CN102764273B - 有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物的提纯方法与应用 - Google Patents

Abstract

有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物的提纯方法与应用，涉及一种属于生物医学领域。提供一种具备抗肿瘤的有尾两栖动物新疆北鲵（Ranodon sibiricus）皮肤分泌物的提纯方法与应用。将新疆北鲵皮肤分泌物用双蒸水冲洗并收集，采用抽滤方法去除杂质；将去除杂质的新疆北鲵皮肤分泌物收集液冷冻后，干燥，浓缩，制成新疆北鲵皮肤分泌物干粉；将新疆北鲵皮肤分泌物干粉保存在冰箱中，应用前PBS溶解后用细菌过滤膜过滤除菌，分装后保存于－20℃冰箱备用。所述有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞的生长具有显著的体外抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物的提纯方法与应用

技术领域

本发明涉及一种属于生物医学领域，具体涉及分布于新疆的一种有尾两栖动物——新疆北鲵（Ranodon sibiricus）皮肤分泌物的提纯方法以及该分泌物在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

两栖动物皮肤裸露、潮湿，易受外界环境作用。在长期进化中，该类生物皮肤腺高度进化且发达，其作用除保持身体湿润外，对抵抗微生物、病毒、甚至天敌的侵害至关重要。两栖类皮肤腺几乎遍布周身，可分为三类：粘液腺、颗粒腺、泡状腺，前两类皮肤腺占绝大多数（赖仞等.两栖类皮肤活性肽与活性生物胺[J].大自然探索,1999,18(67):71-74）。粘液腺分布全身体表，分泌出清澈粘液，覆盖在身体表面形成一层湿润的薄膜，具有防御、繁殖、保湿、皮肤呼吸、温度调节、pH调节等作用；颗粒腺作为两栖类特有的一种毒腺，主要分布于背部和尾部（有尾类），研究发现，其分泌物有防御功能，含有复杂的生物活性物质，具有特殊的生理和药理作用，也是作为中药材的物质基础。

上世纪70年代人们开始从两栖类皮肤分泌液中寻找具有药用价值的活性物质，主要以筛选具抗菌及抗肿瘤功效的活性物质为主。其中抗菌肽成为热点研究物质，该类物质是一类氨基酸数量较少的具有抗菌作用的小肽蛋白质，由于不仅具有毒副作用小、热稳定性好、抗菌谱广等特点，而且其抗菌机理不同于普通抗生素，不易产生抗药菌株，有望成为新一代的抗细菌、抗病毒及抗癌药物的新来源（姜丽丽等.蛙类皮肤及其分泌物中生物活性肽的研究进展[J].中国生化药物杂志,2005.26(4):246-249）。美国费城马盖宁制药公司于1990年开始对青蛙皮肤抗菌肽进行结构与分子设计，筛选出一种对病毒和肿瘤细胞均有杀伤作用的小肽MA1-78。两栖类已被认为是一种极有开发前景的药物资源库（Clarke B T.1997.The nature history ofamphibian skin secretions,their normal function and potential medical applications[J].Biol.Rev，72(3):365-379）

新疆北鲵（Ranodon sibiricus）又名中亚北鲵、西伯利亚鲵，隶属两栖纲，有尾目，小鲵科，北鲵属，是新疆产唯一的有尾两栖动物，仅分布在中国新疆和哈萨克斯坦边境地区的西天山分支及阿拉套山一带，栖息地海拔介于2100～3200m的山间泉水小溪中。新疆北鲵的生存条件恶劣：除高纬度、高海拔、高寒等地理气候环境外，在其生活的溪水和岸边有大量枯枝败叶、水绵青苔、腐殖质；不时有牛羊经过饮水，还在其栖息地排下粪便；新疆北鲵越冬也主要栖息在栖息地周围的地下暗泥石流中，这些都是导致微生物繁衍滋生的有利条件，而新疆北鲵在这种环境中生存，并存活至今，其皮肤在适应环境、繁衍进化、抑制微生物滋生等方面起到重要作用。

在人工饲养新疆北鲵时，每当用手抓完新疆北鲵后，其皮肤分泌的粘性物质很难从手上洗去，且保留时间较长。吴敏等（吴敏等.新疆北鲵皮肤组织学观察[J].两栖爬行动物学研究,1995,(4,5):39-42）对新疆北鲵皮肤的组织学进行了观察，结果表明，其皮肤不仅有丰富的粘液腺体，在背、尾部还布满了颗粒腺体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具备抗肿瘤的有尾两栖动物新疆北鲵（Ranodon sibiricus）皮肤分泌物的提纯方法与应用。

所述有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物的提纯方法如下：

1）将新疆北鲵皮肤分泌物用双蒸水冲洗并收集，采用抽滤方法去除杂质；

2）将去除杂质的新疆北鲵皮肤分泌物收集液冷冻后，干燥，浓缩，制成新疆北鲵皮肤分泌物干粉；

在步骤2）中，所述冷冻的条件可为置于－80℃超低温冰箱冷冻24h；所述干燥可采用真空干燥。

3）将新疆北鲵皮肤分泌物干粉保存在冰箱中，应用前PBS溶解后用细菌过滤膜过滤除菌，分装后保存于－20℃冰箱备用。

所述有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞的生长具有显著的体外抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物，尤其是制备抗肺癌、子宫颈癌和肝癌等药物。具体说明本发明实现的药效和潜在效果如下：

1）新疆北鲵皮肤分泌物抑制肿瘤细胞生长的作用：新疆北鲵皮肤分泌物能显著抑制肿瘤细胞A549（人肺癌细胞细胞株）、Hela（人子宫颈癌细胞株）和HepG2（人肝癌细胞株）的生长，抑制上述三种肿瘤细胞的半数致死浓度（LC50）明显小于5-氟尿嘧啶(5-FU)，半数致死浓度分别为：A549细胞7.27μg/ml、Hela细胞9.967μg/ml、HepG2细胞11.29μg/ml。新疆北鲵皮肤分泌物具有较强的肿瘤抑制作用。

2）新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞的抑制作用主要发生在细胞周期的S期：经细胞凋亡流式实验验证，经分泌物样品处理后的肿瘤细胞，在S期凋亡的细胞和碎片数显著高于同样处理的G1期和G2期，也明显高于未经处理的对照组。新疆北鲵分泌物对肿瘤细胞的抑制作用主要发生在肿瘤细胞DNA合成的S期阶段。

3）新疆北鲵皮肤分泌物可破坏肿瘤细胞的细胞膜结构：通过扫描电镜观察，新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞的抑制，通过破坏肿瘤细胞的细胞膜结构，致使细胞质外溢，细胞皱缩，形态结构发生改变，从而导致肿瘤细胞的死亡。

4）新疆北鲵皮肤分泌物对体外培养的人脐带血管内皮细胞生长无明显的抑制作用，说明该分泌物对正常细胞的生长没有明显作用。

附图说明

图1为新疆北鲵皮肤分泌物对Hela肿瘤细胞体外抑制效果（MTT方法）。IC50为肿瘤细胞生长抑制一半时皮肤分泌物浓度；图中数据是，Hela细胞生长抑制一半时皮肤分泌物；横坐标为浓度对数值Concentration log value，纵坐标为抑制率Inhibition ratio。

图2为新疆北鲵皮肤分泌物对A549肿瘤细胞体外抑制效果（MTT方法）。IC50为肿瘤细胞生长抑制一半时皮肤分泌物浓度；图中数据是，A549细胞生长抑制一半时皮肤分泌物浓度为7.27μg/ml、横坐标为浓度对数值Concentration log value，纵坐标为抑制率Inhibition ratio。

图3为新疆北鲵皮肤分泌物对HepG2肿瘤细胞体外抑制效果（MTT方法）。IC50为肿瘤细胞生长抑制一半时皮肤分泌物浓度；图中数据是，HepG2细胞生长抑制一半时皮肤分泌物浓度为11.29μg/ml；横坐标为浓度对数值Concentration log value，纵坐标为抑制率Inhibitionratio。

图4为新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞体外作用效果图。在图4中，C为没有用药的对照组，K为没有细胞的空白组，T1～T6为不同浓度药物作用组；标尺为100μm。

图5为阳性对照药5-FU对肿瘤细胞体外作用效果图。在图5中，C代表没有用药的对照组，K为没有细胞的空白组，T1～T6为不同浓度药物作用组；标尺为100μm。

图6为新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞作用的超微结构图。在图6中，C1，C2，C3分别代表对照组不同倍数扫描电镜图；T1，T2，T3分别代表用药组细胞扫描电镜图；图中下方数据为电镜放大倍数。

图7为正常肿瘤细胞流式细胞分析图。在图7中，横坐标为细胞凋亡组Annexin LOG，纵坐标为死亡的细胞PI LOG。

图8为新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞体外作用流式细胞分析图。在图8中，横坐标为细胞凋亡组Annexin LOG，纵坐标为死亡的细胞PI LOG。

图9为正常肿瘤细胞细胞周期的影响。在图9中，横坐标为细胞数量number，纵坐标为流式细胞通道数据channels；a为细胞碎片Debris，b为聚集Aggregates，c为细胞周期Dip G1，d为细胞周期Dip G2，e为细胞周期Dip S。

图10为新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞细胞周期的影响。在图10中，1/2为半抑制率药物浓度的一半；横坐标为细胞数量number，纵坐标为流式细胞通道数据channels；a为细胞碎片Debris，b为聚集Aggregates，c为细胞周期Dip G1，d为细胞周期Dip G2，e为细胞周期Dip S。

图11为新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞细胞周期的影响。在图11中，用药浓度为半抑制率药物浓度；横坐标为细胞数量number，纵坐标为流式细胞通道数据channels；a为细胞碎片Debris，b为聚集Aggregates，c为细胞周期Dip G1，d为细胞周期Dip G2，e为细胞周期Dip S。

图12为表示新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞细胞周期影响统计分析图。在图12中，表示不同浓度新疆北鲵皮肤分泌物引起肿瘤细胞凋亡和死亡效果与正常对照组差别；纵坐标为百分率，横坐标为不同组别，control代表对照组，IC50/2代表半抑制率浓度一半，IC50代表半抑制浓度；*代表显著性差异，***代表极显著差异。Ns代表物显著差异。

图13为表示新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞细胞周期影响统计分析图。在图13中，代表不同浓度新疆北鲵皮肤分泌物对S期的影响。纵坐标为百分率，横坐标为不同组别，control代表对照组，IC50/2代表半抑制率浓度一半,IC50代表半抑制浓度。*代表显著性差异，***代表极显著差异。Ns代表物显著差异。

图14为新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞作用后光学显微和相应PI染色结果图。在图14中，a：正常肿瘤细胞光学显微镜图；b：肿瘤细胞处理3h后光学显微镜图；c：正常肿瘤细胞PI染色结果；d：肿瘤细胞处理3h后PI染色结果。

图15为新疆北鲵皮肤分泌物对人脐带血管内皮细胞作用后光学显微镜和相应PI染色结果图。在图15中，a：正常人脐带静脉血管内皮细胞光学显微镜图；b：正常人脐带静脉血管内皮细胞细胞处理3h后光学显微镜图；c：正常人脐带静脉血管内皮细胞PI染色结果；d：正常人脐带静脉血管内皮细胞处理3h后PI染色结果。

图16为新疆北鲵皮肤分泌物多肽类SDS-PAGE图。在图16中，170，130，95，72，55，43，34，26，17，10为标准分子量。M为Marker.，1为新疆北鲵皮肤分泌物多肽类。

图17为新疆北鲵皮肤分泌物多肽类不同组分对肿瘤细胞HepG2的体外作用。在图17中，a，b，c，d，e，f分别为6个组分对肿瘤细胞的作用图，g为空白对照组。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

通常，新疆北鲵皮肤分泌物的采集方法是将北鲵用纯化水清洗干净，酒精棉球擦拭，再用超纯水充分冲洗，将北鲵身体置于全封闭的鼠笼中，保留头部露出保持正常呼吸。滴加适量的无水乙醚于容器中，密闭容器3～5min。北鲵皮肤可见白色泡沫状物质和少量的无色液体分泌，可用双蒸水冲洗并收集。

实施例1

所述有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物的提纯方法如下：

1）将收集液置于-80℃超低温冰箱冷冻24h后，进行冷冻真空干燥，浓缩制成干粉。

2）所得干粉可长期保存至-20℃冰箱中，，应用前PBS溶解后用细菌过滤膜过滤除菌，分装后保存于-20℃冰箱备用。

实施例2：新疆北鲵皮肤分泌物抑制肿瘤细胞生长的作用

第一步：分别取Hela细胞，A549细胞和HepG2细胞，培养于37℃、5%CO₂细胞培养箱中，使用DMEM高糖培养基，培养基中含10%胎牛血清和1%双抗。待培养至一定数量后，将对数生长期的肿瘤细胞用0.25%胰蛋白酶消化吹打，制成单细胞悬液，以5×10³个/孔的密度接种于96孔培养板中，在培养箱培养过夜。

第二步：待细胞贴壁后，根据加入不同药物分组为：

阴性对照组：无药物处理。

阳性对照组：5-氟尿嘧啶(5-FU)，浓度为2.5mg/ml依次2倍稀释10个梯度加药物。

用药组：用样浓度从40μg/mL依次2倍稀释10个梯度加药物。

每种药物设5个复孔，另设空白调零孔。

第三步：于细胞培养箱中孵育24h，倒置显微镜下观察。

第四步：每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），继续37℃培养4h。

第五步：终止培养，小心吸去孔内培养液。

第六步：每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪检测490nm处测量各孔的吸光值。结果图1、图2、图3。从图中可以看出，新疆北鲵皮肤分泌物对Hela(图1)，A549(图2)，HepG2(图3)三种肿瘤细胞生长有明显抑制作用。从光学显微水平看出，相同浓度下，新疆北鲵皮肤分泌物（见图4）对肿瘤细胞的抑制效果比阳性对照药5-FU（见图5）效果更显著。

实施例3：新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞的形态改变

第一步：将A549细胞培养于37℃、5%CO₂细胞培养箱中，使用DMEM高糖培养基，培养基中含10%胎牛血清和1%双抗。待培养至一定数量后根据是否加药物分组为：

阴性对照组：无药物处理

用样组：加入药物1μg/mL。

第二步：在药物处理后6h、12h、24h分别夹取对照组和实验组玻片，注意标记好正反面，用0.1M磷酸缓冲液洗净（两次）

第三步：用2.5%戊二醛溶液（PBS配制）室温于通风厨固定2h甚至更长时间。固定完后用0.1M PH7.4磷酸缓冲液和蒸馏漂洗3次，每次10min。

第四步：洗净后用30％，50％，70％，80％，90％，95％，100％，100％乙醇逐渐上升脱水。每级各10min左右，在4℃冰箱中进行，所有的步骤在专用的冷冻干燥杯中进行，整个过程不要暴露空气。然后从乙醇逐步过渡到纯叔丁醇，纯叔丁醇3次，每次10min，4℃过夜结晶。

第五步：送至电镜室冷冻干燥。

第六步：将已干燥好的样品用导电胶粘于金属的样台上，再一起置于真空喷镀仪真空罩中进行喷镀金铂合金镀层。

第七步：扫描电镜观察。

结果见图6。

从扫描电镜观察可以看出：在6h时，即可观察到用药组培养的细胞明显比对照组的细胞凸起和细胞间的裂痕多，细胞变圆，触角明显变少，说明细胞在皱缩；在24h时，用药组出现了细胞脱落的情况；随着时间的推移，用药组细胞间的空隙增大，细胞皱缩变为球形更为明显，附着能力减弱。说明新疆北鲵皮肤分泌物能够破坏体外培养的A549细胞的细胞膜，具有明显的抑制作用。

实施例4：新疆北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞生长周期的影响

第一步：细胞培养，分别取对数生长期的HepG2细胞，制成单细胞悬液，接种于培养皿中，放置37℃、5%CO2细胞培养箱中，使用DMEM高糖培养基，培养基中含10%胎牛血清和1%双抗。

第二步：同步化，12h后加不含FBS的MEM进行同步化12～24h。

第三步：加药物，弃DMEM培养液换等量的培养液并加入加入药物，设对照组：

阴性对照组：无药物处理。

用药组1：加入根据IC50/2加入相对应浓度的药物。

用药组2：加入根据IC50加入相对应浓度的药物。

第四步：收集细胞，加药物培养12h后，用不含EDTA的0.25％胰酶进行消化，离心（2000转5min），用PBS液洗一边，弃上液。

第五步：固定，向10ml试管内加2.5ml盐水G溶液，重新悬浮细胞，然后缓慢加入－20度预冷的70%酒精7.5ml，冰浴30min；4℃，800r/min离心5min弃去固定液，用预冷的PBS重悬，过300目的尼龙网。

第六步：PI单染法，加RNase溶液，37度保温30min，然后冰浴终止酶作用；加PI染液（100ug/ml）闭光染色30min。

第七步：FCM检测细胞周期。

第八步：流式结果分析modfit曲线拟合。

结果见图7。图7为对照组，从图7中可以看出，细胞碎片峰很少，而用药组细胞碎片明显增加，差异显著（P＜0.05）（见图8）。从对细胞周期的影响发现，新疆北鲵皮肤分泌物引起大量的细胞死亡峰，而且这个峰值随着药物浓度的升高而逐渐升高，具有明显的量效关系。见图9～11，用药组与对照组间存在显著差异（P＜0.01）（见图12）。高浓度的药物主要作用于细胞周期的S期（见图13）。

实施例5.新疆北鲵皮肤分泌物对体外正常细胞作用。

第一步：体外培养人肝癌细胞HepG2及人脐带血管内皮细胞（由厦门大学医学院馈赠）

第二步：以皮肤分泌物IC50浓度对两种细胞同时作用，并于不同时间（3h,6h,12h,24h）取出部分细胞进行PI染色，荧光显微镜拍照，比较两者差别。结果见图14和15。

从图14中可以看出，同样用北鲵皮肤分泌物处理，在处理前，肿瘤细胞HepG2生长良好，形状正常（见图14-a），用PI染色只有少量被PI和AnnexiV染色（见图14-c）,经过3h处理后肿瘤细胞形态出现明显变化，变圆（见图14-b），用PI染色可以看到有大量肿瘤细胞的细胞核被PI染为红色，细胞膜被AnnexiV染成绿色。证明细胞出现死亡，（见图14-d）；相反，经过同样浓度北鲵皮肤分泌物处理的人脐带血管内皮细胞经过3h后，细胞也会有一定程度的变化，但用PI和AnnexiV染色后，则着色的很少，与肿瘤细胞相比有明显的差别（见图15-b和15-d）。证明北鲵皮肤分泌物对肿瘤细胞HepG2能够明显影响其生长并促进其死亡，而对正常细胞则没有明显的作用。

实施例6：新疆北鲵皮肤分泌物SDS-PAGE

第一步：灌制12%的分离胶：单块胶的溶液用量为1.8mL 30%聚丙烯酰胺、1.13mL分离胶缓冲液、1.57mL双蒸水、20μL AP、5μL TEMED。加TEMED后立即混匀灌胶，加胶溶液至离短玻璃板顶端约2cm处后停止，然后轻轻加入少量无水乙醇于分离胶上方，将胶压平，与氧隔开，待聚合。一般0.5h左右聚合完毕，这时可见一条明显的胶与无水乙醇的分隔线。倒掉上层无水乙醇，以吸水纸小心吸干残留的乙醇。

第二步：灌制4%的浓缩胶：单块胶的溶液用量为270μL 30%聚丙烯酰胺、0.5mL分离胶缓冲液、1.23mL双蒸水、10μL AP、3μL TEMED，加TEMED后立即混匀灌胶，并插入样品梳(小心斜放插入，然后放平，可避免产生气泡)。放置30min至60min，使胶完全聚合。

第三步：样品处理：将制备好的分泌物蛋白质样品稀释至合适浓度，与5×loading buffer按4∶1的比例混匀，沸水浴5min，12000rpm离心5min。

第四步：电泳：向电泳槽中加入下槽液，把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽中，加入上槽液，上样。下槽中的缓冲液可以多次使用，上槽中的电泳缓冲液必须每次使用新鲜缓冲液。上样，电泳。开始电泳时电压为80V，待溴酚蓝前沿到达分离胶后将电压增加到100V。

第五步：染色：电泳结束后，取下凝胶放入盛有考马斯亮蓝染色液的盒子里，置摇床上轻摇过夜。

第六步：脱色：染色结束后，将染色液回收，加入脱色液脱色，经多次更换脱色液至条带清晰明亮，背景清晰。用清水冲洗两遍。

第七步：扫描拍照。

结果见图16，从图16中可以看出，新疆北鲵皮肤分泌物蛋白主要包括6种多肽，分子量介于26～55kD之间，分别为27kD、28kD、34kD、45kD、50kD、55kD。

实施例7：采用sephacryl S-300分离新疆北鲵（Ranodon sibiricus）皮肤分泌物并鉴定组分活性。

步骤1.按sephacryl S-300说明书步骤对皮肤分泌物进行分离，获得6个组分。

步骤2.分别对6个组分按实施例2方法进行体外活性实验，以HepG2为研究对象。

结果见图17。从图17中可以看出，在所有6个组分中只有组分2（见图17-b），组分3（见图17-c）有明显抑制体外HepG2的作用，其余组分（图17-a,17-d,17-e,17-f）与对照组（17-g）一样均无明显作用。从实施例6中的SDS-PAGE结果可以看出，组分2分子量为45kD，组分3为34kD。

本发明涉及一种有尾两栖动物——新疆北鲵（Ranodon sibiricus）皮肤分泌物的提取及在抗肿瘤中的应用。这些活性肽主要包括6种多肽，分子量介于26～55kD之间，分别为27kD、28kD、34kD、45kD、50kD、55kD。特别涉及该分泌物具备明显的抑制多种肿瘤细胞株的生长作用，但是对正常细胞则效果不明显。可以应用于抗肿瘤药物的制备。

Claims (3)

1.有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述有尾两栖动物新疆北鲵皮肤分泌物的提纯方法包括以下步骤：

1）将新疆北鲵皮肤分泌物用双蒸水冲洗并收集，采用抽滤方法去除杂质；

2）将去除杂质的新疆北鲵皮肤分泌物收集液冷冻后，干燥，浓缩，制成新疆北鲵皮肤分泌物干粉；所述冷冻的条件为置于－80℃超低温冰箱冷冻24h；

3）将新疆北鲵皮肤分泌物干粉保存在冰箱中，应用前PBS溶解后用细菌过滤膜过滤除菌，分装后保存于－20℃冰箱备用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于在步骤2）中，所述干燥采用真空干燥。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于所述肿瘤为肺癌、子宫颈癌和肝癌。

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