CN110386961A

CN110386961A - 一种皮肤修复多肽rl-rl10及其应用

Info

Publication number: CN110386961A
Application number: CN201910805493.9A
Authority: CN
Inventors: 杨新旺; 王滢; 王思媛; 唐璟; 李自良
Original assignee: Kunming Medical University
Current assignee: Hangzhou Facecare Cosmetic Co ltd; Liu Jiaojiao
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2019-08-29
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2039-08-29
Also published as: CN110386961B

Abstract

本发明公开了一种皮肤修复多肽RL‑RL10，所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID No.1。本发明还公开了所述皮肤修复多肽RL‑RL10在制备创面愈合药物、护肤品和化妆品中的应用，具有广阔的应用前景。

Description

一种皮肤修复多肽RL-RL10及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及皮肤修复多肽RL-RL10及其应用。

背景技术

近几十年以来，由于全球人口老龄化的加重、各种疾病（如糖尿病、尿毒症）等因素导致的慢性创口增多，创伤修复仍然是临床中一个相当棘手的问题。鉴于目前对皮肤损伤继发的难愈合性皮肤溃疡尚无有效治疗方法，寻找效果较好的新型促创面愈合（或创伤修复）药物已成为亟待解决的问题。多肽类分子具有高活性、高特异性及高稳定性等特性，已经引起科学家们以及诸多创新药研发公司的广泛重视。目前国内外已经开展了一些创伤修复活性多肽挖掘工作，但是更高效经济的小分子多肽还有待进一步发掘。

两栖动物生活环境极其复杂，裸露的皮肤很容易受到岩石，各种微生物以及强烈的紫外线等因素造成的损伤。为了抵抗这些侵袭，两栖动物进化出了独特且高效的皮肤活性多肽防御系统。根据之前的研究报道，两栖动物皮肤分泌的小分子活性多肽种类极其丰富，且能快速促进自身皮肤修复的特性，因此，两栖动物的皮肤被视为促创伤修复多肽类药物开发潜力的巨大资源宝库。然而，到目前为止，关于两栖动物促创伤修复活性多肽的研究报道还比较有限。而且，我们需要寻找更为高效和经济的小分子肽。因此，积极寻找两栖动物来源的高活性经济型促创伤修复活性多肽是一项很重要的研究工作。

泽蛙(Rana limnocharis Boie , 1834) 隶属于蛙科蛙属,是一种小形的蛙类。它广布于东南亚地区, 数量大, 适应性强, 广泛生活在田野、池泽附近及丘陵地带。我们以泽蛙为研究对象，在其皮肤中找到一种具有高效促创伤修复活性的多肽。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种皮肤修复多肽RL-RL10，所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID No.1。

本发明的第二目的在于提供一种所述皮肤修复多肽RL-RL10在制备促皮肤创面愈合药物中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种所述皮肤修复多肽RL-RL10在制备护肤品中的应用。

本发明的第四目的在于提供一种所述皮肤修复多肽RL-RL10在制备化妆品中的应用。

附图说明

图1皮肤修复多肽RL-RL10促修复活性的动物模型试验结果；

图中，**P<0.01。

图2皮肤修复多肽RL-RL10HaCaT细胞增殖活性检测结果；

图中，* P<0.05,**P<0.01。

图3 皮肤修复多肽RL-RL10HaCaT细胞迁移活性检测结果。

图4 皮肤修复多肽RL-RL10HaCaT细胞划痕修复活性检测结果；

图中，* P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的一种皮肤修复多肽RL-RL10，其氨基酸序列包括SEQ ID No.1。

本发明所述皮肤修复多肽RL-RL10可用于制备促皮肤创面愈合的药物和相关的护肤品和化妆品等；所述的皮肤创面包括由外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温等外部致伤因子或者局部血液供应障碍、疾病等内部因素引起的各种皮肤创面。

本发明所述多肽具有来源天然、成熟肽序列短、高效修复等特点，具有广阔的应用前景。

实施例1：皮肤修复多肽RL-RL10促修复活性的动物模型试验。

准确称取RL-RL10干粉并溶解到生理盐水中，配置成25、50、100 nmol/L的RL-RL10多肽溶液。选取体重22~25 g的SPF级昆明小鼠作为试验对象，将小鼠随机分成4组，每组3只。首先给小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠[剂量：1 µL/ g（体重）]麻醉小鼠，然后将小鼠背部毛剃除干净，并用75%的酒精消毒，最后在小鼠背部两侧用凿孔器凿出两个8 mm×8 mm的对称创面。术后将小鼠放在加热器旁待其醒后放回饲养室继续正常饲养。选择3组小鼠作为处理组，给处理组小鼠的左侧创面涂抹20 μL 1 mg/mL的康复新(KFX)，右侧创面分别涂抹20 μL 的25、50、100 nmol/L的RL-RL10多肽溶液；剩下1组为对照组，两侧创面均涂抹生理盐水(Saline)。每天给创面上药2次，每隔2天拍照记录小鼠背部创面愈合情况，最后通过Image J 软件计算创伤修复率。

结果如图1所示：RL-RL10多肽的促创伤修复活性呈浓度和时间依赖性。小鼠全皮层损伤模型随着时间的增长，创伤逐渐恢复，而3种处理浓度中100 nmol/L组的促愈合效果最好。试验数据显示：生理盐水组的创伤修复率明显低于KFX组和RL-RL10组；100 nmol/LRL-RL10多肽处理组的创伤修复率极显著高于生理盐水（saline）组（P<0.01），所述多肽具有较强的修复活性。

实施例2：RL-RL10多肽的HaCaT细胞增殖活性检测。

将人永生化表皮（HaCaT）细胞在培养瓶中进行培养。待长满后，用胰酶将HaCaT细胞消化下来，离心，弃上清液，用空培养基（不含胎牛血清的细胞培养基）将细胞吹打成细胞悬液，然后将细胞接种在 96 孔板（HaCaT：5000 个/孔, 90 μL）培养 2-4 h。待细胞贴壁后，将96孔板中的细胞分为4组，每组3个孔，分别为对照组、25 nmol/L RL-RL10组、50nmol/L RL-RL10组、100 nmol/L RL-RL10组，在对应的孔中生理盐水和不同浓度的RL-RL10多肽溶液。培养24 h后，使用CellTiter 96® AQueous 单溶液细胞增殖检测试剂盒（Promega, Madison, WI, USA）进行检测。

结果如图2所示：与对照相比，RL-RL10多肽能够显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）地促HaCaT细胞增殖，并且多肽溶液浓度越高，增殖效果越好。

实施例3：RL-RL10多肽的促HaCaT细胞迁移活性检测。

采用24孔培养板和transwell 小室（8 μm孔；Corning，U.S.A.）测试HaCaT细胞的迁移。将HaCaT细胞在培养瓶中进行培养。待长满瓶底时，消化细胞做成细胞密度为2×10⁵个/mL的单细胞悬液，悬浮在DMEM培养液（无血清）中之后细胞被加到每个上室（100μL/孔）中。然后，把细胞分为4个组，每组3个孔，分别为对照组、25 nmol/L RL-RL10组、50 nmol/LRL-RL10组、100 nmol/L RL-RL10组，把生理盐水和不同浓度的RL-RL10多肽溶液加入对应的下室（600 μL/孔），37℃孵育24h。在小室的上表面，仔细地除去非迁移的细胞。用甲醇固定细胞20 min，用0.1%结晶紫染色20 min，洗脱染色细胞，酶标法测定吸收值，测定570nm处的OD值。

结果如图3所示：与生理盐水（saline）对照相比，RL-RL10多肽显著增加了HACAT细胞迁移的数量，并以浓度依赖的方式促进细胞迁移。

实施例4：RL-RL10多肽的HaCaT细胞划痕修复活性检测。

用含10%的胎牛血清和1%双抗（青霉素, 链霉素，100 U/mL）的DMEM/F12（BI,Israel）培养基在细胞培养瓶里培养HaCaT细胞。用 24 孔板做细胞划痕实验，在每孔中接种 2.5 × 10 ⁵个 HaCaT，培养时间约 12–14 h，待每孔的细胞长满，用200 μL枪头（Axygen, USA）在每孔划痕，之后把每孔含有死细胞的培养基弃除，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗每孔2次，分为4个处理组，每组3个孔，分别为对照组、25 nmol/L RL-RL10组、50nmol/L RL-RL10组、100 nmol/L RL-RL10组，在对应的孔中加入生理盐水和不同浓度的RL-RL10多肽溶液（500 μL/孔）。样品溶解在不含胎牛血清的空培养基中。用显微镜（Zeiss,Germany）每隔 12h 拍照记录划痕愈合状况，连续记录 24 h，最后使用 Image J 软件（National Institutes of Health, Bethesda, MD,USA）计算无细胞区域的总的区域面积来评估细胞创伤愈合的百分比。

结果如图4所示：HaCaT细胞在生理盐水（saline）对照组中12小时和24小时内的愈合率分别为19%和39%。100 nmol/L RL-RL10处理组在12h和24h的愈合率分别分别为29%和51%，极显著高于对照组（P<0.001）。RL-RL10以时间和浓度依赖的方式促进细胞划痕修复。

由此可见，本发明所述RL-RL10多肽对皮肤创面具有高效的修复能力，具有广阔的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明医科大学

<120> 一种皮肤修复多肽RL-RL10及其应用

<130> 2019

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Rana limnocharis

<400> 1

Arg Leu Phe Lys Cys Trp Lys Lys Asp Ser

1 5 10

Claims

1.一种皮肤修复多肽RL-RL10，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID No.1。

2.一种权利要求1所述皮肤修复多肽RL-RL10在制备促皮肤创面愈合药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的皮肤修复多肽RL-RL10在制备促皮肤创面愈合药物中的应用，其特征在于，所述创面是由外部致伤因子或者内部因素引起的。

4.根据权利要求2所述的皮肤修复多肽RL-RL10在制备促皮肤创面愈合药物中的应用，其特征在于，所述创面包括急性和慢性创面。

5.一种权利要求1所述皮肤修复多肽RL-RL10在制备护肤品中的应用。

6.一种权利要求1所述皮肤修复多肽RL-RL10在制备化妆品中的应用。