CN118255869A

CN118255869A - 一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN118255869A
Application number: CN202311744510.5A
Authority: CN
Inventors: 高秀岩; 郑红霞
Original assignee: Shandong Junxiu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Junxiu Biotechnology Co ltd
Filing date: 2023-12-15
Publication date: 2024-06-28

Abstract

本发明属于蛋白质工程和基因工程技术领域，具体涉及一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明采用基因重组技术，以人III型胶原蛋白基因序列为模板，构建并表达一种重组人源胶原蛋白，该重组胶原蛋白包含人III型胶原蛋白序列，具有高生物相容性、高活性。与天然胶原蛋白相比，优点在于具有亲水性，易溶于水，表达量高。经试验证明，本发明构建的重组人源化胶原蛋白具有快速止血、促进损伤组织修复的作用，可作为医疗器械原材料使用，且利用原核发酵蛋白质表达系统，非常适合进行工业化大规模生产，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程和基因工程技术领域，具体涉及一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

胶原蛋白是机体细胞外基质主要结构蛋白，参与细胞增殖、分化、迁移和信号传递等行为，起着支撑、修复、保护的作用。胶原蛋白种类繁多，常见的类型为I型、II型、III型、V型和XI型，成年人皮肤以I型为主，而婴幼儿皮肤以III型胶原蛋白为主；III型胶原蛋白主要存在于皮肤下层组织和表皮层连接处，使皮肤具有弹性和紧致度。

胶原蛋白制备技术主要分为两种，一种是动物胶原提取法，另一种是胶原蛋白的重组表达，后者常见的又分为原核发酵表达和真核发酵表达。因为动物来源和生产环境不可靠，在胶原蛋白的提纯过程中，存在病毒和免疫原安全隐患，限制了动物源胶原蛋白潜在用途的进一步开发。重组类人胶原蛋白是根据人胶原蛋白的特性进行优化或引入特殊功能的氨基酸序列，通过重组表达获得的具有类似胶原蛋白特性的蛋白。与传统提取获得的胶原蛋白相比，具有可加工性、无病毒隐患、良好的水溶性、生产工艺稳定和排异反应低等优点。

大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的原核发酵蛋白质表达系统，其遗传背景清楚，发酵成本低、生产周期短、效率高，可以快速大规模生产外源蛋白，具备规模化生产外源蛋白的潜力。真核表达以酵母表达(类)人胶原蛋白的研究较多，如毕赤酵母、汉逊酵母和酿酒酵母等。但真核表达系统相对于原核表达系统周期较长，培养成本较高。

相对于传统的胶原，重组人源胶原蛋白的制备是在分子水平上利用基因工程技术，通过优化修饰进行表达得到的重组胶原，与人胶原蛋白高度一致，该重组胶原具有无病毒隐患、生物相容性高、极好的水溶性、可促进细胞粘附、增殖分化等优良的特性。然而，现有技术中有关重组胶原蛋白特别是重组人源III型胶原蛋白的报道仍然较少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促损伤修复重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用。具体的，本发明采用基因重组技术，以人III型胶原蛋白基因序列为模板，构建并表达一种重组人源胶原蛋白，该重组胶原蛋白包含人III型胶原蛋白序列，具有高生物相容性、高活性。与天然胶原蛋白相比，优点在于具有亲水性，易溶于水，表达量高。经试验证明，本发明构建的重组人源化胶原蛋白具有快速止血、促进损伤组织修复的作用，可作为医疗器械原材料使用，且利用原核发酵蛋白质表达系统，非常适合进行工业化大规模生产。基于上述研究成果，从而完成本发明。

为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种重组人源胶原蛋白，所述重组人源胶原蛋白选自：

(a1)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同或相近功能的蛋白质；

(a3)与(a1)或(a2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到80％或80％以上并且具有与(a1)或(a2)所示的蛋白质具有相同或相近功能的蛋白质。

本发明的第二个方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子能够编码上述重组人源胶原蛋白。

具体的，所述核酸分子具有(b1)–(b4)中任一所述核苷酸序列：

(b1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(b2)如(b1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列；

(b3)与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上的同一性，且编码所述融合蛋白的核酸分子；

(b4)在严格条件下能够与如(b1)–(b3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同功能融合蛋白的核苷酸序列。

本发明的第三个方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第二方面所述的核酸分子。

本发明的第四个方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的重组表达载体或染色体整合有本发明第二方面所述的核酸分子或者能够表达本发明第一方面所述重组人源胶原蛋白。

本发明的第五个方面，提供一种上述重组人源胶原蛋白的制备方法，包括：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述重组人源胶原蛋白；以及分离纯化所述重组人源胶原蛋白。

本发明的第六个方面，提供上述重组人源胶原蛋白在制备食品、药品、医疗器械或日化用品中的应用。

本发明的第七个方面，提供一种医疗器械，所述医疗器械至少包含上述重组人源胶原蛋白。

本发明的第八个方面，提供上述重组人源胶原蛋白或医疗器械在如下任意一种或多种中的应用：

(c1)制备促进细胞增殖、迁移和/或粘附的产品；

(c2)制备促进伤口愈合和/或抗瘢痕的产品。

其中，所述细胞可以为人正常皮肤永生化角质形成细胞(HacaT)。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案成功获得一种快速促进损伤组织修复重组人源化Ⅲ型胶原蛋白序列；同时采用反向设计基因序列，并经密码子优化，获得适合原核生物表达的基因序列；采用酶切技术，选用适合目的蛋白表达的最优表达质粒；并经优化发酵培养表达获得高表达体系；采用双系统亲和层析，获得安全、有效的重组III型目的蛋白，同时，经试验验证，该重组人源胶原蛋白在细胞水平上，具有良好的促进细胞增殖、迁移和粘附能力；在体损伤组织上，具有促进修复、以及抗瘢痕生长的能力，结构表征分析表明III型重组人源胶原蛋白富含亲水性氨基酸残基，具有人Ⅲ型胶原蛋白的结构表征与活性。同时，上述技术方案利用原核发酵蛋白质表达系统，非常适合进行工业化大规模生产，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中将重组质粒转入感受态大肠杆菌DH5α的平板图。

图2为本发明实施例1中重组质粒通过琼脂糖电泳图谱；1：Maker；2：目的质粒。

图3为本发明实施例1中转化成功重组基因工程菌平板图。

图4为本发明实施例1中诱导表达优化结果；其中，A为不同温度诱导4h，1：16℃、2：25℃、3：30℃、4：35℃；B为不同温度诱导12h，1：16℃、2：25℃、3：30℃、4：35℃；C为不同温度诱导24h，1：16℃、2：25℃、3：30℃、4：35℃。

图5为本发明实施例1中纯化目的蛋白，1：蛋白Maker、2：纯化目的蛋白。

图6为本发明实施例2中纯化目的蛋白外观。

图7为本发明实施例3中重组胶原蛋白CD图谱。

图8为本发明实施例3中重组胶原蛋白DSC图谱。

图9为本发明实施例3中标准品胶原蛋白DSC图谱。

图10为本发明实施例3中重组胶原蛋白红外光谱图图谱。

图11为本发明实施例4中不同浓度重组胶原蛋白对细胞增殖能力影响图；其中，①中重组胶原蛋白浓度为0.2mg/mL；②中重组胶原蛋白浓度为2mg/mL；③中重组胶原蛋白浓度为4mg/mL；④中重组胶原蛋白浓度为8mg/mL；⑤为对照上市产品。

图12为本发明实施例4中处理0h、24h的显微观察图片；A：空白对照，B：重组胶原蛋白，C：上市产品对照。

图13为本发明实施例4中不同材料对HacaT细胞迁移率影响。

图14为本发明实施例5中不同处理对大鼠皮肤修复影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种重组人源胶原蛋白，所述重组人源胶原蛋白选自：

(a1)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白质；

上述(a1)–(a3)中所示蛋白质可以人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达获得。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种核酸分子，所述核酸分子能够编码上述重组人源胶原蛋白。

(b1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

需要说明的是，术语“同一性”指与氨基酸/核苷酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述80％以上同一性，可以为80％、85％、90％、95％或99％以上的同一性。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA等，在此不做具体限定。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述核酸分子。

所述重组表达载体通过上述核酸分子有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌粒、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体、噬菌体P1衍生的载体、酵母人工染色体或哺乳动物人工染色体；进一步优选为质粒；所述质粒包括PET26b质粒。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述重组表达载体或染色体整合上述核酸分子或者能够表达上述重组人源胶原蛋白。

所述宿主细胞包括细菌细胞和真菌细胞；优选为细菌细胞；

所述细菌可以为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属中的任意一种或多种。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述细菌包括但不限于大肠杆菌(如BL21(DE3))、根癌农杆菌(如GV3101)、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或荧光假单胞菌；优选为大肠杆菌。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种上述重组人源胶原蛋白的制备方法，包括：培养上述宿主细胞，从而表达出所述重组人源胶原蛋白；以及分离纯化所述重组人源胶原蛋白。

其中，所述纯化方法包括但不限于盐析法、超滤法、亲和层析法和凝胶过滤层析法；优选亲和层析法，进一步优选为Ni-IDA亲和层析法。

本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括对分离纯化后的重组人源胶原蛋白进行冷冻干燥处理。其安全无热原无菌，具有促损伤修复等性能。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述重组人源胶原蛋白在制备食品、药品、医疗器械或日化用品中的应用。

所述食品可以是固体食品或液体食品，在此不做具体限定。

所述药品可以单位剂量形式给药，液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型等。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、丸剂、粉剂、乳剂、颗粒剂等。

所述医疗器械可以是药械组合产品，所述药械组合产品系指由药品与医疗器械共同组成，并作为一个单一实体生产的产品。所述药械组合产品的一个具体实施方式可以为含有上述重组人源胶原蛋白的外用敷料。

所述日化用品可以为个人卫生清洁剂和化妆品等，在此不做具体限定。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种医疗器械，所述医疗器械至少包含上述重组人源胶原蛋白。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述重组人源胶原蛋白或医疗器械在如下任意一种或多种中的应用：

(c1)制备促进细胞增殖、迁移和/或粘附的产品；

(c2)制备促进伤口愈合和/或抗瘢痕的产品。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1制备重组胶原蛋白

1.设计人源化Ⅲ型胶原蛋白特异序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：

SEQ ID NO:1：

GPQNYSPQYDSYDVKSGVAVGGLAGYPGPAGIPGFPGMKGHRGFDG

RNGEKGPRGAPGERGRNGLPGAAGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGA

PGKNGERGAPGAPGGKGDAGAPGERGSPGERGEPGGKGERGAPGE

KGVKGERGSPGGPGAAGFPGARGLPGVKGESGKPGANGLSGERGAAGIKGHRG FPGNPGAPGSP

2.根据人源化Ⅲ型胶原蛋白序列SEQ ID NO:1反向设计基因序列，进行密码子优化，获得适合原核生物表达的基因序列SEQ ID NO:2，进行基因合成。

SEQ ID NO:2：

GGACCGCAGAATTATAGCCCGCAGTATGATAGTTATGATGTGAAAA

GTGGCGTGGCCGTGGGTGGTCTGGCCGGTTATCCGGGCCCGGCAG

GTATTCCGGGCTTTCCGGGCATGAAAGGCCATCGTGGTTTTGATGG

TCGCAATGGCGAAAAAGGCCCGCGCGGCGCACCGGGTGAACGTG

GTAGAAATGGCCTGCCGGGTGCAGCAGGTGAACGCGGTGCACCG

GGCTTTCGTGGTCCGGCAGGTCCGAATGGCATTCCGGGTGAAAAA

GGTGCACCGGGTAAAAATGGTGAACGTGGCGCACCGGGCGCACC

GGGAGGTAAAGGTGACGCAGGCGCACCGGGGGAACGTGGTAGTC

CGGGTGAACGCGGCGAACCGGGCGGTAAAGGTGAACGCGGAGCC

CCGGGCGAAAAAGGTGTGAAAGGCGAACGTGGCAGTCCGGGCG

GTCCGGGTGCTGCAGGTTTTCCGGGTGCCCGCGGTCTGCCGGGTG

TGAAAGGTGAAAGTGGTAAACCGGGTGCAAATGGTCTGAGCGGT

GAACGTGGAGCAGCAGGTATTAAGGGTCATCGTGGCTTTCCGGGT

AATCCGGGCGCACCTGGCAGCCCTTAA

3.将步骤2中优化后的人源化Ⅲ型胶原蛋白基因序列插入到PET26b质粒的酶切位点NdeI和XhoI之间，通过热激方法转化到感受态大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆(图1)，提取重组质粒，通过琼脂糖电泳进行验证，如图2所示。

4.将步骤3中获得的重组质粒通过热激法注入感受态细胞BL21(DE3),筛选获得重组基因工程菌(图3)。

5.诱导表达：将获得的重组基因工程菌接入LB培养基中，37℃培养过夜扩增活化；再将过夜扩增活化目的菌以2％的接种量接种到LB培养基中，37℃继续培养2h；加入终浓度为0.02mM诱导剂IPTG进行诱导表达，不同时间不同温度下诱导表达的表达量如图4所示，最终确定最佳诱导表达条件为：25℃，培养12h；离心收集菌体。

6.分离纯化目的蛋白：选用Ni-IDA亲和层析。

7.真空梯度冻干：-50℃：2h；-20℃：2h；-5℃：20h；10℃：2h；20℃：2h。

实施例2制备重组胶原蛋白理化性能

按照实例1制备重组胶原蛋白，检测其理化性能如下：

1.外观

用肉眼直接观察，结果：白色海绵状，如图6。

2.可见异物

按照《中华人民共和国药典》“可见异物检查法”的第一法“灯检法”进行检测。结果：无可见异物。

3.水溶解性

称50mg样品，溶解于25℃±2℃100μL的水溶液中，每隔5min强力振摇30s；观察30min内的溶解情况，无目视可见的溶质颗粒或液滴时，完全溶解。结果：目的蛋白水溶解性为50％(m/v)。

4.水分

取样品1.0g，按照YY/T1849-2022中5.2.4中描述的方法进行检测。结果：目的蛋白水分含量为1.3％。

5.炽灼残渣

取样品1.0g，按照《中华人民共和国药典》“炽灼残渣检查法”进行检测。结果：炽灼残渣含量为0.32％。

6.酸碱度

样品用生理盐水稀释为1mg/mL按照《中华人民共和国药典》“pH值测定法”进行检测。结果：pH为7.0。

7.总蛋白含量

总蛋白含量的测定按照YY/T1849-2022中5.6描述的方法进行检测。结果：总蛋白含量为99％。

8.杂质、污染物和添加剂

8.1外源性DNA残留量

按照YY/T 1849-2022中5.5.2描述的方法进行检测。结果：外源性DNA残留量0.5ng/mg。

8.2大肠杆菌蛋白质残留量

按照《中华人民共和国药典》“大肠埃希菌菌体蛋白质残留量”测定法或采用经验证的酶联免疫试剂盒进行检测。结果：大肠杆菌蛋白质残留量0.04％。

8.3重金属总量和微量元素含量

8.3.1重金属总量

按照《中华人民共和国药典》“重金属检查法”进行重金属总量检测。按照《中华人民共和国药典》“原子吸收分光光度法”进行微量元素含量检测。结果：微量元素含量：砷0.1μg/g，汞0.3μg/g，铅0.2μg/g，铬、镉、铜、铁、汞、镍、钼总量10μg/g。重金属总量(以铅Pb计)应不大于10μg/g。

8.4残余抗生素含量/活性

工艺中使用卡那霉素，其残余含量可按照《中华人民共和国药典》“免疫化学法”的“酶联免疫吸附法”进行试验。结果：无卡那霉素残留。

8.5无菌

按照《中华人民共和国药典》“无菌检查法”进行检测。结果：无菌。

8.6细菌内毒素

按照《中华人民共和国药典》“细菌内毒素检查法”进行检测。结果：小于0.5EU/g。

实施例3制备重组胶原蛋白结构表征

1.圆二色(CD)光谱

胶原的CD谱图在195nm附近的波长处有负峰，在221nm附近的波长处有正峰。提示有三螺旋结构。

方法：待测样品制备：称取5mg供试品，置于10mL容量瓶，加入0.5％醋酸(HAc)溶液，定容至10mL混合均匀，配制成浓度为0.5mg/mL胶原溶液，10000r/min离心5min，取上清液备用。

检测条件：取配制后供试品溶液，加入石英比色皿，置于CD光谱仪上进行检测。具体参数为：检测温度：20℃；样品池光径：1mm；扫描范围：180nm～260nm；扫描波长：0.1nm；扫描速度：120nm/min。使用0.5％醋酸(HAc)溶液作为参比。

结果：目标蛋白CD谱图在195nm附近的波长处有负峰，在221nm附近的波长处有正峰，证明目标蛋白有三螺旋结构。

2.微量差热分析(DSC)

胶原蛋白的三螺旋结构的特征表现出特定的吸收峰，如果检测不到特征峰则提示供试品中没有三螺旋结构。采用组织提取胶原蛋白国家医药标准物质作为对照品，测定目标蛋白DSC吸收峰。方法：称取2mg样品，置于差示扫描量热仪(DSC)样品池进行测量，温度扫描区间为25℃～200℃，升温速率为(1℃～10℃)/min，取峰值作为热变性温度。结果：目的蛋白热变形温度峰值为81.2℃(图8)，对照(天然胶原蛋白)为85.4℃(图9)，证明目标蛋白具有三螺旋结构。

3.红外光谱

按照《中华人民共和国药典》“红外分光光度法”进行检测。将样品研磨后常规压片，用傅里叶变换显微红外光谱仪在400～4000(cm^-1)范围内进行红外光谱扫描。

结果：经红外光谱分析，样品的红外光谱特征峰应具有I型胶原蛋白的红外光谱特征峰：3488cm^-1～3188cm^-1、3102cm^-1～3062cm^-1、2985cm^-1～2915cm^-1、1667cm^-1～1627cm^-1，1548cm^-1、1452cm^-1、1402cm^-1、1338cm^-1、1238cm^-1，未给出范围的波数值，其变化值不应超过1％。见图10。

实施例4制备重组胶原蛋白促细胞增殖迁移粘附能力试验

1.不同浓度重组胶原蛋白对细胞增殖能力影响

重组胶原蛋白配置浓度：将重组胶原蛋白溶于DMEM细胞培养液(2％ FBS)中，①0.2mg/mL；②2mg/mL；③4mg/mL；④8mg/mL；同时以上市产品作为对照；DMEM细胞培养液(2％FBS)的溶液中收集生长状态良好的L929细胞，用DMEM细胞培养液(2％ FBS)制备细胞悬液(Ⅰ)，调整细胞浓度为1×10⁵个细胞/mL，分别取500μL细胞悬液(Ⅰ)加入到500μL试验样品①～④和⑤阴性对照DMEM细胞培养液(2％ FBS)的溶液中，混匀，于96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液(5×10³个细胞/孔)。置于细胞培养箱(5％ CO₂，37℃)中培养24h。在显微镜下观察各个板孔的细胞增殖情况，拍照记录。并采用CCK-8法检测细胞活性，每孔加入100μL CCK-8溶液，在细胞培养箱中继续培养1h，在显微镜下观察每个板孔的细胞形态，震荡平板后，用酶标仪测定450nm波长下吸光度，按下式计算细胞存活率(％)。

细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％

As：试验样品组吸光度；

Ac：阴性对照组吸光度；

Ab：CCK-8溶液吸光度。

实验结果：显微镜下观察细胞生长状态：不同浓度重组胶原蛋白与对照相比，形态和生长密度相同，见图11。

表1不同浓度重组胶原蛋白对人角质化细胞增殖能力影响结果

结果表明：不同浓度重组胶原蛋白均具有促进人角质化细胞增殖能力，其增殖能力与上市对照产品无差异。

2.重组胶原蛋白对细胞迁移能力影响

检测重组胶原蛋白对人正常皮肤永生化角质形成细胞(HacaT)的生长迁移能力的影响。本实施例按行业标准YY/T 1849-2022《重组胶原蛋白》的细胞划痕法进行。

2.1试验步骤：用marker笔在6孔板背后每孔横向三等份划线做记号。收集生长状态良好的HacaT细胞并用DMEM细胞培养液制备细胞悬液，调整细胞浓度为3.5×10⁵个细胞/mL，于6孔细胞培养板中加入2mL细胞悬液(每孔7×10⁵个细胞)。置于细胞培养箱(5％ CO₂，37℃)中孵育至达到95％～100％汇合状态。用10μL枪头比着直尺垂直对准孔板，向下轻推纵向划线形成划痕，用PBS漂洗细胞3次，去除划掉的细胞，分别在样品组和空白组加入2mLDMEM培养基配制的试验样品液和空白对照液，在细胞培养箱(5％CO₂，37℃)中培养，于0h、24h后，以横向和纵向划线的交点为核心，在40×显微镜下拍照，每孔获得9个部位的照片，每组合计27个数据。

测量划痕区面积，并通过固定划痕区移行细胞的总面积除以固定划痕区初始面积，计算每组细胞迁移率。使用Image J分析处理各组的细胞迁移面积。使用GraphPadPrism进行统计学分析，如果P值小于0.05则认为两组之间存在显著差异。

2.2HacaT细胞观察结果：当细胞生长至95％～100％汇合状态时，进行细胞划痕，并在显微镜下观察细胞划痕初始面积，拍照记录。细胞划痕处理24h后，再次在显微镜下观察划痕处的细胞迁移面积，拍照记录，结果见图12。

结论：HacaT细胞迁移率计算结果见图13，在本次试验条件下，与空白对照组相比，重组胶原蛋白组和上市产品对照组对HacaT细胞迁移率显著增加(P＜0.0001)，而组胶原蛋白组和上市产品对照组组间无显著性差异，但重组胶原蛋白组优于上市产品对照组。

3.重组胶原蛋白对细胞粘附性测定

步骤：

(1)试验样品试验液包被：包被两个板，一个96孔板内加入100μL PBS(6孔)作为0h观察点，向另一个96孔板内分别加入100μL重组胶原蛋白0.5mg/mL(5孔)、上市对照产品0.5mg/mL(5孔)、PBS(5孔)，样品使用PBS溶解，在培养箱(5％CO₂，37℃)孵育4h，从孔中除去多余的包被溶液，加入100μL 1％ BSA-PBS溶液，在培养箱(5％CO₂，37℃)孵育1h，移除孔内液体后，用PBS洗涤三次，弃除清洗液，用封口膜密封后置于4℃备用。

(2)将NIH/3T3细胞于37℃，5％ CO₂细胞培养箱中培养，细胞生长至培养瓶的80％～90％时，进行细胞接种，使用完全培养基将细胞稀释至5×10⁴/mL。将100μL细胞加入已包被的孔中，并在37℃，5％ CO₂下孵育1h。

(3)将50μL CCK-8(终浓度5％，使用MEM+2％FBS+1％P/S进行溶解)溶液加到第一板试验孔中，第二板细胞使用PBS冲洗3次，将50μL CCK-8(终浓度5％，使用MEM+2％FBS+1％P/S进行溶解)溶液加到第二板试验孔中。继续培养1h后，在酶标仪450nm波长下测定吸光度，按下式计算存活率。

式中：OD_450e——试验样品试验液光密度平均值；

OD_450b——介质对照液光密度平均值。

结果：

表2HacaT细胞粘附性计算结果

结论：本实施例制备的重组胶原蛋白对细胞的粘附能力优于已上市对照品。

实施例5制备重组胶原蛋白促伤口愈合、抗瘢痕性能试验

在大鼠臀部处作三道切口，左右和中线，中线采用重组胶原蛋白制备的粘性材料粘接伤口，左侧缝合后涂抹上市产品，右切口采用可吸收缝合线缝合后不做处理，观察伤口愈合情况(见图14)。

结果：重组胶原粘合伤口未出现瘢痕增殖，大鼠皮肤无痕恢复，上市产品有少量瘢痕，只做缝合处理组瘢痕明显。

本发明未尽事宜为公知技术。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白选自：

(a1)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白质；

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述重组人源胶原蛋白；

进一步的，所述核酸分子具有(b1)–(b4)中任一所述核苷酸序列：

(b1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述核酸分子；

进一步的，所述重组表达载体通过所述核酸分子有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌粒、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种；进一步优选为质粒；所述质粒包括PET26b质粒。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述重组表达载体或染色体整合权利要求2所述核酸分子或者能够表达权利要求1所述重组人源胶原蛋白。

5.如权利要求4所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括细菌细胞和真菌细胞；优选为细菌细胞；

进一步的，所述细菌为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属中的任意一种或多种；

更进一步的，所述细菌包括大肠杆菌(包括BL21(DE3))、根癌农杆菌、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或荧光假单胞菌；优选为大肠杆菌。

6.一种权利要求1所述重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括：培养权利要求4或5所述宿主细胞，从而表达出所述重组人源胶原蛋白；以及分离纯化所述重组人源胶原蛋白。

7.如权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述纯化方法包括盐析法、超滤法、亲和层析法和凝胶过滤层析法；优选为亲和层析法，进一步优选为Ni-IDA亲和层析法；

进一步的，所述制备方法还包括对分离纯化后的重组人源胶原蛋白进行冷冻干燥处理。

8.权利要求1所述重组人源胶原蛋白在制备食品、药品、医疗器械或日化用品中的应用。

9.一种医疗器械，其特征在于，所述医疗器械至少包含权利要求1所述重组人源胶原蛋白。

10.权利要求1所述重组人源胶原蛋白或权利要求9所述医疗器械在如下任意一种或多种中的应用：

(c1)制备促进细胞增殖、迁移和/或粘附的产品；

(c2)制备促进伤口愈合和/或抗瘢痕的产品；

进一步的，所述细胞为人正常皮肤永生化角质形成细胞。