CN106589137A - 穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白，全长为59个氨基酸，其氮端为穿膜肽序列，碳端为β防御素3成熟肽序列，两肽段之间用2个甘氨酸和1个丝氨酸相连，分子量为6.7KD。制备方法由基因的获得、毕赤酵母表达载体的构建、穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白毕赤酵母基因工程菌的构建、穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵、穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白的纯化步骤组成。穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白在制备杀菌凝胶的用途和制备面膜化妆品的用途以及制备爽肤水化妆品的用途。

Description

穿膜肽-人β防御素3融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到穿膜肽-人β防御素3融合蛋白。
背景技术
抗菌肽(antibacterial peptides)，又称为肽抗生素或称为抗微生物肽，是生物防御系统产生的一类防御外源性病原体的肽类物质。抗菌肽广泛分布于植物、动物、昆虫及人体内，具有较强的抵抗微生物入侵的活性，是机体免疫系统的重要组成部分。人防御素(Defensin)属于抗菌肽家族，是近年来发现的一类新型富含精氨酸的阳离子抗菌多肽，根据其来源及分子内二硫键的连接方式不同，将其分为两大类：α防御素、β防御素，其中β防御素主要存在于人的粘膜、呼吸道等上皮组织细胞，由Harder等人于2001年从牛皮癣患者的皮肤脱落物中分离得到，迄今为止，已经发现和鉴定的人β防御素主要有4种，即β防御素1、β防御素2、β防御素3、β防御素4，与防御素家族其他成员相比，β防御素3具有更广的抗菌谱，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抗菌活性，而且抑菌所需浓度远低于其他人β防御素。对多重耐药菌株，β防御素3也显示出强有力的抗性，更重要的是其抗菌活性受盐浓度影响相对较小，对宿主细胞的毒性很低。此特点使其有望成为一种新型肽类抗菌素。
人β防御素3的相对分子量为5154.7，由1个α螺旋和3个反向平行的β折叠片层组成，另外在氨基末端区域内形成一个短螺旋环。β防御素3的6个半胱氨酸残基形成3个二硫键，二硫键的连接方式为Cysl-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6。二硫键的存在，在一定程度上保持了β防御素3分子的稳定性，增强了其抵抗蛋白酶水解的能力。β防御素3具有两性分子结构，正电荷分布在肽表面两侧，而疏水残基簇生在肽表面的底部。β防御素3分子的疏水性与其抗菌活性密切相关，疏水作用被认为是β防御素3透化细菌细胞膜机制中不可缺少的。
β防御素3在人类先天免疫反应中发挥着重要的作用，大量的研究证实，β防御素3具有显著的抗细菌活性。β防御素3杀灭细菌的关键环节是能在细菌胞膜上形成孔道，从而直接杀灭细菌。体外试验的研究结果表明，β防御素3对革兰阳性菌的最小抑菌浓度为0.4-6.25mg/L，对革兰阴性菌的最小抑菌浓度为1.56-16mg/L，比防御素家族的其他成员，如：β防御素1、β防御素2对细菌的抑菌浓度更低，这是因为β防御素3的结构中含有13个精氨酸和赖氨酸，能够在浓度很低的时候，通过13片层形成对称的二聚体，而β防御素1和β防御素2均为单体结构，所以，β防御素3抑菌活性较β防御素1和β防御素2更强，最小抑菌浓度更低，β防御素3对真菌同样具有抑制作用，但目前对其抑制真菌的作用机制尚不明确。除了细菌、真菌，β防御素3还具有抗包膜病毒的作用，特别是对艾滋病毒的抑制作用受到了广泛的关注。
另有研究表明，β防御素3还可充当黑皮素1受体(melanocortin 1 receptor,MC1R)的配体，与α-促黑素(α-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)竞争性和MC1R结合，呈剂量依赖性降低环磷酸腺苷cAMP水平，抑制酪氨酸酶(tyrosinae,TYR)活性，降低表皮细胞黑素的沉积。
皮肤是人体最大的器官，其结构组成包括最外面的表皮层、中间的真皮层、最底部位于真皮下的皮下组织。在机体防御过程中，它是身体的第一层保护系统，可以阻止外来物理性、化学性、机械性和病原危生物等各种有害物质的侵入，同是也是防止体内水分、电解质等物质扩散至体外的保护层，维持体内稳定的内环境，并且参与机体的新陈代谢，具有重要的生理保护功能。β防御素3以外源蛋白的形式作用于皮肤表面，因皮肤的屏障作用，很难穿过皮肤的表皮层发挥其抑菌及抑制黑色素沉积的作用，阻碍β防御素3的临床治疗研究及应用。
近年来，在生物细胞学研究领域中陆续发现了一些具有细胞穿透功能的氨基酸序列，长度多数小于20个氨基酸，被命名为穿膜肽(Cell-penetrating peptides,CPPs)或蛋白转导域(Protein transduction domains,PTDs)，它们可以携带多种物质，包括亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒性物质等进行细胞间/内的传输，并且不受细胞类型的限制；另外研究发现，穿膜肽携带大分子蛋白在皮肤局部给药时可穿透皮肤真皮层，在细胞生物学、基因治疗学以及药学等领域具有很大的研究价值。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服外源蛋白不易透过皮肤屏障的缺点，提供一种可透皮转运的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种快速、简便的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的制备方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于为穿膜肽-人β防御素3融合蛋白提供一种新用途。
解决上述技术问题采用的技术方案是：穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，全长为59个氨基酸，其氮端为穿膜肽序列，碳端为人β防御素3序列，两肽段之间用二个甘氨酸和一个丝氨酸相连，分子量为6.7KD；该穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的氨基酸序列如下：
1 YARVRRRGPR RGGSGIINTL QKYYCRVRGG RCAVLSCLPK EEQIGKCSTR GRKCCRRKK
其中穿膜肽氨基酸序列为：
1 YARVRRRGPR R
人β防御素3氨基酸序列为：
1 GIINTLQKYY CRVRGGRCAV LSCLPKEEQI GKCSTRGRKC CRRKK
穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的核苷酸序列为：
上述穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的制备方法如下：
1、基因的获得
根据毕赤酵母密码子偏好性，设计并全基因合成穿膜肽-人β防御素3融合蛋白核苷酸序列，并在两端添加限制性内切酶酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ以及pPIC9K载体自身α信号肽切割位点序列AAAAGA，命名为HPH-BD3，其核苷酸序列如下：
2、毕赤酵母表达载体的构建
对载体pPIC9K、HPH-BD3进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接pPIC9K与HPH-BD3，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-HPH-BD3，pPIC9K载体购于美国Invitrogen公司。
3、穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母基因工程菌的构建
将10μg经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-HPH-ASIP质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布最小葡萄糖培养基平板，30℃倒置培养2～3天，将最小葡萄糖培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种于含有遗传霉素(购自于陕西昕泰科技有限责任公司)浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上，30℃培养，筛选高拷贝阳性克隆。
4、穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵
将筛选到的阳性克隆接种于400ml毕赤酵母诱导表达前培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L基础盐培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有基础盐培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度26℃～28℃，pH值为4.5～5.5，溶氧控制在30％～40％，基础盐培养基中的甘油耗尽时，流加质量百分浓度为50％的PTM1微量元素甘油溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甘油溶液的体积比为1:0.25，维持溶氧在30％～40％。发酵液的湿菌重达到200mg/mL时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗尽，流加入浓度为12mL/L的PTM1微量元素甲醇溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甲醇溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵45～52小时。
上述的基础盐培养基由40g甘油、18.2gK2SO4、26.7mlH3PO4、0.93g CaSO4·2H2O、14.9g MgSO4、4.13gKOH，溶解于1000ml去离子水中混合配制成。
上述的PTM1微量元素由6g CuSO4·5H2O、0.08g NaI、3g MnSO4、0.2g Na2MoO4·2H2O、0.02g H3BO3、0.5g CoCl2、20g ZnCl2、65g FeSO4·7H2O、5mL H2SO4、0.2g生物素、溶解于1000ml水中混合配制，过滤除菌制成。
5、穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的纯化
发酵液离心分离，取上清液，用分子截留量为60000D或80000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白粗蛋白浓缩液；用CM Sepharose FF阳离子交换层析，收集洗脱液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，脱盐，超滤脱盐浓缩至洗脱液体积的1/17，用冷冻干燥机冻干，得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，CM Sepharose FF介质购自美国GE公司。
在本发明的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵步骤4中，将筛选到的阳性克隆接种于400ml毕赤酵母诱导表达前培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L基础盐培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有基础盐培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度最佳26℃，pH值最佳为5.5，溶氧为在30％～40％，流加浓度为12mL/L PTM1微量元素的甲醇溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甲醇溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵45～52小时。
在本发明的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的纯化步骤5中，发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用分子截留量最佳为60000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白粗蛋白浓缩液；用CM Sepharose FF阴离子交换层析，CM Sepharose FF介质购自美国GE公司，收集洗脱液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，脱盐,超滤脱盐浓缩至洗脱液体积的1/17，用冷冻机冻干，得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白。
穿膜肽-人β防御素3融合蛋白在制备杀菌凝胶的用途。
穿膜肽-人β防御素3融合蛋白在制备面膜化妆品的用途。
穿膜肽-人β防御素3融合蛋白在制备爽肤水化妆品的用途。
本发明采用穿膜肽的穿膜透皮转运特性，携带人β防御素3，构建穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，同时采用真核表达系统的毕赤酵母表达穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，获得高表达的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，经抑菌实验，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单孢杆菌、粪肠球菌均有抑制作用，并经致敏实验，证明无致敏性，可用于制备杀菌凝胶、制备面膜化妆品、爽肤水化妆品。
附图说明
图1是实施例1的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图2是实施例2制备的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的Western Blot鉴定图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，全长为59个氨基酸，其氮端为穿膜肽序列，碳端为人β防御素3序列，两肽段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸相连，分子量为6.7KD；该穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的氨基酸序列如下：
1 YARVRRRGPR RGGSGIINTL QKYYCRVRGG RCAVLSCLPK EEQIGKCSTR GRKCCRRKK
其中穿膜肽氨基酸序列为：
1 YARVRRRGPR R
人β防御素3氨基酸序列为：
1 GIINTLQKYY CRVRGGRCAV LSCLPKEEQI GKCSTRGRKC CRRKK
穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的核苷酸序列为：
上述穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的制备方法如下：
1、基因获得
根据毕赤酵母密码子偏好性，设计并全基因合成穿膜肽-人β防御素3融合蛋白核苷酸序列，由生工生物工程(上海)有限公司合成，并在两端添加限制性内切酶酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ以及pPIC9K载体自身α信号肽切割位点序列AAAAGA，命名为HPH-BD3，其核苷酸序列如下：
2、毕赤酵母表达载体的构建
(1)载体pPIC9K和HPH-BD3的双酶切
对载体pPIC9K、HPH-BD3进行XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，pPIC9K载体购于美国Invitrogen公司。双酶切体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化2小时，用TIANGEN DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)，按产品说明书步骤，从质量浓度为1.5％琼脂糖凝胶上回收特异性条带。
(2)载体pPIC9K与HPH-BD3的连接
用T4DNA连接酶对上述双酶切回收产物pPIC9K与HPH-BD3进行连接，反应体系如下：
上述连接体系充分混匀后，于16℃连接12小时。
(3)载体pPIC9K与HPH-BD3连接产物的转化
取冷冻的DH5α感受态细胞一管100μL，放于冰上解冻，加入上述连接产物，手指轻弹使其混合，在冰中放置30分钟，42℃水浴热激90秒，将管转移到冰浴中，使细胞冷却2～3分钟，加入800μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃温育50分钟，吸取100～200μL，涂于含浓度为50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上，将固体LB平板倒置于37℃培养箱中，培养12～18小时，挑选单菌落接种于含浓度为50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，摇床37℃过夜培养，用TIANGEN质粒小提试剂盒(离心柱型)按操作说明书提取质粒，质粒命名为pPIC9K-HPH-BD3，测序鉴定。
3、穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母基因工程菌的构建
(1)毕赤酵母电转化
对pPIC9K-HPH-BD3质粒进行SalⅠ线性化，反应体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴反应5小时，终止反应前先取出5μL以质量百分浓度为1.0％琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全，用TIANGEN DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)对线性化质粒进行回收。
取10μg上述SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-HPH-BD3质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布最小葡萄糖培养基平板，30℃倒置培养2～3天，在最小葡萄糖培养基平板上长出菌落。
(2)多拷贝插入重组子的筛选
将最小葡萄糖培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到遗传霉素浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上，30℃培养，筛选获得转化子。
4、穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵
将筛选到的转化子接种于400ml毕赤酵母诱导表达前培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L基础盐培养基的5L发酵罐中，温度设定为30℃，pH值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有80L基础盐培养基(基础盐培养基由40g甘油、18.2gK2SO4、26.7mlH3PO4、0.93g CaSO4·2H2O、14.9g MgSO4、4.13gKOH，溶解于1000ml去离子水中混合配制成；)的150L大罐发酵。发酵过程中，生长温度30℃，诱导温度27℃，pH值为5.0，溶氧控制在30％～40％，基础盐培养基中的甘油耗尽时，流加质量百分浓度为50％的PTM1微量元素甘油溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甘油溶液的体积比为1:0.25，维持溶氧在30％～40％。发酵液的湿菌重达到200mg/mL时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗尽，流加入浓度为12mL/L的PTM1微量元素甲醇溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甲醇溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵45～52小时。
上述的PTM1微量元素由6g CuSO4·5H2O、0.08g NaI、3g MnSO4、0.2g Na2MoO4·2H2O、0.02g H3BO3、0.5g CoCl2、20g ZnCl2、65g FeSO4·7H2O、5mL H2SO4、0.2g生物素、溶解于1000ml水中混合配制，过滤除菌制成。
5、穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的纯化
(1)发酵液的固液分离及粗纯
发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液80L，用分子截留量为60000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，通过上述两步超滤法即可去除毕赤酵母发酵产生的色素及一些杂蛋白，获得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白粗蛋白浓缩液。
(2)穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的进一步分离纯化
将穿膜肽-人β防御素3融合蛋白粗蛋白液用CM Sepharose FF阳离子交换层析，CMSepharose FF购于美国GE公司；用3倍柱体积的浓度为20mmol/L、pH为7.5的磷酸盐缓冲液平衡、上样，用10倍柱体积的浓度为1.0mol/LNaCl-磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，脱盐，超滤脱盐浓缩至洗脱液体积的1/17，用冷冻干燥机冻干，得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，表达量达490mg/L。
6、穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的检测及鉴定
(1)穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
1)配制试剂
配制低双丙烯酰胺母液：9.6g丙烯酰胺、0.3g甲叉双丙烯酰胺，溶于20ml水；配制高双丙烯酰胺母液：9.3g丙烯酰胺、0.6g甲叉双丙烯酰胺，溶于20ml水；
配制凝胶缓冲液：2.422g三羟甲基氨基甲烷、0.02g十二烷基硫酸钠，溶于20ml水，盐酸调节pH至8.45；
配制阴极缓冲液：6.06g三羟甲基氨基甲烷+8.89g三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.5g十二烷基硫酸钠，加水至500ml；
配制阳极缓冲液：12.11g三羟甲基氨基甲烷加水溶解，定容至500ml,用质量浓度为2％的盐酸调pH至8.9；
配制固定液：30ml乙醇，0.5ml戊二醛，加水定容至100ml；
配制染色液：0.125g考马斯亮蓝R250、1ml冰醋酸、25ml甲醇，加水定容至100ml；
配制上样缓冲液：2.5ml 1.25M Tris(pH6.8)、1g十二烷基硫酸钠、5ml甘油、0.8g二硫苏糖醇、1ml溴酚蓝，加水定容至10ml；
2)配胶
①按如下体积配制质量百分浓度为16％的分离胶
向玻璃板间灌制5.5ml分离胶，立即覆一层二次蒸馏水，聚合30分钟。
②按如下体积配制质量百分浓度为10％的间隔胶
将分离胶上层的二次蒸馏水倾去，滤纸吸干，灌制1ml间隔胶，聚合30分钟。
③按如下体积配制质量百分浓度为4％的浓缩胶
间隔胶聚合后，灌制3ml浓缩胶，插入样品梳，30分钟后胶即可聚合。
3)电泳
将40μL穿膜肽-人β防御素3融合蛋白浓缩液与10μL上样缓冲液混合，放入水浴锅100℃加热5分钟。在电泳槽底部加入阳极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽，在两块胶之间注入阴极缓冲液，用30V的电压预电泳10分钟，然后上样。当溴酚蓝从间隔胶进入分离胶后，加大电压至90V，继续电泳直至溴酚蓝到达胶底部，断开电源停止电泳，使用固定液固定20分钟，再染色2小时，脱色。电泳结果见图1，图1中所示为纯化前后的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白电泳，与预期结果一致，经灰度值扫描方法检测穿膜肽-人β防御素3融合蛋白中蛋白的纯度，结果在90％以上。
6.2 Western Blot蛋白免疫印迹鉴定
对纯化后的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白进行Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，放入电转移缓冲液(3.03gTris、14.4g甘氨酸、200ml甲醇，加水定容到1000ml)中浸泡20分钟，同时浸泡6张滤纸、聚偏氟乙烯膜，从负极到正极:三层滤纸-凝胶-聚偏氟乙烯膜-三层滤纸，恒流300mA，电转移1小时。将聚偏氟乙烯膜用去离子水漂洗干净，将聚偏氟乙烯膜浸泡于含质量百分浓度为5％的牛血清白蛋白的Tris-HCl缓冲溶液(1.21g三羟甲基氨基甲烷、8.8g氯化钠，加800ml水溶解后，用盐酸调pH至7.5，再加水定容至1L) 缓冲液中，室温封闭l小时，加入来源于兔的多克隆抗体(一抗与Tris-HCl缓冲溶液的体积比为l:500)，4℃过夜，以TBST(1L TBS中加入0.5ml吐温20)洗膜4次，10分钟/次，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(二抗与Tris-HCl缓冲溶液的体积比为l:1000)，37℃孵育l小时，以TBST洗膜4次，底物二氨基联苯胺显色。Western Blot鉴定结果见图2，在图2中，在6.7KD处有显色反应，出现特异性条带，与穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的分子量一致，结果表明，通过上述制备方法所制备的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，能与人β防御素3蛋白抗体产生免疫反应性，说明获得的是正确穿膜肽-人β防御素3融合蛋白。
实施例2
本实施例的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵步骤4为：将筛选到的转化子接种于400ml毕赤酵母诱导表达前培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L基础盐培养基的5L发酵罐中，温度设定为30℃，pH值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有80L基础盐培养基(基础盐培养基由40g甘油、18.2gK2SO4、26.7mlH3PO4、0.93g CaSO4·2H2O、14.9g MgSO4、4.13gKOH，溶解于1000ml去离子水中混合配制成；)的150L大罐发酵。发酵过程中，生长温度30℃，诱导温度26℃，pH值为4.5，溶氧控制在30％～40％，基础盐培养基中的甘油耗尽时，流加质量百分浓度为50％的PTM1微量元素甘油溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甘油溶液的体积比为1:0.25，维持溶氧在30％～40％。发酵液的湿菌重达到200mg/mL时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗尽，流加入浓度为12mL/L的PTM1微量元素甲醇溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甲醇溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵45～52小时。该步骤的其它步骤与实施例1相同。
其它步骤与实施例1相同。
实施例3
本实施例的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵步骤4为：将筛选到的转化子接种于400ml毕赤酵母诱导表达前培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L基础盐培养基的5L发酵罐中，温度设定为30℃，pH值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有80L基础盐培养基(基础盐培养基由40g甘油、18.2gK2SO4、26.7mlH3PO4、0.93g CaSO4·2H2O、14.9g MgSO4、4.13gKOH，溶解于1000ml去离子水中混合配制成；)的150L大罐发酵。发酵过程中，生长温度30℃，诱导温度28℃，pH值为5.5，溶氧控制在30％～40％，基础盐培养基中的甘油耗尽时，流加质量百分浓度为50％的PTM1微量元素甘油溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甘油溶液的体积比为1:0.25，维持溶氧在30％～40％。发酵液的湿菌重达到200mg/mL时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗尽，流加入浓度为12mL/L的PTM1微量元素甲醇溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甲醇溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵45～52小时。该步骤的其它步骤与实施例1相同。
其它步骤与实施例1相同。
实施例4
在以上的实施例1～3的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的纯化步骤5为：
(1)发酵液的固液分离及粗纯
发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液80L，用分子截留量为80000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，通过上述两步超滤法即可去除毕赤酵母发酵产生的色素及一些杂蛋白，获得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白粗蛋白浓缩液。
(2)穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的进一步分离纯化
该步骤与实施例1相同。
其它步骤与相应的实施例相同。
实施例5
采用本发明实施例1制备的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白用于制备抗菌凝胶，该抗菌凝胶由下述质量配比的原料制成：
取3.5g羧甲基纤维素钠，加入100ml蒸馏水溶胀过夜，加入20.5g甘油，0.1g聚乙二醇搅拌均匀，121℃灭菌30min,加入28g穿膜肽-人β防御素3融合蛋白搅拌均匀，得到穿膜肽-人β防御素3融合蛋白凝胶剂。
穿膜肽-人β防御素3融合蛋白凝胶剂的稳定性试验
(1)取三批样品各20g置于离心管中，3500r/min,离心30min,凝胶不分层，用同样方法取本品置于50℃恒温箱、4℃冰箱中48h,均无分层现象。
(2)留样观查
取三批样品作留样观查。在室温下放置三个月，凝胶的均匀度、透明度、酸碱度、稠度等均无明显改变且无霉变现象。
穿膜肽-人β防御素3融合蛋白凝胶剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行了抑菌实验，实验情况如下：
配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(蛋白胨1.5％，牛肉膏1％，NaCl 0.5％,琼脂1.8％，水100ml)，高压蒸汽灭菌，在超净工作台中倒平板，待平板凝固，取培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠埃希氏菌ATCC25922、铜绿假单孢杆菌ATCC15442、粪肠球菌ATCC29212菌液各100μl均匀涂布于表面，取直径3mm的无菌滤纸，浸润穿膜肽-人β防御素3融合蛋白凝胶，放置37℃培养箱中培养24小时。测定各板的抑菌环并记录。实验结果见表1。
表1穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的抑菌实验结果
实验结果表明：穿膜肽-人β防御素3融合蛋白凝胶对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单孢杆菌、粪肠球菌均有抑制作用，出现明显的抑菌圈。
实施例6
采用本发明实施例1制备的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白用于制备面膜化妆品的用途，该面膜化妆品由下述质量配比的原料制成：
制备溶媒：将0.03g分子量为120万道尔顿的透明质酸钠、0.05g分子量为20万道尔顿的透明质酸钠、0.18g羟乙基纤维素加入100mL pH值为7.0、浓度为5mmol/L的磷酸钠缓冲液中，60℃搅拌均匀，向所得混合液中加入0.46g三甲基甘氨酸、4.5mL乳酸钠、4.5mL甘油、3.8mL山梨醇、0.04g乙二胺四乙酸二钠，搅拌均匀，分装，121℃灭菌30分钟，得到溶媒，分装于15mL西林瓶中，每瓶13.5mL，121℃灭菌30分钟。
使用时，取穿膜肽-人β防御素3融合蛋白冻干粉一支5g溶解于一瓶溶媒，用注射器全部吸出，注射到面膜纸上，浸湿面膜纸即可。
实施例7
采用本发明实施例1制备的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白用于制备爽肤水化妆品的用途，该备化妆品由下述质量配比的原料制成：
取0.4g穿膜肽-人β防御素3融合蛋白干粉、0.05g分子量为20万道尔顿的透明质酸钠，2mL甘油、0.02g乙二胺四乙酸二钠、2.5mL山梨醇溶解于100mL去离子水中，调节pH至6.5～7.5，在无菌环境下用孔径为0.22μm的滤膜过滤，分装入洁净无菌的玻璃瓶中保存。使用时，每次0.5mL于化妆棉上，轻拍脸部直至吸收。
为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例2制备的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白进行了致敏性试验，试验情况如下：
受试验物:80mg/ml的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白溶液。
实验动物：健康豚鼠40只，雌雄各半，清洁级，实验开始时体重398±24g。
动物分组:将豚鼠按性别、体重随机分成3组。第一组20只为试验组，给予80mg/ml的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白溶液；第二组10只为阳性对照组，给予20mg/ml的2，4-二硝基氯苯；第三组10只为空白对照组。
试验方法:采用局部封闭涂皮法，试验前24小时用电动剃须刀将豚鼠脊柱两侧去毛，每侧的去毛面积为3cm×3cm。诱发接触：实验第0天取0.5ml穿膜肽-人β防御素3融合蛋白溶液涂在豚鼠左侧脱毛区，用2层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布封闭固定，持续6h，第7天和14天以同样方法各重复一次。空白对照组不予诱发接触，阳性对照组取0.5ml20mg/ml的2，4-二硝基氯苯涂在左侧脱毛区，用2层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布封闭固定，持续6h，第7天和14天以同样方法各重复一次。激发接触：于第28天激发接触，采用与诱发接触同样的方法处理豚鼠右侧脱毛区，6h后去掉受试物，即刻观察，24、48、72h再次观察皮肤过敏反应情况。空白对照组右侧脱毛区给予穿膜肽-人β防御素3融合蛋白溶液，阳性对照组右侧脱毛区给予2％的2，4-二硝基氯苯。
评价指标如下：
一般状况观察：观察动物饮食、排泄、行为活动等变化及其他异常情况。
皮肤反应评分与致敏反应判定见表2、表3。
表2致敏性试验皮肤反应评分表
皮肤反应 积分
红斑和焦痂形成
无红斑 0
轻微红斑(勉强可见) 1
明显红斑(散在或小块红斑) 2
中度～重度红斑 3
严重红斑(紫红色)至轻微焦痂形成 4
水肿形成
无水肿 0
轻微水肿(勉强可见) 1
中度水肿(皮肤隆起轮廓清楚) 2
重度水肿(皮肤隆起约1mm或超过1mm) 3
最高积分 7
轻微水肿(勉强可见) 1
中度水肿(皮肤隆起轮廓清楚) 2
重度水肿(皮肤隆起约1mm或超过1mm) 3
最高积分 7
表3致敏性强度
致敏率(％) 致敏强度
0～8 弱
9～28 轻
29～64 中强
65～80 强
81～100 极强
表4穿膜肽-人β防御素3融合蛋白致敏性试验结果
由表4可见，实验结果表明，试验组与空白对照组在激发接触后24、48、72h均未有皮肤红斑和水肿出现，皮肤刺激反应平均值为0，致敏率为0，穿膜肽-人β防御素3融合蛋白无致敏性。
核苷酸或氨基酸序列表
[0001]
序列表
<110>陕西慧康生物科技有限责任公司
<120>穿膜肽-人β防御素3融合蛋白及其制备方法和应用
<160>4
<210>1
<211>59
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Gly Ser Gly 15
Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly Gly 30
Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Ile Gly 45
Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 59
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 11
<210>3
<211>45
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly 15
Gly Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Ile 30
Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 45
<210>4
<211>198
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CTCGAGAAAA GATACGCTCG TGTTCGTCGC CGTGGTCCAC GTCGCGGTGG ATCCGGTATC 60
ATCAACACTT TGCAGAAGTA CTACTGCAGA GTCAGAGGTG GTCGGTGTGC TGTCCTCAGC 120
TGCTTGCCAA AGGAGGAGCA AATCGGTAAG TGCTCCACCA GAGGTAGAAA GTGCTGCCGA 180
AGAAAGAAGT AAGAATTC 198

Claims (7)

1.一种穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，其特征在于：它的全长为59个氨基酸，其氮端为穿膜肽序列，碳端为人β防御素3序列，两肽段之间用2个甘氨酸和1个丝氨酸相连，分子量为6.7KD，该穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的氨基酸序列为：
1 YARVRRRGPR RGGSGIINTL QKYYCRVRGG RCAVLSCLPK EEQIGKCSTR GRKCCRRKK
其中穿膜肽氨基酸序列为：
1 YARVRRRGPR R
人β防御素3氨基酸序列为：
1 GIINTLQKYY CRVRGGRCAV LSCLPKEEQI GKCSiTRGRKC CRRKK
穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的核苷酸序列为：
2.一种权利要求1穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的制备方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：
(1)基因获得
根据毕赤酵母密码子偏好性，设计并全基因合成穿膜肽-人β防御素3融合蛋白核苷酸序列，并在两端添加限制性内切酶酶切位点Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ以及pPIC9K载体自身α信号肽切割位点序列AAAAGA，命名为HPH-BD3，其核苷酸序列如下：
(2)毕赤酵母表达载体的构建
对载体pPIC9K、HPH-BD3进行Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接pPIC9K与HPH-BD3，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-HPH-BD3；
(3)穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母基因工程菌的构建
将10μg经Sal Ⅰ内切酶线性化的pPIC9K-HPH-BD3质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布最小葡萄糖培养基平板，30℃倒置培养2～3天，将最小葡萄糖培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到遗传霉素浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上，30℃培养，筛选高拷贝阳性克隆；
(4)穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵
将筛选到的阳性克隆接种于400ml毕赤酵母诱导表达前培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L基础盐培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有基础盐培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度26℃～28℃，pH值为4.5～5.5，溶氧控制在30％～40％，基础盐培养基中的甘油耗尽时，流加质量百分浓度为50％的PTM1微量元素甘油溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甘油溶液的体积比为1:0.25，维持溶氧在30％～40％。发酵液的湿菌重达到200mg/mL时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗尽，流加入浓度为12mL/L的PTM1微量元素甲醇溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甲醇溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵45～52小时；
上述的基础盐培养基由40g甘油、18.2gK2SO4、26.7mlH3PO4、0.93g CaSO4·2H2O、14.9gMgSO4、4.13gKOH，溶解于1000ml去离子水中混合配制成；
上述的PTM1微量元素由6g CuSO4·5H2O、0.08g NaI、3g MnSO4、0.2g Na2MoO4·2H2O、0.02g H3BO3、0.5g CoCl2、20g ZnCl2、65g FeSO4·7H2O、5mL H2SO4、0.2g生物素、溶解于1000ml水中混合配制，过滤除菌制成；
(5)穿膜肽-人β防御素3融合蛋白纯化
发酵液离心分离，取上清液，用分子截留量为60000D或80000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白粗蛋白浓缩液；用CM Sepharose FF阳离子交换层析，收集洗脱液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，脱盐，超滤脱盐浓缩至洗脱液体积的1/17，用冷冻干燥机冻干，得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的制备方法，其特征在于：在穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵步骤(4)中，将筛选到的阳性克隆接种于400ml毕赤酵母诱导表达前培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L基础盐培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有基础盐培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度26℃，pH值为5.5，溶氧为在30％～40％，流加浓度为12mL/L PTM1微量元素的甲醇溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甲醇溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵45～52小时。
4.根据权利要求2所述的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的制备方法，其特征在于：在穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的纯化步骤(5)中，发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用分子截留量为60000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白粗蛋白浓缩液；用CM SepharoseFF阴离子交换层析，收集洗脱液，超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，获得穿膜肽-人β防御素3融合蛋白。
5.权利要求1的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白在制备杀菌凝胶的用途。
6.权利要求1的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白在制备面膜化妆品的用途。
7.权利要求1的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白在制备爽肤水化妆品的用途。
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