CN110511280B

CN110511280B - 一种透皮重组纤连蛋白及其应用

Info

Publication number: CN110511280B
Application number: CN201910639291.1A
Authority: CN
Inventors: 温龙平; 钱洁颖
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: CN110511280A

Abstract

本发明公开了一种透皮重组纤连蛋白及其应用。本发明的透皮重组纤连蛋白包括如下氨基酸序列：(Ⅰ)至少一个纤连蛋白的结构域，所述的纤连蛋白的结构域至少包括纤连蛋白的整联蛋白结合结构域；(Ⅱ)连接肽；(Ⅲ)透皮功能短肽序列；其中，所述的(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)的氨基酸序列顺次连接。本发明的透皮重组纤连蛋白不仅有良好的促细胞黏附、伸展及生长效果，与未连接TD‑1短肽的重组纤连蛋白相比透皮能力增强十倍以上，且分子量小，可有效解决DNA重组技术制备纤连蛋白困难，制备得到的纤连蛋白生物活性低的技术缺陷。

Description

一种透皮重组纤连蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种透皮重组纤连蛋白及其应用。

背景技术

纤连蛋白，英文名称fibronectin(英文缩写FN)，是一种高分子量(约440kDa)的细胞外基质的糖蛋白，它与整合素跨膜受体蛋白结合。与整合素相似的是，纤连蛋白结合了细胞外基质成分，如胶原蛋白、纤维蛋白和肝素硫酸盐蛋白聚糖(如多配体聚糖)。纤连蛋白是一种蛋白质二聚体，由两个几乎相同的单体通过一对c末端的二硫键连接而成。每一个纤连蛋白亚基的分子量为230-250kDa，包含三种类型的模体：I型、II型和III型。这三个模体是由两个反向β-折叠导致Beta折叠；但是，I型和II型是通过链内二硫键稳定的，而III型模体不含任何二硫键。III型模体的二硫键的缺失使其在施用力的作用下得以部分展开。纤连蛋白是由单个基因产生的，但它的前体RNA的选择性剪接导致了几种异构体的产生。这些模体沿着纤连蛋白单体的长度被排列成几个功能性的和蛋白质结合的结构域。纤连蛋白有4个蛋白结构域，允许纤连蛋白与其他纤连蛋白分子结合。其中一个纤连蛋白结构域，I1-5，被称为“装配域”，它是建立纤连蛋白基质组装的必要条件。模体III9-10对应于纤连蛋白的“细胞结合域”。RGD序列(Arg-Gly-Asp)位于III10，它是在细胞表面上通过α5β1和αVβ3整合素的细胞附着位点。这个“增效位点”是在III9模体，它可以调节纤连蛋白和α5β1整合素(又称整联蛋白)的增效作用。

纤连蛋白有许多生物学功能，例如对创面愈合和胚胎发育等过程至关重要。细胞纤连蛋白聚集在细胞外基质中，这是一种不溶性的网络，可以分离和支持有机体的器官和组织。纤连蛋白与纤维蛋白在损伤部位沉积，形成血凝块，止血并保护皮下组织其次，在细胞粘附、伸展、生长、迁移和分化过程中起着重要作用。纤连蛋白在医学、美容化妆品以及科研领域有广泛应用及巨大市场，但从人体或动物血液和组织中提取的天然纤连蛋白产量极为有限，成本昂贵。因此限制了FN在很多方面的应用和生产。此外，皮肤表面有一层物质屏障，阻止了绝大多数蛋白类药物通过皮肤，纤连蛋白为蛋白类分子，透皮能力低，因而在皮肤屏障完整或部分完整情形下应用效果不佳。再者，由于纤连蛋白分子太大，DNA重组技术制备纤连蛋白困难，且得到的纤连蛋白生物活性低。

发明内容

本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一种透皮重组纤连蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述透皮重组纤连蛋白的应用。

本发明的目的通过下列技术方案实现：一种透皮重组纤连蛋白，包括如下氨基酸序列：(Ⅰ)至少一个纤连蛋白的结构域，纤连蛋白的结构域至少包括纤连蛋白的整联蛋白结合结构域；(Ⅱ)连接肽；(Ⅲ)透皮功能短肽序列；

其中，所述的(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)的氨基酸序列顺次连接。

优选地，所述的(Ⅰ)至少一个纤连蛋白的结构域的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅰ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的，且功能相同或相似的氨基酸序列。

优选地，所述的(Ⅱ)连接肽为用于构建融合蛋白的连接肽，氨基酸序列如SEQ IDNo:2所示。

优选地，所述的(Ⅲ)功能短肽TD-1的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅱ)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的，且功能相同或相似的氨基酸序列。

上述透皮重组纤连蛋白在制备促进细胞粘附、伸展、生长及促进透皮吸收药物中的应用。

一种编码上述重组纤连蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。

一种遗传构建体，包含重组纤连蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在表达载体中可操作地与一或多个调控核苷酸序列连接。

所述的表达载体优选为pET22b。

一种美容组合物，包含上述透皮重组纤连蛋白。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明截取了纤连蛋白最重要的一部分功能区域，通过连接肽将透皮增强肽TD-1与纤连蛋白连接，得到的透皮重组纤连蛋白具有纤连蛋白的生物学功能及活性，且分子量小，可有效解决DNA重组技术制备纤连蛋白困难，制备得到的纤连蛋白生物活性低的技术缺陷。

2、本发明的透皮重组纤连蛋白既有促进细胞粘附，伸展及生长的能力，同时还具备比单独纤连蛋白强接近十倍的透皮活性。

附图说明

图1是本发明实施例提供的思路设计示意图。

图2是本发明实施例提供的pET22b的说明；其中，a为pET22b的功能区的位置图；b是pET22b的序列图谱。

图3是本发明实施例提供的透皮重组纤连蛋白的目的片段的结构图；其中，1是质粒泳道，2是用MluI/XhoI酶酶切后的质粒泳道，M是DNA Marker。

图4是本发明实施例提供的诱导表达及纯化后的重组纤连蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，a是诱导表达的重组纤连蛋白的SDS-PAGE电泳图；b是纯化后的重组纤连蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图5是本发明实施例提供的内毒素检测的标准曲线。

图6是本发明实施例提供的HaCat细胞的促细胞粘附，伸展及生长的实验结果图。

图7是本发明实施例提供的PC12细胞的促细胞粘附，伸展及生长的实验结果图。

图8是本发明实施例提供的透皮重组纤连蛋白的SD大鼠体外透皮实验结果图。

图9示本发明实施例提供的透皮重组纤连蛋白的SD大鼠体内透皮实验结果图。

图10不同的连接肽连接纤连蛋白与TD-1，比较三者的透皮能力结果图。

图11不同蛋白分子与TD-1重组连接，比较二者的透皮能力结果图；其中，a是TD-1-IFN-Y的透皮能力结果图，b是FN-TD-1的透皮能力结果图。

具体实施方式

下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本发明实施例1为获得透皮重组纤连蛋白目的片段和表达载体(本实施例的表达载体标记为：FN-TD-1)，图1是实施例提供的思路设计示意图。使用商用载体pET22b(CodeNo.VT1200，优宝生物)，见图2(包括pET22b的功能区的位置；pET22b的序列图谱，根据pET22b相关序列位置设计酶切位点；透皮重组纤连蛋白的目的片段的结构)。纤连蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1：IQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSTGSAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT，其核苷酸序列为SEQID No:5：ATCCAGTGGAATGCACCACAGCCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGGTGGAGACCTAAAAATTCTGTAGGCCGTTGGAAGGAAGCTACCATACCAGGCCACTTAAACTCCTACACCATCAAAGGCCTGAAGCCTGGTGTGGTATACGAGGGCCAGCTCATCAGCATCCAGCAGTACGGCCACCAAGAAGTGACTCGCTTTGACTTCACCACCACCAGCACCAGCACAGGATCTGCTGTTCCTCCTCCCACTGACCTGCGATTCACCAACATTGGTCCAGACACCATGCGTGTCACCTGGGCTCCACCCCCATCCATTGATTTAACCAACTTCCTGGTGCGTTACTCACCTGTGAAAAATGAGGAAGATGTTGCAGAGTTGTCAATTTCTCCTTCAGACAATGCAGTGGTCTTAACAAATCTCCTGCCTGGTACAGAATATGTAGTGAGTGTCTCCAGTGTCTACGAACAACATGAGAGCACACCTCTTAGAGGAAGACAGAAAACAGTTTCTGATGTTCCGAGGGACCTGGAAGTTGTTGCTGCGACCCCCACCAGCCTACTGATCAGCTGGGATGCTCCTGCTGTCACAGTGAGATATTACAGGATCACTTACGGAGAAACAGGAGGAAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGGAGCAAGTCTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGAGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTGGCCGTGGAGACAGCCCCGCAAGCAGCAAGCCAATTTCCATTAATTACCGAACA；在纤连蛋白的C端连接有TD-1，且通过连接肽GGGGS连接。TD-1的氨基酸序列为SEQ ID No:3：ACSSSPSKHCG，其核苷酸序列SEQ ID No:6：gcttgtagtagcagcccgagcaaacattgcggt。因此，透皮重组纤连蛋白目的片段的氨基酸序列为SEQ ID No:7：MIQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSTGSAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTGGGGSACSSSPSKHCG，其核苷酸序列为SEQ ID No:4：ATGATCCAGTGGAATGCACCACAGCCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGGTGGAGACCTAAAAATTCTGTAGGCCGTTGGAAGGAAGCTACCATACCAGGCCACTTAAACTCCTACACCATCAAAGGCCTGAAGCCTGGTGTGGTATACGAGGGCCAGCTCATCAGCATCCAGCAGTACGGCCACCAAGAAGTGACTCGCTTTGACTTCACCACCACCAGCACCAGCACAGGATCTGCTGTTCCTCCTCCCACTGACCTGCGATTCACCAACATTGGTCCAGACACCATGCGTGTCACCTGGGCTCCACCCCCATCCATTGATTTAACCAACTTCCTGGTGCGTTACTCACCTGTGAAAAATGAGGAAGATGTTGCAGAGTTGTCAATTTCTCCTTCAGACAATGCAGTGGTCTTAACAAATCTCCTGCCTGGTACAGAATATGTAGTGAGTGTCTCCAGTGTCTACGAACAACATGAGAGCACACCTCTTAGAGGAAGACAGAAAACAGTTTCTGATGTTCCGAGGGACCTGGAAGTTGTTGCTGCGACCCCCACCAGCCTACTGATCAGCTGGGATGCTCCTGCTGTCACAGTGAGATATTACAGGATCACTTACGGAGAAACAGGAGGAAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGGAGCAAGTCTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGAGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTGGCCGTGGAGACAGCCCCGCAAGCAGCAAGCCAATTTCCATTAATTACCGAACAGGTGGTGGTGGCAGCGCTTGTAGTAGCAGCCCGAGCAAACATTGCGGT。

通过PCR扩增的方法扩增透皮重组纤连蛋白目的片段，引物为F1:5'-ATGATCCAGTGGAATGCACCACA-3'和FR1:5'-ACCGCAATGTTTGCTCGGGCTGC-3'；采用快切酶FastDigest MluI(Code No.ER0561,Thermo Fisher Scientific)和FastDigest XhoI(Code No.FD0694,Thermo Fisher Scientific)分别对目的片段与pET22b(+)载体进行反应。反应体系如表1所示。

表1

试剂	使用量(目的片段)	使用量(pET22b(+)载体)
			DNA	10μL(≤0.2μg)	15μL(≤2.5μg)
FastDigest MluI	1.5μL	2.5μL
			FastDigest XhoI	1.5μL	2.5μL
10×FastDigest Buffer	3μL	5μL
			3dH<sub>2</sub>O	14μL	25μL
Total Volume	30μL	50μL

反应体系轻轻混匀后离心，进行反应，反应条件如下：

30℃反应1h后37℃反应1h，双酶切反应结束后，对目的片段与pET22b(+)载体酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，并进行切胶纯化回收(图3)。图3中1为pET22b(+)载体，2为pET22b(+)载体及目的片段酶切产物。从图3中可以看出，本实施例成功构建了透皮重组纤连蛋白载体(pET22b-FN-TD-1，下称FN-TD-1)。

实施例2

本发明实施例2为构建透皮重组纤连蛋白载体(pET22b-FN-TD-1，下称FN-TD-1)，具体步骤如下：

(1)目的片段与pET22b(+)表达载体连接

将实施例1中双酶切纯化回收后的目的片段与pET22b(+)(下称为载体DNA)进行连接，构建重组质粒。连接采用DNA Ligation Kit Ver.2.1连接试剂盒(Code No.6022Q，Takara)，具体操作步骤如下：将实施例1切胶纯化回收的目的片段与pET22b(+)载体DNA混合均匀，制备成体积为10μL的混合液(载体DNA和目的片段的摩尔数比为0.03pmol：0.3pmol)，将混合液于60℃水浴保温2min。向上述混合液中加入等体积的Solution I溶液，混合均匀，置于16℃水浴箱中连接反应16h，得到连接反应液。

(2)转化、涂板培养

取9μL上述连接反应液于1.5mL离心管中，加入1μL Solution III，混匀均匀后立即转化到50μL Trans-T1感受态细胞(Code No.CT101-01，全式金)中，冰上放置30min，于42℃水浴热击45sec，立即冰上静置2min，加入250μL SOC液体培养基，在摇床中37℃、200rpm震荡复苏培养1h。取100μL复苏培养的菌液涂布于含Amp(100ug/mL)的LB固体培养基上，待吸收完全后倒置，于37℃培养箱中培养过夜。挑选白色阳性单菌落及蓝色阴性对照单菌落，接种于4mL含4μL Amp(100mg/mL)的SOC液体培养基中，于37℃、200rpm摇床中震荡培养10h。按照无内毒素质粒小提中量试剂盒(Code No.DP118-02，天根生化科技有限公司)的实验方法提取重组质粒，于-20℃冰箱保存备用。

实施例3

本发明实施例3为重组质粒FN-TD-1的诱导表达及SDS-PAGE电泳鉴定，具体步骤如下：

1、重组质粒FN-TD-1转化到BL21(DE3)感受态细胞：

取1μL实施例2提取的重组质粒FN-TD-1转化到50μL BL21(DE3)感受态细胞中(Code No.9126，TaKaRa)，冰上静置30min，然后42℃水浴热击45sec，立即冰上静置2min，加入250μL SOC液体培养基，在摇床中37℃、200rpm震荡复苏培养1h。取100μL复苏培养的菌液涂布于含Amp(100mg/mL)的LB固体培养基上，待吸收完全后倒置，37℃培养箱中培养过夜。挑选白色阳性单菌落及蓝色阴性对照单菌落，接种于4mL含4μL Amp(100mg/mL)的SOC液体培养基中，于37℃、200rpm摇床中震荡培养10h，得到阳性重组菌液。

2、重组质粒FN-TD-1的诱导表达：

取阳性重组菌液7mL，接种于500mL含有Amp(100μg/μL)的SOC液体培养液中，于37℃、200rpm摇床中震荡培养5h，之后，每隔一小时用紫外分光光度计测定经诱导的阳性重组菌液的OD600，当菌液OD600至0.5时，分别加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，每隔1h取样跑胶检测蛋白的表达情况。

3、诱导表达蛋白SDS-PAGE电泳鉴定：

1)分别取步骤2经诱导的阳性重组菌液和步骤1未诱导的阳性重组菌液，10000rpm、4℃离心15min，弃上清，秤量菌体湿重，沉淀用1×PBS+1％(v/v)吐温洗一遍，10000rpm、4℃离心18min，用1×PBS(pH7.4，0.01M)重悬(湿重的10倍体积)。将悬液中的菌体冰上超声破碎，设定超声条件：总时间为40min，超声时间为2sec，超声停顿时间为1sec，功率65W，超声两次，10000rpm、4℃离心15min，弃上清液，保留沉淀菌体。分别取少量沉淀于1.5mL离心管中，分别加入适量的l×PBS(pH7.4，0.01M)，使沉淀悬浮，分别加入适量5×蛋白上样缓冲液，混合均匀，煮沸10min，分别取10μL样品上样。标准蛋白ProteinRuler IV作为Marker，电流为100mA，电压为100V，进行SDS-PAGE电泳，电泳时间1.5h。

2)染色、脱色：SDS-PAGE电泳结束后，轻轻将蛋白胶块取出，置于摇床上，加入考马斯亮蓝染色液染色1小时，然后加入脱色液脱色15min，倒弃脱色液，更换新的脱色液，反复操作3次，最后脱色过夜。脱色完成后拍照记录(诱导时间梯度图，见图4a)。

从图4a的电泳图可知，随着诱导时间的增加，FN-TD-1蛋白的表达越来越高，在诱导12h时，表达量较高。

实施例4

本发明实施例4为实施例3诱导表达得到的重组纤连蛋白的纯化，包括透皮重组纤连蛋白的变性、复性和纯化，具体步骤如下：

1、包涵体的变性：实施例3步骤3的1)中诱导表达得到的透皮重组纤连蛋白沉淀为包涵体，用8M尿素(pH 7.0)重悬，4℃摇床变性过夜，得到蛋白变性液。

2、蛋白的复性：将蛋白变性液于80000rpm、4℃离心10min，取上清，缓慢加入1倍体积的20mm Tris-Hcl，于pH为7.0、4℃复性过夜，再将1倍体积的复性液(复性液为20mmTris-Hcl(PH 7.0)、2mM的GSH和0.2mM的GSSG)缓慢加入到变性液中，进行再复性过夜，当尿素的浓度为2M时复性结束。

3、纯化：复性后的蛋白过滤膜，除去杂质，过SP柱(杭州纽龙生物科技有限公司)两次，蛋白不挂柱，取流出液再过Q柱(NRPB22L，杭州纽龙生物科技有限公司)2次，去除内毒素，完成纯化工艺。对纯化后的重组纤连蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图4b所示，1、2为实施例3诱导表达的FN-TD-1。本实施例表明，通过SP和Q柱的纯化，得到高纯度的蛋白，其中通过灰度计算FN(制备FN-TD-1过程中同时制备)和FN-TD-1，纯化效率高达99％。

实施例5

本发明实施例5是对实施例4的纯化的重组纤连蛋白的内毒素检测，具体步骤如下：

用金斯瑞公司的ToxinSensorTM内毒素检测试剂盒检测FN(购买的标准品PROSCE-PRO-448)和实施例4的纯化重组纤连蛋白(FN-TD-1)的内毒素。结果如图5和表2所示，图5为内毒素检测的标准曲线图，通过内毒素的标准曲线检测内毒素的实施例4的重组纤连蛋白内毒素含量在0.5EU/mL以下。

表2

样品	吸光度值	内毒素浓度(EU/mL)
			FN(标准品)	1.823	0.4985
实施例4纯化的透皮重组纤连蛋白	1.815	0.4964

实施例6

本发明实施例6是对实施例4中纯化的重组纤连蛋白进行促细胞粘附、伸展及生长的实验，具体步骤如下：分别采用人永生化表皮细胞HaCat(BNCC342026ATCC)和神经细胞PC12(BNCC337644ATCC)进行两组实验，采用复性液(20mm Tris-Hcl(PH 7.0)、2mM的GSH和0.2mM的GSSG)作为对照，CON(PBS)作为空白对照。将实施例4纯化的透皮重组纤连蛋白覆盖96孔板，4℃过夜，吸取蛋白溶液，96孔板底部覆盖上透皮重组纤连蛋白，往孔板里分别加入不含血清的5000个细胞混悬液，37℃培养箱孵育1h，在10倍镜显微镜下观察每组细胞的粘附及伸展情况，从而验证透皮重组纤连蛋白的促细胞粘附、伸展及生长活性，表皮细胞HaCat和神经细胞PC12的实验结果分别见图6和图7。

从结果中我们可以看出，复性液及CON均没有促进细胞粘附的功能，且不同浓度的FN-TD-1蛋白生物学活性成梯度增加。在不含血清的细胞中，FN-TD-1融合蛋白在1h内能很有效地促进细胞的粘附、伸展及生长，且起这种促进效果作用的主要是纤连蛋白FN-TD-1融合蛋白，证明了通过连接肽将透皮增强肽TD-1与纤连蛋白连接得到的透皮重组纤连蛋白保留了纤连蛋白促进细胞的粘附、伸展及生长的生物学活性。

实施例7 SD大鼠体外透皮实验

抽取10只SD大鼠(SPF级，湖南斯莱克)，随机分为2组。脱毛后，放置48h，心脏取血处死。立刻从同一SD大鼠身上取两块完整的皮肤，分别做FN组和FN-TD-1组。将皮肤安装在透皮槽上，角质面加1mL蛋白FN或FN-TD-1，真皮层加4mL buffer，每组给药30ug。分别于2h、4h、8h、16h各吸取接收液100uL，用Human FN ELISA试剂盒(艾美捷，货号K3631-100)检测各样品中FN蛋白的含量。

体外透皮实验结果显示(图8)，随着时间的延长，FN-TD-1重组纤连蛋白与未连接TD-1短肽的纤连蛋白相比，透皮能力增强十倍以上，且FN-TD-1的促透皮效果呈时间依赖性。

实施例8 SD大鼠体内透皮实验

随机抽取十只SD大鼠(SPF级，湖南斯莱克)，并将其平均分为2组：FN透皮给药组、FN-TD-1透皮给药组。水合氯醛麻醉SD大鼠后，在腹部剪出月2cm²面积的无毛部位，在此涂抹给药，分别在给药1h、2h、4h后静脉取血，5h后采用心脏取血。离心收集血液样品中的血清，各取100uL血清用Human FN ELISA试剂盒(艾美捷，货号K3631-100)检测其中FN蛋白的含量。

结果如图9所示，同样地，随着时间的延长，SD大鼠血清中的FN含量也呈明显增加趋势，且在1h时已开始增加，说明FN-TD-1的透皮效果在短时间已经发挥作用，具有较强的促透皮作用。

以上结果阐释了本发明的透皮重组纤连蛋白的分子量小(33kD左右)，容易通过DNA重组技术制备，且保留了纤连蛋白的生物学功能及活性。其中，TD-1短肽起到了显著促进重组纤连蛋白透皮吸收的作用，但对重组纤连蛋白的生物学活性没有影响。本发明发现纤连蛋白的结构域通过连接肽与TD-1短肽连接得到的透皮重组纤连蛋白不仅有良好的促细胞黏附、伸展以及生长效果，而且与未连接TD-1短肽的重组纤连蛋白相比透皮能力增强十倍以上。

实施例9

连接肽(Linker)是将融合蛋白彼此分开，避免形成高级结构而影响功能的发挥。也就是说，为了防止或降低两个蛋白之间在空间构象上的相互干扰，设计融合蛋白时在两个蛋白之间添加一段不会影响两边蛋白的构象和功能发挥的连接肽。使用实施例7中SD大鼠体外透皮实验的方法，通过比较GSGGSGG GSGGSGGG、GGGGSGGG、GGGGS三种不同长度的Linker对透皮纤连蛋白的透皮能力以及纤连蛋白生物学功能的影响，结果发现GGGGS作为纤连蛋白与透皮增强肽的连接肽时，透皮重组纤连蛋白的透皮能力最强(图10)。

实施例10

DNA重组技术是制备生物融合蛋白的重要手段。干扰素-Y(Interferon-gamma，IFN-Y)是一类分泌型糖蛋白，由143个氨基酸组成，相对分子量是16924。通过DNA重组技术，以连接肽连接IFN-Y与TD-1得到的透皮重组人干扰素-Y(TD-1-IFN-Y)。通过透皮实验比较TD-1-IFN-Y与FN-TD-1的透皮能力，发现TD-1-IFN-Y并没有很好的透皮功能。结果显示，并不是所有的简单的DNA重组技术把生物大分子和透皮短肽(TD-1)连接起来就有透皮生物学效应的功能。本发明制备的FN-TD-1保留了纤连蛋白的生物学活性，而且TD-1短肽起到了显著促进重组纤连蛋白透皮吸收的作用(图11)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种透皮重组纤连蛋白及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys Tyr Ile Leu

1 5 10 15

Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser Val Gly Arg Trp Lys Glu Ala Thr Ile

20 25 30

Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys Pro Gly Val

35 40 45

Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly His Gln Glu

50 55 60

Val Thr Arg Phe Asp Phe Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Gly Ser Ala

65 70 75 80

Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr

85 90 95

Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe

100 105 110

Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu

115 120 125

Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro

130 135 140

Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu

145 150 155 160

Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Val Ser Asp Val Pro Arg

165 170 175

Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp

180 185 190

Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu

195 200 205

Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys

210 215 220

Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile

225 230 235 240

Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys

245 250 255

Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr

260

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ser Lys His Cys Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgatccagt ggaatgcacc acagccatct cacatttcca agtacattct caggtggaga 60

cctaaaaatt ctgtaggccg ttggaaggaa gctaccatac caggccactt aaactcctac 120

accatcaaag gcctgaagcc tggtgtggta tacgagggcc agctcatcag catccagcag 180

tacggccacc aagaagtgac tcgctttgac ttcaccacca ccagcaccag cacaggatct 240

gctgttcctc ctcccactga cctgcgattc accaacattg gtccagacac catgcgtgtc 300

acctgggctc cacccccatc cattgattta accaacttcc tggtgcgtta ctcacctgtg 360

aaaaatgagg aagatgttgc agagttgtca atttctcctt cagacaatgc agtggtctta 420

acaaatctcc tgcctggtac agaatatgta gtgagtgtct ccagtgtcta cgaacaacat 480

gagagcacac ctcttagagg aagacagaaa acagtttctg atgttccgag ggacctggaa 540

gttgttgctg cgacccccac cagcctactg atcagctggg atgctcctgc tgtcacagtg 600

agatattaca ggatcactta cggagaaaca ggaggaaata gccctgtcca ggagttcact 660

gtgcctggga gcaagtctac agctaccatc agcggcctta aacctggagt tgattatacc 720

atcactgtgt atgctgtcac tggccgtgga gacagccccg caagcagcaa gccaatttcc 780

attaattacc gaacaggtgg tggtggcagc gcttgtagta gcagcccgag caaacattgc 840

ggt 843

<210> 5

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atccagtgga atgcaccaca gccatctcac atttccaagt acattctcag gtggagacct 60

aaaaattctg taggccgttg gaaggaagct accataccag gccacttaaa ctcctacacc 120

atcaaaggcc tgaagcctgg tgtggtatac gagggccagc tcatcagcat ccagcagtac 180

ggccaccaag aagtgactcg ctttgacttc accaccacca gcaccagcac aggatctgct 240

gttcctcctc ccactgacct gcgattcacc aacattggtc cagacaccat gcgtgtcacc 300

tgggctccac ccccatccat tgatttaacc aacttcctgg tgcgttactc acctgtgaaa 360

aatgaggaag atgttgcaga gttgtcaatt tctccttcag acaatgcagt ggtcttaaca 420

aatctcctgc ctggtacaga atatgtagtg agtgtctcca gtgtctacga acaacatgag 480

agcacacctc ttagaggaag acagaaaaca gtttctgatg ttccgaggga cctggaagtt 540

gttgctgcga cccccaccag cctactgatc agctgggatg ctcctgctgt cacagtgaga 600

tattacagga tcacttacgg agaaacagga ggaaatagcc ctgtccagga gttcactgtg 660

cctgggagca agtctacagc taccatcagc ggccttaaac ctggagttga ttataccatc 720

actgtgtatg ctgtcactgg ccgtggagac agccccgcaa gcagcaagcc aatttccatt 780

aattaccgaa ca 792

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcttgtagta gcagcccgag caaacattgc ggt 33

<210> 7

<211> 281

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys Tyr Ile

1 5 10 15

Leu Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser Val Gly Arg Trp Lys Glu Ala Thr

20 25 30

Ile Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys Pro Gly

35 40 45

Val Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly His Gln

50 55 60

Glu Val Thr Arg Phe Asp Phe Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Gly Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp

85 90 95

Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn

100 105 110

Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu

115 120 125

Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu

130 135 140

Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His

145 150 155 160

Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Val Ser Asp Val Pro

165 170 175

Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser

180 185 190

Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly

195 200 205

Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser

210 215 220

Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr

225 230 235 240

Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser

245 250 255

Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ala Cys

260 265 270

Ser Ser Ser Pro Ser Lys His Cys Gly

275 280

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物F1

<400> 8

atgatccagt ggaatgcacc aca 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>引物FR1

<400> 9

accgcaatgt ttgctcgggc tgc 23

Claims

1.一种透皮重组纤连蛋白，其特征在于：由以下氨基酸序列组成：

（Ⅰ）纤连蛋白的结构域，纤连蛋白的结构域至少包括纤连蛋白的整联蛋白结合结构域；

（Ⅱ）连接肽；

（Ⅲ）透皮功能短肽；

所述的（Ⅰ）、（Ⅱ）和（Ⅲ）的氨基酸序列顺次连接；

所述的（Ⅰ）纤连蛋白的结构域的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；

所述的（Ⅱ）连接肽为用于构建融合蛋白的连接肽，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；

所述的（Ⅲ）透皮功能短肽的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。

2.权利要求1所述的透皮重组纤连蛋白在制备促进细胞粘附、伸展、生长及促进透皮吸收药物中的应用。

3.一种编码权利要求1所述的透皮重组纤连蛋白的核酸分子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。

4.一种遗传构建体，其特征在于：包含权利要求1所述的重组纤连蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在表达载体中可操作地与一或多个调控核苷酸序列连接。

5.根据权利要求4所述的遗传构建体，其特征在于：所述的表达载体为pET22b。

6.一种美容组合物，其特征在于：包含权利要求1所述的透皮重组纤连蛋白。