CN104099360A - 非天然氨基酸标记的目的蛋白或肽的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及非天然氨基酸标记的目的蛋白或肽的生产及制备。例如,本发明涉及经过定点突变的人干扰素α2b,定点修饰的人干扰素α2b,所述干扰素可以是不同种属及不同类型的。本发明还涉及定点突变和定点修饰干扰素的方法,所述方法包括使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入干扰素基因中,借助非天然氨基酸与修饰剂,如聚乙二醇与生长激素定点连接。本发明进一步涉及定点突变或修饰的干扰素的应用,如作为稳定、长效干扰素等的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域,涉及蛋白质或肽(例如干扰素)的非天然氨基酸的定点插入及定点修饰方法。所述方法包括基于基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入蛋白质或肽(例如干扰素)中,以及借助非天然氨基酸与修饰剂,例如聚乙二醇的定点连接。
背景技术
下面以干扰素为例说明本发明的背景技术,但是下述内容无论如何都不能理解为其是现有技术的承认,也无论无何都不能认为本发明的仅仅适用于干扰素。
(1)干扰素
干扰素是细胞在诱生剂作用的条件下产生的一种蛋白质,具有抑制病毒复制,抑制细胞分裂,及免疫调节等功能。人干扰素α2b分子量约为19kD,由165个氨基酸组成,序列如下:
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEM IQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILA VRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE(SEQ ID NO:1)
根据文献报道,对个别密码子进行优化,以提高其在大肠杆菌中的表达量,所用编码人干扰素α2b的编码序列为:
TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCCGCCGCACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGCGCCGCATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACCGCCATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA(SEQ ID NO:2)
干扰素是商品化较早的生物制品,自从1986年美国FDA批准Roch公司的干扰素α2a及Schering公司的干扰素α2b上市,目前干扰素已经成为世界上基因工程药物的重要成员。干扰素在我国也是第一个投放市场的基因药物,已经获得了广泛的使用。其在我国慢性乙型肝炎等治疗方面取得的重要效益和经济利益,使干扰素成为抗病毒和抗癌症方面最广泛应用的药物之一。
作为基因药物,干扰素半衰期短而治疗周期长,需要患者频繁的注射给药,大大降低了患者的依从性以及干扰素的应用价值。因此,改善干扰素药代动力学的研究正在世界范围内广泛进行。
(2)聚乙二醇修饰
共价交联聚乙二醇是增加生物分子水溶性,调节免疫原性,延长其半衰期的常用方法。利用聚乙二醇修饰干扰素,延长其半衰期,改善其生物学特性,已经是得到应用的成功技术。此前已经有美国先灵 葆雅公司生产的佩乐能,及罗氏公司生产的派罗欣作为PEG化干扰素通过FDA认证进入了医药市场。
但是,此两种药物所使用的PEG连接方法都可以和干扰素上多个位点发生反应,因此会产生多聚体和同分异构体。作为细胞因子类药物,干扰素发挥生物学效应需要和相应的受体结合,而非理想位点的不可控PEG修饰会明显阻碍干扰素与其受体分子结合,从而会大大减少PEG化干扰素的生物学活性;而多PEG化及单PEG同分异构体的产生,又对工业生产的后期处理带来高成本的影响,且由于同分异构体的分离的复杂性,在工业化生产中分离同分异构体的步骤往往被省略。已上市的两种PEG化干扰素都为多位点单PEG修饰的同分异构体混合物,相比于未修饰干扰素,其生物学活性大大下降。
针对此问题,国内外已经发表了多篇关于单PEG化修饰的干扰素方法。半胱氨酸的定点突变修饰PEG是单修饰的常用方法,其利用半胱氨酸上特有的巯基作为活性基团,通过特异性地和活性PEG反应进行修饰(Mary S.Rosendahl et al,Bioconjugate Chem.2005;Stacie J.Bell et al,Bioconjugate Chem.2008),此种方法虽然可以一定程度上解决单PEG修饰的异构体问题,但对氨基酸序列中已有半胱氨酸的蛋白质而言,引入多余的半胱氨酸未必可以达到理想的效果,可能会造成蛋白质的多聚化,二硫键的错配等严重问题;Sibu Balan等对干扰素进行定点的二硫键修饰,得到了单PEG修饰的干扰素(Sibu Balan et al,Bioconjugate Chem.2007),但二硫键往往参与形成蛋白质的活性口袋,并对蛋白质形成正确的折叠起到重要作用, 也因此成为针对二硫键的定点修饰技术的严重限制;另外,也有通过改变PH以达到定点N端的PEG修饰方法(Amartya Basu et al,Bioconjugate Chem.2006),以及利用Dock-and-lock融合蛋白技术修饰PEG(Chien-Hsing Chang et al,Bioconjugate Chem.2009)等,但都无法回避位点的局限性以及修饰条件的复杂性问题。
利用叠氮和炔的Click反应在生物分子体系中进行修饰是近年来研究的热门领域。Natalie W.Nairn等利用甲硫氨酸缺陷型菌在干扰素β中引入含有叠氮基团的非天然氨基酸,然后利用有铜催化的Click反应进行单位点的PEG修饰(Natalie W.Nairn et al,Bioconjugate Chem.2012)。但是此种方法仅能针对蛋白质中甲硫氨酸位点引入设计好的非天然氨基酸,如果蛋白质中有多个甲硫氨酸位点,要达到单PEG修饰的目的,则需要定点突变其余位点的甲硫氨酸,如此以来,无论在位点选择的灵活性上,及操作的复杂性上,都有着很大的限制。
(3)遗传密码扩展技术
近年来遗传密码扩展技术发展迅速,利用琥珀终止密码子为有义编码子,通过引入相应的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶,最终可以将设计好的非天然氨基酸引入蛋白质中。根据非天然氨基酸的性质,可以赋予蛋白质特殊的功能。到目前为止,这一技术已经将几十种非天然氨基酸成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中,涉及的非天然氨基酸包括炔基和叠氮等,利用这些生物体中本来不存在的特殊基团,就可以特异性地对蛋白质进行定点修饰。
面对现有技术中干扰素修饰不均匀,分离纯化工艺复杂等问题,该领域迫切需要能够任意位点特异性修饰功能基团的方法.
发明内容
发明人经过对现有技术的思考和研究,利用古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl/PylRS)的蛋白质翻译系统使非天然氨基酸定点掺入到蛋白中,从而得到定点突变的目的蛋白或肽,例如人干扰素。然后将所述定点突变的干扰素作为可被进一步定点修饰的原料,对该定点突变的干扰素进行进一步修饰,进而得到单一位点定点修饰的目的蛋白(例如干扰素)。所述的定点修饰例如为PEG化,即,将PEG定点修饰入目的蛋白(例如干扰素)中,从而得到单一位点PEG修饰的长效干扰素。
相比于其它方法,本发明的优点可体现在如下中的一个或几个:
1.可以在蛋白质任意位点引入非天然氨基酸,从而创造可以仅对该位点进行特异性修饰的原料蛋白;
2.利用非天然氨基酸上特有的活性基团,可以实现高效,特异性的修饰目的;
3.任意位点的PEG修饰可以带来更好的修饰效果,修饰在非活性位点,有可能实现药效减少最小化和药代性能最优化的修饰目的;修饰在抗原暴露区,可以实现免疫原性降低的效果;修饰在易被蛋白酶水解区,可以实现有效避被免体内蛋白酶降解目的; 和
4.通过修饰条件的优化,利用环辛炔介导的无铜Click反应,可以实现高效,对蛋白无害,简单易行的修饰反应。
具体地,在本发明的一个具体的实施方案中,提供了引入非天然氨基酸的目的蛋白(例如人干扰素),主要通过两个步骤:(1)构建含有在选定的位点上具有琥珀密码子突变的编码目的蛋白(例如人干扰素)基因的载体,(2)获得pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒,将步骤(1)与(2)在合适的宿主菌中共表达,且在培养基中填入需要的非天然氨基酸,获得引入突变的目的蛋白(例如人干扰素)。
该突变系统的原理在于:突变型的tRNAPyl/PylRS满足下列关系:(1):突变型的tRNAPyl不能利用宿主细胞的赖氨酰tRNA酶,只能被突变型的PylRS酰化;(2):突变型的PylRS只能酰化tRNAPyl,不能酰化其它tRNA,因此,突变型tRNAPyl和PylRS之间的关系是正交性的,即突变型的PylRS只能酰化突变型tRNAPyl,同时突变型的tRNAPyl只能被突变型的PylRS酰化,也就是说同一质粒中的突变型的tRNAPyl和PylRS是绝对的相互专一的。这种正交性的酶并且是只有这种酶可以把非天然氨基酸酰化到这种正交的tRNA上,并且只能酰化这种tRNA,而不能酰化其它的tRNA。获得的正交赖氨酰tRNA合酶/tRNA系统,使非20种常见氨基酸的Lys-azido(也可称为:Lys-叠氮)与琥珀密码子相对应,从而将非天然氨基酸定点引入到目的蛋白(例如人干扰素)中。
在本发明的一个具体的实施方案中,通过将带有琥珀密码子的人干扰素基因插入到载体(例如pET-21(a)+质粒)中,将插入后得到的载体和所述的pSUPAR-YAV-tRNA/PylRS一起转化大肠杆菌工程菌,然后可通过在发酵液中添加非天然氨基酸例如Lys-azido获得定点突变的目的蛋白(例如人干扰素)。
在本发明的一个具体的实施方案中,本发明提供了一种定点 引入非天然氨基酸的突变重组蛋白或肽(例如人干扰素)及其定点修饰(例如聚乙二醇化)的方法,该突变方法为针对蛋白或肽(例如人干扰素)中特定位点引入的非天然氨基酸Lys-azido,其特有的叠氮基团可以特异性地和修饰剂(例如炔-聚乙二醇)发生Click反应,从而将非天然氨基酸定点偶联在目的蛋白(例如人干扰素)上。
在本发明的另外的实施方案中,将纯化的Lys-azido定点突变目的蛋白或肽,例如人干扰素蛋白与聚乙二醇(聚乙二醇-炔)进行无铜或有铜催化的Click反应,使得例如分子量5k,10k,20k,30k,40k(直线,分枝型)的PEG通过目的蛋白(例如干扰素)上的非天然氨基酸对干扰素实行定点修饰。经简单离子交换色谱纯化即可获得PEG-Lys-azido-目的蛋白(肽),例如PEG-Lys-azido-IFN。经体外实验初步证明,经PEG定点修饰的人干扰素依然保持其原有的生物活性。
在本发明的一个实施方案中,本发明选取了OrigamiB(DE3)表达体系,此种感受态细胞通过基因改造,缺失蛋白还原途径的两个关键酶,从而稳定了蛋白质的二硫键,使菌体内蛋白更易形成天然构象,增强蛋白可溶性。
在本发明的一个实施方案中,出于方便后续纯化的考虑,本发明可在目的蛋白(例如干扰素)C端引入若干个(例如6个)组氨酸,蛋白表达出来后,可以通过简单的Ni-NTA亲和纯化,一步得到高纯度的干扰素纯品。
在本发明的实施方案中,利用Click反应对含有叠氮基团的目的蛋白或肽(例如干扰素)进行修饰,其中修饰剂可为有末端炔基的修饰物,借助一价铜的催化作用,实现定点的修饰;或者修饰剂为以环辛炔为修饰基的修饰物,直接实现对目的蛋白或肽,例如干扰素的高效且无害的修饰。
更为具体地,本发明提供了:
1.定点突变的蛋白或肽,例如人干扰素,其至少1个位点上 的氨基酸被突变为非天然氨基酸,所述非天然氨基酸为:
所示的Lys-azido,或其它含有叠氮结构的非天然氨基酸中的至少1种。
示例性地,所述突变位点可为SEQ ID NO:1中任意位点上一个或多个的氨基酸。优选地,所述突变位点选自:示于SEQ ID NO:1的序列的第P4位,H7位,S8位,K31位,H34位,E51位,A74位,G102位,T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点。
2.定点突变的目的蛋白(例如干扰素),其与示于突变前目的蛋白的氨基酸(例如SEQ ID NO:1)的序列的区别在于:在突变前目的蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1)所示的序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-azido,所述突变氨基酸与突变前目的蛋白氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1)所示的序列的连接方式如下式所示:
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向,R1为突变前目的蛋白(例如SEQ ID NO:1)所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基,
R2为突变前目的蛋白(例如SEQ ID NO:1)所示序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基,
R4为
示例性地,所述第N位氨基酸可为SEQ ID NO:1中任意位点上的一个或多个氨基酸。优选地,所述第N位的氨基酸选自第P4 位,H7位,S8位,K31位,H34位,E51位,A74位,G102位,T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点的中一个或多个。
3.经过修饰的定点突变的目的蛋白(例如干扰素),其结构如下式所示:
式(I):
或式(II)
其中,R1为突变前目的蛋白(例如SEQ ID NO:1)所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基,
R2为突变前目的蛋白(例如SEQ ID NO:1)所示序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基,
R3为相同或不同分子量PEG,环糊精,糖,核酸,氨基酸,多 肽或羧基端修饰基团。
4.项目3的经修饰的定点突变的目的蛋白,所述修饰为在R3上连接不同分子量的PEG,环糊精,糖,核酸,氨基酸,多肽或羧基端修饰基团。
5.编码项目1-4中任一项的突变的目的蛋白(例如干扰素)的核酸分子。示例性地,所述核酸分子与编码SEQID NO:1的核酸分子SEQ ID NO:2的区别在于,编码SEQ IDNO:1的第P4位,H7位,S8位,K31位,H34位,E51位,A74位,G102位,T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点的一个氨基酸的密码子被突变为琥珀密码子。
6.核酸载体,其可操作地连接有项目5的核酸分子。
7.宿主细胞,其中含有项目6的核酸载体。
8.项目7的宿主细胞,其中还含有表达突变的tRNAPyl/PylRS的质粒。
9.项目7或8的宿主细胞,其为真核宿主细胞或原核宿主细胞。
10.制备含有非天然氨基酸的目的蛋白(例如干扰素)的方法,包括步骤:
(1)选择步骤:在目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点;
(2)基因突变:将编码对应于(1)中选择的位点的目的蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为琥珀密码子;
(3)表达载体构建:将(2)基因突变步骤得到的突变的目的蛋白的编码序列与合适的载体可操作地连接,得到突变序列表达载体;
(4)获得pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒:从保藏日为2013年4月8日、保藏号为CGMCC No:7432的大肠埃希氏菌pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS中获取质粒pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒,
(5)表达:将(3)得到的突变序列表达载体与(4)的pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒共同转染相同的宿主细胞,将转染成功后的宿主细胞在含有Lys-azido的培养基中培养,并在合适的条件下诱导表达;
(6)纯化含有非天然氨基酸的干扰素;和
(7)任选的,对表达产物进行活性检测。
11.项目10的定点改良目的蛋白的方法,其中在步骤(7)之后还进一步包括:
(8)对目的蛋白中的非天然氨基酸进行特异性化学修饰,示例性地,所示修饰包括聚乙二醇化、糖基化或酰基化;和
(9)任选地,对(8)中经修饰的干扰素进行稳定性或活性检测,相比野生型得到提高的目的蛋白(例如干扰素)为改良的目的蛋白(例如干扰素)。
12.制备定点PEG化的目的蛋白(例如干扰素)的方法,包括:
(1)获取甲氧基聚乙二醇胺及聚乙二醇单甲醚乙烯醚
(2)合成催化剂BTTES,或环辛炔
(3)将PEG与环辛炔进行偶联,得到无需铜离子催化的活性PEG;及将聚乙二醇单甲醚乙烯醚经过化学反应得到末端含炔基的PEG
(4)将项目2的定点突变的目的蛋白(例如干扰素)与(3)的活性PEG反应,得到用聚乙二醇定点修饰的突变的目的蛋白(例如干扰素)。
13.项目12的方法,其中甲氧基聚乙二醇胺的分子式为CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2NH2,分子量范围2kD-100kD,n为1-60的整数;聚乙二醇单甲醚乙烯醚的分子式为CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2O-CH=CH2,分子量范围2kD-100kD,n为1-60的整数
14.制备定点PEG化的目的蛋白(例如干扰素)的方法,包括在合适的条件下将项目2的定点突变的干扰素与适量的活性PEG 进行Click反应(有铜、无铜),得到用聚乙二醇定点修饰的突变的目的蛋白(例如干扰素)。
15.项目14的方法,其中的PEG的分子量范围为2kD-100kD。
16.定点改良的目的蛋白(例如干扰素),其在项目1-2任一项的定点突变的目的蛋白(例如干扰素)的非天然氨基酸位置定点引入PEG,所述PEG的分子量范围为2kD-100kD。
17.组合物,其中含有有效量的项目1-2中任一项的目的蛋白(例如干扰素)、项目3的经过修饰的定点突变的干扰素或者项目16的定点改良的目的蛋白。
18.药物组合物,其中含有有效量的项目1-2中任一项的目的蛋白(例如干扰素),项目4的经过修饰的定点突变的干扰素、或项目16的定点改良的干扰素,以及药学上可以接受的载体。
19.项目1-2中任一项的目的蛋白,项目4的经过修饰的定点突变的目的蛋白或者项目17的定点改良的目的蛋白在制备长效,稳定性目的蛋白,用于抗病毒,治疗多种恶性肿瘤,免疫调节的药物中的用途。
本发明所述表达突变的tRNAPyl/PylRS的质粒可来源于从保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的、保藏日为2013年4月8日、保藏号为CGMCC No:7432的大肠埃希氏菌(拉丁文名称为Escherichia coli)pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS中获取的pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒。
本发明还提供了一种微生物(例如大肠杆菌),其含有本发明的表达突变的tRNAPyl/PylRS的质粒。示例性地,本发明的微生物为保藏号为CGMCC No:7432的微生物。
附图说明
图1:原核表达野生型人干扰素α2b
A:确证表达:第一道为空载体转化对照,第二道为插入干扰 素基因的载体表达
B:不同感受态细胞对表达量的影响:从左至右分别为未诱导,BL21(DE3)诱导,BL21(AI)诱导,OrigamiB(DE3)诱导
C:不同感受态中,PBV220热启动载体对表达的影响:从左至右分别为未诱导,BL21(DE3)诱导,BL21(AI)诱导,DH10B诱导,OrigamiB(DE3)诱导
D:不同感受态细胞的可溶性分析:从左至右分别为未诱导沉淀,BL21(DE3),BL21(AI),OrigamiB(DE3)沉淀,未诱导裂解上清,BL21(DE3),BL21(AI),OrigamiB(DE3)裂解上清
图2:干扰素不同位点突变型的表达
A:A74、E107位点的表达:Lane1:WT未诱导;Lane2:WT诱导;Lane3:A74未诱导;Lane4:A74诱导(-UAA);Lane5:A74诱导(+UAA);Lane6:E107未诱导;Lane7:E107诱导(-UAA);Lane8:E107诱导(+UAA),其中UAA是指非天然氨基酸。
B:M111、P137位点的表达:Lane1:WT未诱导;Lane2:WT诱导;Lane3:M111未诱导;Lane4:M111诱导(-UAA);Lane5:M111诱导(+UAA);Lane6:P137未诱导;Lane7:P137诱导(-UAA);Lane8:P137诱导(+UAA)
C:Q5、E159位点的表达:Lane1:WT未诱导;Lane2:WT诱导;Lane3:Q5未诱导;Lane4:Q5诱导(-UAA);Lane5:Q5诱导(+UAA);Lane6:E159未诱导;Lane7:E159诱导(-UAA);Lane8:E159诱导(+UAA)
D:P4,S8,E51,G102,T106位点的表达:Lane1:IFN-WT;Lane2、3:IFN-P4(-UAA)/IFN-P4(+UAA);Lane4-11同Lane2、3,为8、51、102、106号突变位点
E:选取三个突变型,进行可溶性验证:A74、E107、E159可溶性验证;Lane1:WT未诱导;Lane2:WT诱导;Lane3:A74诱导(-UAA);Lane4:A74诱导(+UAA);Lane5:E107诱导(-UAA);Lane6:E107诱导(+UAA);Lane7:E159诱导(-UAA);Lane8: E159诱导(+UAA)
图3:突变型干扰素表达条件的优化
A:A74-IFN温度对表达的影响:Lane1:IFN-mut74-诱导(-UAA);Lane2-4:IFN-mut74-诱导(+UAA)-24℃、30℃、37℃诱导过夜。图示为低温下有利于突变型的表达。
B:IPTG对A74-IFN表达的影响:Lane1:IFN-mut74-诱导(-UAA);Lane2-7:IFN-mut74-诱导(+UAA)—0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM IPTG。图示为0.6mM IPTG表达量最高。
C:不同培养基对A74-IFN表达的影响:从左至右为(-UAA)对照组,LB,SOB,2*YT,TB,SB,ArtMedia培养基,图示2*YT表达量最高
图4:Lys-azido定点突变的干扰素经Click反应定点修饰示意图
A:无铜催化Click反应A74-IFN定点修饰不同分子量PEG:Lane1:A74-IFN(-PEG);Lane2:A74-IFN-5K-PEG(直线型);Lane3:A74-IFN-10K-PEG(直线型);Lane4:A74-IFN-20K-PEG(直线型);Lane5:A74-IFN-40K-PEG(分枝型)
B:无铜催化Click反应不同反应时间PEG修饰反应程度。从左至右依次为A74-IFN(-PEG),反应1h,2h,3h,4h,5h,6h,12h,24h;附图为灰度扫描对比,横坐标为不同时间点,纵坐标为修饰PEG干扰素灰度值比未修饰PEG干扰素灰度值。图示反应时间对反应效率无显著影响,1小时之内反应基本达到平衡。
C:无铜催化Click反应中不同反应物比例PEG修饰反应程度。从左至右依次为A74-IFN(-PEG),A74-IFN:PEG(摩尔比)为1:1;1:3;1:5;1:10;1:20;1:50;1:100。附图为灰度扫描对比,横坐标为不同比例,纵坐标为修饰PEG干扰素灰度值比未修饰PEG干扰素灰度值。图示在PEG与干扰素的摩尔比大于20倍时,反应基本达到平衡。
D:无铜催化Click反应中不同温度对PEG修饰速率的影响。 从左至右依次为A74-IFN(-PEG),4℃,25℃,37℃反应1小时,摩尔比为1:20。附图为灰度扫描对比,横坐标为不同温度,纵坐标为修饰PEG干扰素灰度值比未修饰PEG干扰素灰度值。图示温度对反应速率影响不大,在4℃(蛋白药物的适宜温度)条件下,不影响反应速率。
E:有铜催化Click反应A74-IFN定点修饰PEG。Lane1:IFN;Lane2:铜丝(-);Lane3:反应组;Lane4:PEG(-)
图5:分离纯化示意图
A:分离纯化P4-IFN(-PEG),P4-IFN-5K-PEG示意图。从左至右依次为P4-IFN修饰后混合物以及不同吸收峰接收组分。
B:分离纯化P4-IFN不同分子量PEG修饰示意图。从左至右依次为P4-IFN(-PEG);P4-IFN-5K-PEG;P4-IFN-10K-PEG;P4-IFN-20K-PEG;图示中,通过简单的离子交换,修饰与未修饰PEG已实现完全分离。
为了更好地理解本发明,发明人用实施例对具体试验进行阐述和说明,其中所述实施例仅用于说明,并不限定本发明的保护范围。任何与本发明等价的变体或者实施方案都包括在本发明中。
实施例1:包含定点突变的人干扰素的基因载体的构建
(1)辅助质粒的获得
从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(菌种保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,中国科学院微生物研究所,保藏日为2013年4月8日、保藏号为CGMCC No:7432的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的含有质粒pSUPAR-YAV-tRNA/PylRS的大肠埃希氏菌pSUPAR-YAV-tRNA/PylRS中获取质粒pSUPAR-YAV-tRNA/PylRS(以下简称该质粒为辅助质粒),该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶。
(2)含天然人干扰素的质粒的获得
经全基因合成,获得干扰素的基因(SEQ ID NO:2)。然后将其连接在pET-21a(+)表达载体中,获得天然干扰素的表达质粒(pET21a(+)-IFN(WT)。
(3)定点突变位点的选择
根据干扰素的晶体结构,干扰素与其受体的结合位点,不同干扰素亚型的保守序列以及氨基酸暴露范围,并综合考虑抗原表位,酶解位点等信息[Ramaswamy Radhakrishnan,Leigh J Walter,Zinc mediated dimer of human interferon-a2b revealed by X-ray crystallography,Structure1996,Vol4No12;Christoph Thomas et al,Structural linkage between ligand discrimination and receptor activation by type I interferons,Cell.2011August 19;146(4):621–632.],本发明的发明人选取了几个适合位点进行修饰,其主要基于以下因素:1.氨基酸暴露于蛋白表面以方便偶联;2.屏蔽免疫原区;3.屏蔽蛋白酶解区。
通过更详细的文献资料查阅[Mary S.Rosendahl et al,Bioconjugate Chem.2005,16,200-207;Stacie J.Bell et al,Bioconjugate Chem.2008,19,299–305],以及对比已上市的PEG化干扰素的高活性PEG修饰异构体,发明人选取P4位,H7位,S8位,K31位,H34位,E51位,A74位,G102位,T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位为特定位点进行点突变,以此突变型干扰素为原料并对其进行定点修饰。
(4)定点突变的引物设计以及突变载体构建
发明人针对人干扰素第P4位,H7位,S8位,K31位,H34位,E51位,A74位,G102位,T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159这几个位点,分别设计能够使编码所述氨基酸的密码子突变为琥珀密码子的引物,具体引物如下表所示。
表1:突变引物列表
突变位点 | 序列(5’-3’方向) |
IFN P4 F | TGTGATCTGTAGCAAACCCACAGCCTGGGTAGCCGCCGCAC |
IFN P4 R | GTGCGGCGGCTACCCAGGCTGTGGGTTTGCTACAGATCACA |
IFN S8 F | TCTGCCTCAAACCCACTAGCTGGGTAGCCGCCGCACC |
IFN S8 R | GGTGCGGCGGCTACCCAGCTAGTGGGTTTGAGGCAGA |
IFN E51 F | CCAGTTCCAAAAGGCTTAGACCATCCCTGTCCTCCATGAG |
IFN E51 R | CTCATGGAGGACAGGGATGGTCTAAGCCTTTTGGAACTGG |
IFN G102 F | AGCCTGTGTGATACAGTAGGTGGGGGTGACAGAGACTCC |
IFN G102 R | GGAGTCTCTGTCACCCCCACCTACTGTATCACACAGGCT |
IFN T106 F | GATACAGGGGGTGGGGGTGTAGGAGACTCCCCTGATGAAG |
IFN T106 R | CTTCATCAGGGGAGTCTCCTACACCCCCACCCCCTGTATC |
H7 F | TGTGATCTGCCTCAAACCTAGAGCCTGGGTAGCCGCCGCACC |
H7 R | GGTGCGGCGGCTACCCAGGCTCTAGGTTTGAGGCAGATCACA |
K31 F | TCTCTTTTCTCCTGCTTGTAGGACCGCCATGACTTTGG |
K31 R | CCAAAGTCATGGCGGTCCTACAAGCAGGAGAAAAGAGA |
H34 F | CTCCTGCTTGAAGGACCGCTAGGACTTTGGATTTCCCCAGG |
H34 R | CCTGGGGAAATCCAAAGTCCTAGCGGTCCTTCAAGCAGGAG |
Y129 F | CTTCCAAAGAATCACTCTCTAGCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCC |
Y129 R | GGGCTGTATTTCTTCTCTTTCAGCTAGAGAGTGATTCTTTGGAAG |
K133 F | CACTCTCTATCTGAAAGAGTAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGG |
K133 R | CCAGGCACAAGGGCTGTATTTCTACTCTTTCAGATAGAGAGTG |
K134 F | CTCTATCTGAAAGAGAAGTAGTACAGCCCTTGTGCCTGGGAG |
K134 R | CTCCCAGGCACAAGGGCTGTACTACTTCTCTTTCAGATAGAG |
IFN Q5 F | TGTGATCTGCCTTAGACCCACAGCCTGGGTAGCCGC |
IFN Q5 R | GCGGCTACCCAGGCTGTGGGTCTAAGGCAGATCACA |
IFN A74 F | GCACAAAGGACTCATCTTAGGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGAC |
IFN A74 R | GTCTAGGAGGGTCTCATCCCAAGCCTAAGATGAGTCCTTTGTGC |
IFN E107 F | GGGGGTGGGGGTGACATAGACTCCCCTGATGAAGGAGG |
IFN E107 R | CCTCCTTCATCAGGGGAGTCTATGTCACCCCCACCCCC |
IFN M111 F | GACAGAGACTCCCCTGTAGAAGGAGGACTCCATTCTGG |
IFN M111 R | CCAGAATGGAGTCCTCCTTCTACAGGGGAGTCTCTGTC |
IFN P137 F | GAAAGAGAAGAAATACAGCTAGTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAG |
IFN P137 R | CTGCTCTGACAACCTCCCAGGCACACTAGCTGTATTTCTTCTCTTTC |
IFN E159 F | GATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAATAGAGTTTAAGAAGTAAGG |
IFN E159 R | CCTTACTTCTTAAACTCTATTGCAAGTTTGTTGACAAAGAAAAAGATC |
利用定点突变试剂盒(Lightning Site-Directed Mutagenesis Kits,Catalog#210518),按说明书操作以上述步骤(2)中获得的野生型干扰素表达载体pET21a(+)-IFN(WT)为模板将干扰素第P4位,H7位,S8位,K31位, H34位,E51位,A74位,G102位,T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位这几个位点的氨基酸密码子突变为琥珀终止密码子,然后将突变基因插入至pET21-a(+)质粒,构建得到表达质粒,经测序验证突变成功。
(5)定点突变的干扰素表达株的构建
将步骤(1)得到的辅助质粒(氯霉素抗性)和步骤(4)得到的表达质粒(氨苄青霉素抗性)两个质粒同时转化大肠杆菌OrigamiB(DE3),经双抗性平板(氯霉素抗性和氨苄青霉素抗性)筛选出共转化的阳性菌株(阳性菌株表示同时转化有两个质粒)。
实施例2:定点突变的干扰素的表达和纯化
本发明中构建pSUPAR-YAV-tRNA/PylRS质粒与表达源自古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的质粒共表达后,在宿主菌中,从原理上看,利用这套蛋白质翻译系统能够使非天然氨基酸Lys-azido掺入到蛋白中,从而造成干扰素的定点突变。
下面,发明人对Lys-azido的掺入可能性和突变蛋白质的生产性能进行了检测。
1:非天然氨基酸Lys-azido的合成和鉴定
非天然氨基酸Lys-azido的化学合成反应式如下
如上式所述,将原料1(2-溴乙醇)2.3mL溶于90mL丙酮以及15mL水的混合溶液,加入NaN33.12g,60℃油浴加热回流反应20h。冷却至室温,旋蒸除去丙酮,无水乙醚萃取(30mL×8),无水Na2SO4 干燥,旋蒸除去溶剂得2.62g无色液体产物2。
将产物2(500mg,5.74mmol)加入到三光气(1.70g,5.74mmol)的THF(10ml)溶液中。0℃搅拌反应8h,溶剂蒸干。剩余物在真空下干燥1h,得到无色油状产物3。
将3溶解在1.5ml的THF中并缓慢加入Boc-Lys-OH(1.7g,6.88mmol)的1M NaOH(20ml)/THF(5ml)的溶液中。0℃搅拌反应12h并逐渐升温到室温。重新将反应液冷却到0℃并用0℃的1M的盐酸溶液将反应液pH值调整至2~3。反应液用EtOAc萃取(30mL×5),有机层用2×100ml的饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥有机层、过滤、旋蒸除去溶剂得到1.65g无色粘稠液体产物4不用进一步纯化。
将4溶于15mL CH2Cl2中,搅拌下缓慢滴加15mL TFA,室温下反应30min后蒸出溶剂,剩余液体产物用5mL甲醇溶解,加入100mL乙醚,析出大量白色固体沉淀,过滤干燥得到1.38g白色固体终产物5。1H NMR(D2O):δ=1.22-1.45(m,4H),1.67-1.73(m,2H),2.99(m,2H),3.38(m,2H),3.70(m,1H),4.09(m,2H).13C NMR(D2O):δ=21.4,28.4,29.6,39.5,53.4,56.2,57.8,116.0(TFA),153.1,162.3(TFA),172.9.HRMS:m/z calcd for C9H17N5O4[M]+:259.1281;found:259.1283,证明得到的Lys-azido结构正确。
2:突变干扰素的Lys-azido掺入表达及纯化
(1)将实施例1的步骤5获得的表达株在LB培养基(且使之含有34ug/ml氯霉素和100ug/ml氨苄青霉素)中37℃培养12-16小时后,再经二级扩增至菌液OD值到0.6-1.0时,加入Lys-azido至终浓度1mM,37℃继续扩增30分钟,加入IPTG至终浓度0.5mM,阿拉伯糖至终浓度0.2%,24℃诱导表达12小时后收集菌体。
(2)随后对表达温度,IPTG诱导浓度,培养基成分等对突变型表达条件进行优化。通过对比不同条件下的表达量,最终确定表达 条件为24℃下,在2*YT培养基中用0.5mM IPTG诱导过夜。
(3)将收集的菌体用Ni-NTA-Bind-Buffer平衡重悬,超声破碎,离心去除细胞碎片,经过Ni-NTA金属螯合亲和层析,用Ni-NTA-Wash-Buffer充分洗涤,最后用Ni-NTA-Elute-Buffer洗脱,得到初步纯化的干扰素样品,纯度约为90%。
3:突变干扰素的鉴定
(1)设计对照组,将未加Lys-azido的大肠杆菌作为对照,做相同扩增及诱导处理
(2)离心收集菌体,每2ml菌液加入100ul PBS重悬,取10ul菌体加入SDS-PAGE上样缓冲液煮样处理,并做SDS-PAGE电泳分析。
(3)考马斯亮蓝染色5分钟,脱色两小时以上,对比目的位置蛋白质条带,可明显观察到加入Lys-azido组表达出全长干扰素,如图2所示。
实施例3:突变体的聚乙二醇定点偶联
当在干扰素中引入Lys-azido后,需要通过Click反应进行PEG偶联。
1.Lys-azido定点突变蛋白的定点PEG偶联(见图4)
A:PEG-DIBO(甲氧基聚乙二醇胺)的合成,例如可参考Mbua,N.E.,Guo,J.,Wolfert,M.A.,Steet,R.,Boons,G.J.Strain-Promoted Alkyne-Azide Cycloadditions(SPAAC)Reveal New Features of Glycoconjugate Biosynthesis.ChemBioChem.2011,12,1912-1921.
无铜催化的Click反应需借助环辛炔的环张力作用实现,将修饰物与DIBO(有环辛炔结构的化合物)偶联,从而与含有叠氮的基团进行无铜催化Click反应。
B:通过无铜催化Click反应偶联PEG
PEG Click反应体系如下:
Lys-azido-IFN-A74(其是实施例2所制备的)1μg/μl DIBO-PEG 2mM
反应条件:4℃,垂直混悬2小时。
结果验证不同分子量PEG都可成功修饰到干扰素上(见图4-A,B,C,D)
经过上述反应条件能够在1小时内将大约50%的干扰素定点PEG化,反应后的复合物经过除盐,再经过离子交换,可以获得>95%纯度的PEG定点修饰蛋白(Source15S,20mM乙酸钠PH=4.5,0-250mM NaCl梯度)。
其它位点Lys-azido突变蛋白质的PEG定点偶联方法与Lys-azido-IFN-A74相同,得到相近的修饰效果。
C:聚乙二醇单甲醚炔丙基醚(mPEG-炔)的合成,例如可参见Ning XH,Guo J,Wolfert MA,Boons GJ.Angew.Chem.Int.Ed.2008;47:2253–2255.
D:通过有铜催化Click反应偶联5kPEG
5k PEG Click反应体系如下:
注(1,2,3-triazol-1-yl)ethanesulfonic acid,简称BTTES)
反应条件:4℃,垂直混悬30分钟;反应结束后加入EDTA至1mM终止反应,获得的最终产物是单PEG修饰的干扰素蛋(如图4-E所示)。图4-E是通过SDS-PAGE凝胶电泳,对电泳后的胶进行考马斯亮蓝染色-脱色后得到的。从改图可以看出,也可以通 过有铜Click反应对目的蛋白进行PEG的修饰偶联。
实施例4:突变型干扰素及定点修饰干扰素的体外活性评价
(1)光学表面等离子共振实验(SPR)
干扰素α2b通过结合细胞表面两个受体单位发挥生物学作用,我们称之为IFNAR1和IFNAR2。其中IFNAR2是主要的结合单位,以纳摩尔的高亲和力与α类干扰素结合。
光学表面等离子共振实验(SPR)通过将一个蛋白锚定在传感芯片表面,然后将待测样品流过芯片表面,若样品中有能够与芯片表面的生物分子识别膜相互作用的分子,就会引起金膜表面折射率变化,最终导致SPR角变化,通过检测SPR角度变化,获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等信息。
具体过程如下:将IFNAR2锚定在CM5芯片上,响应值230RU;以30ul/min,120s进样留过干扰素样品;解离时间120s;4M氯化镁,30ul/min,洗涤20秒;通过留过不同浓度样品,由软件拟合KD值。通过比较KD值,量化突变氨基酸以及修饰PEG对干扰素活性造成的影响。具体数值见表1(该表中的突变体均是从上述实施例3的B(即通过无铜反应)得到的):
表1:不同突变位点及PEG干扰素与IFNAR2的SPR数据
ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(nM) | U-value | |
WT | 1.47E+06 | 0.01012 | 6.89 | 5 |
S8 | 2.00E+05 | 0.007347 | 36.8 | 12 |
E51 | 2.14E+06 | 0.009315 | 4.36 | 5 |
A74 | 1.06E+06 | 0.007277 | 6.85 | 5 |
T106 | 1.14E+06 | 0.007852 | 6.86 | 4 |
P137 | 7.65E+06 | 0.04368 | 5.71 | 15 |
E159 | 8.16E+05 | 0.007215 | 8.84 | 12 |
S8-5K-PEG | 5.66E+05 | 0.01643 | 29 | 9 |
A74-5K-PEG | 8.93E+05 | 0.01023 | 11.5 | 5 |
T106-5K-PEG | 4.66E+05 | 0.01043 | 22.4 | 9 |
结果显示,部分位点插入非天然氨基酸后对其与受体的结合能力影响不大。而在有些位点上,5K-PEG修饰的突变型干扰素与 干扰素受体的结合能力并未受到显著影响。
(2)抗肿瘤活性
抗肿瘤活性是干扰素重要生理作用之一。干扰素诱导的2-5A合成酶-RNASE L以及PKR-eIF2系统与细胞的增殖相关,而且2-5A合成酶和RNase L酶在快速生长的细胞中已经被发现高水平的表达,表明他们在调控细胞的增长方面发挥着重要作用。
评价干扰素的体外抗肿瘤活性是对干扰素质量评价的一个有效指标。具体做法如下:将对数生长的Daudi细胞2万个每孔接种于96孔板中;37℃,5%CO2培养约1小时;加入不同梯度的干扰素及突变体、PEG修饰物(2100pg/ml-0.9pg/ml,1:3倍比稀释),以等体积空白培养基作为空白对照,以不加干扰素,仅加入缓冲液作为阴性对照;约96小时后用Celltiter-Glu法评价细胞活性,绘制剂量依赖曲线,并计算IC50。
具体数值见下表2:
表2:不同位点干扰素抗肿瘤活性(该表中的突变体均是从上述实施例3的B(即通过无铜反应)得到的)
IFN | IC50(pg/ml) |
WT-IFN | 11.18 |
E51-IFN | 17.2 |
P137-IFN | 22.35 |
P4-IFN | 19.99 |
P4-5K-PEG | 74.71 |
由以上5个数据可以看到,不同位点突变型干扰素相比于野生型IC50有较小变化,而修饰PEG后IC50出现较大变化。但是由于本发明的技术方案解决了PEG化的均一性问题,本领域技术人员可以在此基础上寻找最理想的修饰位点。
虽然用上述实施方式描述了本发明,应当理解的是,在不背 离本发明的精神的前提下,本发明可进行进一步的修饰和变动,且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。例如,本申请虽然以干扰素为例进行了说明,但是很显然,本发明不应当仅仅限于干扰素,本领域技术人可将本发明适用于任何目的蛋白。
Claims (20)
1.表达突变的tRNAPyl/PylRS的质粒,其是从保藏日为2013年4月8日、保藏号为CGMCC No:7432的大肠埃希氏菌pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS中获取的pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS质粒。
2.微生物,其含有权利要求1所述的质粒。
3.根据权利要求2所述的微生物,其是大肠杆菌。
4.制备含有非天然氨基酸的目的蛋白(例如干扰素)的方法,包括步骤:
(1)选择步骤:在目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点;
(2)基因突变:将编码对应于(1)中选择的位点的目的蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为琥珀密码子;
(3)表达载体构建:将(2)基因突变步骤得到的突变的目的蛋白的编码序列与合适的载体可操作地连接,得到突变序列表达载体;
(4)获得权利要求1的质粒;
(5)表达:将(3)得到的突变序列表达载体与(4)的质粒共同转染相同的宿主细胞,将转染成功后的宿主细胞在含有Lys-azido的培养基中培养,并在合适的条件下诱导表达;
(6)纯化含有非天然氨基酸的干扰素;和
(7)任选的,对表达产物进行活性检测。
5.权利要求4的制备含有非天然氨基酸的目的蛋白的方法,其中在步骤(7)之后还进一步包括:
(i)对目的蛋白中的非天然氨基酸进行特异性化学修饰,示例性地,所示修饰包括聚乙二醇化、糖基化或酰基化;和
(ii)任选地,对(i)中经修饰的干扰素进行稳定性或活性检测,相比野生型得到提高的目的蛋白(例如干扰素)为改良的目的蛋白(例如干扰素)。
6.蛋白质,其是根据权利要求4或5的方法获得的。
7.定点突变的蛋白或肽,例如人干扰素,其至少1个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸,所述非天然氨基酸为:
所示的Lys-azido。
示例性地,所述突变位点可为SEQ ID NO:1中任意位点上一个或多个的氨基酸。优选地,所述突变位点选自:示于SEQ ID NO:1的序列的第P4位,H7位,S8位,K31位,H34位,E51位,A74位,G102位,T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点。
8.定点突变的目的蛋白(例如干扰素),其与示于突变前目的蛋白的氨基酸(例如SEQ ID NO:1)的序列的区别在于:在突变前目的蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1)所示的序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-azido,所述突变氨基酸与突变前目的蛋白氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1)所示的序列的连接方式如下式所示:
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向,R1为突变前目的蛋白(例如SEQ ID NO:1)所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基,
R2为突变前目的蛋白(例如SEQ ID NO:1)所示序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基,
R4为
示例性地,所述第N位氨基酸可为SEQ ID NO:1中任意位点上的一个或多个氨基酸。优选地,所述第N位的氨基酸选自第P4位,H7位,S8位,K31位,H34位,E51位,A74位,G102位,T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点的中一个或多个。
9.经过修饰的定点突变的目的蛋白(例如干扰素),其结构如下式所示:
式(I):
或式(II)
其中,R1为突变前目的蛋白(例如SEQ ID NO:1)所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基,
R2为突变前目的蛋白(例如SEQ ID NO:1)所示序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基,
R3为相同或不同分子量PEG,环糊精,糖,核酸,氨基酸,多肽或羧基端修饰基团。
10.根据权利要求9的经修饰的定点突变的目的蛋白,所述修饰为在R3上连接不同分子量的PEG,环糊精,糖,核酸,氨基酸,多肽或羧基端修饰基团。
11.编码权利要求6-10中任一项的突变的目的蛋白(例如干扰素)的核酸分子。示例性地,所述核酸分子与编码SEQID NO:1的核酸分子SEQ ID NO:2的区别在于,编码SEQ IDNO:1的第P4位,H7位,S8位,K31位,H34位,E51位,A74位,G102位,T106位,E107位,M111位,Y129位,K133位,K134位,P137位,E159位或其他对活性影响较小的位点的一个氨基酸的密码子被突变为琥珀密码子。
12.核酸载体,其可操作地连接有权利要求11的核酸分子。
13.宿主细胞,其中含有权利要求12的核酸载体。
14.根据权利要求13的宿主细胞,其中还含有权利要求1的质粒。
15.制备定点PEG化的目的蛋白(例如干扰素)的方法,包括:
(1)获取甲氧基聚乙二醇胺及聚乙二醇单甲醚乙烯醚;
(2)合成催化剂BTTES,或环辛炔;
(3)将PEG与环辛炔进行偶联,得到无需铜离子催化的活性PEG;及将聚乙二醇单甲醚乙烯醚经过化学反应得到末端含炔基的PEG;和
(4)将权利要求6-10中任一项的蛋白(例如干扰素)与(3)的活性PEG反应,得到用聚乙二醇定点修饰的突变的目的蛋白(例如干扰素)。
16.根据权利要求15的方法,其中甲氧基聚乙二醇胺的分子式为CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2NH2,分子量范围2kD-100kD,n为1-60的整数;聚乙二醇单甲醚乙烯醚的分子式为CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2O-CH=CH2,分子量范围2kD-100kD,n为1-60的整数。
17.定点改良的目的蛋白(例如干扰素),其在权利要求6-10中任一项的蛋白(例如干扰素)的非天然氨基酸位置定点引入修饰,例如PEG修饰,优选所述PEG的分子量范围为2kD-100kD。
18.组合物,其中含有有效量的权利要求6-10中任一项的蛋白(例如干扰素)或者权利要求17的定点改良的目的蛋白。
19.药物组合物,其中含有有效量的权利要求6-10中任一项的蛋白(例如干扰素)或者权利要求17的定点改良的目的蛋白,以及药学上可以接受的载体。
20.权利要求6-10中任一项的目的蛋白,或者权利要求17的定点改良的目的蛋白在制备长效、稳定性目的蛋白,用于抗病毒,治疗多种恶性肿瘤,免疫调节的药物中的用途。
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Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104693300A (zh) * | 2013-12-05 | 2015-06-10 | 北京大学 | 改良型聚乙二醇化重组人干扰素α2b |
CN106146663A (zh) * | 2015-04-10 | 2016-11-23 | 北京大学 | 非天然氨基酸标记的新型抗体-药物偶联物及其制备 |
CN107012121A (zh) * | 2016-01-27 | 2017-08-04 | 北京大学 | 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建 |
CN107022568A (zh) * | 2016-02-01 | 2017-08-08 | 北京大学 | 哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统 |
CN108823225A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-11-16 | 中国科学院理化技术研究所杭州研究院 | 蛋白质翻译过程中直接实现脂肪酸修饰的表达系统及应用 |
CN109295100A (zh) * | 2017-07-25 | 2019-02-01 | 北京大学 | 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建 |
CN109957559A (zh) * | 2017-12-26 | 2019-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 一种定点标记的泛素特异性蛋白酶7及其制备方法和应用 |
CN110835633A (zh) * | 2018-08-13 | 2020-02-25 | 北京大学 | 利用优化的基因密码子扩展系统制备ptc稳定细胞系及应用 |
WO2020187269A1 (zh) * | 2019-03-19 | 2020-09-24 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 在蛋白中高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基—tRNA合成酶 |
CN111747869A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-10-09 | 北京大学深圳研究生院 | 一种遗传编码的甲醛反应性非天然氨基酸、制备方法及其应用 |
CN111849929A (zh) * | 2019-04-30 | 2020-10-30 | 苏州鲲鹏生物技术有限公司 | 高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基—tRNA合成酶 |
CN111850020A (zh) * | 2019-04-25 | 2020-10-30 | 苏州鲲鹏生物技术有限公司 | 利用质粒系统在蛋白中引入非天然氨基酸 |
CN111909256A (zh) * | 2019-05-10 | 2020-11-10 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 多肽衍生物及其制备方法 |
CN111909255A (zh) * | 2019-05-10 | 2020-11-10 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 胰岛素衍生物及其制备方法 |
CN114644581A (zh) * | 2021-01-04 | 2022-06-21 | 北京惠大生物科技有限公司 | 含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白及其生物合成方法及应用 |
WO2023011486A1 (zh) * | 2021-08-02 | 2023-02-09 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基-tRNA合成酶及其应用 |
RU2792236C1 (ru) * | 2019-05-10 | 2023-03-21 | Нингбо Кунпенг Биотекх Ко., Лтд. | Производное полипептида и способ его получения |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101076598A (zh) * | 2003-07-07 | 2007-11-21 | 斯克利普斯研究院 | 正交赖氨酰-tRNA和氨酰-tRNA合成酶对的组合物及其应用 |
CN101247821A (zh) * | 2005-06-03 | 2008-08-20 | Ambrx公司 | 经改良人类干扰素分子和其用途 |
WO2009151491A2 (en) * | 2008-02-27 | 2009-12-17 | The Scripps Research Institute | In vivo incorporation of an unnatural amino acid comprising a 1,2-aminothiol group |
CN102838671A (zh) * | 2011-06-23 | 2012-12-26 | 北京大学 | 定点突变和定点修饰的生长激素、其制备方法及其应用 |
-
2013
- 2013-04-12 CN CN201310128367.7A patent/CN104099360A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101076598A (zh) * | 2003-07-07 | 2007-11-21 | 斯克利普斯研究院 | 正交赖氨酰-tRNA和氨酰-tRNA合成酶对的组合物及其应用 |
CN101247821A (zh) * | 2005-06-03 | 2008-08-20 | Ambrx公司 | 经改良人类干扰素分子和其用途 |
WO2009151491A2 (en) * | 2008-02-27 | 2009-12-17 | The Scripps Research Institute | In vivo incorporation of an unnatural amino acid comprising a 1,2-aminothiol group |
CN102838671A (zh) * | 2011-06-23 | 2012-12-26 | 北京大学 | 定点突变和定点修饰的生长激素、其制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
ABHISHEK CHATTERJEE等: "A Versatile Platform for Single- and Multiple-Unnatural Amino Acid Mutagenesis in Escherichia coli", 《BIOCHEMISTRY》 * |
DUY P. NGUYEN等: "Genetic Encoding and Labeling of Aliphatic Azides and Alkynes inRecombinant Proteins via a Pyrrolysyl-tRNA Synthetase/tRNACUA Pair and Click Chemistry", 《JACS》 * |
TAKAHITO MUKAI等: "Adding L-lysine derivatives to the genetic code of mammalian cells with engineered pyrrolysyl-tRNA synthetases", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
张春秋等: "蛋白质功能化新策略:嵌入非天然氨基酸", 《化学进展》 * |
Cited By (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015081858A1 (zh) * | 2013-12-05 | 2015-06-11 | 北京大学 | 改良型聚乙二醇化重组人干扰素α 2b及其制备方法 |
CN104693300A (zh) * | 2013-12-05 | 2015-06-10 | 北京大学 | 改良型聚乙二醇化重组人干扰素α2b |
CN104693300B (zh) * | 2013-12-05 | 2021-07-20 | 北京大学 | 改良型聚乙二醇化重组人干扰素α2b |
CN106146663A (zh) * | 2015-04-10 | 2016-11-23 | 北京大学 | 非天然氨基酸标记的新型抗体-药物偶联物及其制备 |
CN106146663B (zh) * | 2015-04-10 | 2019-11-08 | 北京大学 | 非天然氨基酸标记的新型抗体-药物偶联物及其制备 |
CN107012121A (zh) * | 2016-01-27 | 2017-08-04 | 北京大学 | 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建 |
CN112725282A (zh) * | 2016-01-27 | 2021-04-30 | 北京大学 | 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建 |
CN107022568B (zh) * | 2016-02-01 | 2020-08-25 | 北京大学 | 哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统 |
CN107022568A (zh) * | 2016-02-01 | 2017-08-08 | 北京大学 | 哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统 |
CN109295100A (zh) * | 2017-07-25 | 2019-02-01 | 北京大学 | 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建 |
CN109957559A (zh) * | 2017-12-26 | 2019-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 一种定点标记的泛素特异性蛋白酶7及其制备方法和应用 |
CN108823225A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-11-16 | 中国科学院理化技术研究所杭州研究院 | 蛋白质翻译过程中直接实现脂肪酸修饰的表达系统及应用 |
CN110835633A (zh) * | 2018-08-13 | 2020-02-25 | 北京大学 | 利用优化的基因密码子扩展系统制备ptc稳定细胞系及应用 |
CN110835633B (zh) * | 2018-08-13 | 2021-10-01 | 北京大学 | 利用优化的基因密码子扩展系统制备ptc稳定细胞系及应用 |
WO2020187269A1 (zh) * | 2019-03-19 | 2020-09-24 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 在蛋白中高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基—tRNA合成酶 |
CN111850020A (zh) * | 2019-04-25 | 2020-10-30 | 苏州鲲鹏生物技术有限公司 | 利用质粒系统在蛋白中引入非天然氨基酸 |
CN111849929A (zh) * | 2019-04-30 | 2020-10-30 | 苏州鲲鹏生物技术有限公司 | 高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基—tRNA合成酶 |
CN111909255A (zh) * | 2019-05-10 | 2020-11-10 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 胰岛素衍生物及其制备方法 |
WO2020228610A1 (zh) * | 2019-05-10 | 2020-11-19 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 多肽衍生物及其制备方法 |
CN111909256A (zh) * | 2019-05-10 | 2020-11-10 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 多肽衍生物及其制备方法 |
CN113811614A (zh) * | 2019-05-10 | 2021-12-17 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 多肽衍生物及其制备方法 |
RU2792236C1 (ru) * | 2019-05-10 | 2023-03-21 | Нингбо Кунпенг Биотекх Ко., Лтд. | Производное полипептида и способ его получения |
RU2792236C9 (ru) * | 2019-05-10 | 2023-05-26 | Нингбо Кунпенг Биотекх Ко., Лтд. | Производное полипептида и способ его получения |
EP3967759A4 (en) * | 2019-05-10 | 2023-08-23 | Ningbo Kunpeng Biotech Co., Ltd. | POLYPEPTIDE DERIVATIVE AND METHOD OF MANUFACTURE THEREOF |
CN111747869A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-10-09 | 北京大学深圳研究生院 | 一种遗传编码的甲醛反应性非天然氨基酸、制备方法及其应用 |
WO2021248770A1 (zh) * | 2020-06-12 | 2021-12-16 | 北京大学深圳研究生院 | 一种遗传编码的甲醛反应性非天然氨基酸、制备方法及其应用 |
CN114644581A (zh) * | 2021-01-04 | 2022-06-21 | 北京惠大生物科技有限公司 | 含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白及其生物合成方法及应用 |
WO2023011486A1 (zh) * | 2021-08-02 | 2023-02-09 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基-tRNA合成酶及其应用 |
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