WO2018182284A1 - 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 - Google Patents

세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 Download PDF

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WO2018182284A1
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antibody
cancer
amino acid
acid sequence
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김성훈
심현보
권남훈
한대영
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재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to the Lysyl-tRNA synthetase N-terminal region exposed to the outer membrane and its use, and more specifically to the specific CDR (complementarity determining region) sequences described herein.
  • KRS Lysyl-tRNA synthetase
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting use, diagnosing cancer, and preventing or treating diseases related to immune cell migration.
  • 67LR 67-kDa laminin
  • KRS lysyl-tRNA synthethase
  • Receptors which promote the migration of tumor (or cancer) cells to affect metastasis
  • Human KRS (Genbank Accession No. NP_005539.1, etc.) has N-terminal extension (N-terminal extension, 1-72), anticodon binding domain (ant icodon—binding domain, 73-209) and catalytic domain (catalyt ic domain, 220-597).
  • Cardiovascular diseases are diseases of the heart and major arteries, including atherosclerosis and coronary artery disease (Ross et al., New Engl J Med, 1999: 340 (2): 115-26, Pol i G et al., Redox Biol 2013; 1 (1): 125–30, Libby P et al., Circulat ion 2002; 5; 105 (9): 1135-43).
  • Atherosclerosis It is an inflammatory disease caused by atherosclerosis consisting of cholesterol deposited on the inner artery membrane and immune cells that have moved from the blood into the artery.
  • immune cells such as monocytes migrate to form atherosclerosis.
  • the porridge When the porridge is formed, the inner surface of the blood vessel becomes stiff and the wall becomes thick, and the diameter of the inside of the blood flowing narrows, which causes a problem in blood circulation.
  • the fibrous membranes around the atherosclerosis burst, blood clots develop in the blood vessels, and bleeding occurs within the atherosclerosis, which causes the vessel's internal diameter to narrow or block rapidly.
  • CCL2 CCChemokine ligand 2, MCP 1
  • Pulmonary hypertension 0 1 «101 ⁇ Arterial Hypertension (PAH) is also classified as Group 1 of the pulmonary hypertension WHO clinical classification system (ESC Guidel ines, European Heart Journal 2015). It is a rare disease with common clinical features of elevated pulmonary artery pressure (mPAP) (mPAP> 25 mm Hg) and right ventricular dysfunction.
  • mPAP elevated pulmonary artery pressure
  • inflammatory immune cells such as monocytes / macrophages, leukocytes, eosinophils, and mast cells are activated as they rapidly penetrate into the site of injury and secrete several cytokines, which are caused by surrounding fibroblasts or epithelium.
  • Cells and smooth muscle cells are reactivated to activate them as miyoblast cells, which produce and secrete large quantities of extracellular matrix proteins, ultimately accumulating large amounts of extracellular matrix proteins in tissues. This can lead to scarring and induction of fibrosis or enlargement of tissues (Gurtner GC et al., Trends Cel l Biol. 15: 599-607, 2005).
  • This pathological mechanism is the formation of scars in the skin tissue caused by wounds, burns, bedsores, etc. It is one of the fundamental causes of the hardening fibrosis of tissues such as liver, sinus, blood vessels and lungs.
  • chronic autoimmune diseases such as scleroderma, rheumatoid arthr it is, Crohn's di sease, ulcerat ive col it is, myelof ibrosis, and pre-neoplastic Fibrosis is also a major pathological feature in systemic lupus erythematosu.
  • myof ibroblasts myofibroblasts
  • monocytes and macrophages contribute to wound healing, but they secrete react ive oxygen and nitrogen, which can have a detrimental effect on surrounding cells. Thus, the rapid removal of monocytes and macrophages can lead to further tissue damage and result in fibrosis. Therefore, limiting monocytes and macrophages that respond first in the early stages of the disease is considered a therapeutic strategy for various chronic inflammatory and fibrotic related diseases.
  • TGF- ⁇ ⁇ is a local f ibroblast. It is known to promote extracellular matrix synthesis. However, the factors related to hemagglutination reaction have been reported to induce fibrosis even when they are deficient.
  • Myc-KRS41-597 ⁇ ⁇
  • N-ext N—terminal extension
  • KRS N ext region is specifically involved in the interaction with 67LR. This fact may be used for therapeutic or diagnostic purposes. In order to do so, it is necessary to specifically target a specific target position (especially KRS N ext) within the protein according to the characteristics of the various domain regions constituting the KRS protein.
  • ARS aminoacyl tRNA synthetase
  • KRS-rich proteins ARS has similarities in protein structure so that antibodies obtained from animal reactions show cross reactions that bind to other ARS. Often no sieve is produced.
  • the present inventors have studied to manufacture an antibody that specifically binds to the KRS N-terminal region exposed to the outer membrane, and the antibodies having the specific CDR (complementarity determining region) sequences described herein are KRS N-terminal regions. In addition to exhibiting high binding specificity (speci f icity) and binding affinity (aff ini ty), it was confirmed to inhibit cancer metastasis on in wra.
  • the KRS ⁇ -terminal binding antibody provided by the present invention reduces the increased KRS level in the cell membrane of immune cells and actually inhibits immune cell migration and invasion to treat related diseases. It confirmed and completed this invention. It is therefore an object of the present invention to provide an antibody or fragment thereof that specifically binds to an epitope comprising the sequence of SEQ ID NO: 97 in the Lysyl-tRNA synthetase (KRS) N_terminus. will be.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the antibody or fragment thereof according to the present invention, a recombinant expression vector comprising the polynucleotide, and a cell transformed with the recombinant expression vector.
  • Another object of the present invention ( a ) transforming the host cell with the recombinant expression vector; (b) culturing the transformed host cell to produce an antibody or fragment thereof; And (c) obtaining an antibody or fragment thereof produced in the host cell, wherein the antibody specifically binds to a Lysyl-tRNA synthetase (KRS) N-terminus exposed to the outer membrane of the cell, or It is to provide a method for producing the fragment.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising the antibody or fragment thereof according to the present invention as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a cancer diagnostic composition consisting of the antibody or fragment thereof according to the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a cancer diagnostic composition consisting essentially of the antibody or fragment thereof according to the present invention. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases, including. '
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases consisting of the antibody or fragment thereof according to the present invention. to be.
  • the present invention provides an antibody that specifically binds to an epitope comprising the sequence of SEQ ID NO. Or a fragment thereof.
  • the present invention is the claim according to the present invention.
  • a polynucleotide encoding a sieve or fragment thereof, a recombinant expression vector containing the polynucleotide, and a cell transformed with the recombinant expression vector are provided.
  • the present invention comprises the steps of (a) transforming a host cell with the recombinant expression vector; (b) culturing the transformed host cell to produce an antibody or fragment thereof; And (c) obtaining an antibody produced from a host cell or a fragment thereof, which specifically binds to the N-terminus of Lysyl-tR A synthase (KRS, Lysyl-tRNA synthetase) exposed to the outer membrane.
  • KRS Lysyl-tR A synthase
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising the antibody or fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis consisting of the antibody or fragments thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis consisting essentially of the antibody or fragments thereof.
  • the present invention provides a cancer diagnostic composition comprising the antibody or fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a cancer diagnostic composition comprising the antibody or fragment thereof.
  • the present invention provides a composition for diagnosing cancer, which comprises essentially the antibody or fragment thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases comprising the antibody or fragment thereof as an active ingredient,
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases consisting of the antibody or fragments thereof.
  • the present invention is a drug for preventing or treating immune cell migration-related diseases consisting essentially of the antibody or fragments thereof.
  • the present invention provides the use of the antibody or fragment thereof for the preparation of an agent for inhibiting cancer metastasis.
  • the present invention provides a method for inhibiting cancer metastasis, characterized in that the effective amount of the antibody or fragment thereof is administered to a subject in need thereof.
  • the present invention provides the use of the antibody or fragment thereof for the preparation of a diagnostic agent for cancer.
  • the present invention provides a method for diagnosing cancer, characterized in that the effective amount of the antibody or fragment thereof is administered to a subject in need thereof.
  • the present invention provides the use of the antibody or fragment thereof for the preparation of a therapeutic agent for the treatment of immune cell migration-related diseases.
  • the present invention provides a method for treating immune cell migration-related diseases, characterized in that the effective amount of the hing-che or fragment thereof is administered to a subject in need thereof.
  • the "lysyl-tR A synthase (KRS) N-terminal region exposed to the outer membrane of the cell” refers to extracellular (when the KRS generated in the cell moves and is located in the cytoplasm (or plasma membrane).
  • extracel lul ar) region or means a specific sequence exposed to the surface of the cell membrane, which may usually mean a part or full length sequence of 1 to 72 amino acid region of the KRS N-terminus.
  • the KRS N-terminal region is characterized by the presence of species sequence similarity, in particular comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97.
  • KRS 1 in the present invention means any KRS fragment sequence comprising a full length polypeptide or N—terminal extent ion, known as a lysyl thiA synthase.
  • Antibodies or fragments thereof specifically detect KRS N-terminal regions exposed to the outer membrane as described above, so that any KRS fragment sequence comprising the aforementioned KRS full-length polypeptide or N-terminal region may also be detected.
  • the specific sequence of the KRS which includes the polypeptide represented by SEQ ID NO: 75, is not particularly limited as long as it is known in the art as a lysyl thiA-N synthase, for example, the KRS of the present invention is a human sapiens. ), which is known as NCBI (Genbank) Accession No. NP_005539.1, etc., and derived from mouse (Mus usculus), and NCBI (Genbank) Accession No. NP 444322.1 and the like, and include 3 ⁇ 4 ius norvegicus), including those known as NCBI (Genbank) Accession No. XP_006255692.1, etc. Other reference may be made to the following sequence information, but is not limited thereto.
  • XP_005004655.1 (guinea-pig: Cavia porcellus), ⁇ ⁇ 021503253.l (gerbi 1, Meriones unguiculatus), XP_002711778.1 (rabbit, Oryctolagus cuniculus), XP— 536777.2 (dog, Can is lupus familiar is), XP_003126904.2 (swine, Sus scrofa), XP_011755768.1 (monkey, Macaca nemestrina), XP_008984479.1 (marmoset, Callithrix jacchus), XP_019834275.1 (cow, Bos indicus), XP— 511115.2 (chimpanzee, Pan troglodytes).
  • Antibody (antibody) in the present invention is also called immunoglobulin (ilob unoglobulin, Ig), is a generic term for proteins that selectively participate in antigens and participate in biological immunity.
  • Ig immunoglobulin
  • Whole antibodies found in nature are usually composed of two pairs of light chains (LC) and heavy chains (HC), which are multi-domain polynucleotides, or these HC / LC
  • the basic structure is a two-pair structure of.
  • heavy chains constituting the antibodies of mammals represented by the Greek letters a, S, ⁇ , ⁇ , and ⁇
  • different types of heavy chains such as IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, respectively. It makes up the antibody.
  • the types of light chains that make up antibodies in mammals are ⁇ and ⁇ There are two kinds displayed.
  • the heavy and light chains of an antibody are structurally divided into variable and constant regions according to the variability of amino acid sequences.
  • the constant region of the chain consists of three or four heavy chain variants, including CHI, CH2 and CH3 (IgA, IgD and IgG antibodies) and CH4 (IgE and IgM antibodies), depending on the type of antibody.
  • the variable region of the light chain and the light chain is composed of a heavy chain variable region (VH) or a light chain variable region (VU), respectively.
  • the light and heavy chains are arranged in parallel with their respective variable and constant regions.
  • One heavy disulfide bond and two heavy chains linked to the light chain form two covalent disulfide bonds to form the entire antibody.
  • variable region including the site where the antibody binds to the antigen is determined by complementarity, which is a framework region (FR) having low sequence variability and a hypervariable region having high sequence variability.
  • complementarity which is a framework region (FR) having low sequence variability and a hypervariable region having high sequence variability.
  • CDRs complementary determining regions
  • VH and VL are three CDRs and four FRs, respectively, in the order of FR1— CDR1— FR2— CDR2— FR3-CDR3-FR4 in the direction from N to C to the end.
  • the present invention provides a lysyl-tRNA synthetase (KRS, Lysyl-tRNA).
  • KRS lysyl-tRNA synthetase
  • synthetase An antibody or fragment thereof that specifically binds to an epitope comprising the sequence of SEQ ID NO: 97 in the N-terminus, wherein the 'epi tope' specifically binds to the antibody.
  • Epitopes usually consist of surface groups of molecules such as amino acids or sugar side chains and generally have specific three-dimensional structural and specific charge characteristics.
  • Conformational and non-stereotropic epitopes are distinguished in that binding to conformational epitopes is lost in the presence of denaturing solvents but not for non-stereotropic epitopes.
  • Epitopes are amino acids that are directly involved in binding Acid residues (also referred to as immunogenic components of epitopes) and other amino acid residues not directly involved in binding, such as amino acid residues that are effectively blocked by specific antigen binding peptides (i.e., amino acid residues are put into specific antigen binding peptides).
  • the site where the N3 monoclonal antibody of the present invention derived from the KRS N-terminal sequence binds and the specific sequence is not particularly limited as long as it is a contiguous region including the amino acid represented by SEQ ID NO: 97 (klsknelkrr lka).
  • 13 to 52 including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97 more preferably 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30 '31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, or 42 may be composed of amino acid sequences.
  • the epitope of the present invention may be an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, and SEQ ID NO: 101 which are derived from human KRS N-terminus, and mouse
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, and SEQ ID NO: 106 may be derived from the KRS N-terminus, and is derived from the rat KRS N-terminus; It may be an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, and SEQ ID NO: 111.
  • the human KRS N-terminal region represented by SEQ ID NO: 75 (SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 101) And, most preferably, 15 to 42 amino acid sequences (SEQ ID NO: 101) of the human KRS N-terminal region represented by SEQ ID NO: 75.
  • SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 101
  • SEQ ID NO: 101 15 to 42 amino acid sequences of the human KRS N-terminal region represented by SEQ ID NO: 75.
  • a heavy chain complementarity determining region l comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 37;
  • Replenishment complementarity determining region 2 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 39;
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain complementarity determining region 3CCDR3) comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29, and SEQ ID NO: 41;
  • a light chain complementarity determining region l comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31, and SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 9, West
  • a light chain complementarity determining region 2 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 45;
  • a light chain variable region comprising a light chain complementarity determining region 3 (CDR3) comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35, and SEQ ID NO: 47; It is specified to include.
  • Antibodies composed of the CDR sequences have excellent ability to specifically bind to the KS N-terminal region exposed to the outer membrane. This is illustrated well in the specification examples of the present invention.
  • indirect EUSA secondary selection
  • Western blot (3rd screening)
  • immunoprecipitation (4th screening)
  • immunofluorescence staining (5th screening)
  • the hing-body or fragment thereof that specifically binds to the KRS N-terminal region exposed to the outer membrane is preferably an antibody comprising the CDRs of the heavy chain variable region and the light chain variable region as follows (i), (ii) ), (iii) and ( ⁇ ) represent CDR combinations of the N3, N5, N7 and N9 antibodies of the Examples, respectively:
  • a heavy chain complementarity determining region 1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a heavy chain complementarity determining region 2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • Light chain complementarity determining region 1 comprising the heavy chain variable region including the determining region 3 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and the light chain complementarity determining region 2 and the SEQ ID NO: 11 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • a light chain variable region comprising a light chain complementarity determining region 3 comprising an amino acid sequence represented;
  • heavy chain complementarity determining site 1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • heavy chain complementarity determining site comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain complementarity determining region 3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 and a light chain complementarity determining region 1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21
  • a light chain variable region comprising a light chain complementarity determining region 2 comprising a light chain complementarity determining region 3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 and a light chain complementarity determining region 2 including;
  • heavy chain complementarity determining region 1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25
  • heavy chain complementarity determining region 2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 and heavy chain complementarity comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29
  • a light chain complementarity determining region 1 comprising the heavy chain variable region including the determining region 3 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31, and a light chain complementarity determining region 2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 35
  • a light chain variable region comprising a light chain complementarity determining region 3 comprising an amino acid sequence to be formed;
  • a heavy chain comprising a heavy chain complementarity determining region 1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, a heavy chain complementarity determining region 2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39, and a heavy chain comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41;
  • Light chain complementarity determining region 1 comprising the heavy chain variable region comprising the complementarity determining region 3 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43, light chain complementarity determining region 2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 47
  • a light chain variable region comprising a light chain complementarity determining region 3 comprising an amino acid sequence represented by; The antibody or fragment thereof comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region selected from the group consisting of.
  • the antibody or fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region as follows:
  • the heavy chain variable region is SEQ ID NO: 49 (N3 VH), SEQ ID NO: 53 (N5 VH), SEQ ID NO: 57 (N7 VH) and SEQ ID NO: 61 (N9 VH) comprises an amino acid sequence selected from the group
  • the light chain variable region is SEQ ID NO: 51 (N3 VL), SEQ ID NO: 55 (N5 VL), SEQ ID NO: 59 (N7 VL), and SEQ ID NO: 63 (N9 VL).
  • the antibody comprising the chain variable region (VH) and the light chain variable region (VL) is specifically a sequence and sequence comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, and SEQ ID NO: 89
  • a light chain comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, and SEQ ID NO: 91 It may be an antibody characterized in that.
  • the antibody that binds to the antibody is not limited as long as it has the above CDR combination or VH and VL combination.
  • the antibody may be selected from the group consisting of IgG, IgA, IgM, IgE, and IgD, and preferably may be an IgG antibody.
  • the antibody of the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, as long as the antibody has a CDR combination or a VH and VL combination specifically binding to the KRS N—terminal region. It is preferred that the monoclonal antibody is a population of antibodies in which the amino acid sequences of the heavy and light chains are substantially the same.
  • Antibodies of the invention may be derived from any animal, including mammals, birds, etc., including humans, preferably derived from humans, or from animals of different species than those derived from humans It may be a chimeric antibody comprising a portion of one antibody. That is, the present invention includes all chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and preferably human antibodies.
  • the fragment of the antibody in the present invention means a fragment of the antibody that maintains the antigen-specific binding capacity of the whole antibody, preferably the fragment is at least 20%, 50%, of the KRS N-terminal binding affinity of the parent antibody, 70%, 80%, 90%, 95% or 100% or more. Specifically, it may be in the form of Fab, F (ab) 2, Fab ', F (ab') 2, Fv, diabody (diabody), scFv.
  • Fab fragment ant igen-binding
  • F (ab ') 2 represents an antibody It is a fragment produced by hydrolysis with pepsin, in which two Fabs are connected by disul fide bonds at the reinforcing hinges.
  • F (aV) is a monomer antibody fragment in which a heavy chain hinge is added to a Fab separated by reducing disulfide bonds of the F (ab ') 2 fragment.
  • Fv (variable fragment) is an antibody fragment consisting only of the variable region of each of the heavy and light chains.
  • scFvCsingle chain variable fragment is a recombinant antibody fragment in which the variable chain region (VH) and the light chain variable region (VL) are linked by a flexible peptide linker.
  • Diabody refers to a fragment in which VH and VL of scFv are linked to each other by a very short linker, and thus cannot bind to each other, and form dimers by combining with VL and VH of another scFv of the same type.
  • fragments of antibodies are not limited in structure or form as long as they retain binding specificity for the KRS N-terminal region exposed to the outer membrane, but may preferably be scFv.
  • the scFv according to the present invention has a CDR configuration specific to the KRS N-terminal region as described above, or a VH and VL configuration. If the C-terminus of the VH and the N-terminus of the VL are linked through a linker, the sequence is particularly limited. It doesn't work.
  • the linker is not particularly limited as long as it is known in the art as a linker applied to scFV, but may be a peptide including an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 65.
  • the scFV of the present invention specifically comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID 67 (N3 scFv), SEQ ID 69 (N5 scFv), SEQ ID 71 (N7 scFv) and SEQ ID 73 (N9 scFv) It may be.
  • Antibodies or fragments thereof of the invention may comprise conservative amino acid substitutions (called conservative variants of the antibody) that do not substantially alter their biological activity.
  • the above-described antibodies of the present invention or fragments thereof may be conjugated to enzymes, fluorescent materials, radioactive materials and proteins, and the like.
  • methods for conjugating the material to antibodies are well known in the art.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the antibody or fragment thereof according to the present invention described above.
  • a polynucleotide is described as a ligonucleotide or nucleic acid.
  • DNA molecules e.g., cDNA or genomic DNA
  • NA molecules e.g. mRNA
  • analogs of the DNA or RNA generated using nucleotide analogues e.g., Peptide nucleic acids and non-naturally occurring nucleotide analogues
  • the polynucleotide may be single-stranded or double stranded.
  • the polynucleotide refers to a nucleotide sequence encoding an antibody consisting of a heavy chain and a light chain having a CDR configuration specific to the KRS N-terminal region, or a VH and VL configuration.
  • the sequence is not particularly limited as long as it encodes the antibody or fragment thereof, and encodes the aforementioned CDR sequences in the antibody according to the present invention.
  • the polynucleotide is not particularly limited in sequence, but preferably SEQ ID NO: 2 (heavy chain CDR1), SEQ ID NO: 4 (heavy chain CDR2), SEQ ID NO: 6 (heavy chain CDR3), SEQ ID NO: 8 (light chain CDR1), SEQ ID NO: 10 (light chain) CDR2), SEQ ID NO: 12 (light chain CDR3), SEQ ID NO: 14 (heavy chain CDR1), SEQ ID NO: 16 (heavy chain CDR2), SEQ ID NO: 18 (heavy chain CDR3), SEQ ID NO: 20 (light chain CDR1), SEQ ID NO: 22 (light chain CDR2) SEQ ID NO: 24 (light chain CDR3), SEQ ID NO: 26 (heavy chain CDR1), SEQ ID NO: 28 (light CDR2), SEQ ID NO: 30 (heavy chain CDR3), SEQ ID NO: 32 (light chain CDR1), SEQ ID NO: 34 (light chain CDR2), SEQ ID NO: 36 (light
  • polynucleotides encoding the above-mentioned VH and VL in the antibody according to the present invention are not particularly limited in sequence, but are preferably SEQ ID NO: 5CKVH), SEQ ID NO: 52 (VL) f SEQ ID NO: 54 (VH), sequence It may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 56 (VL), SEQ ID NO: 58 (VH), SEQ ID NO: 60 (VL), SEQ ID NO: 62 (VH) or SEQ ID NO: 64 (VL).
  • polynucleotide encoding the fragment of the antibody is preferably any one of the base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72 and SEQ ID NO: 74 encoding the scFv according to the present invention It may be included.
  • Polynucleotides encoding the antibodies of the invention or fragments thereof are well known in the art. Can be obtained by known methods. For example, on the basis of DNA sequences encoding a part or all of the heavy and light chains of the antibody or amino acid sequences, ligonucleotide synthesis techniques well known in the art, such as polymerase chain reaction (PCR), are known.
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding an antibody or fragment thereof according to the present invention.
  • recombinant can be used interchangeably with 'genet ic manipulat ion', and it is possible to use natural cloning experiment techniques such as modifying, cutting, and linking genes. It means the production of genes that do not exist in the state.
  • the expression (expression) means that the protein or nucleic acid is produced in the cell.
  • a recombinant expression vector is a factor capable of expressing a protein or nucleic acid (RNA) of interest in a suitable host cell, and is essential for operably linked polynucleotide (gene) inserts.
  • Gene constructs that contain regulatory elements are operably l inked to functionally link nucleic acid expression control sequences with nucleic acid sequences encoding a protein or A of interest to perform a general function. inkage), which means that genes are linked by expression control sequences.
  • the expression control sequence refers to a DNA sequence that regulates the expression of a polynucleotide sequence operably linked in a particular host cell, such a control sequence is a promoter for performing transcription, regulating transcription Any operator sequence, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, a sequence regulating termination of transcription and translation, an initiation codon, a termination codon, a pliadenylation signal, an enhancer, and the like.
  • the recombinant expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it is a vector commonly used in the cloning field, and examples thereof include, but are not limited to, plasmid vector, cosmid vector, bacteriophage vector, and viral vector.
  • the plasmids include E. coli-derived plasmids (pBR322, pBR325, pUC118 and pUC119, pET-22b (+)), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUBllO and pTP5) and yeast-derived plasmids ( ⁇ 13, ⁇ 24 and YCp50), and the like.
  • Viruses can be used such as retroviruses, animal viruses such as adenoviruses or vaccinia viruses, and narcotic viruses such as baculoviruses.
  • the recombinant expression vector according to the present invention is a polynucleotide encoding the above-described CDR capable of specifically binding to the KRS N-terminal region, or an antibody or fragment thereof consisting of heavy and light chains having the composition of VH and VL. Means a gene construct operably linked to be expressed in an appropriate host cell.
  • the polynucleotides encoding the light chain and the light chain of the antibody according to the present invention may be included in separate recombinant expression vectors, or may be included in one recombinant expression vector.
  • the present invention provides a cell transformed with the recombinant expression vector described above.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell that can be used to express a polynucleotide encoding an antibody or fragment thereof contained in the recombinant expression vector of the present invention.
  • Cells (host cells) transformed with the recombinant expression vector according to the present invention may be prokaryote (eg, E. coli), eukaryote (eg, yeast or other fungus), plant cells (eg, tobacco or tomato). Plant cells), animal cells (eg, human cells, primitive cells, hamster cells, rat cells, mouse cells, tortilla cells or hybridomas derived from them).
  • Prokaryotes suitable for this purpose are Gram-negative or Gram-positive organisms, for example Enterobacteriaceae, for example Escherichia. E. coli, Enter obacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g. Salmonella typhi Salmonella typhimurium, Serratia, for example Serratia marcescans and Shigella, and Vasily (Bacilli), for example rain. Subtilis (B. subtil is) and b. B. licheniformis, Pseudomonas, for example P. aeruginosa, and Streptomyces.
  • Enterobacteriaceae for example Escherichia.
  • E. coli Enter obacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus
  • Salmonella e.g. Salmonella typhi Salmonella typhimurium
  • Serratia for example Serratia marcescans and Shigella
  • Vasily for example rain
  • the cells of the present invention are not particularly limited as long as the cells of the present invention can express the vector of the present invention.
  • Saccharomyces cerevisiae is most commonly used as a eukaryotes.
  • many other genera, species and strains include, but are not limited to, for example, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces hosts, eg K. K.lactis, K. IL fragilis (ATCC 12,424), K, K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. K.wickeramii (ATCC 24,178), K. K. waltii (ATCC 56,500), K. K.
  • drosophi larum ATCC 36,906
  • K. Themorerlans K. thermotolerans and K. mar i anus
  • yarrowia EP 402,226
  • Pichia pastoris EP 183,070
  • Candida Trichoderma reesia EP 244,234
  • Neurospora crassa Schwanniomyces, for example Schwanniomyces oxydentalis And filamentous fungi such as neurospora, Penici Ilium, tolypocladium and Aspergillus hosts, for example A.
  • transformation 1 refers to a modification of the genotype of a host cell by the introduction of an exogenous polynucleotide, and irrespective of the method used for the transformation.
  • Exogenous polynucleotide into host cell The exogenous polynucleotide introduced into the host cell can be integrated into the genome of the host cell and maintained without being integrated or maintained, and the present invention includes both KRS N-terminal regions according to the present invention.
  • Recombinant expression vectors capable of expressing antibodies or fragments thereof that specifically bind to are known in the art, including but not limited to transient transfect ion, microinjection, transduction transfusion, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome mediated transfection (iposome—mediated t rans feet ion), DEAE dextran-mediated transfect ion, polybrene-mediated transfect ion, electroporat ion It may be introduced and transformed into cells for producing antibodies or fragments thereof by known methods for introducing nucleic acids into gene guns and cells.
  • the present invention (a) transforming the host cell with the recombinant expression vector;
  • Step (a) is a step of transforming a host cell with a recombinant expression vector operably linked to a polynucleotide encoding said antibody or fragment thereof to produce an antibody or fragment thereof according to the invention.
  • Recombinant expression vectors comprising the sequences of the heavy and light chains may be co-transformed in the same host cell so that the heavy and light chains are expressed in one cell, or the recombinant expression vectors comprising the base sequences of the heavy and light chains. It can also be transformed into a separate host cell, so that the heavy and light chains are expressed separately.
  • Step (b) is a step of culturing the transformed host cell to produce a polypeptide of the heavy chain, light chain or antibody fragment of the antibody from the recombinant expression vector introduced into the host cell.
  • the medium composition, culture conditions, culture time, etc. for culturing the host cell can be appropriately selected according to methods commonly used in the art.
  • Hing-body molecules produced in host cells can be accumulated in the cytoplasm of cells, secreted into cells or culture medium by appropriate signal sequences, or targeted to periplasm.
  • the antibody according to the present invention can be protein refolded (refolded) using a method known in the art to maintain the binding specificity for the KRS N-terminus It is desirable to have a conformat ion.
  • the heavy and light chains when producing an IgG-type antibody, may be expressed in separate cells, and in a separate step, the heavy and light chains may be contacted to form a complete antibody, and the heavy and light chains may be expressed in the same cells. It may be possible to form a complete antibody inside the cell.
  • Step (c) is a step of obtaining an antibody or fragment thereof produced in the host cell.
  • Those skilled in the art can appropriately select and control the obtaining method in consideration of the characteristics of the antibody or fragment polypeptide thereof produced in the host cell, the characteristics of the host cell, the mode of expression or whether the polypeptide is targeted.
  • the antibody secreted in the culture medium or fragments thereof can dilute the antibody by obtaining a medium in which the host cells are cultured, and centrifuging to remove impurities.
  • the cells may be lysed in a range that does not affect the functional structure of the antibody or fragment thereof in order to release and recover the antibody present in a specific organelle or cytoplasm outside the cell.
  • the obtained antibody may be further subjected to a process of further removing and concentrating the ball impurities through a method of chromatography, filtration by a filter, or the like.
  • the polypeptide of the production (production) method of the present invention may be the antibody of the present invention or a fragment thereof, or another amino acid sequence of the antibody of the present invention or the fragment thereof may be further bound. In this case, it can be removed from the antibody or fragment thereof of the present invention using methods well known to those skilled in the art.
  • Antibodies or fragments thereof of the invention specifically bind to the KRS N-terminus and are therefore useful in diagnostic assays, for example, to detect and quantify KRS proteins in specific cells, tissues, or serum.
  • the KRS N TM terminal exposed to the extracellular membrane can be specifically detected without lysing the cells.
  • the present invention provides a method for preparing a test article, the method comprising contacting the antibody or fragment thereof with a sample; And detecting said antibody or fragment thereof.
  • the detection method of the present invention may be performed by using the antibody or fragment thereof according to the present invention before contacting the antibody or fragment thereof according to the present invention with a sample. It may include the step (step (1)) of preparing a sample for measuring the presence and concentration of KRS N-terminal peptide exposed to.
  • the sample may be cells or tissues obtained from a biopsy collected from a subject to diagnose cancer (especially breast cancer or lung cancer) or cancer metastasis, blood, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, and the like.
  • the method of detecting a protein using the antibody is not limited thereto, for example, Western blot, immunoblot, dot blot, immunohistochemistry, enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay
  • a sample or a cell lysate may be prepared by adding a buffer suitable for electrophoresis and boiling.
  • Preprocessing such as blocking can be performed.
  • the antibody according to the present invention is the above-described CDR, or an antibody having a constitution of VH and VL and specifically binding to the KRS N-terminus, or the like, as described above for the specific kind and sequence configuration.
  • the antibody or fragment thereof can be generally labeled with a detectable moiety for its 'detection'. See, eg, Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wi ley-Interscience, New York, NY, Pubs, can be labeled with radioisotopes or fluorescent labels using the techniques described. Or various enzyme-substrate labels are available, examples of such enzymatic labels include luciferase, luciferin, 2, 3-dihydrope, such as Drosophila luciferase and bacterial luciferase (US Pat. No. 4,737,456).
  • Peroxidases such as thalazinediones, malate dihydrogenase, urase, horseradish peroxidase (HRP0), alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucoamylase, lysozyme, sacchara Id oxidase (for example glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase), heterocyclic oxidase (for example freecase and xanthine oxidase), lactoperoxidase, Microperoxidase and the like.
  • HRP0 horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase
  • ⁇ -galactosidase glucoamylase
  • lysozyme sacchara Id oxidase
  • glucose oxidase for example glucose oxidase, galactose
  • the label can be conjugated directly or indirectly to the antibody using a variety of known molecules.
  • the antibody may be conjugated to biotin and any labels belonging to the three broad categories mentioned above may be conjugated with avidin and vice versa. Biotin binds selectively to avidin and thus the label can be conjugated to the antibody in this indirect manner.
  • the antibody may be conjugated with a small hapten (eg, digoxin) and one of the different types of labels mentioned above may be -Can be conjugated to a hapten antibody (eg anti-dioxine antibody).
  • a small hapten eg, digoxin
  • the term "contacting" is used in its general sense, and means to mix, bond or contact two or more materials with each other.
  • Cross-contact can be performed in vitro or in another container, and can also be performed in si tu, in vivo, in vivo, in tissue, in cells,
  • the step (3) of detecting the antibody or fragment thereof according to the present invention is performed in the sample after the step (2).
  • the 'detection' refers to a complex of an antibody or a fragment thereof and an antigen according to the present invention formed in a sample, and the presence of a peptide (or a protein containing the same, for example, KRS) of the RS N-terminal region. Detecting presence or absence or measuring the level of the peptide (including both qualitative and quantitative measurements). Therefore, after performing step (2) and before the detection step (step (3)) described later, the step of removing the extra antibody or fragments thereof that do not form a complex with the KRS N-terminal region may be further included.
  • the antibody or fragment thereof used in step (2) described above contains a detectable moiety such as directly labeled with fluorescence, radioisotopes, enzymes, or the like
  • a method known in the art for detecting the moiety Accordingly detection can be performed.
  • radioactivity may be measured by, for example, scintillation counting (scint il lat ion counting).
  • the fluorescence can be quantified using a fluorometer.
  • a secondary antibody labeled with fluorescence, radioactivity, enzyme, etc. is used as known in the art. Can be detected indirectly. Said secondary antibody binds to an antibody according to the invention or a fragment thereof (primary antibody).
  • human KRS lysyl-tRNA synthethase
  • KRS terminal extension (N-ext) region is known to be essential for the trans locat ion of the KRS.
  • KRS N-ext regions are specifically involved in their interaction with 67LR.
  • Antibodies and fragments thereof according to the present invention have an excellent specific binding ability to the KRS N-ext region, and inhibit the metastasis of cancer by inhibiting the binding (interaction) with the laminin receptor as it is actually bound to the S N-ext region. Excellent ability to do This is illustrated well in the specification examples of the present invention. In the present specification, it was confirmed that the tumor-induced in vivo cancer metastasis mouse model showed superior cancer metastasis efficacy in which the antibody-administered antibody according to the present invention was administered. In particular, compared with the YH16899 compound known to inhibit the metastasis by inhibiting the interaction of the laminin receptor (67LR) and KRS, the cancer metastasis inhibitory effect was shown to be excellent. Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis, and a composition for diagnosing cancer, comprising the above-described antibody of the present invention or a fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis, and a composition for diagnosing cancer, comprising the antibody of the present invention or a fragment thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis, and a composition for diagnosing cancer, consisting essentially of the above-described antibody of the present invention or fragments thereof.
  • the cancer is not particularly limited if it is known in the art as a malignant tumor, breast cancer, colon cancer, lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or eye Internal melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal, anal, colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, vaginal cancer, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, vice Thyroid cancer, Adrenal cancer, Soft tissue sarcoma, Urethral cancer, Penile cancer, Prostate cancer, Chronic or acute leukemia, Lymphocytic lymphoma, Bladder cancer, Kidney or
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune cell migration-related diseases consisting of the above-described antibody of the present invention or fragments thereof.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune cell migration-related diseases consisting essentially of the above-described antibody or fragments of the present invention.
  • immune cell in the present invention preferably means monocytes or macrophages.
  • immune cell migration related disease in the present invention is not particularly limited if the specific immune system is known in the art that excessive immune cell migration (and infiltration) is the major pathogenesis, for example cardiovascular fibrotic disease It may be selected from the group consisting of chronic inflammatory disease and Alport syndrome.
  • the specific cardiovascular disease is not particularly limited, but may be selected from the group consisting of pulmonary arterial hypertension, atherosclerosis, angina pectoris, myocardial infarction, ischemic cerebrovascular disease, arteriosclerosis, and mesenteric sclerosis.
  • the fibrotic disease is not particularly limited in its specific kind, for example, scleroderma, rheumatoid arthrit is, Crohn's disease s disease, ulcerative colitis, myelofibrosis, pulmonary fibrosis, hepathic fibrosis, liver cirrhosis, kidney fibrosis, myofibrosis ), Cardiac fibrosis, systemic lupus erythematosu, hereditary fibrosis, infectious fibrosis (especially fibrosis due to persistent infection), irritant fibrosis (fibrosis due to repeated exposure to irritants such as tobacco and toxic substances), chronic Fibrosis due to autoimmunity, fibrosis due to antigen incompatibility during organ transplantation, fibrosis due to hyperlipidemia, fibrosis due to obesity, diabetic fibrosis, fibrosis due to hypertension, and obstruction due to fibrosis upon stent insertion have.
  • the chronic inflammatory diseases include asthma, atopic dermatitis, eczema, psoriasis, osteoarthritis, gout, psoriatic arthritis, cirrhosis, non-alcoholic steatohepatitis, chronic obstructive pulmonary disease, rhinitis, diabetic retinopathy, diabetes It may be selected from the group consisting of sex renal failure, diabetic neuropathy and multiple sclerosis- the pharmaceutical composition according to the present invention comprises the antibody or fragment thereof of the present invention alone or at least one pharmaceutically acceptable carrier
  • pharmaceutically acceptable means physiologically acceptable and, when administered to humans, does not inhibit the action of the active ingredient and allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like.
  • the antibody or fragment thereof may be administered in a variety of oral and parenteral formulations during clinical administration, and when formulated, the commonly used layering agent, extender, deficiency agent, It may be prepared using wetting agents, disintegrating agents, diluents or excipients of surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, patients, powders, granules, capsules, troches, and the like, which may be added to at least one aryl derivative of Formula 1 of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • At least one excipient may be prepared by mixing, for example, starch, carbonate, sucrose or lactose or gelatin.
  • lubricants such as stearic acid magnesium, talc and the like may also be used in addition to the simple brothers.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, or syrups.
  • various excipients may be used. For example, wetting agents, sweetening agents, fragrances, preservatives and the like can be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the therapeutic compositions of the present invention may be prepared by any physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Remington: The Science and Pract ice of Pharmacy, 19th Edit ion, Al fonso, R., ed, Mack Publishing Co. (Eastern). , PA: 1995)) and antibodies with the desired purity can be prepared in the form of lyophilized cakes or aqueous solutions for storage.
  • Acceptable carriers, excipients or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include monolayer solutions such as phosphoric acid, citric acid and other organic acids; Antioxidants including ascorbic acid; Low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; Proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; Hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; Amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; Monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates including glucose, mannose, or textrin; Chelating agents such as EDTA; Sugar alcohols such as mannirol or sorbbi; Salt-forming counterions such as sodium; And / or nonionic surfactants such as tween, pluronics or polyethylene glycol (PEG).
  • monolayer solutions such as phosphoric acid, citric acid and other organic acids
  • Antioxidants including ascorbic acid
  • the antibody of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount to a subject suffering from cancer or a subject suffering from immune cell migration related diseases.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount that exhibits a higher response than a negative control, and preferably an amount sufficient to treat cancer or an amount sufficient to suppress cancer metastasis and immune cell migration. A sufficient amount to treat the disease involved.
  • the total effective amount of the antibody or fragment thereof of the present invention may be administered to a patient in a single dose, and administered by a long-term, multiple dose administered, split ionated treatment protocol. Can be.
  • the dosage of the antibody or fragment thereof of the present invention to human body is generally 0.01-100 tng / kg / week, preferably 0.1 20 mg / kg / week, more preferably 5-10 mg / kg / week Can be.
  • the dose of the antibody or fragment thereof of the present invention may be adjusted to the patient in consideration of various factors such as the age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet and excretion, as well as the route of administration and the frequency of treatment of the pharmaceutical composition.
  • the effective dosage is determined, one of ordinary skill in the art can determine the appropriate effective dosage for the specific use of the antibody or fragment thereof as a cancer metastasis inhibitor.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited to the formulation, route of administration and method of administration as long as the effect of the present invention is shown.
  • the route of administration of the compositions of the invention may be by injection or infusion by known methods of antibody administration, for example intravenous, intraperitoneal, intracranial, subcutaneous, intramuscular, intraocular, intraarterial, intrathecal, or intralesional routes, or It may be injection or infusion with the described sustained release system, but is not limited thereto.
  • the antibodies of the invention may be administered systemically or locally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, hormonal therapy, chemotherapy and biological response modifiers for the prevention or treatment of cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, hormonal therapy, chemotherapy and biological response modifiers for the prevention or treatment of diseases related to immune cell migration.
  • Diagnosis and prognostic assessment of gonorrhea (or cancer metastasis) according to the invention can be carried out by detecting KRS proteins (especially KRS N-terminal regions exposed to the cell membrane) in biological samples, diagnostic and prognostic evaluation of disorders related to cell migration can be carried out by the Department biological sample from the KRS protein (in particular, the KRS N- terminal region exposed to the outer membrane) gum, the term (diagnosis, in the present invention, and Pathology
  • the diagnosis is to determine whether cancer or / and cancer metastasis, immune cell migration-related disease, and the likelihood (risk) of the disease.
  • Xing-bi biological samples include solid tissue samples such as, or cells derived therefrom, such as guitin liquid samples, biopsy samples, tissue cultures of blood and biological origin. More specifically, for example, but not limited to, tissues, extracts, cell lysates, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, peritoneal fluid, and the like.
  • the sample can be obtained from an animal, preferably a sachet, most preferably a human. The sample is used for detection It can be pretreated before use.
  • the antibody or fragment thereof according to the present invention may be provided as a diagnostic kit, and the kit is not particularly limited as long as it is known in the art as an assay kit for providing an antibody or a peptide having a specific binding domain as a component. Examples include Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oakteroni immunodiffusion, locate immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, kit for FACS or protein chips. do.
  • Antibodies or fragments thereof of the invention can be used in packaged combinations of reagents in predetermined amounts with instructions for use in the kit, ie diagnostic kits for performing diagnostic assays.
  • the kit may contain the cofactors required by the enzyme as substrate precursors to provide the substrate and chromophores or fluorophores.
  • other additives may be included, such as stabilizers, buffers (eg, barrier completes or dissolved completes).
  • the relative amounts of the various reagents can be varied widely to provide a concentration in solution of the reagent that fully optimizes the sensitivity of the assay.
  • the reagent may be provided as a generally lyophilized, dry powder, comprising an excipient that will provide a reagent solution with the appropriate concentration upon dissolution.
  • the present invention provides the use of the aforementioned antibody or fragment thereof of the present invention for the preparation of an agent for inhibiting cancer metastasis.
  • the present invention provides a method for inhibiting cancer metastasis, wherein an effective amount of the antibody or fragment thereof of the present invention described above is administered to an individual in need thereof.
  • the present invention provides the use of the above-described antibody of the present invention or a fragment thereof for preparing a diagnostic agent for cancer.
  • the present invention provides a method for diagnosing cancer, comprising administering to the subject in need thereof an effective amount of the antibody of the present invention or a fragment thereof.
  • the present invention provides the use of the above-described antibody of the present invention or a fragment thereof for the preparation of a therapeutic agent for the treatment of immune cell migration related diseases.
  • the present invention provides a method of treating an immune cell migration-related disease, characterized by administering an effective amount of the aforementioned antibody or fragment thereof to a subject in need thereof.
  • effective amount of the present invention, when administered to an individual, refers to an amount that exhibits an effect of improving, treating, preventing, detecting, diagnosing or inhibiting cancer metastasis of cancer, and improving or treating immune cell migration-related diseases.
  • the term “individual” refers to an animal, preferably a mammal, particularly an animal including a human, and may be a cell, tissue, organ or the like derived from an animal. The subject may be a patient in need of the effect.
  • the term 'treatment' of the present invention broadly refers to ameliorating symptoms of cancer or cancer-related diseases or cancer-related diseases, immune cell migration-related diseases, which cure or substantially prevent or improve the condition of such diseases. It may include, but is not limited to, alleviating, healing or preventing one symptom or most of the symptoms resulting from cancer or cancer-related diseases.
  • the term 'compr i sing' of the present invention is used in the same way as 'containing' or 'characteristic', and in the composition or method, additional component elements or method steps, which are not mentioned, are used. Do not exclude 'Consisting of (consist ing of) "is a term meant to exclude the additional element, step, or ingredient, etc. are not described separately di ⁇ .
  • the term 'essent i al ly consist ing of' includes, in the scope of a composition or method, a component element or step that is described, as well as a component element or step that does not substantially affect its basic properties, and the like. Meaning that.
  • Antibodies or fragments thereof according to the present invention have specific CDR (complementarity determining region) sequences as described herein and are specific to KRS N-terminal regions exposed to the extracellular membrane. The combined ability is very good.
  • CDR complementarity determining region
  • the effect of inhibiting cancer metastasis by inhibiting the interaction between the laminin receptor and the KRS N-terminal region is excellent, and can regulate the migration of immune cells. It has a very significant effect on the prevention, improvement and treatment of diseases related to cell migration.
  • FIG. 1 shows the results of screening scFv phage clone binding to the RRS full-length sequence or KRS N-terminal fragment via Western blot (TO).
  • Figure 2 shows the results of screening scFv phage clone binding to the KRS full-length sequence or KRS N-terminal fragments via immunoprecipitation (IP).
  • FIG. 3A illustrates the production of cells exposing KRS—N-terminal regions to cell membranes through expression of myc-KRS T52D (act mutant), and confirming that scFV clones of N3, N5, N7 and N9 bind to the exposed regions, respectively. Results are shown (KRS: means myc-KRS T52D).
  • FIG 3B shows that in the activating mutant (myc-KRS T52A) or laminin untreated (WT-KRS) expression group, no exposure of KRS-N terminal region to the cell membrane occurs, thereby treating scFv clones of N3, N5, N7 and N9. Also shows no detection signal.
  • Figure 3C shows that myc-labeled cells transformed with WT—KRS, T52D, and T52A were treated with laminin and then stained with scFv. The membrane local izat ion and T52D mutant by laminin of WT—KRS were in a similar position. It was stained and the transformed myc was also stained at the same position, showing that it was not stained in T52A (scFv: green, myc: red).
  • 5A is representative of the KRS of N3 IgG and N5 IgG among antibodies of the invention. The binding capacity is confirmed by Western blot. 5B shows a result of confirming the binding ability of N3 IgG and IgG to KRS among the antibodies of the present invention by immunoprecipitation.
  • Figure 6A shows the result of quantitatively confirming the binding force to the KRS N-terminus of N3 IgG through the SPR method.
  • Figure 6B shows the result of quantitatively confirming the binding force to the KRS terminal of N5 IgG through the SPR method.
  • FIG. 7A shows that the cells transformed to express WT-KRS are treated with laminin to expose the N-terminal region of KRS to the extracellular membrane, followed by binding to the exposed region by treating antibody N3 IgG of the present invention. The result confirmed by the immunofluorescence staining method is shown.
  • Figure 7B is a T 52 D-KRS (act ive mutant, myc tagged KRS) to produce a cell exposed to the KRS-N terminal region in the cell membrane, and the antibody IgG treatment of the present invention binding to the exposed region It shows the result confirmed by the immunofluorescent staining method. In addition, in experiments imparting permeability to the cell membrane, it was confirmed that the antibody of the present invention was able to bind to the KRS protein present in the cell.
  • FIG. 7C shows that the N-terminal region of KRS is exposed to the extracellular membrane by laminin treatment of cells transfected with WT-KRS, and then the antibody N5 IgG of the present invention is bound to the exposed region.
  • FIG. 1 The result obtained by the immunofluorescence staining method is shown (N5 IgG: green).
  • Figure 8 shows the results confirmed by the MTT assay method that the antibody N3 IgG of the present invention is not cytotoxic
  • Figure 9A shows the result confirmed that the cell migration (cel l migrat ion) is inhibited by the antibody N3 IgG of the present invention.
  • 9B shows the results confirming that the antibody N3 IgG of the present invention significantly inhibited cell migration (cel l migrat ion) in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 10 schematically shows the construction of a mouse cancer metastasis model and the schedule of administration of a therapeutic substance (antibody or YH16899), and an experimental schedule for observing lung metastasis from the mouse model in an experiment with an in vivo cancer metastasis model.
  • FIG. Shows a mouse lung specimen, which can confirm that lung metastasis of cancer was significantly suppressed by administration of the antibody N3 IgG of the present invention in an in vivo cancer metastasis model.
  • the number and condition of the nodules present in the lung sample can be used to assess the progress and severity of cancer metastasis.
  • FIG. 12 shows the results confirming that the administration of the antibody N3 IgG of the present invention significantly inhibited the generation of pulmonary nodules (ie, significantly inhibited lung metastasis of cancer) in the in vivo cancer metastasis model.
  • Figure 13 shows the control of the lung tissue in the control group and N3 IgG control group, the control group compared with the antibody treatment group of the present invention it was confirmed that the laminin receptor is significantly expressed in the metastatic nodule site.
  • FIG. 14 shows lung samples in the control group, the YH16899-treated group and the N3 IgG-treated group, respectively, showing that the generation of pulmonary nodules was significantly suppressed compared to the control group in the YH16899-treated group and the N3 IgG-treated group.
  • Figure 15 shows the lung metastasis inhibition efficiency (pulmonary nodule production inhibition efficiency) according to the treatment concentration of X-phase cancer metastasis inhibitor substances in the YH16899 treatment group, N3 IgG treatment group.
  • Figure 16 shows the results of quantitatively confirming the binding capacity of the peptide fragment (Fl, F2, F3, F4, F5) of the KS N-terminal of N3 IgG human aiuman, h through the SPR method (gray bars at the bottom of the column Indicates the binding strength of the N3 antibody to the corresponding region (F1 to F5), the darker the color of the bar, the higher the binding strength).
  • FIG. 17 quantitatively confirms the binding capacity of the peptide fragment (Fl, F3 f F5) of the human (h), mouse (mouse, m), 3 ⁇ 4 (rat, r) KRS N ⁇ terminal of the N3 IgG through the SPR method (The gray bar at the bottom of the sequence indicates the binding force of the N3 antibody to the corresponding area (F1 to F5), indicating that the color of the bar shows a strong binding strength-).
  • FIG. 18A shows the effect of collagen, fibronectin and laminin on immune cell (monocyte / macrophage) migration. Transwell cell migration assay. As a result of the comparison, microscopic images of migrating ceil are shown.
  • FIG. 18B is a graph showing the number of cells measured (quantified) in the microscope image of FIG. 18A.
  • 19A shows the results of comparing the effects of various laminin subtypes (LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521) on immune cell (monocyte / macrophage) migration in a transwellli migration assay.
  • LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521 As an example, microscopic images of migrating cells are shown.
  • FIG. 19B is a graph showing the number of cells measured (quantitative) in the microscopic image of FIG. 19A.
  • Figure 19c shows the results confirmed by Western blot increase in the monocyte / macrophage membrane by LN421 treatment.
  • 20A shows the microscopic image of migrating ceil as a result of comparing the migration inhibitory effect of the antibody N3 IgG of the present invention on monocyte / macrophage migration specific to LN421 by a transwellli migration assay.
  • 20b is a graph showing the number of cells measured (quantitative) in the microscopic image of FIG. 20a.
  • Figure 20C shows the results confirmed by Western blot that the increased KRS level in the monocyte / macrophage membrane by LN421 treatment is reduced by the antibody N3 IgG treatment of the present invention.
  • FIG. 21A shows the change of right ventricular end-systol ic pressure (RVESP) of pulmonary hypertension (PAH) momel by antibody N3 IgG administration of the present invention (Mock IgG: negative control, Ab Irapk: N3 antibody linpk, Ab lOmpk: N3 antibody lOmpk, si ldenaf il: positive control).
  • RVESP right ventricular end-systol ic pressure
  • PAH pulmonary hypertension
  • FIG. 21B shows left ventricular end-systol ic pressure (LVESP) change in pulmonary hypertension (PAH) model by administration of antibody N3 IgG of the present invention (Mock IgG: Negative control, Ab Impk: N3) IG lmpk, Ab lOmpk: N3 IgG lOmpk, si ldenaf il: positive control). 22 is a result confirmed by IHC staining that immune cell migration and infiltration are reduced by administration of the antibody N3 IgG of the present invention in pulmonary arterial hypertension (PAH) model.
  • PAH left ventricular end-systol ic pressure
  • the HA tag was used to select scFv that specifically binds to the KRS N-terminal (SEQ ID NO: 75) region exposed to the outer membrane when it is moved to the cell membrane by laminin signaling.
  • Phage display panning experiments were performed using scFv phage l ibrary derived from labeled human B cells. In this experiment,
  • ScFv display phage 1 ibraryCLibrary size: app. 7.6 x 10 Library produced by prof. Hyunbo Shim) is described in Korean Patent Registration No. 10—0961392. All. As shown in Table 1 below, KRS fragments of different regions of KRS full-length sequence and N-terminal positions were used as antigenic proteins for phage di splay panning experiments.
  • Antigen protein of lOyg was added to the Immmo-tube containing lml of IX PBS solution and reacted for 1 hour at 37 ° C, 200rpm to coat the antigen on the inner surface of the rib. The antigen solution was decanted and washed once with brine to remove the uncoated antigen.
  • IX PBST PBS containing 0.05 tween20
  • scFv l ibrary was added and reaction was carried out at 37 ° C. and 150 rpm for 1 hour to bind the scFv phage to the antigen.
  • unbound scFv phage was removed by washing 2 to 5 times with IX PBST.
  • the scFv phage specifically bound to each KRS antigen was isolated within 10 minutes by adding tr i ethylamine (lOOmM) lral at room temperature and neutralized with Tr i sClM, pH 7.4). ER2537 incubated with filtered phage scFv at 0D ⁇ 1. It was added to co / / and infected while incubating for 1 hour 30 minutes at 37V, 120rpm. The phage infected E. coii was centrifuged to remove some of the culture supernatant and then re-dispersed and applied to agarose plates 15 cm in diameter containing ampicillin and glucose (2%).
  • the scFv expressed by the phage selected in Example ⁇ 1-1> binds to the above-mentioned RS full-length or terminal fragments and was examined by indi rect ELISA.
  • the scFv product obtained by repeating panning three times was diluted and applied to 10 cm diameter agarose plates, and the next day, each colony was selected and 200 ⁇ l of SB Each well was cultured in a 96 well plate containing medium ⁇ confirmed that the overall growth was good, and IPTG (lmM) was added and incubated at 30 ° C for 16 hours to induce the production of scFv.
  • IPTG lmM
  • Example ⁇ 1-2> the sequence was analyzed to filter out identical Abs with overlapping CDR sequences in 93 colonies selected by ELISA screening. Specifically, sequencing was performed in the following way: E. coli cultures containing scFv clones were incubated and phagemids were obtained with miniprep. This sequence was confirmed using Omp primer (Hye young Yang, et. Al., 2009, Mol. Cells 27, 225-235). The sequence thus obtained was confirmed using the Bioedit program to determine the sequence of the CDR region of phagemid. Of these, clones with duplicated CDR sequences were removed to identify scFv clones of each of the independent CDR sequences. [Table 2]
  • Example ⁇ 1-3> The 38 scFV clone isolates in Example ⁇ 1-3> were confirmed by Western blot whether they specifically bind to KRS.
  • the scFv-positive single colony clone was cultured in 5 ml of kanamycin-containing SB medium (Bactotrytone 30g, yeast extract 20g, MOPS buf fer lOg / L) to start seed culture.
  • kanamycin-containing SB medium Bacillus subtilis
  • IPTG IPTG was imMed and cultured overnight at 30 ° C to express scFv protein in E. coli peripl asm.
  • the E. coli obtained by centrifugation was suspended in IX TES buf fer (50 mM Tr is, 1 mM EDTA, 20% Sucrose, pH 8.0), followed by mixing by adding 1.5 times 0.2 X TES, and centrifuging to take a supernatant. Periplasm was extracted.
  • the affinity chromatography was performed to wash off the unbound protein layer with PBS. After further washing with buf fer containing 5 mM Imidazole, the bound scFv antibody was eluted using 200 mM Imidazole buf fer. The eluted antibody was dialyzed to confirm purity through electrophoresis and protein quantification by BCA method. Record the amount of purified antibody and dispense for a certain amount.
  • scFv antibodies extracted from periplasm were used to determine whether scFv antibodies bind to KRS full-length or each KRS N-terminal fragment using Western blot technique. After 30 ug of HCT116 cel l lysate was electrophoresed through SDS PAGE, it was transferred to PVDF membrane, blocked with 3% skim milk, and extracted scFv antibody was added by 1.0 / ⁇ for 1 hour. Unbound scFv Antibodies were removed, and the reaction was accompanied by reaction of an Ant i-HA secondary antibody linked to HRPOiorseradish peroxidase) to scFv bound to the antigen, followed by film exposure in the dark using ECL reagent as a substrate.
  • the photosensitized bands were compared to standard molecular markers to identify bands corresponding to the KRS length and the size of each fragment.
  • the Western blot was performed to remove scFv clones that resulted in too weak bands (faint bands), non-speci f ic bands (double bands), etc. 13 scFc clones thus selected were shown in FIG. 1.
  • Example ⁇ VII> In order to confirm whether the scFV clone selected in Example ⁇ VII> actually binds to nat ive KRS, immunoprecipitation (i ⁇ unoprecipi tat ion) was performed.
  • the purified scFv clone was subjected to Ag-Ab binding reaction with HCT116 cel l lysate, and immunoprecipitat ion was performed using HA-tag of scFv.
  • HCT116 cells were lysed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4, lysis buffer) containing 150 mM NaCl, 0.5% Triton X—IOO, 0.1% SDS and protease inhibitors. Each scFv was added to 500 HCT116 cell lysates and then incubated overnight at 4 ° C. Ant i-HA agarose bead 30 ⁇ was added and incubated at 4 ° C for 4 hours. The supernatant was removed by centrifugation. The precipitate thus obtained was dissolved in SDS-sample buffer and boiled twice for 7 minutes.
  • Immunoprecipitated samples prepared through the above-described process were electrophoresed through SDS PAGE, and then transferred to PVDF membrane and blocked with 3% skim milk, followed by KRS polyclonal ant ibodyC rabbit, Neomics, Co. Ltd. # ⁇ 5—01-0005) was added for 1 hour by the addition of antibodies. Unbound antibody was removed and reacted by the addition of an ant i-rabbit secondary antibody (ThermoFisher Scient ific, # 31460). After reacting the secondary antibody, the film was photosensitive in the dark using ECL reagent as a substrate. The photosensitized bands identified bands corresponding to the KRS full length and size of each fragment compared to standard molecular markers. The 12 scFc clones thus selected are shown in FIG. 2.
  • the scFv clone selected in Example ⁇ 1-5> was actually exposed to cel l membrane.
  • immunofluorescence i ⁇ unofluorescence
  • KRS-T52D mutant act ive mutant
  • myc-KRS T52D (active mutant) and myc—KRS T52A (inactive mutant) vectors are site-directed mut agenes is (Qu i kChange ⁇ Site-Directed Mutagenesis kit, Agilent) with pcDNA3-myc ⁇ KRS WT vectors , # 200523).
  • the prepared sample was washed with PBS (4 ° C) and then fixed and washed with 4% paraformaldehyde treatment for 10 minutes. CAS block was performed for 10 minutes, and the scFv and Myc antibody were treated for 2 hours. Unbound antibodies were then removed and reacted with secondary antibody for 1 hour in the dark. DAPI staining was performed for 10 minutes to mount. As shown in FIG. 3, a total of four scFv clones (N3, N5, N7, and N9) that bind only to the cells of the active mutant but not to the inactive mutant (T52A) and WT-K Sdaminin untreated) were selected. In addition, it was confirmed that staining at the position similar to T52D mutant when minin treatment and then scFv staining to induce membrane localization of WT-KRS.
  • A549 cells were transformed in the same manner as described in the Xing-Yi Example ⁇ 1-6>, respectively.
  • the cells are then lysed and wesed in the same manner as described in Examples 1-4 above. Turn blots were performed.
  • all of the selected scFv clones (N3, N5, N7 and N9) did not show bands in fragment 1 without N-terminus 1-72 amino add and had a fragment containing RS 1-200 amino acid. Only bands were confirmed.
  • scFv clones of N3, N5, N7 and N9 all confirmed to specifically bind to KRS N-terminus.
  • N3 scFv was composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67, the sequence contained a linker sequence of SEQ ID NO: 65 in the middle. Accordingly, the VH of N3 consisted of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49, and the VL of N3 consisted of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51.
  • the VH of N3 is heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 1, heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 3, and enhanced CDR3 represented by SEQ ID NO: 5
  • the VL of N3 included a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 7, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 9, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 11.
  • N5 scFv was composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69, the sequence contained a linker sequence of SEQ ID NO: 65 in between. Accordingly, the VH of N5 consisted of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53, and the VL of N5 consisted of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55.
  • the VH of N5 includes a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 15, and a heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 17, and YL of N5 represents a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 19, a sequence Light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 21 and light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 23 were included.
  • N7 scFv consisted of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO.
  • the base sequence contained a linker sequence of SEQ ID 65 in the middle.
  • the VH of N7 consisted of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 57
  • the VL of N7 consisted of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59
  • the VH of N7 represents a heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 25
  • N9 scFv was composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, the sequence contained a linker sequence of SEQ ID NO: 65 in between. Accordingly, the VH of N9 consisted of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 61, and the VL of N9 consisted of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 63.
  • the VH of N9 includes heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 37, heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 39, and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 41, VL of N9 represents light chain CDR 1 represented by SEQ ID NO: 43, Light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 45 and light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 47 were included.
  • polynucleotides encoding scFv in the genomes of clones N3, N5, N7 and N9 phage were amplified by PCR.
  • the base sequence of the primer used to amplify the gene of the VH region of the scFv is as follows: Forward (AGA GAG TGT ACA CTC C CA GGC GGC CGA GGT GCA G, SEQ ID NO: 93), Reverse (CGC CGC TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GCT CAC GGT GAC CAG, SEQ ID NO: 94)
  • the nucleotide sequence of the primers used to amplify the gene in the VL region of scFv is as follows: Forward (MG CGG CCG CCA CCA TGG GAT GGA GCT GTA TCA TCC TCT TCT TGG TAG) CM CAG CTA CAG GTG TAC ACT CCC AGT CTG TGC TGA CTC AG, SEQ ID NO: 95),
  • Conditional PCR was used to amplify the VH or VL genes of N3, N5, N7 or N9 scFv.
  • PCR products were inserted into the pcDNA3.4 vector, a vector used for IgG production using restriction enzymes. Proteins in the heavy and light chains of IgG were allowed to be expressed separately in separate plasmids.
  • the vector containing the DNA encoding the light and heavy chains of the IgG (hereinafter, referred to as N3 IgG, N5 IgG, N7 IgG, N9 IgG, respectively) containing the variable region of scFv was cotransformed into freestyle 293F cells. The light and heavy chains were then co-expressed in the cells. Transformed 293F cells were cultured for 7 days at 37 ° C, 8% C3 ⁇ 4 condition to obtain a supernatant. The supernatant was filtered through cel lulose acetate membrane filter (pore size 0.22 ⁇ , Corning) and purified using Capt ivA TM Pr iMAB protein A col ⁇ (Repl igen, USA). The obtained antibody concentration was measured using BCA kit (Pi erce, 23225), and the IgG antibody protein produced under reducing and non-reducing conditions was analyzed using Bioanalyzer (Agi lent 2100 Bioanalyzer).
  • Example ⁇ 2-1> The binding capacity of IgGs prepared in Example ⁇ 2-1> to KRS was verified by Western blot (WB) and immunoprecipitation (IP) methods.
  • WB Western blot
  • IP immunoprecipitation
  • Western blot was performed in the same manner as described in Example ⁇ 1-4>, and immunoprecipitation was performed in the same manner as described in Example ⁇ 1-5>.
  • Figure 5 shows these results (3 IgG and N5 IgG as a representative
  • KRS 1-207 aa Quantitative binding of purified antibody proteins (N3 IgG and N5 IgG) to antigens (KRS 1-207 aa) was measured using Biacore 2000 Surface Pr asmon Resonance (SPR) biosensor. . After fixing KRS to sensor chip CM5 (GE heal thcare, USA), it was sequentially diluted in HES complete solution (10 mM HEPES, pH7.4 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20). Antibody protein (6.25-100 nM) was flowed at 30 / rf / min rate for 3 minutes and 1M NaCl / 20mM NaOH was blown at 30 / rain rate for 3 minutes to induce protein dissociation bound to antigen. Mock IgG was used as a control. Specific experimental conditions are as follows; I ⁇ obi 1 i zed Ant i gen : KRS
  • Ant ibody N3 IgG, N5 IgG
  • Running buffer HBS-N buffer
  • Table 3 shows the kinetic velocity constants and equilibrium dissociation constants of N3 IgG and N5 IgG measured using Biacore 2000 SPR. Affinity was obtained using the BIA evaluat ion ver .3.2 software as the kinetic velocity constants (ka and kd) and the equilibrium dissociation constants (KD). 6 shows SPR graph results of N3 IgG and N5 IgG, respectively. From Figure 6 and Table 3 it was confirmed that the N3 IgG, N5 IgG of the present invention has a specific high binding capacity to the KRS N-terminal region. There was no binding signal in the control mock IgG.
  • the antibody of the present invention specifically bound to the KRS N-terminal portion exposed to the extracellular membrane.
  • KRS protein in the cells was detected with high sensitivity.
  • FIG. 7C when laminin was induced to induce membrane local izat ion of WT-KRS, N5 IgG was exposed to KRS N—terminal part exposed to the outer membrane. It was confirmed that specifically bound well.
  • the antibodies provided in the present invention were confirmed to have high binding specificity at the KRS N—terminal portion exposed to the extracellular membrane.
  • MTT assay was performed using IgG.
  • A549 cells (5,000 cells / well) were dispensed in 96—well plates and incubated. After washing the cells with serum-free medium, human mock I G and N3 IgG were treated with concentrations of 0, 50, 100 and 500 nM (in serum free media), respectively. After incubating for 24 hours, 50 ⁇ g / weH of MTT solution was added thereto for 4 hours. After removing the MTT so kit ion, the DMS0 100ul was treated and the absorbance was measured at 570nm. Experimental results As shown in Figure 8, it was confirmed that the antibody of the present invention does not exhibit cytotoxicity.
  • A549 cells were suspended in serum-free RPMI medium and placed in the upper chamber at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells per well.
  • N3 IgG or human mock IgG (control) was treated in the chamber with ⁇ or 500 nM and incubated for 24 hours. Then washed twice with PBS and treated with 70% MeOHCin PBS) for 30 minutes. Again washed twice with PBS and treated with Hematoxylin solution for 30 minutes. The chamber was washed three times with DW, the membrane in the chamber was cut and mounted on slide glass.
  • N3 IgG significantly moves A549 cells. The inhibitory effect was shown. In addition, this cell migration inhibitory effect was shown to be concentration-dependent (see Fig. 9B).
  • KRS is able to promote cell migration through cancer metastasis-related 67LR
  • tumor (cancer) animal models were constructed using mouse breast cancer 4T-1 cells (Korea Cell Line Bank), which are well metastasized to the lung. 4 x 7 week old BALB / cAnCr mi ce (two row biotech)
  • FIG. 11 and FIG. 12 show the control of the lung tissue in the control group and N3 IgG control group, the control group was confirmed that the expression of the laminin receptor was significantly expressed in the nodule site metastasized compared to the antibody treatment group of the present invention.
  • N3 IgG was injected intravenously through the tail of each mouse at different concentrations (lmpk, lOmpk). As shown in FIG. 14 and FIG. 15, it was confirmed that the number of pulmonary nodules was significantly reduced in the N3 IgG-treated group, and treated with N3 igG at a dose of lmpk compared to the YH16899 LOOmpk treatment group. It was confirmed that cancer metastasis was significantly suppressed only by
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • N3 IgG antibody was immobilized to Biacore T200 (GE Healthcare) equipped with Series S sensor chip CM5 (GE Healthcare) using an amine coupling kit (GE Healthcare), and then the peptides described in Table 4 below. It was dissolved in the PBS solution at the corresponding concentration and flowed for 60 seconds. The PBS was then scattered for 5 minutes, and then analyzed for binding with Biacore T200 Evaluation Software v2.0 (GE Healthcare).
  • N3 IgG antibodies were shown to bind to epitopes Fl, F2, F3, and F4, but N3 IgG antibodies did not bind to F5. Also, in the case of epitope F4, the binding force was found to be the strongest, and the binding force was found to be strong in the order of F3, F2, and F1.
  • the position where the N3 IgG antibody binds mainly is 15 to 29 amino acid region of the KRS N-terminal region
  • N3 IgG which is an RS antibody
  • the N3 IgG antibody was immobilized on a chip using an amine coupling kit (GE Healthcare) in the same manner as the experimental method described in Example 4-1, and the peptides described in Table 4 were dissolved in the PBS solution at a corresponding concentration of 60. PBS was allowed to flow for 5 minutes and then for 5 minutes. The binding force was then analyzed with Biacore T200 Evaluation software v2.0 (GE Healthcare).
  • the N3 IgG antibody binds to epitopes Fl, F2, F3, and F4 of human (h), mouse (m), and rat (r), but does not bind to F5.
  • the epitope F3 was stronger than the F1 binding in humans, mice, rats (F2, F4 data not shown).
  • N3 IgG antibody can cross-react between species.
  • transwell migration assay As an extracellular matrix, a transwell migration assay and specific experimental methods are as follows. Transwell (Corning, # 3421-5 ⁇ ) was coated with gelatin (0.5mg / ml) and then RAW 264.7 cells (1 x
  • a transwell migration assay was performed in the same manner as in Example 5 using LNlll, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, and LN521 at 10yg / ml as various laminin subtype proteins (purchased from Biolamina). It was.
  • the specific sequence of the laminin subtypes is ⁇ 4 chain of SEQ ID NO: 115, ⁇ 2 chain of SEQ ID NO: 121, ⁇ 5 chain of SEQ ID NO: 122, ⁇ 2 chain of SEQ ID NO: 117, ⁇ chain of SEQ ID NO: 123 according to the chain forming each laminin subtype
  • the ⁇ chain of SEQ ID NO: 119 may be referred to.
  • RAW 264.7 eel 1 (2 x 10 6 cell) incubation
  • laminin subtypes were harvested in Oh, 12h, and 24h after ig / ml treatment of the laminin subtypes in DMEM media.
  • RAW 264.7 ceil protein was isolated into cytosol and membrane fraction using ProteoExtractSubcel lular Proteorae Extraction Kit CCalbiotech, cat # 539790). The obtained protein was electrophoresed and transferred to PVDF membrane (Milipore) and blocked with 33 ⁇ 4 skim milk.
  • KRS polyclonal ant ibody (rabbi t, Neomics, Co. Ltd. # ⁇ 3—01-0005) was added for 1 hour by binding.
  • Example 2 Among the antibodies prepared in Example 1, representatively using an N3 IgG antibody, the effect on immune cell migration and invasion was confirmed.
  • the specific experimental method is as follows. Transwell (Corning # 3421-5 ⁇ ) was coated with gelatin (0.5mg / ml), then RAW
  • Serutn Free DMEM 500 ⁇
  • 421 (1 iig / mi) was placed in the bottom chamber.
  • Each antibody was treated at 100 M concentration in the top chamber.
  • the cells were fixed with 703 ⁇ 4 Methanol for 30 min and then stained with 50% Hematoxylin for 30 min.
  • the membrane was taken and mounted on the slide.
  • the migrating cells on the underside of the membrane were observed under a high magnification microscope (FIG. 20A), and the number of cells in the obtained image was measured and displayed graphically (FIG. 20B).
  • LN421 treatment increases the KRS level of monocytes / macrophage cell membrane, and confirmed that the KRS level of the cell membrane effectively reduced by N3 IgG antibody treatment. In addition, it was confirmed that the cytoplasmic KS level was also reduced in the N3 IgG antibody treatment group.
  • the antibody of the present invention confirmed the potential as a novel therapeutic agent for diseases in which immune cell migration such as monocytes / macrophages is a problem.
  • Subcutaneous injection of MCTOtionocrotal ine 60 mpk was induced in 7 week old SD rats (Oriental Bio) to induce ⁇ . Then divided into 4 groups (tested with 5 animals in each group) and 25 mpk each of Mock human IG (Thermo Fi sher Scient if ic, negative control) lmpk, N3 IgG Impk, N3 IgG lOmpk, si ldenaf il (positive control) Administration was for 3 weeks. All antibodies were injected iv twice a week and si ldenaf i was orally administered daily.
  • Cardiac output was measured using a perivascular perivascular blood probe (Transonic Flowprobes, manufactured by Mi l lar Instruments), and experimental techniques were performed in the same manner as described in the following literature: Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Rass DA. Measurement of cardiac funct ion using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc 2008; 3 (9): 1422- 34.
  • the collected lungs were fixed in PFA (paraformaldehyde) according to a conventional procedure, and then embedded in paraffin through water washing, dehydration, and transparent processes.
  • Paraffin block of rat lung tissue was cut into 6um thickness and slides were prepared. Thereafter, staining was performed as follows. First, after three times xylene treatment for 5 minutes, 100% ethane, 95% ethane, 90% ethane, 70% ethane was treated for 2 minutes in the order of DW and washed with PBS for 5 minutes. After treatment with 0.3% 3 / 43 ⁇ 4, the samples were washed twice with PBS for 5 minutes, soaked in 0.01M citrate buffer, heated and washed with PBS-T (0,03% tween 20).
  • RVESP right ventricul r end-systolic pressure
  • RVVEDP right ventricular end-diastol ic pressure
  • LVESP left ventricular end-systolic pressure
  • CO Cardiac output
  • RVESP is increased, which has also been confirmed in the PAH animal model.
  • N3 antibody significantly reduced the RVESP at both concentrations, especially RVESP better than the positive control drug Sildenafil.
  • LVESP left ventricular end systolic pressure
  • the antibody of the present invention was found to have a lower tendency to affect the arterial pressure (systemic artery pressure) compared to Sildenafil, considering that there is a situation that concerns the risk of hypotension when Sildenafil is administered in the clinical field It is considered to be an advantageous property of therapeutic drugs.
  • symptomatic systolic RV failure occurs in severe pulmonary arterial hypertension. D) low cardiac output and systemic hypotension.
  • the cardio ac output and systemic blood pressure are increased by the treatment for improving pulmonary hypertension by the antibody of the present invention, and the effect of normalizing the blood pressure is expected.
  • administering the antibody of the present invention improves the possibility of side effects of existing therapeutic drugs, and alleviates PAH symptoms and shows a therapeutic effect.
  • the antibodies or fragments thereof according to the present invention have a specific CDR (complementarity determining region) sequence described herein and KKS exposed to the outer membrane. Because of its very high specific binding capacity to the N -terminal region, it can be used for the diagnosis of a disease known as a disease (eg cancer) involving the specific behavior of KRS, and also KRS N-terminal region in vivo. Because it is specifically targeted to, it can be used as a therapeutic agent because it has an excellent effect of inhibiting the interaction of laminin receptor and RS N-terminal region and inhibiting cancer metastasis, and can regulate the migration of immune cells, Since it can be used very effectively for the prevention, improvement and treatment of diseases, it is highly available industrially.
  • a disease eg cancer

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Abstract

본 발명은 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체와 이의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR (상보성 결정부위) 서열을 가지며 라이실-tRNA 합성효소 (KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편과, 상기 항체 또는 단편의 암 전이 억제 용도, 암 진단 용도 및 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약 학적 조성물에 대한 것이다. 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편들은 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적 결합능력이 매우 우수하기 때문에, 암 진단에 효과가 있고, 항암 및 암 전이 억제 효과가 있으며, 면역세포 이동과 관련한 질환을 예방 및 치료하는 데에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
세포 외막에 노출되는 라이실 -tR A합성효소 N-말단 영역에 특이적으로 결합 하는 항체
【기술분야】
본 출원은 2017년 3월 27일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2017-0038775 호, 2017년 9월 15일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10—201게 118890호 및 제 10- 2017— 0118917호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이 다. 본 발명은 세포 외막에 노출되는 라이실 -tRNA 합성효소 N-말단 영역에 특이 적으로 결합하는 항체와 이의 이용에 관한 것으로， 보다 상세하게는 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR (상보성 결정부위) 서열을 가지며 라이실 -tRNA 합성효소 (KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N_말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편과, 상기 항체 또는 단편의 암 전이 억제 용도， 암 진단 용도 및 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약 학적 조성물에 대한 것이다.
【배경기술】
최근 연구를 통해 일반적으로 세포질 (cytosol )에 존재하는 인간 KRS (라이실 tRNA 합성효소, lysyl-tRNA synthethase)가 원형질막 (세포막)으로 이동 (trans locat ion)되어 원형질막에 존재하는 67LR(67-kDa 라미닌 수용체)과 상호작용 함으로써 종양 (또는 암) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이 (metastasi s)에 영향을 미친다는 것이 규명되었다 (Dae Gyu Kim et al . , Chemi cal inhibit ion of promet astat ic lysyl-tRNA synthet se! am inin receptor interact ion, Nat Chera Biol . 2014 Jan; 10(1) : 2934, Dae Gye Kim et . al . Interact ion of two trans 1 at ional components , lysyl-tRNA synthetase and p40/37LRP, in l asma membrane promotes 1 am i n i n-dependent cel l migrat ion, FASEB J . (2012)26, 4142- 4159) . 인간 KRS(Genbank Accession No . NP_005539.1 등)는 Nᅳ말단 연장 (N- terminal extension, 1-72) , 안티코돈 결합 도메인 (ant icodon— binding domain, 73- 209) 및 촉매 도메인 (catalyt i c domain, 220-597)을 포함한다. 인간 KRS는 단백질 합성에 필수적인 효소이며 일반적으로 세포질에서 다증 tRNA 합성효소 복합체 (rault i-tRNA synthetase complex, ' MSC) 내에 존재한다. 그러나 라미닌 ( laminin) 신 호 후, p38 MAPK는 T52 잔기에서 KRS를 인산화시키고, KRS는 세포막으로 이동하여 유비퀴틴 매개 분해로부터 67LR을 보호한다. 또한 세포막으로 이동된 KRS 는 암전 이와 관련된 67LR을 안정화시키고 이와 상호작용을 함으로서 암 전이 (cancer metastasis)를 촉진한다고 보고되었다. 한편, 면역세포는 체내의 1차 방어망이기도 하지만, 최근 과도한 면역세포의 활성화가 주요한 발병 기전증의 하나임이 보고되고 있다. 염증성 면역세포의 활성 화시 일반적으로 면역세포의 이동성 증가가 관찰되는테， 구체적으로 다음과 같은 질병들에서 이러한 면역세포 이동 및 침윤이 질병의 병리와 밀접한 관련이 있는 것 으로 보고되고 있다. 일례로, 심혈관계 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환으로, 죽상동맥 경화증과 관상동맥 질환 등이 포함된다 (Ross et al . , New Engl J Med, 1999 :340(2) : 115-26 , Pol i G et al . , Redox Biol 2013 ; 1(1) : 125—30, Libby P et al . , Circulat ion 2002; 5; 105(9) : 1135-43) .죽상동맥경화증은 콜레스테를에 의한 염 증성 질환이고, 동맥 안쪽 막에 침착한 콜레스테를과 혈액에서 동맥 안쪽으로 이동 한 면역세포로 구성된 죽종에 의하여 발병한다. 즉, 콜레스테롤 산화물이 염증을 일으키고 있는 부위로 단핵구와 같은 면역세포가 이동하면서 죽종이 형성된다. 죽 종이 형성될 경우 혈관의 내면은 껄끄러워지고 벽은 두꺼워지면서 혈액이 흐르는 내부의 지름이 좁아져 혈액순환에 장애가 생긴다. 죽종 주위를 둘러싼 섬유성막이 터지면 혈관 안에 혈전이 발생하고, 죽종 안으로 출혈이 일어나 혈관 내경이 급격 하게 좁아지거나 막히게 된다. 주로 심장에 피를 공급하는 혈관, 뇌에 피를 공급하 는 혈관, 콩팔에 피를 공급하는 혈관 및 말초혈관에 발생하여 허혈성 심장질흰■, 허 혈성 뇌혈관질환 (뇌졸중)， 신부전, 사지 허혈성 동맥 질환을 일으킨다. 기존에 이 러한 심혈관계 질환의 발생 및 발달에는 단핵구의 이동을 유도함으로써 염증반응을 일으키는 CCL2(CCChemokine l igand 2, MCP 1)가 중요한 역할을 수행하는 것으로 알 려져， CCL2의 작용 및 이에 따른 단핵구의 이동을 억제함으로써 상기와 같은 심혈 관계 질환을 치료하는 방법이 새로이 제시되기도 하였다 (Gu L et al . , Mol Cel l , 1998 ;2(2) :275-81, Aiel lo RJ et al . , Arterioscler Thromb Vase Biol 1999； 19(6) : 1518-25, Gosl ing Jl et al . , Cl in Invest 1999 ; 103(6) :773-8, Harr ington JR et al .， Stem Cel ls 2000； 18(1) :65-6, Ikeda U et al . , Cl in Cardiol 200 ； 25(4)： 143-7) . 또한 폐동맥 고¾압0 1«101^^ Arterial Hypertension, PAH)은 폐 고혈압 세 계 보건기구 (WHO) 임상 분류 시스템 (ESC Guidel ines, European Heart Journal 2015)의 Group 1으로 분류되며, 호흡곤란, 평균 폐동맥압 (mean pulmonary artery pressure , mPAP) 의 상승 (mPAP > 25 mm Hg) 및 우심실 기능부전을 공통적 임상특 징으로 하는 희귀질환이다, 이러한 폐동맥 고혈압은 유전, 감염, 연관질환 등 여러 가지 선쟤요인이 관여하지만 혈관손상 (endothel ial cel l injury)에 따른 면역반응 이 핵심 병리적 요인으로 작용하는 것으로 알려졌다 (Huertas et al ,， Circulat ion, 129 : 1332-1340， 2014) . 이러한 현상에는 면역세포의 침윤과 기능장애 (dysfunct ion) 에 따른 일련의 과정이 병리현상과 깊게 연관되어 있는 것으로 알려졌으며, 특히 PAH에서 면역세포와 혈관내피세포 상호작용이 중요한 것으로 알려졌다, 뿐만아니라 최근 알포트 증후군 (Alport syndrome)에 있어서도 단핵구 대식세포의 침윤이 상기 병의 진행을촉진시킨다는 보고가 있었다. 한편, 섬유화 (f ibrosis) 관련 질병에 있어서, 지속적인 (만성적인) 염증반웅 이 상처치유 프로그램 (wound— heal ing program)을 활성화시키게 되는데 이것이 섬유 증 (f ibrosis)으로 이어지게 된다. 조직의 손상 후 단핵구 /대식세포나 호증성 백혈 구, 호산백혈구, 비만세포 등의 염증성 면역세포가 손상 부위로 빠르게 침투 하면 서 활성화되며 여러 사이토카인을 분비하게 되고 이것들은 주위의 섬유아세포나 상 피세포， 평활근세포를 다시 활성화 시켜 이들을 미요브라스트형의 세포로 활성화시 키는데 이 미요브라스트형의 세포는 다량의 세포외 기질 단백질을 생산 분비하게 하여 궁극적으로 조직에 세포외 기질 단백질의 다량 축적을 초래하여 상처를 남기 며 또한 조직의 섬유화나 비대화를 유도하게 된다 (Gurtner GC et al . , Trends Cel l Biol . 15 ： 599-607, 2005) . 이 병리 기전은 창상, 화상, 욕창등에 의한 피부 상처시 발생되는 피부 조직 내의 상흔 형성이니' 간, 신징-， 혈관, 폐등의 조직의 경 화성 섬유화 현상의 근본적인 원인중 하나이다. 또한 만성 자가면역 질환인 경피증 (scleroderma) , 류마티스 관절염 (rheumatoid arthr i t is) , 크론병 (Crohn' s di sease) , 궤양성 대장염 (ulcerat ive col i t is) , 골수 섬유증 (myelof ibrosis) , 전 신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosu)에서도 섬유화는 주된 병리적 특성으로 나타난다. 아울러 아토피 질환， 천식 질환, C0PD, 건선증， 켈로이드, 증 식성 망막증등 에서도 염증성 면역세포의 활성화가 병리 현상에 기여한다고 알려져 있다. 특히 , 상기 상처치유 프로그램 (wound— heal ing program)에 있어서 미요브라스 트형의 세포로 활성화된 섬유아세포를 myof ibroblast (근섬유아세포)라고 한다. myof ibroblast는 섬유화 (f ibrosis) 관련된 모든 질환병리의 증심에 있으므로 myof ibroblast의 활성을 유도하는 분자생물학적 흑은 면역학적 기전을 제거하는 것 이 질환치료의 핵심 요소가 된다. 많은 선천적 ( innate i隱 uni ty) 흑은 후천적 (adapt ive immunity) 면역이 fibroblast의 활성과 분화에 증요하다는 사실은 널리 알려져 있으며， 이에 상처부위에서 염증반웅을 제거하는 것이 섬유화로의 t i ssue remodel ing 을 중단시키고 정상조직형태를 유지하는 핵심적 요소가 된다, 하지만 실제적으로 염증반웅의 제거가 쉽게 이뤄지지 않으므로 선천적 후천적 면역의 기전 을 이해하여 핵심 매개체 (mediator)를 찾는 것이 섬유화를 늦추는데 중요하다. 단핵구， 대식세포 등은 wound heal ing에도 기여하는 부분이 있으나 react ive oxygen, nitrogen등을 분비하므로 주변 세포에 해로운 영향을 끼치게된다. 따라서 단핵구, 대식세포의 신속한 제거가 없다면 조직 손상을 더 유발하게 되며 섬유화를 초래히-게 된디- . 따라서 상기 질병의 초기에 가장 먼저 반웅하는 단핵구， 대식세포 들을 제한하는 것은 다양한 만성 염증 및 섬유화 관련 질환에 있어서 하나의 치료 적 전략으로 여겨진다. 상기 wound— heal ing 기전이 섬유화 반웅을 촉발 시킬 때, 혈구 웅집에 관련 된 PDGF (pi ate let—der ived growth factor)는 다른 염증반웅 면역세포들을 상처부위 로 불러들이고 TGF-β Ι은 국소 f ibroblast로부터 세포외 기질 합성을 촉진시키는 것으로 알려졌다. 하지만 상기 혈구응집 반웅에 관련된 요소들은 이들이 결핍된 경 우에도 섬유화를 유도하는 결과를보임이 보고되었다. 한편， N— terminal extension(N-ext )의 말단 잔기 40개가 결실된 Myc-KRS41- 597( Δ Ν)이 원형질막에 위치 ( local ize)되지 않는다는 사실은 KRS N—ext 영역이 KRS 가 세포막으로 이동 (translocat ion) 하는데 있어서 필수적인 영역임을 나타낸다. 또한 암 전이와 관련하여， 67LR과의 상호작용에 있어서 구체적으로 KRS N ext 영역 이 이들의 결합애 관여함이 알려졌다. 이러한 사실을 치료 또는 진단 목적으로 이 용하기 위해서는， KRS 단백질을 이루는 여러 도메인 영역의 특성에 따라서 단백질 내의 목적하는 특정 위치 (특히 KRS N ext )를 특이적으로 타겟팅 (target ing)하는 것 이 필요한 실정이다. 그러나 KRS를 비룻한 ARS(aminoacyl tRNA synthetase)들에 대한 바이오마커 로서의 중요성에도 불구하고 ARS들은 단백질 구조상 유사한 점이 많아 동물로부터 면역반웅으로 얻어지는 항체는 다른 ARS에도 결합하는 교차 반웅을 보이고 아예 고 감도의 힝 -체가 생성되지 않는 경우가 많다. 또한， 상기와 같이 과도한 면역세포 활성화가 문제되는 질환들에 있어서 기 존에 면역세포들의 이동 (및 침윤)을 막기 위한 타겟 인자 (target factor)들이 제시 되어왔고 이들을 대상으로 질병의 치료적 방법을 고안하는 시도가 이루어지고 있지 만 각각의 한계점들이 보고되고 있는 실정이며, 이에 따라 효과적인 질병 치료를 위해 여전히 면역세포 이동에 있어서 핵심 매개체 (mediator)가 무엇인지 이를 제어 할 전략은 무엇인지를 찾는 것이 중요한 해결 과제로서 요구되고 있는 실정이다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에 본 발명자들은 세포 외막에 노출되는 KRS N—말단 영역에 특이적으로 결 합하는 항체를 제작하고자 연구하던 증， 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR (상보성 결정부위) 서열을 가지는 항체들이 KRS N-말단 영역에 메우 높은 결합특이성 (speci f icity) 및 결합친화력 (aff ini ty)을 나타낼 뿐만 아니라, in wra상에서 암 전이를 억제하는 것을 확인하였다. 또한 면역세포 (단핵구 /대식세포)의 세포막 영역 에 KRS 수준이 증가되는 현심-이 면역세포 이동 및 침윤 관련된 질환에 대하여 중요 한 병리현상임을 확인하였으며 이는 라미닌 (특히， 라미닌 아형 α 4β 2 Υ 1)과 특별 한 연관성을 가지고， 본 발명에서 제공하는 KRS Ν-말단 결합 항체가 면역세포의 세 포막에 증가된 KRS 수준을 감소시키며 실제로 면역세포 이동 및 침윤을 억제하여 관련 질환을 치료하는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은, 라이실 -tRNA 합성효소 (KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N_말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은， 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하 는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터 및 상기 재조합 발현 백터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은, (a) 상기 재조합 발현 백터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; (b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하 는 단계; 및 (c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함 하는， 세포 외막에 노출되는 라이실 tRNA 합성효소 (KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법을 제공하는 것 이다. 본 발명의 또 다른 목적은， 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 유효성분으 로 포함하는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 구 성되는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이디- .
또한 본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 필 수적으로 구성되는 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공하 는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 유효성분으 로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은ᅳ 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 구 성되는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은ᅳ 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 필 수적으로구성되는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다, 본 발명의 또 다른 목적은， 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 유효성분으 로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물올 제공하 는 것이다. '
또한본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 구 성되는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것 이다.
또한본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편으로 필 수적으로 구성되는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이디- . 본 발명의 또 다른 목적은， 암 전이 억제용 제제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이 억제 방법을 제공 하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은， 암 진단용 제제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은. 면역세포 이동 관련 질환의 치료용 제제를 제조 하기 위한본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은， 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 면역세포 이동 관련 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은 라이실 -tRNA 합성효소 (KRS , Lysyl -tRNA synthetase) N_말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프 (epi tope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 항 체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하 는 재조합 발현백터 및 상기 재조합발현 백터로 형질전환된 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 상기 재조합 발 현 백터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단계; 및 (c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 외막에 노출되는 라이실 -tR A 합성효소 (KRS , Lysyl-tRNA synthetase) N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로구성되는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용조성물을 제공한다.
또한본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 구성되는 포함하는 암 진단용조성물을 제공한다 .
또한본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 적 조성물을 제공한다,
또한본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 구성되는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 을 제공한디- .
또한본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약 학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 전이 억제용 제제 를 제조하기 위한 상기 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이 억제 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 진단용 제제를 제 조하기 위한 상기 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 면역세포 이동 관련 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한상기 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은 상기 힝-체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 면역세포 이동 관련 질환의 치료 방법을 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명에서 "세포 외막에 노출되는 라이실 -tR A 합성효소 (KRS) N-말단 영 역" 은 세포 내에서 생성된 KRS가 이동하여 세포믹ᅳ (또는 원형질막)에 위치될 때 세 포 외 (extracel lul ar) 영역으로 또는 세포막 표면에 노출되는 특정 서열을 의미하 는 것으로서, 통상 KRS N-말단의 1 내지 72개의 아미노산 영역의 일부 또는 전장 서열을 의미하는 것일 수 있디-. 또한 KRS N-말단 영역은 종간 서열유사성이 존재하 며 특히 서열번호 97로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 인간에서는 서열번호 75로 표시되는 서열을 포함하며， 마우스 (mouse)에서는 서열번호 113으로 표시되는 서열을 포함하며， 멧 (rat)에서는 서열번 호 114로 표시되는 서열을 포함한다. 본 발명에서 "KRS1'는 라이실 티알엔에이 합성효소로 알려져 있는 전장 (全長) 플리펩티드 또는 N—말단 영역 (N— terminal extent ion)을 포함하는 임의의 KRS 단편 서열을 의미한다. 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편들은 전술한 바와 같이 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역을 특이적으로 검출하므로, 전술한 KRS 전장 폴리 펩타이드 또는 N-말단 영역을 포함하는 임의의 KRS 단편 서열 또한 검출할 수 있 다. 상기 KRS의 구체적 서열은， 서열번호 75로 표시되는 플리펩타이드를 포함하는 것으로서 당업계에 라이실 티알엔에이 합성 효소로서 알려진 것이라면 특별히 제한 되지 않으며， 일례로 본 발명의 KRS는 인간 sapiens) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. NP_005539.1 등으로 공지된 것을 포함하고, 마우스 (Mus usculus) 유래의 것으로서 NCBI (Genbank) Accession No. NP— 444322.1 등으로 공지된 것을 포함하며， ¾ ius norvegicus) 유래의 것으로서 NCBI(Genbank) Accession No. XP_006255692.1 등으로 공지된 것을 포함하며, 이외 에도 하기의 서 열정보를 참조로 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다: XP_005004655.1(guinea-pig: Cavia porcellus) , ΧΡᅳ 021503253. l(gerbi 1 , Meriones unguiculatus) , XP_002711778.1(rabbit, Oryctolagus cuniculus) , XP— 536777.2 (dog, Can is lupus familiar is) , XP_003126904.2 (swine, Sus scrofa) , XP_011755768.1( monkey, Macaca nemestrina) , XP_008984479.1 (marmoset , Callithrix jacchus) , XP_019834275.1 (cow, Bos indicus) , XP— 511115.2 (chimpanzee, Pan troglodytes) . 가장 바람직하 게는 서열번호 76(Genbank Accession No . NP_005539.1)으로 표시되는 아미노산 서 열로 이루어지는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 발명에서 항체 (antibody)는 면역 글로붙린 (i腿 unoglobulin, Ig)이라고도 불리며， 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자 연에서 발견되는 전체 항체 (whole antibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어 진 폴리팹티드인 경쇄 (light chain, LC) 및 중쇄 (heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이루어지거나， 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 한다. 포유류의 항체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 a , S , ε , γ 및 μ로 표시되는 5가 지 유형이 있으며， 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 등 다른 종류의 항체를 구성하게 된다. 포유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는 λ 및 κ로 표시되는 2가지 종류가 존재한다.
항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역 과 불변영역으로 구분된다. 증쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CHI, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄블변영 역으로 구성되어 있으며， 경쇄는 1개의 볼변영역인 CL으로 구성되어 있다, 증쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역 (VH) 또는 경쇄가변영역 (VU의 하나의 도메인 으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되 어 1개의 공유 이황결합 (disulf ide bond)에 의해 연결되고， 경쇄와 결합한 두 분자 의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전 체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항 체는 2개의 증쇄 및 경쇄의 쌍 (HC/LC)으로 구성되어 있으므로， 한 분자의 전체 항 체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일특이성 을 갖게 된다. 항체가 항원에 결합하는 부위를 포함하는 가변영역은 서열 가변성이 적은 골 격 부위 (framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위 (hypervariable region)인 상보성 결정부위 (complementary determining region, CDR)로 세분된다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 Nᅳ말단부터 C—말단의 방향으로 FR1— CDR1— FR2— CDR2— FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영 역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로， 항체의 항원 특이성에 가장 증요하다. 본 발명은 라이실 -tRNA합성효소 (KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 중에 서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다. 본 발명에서 '에피토프 (epi tope)' 는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단 백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 대체로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자 의 표면기로 이루어지고， 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특성 및 특이적 전하 특 성을 갖는다. 입체형태적 및 비 -입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에서 입체형태적 에피토프에 대한 결합은 손실되지만 비 -입체형태적 에피토프에 대해서 는 손실되지 않는다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관련되는 아미노 산 잔기 (에피토프의 면역원성 성분으로도 칭해짐 ) 및 결합에 직접 관련되지 않는 기타 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기 (즉 , 아미노산 잔기가 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트
( footpr int) 내에 존재함)를 포함할 수 있다.
바람직하게는 KRS N-말단 서열로부터 유래된 본 발명의 N3 단클론 항체가 결 합하는 부위로， 서열번호 97로 표시되는 아미노산 (klsknelkrr lka)을 포함하는 연속 되는 영역이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으며， 통상 서열번호 97의 아미노산 서열 포함하여 13 내지 52개， 더욱 바람직하게 13， 14 , 15 , 16， 17 , 18, 19， 20, 21 , 22 , 23, 24 , 25, 26 , 27, 28, 29， 30 ' 31, 32, 33, 34 , 35 , 36 , 37, 38 , 39 , 40, 41 , 또는 42 개의 아미노산서열로 이루어지는 것일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 상기 에피토프는, 인간 KRS N-말단에서 유래된 것인 서열번호 75, 서열번호 98， 서열번호 99， 서열번호 100 및 서열번호 101로 표시되 는 아미노산 서열일 수 있으며, 마우스 KRS N-말단에서 유래된 것인 서열번호 113 , 서열번호 103， 서열번호 104 , 서열번호 105 및 서열번호 106로 표시되는 아미노산 서열일 수 있으며， 랫 KRS N-말단에서 유래된 것으로 서열번호 114， 서열번호 108， 서열번호 109， 서열번호 110 및 서열번호 111로 표시되는 아미노산 서열일 수 있 디- . 보다 바람직하게는 서열번호 75로 표시되는 인간 KRS N-말단 영역의 15 내지 29 아미노산 서열을 포함하는 서열 (서열번호 75 , 서열번호 98, 서열번호 99, 서열 번호 100 및 서열번호 101)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 75로 표시되 는 인간 KRS N-말단 영역의 15내지 42 아미노산 서열 (서열번호 101)일 수 있다. 본 발명에서 제공하는 '세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편 ' 은
서열번호 1， 서열번호 13, 서열번호 25 및 서열번호 37로 이루어진 군에서 선텍된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 l(CDRl) ; 서열번호 3， 서 열번호 15, 서열번호 27 및 서열번호 39로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 을 포함하는 증쇄 상보성 결정부위 2(CDR2) ; 서열번호 5， 서열번호 17 , 서열번호 29 및 서열번호 41로 이루어진 군에서 선택된 아미노산서열을포함하는 중쇄 상보 성 결정부위 3CCDR3)을 포함하는 중쇄가변영역 (VH) 및
서열번호 7， 서열번호 19, 서열번호 31 및 서열번호 43으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 l(CDRl) ; 서열번호 9, 서 열번호 21, 서열번호 33 및 서열번호 45로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 11， 서열번호 23， 서열번호 35 및 서열번호 47로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보 성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역 (VL); 을 포함하는 것을 특정으로 한 다. 상기 CDR 서열로 구성된 항체들은 세포 외막에 노출되는 K S N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 능력이 뛰어나다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있디-. 본 발명의 실시예에서는 세포 외막에 노출되는 KRS N—말단 영역에 특이적으 로 결합하는 scFv 단편을 제작하기 위하여, scFv phage library 스크리닝을 통한 1 차 선별을 시작으로, indirect EUSA(2차 선별)， 웨스턴 블롯 (3차 선별)， 면역침전 (4차 선별), 면역형광염색 (5차 선별)의 총 5단계의 실험을 거쳐 KRS N-말단 결합에 있어서 높은 결합특이성 및 결합친화력을 보이는 scFv 단편을 선별하였다. scFv phage library 스크리닝을 통한 1차 선별 시 총 1920개의 scFv 클론이 선별되었으 나, 상기 5단계의 선별을 거치면서 최종적으로 가장 특이성이 높은 N3 scFv, N5 scFv, N7 scFv, N9scFv 단편 4종을 선별해 내었다. 또한 상기 scFv를 IgG로 전환하 여 N3 IgG, N5 IgG, N7 IgG, N9 IgG 의 항체를 제작하였으며, 상기 항체 또한 KRS N-말단 결합에 있어서 높은 결합 특이성을 보이는 것을 확인하였다, 본 발명에 따른 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하 는 힝-체 또는 그 단편은, 바람직하게 아래와 같은 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 CDR 구성을 포함하는 항체로서 하기 (i), (ii), (iii) 및 (ίν)는 각각 실시예의 Ν3, Ν5, Ν7 및 Ν9항체의 CDR 조합을 나타낸다:
(i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 상보성 결정부위 3을 포함 하는 중쇄가변영역 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보 성 결정부위 1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결 정부위 2 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 3을 포함하는 경쇄가변영역;
(Π)서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 1， 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보 성 결정부위 2 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보 성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역;
( i i i ) 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 1， 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상 보성 결정부위 2 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보 성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역; 및
( iv) 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부 위 1， 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경 쇄 상보성 결정부위 1 , 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상 보성 결정부위 2 및 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보 성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역; 으로 이루어진 군에서 선택된 중쇄가변영 역 및 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는그 단편. 가장바람직하게 본 발명에 따른 상기 항체 또는 그 단편은， 아래와 같은 중 쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 한다: 상기 힝-체 또는 그 단편에 있어서， 상기 중쇄가변영역은 서열번호 49(N3 VH) , 서열번호 53(N5 VH) , 서 열번호 57(N7 VH) 및 서열번호 61(N9 VH)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 을 포함하고， 상기 경쇄가변영역은 서열번호 51(N3 VL) , 서열번호 55(N5 VL) , 서열 번호 59(N7 VL) 및 서열번호 63(N9 VL)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서 열.
상기 증쇄가변영역 (VH)과 경쇄가변영역 (VL)을 포함하는 항체는 구체적으로는 서열번호 77, 서열번호 81， 서열번호 85 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 및 서열번호 79 , 서열번호 83， 서열번호 87 및 서 열번호 91로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄로 이루어진 것을 특징으로 하는 항체일 수 있다.
가장 바람직하게는 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 81로 표시되 는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번 호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 서열번호 89로 표시되는 아미노 산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 91로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경 쇄를 포함하는 항체이다, 본 발명에 따른 '세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합 하는 항체' 는 상기한 CDR조합이나, VH 및 VL 조합을 갖는 것이라면 그 종류가 제 한되지 않는디-. 구체적 일례로 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 KRS N—말단 영역에 특이적으로 결합하는 상기한 CDR 조합 이나 , VH 및 VL 조합을 갖는 것이라면 단일클론 (monoclonal ) 항체일 수도 있고， 다 클론 (polyclonal ) 항체일 수도 있지만， 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실 질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물， 조류 등을포함한 임의의 동물 에서 유래한 것일 수 있으며， 바람직하게는 인간에서 유래한 것이거나， 인간에서 유래한 항체의 부분과 다른 종의 동물에서 유래한 항체의 부분을 포함하는 키메릭 (chimeric) 항체일 수 있다. 즉, 본 발명은 키메라 항체， 인간화된 항체, 인간항체 를 모두 포함하며 바람직하게는 인간항체 일 수 있다. 또한 본 발명에서 항체의 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하 고 있는 항체의 단편을 의미하며 , 바람직하게 상기 단편은 모항체의 KRS N-말단 결 합 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%， 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유 한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab' , F(ab ' )2, Fv, 디아바디 (diabody) , scFv 등 의 형태일 수 있다.
Fab( fragment ant igen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로， 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab ' )2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 증쇄 경첩 (hinge)에서 이황결합 (disul fide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(aV )는 F(ab ' )2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편 이다. Fv(variable fragment )는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFvCsingle chain variable fragment )는 증쇄가변영역 (VH)과 경쇄가변 영역 (VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디 (diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고， 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태 의 단편을 의미한다. 본 발명의 목적상 항체의 단편은 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않지만， 바 람직하게 scFv일 수 있다. 본 발명에 따른 scFv는 상기한 KRS N-말단 영역에 특이 적인 CDR 구성 , 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 것으로서 VH의 C-말단과 VL의 N-말단 이 링커를 통해 연결된 것이라면 그 서열이 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커는 당업계에 scFV에 적용되는 링커로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 바람직하게 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 일 수 있다. 이에 따라본 발명의 scFV는 구체적으로 서열번호 67(N3 scFv) , 서열번호 69(N5 scFv) , 서열번호 71(N7 scFv) 및 서열번호 73(N9 scFv)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환 (항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다. 또한 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으니ᅳ, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 항체에 상 기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한본 발명은, 전술한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴 리뉴클레오티드를 제공한다. 본 명세서에서 플리뉴클레오티드는 을리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재 될 수도 있으며, DNA분자들 (예를 들어, cDNA 또는 유전체 (genomic DNA), NA 분자 들 (예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들 (예를 들어， 펩티드 핵산들 및 비 -자연적으로 발생하는 뉴클레오티 드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일- 가닥 (single-stranded) 또는 이중 -가닥 (double stranded)이 될 수 있다. 상기 플리뉴클레오티드는 상기한 KRS N-말단 영역에 특이적인 CDR 구성, 또 는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체를 암호화하는 염기서열 을 의미한다. 본 발명의 플리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호 화하는 것이면 그 서열이 특별히 제한되지 아니하는 것으로서， 앞서 설명한 본 발 명에 따른 항체에서 전술한 CDR 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 2(중쇄 CDR1), 서열번호 4(중쇄 CDR2) , 서열번호 6(중쇄 CDR3), 서열번호 8(경쇄 CDR1), 서열번호 10(경쇄 CDR2), 서열번호 12(경쇄 CDR3), 서열번호 14(중쇄 CDR1), 서열번호 16(중쇄 CDR2), 서열 번호 18(중쇄 CDR3), 서열번호 20(경쇄 CDR1), 서열번호 22(경쇄 CDR2), 서열번호 24(경쇄 CDR3), 서열번호 26(중쇄 CDR1), 서열번호 28(증쇄 CDR2), 서열번호 30(중 쇄 CDR3), 서열번호 32(경쇄 CDR1), 서열번호 34(경쇄 CDR2), 서열번호 36(경쇄 CDR3), 서열번호 38(중쇄 CDR1), 서열번호 40(중쇄 CDR2), 서열번호 42(중쇄 CDR3), 서열번호 44(경쇄 CDR1), 서열번호 46(경쇄 CDR2) 또는 서열번호 48(경쇄 CDR3)로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한본 발명에 따른 항체에서 전술한 VH와 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티 드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 서열번호 5CKVH), 서열번호 52(VL)f 서열번호 54(VH), 서열번호 56(VL), 서열번호 58(VH), 서열번호 60(VL), 서열번호 62(VH) 또는 서열번호 64(VL)으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 본 발명에 따른 scFv를 암호화하는 서열번호 68， 서열번호 70, 서열번호 72 및 서열번 호 74로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있 디-. 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일 부분 또는 전부를 코딩하는 DNA서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당분야 에 잘 알려진 을리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반웅 (PCR)법 등을사용하여 합성할수 있다. 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티 드를 포함하는 재조합 발현 백터를 제공한다. 본 발명에서 재조협 -(recombinant)은 '유전자 조작 (genet ic manipulat ion) '과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝 (molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다. 본 발명에서 '발현 (express ion) '은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. 본 발명에서 재조합 발현 백터란 적합한 숙주세포 (host cel l )에서 목적하는 단백질 또는 핵산 (RNA)을 발현할 수 있는 펙터로서， 폴리뉴클레오티드 (유전자) 삽 입물이 발현될 수 있도특 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유 전자 작제물을 말한다.작동가능하게 연결된 (operably l inked)이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 A를 코딩하는 핵산 서열 이 기능적으로 연결 (funct ion l inkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 발현조절서열 (expression control sequence)이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티 드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다, 그러한 조절 서열은 전사를 실시 하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열， 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈， 종결 코돈, 플리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 본 발명의 재조합 발현 백터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 백터라 면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며， 그 예로는 플라스미드 백터, 코즈미드 백 터 , 박테리오파아지 백터 및 바이러스 백터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다, 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드 (pUBllO 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드 (ΥΕρ13, ΥΕρ24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러 스， 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배클로 바이러 스와 같은 곤층 바이러스 등이 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 재조합 발현 백터는 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 전술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지 는 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현 될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 의미한다. 본 발명에 따른 항체의 증쇄와 경쇄를 암호화하는 플리뉴클레오티드는 각각 별개의 재조합 발현 백터에 포함되어 있을 수도 있고， 하나의 재조합 발현 백터에 포함되어 있을수도 있다. 본 발명은 전술한 재조합 발현 백터로 형질전환된 세포를 제공한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 재조합 발현 백터에 포함된 항체 또는 그 단편 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명애 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포 ( 숙주세포)는 원핵생물 (예를 들어, 대장균), 진핵생물 (예를 들어， 효모 또는 다른 균류), 식물 세포 (예를 들어， 담배 또는 토마토 식물 세포)， 동물 세포 (예를 들어, 인간 세포， 원승이 세포， 햄스터 (hamster) 세포， 랫 세포 (rat cell), 마우스 세포 (mouse cell), 곤층 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직 하게는 인간을포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다. 본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체， 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이 . 콜라이， 엔떼로박터 (Enter obacter), 에르위니아 (Erwinia), 클랩시 앨라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella)， 예를 들어, 살 모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium) , 세라티아 (Serratia), 예를 들어， 세 라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli), 예를 들어， 비. 섭틸리스 (B. subtil is) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis), 슈도모나스 (Pseudomonas) , 예를 들어 피.애투기노사 (P. aeruginosa) 및 스트랩토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 백터를 발현가능 한 것이면， 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이 . 콜라이일 수 있다. 본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속， 종 및 균주， 이에 한정되지 아니하나， 예를 들어 쉬조사카로마이세스픔베 (Schizosaccharomyces pombe) , 클루이베로마이세스 숙주， 예를 들어 케이. 락티스 (K.lactis), 케이. 프라길리스 (IL fragilis) (ATCC 12,424), 케이, 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K.wickeramii) (ATCC 24,178)， 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophi larum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모를레란스 ((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누 스 (K. mar i anus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226)； 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070)； 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Tr i c oderma reesia (EP 244,234))； 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidental is)； 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penici Ilium), 를리포클라디 움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란 스 (nididans) 및 에이, 니거 (niger)가사용가능 하다. 상기 용어 1형질전환 (transformation)1은 외래성 플리뉴클레오티드가도입됨 에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유 지되거나통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자모두 포함한다. 본 발명에 따론 KRS N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편 을 발현할 수 있는 재조합 발현 백터는 당업계에 공지된 방법， 예를 들어 이에 한 정되지는 않으나， 일시적 형질감염 (transient transfect ion) , 미세주사， 형질도입 (transduction), 세포융합， 칼슘 포스떼이트 침전법， 리포좀 매개된 형질감염 ( l iposome— mediated t rans feet ion) , DEAE 덱스트란—매개된 형질감염 (DEAE dextran- raediated transfect ion) , 폴리브렌―매개된 형질감염 (polybrene— mediated transfect ion) , 전기천공법 (electroporat ion)， 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질전환할 수 있다. 본 발명은, (a) 상기 재조합발현 백터로숙주 세포를 형질전환하는단계;
(b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단계 ; 및
(c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는， 세포 외막에 노출되는 라이실 tRNA 합성효소 (KRS, Lysyl~tRNA synthetase) N-말단 에 특이적으로 결합하는항체 또는 그 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
(a) 단계는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 생산하기 위하여 숙주세포 를 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현 백터로 형질전환하는 단계이다.
통상의 기술자는 선택된 숙주세포와 재조합 발현 백터에 따라 앞서 서술한 바와 같이 적절한 형질전환 방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 중쇄와 경 쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 백터는 동일한 숙주세포애 공동형질전환하 여 중쇄와 경쇄가 하나의 세포에서 발현되도특 할 수도 있고， 중쇄와 경쇄의 염기 서열을 포함하는 재조합 발현 백터를 각각 별개의 숙주세포에 형질전환하여 중쇄와 경쇄가 따로 발현되도록 할수도 있다.
(b) 단계는 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 백터로부터 본 발명에 따른 항체의 중쇄， 경쇄 또는 항체 단편의 플리펩티드 가 생산되도록 하는 단계이디- .
상기 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건， 배양 시간 등은 당 업계에서 통상 사용되는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 숙주세포애서 생산 되는 힝-체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세 포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나， 페리플라즘 등으로 표적화 (targeted)되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체가 KRS N-말단에 대한 결합특이성을 유지하 도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리플딩 (refolding)시키고 기 능성 구조 (conformat ion)를 갖도특 하는 것이 바람직하디-. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우， 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄 와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고， 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수 도 있다.
(c) 단계는 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계이다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어， 배양 배지로 분비된 항체 또는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고， 원심분리하여 불순물을 제거 하는 등의 방법으로 항체를 희수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 그 단 편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또 한 수득한 항체는 크로마토그래피， 필터 등에 의한 여과， 투석 둥의 방법을 통해 볼순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다. 본 발명 제조 (생산) 방법의 플리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며， 본 발명의 항체 또는 그 단편 의 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다. 이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 KRS N-말단과 특이적으로 결합하므로 예를 들어 , 특정 세포, 조직 , 또는 혈청 내 KRS 단백질을 검출하고 정량하기 위한 진단 분석에 유용하다. 특히 세포를 용해시키지 않고도 세포 외막으로 노출된 KRS N™말 단을 특이적으로 검출 가능하다. 따라서 본 발명은， 상기 항체 또는 그 단편을 시 료와 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는， 세포 외막에 노출되는 라이실—tRNA 합성효소 (KRS, Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 의 특이적 검출 방법. 본 발명의 상기 검출 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 시료와 접 촉시키기 전에， 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 이용하여 KRS (또는 세포 외막 으로 노출된 KRS N—말단 펩타이드)의 유무와 농도를 측정하기 위한 시료를 준비하 는 단계 ((1) 단계)를 포함할 수 있다.
통상의 기술자는 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 공지의 방법을 적절하 게 선택하고， 선택된 방법에 적합하게 시료를 준비할 수 있디-. 또한 시료는 암 (특 히 유방암 또는 폐암) 또는 암전이 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 생 검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈， 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 등일 수 도 있다. 상기 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 방법이란 여기 제한되는 것은 아니나， 예를 들어 웨스턴 블랏， 면역 블랏， 닷 블랏, 면역조직화학염색 (i隱 unohistochemistry), 효소면역분석 (ELISA) , 방사능면역검정법
(radioimmunoassay), 경쟁적 결합 분석， 면역침전 등이 있다. 예를 들어 웨스턴 블 랏을 실시하기 위하여서는 시료 또는 세포의 용해물에 전기영동에 적합한 버퍼를 첨가하여 끓이는 등의 방법으로 준비할 수 있으며, 면역조직화학염색을 위해서는 세포나 조직의 절편을 고정하고 블락킹 (blocking)하는 등의 전처리를 할 수 있다. 다음으로 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 전술한 단계에서 준비한 시료 와 접촉시키는 단계 ((2) 단겨 D를 수행한다.
본 발명에 따른 항체는 앞서 서술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 가지며 KRS N-말단에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단¾으로서ᅳ 그 구체적 종류와 서열 구성에 대해서는 전술한바와 같디-.
상기 항체 또는 그 단편은 이의 '검출 '을 위하여, 일반적으로 검출가능 모이 어티 (moiety)로 표지될 수 있다. 예를 들어， 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen 등, Ed. Wi ley-Interscience, New York, N. Y., Pubs]에 기술된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 또는 다양한 효소 -기질 표지가 이용가능하며 , 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 제 4,737,456호)와 같은 루 시퍼라제， 루시페린 (luciferin), 2, 3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디 하이드로게나제, 유라제 (urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP0)와 같은 퍼옥시다 제， 알칼라인 포스파타제， β-갈락토시다제， 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라 이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스 -6- 포스페이트 디하이드로게나제)， 해테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제)， 락토퍼옥시다제， 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소 를 접합시키는 기술은 예를 들어， 문헌 [O'Sullivan 등, 1981, Methods for the Preparat ion of Enzyme-항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J . Langone & H. Van Vimakis , eds . ) , Academic press , N. Y . , 73： 147-166]에 기술되어 있다ᅳ 표지는 다양한 공지된 기슬을 이용하여 항체에 직 접 또는 간접적으로 접합될 수 있디- . 예를 들어， 항체는 바이오틴 (biot in)에 접합 될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아 비딘과， 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘 (avidin)에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또 는， 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐 (hapten) ( 예를 들어 , 딕옥신 [digoxin] )과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항 -합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대， 항-딕옥신 항체) . 따라 서 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다. 본 발명에서 "접촉 (contact ing) "이라 함은 이의 일반적인 의미로 사용되는 것으로서, 2개 이상의 물질을 흔합, 결합, 또는 서로 맞닿게 하는 것을 의미한다. 싱-기 접촉은 시험관 내 ( in vi tro) 또는 다른 컨테이너 (container) 상에서 수행될 수 있고, 또한 인 시투 ( in si tu) , 생체 내， 개체 내, 조직 내, 세포 내에서 수행 될 수 있다, 다음으로는 상기 (2) 단계 수행 후의 시료에서 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계 ( (3) 단계)를 수행한다. 상기 '검출' 은 시료 내에서 형성된 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편과 항 원의 복합체를 대상으로 하는 것으로서, RS N-말단 영역의 펩타이드 (또는 이를 포 함하는 단백질, 예를 들어 KRS)의 존재 유무의 감지 또는 상기 펩타이드의 수준을 측정 (정성적 또는 정량적 측정을 모두 포함)하는 것을 의미한다. 따라서 상기 (2) 단계 수행 후 후술하는 검출 단계 ((3) 단계) 전에， KRS N-말단 영역과 복합체를 형 성하지 않은 여분의 항체 또는 그 단편들을 제거하는 단계가 추가로 포함될 수 있 다.
전술한 (2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 형광, 방사성 동위원소， 효소 등으로 직접 표지되는 등의 검출가능한 모이어티를 포함하는 경우에는 해당 모이어티를 검출하는 당업계에 공지된 방법에 따라 검출을 수행할 수 있다. 일례로 방사능은， 예를 들어, 신틸레이션 계수 (scint i l lat ion count ing)에 의해 측정될 수 있으며， 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.
또한 전술한 (2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 자체로서 전술한 검 출 모이어티를 포함하지 않는 경우에는, 당업계에 알려진 바와 같이 형광, 방사능， 효소 등으로 표지된 2차 항체를 이용하여 간접적으로 감지할 수 있다. 상기 2차 항 체는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편 ( 1차 항체)에 결합한다. 최근 연구를 통해 일반적으로 세포질 (cytosol )에 존재하는 인간 KRS (라이실一 tR A 합성효소, lysyl- tRNA synthethase)가 원형질막 (세포막)으로 이동 (trans locat ion)되어 원형질막에 존재하는 67LR(67— kDa 라미닌 수용체)과 상호작용 함으로써 종양 (또는 암) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이 (metastasi s )에 영향을 미친다는 것이 규명되었다 (Dae Gyu Kim et al . , Chemi cal inhibi t ion of promet astat ic lysyl -tRNA synthetaselaminin receptor interact ion, Nat Chem Biol . 2014 Jan ; 10( 1)： 2934. ) . 이때 KRS terminal extension(N-ext ) 영역이 KRS 가 세포막으로 이동 (trans locat ion) 하는데 있어서 필수적인 것으로 알려졌다. 또 한 암 전이와 관련하여， 67LR과의 상호작용에 있어서 구체적으로 KRS N-ext 영역이 이들의 결합에 관여함이 알려졌다. 본 발명에 따른 항체 및 그 단편들은 상기 KRS N-ext 영역에 특이적 결합능 력이 뛰어나며， 실제 S N-ext 영역에 결합됨에 따라 라미닌 수용체와의 결합 (상 호작용)을 저해하여 암의 전이를 억제하는 능력이 탁월하다. 이는 본 발명의 명세 서 실시예에 잘 나타나있다. 본 명세서 실시예에서는 암을 유발한 in vivo 암 전이 마우스 모델에 대하여 본 발명에 따른 항체를 투여한 결괴- , 농도 의존적으로 탁월 한 암 전이 효능을 보임을 확인하였다. 특히 기존에 라미닌 수용체 (67LR)와 KRS의 상호작용을 저해하여 암 전이를 억제하는 것으로 알려진 YH16899 화합물과 비교하 여도 암전이 억제 효능이 매우우수한 것으로 나타났다. 따라서 본 발명은, 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포 함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물, 및 암 진단용 조성물을 제공한다ᅳ
또한본 발명은, 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편으로 구성되는 암 전이 억제용 약학적 조성물, 및 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성 되는 암 전이 억제용 약학적 조성물， 및 암 진단용 조성물을 제공한다. 상기 암은 당업계에 악성 종양으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한 되지 않으나， 유방암, 대장암, 폐암， 소세포폐암, 위암， 간암， 혈액암, 골암, 췌장 암， 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종， 자궁암， 난소암, 직장 임-， 항문암, 결장암， 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종， 자궁경부암, 질암， 음문 암종， 호지킨병 , 식도암， 소장암， 내분비선암, 갑상선암， 부갑상선암， 부신암， 연 조직 육종， 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종， 방 광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종， CNS 종양, 1차 CNS 림 프종, 척수 종양， 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게 본 발명에서 상기 암은 유방암 또는 폐암일 수 있다. 본 발명은 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 면 역세포 이동 관련 질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한본 발명은 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편으로 구성되는 면역세포 이동 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한본 발명은 전술한본 발명의 항체 또는 그 단편으로 필수적으로 구성되 는 면역세포 이동 관련 질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에서 상기 용어 "면역 세포" 는 바람직하게 단핵구 또는 대식세포를 의미한다. 본 발명에서 용어 "면역세포 이동 관련 질환" 은, 당업계에 과도한면역세포 이동 (및 침윤)이 주요한 발병 기전인 것으로 공지된 것이라면 그 구체적 종류가 특 별히 제한되지 않으나, 예를 들어 심혈관 질환 섬유화 질환， 만성염증 질환 및 알 포트 증후군 (Alport syndrome) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 심혈관 질환은 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 폐동맥 고혈압， 죽상동맥경화, 협심증, 심근경색증, 허혈성 뇌혈관질환， 세동맥 경 화 및 중막 경화로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 섬유화 질환은 그 구체적 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 경피증 (scleroderma) , 류마티스 관절염 (rheumatoid arthrit is) , 크론 병 (Crohn ' s disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 골수 섬유증 (myelofibrosis), 폐 섬유증 (pulmonary fibrosis) , 간 섬유증 (hepathic fibrosis) , 간경변증 (liver cirrhosis), 신장 섬유증 (kidney fibrosis), 근섬유증 (myofibrosis), 심장 섬유증， 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosu), 유전성 섬유증， 감염성 섬유증 (특히 지속적 감염에 의한 섬유증), 자극성 섬유증 (담배, 독성물질 등 자극성 물질에 대한 반복된 노출에 의한 섬유증 )， 만성 자가면역에 의한 섬유증, 장기이식시 항원부적합에 의한 섬유증， 고지혈증 에 의한 섬유증， 비만에 의한 섬유증, 당뇨성 섬유증, 고혈압에 의한 섬유증 및 스 텐트삽입시 섬유화로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 만성염증 질환은 천식, 아토피성 피부염, 습진， 건선증， 골관절염， 통 풍, 건선성 관절염， 간경변， 무알콜성 지방간염 (non— alcoholic steatohepatitis) , 만성폐쇄성 폐질환, 비염, 당뇨병성 망막증， 당뇨병성 신부전증, 당뇨병성 신경병 증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있디-, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다ᅳ 상기 에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때， 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르 기 반웅 또는 이와유사한 반웅을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 임상 투 여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에 는 보통 사용하는 층전제, 증량제, 결힙 -제, 습윤제， 붕해제， 계면활성제 둥의 희석 제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 상기 화학식 1의 아릴 유도체 , 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 탄산칼슴， 수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부 형제 외에 스테아린산 마그네슴, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데， 흔히 사용되는 단순 회석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제， 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제, 현탁용제， 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 본 발명의 치료용 조성물을 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington: The Science and Pract ice of Pharmacy, 19th Edit ion, Al fonso, R. , ed, Mack Publ ishing Co. (Eastern, PA: 1995) )와 바람직한 순도를 갖는 항체를 흔합하여 저장하기 위해 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 제조할 수 있다. 허용가능한 담체， 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완층용액, 예를 들어 인산, 시 트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만 의 잔기) 플리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민， 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체， 예를 들어 플리비닐피롤리돈; 아미노산， 예를 들어 글리신, 글루타 민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류， 이당류， 및 글루코스， 만노스 또는 텍스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제， 예를 들어 EDTA; 당 알콜， 예를 들 어 만니롤 또는 소르비를; 염 -형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및 (또는) 비이온 성 계면활성제， 예를 들어 트원, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함 된다. 본 발명의 항체는 암 투병 중인 개체 또는 면역세포 이동 관련 질환 투병 중 인 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효 한 양" 이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하 게는 암을 치료하기에 층분한 양 또는 암 전이를 억제하기에 층분한 양 및 면역세 포 이동 관련 질환을 치료하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 항체 또는 그 단 편의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며， 다증 투여량 (mult iple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fract ionated treatment protocol )에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편의 인체 에 대한 투여량은 일반적으로 0.01 - 100 tng/kg/week이며， 바람직하게는 0.1 20 mg/kg/week이며， 더욱 바람직하게는 5 - 10 mg/kg/week일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중， 건강 상태， 성별, 질환의 중증도， 식이 및 배설을 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암 전이 억제제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다ᅳ 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 공지된 항체 투여 방법, 예를 들어 정맥내， 복강내, 뇌내, 피하， 근육내， 안내, 동맥내, 뇌척수내， 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 기재된 서방성 (sustained release) 시스템에 의한 주 사 또는 주입일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 일례로 본 발명의 항체는 전신으 로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 암 예방 또는 치료를 위하여 단독으로， 또는 수 술， 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는 방법들과 병용하 여 사용할 수 있다.
또한본 발명의 약학적 조성물은 면역세포 이동 관련 질환 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있디- . 본 발명에 따른 임- (또는 암 전이)의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중 애서 KRS 단백질 (특히， 세포 의막에 노출된 KRS N-말단 영역)을 검출함으로써 수행 될 수 있으며， 본 발명에 따른 면역세포 이동 관련 질환의 진단 및 예후 평가는 생 물학적 시료 중에서 KRS 단백질 (특히 , 세포 외막에 노출된 KRS N-말단 영역)을 검 출함으로써 수행될 수 있다, 본 발명에서 용어 (진단' 은, 병리 상태의 존재 또는 특정을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 진단은 암 또는 /및 암 전이， 면역세포 이동 관련 질환 의 발병 여부， 발병 가능성 (위험성)을 확인하는 것이다.
'검출' 에 대해서는 전술한 바와 같으며， 싱-기 생물학적 시료는 혈액 및 생 물학적 기원의 기티ᅳ 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않 으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈， 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀， 뇨, 젖， 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포 유동물， 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사 용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여괴 · , 증류， 추출， 농축, 방해 성분의 불활성화， 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한， 상기 시료로부터 핵산 및 단백 질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 진단 키트로서 제공될 수 있으며， 상기 키트는 당업계에 항체 또는 특정 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 구성품으로 제공 하는 분석 키트로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 예를 들 어 웨스턴 블랏, ELISA, 방사성면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확 산법， 로케이트 면역전기영동, 조직면역염색， 면역침전 분석법， 보체 고정 분석법， FACS또는 단백질 칩용 키트 둥을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 상기 키트 즉, 진단 분석을 수행하기 위한 진단 키트에서 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사 용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에， 키트는 기질 및 발색단 또는 형광단 을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자 (cofactor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액 (예를 들어 , 차단 완층액 또는 용해 완층액) 등 과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 충분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화 될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제 를 포함하는, 일반적으로 동결건조된， 건조 분말로서 제공될 수 있디- . 본 발명은 암 전이 억제용 제제를 제조하기 위한 전술한 본 발명의 항체 또 는 그 단편의 용도를 제공한다. 본 발명은 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하 는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이 억제 방법을 제공한다. 본 발명은 암 진단용 제제를 제조하기 위한 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다. 본 발명은 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하 는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법을 제공한다. 본 발명은 면역세포 이동 관련 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편의 용도를 제공한다. 본 발명은 전술한 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것올 특징으로 하는 면역세포 이동 관련 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 싱-기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때, 암의 개선， 치료, 예방, 검출， 진단 또는 암 전이 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하고， 면 역세포 이동 관련 질환의 개선, 치료， 예방, 검출, 진단 효과를 나타내는 양을 말 하며, 상기 '개체' 란 동물， 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포， 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한환자 (pat ient ) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '치료' 는 암 또는 암 관련 질환 또는 암 관련 질환, 면역 세포 이동 관련 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 이러한 질환을 치유하거나ᅳ 실질적으로 예방하거나， 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며 , 암 또는 암 관련 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증 상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니 다. 본 발명의 용어 ' 을 포함하는 (compr i sing)' 이란 '함유하는' 또는 '특징 으로 하는' 과 동일하게 사용되며， 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추 가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 ' 로 구성되는 (consist ing of ) ' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한디■. 용어 '필수적으로 구성되는 (essent i al ly consist ing of ) ' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한디- .
【유리한 효과】
본 발명에 따른 항체 또는 그 단편들은 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR (상 보성 결정부위) 서열을 가지며 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 영역에 특이적 결 합능력이 메우 우수하다. 또한 in vivo 상에서도 KRS 말단 영역에 특이적으로 타 겟팅되므로 라미닌 수용체와 KRS N-말단 영역의 상호작용을 억제하여 암 전이를 억 제하는 효과가 탁월하고， 면역세포의 이동을 조절할 수 있어， 면역세포 이동과 관 련한 질환의 예방， 개선 및 치료등에 매우 현저한 효과를 나타낸다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 웨스턴 블롯 (TO)을 통하여 RRS 전장 서열 또는 KRS N-말단 단편에 결 합하는 scFv phage clone을 선별한 결과를 나타낸다. 도 2는 면역침전법 ( IP)을 통하여 KRS 전장 서열 또는 KRS N-말단 단편에 결 합하는 scFv phage clone을 선별한 결과를 나타낸다. 도 3A는 myc-KRS T52D(Act ive mutant ) 발현을 통해 세포막에 KRS— N 말단 영 역을 노출된 세포를 제작하고, 각각 N3, N5 , N7 및 N9의 scFV clone이 상기 노출 영역에 결합하는지를 확인한 결과를 나타낸다 (KRS: myc-KRS T52D를 의미함) . 도 3B는 Inact ive mutant (myc-KRS T52A) 또는 WT-KRS( laminin untreated) 발 현 군에서는 세포막에 KRS-N 말단 영역의 노출이 일어나지 않아, N3 , N5, N7 및 N9 의 scFv clone을 처리하여도 검출 신호가 나타나지 않음을 보여준다. 도 3C는 myc이 표지된 WT—KRS, T52D, T52A로 형질전환시킨 세포에 라미닌을 처리한 다음 scFv를 염색하였을 띠ᅵ， WT— KRS의 라미닌에 의한 membrane local izat ion과 T52D mutant가 유사한 위치에 염색이 되고, 형질 전환된 myc도 동 일한 위치에 염색이 되었으니' , T52A에서는 염색이 되지 않는 것을 보여준다 (scFv: 초록색， myc: 빨간색) . 도 4는 Ful l length KRS(F로 표시, 서열번호 76) , N—말단의 1~기번째 아미노 산이 결실된 KRS 단편 (1로 표시)， 및 N 말단의 1~200번째 아미노산으로 이루어지는 KRS 단편 (2로 표시)을 사용하여 , N3, N5, N7 및 N9의 scFv clone이 KRS N— terminus 에 특이적으로 바인딩하는지를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 5A는 본 발명의 항체들 중， 대표적으로 N3 IgG 및 N5 IgG의 KRS에 대한 결합능을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 5B는 본 발명의 항체들 중, 대표적으로 N3 IgG 및 IgG의 KRS에 대한 결합능을 면역침전으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 6A는 SPR 방법을 통하여 N3 IgG의 KRS N—말단에 대한 결합력을 정량적으 로 확인한 결과를 나타낸다. 도 6B는 SPR 방법을 통하여 N5 IgG의 KRS 말단에 대한 결합력을 정량적으 로 확인한 결과를 나타낸다. 도 7A는 WT-KRS를 발현하도록 형질전환한 세포에 라미닌을 처리하여 KRS의 N-말단 영역이 세포 외막으로 노출되도록 한 후, 본 발명의 항체 N3 IgG를 처리하 여 상기 노출 영역에 대한 결합을 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 7B는 T52D—KRS( act ive mutant , myc tagged KRS) 발현을 통해 세포막에 KRS-N 말단 영역을 노출된 세포를 제작하고, 본 발명의 항체 IgG를 처리하여 상 기 노출 영역에 대한 결합을 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다. 또한 세 포막에 투과성을 부여한 실험에서， 본 발명의 항체가 세포 내부로 들어가 세포 내 부에 존재하는 KRS 단백질과도 결합 가능함을 확인하였다. 도 7C는 WT-KRS를 발현하도톡 형질전환한 세포에 라미닌을 처리하여 KRS의 N-말단 영역이 세포 외막으로 노출되도록 한 후， 본 발명의 항체 N5 IgG를 처리하 여 상기 노출 영역에 대한 결합을 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다 (N5 IgG: 초록색) . 도 8은 본 발명 항체 N3 IgG가 세포 독성이 없음을 MTT assay 방법으로 확인 한 결과를 나타낸다, 도 9A는 본 발명 항체 N3 IgG 처리에 의하여 세포 이동 (cel l migrat ion)이 억제됨을 확인한 결과를 나타낸다. 도 9B는 본 발명 항체 N3 IgG가 농도 의존적으로 현저하게 세포 이동 (cel l migrat ion)을 억제시키는 것을 확인한 결과를 나타낸다. 도 10은 in vivo암전이 모델을 이용한 실험에서 , 마우스 암 전이 모델의 제 작과 치료물질 투여 (항체 또는 YH16899) 일정 , 및 상기 마우스 모델로부터 폐 전이 를 관찰하는 실험 스케줄을 도식적으로 나타낸다, 도 11은 in vivo암전이 모델에서 본 발명 항체 N3 IgG의 투여에 의하여 암 의 폐 전이가 현저히 억제되었음을 확인할 수 있는, 마우스 폐 표본을 보여준다. 폐 시료에 나타나는 결절의 개수 및 상태 등으로 암 전이의 진행도 및 심각도를 평 가할수 있다. 도 12는 in vivo 암전이 모델에서 본 발명 항체 N3 IgG의 투여에 의하여 대 조군 대비 폐 결절의 생성이 현저히 억제 (즉, 암의 폐 전이가 현저히 억제됨)됨을 확인한 결과를 나타낸다. 도 13은 대조군과 N3 IgG의 처리군에서의 폐조직을 대조적으로 보여주며, 대 조군에서는 본 발명의 항체 처리군에 비하여 라미닌 수용체가 전이된 결절 부위에 상당히 많이 발현된 것을 확인하였다. 도 14는 각각 대조군, YH16899 처리군, N3 IgG의 처리군에서의 폐 표본을 보 여주는 것으로서, YH16899 처리군 및 N3 IgG의 처리군에서 대조군 대비 폐 결절의 생성이 현저히 억제된 결과를 나타낸다. 도 15는 YH16899 처리군, N3 IgG의 처리군에서 싱-기 암 전이 억제제 물질들 의 처리 농도에 따른 폐전이 억제 효율 (폐 결절 생성 억제 효율)을 나타낸다. 도 16은 SPR방법을 통하여 N3 IgG의 사람 aiuman, h) K S N-말단의 펩타이드 조각 (Fl, F2, F3, F4, F5)에 대한 결합력을 정량적으로 확인한 결과를 나타낸다 (서 열 하단의 회색 막대는 해당 영역 (F1 내지 F5)에 대한 N3 항체의 결합력을 나타내 는 것으로， 막대의 색이 진할수록 높은 결합강도를 나타내는 것을 표시함) , 도 17은 SPR방법을 통하여 N3 IgG의 사람 (human, h), 마우스 (mouse, m) , ¾ (rat, r) KRS N~말단의 펩타이드 조각 (Fl, F3f F5) 대한 결합력을 정량적으로 확인 한 결과를 나타낸다 (서열 하단의 회색 막대는 해당 영역 (F1 내지 F5)에 대한 N3 항 체의 결합력을 나타내는 것으로， 막대의 색이 진할수톡 높은 결합강도를 나타내는 것을 표시험 -). 도 18a는 면역세포 (단핵구 /대식세포) 이동에 대한 콜라겐 (collagen), 파이브 로넥틴 (fibronectin) 및 라미닌 (lamimn)의 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이 (transweli migration assay)≤. 비교한 결과로서, migrating ceil에 대한 현미경 이미지를 나타낸다. 도 18b는 상기 도 18a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정 (정량)하여 그래프 로 표시한 것이다. 도 19a는 면역세포 (단핵구 /대식세포) 이동에 대한 다양한 라미닌 아형 (LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521)의 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이 (transweli migration assay)로 비교한 결과로서, migrating cell에 대한 현 미경 이미지를 나타낸다. 도 19b는 도 19a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정 (정량)하여 그래프로 표 시한 것이다. 도 19c는 LN421 처리에 의하여 단핵구 /대식세포 막에서 RS가 증가하는 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 20a는 LN421에 특이적인 단핵구 /대식세포 이동에 대한 본 발명 항체 N3 IgG의 이동 억제 효과를 트랜스웰 세포이동 어세이 (transweli migration assay)로 비교한 결과로서, migrating ceil에 대한 현미경 이미지를 나타낸다. 도 20b는 도 20a의 현미경 이미지에서 세포수를 측정 (정량)하여 그래프로 표 시한 것이다. 도 20c는 LN421 처리에 의해 단핵구 /대식세포 막에서 증가된 KRS 수준이, 본 발명 항체 N3 IgG 처리에 의하여 감소되는 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나 타낸다. 도 21a는 본 발명의 항체 N3 IgG투여에 의한 폐동맥 고혈압 (PAH) 모멜의 우 심실 수축기말 압력 (right ventricular end-systol ic pressure ; RVESP) 변화를 나 타낸다 (Mock IgG: 음성 대조군， Ab Irapk: N3 항체 linpk, Ab lOmpk ： N3 항체 lOmpk, si ldenaf i l : 양성 대조군) . 도 21b는 본 발명의 항체 N3 IgG 투여에 의한 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델의 좌 심실 수축기말 압력 ( left ventricular end-systol ic pressure ; LVESP) 변화를 나타 낸다 (Mock IgG: 음성 대조군， Ab Impk: N3 I G lmpk, Ab lOmpk ： N3 IgG lOmpk, si ldenaf i l : 양성 대조군) . 도 22는 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델에서 본 발명의 항체 N3 IgG 투여에 의해 면역세포 이동 및 침윤이 감소되었음을 IHC 염색으로 확인한 결과이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
scFv l ibrary 스크리닝 <1-1> scFv phage 선별 _ 1차
KRS 전장서열 (서열번호 76) 중에서， 라미닌 신호에 의해 세포막으로 이동되 었을 때 세포 외막에 노출되는 KRS N-말단 (서열번호 75) 영역에만 특이적으로 결합 하는 scFv를 선별하기 위하여， HA tag으로 표지된 인간의 B 세포에서 유래한 scFv phage l ibrary를 이용한 phage display panning 실험을 실시하였다. 본 실험에 시-
_ 9
용한 scFv display phage 1 ibraryCLibrary size : app . 7.6 x 10 Library produced by prof . Hyunbo Shim)에 대해서는 대한민국 등록특허 10—0961392호에 기재되어 있 다. 하기 표 1에서 보는 바와 같이， KRS 전장서열 및 N—말단 위치의 서로 다른 특 정 영역의 KRS 단편들이 phage di splay panning 실험을 위한 항원단백질로서 사용 되었다. lml의 IX PBS 용액을 포함하는 Immmo-튜브에 l lO y g의 항원 단백질을 첨가 하고 37°C , 200rpm으로 1시간 동안 반웅시켜 류브 안쪽 표면에 항원을 코팅하였다. 항원 용액을 따라내고 수듯물로 1회 세척하여 코팅되지 않은 항원을 제거하였다. 항원 단백질과 phage간 비특이적 결합을 막기 위하여 iTOimo-류브와 scFv l ibrary 를 각각 3% 탈지유가 포함된 IX PBST(0.05 tween20을 포함하는 PBS)로 1시간 동안 상은에서 반웅시켰다. I隱 uno-류브에서 탈지유를 제거한 후, scFv l ibrary를 첨가 하여 37°C , 150rpm으로 1시간 동안 반웅시켜 항원에 scFv phage가 결합하도록 하였 다. scFv phage를 류브에서 반웅시킨 후, IX PBST로 2~5번 세척하여 결합하지 않은 scFv phage를 제거하였다.
각각의 KRS 항원에 특이적으로 결합한 scFv phage는 상온에서 tr i ethylamine( lOOmM) lral을 첨가하여 10분 이내에 분리해내고, Tr i sClM, pH 7.4) 로 중화시켰디-. 여과한 phage scFv를 0D<1으로 배양한 ER2537 . co//에 첨가하여 37V , 120rpm으로 1시간 30분 동안 배양하면서 감염시켰다. phage에 감염된 E. coii 는 원심분리하여 배양 상층액을 일부 제거한 후 재분산하여 암피실린과 포도당 (2%) 을 포함하는 지름 15cm의 아가로즈 플레이트에 도포하였다. 다음날 5ml SB 배지를 도포하여 플레이트에서 자란 세포들을 모두 수득하고, glyceroK50%)을 전체 부피 의 0.5배기- 되도록 첨가하여 흔합하고 lml씩 분주하여 — 8CTC에 보관하였다 (scFv panning stock) . 상기 제조한 stock 20 μ 1를 20ml SB 용액에 접종하여 배양하고， helper phage를 이용하여 다음 단계의 phage panning을 위한 scFv phage l ibrary( lml )로 제작하였다. 힘 -원에 특이적인 scFv를 발현하는 phage를 분리하기 위한 상기 과정을 2~3회 반복하였다.
<1-2> ELISA를 통한 결합특이적 scFv항체 선별 _2차선별
실시예 <1—1>에서 선별된 phage가 발현하는 scFv가 전술한 RS 전장또는 말단 단편들에 결합하는지 indi rect ELISA를 실시하여 조사하였다.
Panning을 3회 반복하여 수득한 scFv 결과물을 희석하여 지름 10cm의 아가로 즈 플레이트에 도포하고, 다음날 각각의 콜로니 (colony)를 선별하여 200 μ 1의 SB 배지가 포함된 96 well 플레이트에서 각각 배양하였다ᅳ 전체적으로 증식이 잘된 것 을 확인하고， IPTG(lmM)를 첨가하고 30°C로 16시간 동안 배양하여 scFv의 생산을 유도하였다. 다음날 96 well 플레이트를 원심분리하여 세포만 분리한 뒤, TES 용액 을 이용하여 세포를 용해시키고, 다시 원심분리하여 상층액만 분리하였다. 수득한 상층액으로 indirect ELISA를 실시하여 상기 항원에 특이적으로 결합하는 scFv를 선별하였다. 상기 KRS 전장 또는 N-말단 단편 항원별로 각각 플레이트를 코팅하고, scFv를 포함하는 배양 상층액을 반응시킨 후, 2차 항체로 항 -HA-HRP 항체 (Roche Applied Science)와 반웅시켰다. Tetramethylbenzimidine(TMB, Thermo scientific) 을 이용하여 발색 반응한 후， ¾S04(1M)을 이용하여 발색 반웅을 중지시키고 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였디-. control (blank)과 전술한 항원 (Ag)에 대 하여 동시에 ELISA를 수행하여 positive값을 얻은 colony만 선별하는 작업을 수행 하였다. ELISA에 수행된 colony는 총 1920개, 그 중 positive로 선별된 것은 93개 이다 (표 1 참조).
【표 1】
Figure imgf000040_0001
<l-3>서열분석
상기 실시예 <1-2>에서 ELISA screening을 통하여 선별된 93개의 colony증에 서 중복된 CDR서열을 가진 동일 Ab를 걸러내기 위하여 sequence를 분석하였다. 구 체적으로 서열분석은 다음과 같은 방법으로 수행되었다: scFv clone을 보유하고 있 는 E.coli^ 배양한 다음, miniprep으로 phagemid를 확보하였다. 이를 Omp primer (Hye young Yang, et. al. , 2009, Mol . Cells 27, 225—235)를 사용하여 sequence를 확인하였다. 이와 같이 확보된 sequence를 Bioedit 프로그렘을 사용하 여 phagemid의 CDR region의 서열을 확인하였다. 이 중 증복된 CDR 서열을 가진 clone을 제거하여， 각각독립된 CDR서열의 scFv clone을 확인하였다. 【표 2]
Figure imgf000041_0001
서열분석을통해 중복된 CDR서열의 항체를 선별한 결과, 상기 표 2에서 보 는 바와 같이 각기 다른 CDR서열의 scFv clone은 38개였다.
<1-4> western blot을 통한결합특이적 scFv항체 선별 _3차선별
상기 실시예 <1-3>에서 분리한 38개의 scFV c lone을 대상으로, 이들이 KRS와 특이적으로 결합하는지 western blot으로 확인하였다.
상기 scFv 양성 단일 콜로니 클론을 카나마이신을 함유하는 SB 배지 (Bactotrytone 30g , yeast extract 20g,MOPS buf fer lOg/L)에 5 ml에 배양하여 seed culture를 시작하여 overnight 배양후 500ml 카나마이신함유 SB배지에 옮겨 0D 600 = 0.5 정도 되었을 때 IPTG를 ImM되게 넣어 30도에서 overnight 배양하여 scFv 단백질을 대장균의 페리플라즘 (peripl asm)에서 발현하였다. 다음날 원심분리 하여 수득한 대장균을 IX TES buf fer에 (50 mM Tr i s , 1 mM EDTA , 20% Sucrose, pH 8.0) 현탁한 후 0.2 X TES를 1.5배 첨가하여 섞어주고 원심분리하여 상등액을 취함 으로서 페리플라즘을 추출하였다.
페리플라즘에서 추출한 scFv 항체에 최종 5 mM MgS04를 가하고 이를 미리
PBS에 평형시킨 Ni-NTA bead와 섞어 1시간 동안 냉장에서 교반하여 Ni-NTA bead에 결합시킨 후 친화도 크로마토그래피를 수행하여 결합하지 않은 단백질 을 PBS로 층 분히 씻어내었다. 5 mM Imidazole이 함유된 buf fer로 더 충분히 씻어 준 다음 결합 한 scFv 항체는 200 mM Imidazole buf fer를 이용하여 용출하였다, 용출된 항체는 투석하여 전기이동을 통해 순도를 확인하고 BCA 방법으로 단백질 정량을 하여 정제 된 항체양을 기록 후 일정량을 분주하여 넁동 보관하였디-.
전술한 바와 같이 페리플라즘에서 추출한 scFv 항체는 웨스턴블롯 (western blot ) 기법을 사용하여, KRS 전장 또는 각각의 KRS N-말단 단편에 scFv 항체가 결 합하는지 여부를 확인하는 데 사용하였다. 30ug의 HCT116 cel l lysate를 SDS PAGE 를 통해 전기 이동한 후 PVDF membrane에 옮겨 3% skim mi lk로 blocking 한 후 추 출한 scFv 항체를 1.0 /^씩 첨가하여 1시간동안 결합시켰다. 결합하지 않은 scFv 항체를 제거하고, 검출을 위해서 항원과 결합한 scFv에 HRPOiorseradish peroxidase) } 연결된 Ant i— HA 이차 항체를 반웅시킨 후， 기질로 ECL reagent를 이 용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 KRS 전 장 및 각각의 단편의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다. 상기 Western blot을 수행하여서 너무 약한 band( faint band) , non-speci f ic band(double band) 등의 결과를 얻은 scFv clone을 제거하였디 · . 이렇게 선별된 scFc 클론은 13개로서， 이러한 결과를 도 1 에서 보여준다.
<1-5> 면역침전을 통한 결합특이적 scFv 항체 선별— 4차선별
상기 실시예 <卜4>에서 선별된 scFV clone이 실제 nat ive KRS에 binding하는 지 확인하기 위하여 면역침강 (i隱 unoprecipi tat ion)을 수행하였다. 정제된 scFv clone을 HCT116 cel l lysate와 Ag-Ab binding 반응시키고， scFv의 HA-tag을 활용하 여 immunoprecipitat ion을 수행하였다.
구체적으로, HCT116세포를 150mM NaCl , 0.5% 트리톤 X—IOO, 0.1% SDS 및 단 백질 분해효소 저해제를 포함하는 20mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.4, 용해버퍼 )로 용해하 였다. 500 의 HCT116 세포 용해물에 각각의 scFv를 5 씩 첨가한 후 4°C에서 하룻 밤동안 배양하였다. ant i-HA agarose bead 30^을 첨가하고 4°C에서 4시간동안 배 양하였다ᅳ 원심분리를 통해 상등액을 제거하였다. 이렇게 수득한 침전물을 SDS-샘 플 버퍼에 녹이고 7분 동안끓이는 과정을 두 번 반복하였다.
전술한 과정을 통해 준비된 면역침전 시료들을 각각 SDS PAGE를 통해 전기 이동한 후, PVDF membrane에 옮겨 3% skim mi lk로 blocking 한 후, KRS polyclonal ant ibodyC rabbi t , Neomics , Co. Ltd. #匪5— 01-0005) 항체를 첨가하여 1시간동안 결 합시켰다. 결합하지 않은 항체를 제거하고, ant i-rabbit 2차 항체 (ThermoFisher Scient i fic , #31460)를 첨가하여 반응시켰다. 이차 항체를 반웅시킨 후, 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 KRS 전장 및 각각의 단편의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였디-. 이렇게 선별된 scFc 클론은 12개로서， 이러한 결과를 도 2에서 보여준다.
<1-6>면역형광법을 통한 결합특이적 scFv 항체 선별„5차 선별
상기 실시예 <1— 5>에서 선별된 scFv clone이 실제 cel l membrane에 노출된 KRS N-말단 영역에 binding하는지 확인하기 위하여 면역형광염색 (i腿 unofluorescence)을 수행하였다, 이때 KRS가 membrane에 노출되는 현상을 만들 기 위하여 KRS-T52D mutant (act ive mutant)를 사용하였다, 구체적으로 glass coverslip에 A549 세포를 분주한 뒤 (1 χ 105 cell, 12 well plate 기준)， 24시간 후 각각 oiyc-KRS WT/ myc-KRS T52D(Active mutant)/ myc-KRS T52A(Inact ive mutant)을 과발현시켰다. 이후 24시간 배양, 무혈청 배지 (RPMI 1640 media)를 이용하여， 37°C 에서 1시간동안 배양하였다. 그 후, lOwg/ml 라미닌 (L2020; Sigraa)을 처리하여 37 °C에서 1시간동안 방치하여 셈플을 준비하였다. 각각의 myc-KRS T52D(Active mutant) 및 myc— KRS T52A( Inactive mutant) 백터들은 pcDNA3-mycᅳ KRS WT 백터를 backbone으로 하여 site-directed mut agenes i s ( Qu i kChange Π Site-Directed Mutagenesis kit, Agilent, #200523)를 통해 제작하였다.
상기 준비된 샘플을 PBS(4°C)로 세척한 뒤 10분 동안 4% paraformaldehyde 처리하여 고정시키고 세척하였다. 10분 동안 CAS block을 수행하고, 상기 scFv 및 Myc antibody를 2시간동안 처리하였디-. 그 후 비결합 항체들을 제거하고, 암실에서 1시간동안 2차 항체와 반옹시켰다. DAPI 염색을 10분 동안 수행하여 마운팅하였다. 실험결과 도 3에서 보는 바와 같이, Inactive mutant(T52A)와 WT- K Sdaminin untreated)에는 결합하지 않고 active mutant의 cell에만 결합하는 scFv clone은 총 4개 (N3, N5, N7 및 N9) 선별되었다. 또한 WT-KRS의 membrane localization을 유도하기 위해 minin을 처리한 다음 scFv를 염색하였을 때, T52D mutant와유사한 위치에 염색되는 것을 확인하였다.
이들 클론들은 세포의 표면 (tip)에서 특이적으로 결합되어있음을 확인하였 다.
<1-7> KRS N—말단에 대한 특이적 결합능의 확인
상기 실시예 <1_6>을 통해 최종 선별된 scFv clone들 (N3, N5, N7 및 N9)이 실제 KRS N-terminus에 binding 하는지 확인하기 위하여， Full length KRS(F로 표 시 , 서열번호 76) N-말단의 기번째 아미노산이 결실된 KRS 단편 (1로 표시)， 및 말단의 1~200번째 아미노산으로 이루어지는 KRS 단편 (2로 표시)을 사용하여 웨스 턴블롯을 진행하였다.
상기 Full length KRS와 KRS단편들을 코딩하는 플리뉴클레오티드를 이용하 여 , 싱-기 실시예 <1— 6>에 기재된 것과 같은 방법으로 각각 A549 세포를 형질전환하 였디. 그 후 세포를 용해키고, 상기 실시예 <1— 4>기재된 것과 같은 방법으로 웨스 턴 블롯을 수행하였다. 그 결과 도 4에서 보는 바와 같이 선별된 scFv clone(N3 , N5 , N7 및 N9) 모 두 N-terminus 1~72 amino add가 없는 fragment 1에서는 band를 보이지 않고 RS 1-200 amino acid를 갖고 있는 fragment에서만 band를 보이는 것을 확인하였다. 이 로서 N3 , N5, N7 및 N9의 scFv c lone들은 모두 KRS N-terminus에 특이적으로 결합 하는 것을 확인하였다.
<1-8> KRS N-말단 결합특이적 scFv clone의 서열 분석
상기 실시예 <1— 6>을 통해 최종 선별된 scFv <: 1011£；들^3 N5 , N7 및 N9)에 대하여 이들의 CDR 구성, 및 VH와 VL 서열 분석이 이루어졌다. 서열분석은 전술한 실시예 <1 3>과 동일한 방법으로 수행되었다. 서열분석결과 N3 scFv는 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, 상기 서열은 중간에 서열번호 65의 링커서열을 포함하고 있었다. 이에 따라 N3의 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, N3의 VL은 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었다. 상기 N3의 VH 및 VL에 포함된 각각의 CDR서열을 분석한 결과, 상기 N3의 VH는 서열번호 1로 표시되 는 중쇄 CDR1 , 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 증쇄 CDR3을 포함하며， 상기 N3의 VL은 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR1 , 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR3을포함하고 있었다.
N5 scFv는 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, 상 기 서열은 증간에 서열번호 65의 링커서열을 포함하고 있었다. 이에 따라 N5의 VH 는 서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, N5의 VL은 서열 번호 55로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었다. 상기 N5의 VH는 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 CDR1 , 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 17로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하며， N5의 YL은 서열번호 19로 표시되는 경쇄 CDR1 , 서 열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하 고 있었다.
N7 scFv는 서열번호 기로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며， 상 기 서열은 중간에 서열번호 65의 링커서열을 포함하고 있었다. 이에 따라 N7의 VH 는 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, N7의 VL은 서열번 호 59로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었다, 상기 N7의 VH는 서열번호 25 로 표시되는 중쇄 CDR1 , 서열번호 27로 표시되는 증쇄 CDR2 및 서열번호 29로 표시 되는 중쇄 CDR3을 포함하며， N7의 VL은 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1 , 서열번 호 33으로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 35로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하고 있었다.
N9 scFv는 서열번호 73으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며， 상기 서열은 증간에 서열번호 65의 링커서열을 포함하고 있었다. 이에 따라 N9의 VH는 서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며， N9의 VL은 서열 번호 63으로 표시되는 아미노산서열로 이루어져 있었디- . 상기 N9의 VH는 서열번호 37로 표시되는 중쇄 CDR1 , 서열번호 39로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 41로 표 시되는 중쇄 CDR3을 포함하며， N9의 VL은 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR 1， 서열번호 45로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 47로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하 고 있었다.
<실시예 2>
scFv 항체의 IgG로의 전환 및 특이적 결합력 평가 <2-1> scFv항체의 IgG로의 전환
먼저 클론 N3 , N5 , N7 및 N9 phage의 유전체에서 scFv를 암호화하는 폴리뉴 클레오티드를 PCR로 증폭하였다. 상기 scFv의 VH 영역의 유전자를 증폭하는데 사용 한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: Forward(AGA GAG TGT ACA CTC C CA GGC GGC CGA GGT GCA G , 서열번호 93)， Reverse (CGC CGC TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GCT CAC GGT GAC CAG, 서열번호 94) scFv의 VL 영역의 유전자를 증폭하는데 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: Forward(MG CGG CCG CCA CCA TGG GAT GGA GCT GTA TCA TCC TCT TCT TGG TAG CM CAG CTA CAG GTG TAC ACT CCC AGT CTG TGC TGA CTC AG, 서열번호 95)， Reverse (CGC CGC CGT ACG TAG GAC CGT CAG CTT GGT, 서열번 호 96)
각각의 phage DNA(50ng)를 주형으로 하여 상기 프라이머 (각각 10pmol )를 이 용하여 95°C/3min ; 95°C /30sec , 60°C /30sec , 72°C /30sec , 30 cycles ; 72°C /5min의 조건으로 PCR을 수행하여 N3, N5, N7 또는 N9 scFv의 VH 또는 VL 유전자를 증폭하 였다. PCR산물은 제한효소를 이용하여 IgG 생산에 사용되는 백터인 pcDNA3.4 백터 에 삽입하였다. IgG의 중쇄 (heavy chain)와 경쇄 ( l ight chain)의 단백질은 별개의 플라스미드에서 개별적으로 발현되도록 하였다.
상기에서 제조된， scFv의 가변영역을 포함하는 IgG (이하 각각 N3 IgG, N5 IgG, N7 IgG, N9 IgG로 지칭)의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 백터는 freestyle 293F 세포에 공동형질전환시켜 경쇄와 중쇄가 세포 안에서 함께 발현되 도톡 하였다. 형질전환된 293F 세포를 37°C , 8% C¾조건에서 7일 동안 배양하여 상 층액을 수득하였다. 상층액은 cel lulose acetate membrane f i l ter(pore size 0.22 μ ηι, Corning)로 여과하고 Capt ivA™ Pr iMAB protein A col讓 (Repl igen, USA)을 사용하여 정제하였다. 수득한 항체 농도는 BCA ki t (Pi erce, 23225)를 이용하여 측 정하였고， Bioanalyzer( Agi lent 2100 Bioanalyzer )를 이용하여 환원과 비환원 조건 에서 생산된 IgG항체 단백질을 분석하였다.
<2-2> 전환된 IgG의 KRS 결합력 검증― 웨스턴 불롯 및 면역침전
상기 실시예 <2— 1>에서 제작된 IgG 들의 KRS에 대한 결합력을 웨스턴블롯 (WB) 및 면역침전 ( IP) 방식으로 검증하였다. 상기 실시예 <1-4>에 기재된 것과 같 은 방식으로 웨스턴 블롯을 수행하였으며， 상기 실시예 <1-5>에 기재된 것과 같은 방식으로 면역침전을 수행하였다. 그 결과 본 발명에서 제작된 IgG들은 KRS에 결합하는 것을 검증하였으며， 도 5에서는 이러한 결과를 (3 IgG 및 N5 IgG를 대표로하여 보여준다,
<2-3> 전환된 IgG의 KRS N-말단 특이적 결합력 검증— SPR
정제한 항체 단백질 (N3 IgG 및 N5 IgG)과 항원 (KRS 1-207 aa)에 대한 정량적 인 결합력을 Biacore 2000 SPR(Surface Pl asmon Resonance) (GE healthcare , 미국) 바이오센서를 이용하여 측정하였디- . KRS를 센서칩 (sensor chip CM5)(GE heal thcare , 미국)에 고정시킨 후, HES 완층용액 ( 10 mM HEPES, pH7.4 150 mM NaCl , 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20)에 순차적으로 희석한 항체 단백질 (6.25 ~ 100 nM)을 3분 동안 30 /rf/min 속도로 흘려주고, 1M NaCl / 20mM NaOH를 3분 동안 30 /rain 속도로 홀려줌으로써 항원에 결합된 단백질 해리를 유도하였다. 대조군으로 서 mock IgG를 사용하였다. 구체적인 실험 조건은 다음과 같다; I腿 obi 1 i zed Ant i gen ： KRS
Immobi l ized level ： 185 RU
Ant ibody ： N3 IgG, N5 IgG
Running buffer ： HBS-N buffer
Regenerat ion ： 2 M NaCl , 20 ml NaOH (f low 30 ul I min 1 min)
【표 3】
Figure imgf000047_0001
상기 표 3은 Biacore 2000 SPR을 이용하여 측정한 N3 IgG, N5 IgG의 운동속 도 상수와 평형 해리상수를 나타낸 것이다. BIA evaluat ion ver .3.2 소프트웨어를 이용하여 친화도를운동속도 상수 (ka 및 kd)와 평형해리상수 (KD)로 얻었다. 도 6 은 각각 N3 IgG, N5 IgG의 SPR그래프 결과를 나타낸다. 도 6 및 표 3으로부터 본 발명의 N3 IgG, N5 IgG는 KRS N—말단 영역에 특이적으로 높은 결합력을 가짐을 확 인하였다. 대조군인 mock IgG에서는 binding signal이 없었다.
<2-4> 전환된 IgG의 KRS Nᅳ말단 특이적 결합력 검증 _면역형광 염색 본 발명에서 제작한 IgG이 실제 cel l membrane에 노출된 KRS 영역에 binding 하는지 확인하기 위하여 면역형광염색 ( i瞧 unof luorescence)을 수행하였다. 대표적 으로 N3 IgG와 N5 IgG를 사용하여, 상기 실시예 <1— 6>에 기재된 것과 같은 방법으 로 면역형광 염색을 수행하였다. 그 결과 도 7A에서 보는 바와 같이, 1 ami n in을 처리하여 WT— KRS의 membrane local izat ion을 유도한 경우에 있어서， N3 IgG이 세포 외막으로 노출된 KRS N-말단 부분에 특이적으로 잘 결합한 것을 확인하였다, 도 7B에서 보는 바와 같이, T52D— KRS(act ive mutant , myc tagged KRS)를 이용한 실험에서도， 본 발명의 항체는 세포 외막으로 노출된 KRS N-말단부분에 특이적으로 잘 결합하였으며 , 실험 세포에 세포 막 투과성을 부과하였을 때 세포내에 존재하는 KRS 단백질을 높은 감도로 검출해내 었디■. 또한 도 7C에서 보는 바와 같이， laminin을 처리하여 WT-KRS의 membrane local izat ion을 유도한 경우에 N5 IgG이 세포 외막으로 노출된 KRS N—말단 부분에 특이적으로 잘 결합한 것을 확인하였다.
이로써 본 발명에서 제공하는 항체들은 세포 외막으로 노출된 KRS N—말단부 분에 결합 특이성이 높은 것을 확인하였다.
<실시예 3>
암 전이 억제 효능 확인
<3-1>세포 독성 평가
대표적으로 IgG를 이용하여 MTT assay를 수행하였다. A549 cell을 (5,000 cell/well) 96— well plate에 분주하고 배양하였다. 무혈청 배지를 사용하여 상기 세포들을 세척한 뒤 , human mock I G 및 N3 IgG을 각각 0, 50, 100， 500nM의 농도 (in serum free media)로 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 MTT solution을 50ug/weH씩 첨가하여 4시간 동안 처리하였다. MTT so kit ion을 제거한 후, DMS0 lOOul을 처리하고 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험 결과 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 항체는 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
<3-2>세포 이동 (cell migration) 분석
세포 이동은 선행 문헌 (Park, S. G. et al . Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro— inflammatory response, Proc. Natl . Acad, Sci . U S A 102, 6356-6361 (2005))에 기재한 바와 같이 폴리카보네이트 막 (8.0μιη 공극 싸이 즈, Costar)를 가진 24-웰 트랜스웰 챔버로 축정하였다. 상기 트렌스웰 챔버에서 lower well을 10ug Laminin(in gelatin)으로 코팅하고， UV로 건조하였다. 그 후
A549세포를무혈청 (serumfree) RPMI 배지에 현탁한 다음 각 웰당 1 x 105세포의 농 도로 상위 챔버에 넣었다. Ν3 IgG 또는 human mock IgG (대조군)를 ΙΟΟηΜ 또는 500nM로 상기 챔버에 처리하고 24시간동안 배양하였다. 그 후, PBS로 2회 세척하고 70% MeOHCin PBS)를 30분 동안 처리하였다. 다시 PBS로 2회 세척하고 Hematoxylin solution을 30분 동안 처리하였다. 상기 챔버를 DW로 3회 세척하였고, 챔버내의 막 (membrane)을 자르고 slide glass위에 마운팅하였다. 실험결과 도 9A에서 보는 바와 같이， N3 IgG는 A549세포의 이동을 현저하게 억제하는 효과를 나타냈다. 또한 이러한 세포 이동 억제효과는 농도 의존적임을 나 타내었다 (도 9B 참조) .
<3-3> in vivo암 전이 모델에서, 암 전이 억제 효능 평가
KRS가 암 전이외- 관련된 67LR을 통해 세포 이동을 촉진할 수 있기 때문에， 폐로 전이가 잘되는 마우스 유방암 4T-1 세포 (한국세포주은행)를 사용하여 종양 ( 암) 동물 모델을 제작하였다. 7주령 BALB/cAnCr mi ce (두열 바이오텍) 6마리에 4 x
104cel ls 4T1 세포를 마우스의 fat pad에 주입하여 동소이식 유방암 동물모델 (orthotopic model )을 제작하였다.
Mammary Fat pad에 암을 주입하고 10일 뒤 (daylO) , fat pad에서 암조직을 제거하였다. 1일 후 (dayll) , N3 IgG를 3일 간격， 주 2희， 2주 동안 (총 4회， dayll , 14， 18, 21) 10 iiig/kg씩 꼬리 혈관 정맥 주사 (tai l vein i .v. inj ect ion) 방법으로 투여하였고 control mock I G(Thermo #31154)도 동일 용량으로 투여하였다. 모든 항체 투여 일정 종료 후， 일주일 후ᅳ 암을 주입한지 28일 후에 쥐를 희생시켜서 폐 조직을 얻었다. 폐 조직 부검 시 기관지에 주사기를 이용하여 식염수를 주입, 폐를 부풀린 후 채취， Bouin 's solut ion(Sigma #HT10132)에 24시간 동안 보관하였다. 이후 현미경을 통하여 폐의 각 엽에서 전이된 결절 (metastasi s nodule)의 개수를 확인하였다. 실험 결과 도 11 및 도 12에서 보는 바와 같이, 대조군에서는 암 전이에 의 하여 폐에 많은 결절이 생긴 것을 확인할 수 있었으며 N3 IgG의 처리군에서는 이러 한 결절이 현저히 억제된 것을 확인하였다. 도 13은 대조군과 N3 IgG의 처리군애서 의 폐조직을 대조적으로 보여주며, 대조군에서는 본 발명의 항체 처리군에 비하여 전이된 결절 부위에서 라미닌 수용체가 상당히 많이 발현된 것을 확인하였다.
<3-4> in vivo암 전이 모델에서， 항-암전이 화합물 (YH16899)과 효능 비교 기존에 'Dae Gyit Kim et al . , (2014)' 의 문헌에서 YH16899라는 화합물이 67LR와 KRS의 상호작용을 억제하여 암전이 억제애 효과가 있는 것으로 알려졌다, 이에 YH16899와 본 발명 항체 N3 IgG의 암전이 억제효능을 비교하였다. in vivo 종 양 모델의 제작과 폐전이 상태의 관찰은 상기 실시예 <3-3>과 동일한 방법으로 수 행되었다. YH16899는 lOOmpk섹 매일 경구투여 되었다. N3 IgG는 각각 농도별로 ( lmpk , lOmpk) 마우스 꼬리를 통해 정맥 주사되었다. 실험 결과 도 14 및 도 15에서 보는 바와 같이， N3 IgG처리군에서 농도 의 존적으로 폐 결절의 수가 현저하게 감소되는 것을 확인하였으며, YH16899 lOOmpk처 리 군과 비교하여 lmpk의 용량으로 N3 igG을 처리하는 것만으로도 암전이가 현저히 억제되는 것을 확인하였다,
<실시예 4>
KRS 함체의 결합위치 확인
<4-1> KRS 단클론 항체의 인간 KRS에 결합하는 위치
상기에서 제조한 KRS 항체들 중 N3 IgG가 인간 KRS에 결합하는 위치를 확인 하기 위하여 다음과 같이 SPR(Surface Plasmon Resonance)실험을 실시하였다,
던저, 아민 커플링 키트 (GE Healthcare)를 이용하여 N3 IgG항체를 Series S 센서칩 CM5(GE Healthcare)가 장착된 Biacore T200(GE Healthcare)에 고정하였디-, 그 다음 하기 표 4에 기재된 펩타이드를 PBS 용액에 해당 농도로 녹여 60초 동안 흘려주었다. 그 다음 5분 동안 PBS를 흩려주었다, 그 다음 Biacore T200 Evaluation소프트웨어 v2.0 (GE Healthcare)으로 결합력을 분석하였다.
【표 4]
펩타이드 정보
명칭 서 보 Species MW 서염뛰호
F1 (1-29) MMVOAAEVKVDGSEPKLSKNELKRRLKA H 3168 97
F2 (5-34) OAAEVKVDGSEPKLSKNELKRRLKAEKKVA H 3351 98
F3 (10-38) KVDGSEPKLSKNELKRRLKAEKKVAEKEA H 3310 99
F4 (15-42) EP LSKNELKRRLKAE KVAEKEAKOKE H 3337 100
F5 (24-49) RRLKAEKKVAEKEAK0KELSEK0LS H 3084 101
mFl (1-28) MATLOESEVKVDGEOKLSIiNELKRRLKA M 3230 102
mF2 (3-34) 0ESEVKVDGE0KLS NELKRRLKAEKKLA M 3383 103
mF3 (10-37) VDGEOKLSKNELK RLKAEKKLAEKEA M 3268 104
mF4 (15-41) OKLSK ELIiRRLKAEKKLAEKEAKOKE M 3253 105
mF5 (24-48) R L AEKKLAEKEAR0 ELSE 0LN M 2997 106
rFl (1-28) MATLREGEVKLDGEPKLSKNELKRRLKA 3211 107
rF2 (3-34) EGEV LDGEP LSK1MEL RRL AEKKLA R 3364
rF3 (10-37) KLDGEPKLSKNELKRRLKAEKKLAEKEA R 3251 109
rF4 (15-41) PKLSK ELKRRLKAEKKLAEKEA OKE R 3222 110
rF5 (24-48) RRL AE KLAE EAKQ ELSEKOLN R 2997 111 그 결과 도 16에 나타난 바와 같이 , 에피토프 Fl, F2, F3, F4에서는 N3 IgG 항체가 결합하는 것으로 나타났으나， F5에서는 N3 IgG 항체가 결합하지 않는 것으 로 나타났다. 또한， 에피토프 F4의 경우에 결합력이 가장 강한 것으로 나타났고, F3, F2, F1 순서로 결합력이 강한 것으로 나타났다.
이를 통해, N3 IgG 항체가주로 결합하는 위치는 KRS N-말단 영역의 15내지 29 아미노산부위인 것을 확인할수 있었다,
<4-2> K S단클론 항체의 다른 종간 교차 반웅성 (cross activity)
상기의 실시예에서 RS 항체인 N3 IgG가 인간 KRS에 결합하는 위치를 확인하 였고， N3 IgG가 다른 종인 마우스 (m), 랫 (r)과 교차 반응성을 나타내는지 확인하기 위하여 다음과 같이 SPR(Surface Plasmon Resonance)실험을 실시하였다,
상기 실시예 4-1에 기재되어 있는 실험 방법과 동일하게 아민 커플링 키트 (GE Healthcare)를 이용하여 N3 IgG 항체를 칩에 고정하였고, 상기 표 4에 기재된 펩타이드를 PBS 용액에 해당 농도로 녹여 60초 동안 흘려준 다음 5분 동안 PBS를 흘려주었다. 그 다음 Biacore T200 Evaluation 소프트웨어 v2.0 (GE Healthcare)으 로 결합력을 분석하였다.
그 결과 도 17에 나타난 바와 같이 , N3 IgG 항체가 사람 (h), 마우스 (m), 랫 (r)의 에피토프 Fl, F2, F3, F4와 결합하고, F5와는 결합하지 않는 것으로 나타났 다. 또한, 에피토프 F3가 F1애 비해 결합력이 강한 것도 사람, 마우스， 랫에서 동 일하게 나타났다 (F2, F4 데이터 미도시).
이를 통해， N3 IgG 항체가 종간의 교차 반응이 가능한 것을 확인할 수 있었 다.
<실시예 5>
면역세포 이동 및 침윤에 있어서 , 라미닌 신호의 역할 확인
혈관을 이루고 있는 여러 세포외 기질들 중에서, 어떤 것이 단핵구 /대식세포 의 이동 및 침윤을 촉진하는지 확인하였다. 세포외 기질로서 콜라겐 (collagen) , 파 이브로넥틴 (fibronectin) 및 라미닌 (laminin)을 사용하여 트랜스웰 세포이동 어세 이 (transwell migration assay) , 구체적인 실험방법은 다음과 같다. Transwell (Corning, #3421-5麵)을 gelatin (0.5mg/ml)으로 코팅한 후 RAW 264.7 cell (1 x
5
10 cells/weli)을 top chamber에 분주 (seeding)하였다. Laminin( laminin mixture ,Biolaminatt), Fibronectin, 또는 Col lagen(K) μ g/ml)을 각각 포함한 Serum Free DMEM (δθθμΐ)을 bottom chamber에 넣어주었다. 24시간 뒤에 Membrane의 위쪽에 존 재하는 non-migrating 세포를 면봉으로 제거하였다. bottom chamber의 세포들을 70% Methanol로 30 min 처리하여 고정 (fix)한 후， 50¾ Hematoxylin으로 30 min동안 염색하였다. 염색후 membrane을 취하여 slide에 mounting하고， membrane의 아렛면 에 존재하는 migrating cell을고배율 현미경에서 관찰하고 정량하였다, 실험결과 도 18a 및 도 18b에서 보는 바와 같이, 여러 세포외 기질 중 라미 닌이 가장 강하게 단핵구 /대식세포의 이동을 촉진함을 확인하였다.
<실시예 6>
라민닌 아형 (subtype)별 면역세포 이동 및 침윤 효과
면역세포 이동 및 침윤에 있어서， 라미닌 아형에 따른 효과를 평가하였다. 다양한 라미닌 아형 단백질 (Biolamina로부터 구입)로서 LNlll, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511, LN521을 10yg/ml씩 사용하여 실시예 5와 동일한 방법으로 트랜스웰 세포이동 어세이 (transwell migration assay)를 수행하였다. 상기 라미닌 아형들의 구체적 서열은 각 라미닌 아형을 이루고 있는 사슬에 따라 서열번호 115 의 α4 사슬, 서열번호 121의 α2 사슬, 서열번호 122의 α5 사슬， 서열번호 117의 β2사슬， 서열번호 123의 ΐ 사슬， 서열번호 119의 γΐ 사슬을 참조로 할 수 있 다，
또한 RAW 264.7 eel 1(2 x 106cell) 18hr 배양 후 serum free—DMEM media에 laminin 아형들을 각각 ig/ml 처리 후 Oh, 12h, 24h에 harvest하였다. ProteoExtractSubcel lular Proteorae Extraction KitCCalbiotech, cat# 539790)를 사용하여， RAW 264.7 ceil protein을 cytosol과 membrane fraction으로 분리하였 다. 얻어진 단백질을 전기 영동한 후 PVDF membrane (Milipore) 에 옮겨 3¾ skim milk로 blocking 하였다. 이早 KRS polyclonal ant ibody( rabbi t , Neomics, Co. Ltd. #丽3—01-0005) 항체를 첨가하여 1시간동안 결합시켰다. 결합하지 않은 항체를 제거하고, ant i -rabbit 2차 항체 (ThermoFisher Scientific, #31460)를 첨가하여 반 웅시켰다. 이차 항체를 반응시킨 후, 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 필 름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 KRS의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였디-. Na+/K+ ATPase (Abeam) 와 tubulin (Sigma) 항체를 각각 plasma membrane과 cytosol 마커 확인용으로사용하였다. 실험결과 도 19a 및 도 19b에서 보는 바와 같이, 단핵구 /대식세포는 라미닌 중에서도 α4β2χ1 아형 (LN421)에 특이적으로 반웅하여 이동함을 확인하였다. 즉 ， 단핵구 /대식세포는 LN421에 특이적으로 이동 및 침윤하는 것을 확인하였다. 또한 도 19c에서 보는 바와 같이 단핵구 /대식세포에 LN421을 처리할 경우 세포질 (cytosol) 영역에서 KRS 검출량이 일부 감소되는 것과 대비하여 세포막 영역에 KRS 검출량이 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 단핵구 /대식세포의 세포 내부 에서 발현되어 일반적으로 세포질 영역에 존재하고 있는 KRS가 LN421처리에 의하여 세포막 영역으로 이동하는 것을 시사하며, 면역세포 막 영역에서 KRS가 증가되는 현상은 면역세포 이동 및 침윤과 관련된 질환에 대하여 중요한 병리현상인 것으로 사료되었다.
<실시예 7>
세포막 K S수준 감소를 위하 함체 제작 및 면역세포 이듀 /침^ 체어 효과
«1
상기 실시예 1에서 제작한 항체들 중 대표적으로 N3 IgG 항체를 이용하여, 면역세포 이동 및 침윤에 대한 효과를 확인하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같 다. Transwell (Corning#3421-5薩)을 gelatin (0.5mg/ml)으로 코팅하고, 이후 RAW
264.7 cell (1 x l cel ls/wel 1 )을 top chamber에 분주 (seeding)하였다. Laminin
421(1 iig/mi)을 포함한 Serutn Free DMEM(500 μΐ)을 bottom chamber에 넣어주었 다. 각 항체는 top chamber에 100 M 농도로 처리하였다. 24시간 뒤에 70¾ Methanol로 30 min동안 고정시킨 후， 50% Hematoxylin으로 30 min 동안 염색하였 다. Membrane의 위쪽에 존재하는 비 -이동 (non-migrating) 세포를 면봉으로 제거한 뒤， membrane을 취하여 slide에 mounting하였다. Membrane의 아랫면에 존재하는 migrating cell을 고배율 현미경에서 관찰하였고 (도 20a), 수득된 이미지에서 세포 수를 측정하여 그래프로 표시하였디ᅵ (도 20b).
또한 R 264.7 cell에 Laminin 421(1 ug/ml) 및 항체 (100 nM)를 처리하여 24시간 배양하고 harvest하였으며, 이후 ProteoExtract subcellular proteom extraction kit(Calbiochem)를 사용하여 membrane과 cytosol fraction으로 나눠 샘 플링 한 뒤 S에 대하여 western blot을 수행하였다. 구체적인 방법은 실시예 6에 서 기재한 바와 같다. 실험결과 도 20a및 도 20b에서 보는 바와 같이， 본 발명의 항체가특이적으 로 LN421 의존적인 단핵구 /대식세포 이동을 효과적으로 저해하는 것을 확인하였다. 또한 도 20c에서 보는 바와 같이， LN421 처리는 단핵구 /대식세포 세포막의 KRS 수 준을 증가시키며， N3 IgG 항체 처리에 의해 세포막의 KRS 수준이 효과적으로 감소 띔을 확인하였다. 뿐만 아니라 N3 IgG 항체 처리군에서는 세포질의 K S 수준도 감 소된 것이 확인되었다.
이를 통해， 본 발명의 항체는 단핵구 /대식세포와 같은 면역세포 이동이 문제 되는 질환에 대한새로운 치료제로서의 가능성을 확인하였다.
<실시예 8>
면역세포 이동 관련 질환의 in vivo모델에서 효능 확인
상기 실시예들과 같이 본 발명의 항체들 중 대표적으로 N3 IgG 항체를 이용 하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.
[실험방법]
1. 폐동맥 고혈압 (PAH) 모델 제작 및 시험물질 투여
7주령 SD rat (오리엔트바이오)에 ΡΑΉ를 유도하기 위하여 MCTOtionocrotal ine) 60 mpk를 피하주사하였다. 이후 4개의 군으로 나누고 (각 군당 5마리로 실험)， 각각 Mock human I G(Thermo Fi sher Scient i f ic , 음성 대조군) lmpk, N3 IgG Impk, N3 IgG lOmpk, si ldenaf i l (양성 대조군) 25 mpk를 3주간 투여하였다. 모든 항체는 주 2회 iv 주사하였고 si ldenaf i l은 매일 경구투여하였다.
2. 혈류 및 혈압 측정
3주 후 rat를 isof lurane으로 마취하고, 동물용 초정밀공압측정시스템 (MPVS Cardiovascular Pressure and Volume system, 모1 명: MPVS Ultra, 제조사명: Mi l lar Instruments)을 이용하여 혈류와 압력을 측정하였다. 우심실 수축기압 (RVESP) 및 이완기압, 좌심실 수축기압 및 이완기압은 전용 카테터 (Mikro- Tipratpressurecatheter ,제조사명: Mi l lar Instruments)를 이용하여 측정하였다. 심박출량은 혈관주위 (perivascular) 혈류 탐침자 (TransonicFlowprobes ,제조사명: Mi l lar Instruments)를 이용하여 측정하였으며, 이에 대한 실험기법은 하기 문헌에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행되었다: Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Rass DA. Measurement of cardiac funct ion using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc 2008 ;3(9) : 1422- 34.
3. 면역조직화학염색 (i隱 unohistochemistry, IHC)
채취한 폐를 통상적인 과정에 따라 PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후 수 세， 탈수， 투명 과정을 거쳐 파라핀 침투시켜 포매하였다. Rat의 폐조직 파라핀 블 록을 6um 두께로 박절하고 슬라이드를 제작하였다. 그 후 다음과 같이 염색을 수 행하였다. 먼저 5분간 3회 xylene 처리 후, 100 % 에탄을, 95 % 에탄을, 90 % 에탄 을, 70 % 에탄을， DW 순으로 2분 간 처리하고 PBS로 5분간 washing하였다. 0.3 % ¾¾의 처리 후, 샘플을 PBS로 5분 동안 2희 washing하였다, 0.01M citrate buffer 에 담가 가열 후， PBS— T(0,03 % tween 20)로 세척하였다. 이후 30분간 실은에서 blocking(2 % BSA & 2 % goat serum in PBS)하였다. 항 -CD68 항체 (1 ： 200, ED1 clone, Abeam)로 4°C에서 overnight 염색하였다. PBS—T로 5분간 3희 세척한 후, polymer-HRP amti -mouse envision kit(DAKO)로 4°C에서 1 시간 처리하였다. PBS-T 로 3회 세척한 후， DAB substrate buffer 및 DAB chromogen 20을 처리하여 발색시 켰다. 염색 된 조직을 1 분간 Mayer' s heitiatoxylin(Sigma)으로 처리 한 다음， 70% 에탄을, 90% 에탄을, 95% 에탄을， 100% 에탄올 순서로 각각 2분간 2회 처리하였다. 마지막으로 5분간 3회 xylene 처리한후 광학현미경으로 관찰하였다.
[실험결과]
<8-1> 혈압 및 심박출량 변화 확인
면역세포의 침윤이 병리현상과 깊이 관계된 질환인 PAH 모델에 N3 IgG 항체 를 lmpk 또는 10 mpk로 3주간 처리한 뒤 (iv, 주 2회), 우심실 수축기말 압력 (right ventricul r end-systolic pressure; RVESP), 우심실 이완기말 압력 (right ventricular end-diastol ic pressure; RVEDP) , 좌심실 수축기말 압력 (left ventricular end-systolic pressure; LVESP) 좌심실 이완기말 압력 압력 (left ventricular end-diastol ic pressure; LVEDP) 및 심박출량 (cardiac output； CO)을 측정하였으며 , 그 결과를 표 5에 나타낸다.
【표 5】
Figure imgf000056_0001
(MCT +mock IgG 처리군 1마리는 마취사. Sildenafil 처리군 1마리는 수술 중 사망 하여 CO 측정하지 못함). 폐동맥 고혈압은 폐동맥이 좁아짐으로 인하여 우심실 압력이 상승하며， 결과 적으로 우심실 부전을 초래한다. 또한 지속적인 고혈압으로 그 보상 기전이 파괴되 면 우심실 비대에 이어 우심실 확장이 일어나게 된다. 이는 심실중격의 이동으로 인한 좌심실의 압박을 가져오게 되고 좌심실의 확장기말 용적 및 심박출량의 감소 를 가져오게 된디- (이우석 et al., 중증 폐동맥 고혈압 환자의 임상적 특징과 예후 예측 인자， Korean Circulation J 2007； 37： 265-270) . 결과적으로 폐동맥 고혈압은 주로 우심실과관계되지만 좌심실의 기능과도 연관된다.
PAH 환자에서는 RVESP가 증가되며 이는 본 실험의 PAH 동물 모델에서도 확인 되었다. 이에 대하여 도 21a에서 보는 바와 같이， N3 항체는 두 농도 모두에서 유 의적으로 RVESP를 감소시켰으며, 특히 양성대조군 약물인 Sildenafil 보다 우수하 게 RVESP를 감소시켰다.
또한 N3 IgG 항체 투여애 따른 좌심실 수축기말 압력 (LVESP) 감소는 관찰되 지 않았으며， 오히려 본 발명의 항체를 투여한 군에서는 도 21b에서 보는 바와 같 이 LVESP가 유의하게 증가되는 결과를 보였다. 이는 기존 폐동맥 고혈압의 치료제 로 사용되고 있는 Sildenafil의 경우 폐동맥의 확장뿐만 아니라, 전신동맥의 확장 도 유발하여 전신 혈압 (systemic blood pressure)을 저하시킬 위험이 있는 것과 대 비되는 것이다.
즉， 본 발명의 항체는 Sildenafil과 비교하여 전신 동맥압 (systemic artery pressure)에 미치는 영향이 낮은 경향성을 보이는 것을 확인하였으며， 이러한 효과 는 임상현장에서 Sildenafil 투여 시 저혈압 발생 위험을 염려하는 상황이 있음을 고려하였을 때， 치료약제의 유리한 특성이 될 것으로 사료되었디-. 뿐만 아니리-， 폐 동맥고혈압이 심한 경우 수축기 우심실 부전 (systolic RV failure)이 발생함에 따 라, 낮은 심박출량 (cardiac output ) 및 전신 저혈압 (systemic hypotension)이 동반 될 수 있다.
이에 대하여 본 발명의 항체에 의한 폐동맥고혈압을 호전시키는 치료에 의해 심박출량 (cardi ac output )과 전신 혈압 (systemic blood pressure)이 상승되어 혈압 이 정상화되는 효과가 예상된다.
종합하여， 이로서 본 발명의 항체를 투여하는 것은 기존 치료 약물의 부작용 가능성를 개선하며， PAH증상완화 및 치료 효과를 보임을 확인하였다.
<8-2>심초음파 검사 (Echocardiography)
우심실의 압력 과부하를 시사하는 D shaped left ventr icle 소견은 MCT 단독 투여 군 (즉， 실험물질 비투여 PAH 모델)에서 3마리， MCT + Si ldenaf i l 투여한 군의 3마리에서 각각관찰되었으며 , 치료항체를 투여한 군에서는 관찰되지 않았다.
뿐만 아니라 하기 표 6에서 보는 바와 같이， 각 군의 체증은 비슷한 정도로 증가하였으며 유의적 차이가 없었다. 즉, 치료항체 투여를 통한 비정상적 몸무게 감소를 비롯한 이상 징후를 시사하는 소견은 관찰되지 않았다.
【표 6】
Figure imgf000057_0001
<8-3> 단핵구 /대식세포 이동 및 침윤 정도 확인
각 실험군의 폐 조직을 이용하여 단핵구 / 대식세포 마커인 CD68에 대한 IHC 염색을 수행하였다. 실험 결과 도 22에서 보는 바와 같이, 본 발명의 N3 IgG 항체 처리군은 단핵구 /대식세포의 폐 조직 침윤을 명확하게 감소시켰음을 확인하였으며， 이러한 효과는 si ldenaf i l 보다 현저히 우수함을 확인하였디- .
【산업상 이용가능성】
이상 살펴본 바와 같이， 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편들은 본 명세서에 서 기재하는 특정 CDR (상보성 결정부위) 서열을 가지며 세포 외막에 노출되는 KKS N—말단 영역에 특이적 결합능력이 매우 우수하기 때문에, KRS의 특이적 행태를 수 반하는 질병 (예를들어, 암)으로서 알려진 질병의 진단에 이용가능하다, 또한 in vivo 상에서도 KRS N—말단 영역에 특이적으로 타켓팅되므로 라미닌 수용체와 RS N-말단 영역의 상호작용을 억제하여 암 전이를 억제하는 효과가 탁월하므로 치료제 로서 이용될 수 있고, 면역세포의 이동을 조절할 수 있어， 면역세포 이동과 관련한 질환의 예방， 개선 및 치료 등에 매우 유용하게 사용될 수 있으므로 산업상 이용가 능성이 크다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
라이실—tRM 합성효소 (KRS , Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 중에서 서열번호 97의 서열을 포함하는 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단 편.
【청구항 2J
제 1항에 있어서， 상기 에피토프는 서열번호 75 , 서열번호 98， 서열번호 99 , 서열번호 100 , 서열번호 101 , 서열번호 103， 서열번호 104， 서열번호 105, 서열번 호 106， 서열번호 108 , 서열번호 109， 서열번호 110, 서열번호 111 , 서열번호 113 및 서열번호 114로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단 편.
【청구항 3]
제 1항에 있어서， 상기 항체 또는 그 단편은 서열번호 1 , 서열번호 13， 서열 번호 25 및 서열번호 37로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 KCDR1) ; 서열번호 3, 서열번호 15， 서열번호 27 및 서열번호 39 로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2) ; 서열번호 5, 서열번호 17, 서열번호 29 및 서열번호 41로 이루어진 군에 서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 중 쇄가변영역 (YH) 및
서열번호 7 , 서열번호 19， 서열번호 31 및 서열번호 43으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 l(CDRl) ; 서열번호 9 , 서 열번호 21， 서열번호 33 및 서열번호 45로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2) ; 서열번호 11， 서열번호 23 , 서열번호 35 및 서열번호 47로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보 성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역 (VL)
을 포함하는, 세포 외막에 노출되는 라이실 -tRNA 합성효소 (KRS, Lysyl-tRNA synthetase) Ν· "말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
【청구항 4】
제 3항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열 을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 7로 표시 되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 11로 표시되는 아 미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역;
서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함 하는 중쇄가변영역 및 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상 보성 결정부위 1 , 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역;
서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 증쇄 상보성 결정부위 1， 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서 열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하 는 중쇄가변영역 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보 성 결정부위 1, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결 정부위 3을포함하는 경쇄가변영역; 및
서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1 , 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2 및 서 열번호 41로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3을 포함하 는 중쇄가변영역 및 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상 보성 결정부위 1, 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2 및 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결 정부위 3을 포함하는 경쇄가변영역;
으로 이루어진 군에서 선택된 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 것 을 특징으로하는 항체 또는그 단편 .
【청구항 5]
제 3항에 있어서， 상기 중쇄가변영역은 서열번호 49， 서열번호 53， 서열번호 57 및 서열번호 61로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경 쇄가변영역은 서열번호 51， 서열번호 55 , 서열번호 59 및 서열번호 63으로 이루어 진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단 편.
【청구항 6]
제 3항에 있어서， 상기 항체는 IgG, IgA, IgM , IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 단편은 디아바디, Fab , Fab ' , F(ab)2 , F(ab ' )2 , Fv 및 scFV로 이루 어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
【청구항 7]
제 6항에 있어서 , 상기 scFV는 서열번호 67， 서열번호 69， 서열번호 71 및 서 열번호 73으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편 .
【청구항 8]
제 1항 내지 제 7항 증 어느 한 항의 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴 클레오티드.
【청구항 9]
겨8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터 . t청구형- 10】
제 9항의 재조합 발현 백터로 형질전환된 세포. 【청구항 11]
(a) 제 9항의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;
(b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단겨 1 ; τΐΐ
(c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는， 세포 외막에 노출되는 라이실 -tRNA 합성효소 (KRS , Lysyl-tRNA synthetase) N-말단 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법 . ί청구항 12】
제 1항의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 세포 외막에 노출되는 라이실 tRNA 합성효소 (KRS, Lysyl-tR A synthetase) N_말단의 특이적 검출 방법.
【청구항 13]
제 1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물. 【청구항 14】
제 13항에 있어서, 상기 암은 유방암， 대장암, 폐암, 소세포폐암， 위암, 간 임- , 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암， 피부 또는 안구내 혹색종, 자궁암， 난소암， 직장암, 항문암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자 궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병， 식도암， 소장암, 내분비선암， 갑상선암, 부 갑상선암， 부신암， 연조직 육종, 요도암, 음경암， 전립선암， 만성 또는 급성 백혈 병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종， 신장골반 암종， CNS 종양， 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어 지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 15]
제 13항에 있어서， 상기 암은 유방암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 조성 물.
【청구항 16]
제 1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암진단용 조성물. 【청구항 17]
제 1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 면역세포 이동 관련 질 환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 18] 제 17항에 있어서， 상기 면역세포 이동과 관련된 질환은 심혈관 질환 섬유화 질환, 만성염증 질환 및 알포트 증후군 (Alport syndrome) 으로 이루어진 군에서 선 택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 19]
제 18항에 있어서， 상기 심혈관 질환은 폐동맥 고혈압, 죽상동맥경화， 협심 증， 심근경색증， 허혈성 뇌혈관질환, 세동맥 경희- 및 중막 경화로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 20]
제 18항에 있어서, 상기 섬유화 질환은 경피증 (scleroderma) , 류마티스 관절 염 (rheumatoid arthr it is) , 크론 병 (Crohn' s disease) , 궤양성 대장염 (ulcerat ive col itis) , 골수 섬유증 (myelof ibrosis) , 폐 섬유증 (pulmonary f ibrosi s) , 간 섬유증 (hepathic f ibrosis) , 간경변증 ( l iver ci rrhosis) , 신장 섬유 증 (kidney f ibrosis) , 근섬유증 (myof ibrosis) , 심장 섬유증， 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosu) , 유전성 섬유증, 감염성 섬유증, 자극성 섬유증， 만성 자가면역에 의한 섬유증, 장기이식시 항원부적합에 의한 섬유증, 고지혈증에 의한 섬유증, 비만에 의한 섬유증， 당뇨성 섬유증， 고혈압에 의한 섬유증 및 스텐 트삽입시 섬유화로 인한 폐색으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 21]
제 18항에 있어서, 상기 만성염증 질환은 천식， 아토피성 피부염, 습진, 건선 증, 골관절염, 통풍, 건선성 관절염, 간경변, 무알콜성 지방간염, 만성폐쇄성 폐질 환, 비염， 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신부전증， 당뇨병성 신경병증 및 다발성 경 화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 22]
암 전이 억제용 제제를 제조하기 위한 제 1항의 항체 또는 그 단편의 용도. 【청구항 23]
제 1항의 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 전이 억제 방법.
【청구항 24】
암 전단용 제제를 제조하기 위한 제 1항의 항체 또는 그 단편의 용도. 【청구항 25】
제 1항의 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법 .
【청구항 26]
면역세포 이동 관련 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 거 U항의 항체 또는 그 단편의 용도.
【청구항 27】
제 1항의 항체 또는 그 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 면역세포 이동 관련 질환의 치료 방법 .
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