达载体，通过培养借助该表达载体转化的动物细胞能够稳定而高效地产生抗体。

Description

用于抗体表达的双顺反子表达载体以及用其生产抗体的方法
技术领域
本发明涉及用于抗体表达的双顺反子表达载体、用该表达载体转染的动物细胞、和包括培养该动物细胞的抗体生产方法，其中所述表达载体包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-抗体轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“启动子-UTR-内含子-抗体重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
背景技术
通过遗传重组已经产生了各种人蛋白。然而，由于真核细胞专有的一系列过程，例如糖基化和磷酸化，具有正常生物学活性的蛋白往往只在利用哺乳动物细胞时合成。常用作治疗性抗体的免疫球蛋白G(IgG)基因由重链基因和轻链基因构成。各自基因产生的重链和轻链在胞内的折叠过程中连接并释放出细胞。作为哺乳动物细胞的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞常用于产生重组抗体(Kaufman等.,Mol.Cell.Biol.(1985)5,1750)。
在用于构建能在哺乳动物细胞中诱导更强而稳定的基因表达的重组表达载体的各种方法中，代表性的方法是通过选择强启动子来增加基因表达效率。启动子是DNA上一位点，其中由于存在各种转录因子的结合位点和TATA盒，RNA聚合酶能与之结合并启动mRNA合成，而基因表达水平在很大程度上取决于该启动子的性能而有所不同。为改进抗体的表达，诱导高的组成型表达是合适的，代表性的强启动子的例子可包括猿病毒40(SV40)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、延长因子1-α(EF1-α)启动子等。
除了利用强启动子增加载体本身合成mRNA的能力的方法，可采用基因扩增系统来增加治疗性蛋白的生产率。这种方法概述如下。细胞用外来基因转染，并且只有该外来基因掺入染色体的细胞可通过添加化学物质得到选择性培养。然后，分离选择性培养的细胞，将用量增加的化学物质加入细胞培养物以诱导掺入到选择性培养的细胞的染色体中的外来基因扩增。基因扩增中使用的代表基因包括二氢叶酸还原酶(在下文中，DHFR)和谷氨酰胺合成酶(在下文中，GS)。用于扩增扩增基因的化学物质类型包括用于DHFR的甲氨蝶呤(在下文中，MTX)和用于GS的甲硫氨酸亚砜胺(在下文中，MSX)。可以通过基因扩增方法制备含有高于1000拷贝的扩增的外来基因的细胞系。
构建能组成型表达抗体基因的细胞系的常规方法包括这样的方法，其中将包含所需重链和轻链基因的质粒载体DNA与具有扩增基因的载体DNA共同转染入细胞，并分离在染色体中整合了两种载体DNA的细胞系(Kaufman,MethodsinEnz.(1990)185,487)，或是这样的方法，其中利用SV40启动子构建表达扩增基因的载体，然后分离在染色体中整合了载体的细胞系。
作为表达扩增基因的另一方法，可利用双顺反子载体(bicistronicvector)。与原核细胞不同，真核细胞在原则上通过一个启动子产生单一的mRNA，仅翻译相应的基因以合成蛋白质。然而，一些病毒在它们mRNA序列的中部具有核糖体结合序列，因此可以从单一mRNA合成多个蛋白。当抗体基因和扩增基因由不同启动子表达时，可能仅有扩增基因而非抗体基因在基因扩增期间扩增。然而，可利用内部核糖体进入位点(IRES)解决该问题，从而利用同一启动子表达(多个)基因。然而，利用双顺反子载体的方法也具有不能大规模制备所需蛋白的缺点，因此需要更强大的方法。
同时，贝伐单抗(也称为)是基因泰克(Genentech，美国)开发的针对VEGF的人源化抗体，其起到血管生成抑制剂的作用，并作为主要用于治疗结肠直肠癌、肺癌、肾癌、脑癌等的治疗性抗体已得到广泛关注。托珠单抗(Tocilizumab,也称为)是由罗氏公司(Roche，瑞士制药公司)开发的针对IL-6受体的人单克隆抗体，已在美国、欧洲和日本以Actemra为产品名称批准作为类风湿性关节炎的治疗剂。狄诺塞麦(Denosumab，也称为)是安进公司(Amgen，美国)开发的针对NF-kB配体(RANKL)的受体激活剂的人单克隆抗体，已在美国、加拿大和欧洲以Prolia为产品名称批准作为骨质疏松症的治疗剂，还在欧洲以Xgeva为产品名称批准作为预防具有实体癌骨转移的患者骨折的药物。
同时，贝利单抗(belimumab，也称为)是由葛兰素史克(GSK，一跨国制药公司)开发的针对B淋巴细胞刺激因子(BLyS)的人单克隆抗体，并已在美国、加拿大和欧洲被批准作为狼疮(系统性红斑狼疮，SLE)的治疗剂。戈利木单抗(Golimumab，也称为)是由扬森生物技术公司(前身为Centocor公司，其是强生公司-全球性制药公司的子公司)开发的针对TNFα的人单克隆抗体，已在美国、加拿大和韩国以Simponi为产品名称被批准作为风湿性关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎的治疗剂。
同时，优特克单抗(ustekinumab，也称为)是由杨森制药公司(跨国制药公司)开发的针对白介素12(IL-12)和白介素23(IL-23)的人单克隆抗体，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准作为银屑病关节炎的治疗剂，并且该药物处于重度银屑病、中度至重度斑块型银屑病、多发性硬化症、结节病等治疗的临床试验。易普利姆玛(Ipilimumab，也称为)是由百时美施贵宝公司(BMS，一美国制药公司)开发的针对细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA-4)的人单克隆抗体，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准以Yervoy为产品名称作为黑色素瘤和皮肤癌的治疗剂，并且该药物处于非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌和转移性激素难治性前列腺癌治疗的临床试验。
本领域需要开发大规模生产这些重磅炸弹型抗体治疗剂的方法。
发明内容
技术问题
本发明人努力发现了在各种哺乳动物细胞中诱导更强效和稳定的基因表达的方法，因此，本发明人构建了双顺反子表达载体，其在常规表达载体中包括了非翻译区(UTR)和内含子，本发明人已证实该双顺反子表达载体能高产率地共同表达各种抗体治疗剂的轻链和重链以及扩增基因，从而完成了本发明。
技术方案
本发明的一个目的是提供用于抗体表达的双顺反子表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-抗体轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“启动子-UTR-内含子-抗体重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
本发明的另一目的是提供用该表达载体转染的动物细胞。
本发明还有一目的是提供生产抗体的方法，包括培养该动物细胞。
本发明的优势效果
根据本发明采用包含内含子的用于抗体表达的双顺反子表达载体，可构建高表达效率地表达所需抗体的表达载体，通过培养经转染的动物细胞，该表达载体能稳定而高效地产生抗体。
附图简述
图1是一示意图，显示了本发明的基因片段Gln-LC和Gln-HC的构建组成。
图2是显示构建本发明的GS-Gln-LC的过程的示意图。
图3是一示意图，显示了通过将Gln-HC插入本发明的GS-Gln-LC来构建本发明的含GS基因的pCYBIG载体的过程。
图4是一示意图，显示了从本发明的pCYBIG载体构建本发明的含DHFR基因的pCYBID载体的过程。
图5是一示意图，显示了构建pCYB204IG载体的过程，其是本发明的含GS基因的用于贝伐珠单抗(bevacizumab)的轻链/重链的表达载体。
图6是一示意图，显示了构建pCYB204ID载体的过程，其是本发明的含DHFR基因的用于贝伐珠单抗的轻链/重链的表达载体。
图7A显示在500μMMSX下，用pCYB204IG转染的细胞系中抗体的表达量。
图7B显示在800nMMSX下，用pCYB204ID转染的细胞系中抗体的表达量。
图8是一示意图，显示了用于本发明的表达载体pCYBBSS001的限制性图谱。
图9是一示意图，显示了用于本发明的表达载体pCYBBSS002的限制性图谱。
图10是一示意图，显示了用于本发明的表达载体pCYBBSS003的限制性图谱。
图11是一示意图，显示了用于本发明的表达载体pCYBBSS004的限制性图谱。
图12是一示意图，显示了用于本发明的表达载体pCYBBSS005的限制性图谱。
图13是一示意图，显示了用于本发明的表达载体pCYBBSS006的限制性图谱。
最佳方式
为实现上述目的，本发明一方面提供用于抗体表达的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-抗体轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-抗体重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
本发明涉及提供双顺反子表达载体，通过包含UTR和内含子，其设计成表达重链和轻链的抗体基因以及扩增基因，就好像它们是一个基因一样，从而能够在各种动物细胞中实现更强效而稳定的基因表达。具体地说，本发明提供包含UTR和内含子的新型表达盒。
特别是，本发明提供用于抗体表达的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-贝伐珠单抗轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-贝伐珠单抗重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。本发明提供用于抗体表达的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-托珠单抗轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-托珠单抗重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。本发明提供用于抗体表达的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-狄诺塞麦轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-狄诺塞麦重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。本发明提供用于抗体表达的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-贝利单抗轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-贝利单抗重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。本发明提供用于抗体表达的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-戈利木单抗轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-戈利木单抗重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。本发明提供用于抗体表达的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-优特克单抗轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-优特克单抗重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。本发明提供用于抗体表达的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-易普利姆玛轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-易普利姆玛重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
本文所用的术语“双顺反子”是指一系统，其中核糖体可在真核细胞中在mRNA内合成多肽，从而能自单一的mRNA合成多个蛋白。在本发明中，载体设计成能同时表达抗体基因和扩增基因。
不同于具有多顺反子系统的原核细胞例如大肠杆菌，其中可以通过核糖体与mRNA的各位点的多次结合从一个mRNA同时合成多个蛋白，在真核细胞中，在从mRNA翻译蛋白质的过程中，核糖体结合于mRNA的5’端，并通过扫描找寻起始密码子AUG。由于蛋白质的合成仅从该AUG密码子开始，真核细胞具有单顺反子系统，其中从一个mRNA仅可合成一条多肽，并且已知Kozac序列在ATG的识别和蛋白质合成的启动中起重要作用。然而，在脑心肌炎病毒(下文为EMCV)的情况中，其具有称为内部核糖体进入位点(下文为IRES)的特定结构的RNA序列，在真核细胞中可以从一个mRNA翻译多个蛋白(Jang等.,J.Virol.(1989)63,1651)。在本发明中，为同时表达抗体基因和扩增基因，载体设计成IRES可以位于抗体的重链基因的下游，其后是扩增基因。
本文所用的术语“载体”是指包含基本调节因子，例如启动子以便在合适的宿主细胞中表达靶基因的基因构建物；优选地，出于本发明的目的，载体是指用于表达抗体的载体，其可以是双顺反子表达载体。
在示范性的实施方式中，本发明的载体可以是表达贝伐珠单抗的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-贝伐珠单抗轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-贝伐珠单抗重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
在另一示范性的实施方式中，本发明的载体可以是表达托珠单抗的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-托珠单抗轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-托珠单抗重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
在还有另一示范性实施方式中，本发明的表达载体可以是用于表达狄诺塞麦的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-狄诺塞麦轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-狄诺塞麦重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
在还有另一示范性实施方式中，本发明的表达载体可以是用于表达戈利木单抗的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-戈利木单抗轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-戈利木单抗重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
在还有另一示范性实施方式中，本发明的表达载体可以是用于表达贝利单抗的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-贝利单抗轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-贝利单抗重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
在还有另一示范性实施方式中，本发明的表达载体可以是用于表达优特克单抗的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-优特克单抗轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-优特克单抗重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
在还有另一示范性实施方式中，本发明的表达载体可以是用于表达易普利姆玛的双顺反子表达载体，包含：(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-易普利姆玛轻链基因-polyA”；和(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-易普利姆玛重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
本文所用的术语“启动子”是指DNA核苷酸序列中转录调节因子所结合的区域，出于本发明的目的，可利用能诱导强效和稳定基因表达的启动子增加基因表达的效率。
启动子宜选自下组：猿病毒40(SV40)早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和延长因子1-α(EF1-α)启动子，但不限于此。具体地说，EF1-α可以是人延长因子1-α(hEF1-α)。优选地，启动子可以是CMV启动子，最优选巨细胞病毒株AD169的启动子。在本发明的示范性实施方式中，通过插入CMV启动子(其为巨细胞病毒株AD169基因组序列(GenBank:X17403.1)中迄今已知的最强启动子之一)来构建表达载体，以诱导高抗体表达。
本文所用的术语“非翻译区(UTR)”是mRNA的非翻译区域，通常是指编码区的两端。具体地说，5’端部分称为5’UTR，3’端称为3’UTR。更具体地说，本文所用的UTR包含在本发明的双顺反子载体中，其不用作特别限定，只要其具有增加基因表达量的作用即可。甚至更具体地说，所述UTR可以是衍生自CMV的UTR。本发明人首次验证了包含同时含有UTR和内含子的表达盒的双顺反子表达载体能增加整合入载体的基因的表达水平，因此本发明涉及提供新型的抗体表达载体。
本发明的UTR优选为SEQIDNO:2所示的巨细胞病毒株AD169的UTR，但不限于此。在本发明的示范性实施方式中，通过将UTR分别插入启动子与轻链和重链的抗体基因之间，利用巨细胞病毒株AD169基因组序列(GenBank:X17403.1)上的UTR构建表达载体，以获得更强的基因表达。
本文所用的术语“内含子”是指在真核细胞中发现的DNA区域的特征性序列，其因缺乏遗传信息而不编码蛋白质。在mRNA合成期间，内含子在核中被RNA聚合酶转录，并通过剪接从mRNA序列上切除，同时转运出核。有越来越大的研究结果支持当质粒包含内含子和非翻译的外显子时，其能具有更高的基因表达水平。因此，现已通过将异源内含子导入重组表达载体开发了能作稳定和组成型基因表达的更改进的载体以供使用。然而，内含子插入已经应用于单顺反子载体，因此，该载体仅能表达一个基因。为克服该缺陷，本发明人致力于将一外来内含子基因插入双顺反子载体系统的启动子下游位置以便高效率地诱导基因表达。具体地说，本发明的内含子可以是衍生自CMV的内含子。
本发明的内含子可优选SEQIDNO:3所示巨细胞病毒株AD169的UTR，但不限于此。在本发明的示范性实施方式中，通过将UTR分别插入启动子与轻链和重链的抗体基因之间，利用巨细胞病毒株AD169基因组序列(GenBank:X17403.1)的UTR构建表达载体以实现更强的基因表达。
本发明表达载体中包含的启动子、UTR和内含子可具有相同或不同的来源。例如，启动子可以是SV40早期启动子，UTR和内含子可以衍生自SV40；启动子可以是CMV启动子，UTR和内含子可以衍生自CMV；启动子可以是hEF1-α启动子，UTR和内含子可以衍生自hEF1-α。
在本发明中，本文所用的术语“扩增基因”是指这样的基因，其被扩增以便诱导该基因与有待稳定而高效表达的所需抗体基因一起共表达。可以基于以下原理，利用某种化学物质扩增扩增基因，即，未整合扩增基因的细胞无法在该化学物质的存在下生长，从而仅有在染色体中同时整合了扩增基因和抗体基因的那些细胞能够生长。本发明的双顺反子表达载体可诱导扩增基因和抗体基因共表达，就像它们是一个基因一样，从而能够实现靶抗体基因的高表达。
扩增基因优选为谷氨酰胺合成酶(GS)或二氢叶酸还原酶(DHFR)，但不限于此。在本发明的示范性实施方式中，构建了包含GS作为扩增基因的pCYB204IG表达载体和包含DHFR作为扩增基因的pCYB204IG表达载体(图5和6)，并且经证实，表达载体pCYBBSS001(图8)、pCYBBSS002(图9)、pCYBBSS003(图10)、pCYBBSS004(图11)、pCYBBSS005(图12)和pCYBBSS006(图13)可用于高水平地表达抗体基因。
本文所用的术语“抗体”是指一物质，其在免疫系统中因抗原性刺激而产生，特异性结合特定抗原并且在血流和淋巴中自由循环，从而导致抗原-抗体相互作用。出于本发明的目的，抗体以高水平组成型表达。本发明的表达载体可以诱导强而稳定的抗体基因表达，可以利用转染了该表达载体的动物细胞高效产生抗体。
抗体是由氨基酸和糖链组成的蛋白质，通过两个轻链和两个重链之间的二硫键形成Y-形的蛋白。在本发明的示范性实施方式中，构建了能产生具有轻链和重链的抗体的表达载体，其包含具有UTR和内含子的抗体轻链表达盒和具有UTR和内含子的抗体重链表达盒。
本发明的抗体优选是本领域常规使用的治疗性抗体，但不限于此。例如，抗体可以选自下组：贝伐珠单抗，靶向血管内皮生长因子-A(VEGF-A)的抗体；托珠单抗，靶向IL-6受体的抗体；狄诺塞麦，靶向NF-kB配体(RANKL)的受体激活物的抗体；贝利单抗，靶向B淋巴细胞刺激物(BLyS)的抗体；戈利木单抗，靶向TNFα的抗体；优特克单抗，靶向白介素-12(IL-12)和白介素-23(IL-23)的抗体；和易普利姆玛，靶向细胞毒性T淋巴细胞抗原-4的抗体。
贝伐单抗也称为阿瓦斯丁(Avastin)，是由基因泰克(美国)开发的人源化抗体，已知其作为治疗结肠直肠癌、肺癌、肾癌、脑癌的抗体治疗剂。在本发明的示范性实施方式中，证实了将代表性的抗体治疗剂-贝伐单抗引入本发明的用于抗体表达的双顺反子表达载体有效产生了抗体。
托珠单抗是由罗氏公司的日本子公司-中外制药(Chugai)开发的人单克隆抗体，已在美国、欧洲和日本以Actemra为产品名称批准作为类风湿性关节炎的治疗剂。在本发明的示范性实施方式中，证实了将托珠单抗引入本发明的用于抗体表达的双顺反子表达载体有效产生了抗体。因此，本发明的双顺反子表达载体经证实是能高水平地表达抗体-托珠单抗的系统。
狄诺塞麦是安进公司(美国)开发的人单克隆抗体，已在美国、加拿大和欧洲以Prolia为产品名称批准作为骨质疏松症的治疗剂，还在欧洲以Xgeva为产品名称批准作为预防具有实体癌骨转移的患者中骨折的药物。在本发明的示范性实施方式中，证实了将狄诺塞麦引入本发明的用于抗体表达的双顺反子表达载体有效产生了抗体。因此，本发明的双顺反子表达载体经证实是能高水平地表达抗体-狄诺塞麦的系统。
贝利单抗是由葛兰素史克(GSK，一跨国制药公司)开发的针对B淋巴细胞刺激因子(BLyS)的人单克隆抗体，并已在美国、加拿大和欧洲被批准作为狼疮(系统性红斑狼疮，SLE)的治疗剂。在本发明的示范性实施方式中，证实了将贝利单抗引入本发明的用于抗体表达的双顺反子表达载体有效产生了抗体。因此，本发明的双顺反子表达载体经证实是能高水平地表达抗体-贝利单抗的系统。
戈利木单抗是由扬森生物技术公司(前身为Centocor公司，其是强生公司-全球性制药公司的子公司)开发的人单克隆抗体，已在美国、加拿大和韩国以Simponi为产品名称被批准作为风湿性关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎的治疗剂。在本发明的示范性实施方式中，证实了将戈利木单抗引入本发明的用于抗体表达的双顺反子表达载体有效产生了抗体。因此，本发明的双顺反子表达载体经证实是能高水平地表达抗体-戈利木单抗的系统。
优特克单抗是由杨森制药公司(跨国制药公司)开发的针对白介素12(IL-12)和白介素23(IL-23)的人单克隆抗体，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准作为银屑病关节炎的治疗剂，并且该药物处于重度银屑病、中度至重度斑块型银屑病、多发性硬化症、结节病等治疗的临床试验。在本发明的示范性实施方式中，证实了将优特克单抗引入本发明的用于抗体表达的双顺反子表达载体有效产生了抗体。因此，本发明的双顺反子表达载体经证实是能高水平地表达抗体-优特克单抗的系统。
易普利姆玛是由百时美施贵宝公司(BMS，一美国制药公司)开发的针对细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA-4)的人单克隆抗体，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准以Yervoy为产品名称作为黑色素瘤和皮肤癌的治疗剂，并且该药物处于非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌和转移性激素难治性前列腺癌治疗的临床试验。具体地说，将FDA批准作为黑色素瘤治疗剂的Yervoy以静脉内注射的形式给予，其通过识别黑色素瘤形成细胞作为靶标并协助人免疫系统攻击黑色素瘤形成细胞而表现出药物作用。在本发明的示范性实施方式中，证实了将易普利姆玛引入本发明的用于抗体表达的双顺反子表达载体有效产生了抗体。因此，本发明的双顺反子表达载体经证实是能高水平地表达抗体-易普利姆玛的系统。
本文所用的术语“抗体轻链基因”是指编码抗体中轻链区的基因，所述抗体是由两条轻链和两条重链之间的氨基酸和糖链连接的Y-形蛋白。在本发明中，抗体轻链基因可以包括但不限于任何抗体的任何轻链基因，其中可以利用本发明的双顺反子载体增加表达水平，并且例如，轻链基因可以是编码抗体治疗剂，即，贝伐单抗、托珠单抗、狄诺塞麦、贝利单抗、戈利木单抗、优特克单抗或易普利姆玛的轻链区的核苷酸序列。
具体地说，抗体轻链基因可以是由编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列构成：SEQIDNO:13，贝伐单抗的轻链区；SEQIDNO:17，托珠单抗的轻链区；SEQIDNO:21，狄诺塞麦的轻链区；SEQIDNO:25，贝利单抗的轻链区；SEQIDNO:29，戈利木单抗的轻链区；SEQIDNO:33，优特克单抗的轻链区；和SEQIDNO:37，易普利姆玛的轻链区。更具体地说，抗体轻链基因可以是由选自下组的核苷酸序列构成：SEQIDNO:11，编码贝伐单抗的轻链区；SEQIDNO:15，编码托珠单抗的轻链区；SEQIDNO:19，编码狄诺塞麦的轻链区；SEQIDNO:23，编码贝利单抗的轻链区；SEQIDNO:27，编码戈利木单抗的轻链区；SEQIDNO:31，编码优特克单抗的轻链区；和SEQIDNO:35，编码易普利姆玛的轻链区。
本文所用的术语“抗体重链基因”是指编码抗体中重链区的基因，所述抗体是由两条轻链和两条重链之间的氨基酸和糖链连接的Y-形蛋白。在本发明中，抗体重链基因可以包括但不限于任何抗体的任何重链基因，其中可以利用本发明的双顺反子载体增加表达水平，并且例如，重链基因可以是编码抗体治疗剂，即，贝伐单抗、托珠单抗、狄诺塞麦、贝利单抗、戈利木单抗、优特克单抗或易普利姆玛的重链区的核苷酸序列。
具体地说，抗体轻链基因可以是由编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列构成：SEQIDNO:14，贝伐单抗的重链区；SEQIDNO:18，托珠单抗的重链区；SEQIDNO:22，狄诺塞麦的重链区；SEQIDNO:26，贝利单抗的重链区；SEQIDNO:30，戈利木单抗的重链区；SEQIDNO:34，优特克单抗的重链区；和SEQIDNO:38，易普利姆玛的重链区。更具体地说，抗体重链基因可以是由选自下组的核苷酸序列构成：SEQIDNO:12，编码贝伐单抗的重链区；SEQIDNO:16，编码托珠单抗的重链区；SEQIDNO:20，编码狄诺塞麦的重链区；SEQIDNO:24，编码贝利单抗的重链区；SEQIDNO:28，编码戈利木单抗的重链区；SEQIDNO:32，编码优特克单抗的重链区；和SEQIDNO:36，编码易普利姆玛的重链区。
本文所用的术语“内部核糖体进入位点(IRES)，SEQIDNO:4”是指真核细胞的mRNA内存在的特定区域，核糖体与其直接结合，从而能够从一个mRNA合成多个蛋白。在本发明中，IRES用于制备作为双顺反子表达载体的本发明表达载体。
在真核细胞中，mRNA的翻译通常依赖于mRNA5'端的帽结构。然而，当翻译独立于帽结构时，核糖体可直接结合于mRNA内的特定区域，并从其开始翻译，这即是所谓的内部起始位点。在内部起始位点中，mRNA上的核糖体结合位点称为IRES，其发现于病毒例如脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎(EMC)病毒的mRNA中，也发现于细胞mRNA，例如结合免疫球蛋白蛋白质(BiP)mRNA和果蝇触角同源盒基因(Antp)mRNA。
本文所用的术语“polyA”也称为多腺苷酸或聚腺苷酸片段，是指通常存在于真核细胞中mRNA3'端的腺苷酸连续序列。其长度是从10到200个核苷酸，并且可以根据表达载体骨架的容许尺寸进行不同地控制。PolyA已知涉及mRNA的稳定、翻译以及从细胞核向细胞质的转运。
用于抗体产生的本发明双顺反子表达载体可优选是图5所示的pCYB204IG，图6所示的pCYB204ID，图8所示的pCYBBSS001，图9所示的pCYBBSS002，图10所示的pCYBBSS003，图11所示的pCYBBSS004，图12所示的pCYBBSS005，或图13所示的pCYBBSS006，但不限于此。
pCYB204IG表达载体是这样的表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-贝伐珠单抗轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-贝伐珠单抗重链基因-IRES-GS-polyA”。pCYB204ID表达载体是这样的表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-贝伐珠单抗轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-贝伐珠单抗重链基因-IRES-DHFR-polyA”。pCYBBSS001表达载体是这样的表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-托珠单抗轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-托珠单抗重链基因-IRES-DHFR-polyA”。pCYBBSS002表达载体是这样的表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-狄诺塞麦轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-狄诺塞麦重链基因-IRES-DHFR-polyA”。pCYBBSS003表达载体是这样的表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-贝利单抗轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-贝利单抗重链基因-IRES-DHFR-polyA”。pCYBBSS004表达载体是这样的表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-戈利木单抗轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-戈利木单抗重链基因-IRES-DHFR-polyA”。pCYBBSS005表达载体是这样的表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-优特克单抗轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-优特克单抗重链基因-IRES-DHFR-polyA”。pCYBBSS006表达载体是这样的表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-易普利姆玛轻链基因-polyA”，所述第二表达盒包含“CMV启动子-UTR-内含子-易普利姆玛重链基因-IRES-DHFR-polyA”。
在本发明的示范性实施方式中，利用GS作为扩增基因连同轻链表达盒和重链表达盒构建pCYBIG表达载体，而包含DHFR而非GS作为扩增基因的pCYBID表达载体从pCYBIG表达载体构建。
本发明的双顺反子表达载体设计成重链和轻链的抗体基因能连同扩增基因一起表达，就好像它们是一个基因一样，如上所述，因此，所述表达载体可以用于稳定而高效地表达抗体。
在示范性的实施方式中，本发明提供用所述表达载体转染的动物细胞。
在本发明中，转染入动物细胞的表达载体是用于抗体表达的双顺反子表达载体，如上文所解释。
本文所用的术语“转染”是指通过将DNA直接插入培养的动物细胞而对细胞作遗传改变，靶基因一般插入有待导入细胞的载体，例如质粒。可以按照本领域已知的常规方法进行转染。转染方法的优选例子可包括硫酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔和再分配(将称为脂质体的人工膜与制备DNA复合物的细胞相融合的方法)。在本发明的示范性实施方式中，利用脂质转染试剂，以轻链/重链表达载体转染动物细胞。
所述动物细胞可以是本领域所用的任何类型的动物细胞而无需限定，只要它们能产生抗体，优选地，所述动物细胞可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在本发明的示范性实施方式中，通过将贝伐珠单抗的轻链和重链基因插入载体来构建用于表达抗体-贝伐珠单抗的pCYB204IG和pCYB204GS双顺反子载体，其中扩增基因可以不同，或是GS或是DHFR。检查用以上两种载体转染的各细胞系中抗体-贝伐珠单抗的表达量后，用pCYB204ID载体转染的细胞系显示贝伐珠单抗的表达比用pCYB204IG载体转染的细胞系至少高两倍。
此外，在本发明的示范性实施方式中，通过将托珠单抗的轻链和重链基因插入载体来构建用于表达抗体-托珠单抗的pCYBBSS001双顺反子载体，其中包含DHFR作为扩增基因。检查用pCYBBSS001双顺反子载体转染的细胞系中抗体-托珠单抗的表达量后，在800nM甲氨蝶呤(MTX)的基因扩增条件下证实有50.8μg/mL和51.7μg/mL的高表达。
在本发明的示范性实施方式中，通过将狄诺塞麦的轻链和重链基因插入载体来构建用于表达抗体-狄诺塞麦的pCYBBSS002双顺反子载体，其中包含DHFR作为扩增基因。检查用pCYBBSS002双顺反子载体转染的细胞系中抗体-狄诺塞麦的表达量后，在800nMMTX的基因扩增条件下证实有81.4μg/mL的高表达。
在本发明的示范性实施方式中，通过将贝利单抗的轻链和重链基因插入载体来构建用于表达抗体-贝利单抗的pCYBBSS003双顺反子载体，其中包含DHFR作为扩增基因。检查用pCYBBSS003双顺反子载体转染的细胞系中抗体-贝利单抗的表达量后，证实有4μg/mL的高表达。
在本发明的示范性实施方式中，通过将戈利木单抗的轻链和重链基因插入载体来构建用于表达抗体-戈利木单抗的pCYBBSS004双顺反子载体，其中包含DHFR作为扩增基因。检查用pCYBBSS004双顺反子载体转染的细胞系中抗体-戈利木单抗的表达量后，在500nMMTX的基因扩增条件下证实有120.3μg/mL的高表达。
在本发明的示范性实施方式中，通过将优特克单抗的轻链和重链基因插入载体来构建用于表达抗体-优特克单抗的pCYBBSS005双顺反子载体，其中包含DHFR作为扩增基因。检查用pCYBBSS005双顺反子载体转染的细胞系中抗体-优特克单抗的表达量后，证实有2.5μg/mL的高表达。
此外，在本发明的示范性实施方式中，通过将易普利姆玛的轻链和重链基因插入载体来构建用于表达抗体-易普利姆玛的pCYBBSS006双顺反子载体，其中包含DHFR作为扩增基因。检查用pCYBBSS006双顺反子载体转染的细胞系中抗体-易普利姆玛的表达量后，在500nMMTX的基因扩增条件下证实有8μg/mL的高表达。
总之，如上文解释的，通过将本发明的用于抗体表达的双顺反子表达载体应用于各种抗体治疗剂来检测抗体的表达量，结果证实本发明的表达载体提高了各种抗体的表达能力。
在另一方面，本发明提供产生抗体的方法，包括培养动物细胞。
本发明的动物细胞是用本发明的包含内含子的双顺反子表达载体转染的动物细胞，如上所述。
本发明的产生抗体的方法可稳定而高效地产生抗体。该方法还可包括从培养动物细胞的培养产物中纯化抗体。
本发明可产生的抗体与上述相同，它们可以是贝伐单抗、托珠单抗、狄诺塞麦、贝利单抗、戈利木单抗、优特克单抗或易普利姆玛，但不限于此。
发明详述
下文将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅是出于说明的目的，本发明不限于这些实施例。
实施例1：Gln-LC，用于表达轻链的基因集的构建
基于人巨细胞病毒株AD169的完整基因组(GenBank:X17403.1)的核苷酸序列获得包含UTR和内含子的CMV启动子的DNA序列。由于启动子、克隆位点和polyA元件是表达靶蛋白至少所需，请求韩国基诺泰克公司(Genotech，Korea)合成该CMV启动子、UTR、内含子、克隆位点和SV40polyA的DNA。
此外，将XbaI和NotI限制性位点分别插入内含子和polyA之间以便克隆抗体蛋白的轻链；将AscI限制性位点插在CMV启动子的5’端；将BamHI和XhoI限制性位点插在3’端，用于后续克隆过程。
通过上述过程构建了用于表达轻链的具有[AscI]-CMV启动子-UTR-内含子-[XbaI/NotI]-polyA-[BamHI/XhoI]组成的基因集Gln-LC(图1)。
实施例2：Gln-HC，用于表达重链的基因集的构建
利用实施例1构建的Gln-LC基因集作为模版连同下表1中总结的BamHIGln-F引物(SEQIDNO:7)和NheIGln-R引物(SEQIDNO:8)进行PCR。
[表1]
在用于表达重链的基因集Gln-HC中，将BamHI限制性位点插在CMV启动子的3’端，将NheI和XhoI限制性位点插在CMV启动子的下游以便克隆UTR、内含子和抗体蛋白的重链区域，用于后续克隆过程。
如下所述进行PCR：94℃变性5min；进行30轮的：94℃变性50s，50℃退火30s和72℃延伸2m；和72℃聚合7m。PCR反应溶液含有25μLPremixTaq(ExTaq版)(宝生物公司-TAKARACo.,Ltd.),2μL的各SEQIDNO:7和8(10皮摩尔/μL)，并加入蒸馏水至最终体积为50μL。
通过上述过程制备了用于表达重链的具有[BamHI]-CMV启动子-UTR-内含子-[NheI/XhoI]-[NheI]组成的基因集Gln-HC(图1)。
按照生产商的使用说明书，将PCR扩增的Gln-HC基因插入pGEMT-easy(T-便捷)载体(普洛迈格公司-PromegaCorporation)。
实施例3：通过用于表达轻链的基因集的GS载体构建GS-Gln-LC质粒
为构建含有谷氨酰胺合成酶(GS)作为扩增基因的表达载体，利用本发明人的公司开发的IRES-GS载体。37℃，用MluI和XhoI处理含有IRES、GS基因和polyA的IRES-GS载体4小时，回收含有IRES-GS基因-f1起点-卡那霉素/新霉素耐受性基因-PolyA-pUC起点的DNA片段。
同时，用AscI和XhoI消化来切割实施例1中构建的用于表达轻链的基因集，Gln-LC。
对切割的IRES-GS载体片段和Gln-LC基因集片段分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶提取回收。连接回收的DNA片段以构建GS-Gln-LC质粒(图2)。
实施例4：构建pCYBIG，用于表达轻链和重链的质粒
为获得Gln-HC(实施例2构建的插入T-easy载体的表达轻链的基因集)的DNA，在37℃下，通过用BamHI和XhoI处理4小时来切割构建的载体。对经处理的DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收对应于Gln-HC大小的DNA片段。
同时，在37℃下，通过用BamHI和XhoI处理4小时来切割实施例3构建的GS-Gln-LC质粒。对经限制性酶处理的DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收对应于GS-Gln-LC质粒大小的DNA片段。
连接上文回收的Gln-HC基因集片段和GS-Gln-LC质粒片段以构建pCYBIG载体(图3)。
实施例5：构建pCYBID，用于表达轻链和重链的质粒
尝试构建pCYBID载体，其中实施例4中构建的pCYBIG载体中的GS扩增基因取代为DHFR基因。
具体地说，利用DHFR基因作为模板连同下表2总结的salIDHFR-F引物(SEQIDNO:9)和NheIDHFR-R引物(SEQIDNO:10)，进行PCR。
[表2]
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO
SalI DHFR-F GGC CGT CGA CAT GGT TCG ACC GCT G 9
NheI DHFR-R GGC CGC TAG CTT AGC CTT TCT TCT CAT AGA C 10
如下所述进行PCR：94℃变性5min；进行30轮的：94℃变性50s，50℃退火30s和72℃延伸2m；和72℃聚合7m。PCR反应溶液含有25μLPremixTaq(ExTaq版)(宝生物公司),2μL的各SEQIDNO:9和10(10皮摩尔/μL)，并加入蒸馏水至最终体积为50μL。按照生产商的使用说明书，将如上所述通过PCR扩增的DHFR基因插入pGEMT-easy载体(普洛迈格公司)。
同时，通过用salI和XbaI处理来切割实施例4构建的pCYBIG载体的DNA，通过用salI和NheI处理来切割克隆入T-easy载体的DHFR基因的DNA。
通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建pCYBID载体，其中GS基因取代为DHFR基因(图4)。
实施例6：构建表达贝伐珠单抗的质粒
6-1.插入贝伐珠单抗轻链的基因
在实施例4和5构建的pCYBIG载体和pCYBID载体中分别插入贝伐珠单抗轻链的基因以构建表达贝伐珠单抗轻链的质粒。
具体地说，用XbaI和NotI切割pCYBIG载体和pCYBID载体。
对于贝伐珠单抗轻链的基因，用DNA核苷酸序列(SEQIDNO:11)取代贝伐珠单抗的氨基酸序列(SEQIDNO:13)。
利用针对CHO细胞优化的DNA核苷酸序列进行DNA核苷酸序列的取代，所述CHO细胞是表达抗体的细胞系，NheI和NotI限制性位点插入5’-以及3’-端。
将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游，以便诱导表达水平增加，并插入‘MGWSCIILFLVATATGVHS’作为信号序列以供基因合成。用NheI和NotI处理来切割如此合成的基因。
通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建分别插入了贝伐珠单抗轻链基因的pCYBIG载体和pCYBID载体。
6-2.插入贝伐珠单抗重链的基因
用NheI和XhoI切割实施例6-1构建的载体，pCYBIG-贝伐珠单抗轻链基因载体和pCYBID-贝伐珠单抗轻链基因载体。用DNA核苷酸序列(SEQIDNO:12)取代贝伐珠单抗的氨基酸序列(SEQIDNO:14)。如实施例6-1所示，将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游以设计载体，将NheI和XhoI限制性位点插入两端来合成基因，并用NheI和XhoI处理进行切割。通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建分别插入了贝伐珠单抗轻链和重链基因的载体(图5和6)。
就克隆贝伐珠单抗轻链和重链的方法而言，图5和6显示了pCYB204IG载体和pCYB204ID载体的示意图。
实施例7：检测pCYB204IG载体的抗体表达效率
7-1.转染
为开发能稳定表达抗体蛋白的细胞系，首先，在转染前一天，将GS-缺陷型CHO-K1细胞以4×105个细胞的浓度等份加入6-孔板，37℃下在CO2孵育箱内培养。确认细胞活力为98％或更高后，利用脂质转染试剂(英杰公司)将pCYB204IG载体转染入细胞。具体地说，利用以下培养基进行转染，所述培养基在Opti-MEM-1(英杰公司)中包含20μg表达载体DNA和10μL脂质转染试剂，并从中选择pCYB204IG转染的CHO-K1细胞。
7-2.抗体基因的扩增
用25μM起始浓度的甲硫氨酸亚砜胺(MSX)处理实施例7-1中pCYB204IG转染的CHO-K1细胞系，观察生长的进展情况直至细胞生长回复正常。用25μMMSX处理后，第7天后将传代培养物中MSX的处理浓度增加至250μM。以相同的方式，通过在传代培养的时间点增加MSX浓度，将MSX的处理浓度最终增加至500μM，其中通过MSX所致外部压力回复生长。检测在500μMMSX下制备的细胞系集合(集合1和集合2)的表达水平。利用抗-Fc，通过ELISA证实表达水平的检测值(图7A)。
实施例8：检测pCYB204ID载体的抗体表达效率
8-1：转染
为比较用pCYB204ID表达载体转染的细胞系的表达水平，该表达载体含有DHFR基因而非pCYB204IG载体的GS基因作为扩增基因，用pCYB204ID转染CHO-DG44细胞(Gibco,12609-012)，选择转染的CHO-DG44细胞。
8-2.抗体基因的扩增
通过甲硫氨酸亚砜胺(MSX)处理来扩增实施例8-1中pCYB204ID转染的CHO-DG44细胞系。以与实施例7-2相同的方式，通过在细胞生长恢复至正常之时增加MTX浓度的方法来检测表达水平。MTX处理浓度是50nM、200nM和800nM。利用抗-Fc，通过ELISA证实表达水平的检测值(图7B)。
比较实施例7-2和8-2中各载体的检测抗体表达水平后，证实用pCYB204ID载体转染的细胞系的表达比用pCYB204IG载体转染的细胞系至少高两倍。
实施例9：构建表达托珠单抗的质粒
9-1.插入托珠单抗轻链的基因
在实施例5构建的pCYBID载体中插入托珠单抗轻链基因以构建表达托珠单抗轻链的质粒。
具体地说，用XbaI和NotI切割pCYBID载体。
用编码托珠单抗的氨基酸序列(SEQIDNO:17)的DNA核苷酸序列(SEQIDNO:15)取代托珠单抗轻链的基因。利用针对CHO细胞优化的DNA核苷酸序列进行DNA核苷酸序列的取代，所述CHO细胞是表达抗体的细胞系，NheI和NotI限制性位点插入5’-以及3’-端。将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游，以便诱导表达水平增加，并插入‘MGWSCIILFLVATATGVHS’作为信号序列以供基因合成。用NheI和NotI处理来切割如此合成的基因。
通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入了托珠单抗轻链基因的pCYBID载体。
9-2.插入托珠单抗重链的基因
用NheI和XhoI切割实施例9-1构建的表达轻链的pCYBID-托珠单抗轻链基因载体。用DNA核苷酸序列(SEQIDNO:16)取代托珠单抗的氨基酸序列(SEQIDNO:18)。然后，如实施例9-1所示，将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游以设计载体，将NheI和XhoI限制性位点插入两端来合成基因，并用NheI和XhoI处理进行切割。通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入了托珠单抗轻链和重链基因的pCYB载体(图8)。
图8显示了本发明的表达载体pCYBBSS001的限制性图谱的示意图。
实施例10：检测pCYBBSS001载体的抗体表达效率
10-1.转染
为开发能稳定表达抗体蛋白的细胞系，首先，在转染前一天，将DHFR-缺陷型CHO-DG44细胞(Chasin博士，哥伦比亚大学，美国)以8×105个细胞的浓度等份加入6-孔板，37℃下在CO2孵育箱内培养。确认平板中的细胞生长达到70％到80％汇合后，利用脂质转染试剂LTX和PLUS试剂(英杰公司)将轻链/重链表达载体pCYBBSS001转染入细胞。具体地说，利用以下培养基进行转染，所述培养基在Opti-MEM-1(英杰公司)中包含2.5μg表达载体DNA和10μL脂质转染试剂LTX，并从中选择轻链/重链表达载体pCYBBSS001转染的CHO-DG44细胞。
10-2.抗体基因的扩增
通过甲氨蝶呤(MTX)处理用实施例10-1的pCYBBSS001转染的CHO-DG44细胞系进行基因扩增。通过在细胞生长恢复至正常之时增加MTX浓度的方法来检测表达水平。MTX处理在50nM、200nM和800nM的浓度下进行。结果，用800nMMTX处理时，用pCYBBSS001载体转染的细胞系显示表达水平最高。通过Octet滴度测定检测表达水平，A蛋白倾角和读数生物传感器(ProteinADipandReadbiosensors，FB公司-ForteBIO,目录号18-5010,批号120716)用1XPBS平衡至少10分钟，并与培养液反应。分析各样品后，生物传感器的再生/中和进行3轮，用1XPBS稀释到要分析的标准范围内之后，分析培养液。两个集合中800nMMTX浓度下的表达水平证实为50.8μg/mL和51.7μg/mL，该结果表明本发明的插入内含子的表达载体作转染能实现基因的组成型和高表达。
实施例11：构建表达狄诺塞麦的质粒
11-1.插入狄诺塞麦轻链的基因
在实施例5构建的pCYBID载体中插入狄诺塞麦轻链基因以构建表达狄诺塞麦轻链的质粒。
具体地说，用XbaI和NotI切割pCYBID载体。
对于狄诺塞麦轻链的基因，用DNA核苷酸序列(SEQIDNO:19)取代托珠单抗的氨基酸序列(SEQIDNO:21)。利用针对CHO细胞优化的DNA核苷酸序列进行DNA核苷酸序列的取代，所述CHO细胞是表达抗体的细胞系，NheI和NotI限制性位点插入5’-以及3’-端。将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游，以便诱导表达水平增加，并插入‘MGWSCIILFLVATATGVHS’作为信号序列以供基因合成。用NheI和NotI处理来切割如此合成的基因。
通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入了狄诺塞麦轻链基因的pCYBID载体。
11-2.插入狄诺塞麦重链的基因
用NheI和XhoI切割实施例11-1构建的表达轻链的pCYBID-狄诺塞麦轻链基因载体。用DNA核苷酸序列(SEQIDNO:20)取代狄诺塞麦的氨基酸序列(SEQIDNO:22)。然后，如实施例11-1所示，将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游以设计载体，将NheI和XhoI限制性位点插入两端来合成基因，并用NheI和XhoI处理进行切割。通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入了狄诺塞麦轻链和重链基因的pCYB载体(图9)。
图9显示了本发明的表达载体pCYBBSS002的限制性图谱的示意图。
实施例12：检测pCYBBSS002载体的抗体表达效率
12-1.转染
为开发能稳定表达抗体蛋白的细胞系，首先，在转染前一天，将DHFR-缺陷型CHO-DG44细胞(Chasin博士，哥伦比亚大学，美国)以8×105个细胞的浓度等份加入6-孔板，37℃下在CO2孵育箱内培养。确认平板中的细胞生长达到70％到80％汇合后，利用脂质转染试剂LTX和PLUS试剂(英杰公司)将轻链/重链表达载体pCYBBSS002转染入细胞。具体地说，利用以下培养基进行转染，所述培养基在Opti-MEM-1(英杰公司)中包含2.5μg表达载体DNA和10μL脂质转染试剂LTX，并从中选择轻链/重链表达载体pCYBBSS002转染的CHO-DG44细胞。
12-2.抗体基因的扩增
利用甲氨蝶呤(MTX)处理实施例12-1的pCYBBSS002转染的CHO-DG44细胞系进行基因扩增。通过在细胞生长恢复至正常之时增加MTX浓度的方法来检测表达水平。MTX处理在50nM、200nM和800nM的浓度下进行。结果，用800nMMTX处理时，用pCYBBSS002载体转染的细胞系显示表达水平最高。通过Octet滴度测定检测表达水平，A蛋白倾角和读数生物传感器(FB公司,目录号18-5010,批号120716)用1XPBS平衡至少10分钟，并与培养液反应。分析各样品后，生物传感器的再生/中和进行3轮，用1XPBS稀释到要分析的标准范围内之后，分析培养液。800nMMTX浓度下的表达水平证实为81.4μg/mL，该结果表明本发明的插入内含子的表达载体作转染能实现基因的组成型和高表达。
实施例13：构建表达贝利单抗的质粒
13-1.插入贝利单抗轻链的基因
在实施例5构建的pCYBID载体中插入贝利单抗轻链基因以构建表达贝利单抗轻链的质粒。
具体地说，用XbaI和NotI切割pCYBID载体。
用编码氨基酸序列(SEQIDNO:25)的DNA核苷酸序列(SEQIDNO:23)取代贝利单抗轻链的基因。利用针对CHO细胞优化的DNA核苷酸序列进行DNA核苷酸序列的取代，所述CHO细胞是表达抗体的细胞系，NheI和NotI限制性位点插入5’-以及3’-端。将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游，以便诱导表达水平增加，并插入‘MGWSCIILFLVATATGVHS’作为信号序列以供基因合成。用NheI和NotI处理来切割如此合成的基因。
通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入了贝利单抗轻链基因的pCYBID载体。
13-2.插入贝利单抗重链的基因
用NheI和XhoI切割实施例13-1构建的表达轻链的pCYBID-贝利单抗轻链基因载体。用DNA核苷酸序列(SEQIDNO:24)取代贝利单抗的氨基酸序列(SEQIDNO:26)。然后，如实施例13-1所示，将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游以设计载体，将NheI和XhoI限制性位点插入两端来合成基因，并用NheI和XhoI处理进行切割。通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以分别构建插入贝利单抗轻链和重链基因的pCYB载体(图10)。
图10显示了本发明的表达载体pCYBBSS003的限制性图谱的示意图。
实施例14：检测pCYBBSS003载体的抗体表达效率
14-1.转染
为开发能稳定表达抗体蛋白的细胞系，首先，在转染前一天，将DHFR-缺陷型CHO-DG44细胞(Chasin博士，哥伦比亚大学，美国)以8×105个细胞的浓度等份加入6-孔板，37℃下在CO2孵育箱内培养。确认平板中的细胞生长达到70％到80％汇合后，利用脂质转染试剂LTX和PLUS试剂(英杰公司)将轻链/重链表达载体pCYBBSS003转染入细胞。具体地说，利用以下培养基进行转染，所述培养基在Opti-MEM-1(英杰公司)中包含2.5μg表达载体DNA和10μL脂质转染试剂LTX，并从中选择轻链/重链表达载体pCYBBSS003转染的CHO-DG44细胞。
14-2.检测抗体基因的表达水平
检测实施例14-1的pCYBBSS003转染的CHO-DG44细胞系中贝利单抗的表达水平。利用抗-Fc，通过ELISA检测表达水平，通过计算皮克/细胞/天(PCD)来获得表达水平/细胞。结果，pCYBBSS003载体转染的细胞系显示表达水平为8μg/mL，该结果表明本发明的插入内含子的表达载体作转染能实现基因的组成型和高表达。
实施例15：构建表达戈利木单抗的质粒
15-1.插入戈利木单抗轻链的基因
在实施例5构建的pCYBID载体中插入戈利木单抗轻链基因以构建表达戈利木单抗轻链的质粒。
具体地说，用XbaI和NotI切割pCYBID载体。
用编码戈利木单抗的氨基酸序列(SEQIDNO:29)的DNA核苷酸序列(SEQIDNO:27)取代戈利木单抗轻链的基因。利用针对CHO细胞优化的DNA核苷酸序列进行DNA核苷酸序列的取代，所述CHO细胞是表达抗体的细胞系，NheI和NotI限制性位点插入5’-以及3’-端。将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游，以便诱导表达水平增加，并插入‘MGWSCIILFLVATATGVHS’作为信号序列以供基因合成。用NheI和NotI处理来切割如此合成的基因。
通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入了戈利木单抗轻链基因的pCYBID载体。
15-2.插入戈利木单抗重链的基因
用NheI和XhoI切割实施例15-1构建的表达轻链的pCYBID-戈利木单抗轻链基因载体。用DNA核苷酸序列(SEQIDNO:28)取代戈利木单抗的氨基酸序列(SEQIDNO:30)。然后，如实施例15-1所示，将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游以设计载体，将NheI和XhoI限制性位点插入两端来合成基因，并用NheI和XhoI处理进行切割。通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入戈利木单抗轻链和重链基因的pCYB载体(图11)。
图11显示了本发明的表达载体pCYBBSS004的限制性图谱的示意图。
实施例16：检测pCYBBSS004载体的抗体表达效率
16-1.转染
为开发能稳定表达抗体蛋白的细胞系，首先，在转染前一天，将DHFR-缺陷型CHO-DG44细胞(Chasin博士，哥伦比亚大学，美国)以8×105个细胞的浓度等份加入6-孔板，37℃下在CO2孵育箱内培养。确认平板中的细胞生长达到70％到80％汇合后，利用脂质转染试剂LTX和PLUS试剂(英杰公司)将轻链/重链表达载体pCYBBSS003转染入细胞。具体地说，利用以下培养基进行转染，所述培养基在Opti-MEM-1(英杰公司)中包含2.5μg表达载体DNA和10μL脂质转染试剂LTX，并从中选择轻链/重链表达载体pCYBBSS004转染的CHO-DG44细胞。
16-2.抗体基因的扩增
利用甲氨蝶呤(MTX)处理实施例16-1的pCYBBSS004转染的CHO-DG44细胞系进行基因扩增。通过在细胞生长恢复至正常之时增加MTX浓度的方法来检测表达水平。MTX处理在50nM、200nM、500nM和800nM的浓度下进行。结果，用800nMMTX处理时，用pCYBBSS004载体转染的细胞系显示表达水平最高。通过Octet滴度测定检测表达水平，A蛋白倾角和读数生物传感器(FB公司,目录号18-5010,批号120716)用1XPBS平衡至少10分钟，并与培养液反应。分析各样品后，生物传感器的再生/中和进行3轮，用1XPBS稀释到要分析的标准范围内之后，分析培养液。500nMMTX浓度下的表达水平证实为120.3μg/mL，该结果表明本发明的戈利木单抗表达载体作转染能实现基因的组成型和高表达。
实施例17：构建表达优特克单抗的质粒
17-1.插入优特克单抗轻链的基因
在实施例5构建的pCYBID载体中插入优特克单抗轻链基因以构建表达优特克单抗轻链的质粒。
具体地说，用XbaI和NotI切割pCYBID载体。
用编码优特克单抗的氨基酸序列(SEQIDNO:33)的DNA核苷酸序列(SEQIDNO:31)取代优特克单抗轻链的基因。利用针对CHO细胞优化的DNA核苷酸序列进行DNA核苷酸序列的取代，所述CHO细胞是表达抗体的细胞系，NheI和NotI限制性位点插入5’-以及3’-端。将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游，以便诱导表达水平增加，并插入‘MGWSCIILFLVATATGVHS’作为信号序列以供基因合成。用NheI和NotI处理来切割如此合成的基因。
通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入了优特克单抗轻链基因的pCYBID载体。
17-2.插入优特克单抗重链的基因
用NheI和XhoI切割实施例17-1构建的表达轻链的pCYBID-优特克单抗轻链基因载体。用DNA核苷酸序列(SEQIDNO:32)取代优特克单抗的氨基酸序列(SEQIDNO:34)。然后，如实施例17-1所示，将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游以设计载体，将NheI和XhoI限制性位点插入两端来合成基因，并用NheI和XhoI处理进行切割。通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入优特克单抗轻链和重链基因的pCYB载体(图12)。
图12显示了本发明的表达载体pCYBBSS005的限制性图谱的示意图。
实施例18：检测pCYBBSS005载体的抗体表达效率
18-1.转染
为开发能稳定表达抗体蛋白的细胞系，首先，在转染前一天，将DHFR-缺陷型CHO-DG44细胞(Chasin博士，哥伦比亚大学，美国)以8×105个细胞的浓度等份加入6-孔板，37℃下在CO2孵育箱内培养。确认平板中的细胞生长达到70％到80％汇合后，利用脂质转染试剂LTX和PLUS试剂(英杰公司)将轻链/重链表达载体pCYBBSS005转染入细胞。具体地说，利用以下培养基进行转染，所述培养基在Opti-MEM-1(英杰公司)中包含2.5μg表达载体DNA和10μL脂质转染试剂LTX，并从中选择轻链/重链表达载体pCYBBSS005转染的CHO-DG44细胞。
18-2.检测抗体基因的表达水平
检测实施例18-1的pCYBBSS005转染的CHO-DG44细胞系中优特克单抗的表达水平。利用抗-Fc，通过ELISA检测表达水平，通过计算皮克/细胞/天(PCD)来获得表达水平/细胞。结果，pCYBBSS005载体转染的细胞系显示表达水平为2.5μg/mL，该结果表明本发明的插入内含子的表达载体作转染能实现基因的组成型和高表达。
实施例19：构建表达易普利姆玛的质粒
19-1.插入易普利姆玛轻链的基因
在实施例5构建的pCYBID载体中插入易普利姆玛轻链基因以构建表达易普利姆玛轻链的质粒。
具体地说，用XbaI和NotI切割pCYBID载体。
用编码易普利姆玛的氨基酸序列(SEQIDNO:35)的DNA核苷酸序列(SEQIDNO:37)取代易普利姆玛轻链的基因。利用针对CHO细胞优化的DNA核苷酸序列进行DNA核苷酸序列的取代，所述CHO细胞是表达抗体的细胞系，NheI和NotI限制性位点插入5’-以及3’-端。将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游，以便诱导表达水平增加，并插入‘MGWSCIILFLVATATGVHS’作为信号序列以供基因合成。用NheI和NotI处理来切割如此合成的基因。
通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入了易普利姆玛轻链基因的pCYBID载体。
19-2.插入易普利姆玛重链的基因
用NheI和XhoI切割实施例19-1构建的表达轻链的pCYBID-易普利姆玛轻链基因载体。用DNA核苷酸序列(SEQIDNO:36)取代易普利姆玛的氨基酸序列(SEQIDNO:38)。然后，如实施例19-1所示，将Kozak序列(GCCACC)插入起始密码子ATG的上游以设计载体，将NheI和XhoI限制性位点插入两端来合成基因，并用NheI和XhoI处理进行切割。通过1％琼脂糖凝胶电泳回收切割的各DNA，将两种DNA连接以构建插入易普利姆玛轻链和重链基因的pCYB载体(图13)。
图13显示了本发明的表达载体pCYBBSS006的限制性图谱的示意图。
实施例20：检测pCYBBSS006载体的抗体表达效率
20-1.转染
为开发能稳定表达抗体蛋白的细胞系，首先，在转染前一天，将DHFR-缺陷型CHO-DG44细胞(Chasin博士，哥伦比亚大学，美国)以8×105个细胞的浓度等份加入6-孔板，37℃下在CO2孵育箱内培养。确认平板中的细胞生长达到70％到80％汇合后，利用脂质转染试剂LTX和PLUS试剂(英杰公司)将轻链/重链表达载体pCYBBSS005转染入细胞。具体地说，利用以下培养基进行转染，所述培养基在Opti-MEM-1(英杰公司)中包含2.5μg表达载体DNA和10μL脂质转染试剂LTX，并从中选择轻链/重链表达载体pCYBBSS006转染的CHO-DG44细胞。
20-2.抗体基因的扩增
利用甲氨蝶呤(MTX)处理实施例20-1的pCYBBSS006转染的CHO-DG44细胞系进行基因扩增。通过在细胞生长恢复至正常之时增加MTX浓度的方法来检测表达水平。MTX处理在50nM、200nM、500nM和800nM的浓度下进行。结果，用500nMMTX处理时，用pCYBBSS006载体转染的细胞系显示表达水平最高。通过Octet滴度测定检测表达水平，A蛋白倾角和读数生物传感器(FB公司,目录号18-5010,批号120716)用1XPBS平衡至少10分钟，并与培养液反应。分析各样品后，生物传感器的再生/中和进行3轮，用1XPBS稀释到要分析的标准范围内之后，分析培养液。500nMMTX浓度下的表达水平证实为8μg/mL，该结果表明本发明的插入内含子的表达载体作转染能实现基因的组成型和高表达。
本领域的那些普通技术人员将认识到，本发明可以体现为其它具体形式而不背离其精神或本质特征。所述的实施方式在所有方面都仅是说明性而非限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求而非前述所表明。落在权利要求的等价方式的含义和范围之内的所有改变应包括在本发明的范围内。

Claims (20)

1.一种用于抗体表达的表达载体，包含：
(i)第一表达盒，包含“启动子-非翻译区(UTR)-内含子-抗体轻链基因-polyA”；和
(ii)第二表达盒，包含“启动子-UTR-内含子-抗体重链基因-内部核糖体进入位点(IRES)-扩增基因-polyA”。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述启动子选自下组：猿病毒40(SV40)早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和人延长因子1-α(hEF1-α)启动子。
3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述UTR衍生自CMV。
4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述内含子衍生自CMV。
5.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述启动子是SV40早期启动子，而所述UTR和内含子衍生自SV40。
6.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述启动子是CMV启动子，而所述UTR和内含子衍生自CMV。
7.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述启动子是hEF1-α启动子，而所述UTR和内含子衍生自hEF1-α。
8.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述启动子是由SEQIDNO:1所示核苷酸序列构成的CMV启动子。
9.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述UTR衍生自CMV，由SEQIDNO:2所示核苷酸序列构成。
10.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述内含子由SEQIDNO:3所示的核苷酸序列构成。
11.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述扩增基因是谷氨酰胺合成酶(GS)或二氢叶酸还原酶(DHFR)。
12.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述抗体是贝伐单抗、托珠单抗、狄诺塞麦、贝利单抗、戈利木单抗、优特克单抗或易普利姆玛。
13.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含选自下组的切割谱：图5所示的pCYB204IG的切割谱、图6所示的pCYB204ID的切割谱、图8所示的pCYBBSS001的切割谱、图9所示的pCYBBSS002的切割谱、图10所示的pCYBBSS003的切割谱、图11所示的pCYBBSS004的切割谱、图12所示的pCYBBSS005的切割谱和图13所示的pCYBBSS006的切割谱。
14.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述抗体轻链基因由选自下组的核苷酸序列构成：SEQIDNO:11、SEQIDNO:15、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23、SEQIDNO:27、SEQIDNO:31和SEQIDNO:35。
15.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述抗体重链基因由选自下组的核苷酸序列构成：SEQIDNO:12、SEQIDNO:16、SEQIDNO:20、SEQIDNO:24、SEQIDNO:28、SEQIDNO:32和SEQIDNO:36。
16.一种动物细胞，用权利要求1-15中任一项所述的表达载体转染。
17.如权利要求16所述的动物细胞，其特征在于，所述动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
18.一种产生抗体的方法，包括培养权利要求16所述的动物细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，还包括在培养所述动物细胞的培养产物中纯化所述抗体。
20.如权利要求18或权利要求19所述的方法，其特征在于，所述抗体是贝伐单抗、托珠单抗、狄诺塞麦、贝利单抗、戈利木单抗、优特克单抗或易普利姆玛。
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