CN105250994A - 一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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陈海佳
王一飞
葛啸虎
黎娟妹
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本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法和应用，本发明的促进皮肤伤口愈合的制剂的原料包括透明质酸、自体纤维母细胞和基质细胞衍生因子-1，用于作为伤口愈合的药物，能够快速愈合伤口，尤其对于大面积烧烫伤患者的创面具有明显的疗效，可以大大减轻患者的痛苦，显著提高患者生活质量，而且该制剂中各原料组分的浓度较低，成本较低。

Description

一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤创伤愈合是皮肤组织受到损伤后的修复过程，修复过程包括炎症反应、细胞增生和新生组织重塑等。炎症反应包括各种细胞因子、白细胞等；细胞新生包括纤维母细胞自体增殖或是间充质细胞分化为纤维母细胞等；组织重塑包括纤维母细胞的有序重排成有一定功能的皮肤组织。由此，纤维母细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分，它与自身分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分一同构成了真皮的主体。纤维母细胞的主要功能是：合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、基质大分子物质和某些生长因子，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用，纤维母细胞的减少也是引起皱纹产生的重要原因。
基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是吸引静息T淋巴细胞、单核细胞以及造血干细胞的趋化因子。在创面发生时，局部产生炎症反应，生成多种细胞因子，其中包括SDF-1因子，对细胞有趋化归巢的作用，使得归巢后的干细胞分化成纤维母细胞，或是归巢的干细胞分泌细胞因子促进血管新生，从而达到修复创面的作用。
透明质酸又名玻尿酸，是一种酸性黏多糖，在与水分子结合后可以形成具有黏弹性的物质。在人体内主要存在于皮肤和结缔组织中，可以作为一种提供细胞埋入的细胞基质物质，除了为体内细胞提供一定体积的外基质外，还可以影响组织的稳定性、结合力和粘弹性。所有天然透明质酸的分子结构都是一样的，几乎没有物质之间和组织特异性的差异，所以纯的透明质酸没有免疫原性。
现有技术中纤维母细胞和透明质酸大多是应用在美容方面，如除去皱纹、填充痘坑等，很少有真正修复创面的产品，基质细胞衍生因子-1大多是应用在监测炎症或是某种疾病中的表达和水平，没有运用到用于修复创面的实际产品中。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种能够快速愈合伤口，尤其对于大面积烧烫伤患者的创面具有明显的疗效，可以大大减轻患者的痛苦，显著提高患者生活质量的促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法。
本发明还提供一种含有基质细胞衍生因子的制剂用于作为伤口愈合的药物的新用途。
本发明通过以下技术方案实现该目的：
一种促进皮肤伤口愈合的制剂，所述制剂的原料包括透明质酸、自体纤维母细胞和基质细胞衍生因子-1，所述各原料的含量为：
透明质酸0.05～1.0v/v％
自体纤维母细胞1.0×105～7.0×106/mL
基质细胞衍生因子-12.0～7.0ng/mL。
作为优选的，所述各原料的含量为：
透明质酸0.1～0.5v/v％
自体纤维母细胞7.0×105～5.0×106/mL
基质细胞衍生因子-13.0～6.0ng/mL。
作为进一步优选的，所述各原料的含量为：
透明质酸0.2v/v％
自体纤维母细胞2.0×106/mL
基质细胞衍生因子-15.0ng/mL。
其中，所述的促进皮肤伤口愈合的制剂为肌注用液剂。
一种促进皮肤伤口愈合的制剂用于作为伤口愈合的药物的新用途。
一种促进皮肤伤口愈合的制剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：自体纤维母细胞的分离培养，制成纤维母细胞悬液，活力85％以上，于2～8℃保存备用；
步骤2：向步骤1制备的纤维母细胞悬液中加入2.0～7.0ng/mL的基质细胞衍生因子-1，以及0.05～1.0v/v％的透明质酸，混合均匀，制得所述制剂，于2～8℃保存备用。
其中，所述步骤1具体为：
1)采集自体皮肤真皮组织置于离心管，在无菌操作条件下用细胞清洗液离心清洗2遍，然后用眼科剪刀剪成1～2mm2的小块，再加细胞清洗液清洗3遍；用Ⅰ型胶原酶置2～8℃消化8～12h，转移置至37℃摇床消化完全；
2)消化完毕后加入培养液离心，弃上清，再加入培养基混匀转移到六孔板培养，每3天换液，实时观察细胞状态并做好记录；在细胞达到70％汇合度时，传代培养，P1代细胞达到80％的汇合度时，传为P2代，P2代汇合度到85％时，收集5.0×105～3.5×107个细胞用5ml生理盐水重悬，至4℃保存待用。
其中，所述细胞清洗液包括D-Hank’s液、青霉素和万古霉素。
其中，所述培养液为包含有10％FBS的DMEM。
其中，所述自体皮肤真皮组织取自耳后或不易碰触到的部位。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的促进皮肤伤口愈合的制剂的原料包括透明质酸、自体纤维母细胞和基质细胞衍生因子-1，用于作为伤口愈合的药物，能够快速愈合伤口，尤其对于大面积烧烫伤患者的创面具有明显的疗效，可以大大减轻患者的痛苦，显著提高患者生活质量，而且该制剂中各原料组分的浓度较低，成本较低。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1。
本实施例的促进皮肤伤口愈合的制剂，所述制剂的原料包括透明质酸、自体纤维母细胞和基质细胞衍生因子-1，所述各原料的含量为：
透明质酸0.05～1.0v/v％
自体纤维母细胞1.0×105～7.0×106/mL
基质细胞衍生因子-12.0～7.0ng/mL。
本实施例的促进皮肤伤口愈合的制剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：自体纤维母细胞的分离培养，制成纤维母细胞悬液，活力85％以上，于2～8℃保存备用；
步骤2：向步骤1制备的纤维母细胞悬液中加入2.0～7.0ng/mL的基质细胞衍生因子-1，以及0.05～1.0v/v％的透明质酸，混合均匀，制得所述制剂，于2～8℃保存备用。
实施例2。
本实施例为在实施例1基础上的进一步优化，所述各原料的含量为：
透明质酸0.1～0.5v/v％
自体纤维母细胞7.0×105～5.0×106/mL
基质细胞衍生因子-13.0～6.0ng/mL。
本实施例的促进皮肤伤口愈合的制剂的制备方法同实施例1，不再赘述。
实施例3。
本实施例为在实施例2基础上的进一步优化，所述各原料的含量为：
透明质酸0.2v/v％
自体纤维母细胞2.0×106/mL
基质细胞衍生因子-15.0ng/mL。
本实施例的促进皮肤伤口愈合的制剂的制备方法同实施例1，不再赘述。
实施例4、自体纤维母细胞的分离培养(小鼠试验)
1)在无菌操作实验室，取出小鼠(购买于广东省医学实验动物中心)，体重为18.0g，用断颈法处死小鼠，选择小鼠较平坦的部位用脱毛膏去除绒毛，用灭菌手术剪刀剪下1×1cm2的皮肤组织块，置于50ml离心管；
2)用细胞清洗液离心清洗2遍，用眼科剪刀剪成1-2mm2小块，再加细胞清洗液清洗3遍；用Ⅰ型胶原酶置4℃消化过夜，第二天转移置至37℃消化完全；
3)消化完毕后加入培养液离心，弃上清，再加入培养基(DMEM+10％FBS)混匀转移到六孔板培养，每3d换液，实时观察细胞状态并做好记录；在细胞达到70％汇合度时，传代培养，P1代细胞达到80％的汇合度时，传为P2代，P2代汇合度到85％时，收集1×107个细胞用5ml生理盐水重悬，至4℃保存待用。
实施例5、促进皮肤伤口愈合的制剂制作
向实施例4制备的纤维母细胞悬液中加入2.0～7.0ng/mL的基质细胞衍生因子-1，以及0.05～1.0v/v％的透明质酸，混合均匀，制得所述制剂，于2～8℃保存备用。
实施例6、有效性试验
1)选取雌雄昆明小鼠各6只(购买于广东省医学实验动物中心)，体重均在20g左右，正常条件饲养一周，随时观察小鼠皮肤状况，以防有皮肤病小鼠；
2)将12只小鼠随机平均分成3组，每组4只小鼠，第一组为试验组，第二组为对照组，第三组为阴性对照组；
3)分别对三组小鼠进行背部绒毛修剪，修剪部位完全裸露出皮肤，用相同的镊子烤红同时进行制造同样大小的伤口，但不对小鼠生长造成威胁；试验组小鼠背部围绕伤口周围给予以上制作好制剂肌注1mL/只/天；对照组小鼠伤口则是一天一次涂抹市场上的烫烧伤皮肤修复膏，阴性对照组不给予任何处理，正常喂食，观察各种小鼠伤口愈合情况一周，试验结果如下表1所示：
表1小鼠伤口愈合情况表
由表1可知：试验组所有小鼠的伤口在第4天基本愈合，对照组小鼠伤口在第4天才开始愈合，而阴性对照组部分小鼠的伤口在第6天愈合，部分溃烂加大。表明本发明的促进皮肤伤口愈合的制剂能够快速愈合伤口，尤其对于大面积烧烫伤创面具有明显的疗效。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种促进皮肤伤口愈合的制剂，其特征在于，所述制剂的原料包括透明质酸、自体纤维母细胞和基质细胞衍生因子-1，所述各原料的含量为：
透明质酸0.05～1.0v/v％
自体纤维母细胞1.0×105～7.0×106/mL
基质细胞衍生因子-12.0～7.0ng/mL。
2.根据权利要求1所述的促进皮肤伤口愈合的制剂，其特征在于，所述各原料的含量为：
透明质酸0.1～0.5v/v％
自体纤维母细胞7.0×105～5.0×106/mL
基质细胞衍生因子-13.0～6.0ng/mL。
3.根据权利要求1所述的促进皮肤伤口愈合的制剂，其特征在于，所述各原料的含量为：
透明质酸0.2v/v％
自体纤维母细胞2.0×106/mL
基质细胞衍生因子-15.0ng/mL。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的促进皮肤伤口愈合的制剂，其特征在于，所述制剂为肌注用液剂。
5.权利要求1～3任意一项所述的促进皮肤伤口愈合的制剂用于作为伤口愈合的药物的新用途。
6.一种促进皮肤伤口愈合的制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：自体纤维母细胞的分离培养，制成纤维母细胞悬液，活力85％以上，于2～8℃保存备用；
步骤2：向步骤1制备的纤维母细胞悬液中加入2.0～7.0ng/mL的基质细胞衍生因子-1，以及0.05～1.0v/v％的透明质酸，混合均匀，制得所述制剂，于2～8℃保存备用。
7.根据权利要求6所述的促进皮肤伤口愈合的制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
1)采集自体皮肤真皮组织置于离心管，在无菌操作条件下用细胞清洗液离心清洗2遍，然后用眼科剪刀剪成1～2mm2的小块，再加细胞清洗液清洗3遍；用Ⅰ型胶原酶置2～8℃消化8～12h，转移置至37℃摇床消化完全；
2)消化完毕后加入培养液离心，弃上清，再加入培养基混匀转移到六孔板培养，每3天换液，实时观察细胞状态并做好记录；在细胞达到70％汇合度时，传代培养，P1代细胞达到80％的汇合度时，传为P2代，P2代汇合度到85％时，收集5.0×105～3.5×107个细胞用5ml生理盐水重悬，至4℃保存待用。
8.根据权利要求7所述的促进皮肤伤口愈合的制剂的制备方法，其特征在于，所述细胞清洗液包括D-Hank’s液、青霉素和万古霉素。
9.根据权利要求7所述的促进皮肤伤口愈合的制剂的制备方法，其特征在于，所述培养液为包含有10％FBS的DMEM。
10.根据权利要求7所述的促进皮肤伤口愈合的制剂的制备方法，其特征在于，所述自体皮肤真皮组织取自耳后或不易碰触到的部位。
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