CN108794639B - 一种重组纤连蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组纤连蛋白及其应用。本发明提供了一种重组纤连蛋白，能有效解决DNA重组技术制备纤连蛋白困难，且DNA重组技术制备得到的纤连蛋白生物活性低的技术缺陷。一种重组纤连蛋白，包括如下氨基酸序列：(I)至少一个纤连蛋白的结构域，所述纤连蛋白的结构域至少包括纤连蛋白的整联蛋白结合结构域；和(Ⅱ)至少一个层粘连蛋白的结构域，所述层粘连蛋白的结构域至少包括层粘连蛋白的整联蛋白结合结构域；其中，所述(I)和(Ⅱ)的氨基酸序列顺次连接。

Description

一种重组纤连蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组纤连蛋白及其应用。

背景技术

纤连蛋白，英文名称fibronectin（英文缩写FN），是一种高分子量(约440kDa)的细胞外基质的糖蛋白，它与整合素跨膜受体蛋白结合。与整合素相似的是，纤连蛋白结合了细胞外基质成分，如胶原蛋白、纤维蛋白和肝素硫酸盐蛋白聚糖(如多配体聚糖)。纤连蛋白在细胞粘附、生长、迁移和分化过程中起着重要作用，例如它对创面愈合和胚胎发育等过程至关重要。纤连蛋白表达、降解和组织分布的变化与许多疾病相关，包括癌症和纤维化。

纤连蛋白是一种蛋白质二聚体，由两个几乎相同的单体通过一对二硫键连接而成。由一对c末端的二硫键相连。每一个纤连蛋白亚基的分子量为230-250 kDa，包含三种类型的模体：I型、II型和III型。这三个模体是由两个反向β-折叠导致Beta折叠；但是，I型和II型是通过链内二硫键稳定的，而III型模体不含任何二硫键。III型模体的二硫键的缺失使其在施用力的作用下得以部分展开。纤连蛋白是由单个基因产生的，但它的前体RNA的选择性剪接导致了几种异构体的产生。这些模体沿着纤连蛋白单体的长度被排列成几个功能性的和蛋白质结合的结构域。纤连蛋白有4个蛋白结构域，允许纤连蛋白与其他纤连蛋白分子结合。其中一个纤连蛋白结构域，I1-5，被称为“装配域”，它是建立纤连蛋白基质组装的必要条件。模体III9-10对应于纤连蛋白的“细胞结合域”。RGD序列(Arg-Gly-Asp)位于III10，它是在细胞表面上通过α5β1 和αVβ3整合素的细胞附着位点。这个“增效位点”是在III9模体，它可以调节纤连蛋白和α5β1整合素（又称整联蛋白）的增效作用。

纤连蛋白有许多生物学功能，它可以保证脊椎动物的正常功能。它涉及细胞粘附、生长、迁移和分化。细胞纤连蛋白聚集在细胞外基质中，这是一种不溶性的网络，可以分离和支持有机体的器官和组织。

纤连蛋白在伤口愈合中起着至关重要的作用。纤连蛋白与纤维蛋白在损伤部位沉积，形成血凝块，止血并保护皮下组织。随着损伤组织的修复，成纤维细胞和巨噬细胞开始对该区域进行重新建模，降解形成临时血凝块基质的蛋白质，并将其替换为更像正常的周围组织的基质。成纤维细胞分泌蛋白酶，包括基质金属蛋白酶，可以消化血浆纤维蛋白，接着成纤维细胞分泌细胞纤连蛋白，并将其组装成不溶性基质。通过蛋白酶分解纤连蛋白，可促进伤口收缩，这是伤口愈合的关键步骤。被分裂的纤连蛋白进一步暴露其v区，其中包含了α4β整合素结合位点。这些纤连蛋白片段被认为可以提高α4β1与细胞整合素结合，使他们能够粘附和紧密地结合周围的基质。

纤连蛋白对创面愈合有深远的影响，包括在肉芽组织的发育和组织过程中，细胞的迁移和生长，以及结缔组织基质的重塑和再合成。在创面愈合的机制中，研究了纤连蛋白在体内的生物学意义。在急性炎症或手术创伤和弥散性血管内凝血的患者中，血浆纤维蛋白水平降低。纤连蛋白位于胚胎和成人组织的细胞外基质中(不是在成人组织的基底膜中)，但可能在炎性病变中更广泛分布。在血液凝固过程中，纤连蛋白与凝块有关，在凝血因子XIII(纤维稳定因子)的帮助下与血浆纤连蛋白交叉连接。成纤维细胞通过粘附血浆纤维蛋白在伤口愈合过程中起着重要作用。成纤维细胞粘附在血浆纤维蛋白需要纤连蛋白，而且当纤连蛋白与血浆纤维蛋白交联时，血浆纤维蛋白粘附力最强。那些凝血因子XIII缺失的患者在伤口愈合过程中出现损伤，因为纤维母细胞在缺乏因子XIII的纤维蛋白中生长发育不良。纤连蛋白通过巨噬细胞和成纤维细胞促进颗粒吞噬作用。在纤连蛋白的帮助下，成纤维细胞在创口处使胶原蛋白沉积。纤维蛋白与新沉积的胶原纤维密切相关。根据纤维的大小和组织学染色特征，很可能至少部分是由III型胶原(网状蛋白)组成。在体外研究中，原生胶原蛋白证明纤维蛋白与III型胶原蛋白结合。

纤连蛋白在医学、美容化妆品以及科研领域有广泛应用及巨大市场，但从人体或动物血液和组织中提取的天然纤连蛋白产量极为有限，成本昂贵。因此限制了FN在很多方面的应用和生产。重组DNA技术为解决上述问题提供了最佳方案，但由于纤连蛋白分子太大（由2000多个氨基酸组成），重组DNA技术通常只能表达纤连蛋白分子的一部分，对纤连蛋白的功能有所影响。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种重组纤连蛋白，能有效解决DNA重组技术制备纤连蛋白困难，且DNA重组技术制备得到的纤连蛋白生物活性低的技术缺陷。

本发明提供了一种重组纤连蛋白，包括如下氨基酸序列：

（Ⅰ）至少一个纤连蛋白的结构域，所述纤连蛋白的结构域至少包括纤连蛋白的整联蛋白结合结构域；和

（Ⅱ）至少一个层粘连蛋白的结构域，所述层粘连蛋白的结构域至少包括层粘连蛋白的整联蛋白结合结构域；

其中，所述（Ⅰ）和所述（Ⅱ）的氨基酸序列顺次连接。

作为优选，所述（Ⅰ）至少一个纤连蛋白的结构域的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与（Ⅰ）所示的氨基酸序列至少有%同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。

作为优选，所述（Ⅱ）层粘连蛋白的整联蛋白结合结构域的氨基酸序列如SEQ IDNo:2所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与（Ⅱ）所示的氨基酸序列至少有%同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。

作为优选，所述（Ⅱ）层粘连蛋白的结构域包括层粘连蛋白的α链的C端的LargeGlobular domain 1、Large Globular domain 2、Large Globular domain 3、LargeGlobular domain 4和Large Globular domain 5中的一种或多种。

作为优选，还包括（Ⅲ）连接肽，所述（Ⅰ）、所述（Ⅲ）和所述（Ⅱ）的氨基酸序列顺次连接；所述（Ⅲ）连接肽为用于构建融合蛋白的连接肽。

作为优选，所述（Ⅲ）连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。

本发明公开的所述的重组纤连蛋白在促进细胞粘附的应用。

本发明公开的一种编码重组纤连蛋白的核酸。

本发明公开的一种遗传构建体，其包含重组纤连蛋白的核酸，所述核酸在载体中可操作地与一或多个调控核苷酸序列连接。

本发明公开的一种美容组合物，包含重组纤连蛋白。

本发明的目的针对现有技术中DNA重组技术制备纤连蛋白困难，且DNA重组技术制备得到的纤连蛋白生物活性低的技术缺陷。因此，本发明公开重组纤连蛋白是一种能用DNA重组技术制备且制备得到的重组纤连蛋白的活性生物活性高。本发明的重组纤连蛋白包括了（Ⅰ）至少一个纤连蛋白的结构域，纤连蛋白的结构域至少包括纤连蛋白的整联蛋白结合结构域；和（Ⅱ）至少一个层粘连蛋白的结构域，层粘连蛋白的结构域至少包括层粘连蛋白的整联蛋白结合结构域；其中，（Ⅰ）和（Ⅱ）的氨基酸序列顺次连接。本发明截取了纤连蛋白的一部分，直接与层粘连蛋白的结构域连接，得到的重组纤连蛋白的分子量小，容易通过DNA重组技术制备，且不影响其重组纤连蛋白的生物活性。其中，层粘连蛋白（Laminin，LN）又称板层素其分子量为805kD，由一个400kD的α链和两条200kD左右的β链组成。层粘连蛋白是一种主要存在于上皮细胞外基质中的大分子非胶原性糖蛋白（分子量约为20~40万）。在层粘连蛋白的α链的C端有5个Large Globular (LG) domain (LG1-LG5)，本发明发现纤连蛋白的整联蛋白结合结构域，直接与层粘连蛋白的整联蛋白结合结构域连接得到的重组纤连蛋白，得到的重组牵连蛋白，其分子量少，还具备牵连蛋白（全长的牵连蛋白）的作用，起到了1+1>2的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明实施例提供的pET22b的功能区的位置结构图；

图2示本发明实施例提供的pET22b的序列图谱；

图3示本发明实施例提供的重组纤连蛋白的目的片段的结构图；

图4示本发明实施例提供的目的片段与pET22b(+)载体的酶切后电泳图；

图5示本发明实施例提供的阳性重组菌液的诱导和未诱导的SDS-PAGE电泳图；

图6示本发明实施例提供的纯化后的重组纤连蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图7示本发明实施例提供的内毒素检测的标准曲线；

图8示本发明实施例提供的重组纤连蛋白的促细胞粘附的试验结果图

图9示本发明实施例提供的重组纤连蛋白的促细胞粘附的比对试验结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种重组纤连蛋白及其应用，用于解决DNA重组技术制备纤连蛋白困难，且DNA重组技术制备得到的纤连蛋白生物活性低的技术缺陷。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供重组纤连蛋白的具体实施方式，包括如下氨基酸序列：

（Ⅰ）至少一个纤连蛋白的结构域，纤连蛋白的结构域至少包括纤连蛋白的整联蛋白结合结构域；和

（Ⅱ）至少一个层粘连蛋白的结构域，层粘连蛋白的结构域至少包括层粘连蛋白的整联蛋白结合结构域；

其中，（Ⅰ）和（Ⅱ）的氨基酸序列顺次连接。

具体的，（Ⅰ）至少一个纤连蛋白的结构域的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与（Ⅰ）所示的氨基酸序列至少有80%同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。

具体的，（Ⅱ）层粘连蛋白的整联蛋白结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与（Ⅱ）所示的氨基酸序列至少有80%同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。

具体的，（Ⅱ）层粘连蛋白的结构域包括层粘连蛋白的α链的C端的Large Globulardomain 1（LG-1）、Large Globular domain 2（LG-2）、Large Globular domain 3（LG-3）、Large Globular domain 4（LG-4）和Large Globular domain 5（LG-5）中的一种或多种。

其中，（Ⅱ）层粘连蛋白的结构域包括LG-1、LG-2、LG-3、LG-4和LG-5任意组合的连接组合。

其中，层粘连蛋白的α链的C端的Large Globular domain 3（LG-3）的氨基酸序列如下表所示：

更具体的，（Ⅱ）层粘连蛋白的结构域为层粘连蛋白的α链的C端的Large Globulardomain 3（LG-3）。

具体的，还包括（Ⅲ）连接肽；（Ⅲ）连接肽为用于构建融合蛋白的连接肽。

具体的，（Ⅲ）连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，其氨基酸序列为GGGGS。

具体的，上述重组纤连蛋白在促进细胞粘附的应用。

本发明提供的重组纤连蛋白的分子量小，为35KDa。

具体的，本发明还公开了一种编码上述重组纤连蛋白的核酸。

具体的，本发明还公开了一种遗传构建体，其包含上述重组纤连蛋白的核酸，核酸在载体中可操作地与一或多个调控核苷酸序列连接。

更具体的，载体中包含信号肽和用于蛋白质纯化的标签。

其中，用于蛋白质纯化的标签为组氨酸标签。

其中，调控核苷酸序列为启动子。

具体的，本发明还公开了一种美容组合物，包含上述重组纤连蛋白。

其中，以下实施例所用的试剂和原料均为市售或自制。

实施例1

本发明实施例1为获得重组纤连蛋白目的片段和表达载体(本实施例的表达载体标记为：FN- LG-3)，使用商用载体pET22b，请参阅图1和图2，图1为pET22b的功能区的位置，图2为pET22b的序列图谱，根据图1和图2的相关序列位置设计酶切位点，图3为重组纤连蛋白的目的片段的结构，其中纤连蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1（图3标记为FN-protein），其氨基酸序列为：IQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSTGSAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT，其核苷酸序列为ATCCAGTGGAATGCACCACAGCCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGGTGGAGACCTAAAAATTCTGTAGGCCGTTGGAAGGAAGCTACCATACCAGGCCACTTAAACTCCTACACCATCAAAGGCCTGAAGCCTGGTGTGGTATACGAGGGCCAGCTCATCAGCATCCAGCAGTACGGCCACCAAGAAGTGACTCGCTTTGACTTCACCACCACCAGCACCAGCACAGGATCTGCTGTTCCTCCTCCCACTGACCTGCGATTCACCAACATTGGTCCAGACACCATGCGTGTCACCTGGGCTCCACCCCCATCCATTGATTTAACCAACTTCCTGGTGCGTTACTCACCTGTGAAAAATGAGGAAGATGTTGCAGAGTTGTCAATTTCTCCTTCAGACAATGCAGTGGTCTTAACAAATCTCCTGCCTGGTACAGAATATGTAGTGAGTGTCTCCAGTGTCTACGAACAACATGAGAGCACACCTCTTAGAGGAAGACAGAAAACAGTTTCTGATGTTCCGAGGGACCTGGAAGTTGTTGCTGCGACCCCCACCAGCCTACTGATCAGCTGGGATGCTCCTGCTGTCACAGTGAGATATTACAGGATCACTTACGGAGAAACAGGAGGAAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGGAGCAAGTCTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGAGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTGGCCGTGGAGACAGCCCCGCAAGCAGCAAGCCAATTTCCATTAATTACCGAACA；在纤连蛋白的N端连接有信号肽和HIS标签，在纤连蛋白的C端连接有LG-3，其中，LG-3的氨基酸序列为SEQ ID No.2（图3标记为LG-3），其氨基酸序列为：RNIPPFEGCIWN，其核苷酸序列（SEQ ID No.5）为CGAAACATACCGCCATTCGAAGGATGCATATGGAAC；因此，重组纤连蛋白的目的片段的氨基酸序列为IQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSTGSAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTRNIPPFEGCIWN，其核苷酸序列（SEQ ID No.4）为ATCCAGTGGAATGCACCACAGCCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGGTGGAGACCTAAAAATTCTGTAGGCCGTTGGAAGGAAGCTACCATACCAGGCCACTTAAACTCCTACACCATCAAAGGCCTGAAGCCTGGTGTGGTATACGAGGGCCAGCTCATCAGCATCCAGCAGTACGGCCACCAAGAAGTGACTCGCTTTGACTTCACCACCACCAGCACCAGCACAGGATCTGCTGTTCCTCCTCCCACTGACCTGCGATTCACCAACATTGGTCCAGACACCATGCGTGTCACCTGGGCTCCACCCCCATCCATTGATTTAACCAACTTCCTGGTGCGTTACTCACCTGTGAAAAATGAGGAAGATGTTGCAGAGTTGTCAATTTCTCCTTCAGACAATGCAGTGGTCTTAACAAATCTCCTGCCTGGTACAGAATATGTAGTGAGTGTCTCCAGTGTCTACGAACAACATGAGAGCACACCTCTTAGAGGAAGACAGAAAACAGTTTCTGATGTTCCGAGGGACCTGGAAGTTGTTGCTGCGACCCCCACCAGCCTACTGATCAGCTGGGATGCTCCTGCTGTCACAGTGAGATATTACAGGATCACTTACGGAGAAACAGGAGGAAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGGAGCAAGTCTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGAGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTGGCCGTGGAGACAGCCCCGCAAGCAGCAAGCCAATTTCCATTAATTACCGAACACGAAACATACCGCCATTCGAAGGATGCATATGGAAC。通过PCR扩增的方法把目的片段进行扩增，其扩增引物为：R：5’-GGCCATGGATCACCACCACCACCACCACATCCAGTGGAAT-3’、F：5’-GGCTCGAGTTAGTTCCATATGCATCCTTCGAATGG-3’，获得目的片段，采用快切酶QickCutTM NcoI和QuickCutTM XhoI分别对目的片段与pET22b(+)载体进行反应。反应体系及条件如下：

反应体系如下表所示：

轻轻混匀后离心，反应条件如下：

30℃，反应1 h后在37℃，反应1 h，双酶切反应结束后，对目的片段与pET22b(+)载体酶切产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，并将进行切胶回收，请参阅图4，1为pET22b(+)载体，2为pET22b(+)载体及目的片段酶切产物，其中在5000多bp处为酶切后质粒，在840bp左右处为酶切后FN-LG3目的片段。从图4可以看出，本实施例成功构建重组质粒（原核表达重组质粒pET22b-His-FN- LG-3，下称FN-LG-3）。

实施例2

本发明实施例2为构建重组纤连蛋白载体（原核表达重组质粒pET22b-His-FN-LG-3，下称FN-LG-3），其中，His为组氨酸标签，其His的序列为HHHHHH；在His的N端还连接有信号肽，其信号肽为pelB信号肽，信号肽的氨基酸序列为MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA，构建重组纤连蛋白载体的具体步骤如下：

（1）目的片段与pET22b(+)表达载体连接

将上述双酶切纯化后的目的片段与pET22b(+)（下称为载体DNA）进行连接，构建重组质粒，连接采用DNA Ligation Kit Ver.2.1连接试剂盒，具体操作步骤如下：将实施例1切胶回收的目的片段与pET22b(+)的载体DNA混合均匀，制备成体积为10 μl的载体DNA混合液（载体DNA和目的片段的摩尔数比为：0.03pmol：0.3pmol），将载体DNA混合液于60℃水浴保温2 min。向上述载体DNA混合液中加入等体积的Solution I溶液，混合均匀；将混合液置于16℃水浴箱中反应16 h，进行连接反应。得到连接反应液。

（2）转化、涂板培养

取9 μl上述连接反应液于1.5ml离心管中，加入1μl Solution III，混匀均匀后立即转化到50 μl Trans-T1感受态细胞中，冰上放置30 min，于42℃水浴热击45 sec，立即冰上静置2 min。往转化反应液中加入250 μl SOC液体培养基，在摇床中37℃，200 rpm，震荡复苏培养1 h。取100 μl复苏培养的菌液涂布于含Amp的LB固体培养基上，待吸收完全后倒置，于37℃培养箱中培养过夜；挑选白色阳性单菌落及蓝色阴性对照单菌落，接种于4 ml含4 µl Amp（100 mg/ml）的SOC液体培养基中，于37℃，200 rpm摇床中震荡培养10 h。按照小型质粒提取的方法提取重组质粒，于-20℃冰箱保存备用。

实施例3

本发明实施例3为重组质粒FN-LG-3的诱导表达及SDS-PAGE电泳鉴定，具体步骤如下：

1、重组质粒FN-LG-3转化到BL21(DE3)感受态细胞：

分别取1µl上述提取的pET22b-His-FN-LG-3重组质粒转化到50 μl BL21(DE3)感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃水浴热击45 sec，立即冰上静置2 min，分别上述反应液中加入250 μl SOC液体培养基，在摇床中于37℃，200 rpm，震荡复苏培养1 h。取100 μl复苏培养的菌液涂布于含Amp的LB固体培养基上，待吸收完全后倒置，37℃培养箱中培养过夜。挑选白色阳性单菌落及蓝色阴性对照单菌落，接种于4 ml含4 µl Amp（100 mg/ml）的SOC液体培养基中，于37℃，200 rpm摇床中震荡培养10 h。

2、重组质粒FN-LG-3的诱导表达：

取阳性重组菌液7ml，接种于500 ml含有Amp(100 μg/μl)的SOC液体培养液中，于37℃，200 rpm，摇床中震荡培养，培养5h后，每隔一小时用紫外分光光度计测定菌液的OD600，当菌液OD600至0.5时。分别加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，另设定未诱导组作对照，继续诱导培养4小时。

3、诱导表达蛋白SDS-PAGE电泳鉴定：

第一、分别取经诱导的阳性重组菌液和未诱导的阳性重组菌液，10000 rpm，4℃离心15min，弃上清，秤量菌体湿重，沉淀用1×PBS+1% 吐温洗一遍，10000 rpm，4℃离心18min，用1×PBS重悬（湿重的10倍体积）。冰上超声破碎，设定超声条件：总时间为40min，超声时间为2 sec，超声停顿时间为1 sec，功率65W，超声两遍，10000 rpm，4℃离心15min，倒弃上清液，保留沉淀菌体。分别取少量沉淀于1.5ml离心管中，分别加入适量的l×PBS，使沉淀悬浮。分别加入适量5×蛋白上样缓冲液，混合均匀后，煮沸10 min。装备好电泳装置，分别取上述样品10μl上样。标准蛋白ProteinRuler IV作为Marker，电流为100 mA，电压为100V，进行SDS-PAGE电泳，电泳时间1.5h。

第二、染色、脱色：SDS-PAGE电泳结束后，轻轻将蛋白胶块取出，置于摇床上，加入考马斯亮蓝染色液染色1小时，然后加入脱色液，脱色15 min，倒弃脱色液，更换新的脱色液，反复操作3次，最后脱色过夜。脱色完成后拍照记录。

从图5的电泳图可知，M1为本实施例阳性重组菌液诱导得到的重组纤连蛋白FN-LG3，1为使用0.5mM IPTG诱导得到的重组菌液的沉淀，2为0.5mM IPTG诱导得到的重组菌液的上清，3为未诱导的重组菌液的沉淀，4为未诱导的重组菌液的上清，M2为不带有功能短肽（功能短肽为LG-3）的对照FN蛋白，5为0.5mM IPTG诱导得到的重组菌液的沉淀，6为0.5mMIPTG诱导得到的重组菌液的上清，7为未诱导的重组菌液的沉淀，8为未诱导的重组菌液的上清。

实施例4

本发明实施例4为实施例3诱导表达得到的重组纤连蛋白的纯化，具体步骤包括重组纤连蛋白的变性、复性和纯化：

1、变性：上述诱导表达得到的沉淀用8M尿素（含1%的β-巯基乙醇）重悬，并在4度摇床过夜，得到变性液。

2、复性：将变性液在10000 rpm，4℃离心18min离心，取上清，用3倍体积的20mmTris-Hcl，于PH为7.0在4℃复性过夜，再用3倍体积的复性液（复性液为20mm Tris-Hcl（PH7.0）、2mM的GSH和0.2的mM的GSSG）进行再复性过夜（变性液：复性液为1:6）。

3、纯化：复性蛋白过滤膜，除去杂质，再过SP柱，蛋白不挂柱，取废液再过Q柱（去除内毒素），再过Ni柱，完成纯化工艺，对纯化后的重组纤连蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图6所示，M为Maker，1为FN（购买的人纤连蛋白：人血浆中提取纯化）、2为实施例3制备的FN-LG-3。本实施案例表明，通过SP和Q柱及Ni柱的纯化，得到高纯度的蛋白，其中通过灰度计算目标蛋白FN和FN-LG-3，纯化效率高达99%。

实施例5

本发明实施例5为对实施例4的纯化的重组纤连蛋白进行内毒素检测，具体步骤如下：

用金斯瑞公司的ToxinSensorTM的内毒素检测试剂盒检测FN（购买的标准品）和实施例4的纯化的重组纤连蛋白（FN- LG-3融合蛋白）的内毒素。结果显如图7和下表所示，图7为内毒素检测的标准曲线，通过内毒素的标准曲线检测内毒素的实施例4的重组纤连蛋白在0.5EU/ml以下。

实施例6

本发明实施例5为对实施例4的纯化的重组纤连蛋白进行促细胞粘附的试验，具体步骤如下：

将实施例4的纯化的重组纤连蛋白覆盖96孔板1h，用1×PBS洗两遍。加1%BSA于37℃封闭1h后，加入细胞(用无血清培养基培养)，1h后去上清，1×PBS洗去未吸附的细胞，用MTT法检测吸附在孔板底部活细胞的数量，验证重组纤连蛋白的活性，结果请请参阅图8及图9，其中，图8的CON为空白对照、进口FN为购买于ProSpec公司的人纤连蛋白（人血浆中提取纯化）、国产FN为购买于必拓生物的重组人纤维连接蛋白片段（分子量为63kDa）、FN为通过基因工程方法获得的纤连蛋白（该纤连蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1），FN不含有LG-3的功能短肽，FN-LG-3为实施例4的纯化的重组纤连蛋白。从图8可知，本发明得到的重组纤连蛋白具有优良的促细胞吸附的活性，其效果比进口FN（人血浆中提取纯化）和国产FN（重组人纤维连接蛋白片段，分子量为63kDa）促细胞吸附的活性好；另一方面，在图9中，1为空白对照、2为实施例4制得的重组纤连蛋白（FN-LG-3），3为不带有功能短肽LG-3的对照FN蛋白（该对照FN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1）和购买的LG-3功能短肽机械混合的混合物，4为不带有功能短肽LG-3的对照FN蛋白（该对照FN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1），5为购买的LG-3功能短肽，图9主要是通过比较不带有功能短肽LG-3的对照FN蛋白（该对照FN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1），FN-LG-3融合蛋白、不带有功能短肽LG-3的对照FN蛋白（该对照FN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1）和LG-3蛋白的混合物，以及单独使用LG-3功能短肽时，各组的促细胞吸附的效果。从图9可以看出，实施例4的重组纤连蛋白（FN-LG-3）的活性均优于单独使用不带有功能短肽LG-3的对照FN蛋白、LG-3功能短肽以及单纯地混合不带有功能短肽LG-3的对照FN蛋白和LG-3功能短肽的混合物，并具有显著的统计学意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广州澳特朗生物技术有限公司

<120> 一种重组纤连蛋白及其应用

<130> MP1809054

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys Tyr Ile Leu

1 5 10 15

Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser Val Gly Arg Trp Lys Glu Ala Thr Ile

20 25 30

Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys Pro Gly Val

35 40 45

Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly His Gln Glu

50 55 60

Val Thr Arg Phe Asp Phe Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Gly Ser Ala

65 70 75 80

Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr

85 90 95

Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe

100 105 110

Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu

115 120 125

Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro

130 135 140

Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu

145 150 155 160

Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Val Ser Asp Val Pro Arg

165 170 175

Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp

180 185 190

Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu

195 200 205

Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys

210 215 220

Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile

225 230 235 240

Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys

245 250 255

Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr

260

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Asn Ile Pro Pro Phe Glu Gly Cys Ile Trp Asn

1 5 10

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser

1

<210> 4

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atccagtgga atgcaccaca gccatctcac atttccaagt acattctcag gtggagacct 60

aaaaattctg taggccgttg gaaggaagct accataccag gccacttaaa ctcctacacc 120

atcaaaggcc tgaagcctgg tgtggtatac gagggccagc tcatcagcat ccagcagtac 180

ggccaccaag aagtgactcg ctttgacttc accaccacca gcaccagcac aggatctgct 240

gttcctcctc ccactgacct gcgattcacc aacattggtc cagacaccat gcgtgtcacc 300

tgggctccac ccccatccat tgatttaacc aacttcctgg tgcgttactc acctgtgaaa 360

aatgaggaag atgttgcaga gttgtcaatt tctccttcag acaatgcagt ggtcttaaca 420

aatctcctgc ctggtacaga atatgtagtg agtgtctcca gtgtctacga acaacatgag 480

agcacacctc ttagaggaag acagaaaaca gtttctgatg ttccgaggga cctggaagtt 540

gttgctgcga cccccaccag cctactgatc agctgggatg ctcctgctgt cacagtgaga 600

tattacagga tcacttacgg agaaacagga ggaaatagcc ctgtccagga gttcactgtg 660

cctgggagca agtctacagc taccatcagc ggccttaaac ctggagttga ttataccatc 720

actgtgtatg ctgtcactgg ccgtggagac agccccgcaa gcagcaagcc aatttccatt 780

aattaccgaa cacgaaacat accgccattc gaaggatgca tatggaac 828

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaaacatac cgccattcga aggatgcata tggaac 36

Claims (4)

1.一种重组纤连蛋白，其特征在于，由如下氨基酸序列组成：

（Ⅰ）纤连蛋白的整联蛋白结合结构域；和

（Ⅱ）层粘连蛋白的整联蛋白结合结构域；

其中，所述（Ⅰ）和所述（Ⅱ）的氨基酸序列顺次连接；所述（Ⅰ）的氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示；所述（Ⅱ）的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

2.权利要求1所述的重组纤连蛋白在制备促进细胞粘附的产品中的应用。

3.一种编码权利要求1所述的重组纤连蛋白的核酸。

4.一种遗传构建体，其包含权利要求3所述的核酸，所述核酸在载体中可操作地与一个或多个调控核苷酸序列连接。

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