CN111718920A - 在蛋白中高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基-tRNA合成酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在蛋白中高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基—tRNA合成酶。具体地，本发明提供了一种突变型赖氨酰‑tRNA合成酶。相比野生型赖氨酰‑tRNA合成酶，本发明突变型赖氨酰‑tRNA合成酶可显著提高非天然氨基酸插入量和含有非天然氨基酸的目的蛋白量。此外，本发明突变型赖氨酰‑tRNA合成酶还可以提高目的蛋白的稳定性，使其不容易断裂。

Description

在蛋白中高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基-tRNA合成酶
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及在蛋白中高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基—tRNA合成酶。
背景技术
将蛋白质中的希望的位置的氨基酸残基用通常的蛋白质合成所涉及的20种类以外的氨基酸(非天然氨基酸)替换而得到的非天然氨基酸整合蛋白质(全蛋白质)，能够成为用于蛋白质的结构功能解析的有效手段。使用源自各种生物种类的氨基酰 -tRNA合成酶(aaRS)/tRNA对，已经合成了30种类以上的全蛋白质。历史最长并且应用于许多有用非天然氨基酸导入的体系为酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)突变体与经琥珀抑制基因化tRNATyr对。就该方法而言，成为关键的是其正交的关系，即，真细菌、与古细菌和真核生物这两个组中的aaRS在各自的组内将tRNA氨基酰化，但不能将其它组的tRNA氨基酰化。
另一方面，源自马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)的吡咯赖氨酰 -tRNA合成酶(PylRS)和琥珀抑制基因tRNAPyl，在大肠杆菌细胞内作为具有正交性的aaRS/tRNA对而发挥功能。吡咯赖氨酸(Pyrrolysine)是在侧链上具有大体积甲基吡咯啉部分的赖氨酸衍生物。野生型PylRS能够在大肠杆菌内使Nε-Boc-L-赖氨酸与tRNAPyl结合。但是，由于LysRS对赖氨酸的识别严密，因此，至今为止，很难将具有各种大小、形状的官能团的赖氨酸衍生物位点特异性地导入蛋白质。
因此，本领域需要对野生型赖氨酰-tRNA合成酶进行改造，开发在蛋白中高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基-tRNA合成酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种在蛋白中高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基-tRNA合成酶及方法。
本发明的第一方面，提供了一种突变型赖氨酰-tRNA合成酶，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶在对应于野生型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列中第19位精氨酸 (R)和/或第29位组氨酸(H)发生突变。
在另一优选例中，所述野生型赖氨酰-tRNA合成酶来自产甲烷古细菌的马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri) 或噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)。
在另一优选例中，所述野生型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.: 1所示。
在另一优选例中，所述野生型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.: 2所示。
在另一优选例中，所述第19位精氨酸(R)突变为组氨酸(H)或赖氨酸(K)；和/ 或
第29位组氨酸(H)突变为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶中的突变选自下组：R19H、R19K、H29R、H29K、或其组合。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶还包括选自下组的位点发生突变：第26位异亮氨酸(I)、第122位苏氨酸(T)、第309位亮氨酸(L)、第348 位半胱氨酸(C)、第384位酪氨酸(Y)、或其组合。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的突变位点还包括第26位异亮氨酸(I)；优选地，所述第26位异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的突变位点还包括第122 位苏氨酸(T)；优选地，所述第122位苏氨酸(T)突变为色氨酸(S)。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的突变位点还包括第309 位亮氨酸(L)；优选地，所述第309位亮氨酸(L)突变为丙氨酸(A)。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的突变位点还包括第348 位半胱氨酸(C)；优选地，所述第348位半胱氨酸(C)突变为色氨酸(S)。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的突变位点还包括第384 位酪氨酸(Y)；优选地，所述第384位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶还包括选自下组的突变： I26V、T122S、L309A、C348S、Y384F、或其组合。
在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变： R19H和H29R。
在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变： R19K和H29R。
在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变： R19H和H29K。
在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变： R19K和H29K。
在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变： R19H、I26V和H29R。
在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变： R19H、H29R、T122S和Y384F。
在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变： R19H、H29R、L309A和C348S。
在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶除所述突变(如第19和/ 或29位，以及任选的第26、122、309、348和/或384位)外，其余氨基酸与SEQ ID NO.:1或SEQ IDNO.:2所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有赖氨酰-tRNA合成酶的活性。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.:2相比具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少 95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶为SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:2所示的野生型赖氨酰-tRNA合成酶经突变形成的。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶选自下组：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.:3-8任一所示的多肽；或
(2)将SEQ ID NO.:3-8任一所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(1)所述多肽功能的由SEQ ID NO.:3-8 任一所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3-8任一所示。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶为非天然蛋白。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶用于将赖氨酸衍生物引入目的蛋白中。
在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶具有以下特征：
与野生型赖氨酰-tRNA合成酶相比，能将大官能团的赖氨酸衍生物导入蛋白中。
本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码如SEQ ID NO.:3-8任一所示多肽。
在另一优选例中，所述的多核苷酸包括DNA序列、RNA序列、或其组合。
在另一优选例中，所述的多核苷酸在突变型赖氨酰-tRNA合成酶的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。
本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
在另一优选例中，所述载体选自下组：pET、pCW、pUC、pPIC9k、pMA5、或其组合。
在另一优选例中，所述载体为pEvol载体和/或pBAD载体。
在另一优选例中，所述载体用于表达突变型赖氨酰-tRNA合成酶。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：原核细胞、真核细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞、植物细胞或动物细胞(如哺乳动物细胞)。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌Top10、或BL21。
在另一优选例中，所述宿主细胞包含：
(a)本发明第一方面所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶；和
(b)在所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的存在下能够与赖氨酸衍生物结合的正交tRNA；以及任选地
(c)编码目的蛋白的目的核酸序列，所述目的核酸序列在用于引入赖氨酸衍生物的位置上包含由所述正交tRNA识别的密码子。
在另一优选例中，所述宿主细胞还包含：
(d)赖氨酸衍生物。
在另一优选例中，所述赖氨酸衍生物是所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的底物。
在另一优选例中，所述赖氨酸衍生物选自下组：炔基氧羰基赖氨酸衍生物、BOC-赖氨酸(叔丁氧羰基-L-赖氨酸)衍生物、脂肪酰化赖氨酸、或其组合。
在另一优选例中，所述炔基氧羰基赖氨酸的结构如下式I所示：
Figure BDA0002000074010000051
其中，n为0-8。
在另一优选例中，所述正交tRNA为抑制基因tRNA，较佳地为琥珀抑制型tRNA。
在另一优选例中，所述正交tRNA的编码核酸序列如SEQ ID NO.:9所示。
GGAAACCTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCGCCA(SEQ ID NO.:9)
在另一优选例中，所述正交tRNA识别的密码子为琥珀密码子。
在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，较佳地为大肠杆菌。
本发明的第五方面，提供了一种表达系统，所述表达系统包括：
(a)本发明第一方面所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶；和
(b)在所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的存在下能够与赖氨酸衍生物结合的正交tRNA；以及任选地
(c)编码目的蛋白的目的核酸序列，所述目的核酸序列在用于引入赖氨酸衍生物的位置上包含由所述正交tRNA识别的密码子。
在另一优选例中，所述表达系统还包括：
(d)赖氨酸衍生物。
在另一优选例中，所述赖氨酸衍生物选自下组：炔基氧羰基赖氨酸衍生物、 BOC-赖氨酸(叔丁氧羰基-L-赖氨酸)衍生物、脂肪酰化赖氨酸、或其组合。
在另一优选例中，所述炔基氧羰基赖氨酸的结构如下式I所示：
Figure BDA0002000074010000061
其中，n为0-8。
在另一优选例中，所述正交tRNA为抑制基因tRNA，较佳地为琥珀抑制型tRNA。
在另一优选例中，所述正交tRNA的核酸序列如SEQ ID NO.:9所示。
在另一优选例中，所述正交tRNA识别的密码子为琥珀密码子。
在另一优选例中，所述表达系统为细胞或细胞提取液。
在另一优选例中，所述表达系统用于将炔基氧羰基赖氨酸引入到目的蛋白中或制备含非天然氨基酸的目的蛋白。
本发明的第六方面，提供了一种在目的蛋白中引入非天然氨基酸的方法，包括步骤：
(1)提供本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的表达系统；和
(2)在赖氨酸衍生物的存在下，在所述宿主细胞或表达系统中表达目的蛋白。
在另一优选例中，所述目的蛋白选自下组：人胰岛素前体蛋白、赖脯胰岛素的前体蛋白、甘精胰岛素的前体蛋白、甲状旁腺素、可的瑞琳、降血钙素、比伐卢定、胰高血糖素样肽及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁肽、齐考诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁肽、水蛭素、生长激素、生长因子、生长激素释放因子、促肾上腺皮质激素、释放因子、德舍瑞林、去氨加压素、依降钙素、胰高血糖素、亮丙瑞林、促黄体激素释放激素、生长激素抑制素、促甲状腺激素释放激素、曲普瑞林、血管活性肠肽、干扰素、甲状旁腺激素、BH3肽、淀粉样变肽、或上述肽的片段、或其组合。
在另一优选例中，所述非天然氨基酸为赖氨酸衍生物。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(1)提供表达本发明第一方面所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶、正交tRNA、目的核酸序列的细胞或细胞提取液；和
(2)在赖氨酸衍生物的存在下，培养所述细胞或细胞提取液，从而通过所述正交tRNA合成酶和正交tRNA对将所述赖氨酸衍生物引入所述目的蛋白中。
本发明的第七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有(a)容器，以及(b) 位于所述容器内的本发明第一方面所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶或本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述试剂盒包括：
(i)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述突变型赖氨酰-tRNA 合成酶的第一表达盒；和/或
(ii)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于表达正交tRNA的第二表达盒，其中所述正交tRNA在所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的存在下能够与赖氨酸衍生物结合；和/或
(iii)第三核酸序列，所述第三核酸序列含有用于表达目的蛋白的第三表达盒，目的蛋白的编码序列在用于引入赖氨酸衍生物的位置上包含由所述正交tRNA 识别的密码子。
在另一优选例中，所述试剂盒还包含细胞提取液。
在另一优选例中，所述的各核酸序列位于相同或不同的容器内。
在另一优选例中，所述的各核酸序列位于不同的载体上
本发明的第八方面，提供了一种翻译系统，所述翻译系统包括：
(a)本发明第一方面所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶；
(b)在所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的存在下能够与赖氨酸衍生物结合的正交tRNA；以及
(c)赖氨酸衍生物。
本发明的第九方面，提供了如本发明第一方面所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶、或本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第五方面所述的表达系统、或本发明第七方面所述的试剂盒的用途，用于将非天然氨基酸掺入目的蛋白中或制备含非天然氨基酸的目的蛋白。
本发明的第十方面，提供了一种含非天然氨基酸的目的蛋白的制备方法，包括步骤：
(1)提供本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的表达系统；和
(2)在赖氨酸衍生物的存在下，在所述宿主细胞或表达系统中表达目的蛋白。
本发明的第十一方面，提供了一种产生本发明第一方面所述突变型赖氨酰 -tRNA合成酶的方法，包括步骤：(i)培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出突变型赖氨酰-tRNA合成酶。
本发明的第十二方面，提供了一种酶制剂，所述酶制剂含有本发明第一方面所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶。
在另一优选例中，所述药物制剂的剂型包括：冻干制剂、液体制剂、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了质粒pEvol-pylRs(R19H,H29R)-pylT图谱。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，意外地获得一种突变型赖氨酰-tRNA合成酶。相比野生型赖氨酰-tRNA合成酶，本发明突变型赖氨酰-tRNA 合成酶可显著提高非天然氨基酸插入量和含有非天然氨基酸的目的蛋白量。此外，本发明突变型赖氨酰-tRNA合成酶还可以提高目的蛋白的稳定性，使其不容易断裂。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、 99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
序列同一性(或同源性)通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
在本文中，“氨酰-tRNA合成酶”、“赖氨酰-tRNA合成酶”可互换使用。
野生型赖氨酰-tRNA合成酶
如本文所用，“野生型赖氨酰-tRNA合成酶”是指天然存在的、未经过人工改造的氨酰-tRNA合成酶，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型赖氨酰-tRNA合成酶的来源没有特别限制，一种优选的来源为产甲烷古细菌的马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)和噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)等取得，但不限于此。
在本发明的一个优选例中，所述野生型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列如 SEQID NO.:1所示。
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYR KTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPA IPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEI SLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGID NDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQM GSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAG FGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL(SEQ ID NO.:1)
在本发明的一个优选例中，所述野生型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列如 SEQID NO.:2所示。
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYR KTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPA IPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEI SLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGID NDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQM GSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAG FGLERLLKVKHDFKNIKRAARSGSYYNGISTNL(SEQ ID NO.:2)
突变型赖氨酰-tRNA合成酶
如本文所用，术语“突变蛋白”、“本发明突变蛋白”、“本发明突变的氨酰-tRNA合成酶”、“突变型赖氨酰-tRNA合成酶”、“突变体酶”、“氨酰-tRNA 合成酶的突变体”可互换使用，均指非天然存在的突变的氨酰-tRNA合成酶，且所述突变的氨酰-tRNA合成酶为对SEQID NO.:1或SEQ ID NO.:2所示多肽进行人工改造的蛋白。具体地，所述突变的氨酰-tRNA合成酶如本发明第一方面所述。
应理解，本发明突变型赖氨酰-tRNA合成酶中的氨基酸编号基于野生型赖氨酰 -tRNA合成酶(优选地，SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:2)作出。当某一具体突变蛋白与SEQ IDNO.:1或SEQ ID NO.:2所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:2的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似糖基转移酶活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。
本发明突变蛋白是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。
本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表I进行氨基酸替换而产生。
表I
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
PylRS的氨基酸底物的识别与催化活性功能域的立体结构相关，野生型PylRS 能够活化的赖氨酸衍生物的大小有限，具有大官能团的赖氨酸衍生物就不能导入到蛋白质中，因此，通过对PylRS位点的突变，避免结合底物的空间位阻，或突变氨基酸与底物氨基酸或者是主链部分发生的相互作用，来提高效果。
优选地，所述的突变蛋白如SEQ ID NO.:3-8中任一所示。
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应理解，本发明突变蛋白与SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:2所示的序列相比，通常具有较高的同源性(相同性)，优选地，所述的突变蛋白与SEQ ID NO.:1 或SEQ ID NO.:2所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，更佳地至少为98％，最佳地至少为99％。
此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。
术语“编码突变型赖氨酰-tRNA合成酶的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变型赖氨酰-tRNA合成酶的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件) 下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2) 杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子 (或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：
经大量筛选和改造，本发明首次发现了在对应于野生型赖氨酰-tRNA合成酶 (如SEQ ID NO.:1或2)中第19位精氨酸(R)和/或第29位组氨酸(H)突变，得到的突变型赖氨酰-tRNA合成酶能够将大官能团的赖氨酸衍生物导入蛋白中。
相比野生型赖氨酰-tRNA合成酶，本发明突变型赖氨酰-tRNA合成酶可显著提高非天然氨基酸插入量和含有非天然氨基酸的目的蛋白量。此外，本发明突变型赖氨酰-tRNA合成酶还可以提高目的蛋白的稳定性，使其不容易断裂。
本发明还发现对赖氨酰-tRNA合成酶的其他位点如第26、122、309、348和/ 或384位等位点的一个或几个氨基酸进行突变，可进一步提高非天然氨基酸插入量、含有非天然氨基酸的目的蛋白量和/或目的蛋白的稳定性。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。
实施例1突变体的构建
根据野生型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs的氨基酸序列1(SEQ ID NO.:1)，克隆至表达载体质粒pEvol-pBpF(购自NTCC公司，氯霉素抗性)的araBAD启动子下游SpeI-SalI位点，其中SpeI酶切位点通过PCR方法增加，SalI位点为载体本身具有。保留表达载体质粒pEvol-pBpF原有的谷氨酰胺启动子glnS。在表达载体质粒 pEvol-pBpF的proK启动子下游，以PCR方法插入赖氨酰-tRNA合成酶的 tRNA(pylTcua)的DNA序列(SEQ ID NO.:9)。该质粒命名为pEvol-pylRs-pylT。
根据野生型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs的氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)，引入突变R19H，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示的突变型赖氨酰-tRNA合成酶 pylRs(R19H)。根据野生型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs的氨基酸序列(SEQ ID NO.: 1)，引入突变H29R，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示的突变型赖氨酰-tRNA 合成酶pylRs(H29R)。根据野生型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs的氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)，引入突变R19H,H29R，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示的突变型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs(R19H,H29R)。根据野生型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs 的氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)，引入突变R19H,I26V,H29R，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示的突变型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs(R19H,I26V,H29R)。根据野生型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs的氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)，引入突变 R19H,H29R,T122S,Y384F，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示的突变型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs(R19H,H29R,T122S,Y384F)。根据野生型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs的氨基酸序列(SEQ IDNO.:1)，引入突变R19H,H29R,L309A,C348S，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示的突变型赖氨酰-tRNA合成酶pylRs(R19H, H29R,L309A,C348S)。
以质粒pEvol-pylRs-pylT为模板，设计引物，见SEQ ID NO.:10和SEQ ID NO.:11，引入定点突变R19H。将PCR产物经DpnI处理，以核酸电泳进行分离，以琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒提取，使用T4DNA Ligase连接，以化学法(CaCl2法)转化大E.coli Top10感受态细胞中，将所述转化的细胞培养在含有氯霉素的LB琼脂培养基(10g/L酵母蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl，1.5％琼脂)上37℃培养过夜。挑取单个活菌落，在含有氯霉素的液体LB培养基(10g/L酵母蛋白胨，5g/L 酵母浸粉，10g/L NaCl)中37℃220rpm培养过夜。以质粒小量提取试剂盒提取质粒，得到的质粒命名为pEvol-pylRs(R19H)-pylT；
以质粒pEvol-pylRs-pylT为模板，设计引物，见SEQ ID NO.:12和SEQ ID NO.:13，引入定点突变H29R，得到的质粒命名为pEvol-pylRs(H29R)-pylT；
以质粒pEvol-pylRs(R19H)-pylT为模板，设计引物，见SEQ ID NO.:12和SEQ IDNO.:13，引入定点突变H29R，得到的质粒命名为pEvol-pylRs (R19H,H29R)-pylT。质粒图谱见图1。
5’-ATACCGGCACCATCCACAAG-3’(SEQ ID NO.:10)
5’-GGCTCATCCACAGACCAGTT-3’(SEQ ID NO.:11)
5’-GCGAGGTTTCCCGTAGCAAA-3’(SEQ ID NO.:12)
5’-GGTGTTTGATCTTGTGGATGGT-3’(SEQ ID NO.:13)
利用上述方法另分别构建pEvol-pylRs(R19H,I26V,H29R)-pylT、质粒 pEvol-pylRs(R19H,H29R,T122S,Y384F)-pylT和质粒pEvol-pylRs(R19H,H29R, L309A,C348S)-pylT。
实施例2菌种构建和叔丁氧羰基(Boc)修饰融合蛋白的高密度表达
将质粒pEvol-pylRs-pylT、质粒pEvol-pylRs(R19H)-pylT、质粒pEvol-pylRs(H29R)-pylT、质粒pEvol-pylRs(R19H,H29R)-pylT、质粒pEvol-pylRs(R19H,I26V, H29R)-pylT和质粒pEvol-pylRs(R19H,H29R,T122S,Y384F)-pylT分别与胰岛素融合蛋白表达载体pBAD-INS(卡那抗性)以化学法(CaCl2法)共转化到E.coli Top10 感受态细胞中(感受态细胞购买自Thermo公司)，将所述转化的细胞培养在含有25 μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基(10g/L酵母蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl，1.5％琼脂)上37℃培养过夜。挑取单个活菌落，在含有25 μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的液体LB培养基(10g/L酵母蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl)中37℃220rpm培养过夜。加入终浓度20％甘油保存菌种。
将各菌种接种于液体LB培养基中37℃、220rpm培养过夜，以1％(v/v)接种罐发酵培养基(12g/L酵母蛋白胨，24g/L酵母浸粉，4mL/L甘油，12.8g/L磷酸氢二钠，3g/L磷酸二氢钾，0.3‰消泡剂)，在35(±3)℃，200～1000rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养3～10h后，以步进速率流加含甘油和酵母蛋白胨的补料培养基，持续至发酵结束。培养至OD600达到25～80时，加入终浓度 0.25％L-ara和终浓度5mM Boc-Lys进行诱导。继续培养至OD600达到180～220时，放罐。然后离心(5000rpm，30min，25℃)收集。以SDS-聚丙烯酰胺电泳对各菌种全细胞中含有Boc修饰赖氨酸的融合蛋白表达情况进行检测。
融合蛋白是以不可溶的“包涵体”形式表达。为释放包涵体，用高压均质机将大肠杆菌细胞破碎。通过10000g离心法去除核酸、细胞碎片和可溶性蛋白。用纯水洗涤含有融合蛋白的包涵体，所得的包涵体沉淀用作折叠的原材料。
不同突变酶的融合蛋白表达量如下表：
酶 Boc赖氨酸的融合蛋白表达量(g/L发酵液)
pylRs 7.9
R19H 8.9
H29R 8.6
R19H,H29R 9.4
R19H,I26V,H29R 11.4
R19H,H29R,T122S,Y384F 14.0
为了使融合蛋白重折叠，将包涵体溶解于pH 10.5并含有2～10mM巯基乙醇的7.5M脲溶液中，使溶解后总蛋白的浓度为10～25mg/mL。将样品稀释5～10倍，在4～8℃，pH为10.5～11.7的条件下进行常规折叠16～30小时。于18～25℃下, pH值维持在8.0～9.5，用胰蛋白酶和羧肽酶B将融合蛋白酶解10～20小时，然后加入0.45M硫酸铵终止酶解反应。反相HPLC分析结果表明，该酶解步骤的收率高于90％。胰蛋白酶与羧肽酶B酶解后获得的胰岛素类似物被命名为BOC-赖氨酸胰岛素。Boc-赖氨酸胰岛素在上述条件下不能被酶解。通过膜过滤澄清样品，以0.45mM 硫酸铵作为缓冲液，经疏水层析初纯化，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度达90％。并且对获得的Boc-人胰岛素进行MALDI-TOF质谱分析，结果检测出其分子量与理论分子量5907.7Da相符合。经疏水层析洗脱收集样品，加入盐酸进行Boc-人胰岛素脱保护反应，加入氢氧化钠溶液控制pH为2.8～3.2以终止反应，再经两步高压反相层析，重组人胰岛素的得率高于85％。
不同突变酶的重组人胰岛素表达量如下表：
酶 人胰岛素的产量(mg/L发酵液)
pylRs 360
R19H 440
H29R 400
R19H,H29R 450
R19H,I26V,H29R 580
R19H,H29R,T122S,Y384F 700
结果表明，利用本发明的突变酶制备含有Boc-赖氨酸的目的蛋白，可显著提高非天然氨基酸插入量和含有非天然氨基酸的目的蛋白量。
实施例3菌种构建和丁炔氧羰基修饰融合蛋白的高密度表达
将质粒pEvol-pylRs-pylT、质粒pEvol-pylRs(R19H)-pylT、质粒 pEvol-pylRs(H29R)-pylT、质粒pEvol-pylRs(R19H,H29R)-pylT、质粒pEvol-pylRs(R19H,I26V,H29R)-pylT和质粒pEvol-pylRs(R19H,H29R,L309A, C348S)-pylT分别与胰岛素融合蛋白表达载体pBAD-INS(质粒由本公司构建，卡那抗性)以化学法(CaCl2法)共转化大E.coli Top10感受态细胞中(感受态细胞购买自 Thermo公司)，将所述转化的细胞培养在含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基(10g/L酵母蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl，1.5％琼脂)上37℃培养过夜。挑取单个活菌落，在含有25μg/mL卡那霉素和17μg/mL氯霉素的液体LB培养基(10g/L酵母蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl)中37℃ 220rpm培养过夜。加入终浓度20％甘油保存菌种。
将各菌种接种于液体LB培养基中37℃220rpm培养过夜，以1％(v/v)接种罐发酵培养基(12g/L酵母蛋白胨，24g/L酵母浸粉，4mL/L甘油，12.8g/L磷酸氢二钠，3g/L磷酸二氢钾，0.3‰消泡剂)，在35(±3)℃，200～1000rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养3～10h后，以步进速率流加含甘油和酵母蛋白胨的补料培养基，持续至发酵结束。培养至OD600达到25～80时，加入终浓度 0.25％L-ara和终浓度5mM丁炔氧羰基-Lys进行诱导。继续培养至OD600达到180～ 220时，放罐。然后离心(5000rpm，30min，25℃)收集。以SDS-聚丙烯酰胺电泳对各菌种全细胞中含有丁炔氧羰基修饰赖氨酸的融合蛋白表达情况进行检测。
酶 丁炔氧羰基赖氨酸的融合蛋白表达量(g/L发酵液)
pylRs 4.5
H29R 5.0
R19H 5.2
R19H,H29R 6.8
R19H,I26V,H29R 6.7
R19H,H29R,L309A,C348S 8.4
融合蛋白是以不可溶的“包涵体”形式表达。为释放包涵体，用高压均质机将大肠杆菌细胞破碎。通过10000g离心法去除核酸、细胞碎片和可溶性蛋白。用纯水洗涤含有融合蛋白的包涵体，所得的包涵体沉淀用作折叠的原材料。为了使融合蛋白重折叠，将包涵体溶解于pH 10.5并含有2～10mM巯基乙醇的7.5M脲溶液中，使溶解后总蛋白的浓度为10～25mg/mL。将样品稀释5～10倍，在4～8℃，pH 为10.5～11.7的条件下进行常规折叠16～30小时。于18～25℃下,pH值维持在 8.0～9.5，用胰蛋白酶和羧肽酶B将融合蛋白酶解10～20小时，然后加入0.45M 硫酸铵终止酶解反应。反相HPLC分析结果表明，该酶解步骤的收率高于90％。胰蛋白酶与羧肽酶B酶解后获得的胰岛素类似物被命名为丁炔氧羰基-赖氨酸胰岛素。丁炔氧羰基-赖氨酸胰岛素在上述条件下不能被酶解。通过膜过滤澄清样品，以0.45mM硫酸铵作为缓冲液，经疏水层析初纯化，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度达90％。并且对获得的丁炔氧羰基-人胰岛素进行MALDI-TOF质谱分析，结果检测出其分子量与理论分子量5907.7Da相符合。
酶 丁炔氧羰基人胰岛素的产量(mg/L发酵液)
pylRs 530
H29R 590
R19H 610
R19H,H29R 810
R19H,I26V,H29R 790
R19H,H29R,L309A,C348S 1000
结果表明，利用本发明的突变酶制备丁炔氧羰基修饰的目的蛋白，可显著提高非天然氨基酸插入量和含有非天然氨基酸的目的蛋白量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 宁波鲲鹏生物科技有限公司
<120> 在蛋白中高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基-tRNA合成酶
<130> P2018-1781
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 454
<212> PRT
<213> 马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)
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<213> 马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)
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His Leu Gly Ile Asp Phe Lys Ile Val Gly Asp Ser Cys Met Val Tyr
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Gly Asp Thr Leu Asp Val Met His Gly Asp Leu Glu Leu Ser Ser Ala
385 390 395 400
Val Val Gly Pro Ile Pro Leu Asp Arg Glu Trp Gly Ile Asp Lys Pro
405 410 415
Trp Ile Gly Ala Gly Phe Gly Leu Glu Arg Leu Leu Lys Val Lys His
420 425 430
Asp Phe Lys Asn Ile Lys Arg Ala Ala Arg Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn
435 440 445
Gly Ile Ser Thr Asn Leu
450
<210> 8
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Met Asp Lys Lys Pro Leu Asn Thr Leu Ile Ser Ala Thr Gly Leu Trp
1 5 10 15
Met Ser Arg Thr Gly Thr Ile His Lys Ile Lys His Arg Glu Val Ser
20 25 30
Arg Ser Lys Ile Tyr Ile Glu Met Ala Cys Gly Asp His Leu Val Val
35 40 45
Asn Asn Ser Arg Ser Ser Arg Thr Ala Arg Ala Leu Arg His His Lys
50 55 60
Tyr Arg Lys Thr Cys Lys Arg Cys Arg Val Ser Asp Glu Asp Leu Asn
65 70 75 80
Lys Phe Leu Thr Lys Ala Asn Glu Asp Gln Thr Ser Val Lys Val Lys
85 90 95
Val Val Ser Ala Pro Thr Arg Thr Lys Lys Ala Met Pro Lys Ser Val
100 105 110
Ala Arg Ala Pro Lys Pro Leu Glu Asn Thr Glu Ala Ala Gln Ala Gln
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Lys Phe Ser Pro Ala Ile Pro Val Ser Thr Gln Glu
130 135 140
Ser Val Ser Val Pro Ala Ser Val Ser Thr Ser Ile Ser Ser Ile Ser
145 150 155 160
Thr Gly Ala Thr Ala Ser Ala Leu Val Lys Gly Asn Thr Asn Pro Ile
165 170 175
Thr Ser Met Ser Ala Pro Val Gln Ala Ser Ala Pro Ala Leu Thr Lys
180 185 190
Ser Gln Thr Asp Arg Leu Glu Val Leu Leu Asn Pro Lys Asp Glu Ile
195 200 205
Ser Leu Asn Ser Gly Lys Pro Phe Arg Glu Leu Glu Ser Glu Leu Leu
210 215 220
Ser Arg Arg Lys Lys Asp Leu Gln Gln Ile Tyr Ala Glu Glu Arg Glu
225 230 235 240
Asn Tyr Leu Gly Lys Leu Glu Arg Glu Ile Thr Arg Phe Phe Val Asp
245 250 255
Arg Gly Phe Leu Glu Ile Lys Ser Pro Ile Leu Ile Pro Leu Glu Tyr
260 265 270
Ile Glu Arg Met Gly Ile Asp Asn Asp Thr Glu Leu Ser Lys Gln Ile
275 280 285
Phe Arg Val Asp Lys Asn Phe Cys Leu Arg Pro Met Leu Ala Pro Asn
290 295 300
Leu Tyr Asn Tyr Leu Arg Lys Leu Asp Arg Ala Leu Pro Asp Pro Ile
305 310 315 320
Lys Ile Phe Glu Ile Gly Pro Cys Tyr Arg Lys Glu Ser Asp Gly Lys
325 330 335
Glu His Leu Glu Glu Phe Thr Met Leu Asn Phe Cys Gln Met Gly Ser
340 345 350
Gly Cys Thr Arg Glu Asn Leu Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Leu Asn
355 360 365
His Leu Gly Ile Asp Phe Lys Ile Val Gly Asp Ser Cys Met Val Tyr
370 375 380
Gly Asp Thr Leu Asp Val Met His Gly Asp Leu Glu Leu Ser Ser Ala
385 390 395 400
Val Val Gly Pro Ile Pro Leu Asp Arg Glu Trp Gly Ile Asp Lys Pro
405 410 415
Trp Ile Gly Ala Gly Phe Gly Leu Glu Arg Leu Leu Lys Val Lys His
420 425 430
Asp Phe Lys Asn Ile Lys Arg Ala Ala Arg Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn
435 440 445
Gly Ile Ser Thr Asn Leu
450
<210> 9
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
ggaaacctga tcatgtagat cgaatggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60
gggtttccgc ca 72
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
ataccggcac catccacaag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
ggctcatcca cagaccagtt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
gcgaggtttc ccgtagcaaa 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
ggtgtttgat cttgtggatg gt 22

Claims (10)

1.一种突变型赖氨酰-tRNA合成酶，其特征在于，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶在对应于野生型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列中第19位精氨酸(R)和/或第29位组氨酸(H)发生突变。
2.如权利要求1所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶，其特征在于，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶还包括选自下组的位点发生突变：第26位异亮氨酸(I)、第122位苏氨酸(T)、第309位亮氨酸(L)、第348位半胱氨酸(C)、第384位酪氨酸(Y)、或其组合。
3.如权利要求1所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶，其特征在于，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶选自下组：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.:3-8任一所示的多肽；或
(2)将SEQ ID NO.:3-8任一所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(1)所述多肽功能的由SEQ ID NO.:3-8任一所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶。
5.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求5所述的载体，或其基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含：
(a)权利要求1所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶；和
(b)在所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的存在下能够与赖氨酸衍生物结合的正交tRNA；以及任选地
(c)编码目的蛋白的目的核酸序列，所述目的核酸序列在用于引入赖氨酸衍生物的位置上包含由所述正交tRNA识别的密码子。
8.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统包括：
(a)权利要求1所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶；和
(b)在所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的存在下能够与赖氨酸衍生物结合的正交tRNA；以及任选地
(c)编码目的蛋白的目的核酸序列，所述目的核酸序列在用于引入赖氨酸衍生物的位置上包含由所述正交tRNA识别的密码子。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有(a)容器，以及(b)位于所述容器内的权利要求1所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶、或权利要求4所述的多核苷酸、或权利要求5所述的载体。
10.如权利要求1所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶、或权利要求6所述的宿主细胞、或权利要求8所述的表达系统、或权利要求9所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于将非天然氨基酸掺入目的蛋白中或制备含非天然氨基酸的目的蛋白。
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Denomination of invention: Efficient introduction of lysine derivatives into proteins as aminoacyl-tRNA synthetases

Effective date of registration: 20230612

Granted publication date: 20210507

Pledgee: Huarong Financial Leasing Co.,Ltd. Ningbo Branch

Pledgor: Ningbo Kunpeng Biotechnology Co.,Ltd.

Registration number: Y2023980043585