KR101871805B1 - 재조합 상피세포성장인자의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상피세포성장인자(EGF)의 상업적 생산을 위해, KSI(ketosteroid isomoerase); 단백질 절단효소 인식부위(protease recognition site); 및 상피세포성장인자(EGF)로 구성되는, 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질 및 상기 융합 단백질을 이용한 EGF의 제조방법을 제공한다.

Description

재조합 상피세포성장인자의 제조방법{Method for producing recombinant epidermal growth factor}
본 발명은 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것으로 더 상세하게는 재조합 상피세포성장인자의 제조방법에 관한 것이다.
생체 내 특히 혈액 및 조직 내에는 우리 몸의 성장 및 분화에 영향을 주는 수많은 단백질 및 펩타이드 호르몬 및 성장인자들이 존재하는데 이들은 주로 세포벽에 존재하는 수용체와 특이적으로 결합하여 그 결합으로 인하여 세포의 성장 및 분화에 영향을 주게 된다. 이와 같은 성장인자 중에서 상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF)는 53개의 아미노산으로부터 형성되는 단백질의 일종으로 피부의 표면에 있는 수용체와 결합하여 새로운 세포의 생산을 촉진하는 역할을 하며 미국의 생물학자 스탠리 코헨(Stanley Cohen) 박사가 발견하여 노벨 의학 생리학상을 수상하였다. EGF는 침, 소변, 모유, 눈물 및 혈액 등에 고농도로 존재하고 상처가 났을 때 혈액으로부터 공급이 되어 흉터 없이 상처를 아물게 하는 작용을 한다. 이외에도 여성호르몬 분비를 촉진하는 FSH(follicle stimulation hormone)과 함께 자궁속의 수정란을 성숙시키고, 혈관이 없어서 변질되기 쉬운 각막의 재생을 돕는다. 또한 상피세포 및 내피세포의 세포증식 촉진, 진피의 구성성분인 콜라겐을 합성하는 섬유아세포의 세포증식 촉진. 피부 손상부위의 혈관 신생촉진 및 기타 재생 촉진인자의 분비유도 등 피부재생에 핵심적 역할을 담당한다. 이러한 EGF를 인간의 소변에서 분리정제하여 생산하거나 인간 EGF 유전자를 대장균 또는 효모에서 발현시키는 등 다양한 연구들이 시도되었지만 정제 과정 중에 침전 및 농축 과정이 빈번하여 회수율이 낮고 단백질 분해 효소에 의해 유전자의 발현율도 낮은 문제점이 있다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제0062551호는 유전자 재조합 기술에 의한 인간 상피성장인자의 제조방법을 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 산업적으로 이용가능한 수율 또는 충분한 활성을 나타내지 못하는 한계가 존재한다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 유전자 재조합 방법을 이용하여 천연 EGF보다 안정성과 활성이 우수한 상피세포성장인자의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 KSI(ketosteroid isomoerase); 단백질 절단효소 인식부위(protease recognition site); 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 상피세포성장인자(EGF)를 포함하는, 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계; 상기 형질전환 숙주세포를 배양배지에서 배양하는 형질전환 숙주세포 배양단계; 상기 배양된 형질전환 숙주세포로부터 상기 융합 단백질을 정제하는 정제단계; 및 상기 융합 단백질에 단백질 분해효소를 처리하여 재조합된 상피세포성장인자를 절단하고 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 상피세포성장인자 제조방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 유전자 재조합 방법을 이용하여 안정성과 활성이 우수한 상피세포성장인자의 제조방법을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 상피세포성장인자가 과발현 되도록 설계된 융합 EGF 유전자 컨스트럭트의 구조를 개략적으로 나타낸 구성도이다.
도 2는 본 발명의 융합 EGF 유전자 컨스트럭트를 발현벡터에 삽입하여 제작한 재조합 벡터의 구조를 나타내는 구성도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 융합 EGF 유전자 컨스트럭트의 과발현(over-expression)을 확인한 겔 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 EGF의 정제 결과를 나타내는 겔 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 KSI로부터 EGF를 분리하기 위하여 융합 EGF에 Factor Xa를 첨가하여 반응을 유도하는 개요도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 융합 EGF 유전자로부터 재조합 EGF를 분리과정을 나타내고 있는 개요도이다.
도 7은 본 발명의 재조합 EGF의 N-말단 분석을 통해 KSI와 EGF의 정확한 분리여부를 확인하는 과정을 나타내는 개요도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 EGF의 세포증식 효과를 나타내는 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "상피세포성장인자(epidermal growth factor)"는 단일사슬 폴리펩티드로서 53개의아미노산으로 이루어져 있으며 신체내의 다양한 기관에서 생산, 분비되며, 세포의 부착, 분열촉진, 그리고 손상된 상피 조직의 치유에 필요한 세포들의 재배열 등을 촉진하는 역할을 담당한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "KSI(ketosteroid isomoerase)"는 3-oxo-Δ5 케토스테로이드의 이성질화(isomerization)를 촉진시키는 효소로 포유동물의 스테로이드 생합성에 필수적인 역할을 담당하는 효소이고 본 발명에서는 재조합 상피세포 성장인자의 과발현을 위한 융합 파트너로 사용되었다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 KSI(ketosteroid isomoerase); 단백질 절단효소 인식부위(protease recognition site); 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 상피세포성장인자(EGF)를 포함하는, 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질이 제공된다.
상기 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질에 있어서, 상기 단백질 절단효소는 트롬빈, TEV(tobacco etch virus) 프로테아제, 프리시션(PreScission) 프로테아제, Factor Xα 또는 엔테로키나아제(Enterokinase)일 수 있고 상기 단백질 절단효소는 Factor Xa일 수 있다.
상기 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질에 있어서, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고 상기 융합 단백질은 분리-정제를 위한 태그(tag)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 태그는 친화성 태그(affinity tag) 또는 에피토프 태그(epitope tag)일 수 있고 상기 친화성 태그(affinity Tag)는 히스티틴 태그(histidine tag), 글루타치온 전이효소(glutathione s transferase, GST), 인테인(Intein) 또는 말토스 결합단백질(maltose binding protein, MBP)일 수 있으며 상기 에피토프 태그(epitope tag)는 플래그 태그(FLAG tag), Myc, V5 또는 HA일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계; 상기 형질전환 숙주세포를 배양배지에서 배양하는 형질전환 숙주세포 배양단계; 상기 배양된 형질전환 숙주세포로부터 상기 융합 단백질을 정제하는 정제단계; 및 상기 융합 단백질에 단백질 분해효소를 처리하여 재조합된 상피세포성장인자를 절단하고 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 상피세포성장인자 제조방법이 제공된다.
상기 재조합 상피세포성장인자 제조방법에 있어서, 상기 단백질 절단효소는 트롬빈, TEV(tobacco etch virus) 프로테아제, 프리시션(PreScission) 프로테아제, Factor Xα 또는 엔테로키나아제(Enterokinase)일 수 있다.
이하, 실시예를 통해 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전히 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 융합 EGF 유전자 컨스트럭트 제조
본 발명의 일 실시예에 따라 상피세포성장인자(EGF)가 과발현 되도록 설계된 융합 EGF 유전자 컨스트럭트는 ㈜바이오니아에 합성을 의뢰하여 제조하였다.
구체적으로, EGF 유전자에 융합 파트너로 KSI(ketosteroid isomoerase) 유전자를 결합하여 발현 유도 대장균(E. coli)내에서 봉입체(inclusion body)를 형성하며 융합 EGF가 과발현(over expression) 되도록 제조하였고 사이트 특정 단백질분해효소(site specific protease)인 Factor Xa를 이용하여 상기 KSI로부터 EGF를 용이하게 분리할 수 있도록 KSI와 EGF 사이에 Factor Xa 인식부위(recognition site)를 추가하였다. 또한 재조합 EGF 정제가 용이하도록 N-말단(N-terminal)에 정제용histag을 추가하였고 재조합 균주 내에서 EGF의 발현이 용이하도록 DNA 서열을 수정하여 상피세포성장인자(EGF)가 과발현 되도록 설계된 융합 EGF 유전자 컨스트럭트를 제작하였다(도 1). 상기 융합 EGF 유전자 컨스트럭트(histag-KSI-Factor Xa recognition site-EGF)의 제조에 사용된 모든 유전자의 핵산서열을 하기 표 1에 표시하였다.
유전자 핵산 서열(5' -> 3') 서열번호
histag-KSI-Factor Xa recognition site- EGF CACCACCACCACCACCACATGCATACCCCAGAACACATCACCGCCGTGGTACAGCGCTTTGTGGCTGCGCTCAATGCCGGCGATCTGGACGGCATCGTCGCGCTGTTTGCCGATGACGCCACGGTGGAAGACCCCGTGGGTTCCGAGCCCAGGTCCGGTACGGCTGCGATTCGTGAGTTTTACGCCAACTCGCTCAAACTGCCTTTGGCGGTGGAGCTGACGCAGGAGGTACGCGCGGTCGCCAACGAAGCGGCCTTCGCTTTCACCGTCAGCTTCGAGTATCAGGGCCGCAAGACCGTAGTTGCGCCCATCGATCACTTTCGCTTCAATGGCGCCGGCAAGGTGGTGAGCATCCGCGCCTTGTTTGGCGAGAAGAATATTCACGCATGCCAGATTGAGGGCAGAAATAGTGATTCTGAGTGTCCCCTGAGTCACGACGGGTATTGTCTCCACGATGGCGTCTGCATGTATATTGAAGCACTGGATAAGTATGCTTGCAATTGTGTGGTGGGCTACATCGGGGAGAGATGCCAATACAGAGACCTCAAATGGTGGGAACTGCGCTGA 4
EGF AATAGTGATTCTGAGTGTCCCCTGAGTCACGACGGGTATTGTCTCCACGATGGCGTCTGCATGTATATTGAAGCACTGGATAAGTATGCTTGCAATTGTGTGGTGGGCTACATCGGGGAGAGATGCCAATACAGAGACCTCAAATGGTGGGAACTGCGCTGA 5
KSI ATGCATACCCCAGAACACATCACCGCCGTGGTACAGCGCTTTGTGGCTGCGCTCAATGCCGGCGATCTGGACGGCATCGTCGCGCTGTTTGCCGATGACGCCACGGTGGAAGACCCCGTGGGTTCCGAGCCCAGGTCCGGTACGGCTGCGATTCGTGAGTTTTACGCCAACTCGCTCAAACTGCCTTTGGCGGTGGAGCTGACGCAGGAGGTACGCGCGGTCGCCAACGAAGCGGCCTTCGCTTTCACCGTCAGCTTCGAGTATCAGGGCCGCAAGACCGTAGTTGCGCCCATCGATCACTTTCGCTTCAATGGCGCCGGCAAGGTGGTGAGCATCCGCGCCTTGTTTGGCGAGAAGAATATTCACGCATGCCAG 6
Histag CACCACCACCACCACCAC 7
Factor Xa recognition site ATTGAGGGCAGA 8
실시예 2: 재조합 벡터 제작
본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 융합 EGF 유전자 컨스트럭트(histag-KSI-Factor Xa recognition site-EGF)를 제한효소 Nde1 및 Xho1로 절단한 후 T7 프로모터(promoter)의 조절 하에, 발현유도체(inducer)인 IPTG 유도시 융합 EGF(fused EGF)가 과발현 되도록 설계되어 있는 pET31b(+) 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제작하였고 발현균주인 BL21(DE3)pLysS로 형질 전환시켰다(도 2).
실시예 3: 융합 EGF의 발현 확인
본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 균주 내의 융합 EGF 유전자 컨스트럭트의 발현을 관찰하였다. 구체적으로, 재조합 균주인 BL21(DE3)pLysS를 0.5% NaCl, 0.5% 효모 추출물 및 1% 트립톤(tryptone)을 포함하는 LB 배지에 1%를 접종하고 37℃에서 220 rpm으로 진탕 배양(shake culture)하였고 OD700=0.6~0.8까지 배양한 뒤 1 mM IPTG를 첨가하여 5시간 동안 배양함으로써 발현을 유도하였다. 이어서 원심분리 후 수득한 세포를 용해하였고 상기 세포용해물(cytolysate)을 전기영동(SDS-PAGE)을 통하여 융합 EGF 유전자 컨스트럭트의 과발현(20.95 kDa)을 확인하였다(도 3).
실시예 4: 융합 EGF의 정제
본 발명의 일 실시예에 따라 융합 EGF를 배양하여 정제하였고 정제 결과를 확인하였다. 구체적으로, 융합 EGF의 정제는 N말단에 태그(tagging)된 폴리 히스티딘(poly histidine)과 Ni-NTA++ 레진(resin)의 친화도(affinity)를 이용하여 정제를 수행하였다. 먼저, 0.5% NaCl, 0.5% 효모 추출물 및 1% 트립톤을 포함하는 LB 배지에 1%를 접종하였고 37℃에서 220 rpm으로 진탕 배양하였다. 이어서, OD600=0.6~0.8까지 배양한 뒤 1 mM IPTG를 첨가하여 5시간 동안 배양하였고 IPTG 유도를 마친 후 원심분리하여 세포만을 회수하였으며 Tris-Cl, 염화나트륨(NaCl), 이미다졸(imidazole) 및 요소(urea)가 포함된 완충액에 재부유(resuspension)한 후 상기 세포를 용해(lysis)하였다. 이어서 상기 세포를 원심분리하여 상층액만 분리한 후 Ni-NTA++ 레진과 1시간 동안 진탕배양하였고 300 mM의 이미다졸을 첨가하여 상기 레진으로부터 융합 EGF가 용출되도록 하였으며 상기 용출된 융합 EGF는 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 정제 결과를 확인하였다(도 4).
실시예 5: EGF의 분리
본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 융합 EGF 유전자 컨스트럭트에서 재조합 EGF를 분리하였다. 구체적으로, 20 mM Tris-Cl(pH 8.0), 100 mM NaCl 및 2 mM CaCl2을 포함하는 반응완충액(reaction buffer)에 융합 EGF 유전자 컨스트럭트(histag-KSI-Factor Xa recognition site-EGF)와 Factor Xa를 함께 첨가하고 25 ℃에서 6 시간 동안 절단 반응(cleavage reaction)을 수행하였다(도 5). 이 후, KSI와 EGF의 분리로 하얗게 침전물이 발생하였고 상기 반응액을 14000 rpm의 조건으로 10분 동안 원심분리(centrifugation)를 수행한 후 상층액 내 재조합 EGF를 수득하였다(도 6).
실시예 6: 재조합 EGF의 N 말단 분석
본 발명의 일 실시예에 따라 KSI로부터 분리된 EGF의 정확한 분리 여부를 확인하기 위하여 N-말단 분석을 수행하였다. 구체적으로 상기 실시예 5를 통해 분리한 재조합 EGF 샘플을 한국기초과학연구원에 의뢰하여 Factor Xa에 의한 KSI와 EGF의 정확한 분리 여부를 Procise 491 HT 단백질 서열분석기(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 N-말단 아미노산 서열분석을 수행하였다(도 7). 그 결과, Factor Xa에 의해 KSI와 재조합 EGF가 정확하게 분리되었음을 확인하였다.
상기 재조합 EGF의 N-말단 분석 결과를 하기 표 2에 표시하였고 하기 표 2의 밑줄은 검출된 주요 아미노산을 나타내고 있다.
EGF 아미노산 서열 NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR
(서열번호 2)
Cleaved rEGF N-terminal sequencing 결과
 1. Asn, Tyr, Phe
2. Ser, Ile, Ala, His, Val
3. Asp, His, Arg, Phe
4. Ser, Ala, Asn, Pro
5. Glu, Leu
실시예 7: 재조합 EGF의 활성 테스트
본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 재조합 EGF의 세포증식 효과를 비교하기 위하여 MTS assay를 수행하였다. 구체적으로, Balb/c 3T3 세포를 세포주(cell line)로 하여 상기 세포에 PBS를 처리한 음성대조군, 일반 EGF를 처리한 양성대조군 및 본 발명의 재조합 EGF를 처리한 실험군으로 분류하고 0~100 ng/ml의 농도로 처리한 뒤 48시간 동안 배양하여 재조합 EGF 처리에 따른 상기 각 실험군의 세포증식(cell proliferation) 효과를 측정하였다. 그 결과, 일반 EGF를 처리한 양성대조군과 비교하여 본 발명의 재조합 EGF를 처리한 실험군에서 더 높은 세포증식효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 8).
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> LSM CO. , LTD <120> Method for producing recombinant epidermal growth factor <130> PD16-5329 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KSI <400> 1 Met His Thr Pro Glu His Ile Thr Ala Val Val Gln Arg Phe Val Ala 1 5 10 15 Ala Leu Asn Ala Gly Asp Leu Asp Gly Ile Val Ala Leu Phe Ala Asp 20 25 30 Asp Ala Thr Val Glu Asp Pro Val Gly Ser Glu Pro Arg Ser Gly Thr 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Glu Phe Tyr Ala Asn Ser Leu Lys Leu Pro Leu Ala 50 55 60 Val Glu Leu Thr Gln Glu Val Arg Ala Val Ala Asn Glu Ala Ala Phe 65 70 75 80 Ala Phe Thr Val Ser Phe Glu Tyr Gln Gly Arg Lys Thr Val Val Ala 85 90 95 Pro Ile Asp His Phe Arg Phe Asn Gly Ala Gly Lys Val Val Ser Ile 100 105 110 Arg Ala Leu Phe Gly Glu Lys Asn Ile His Ala Cys Gln 115 120 125 <210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF <400> 2 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1 5 10 15 Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn 20 25 30 Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys 35 40 45 Trp Trp Glu Leu Arg 50 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor Xa recognition site <400> 3 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 4 <211> 567 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> histag-KSI-Factor Xa recognition site- EGF <400> 4 caccaccacc accaccacat gcatacccca gaacacatca ccgccgtggt acagcgcttt 60 gtggctgcgc tcaatgccgg cgatctggac ggcatcgtcg cgctgtttgc cgatgacgcc 120 acggtggaag accccgtggg ttccgagccc aggtccggta cggctgcgat tcgtgagttt 180 tacgccaact cgctcaaact gcctttggcg gtggagctga cgcaggaggt acgcgcggtc 240 gccaacgaag cggccttcgc tttcaccgtc agcttcgagt atcagggccg caagaccgta 300 gttgcgccca tcgatcactt tcgcttcaat ggcgccggca aggtggtgag catccgcgcc 360 ttgtttggcg agaagaatat tcacgcatgc cagattgagg gcagaaatag tgattctgag 420 tgtcccctga gtcacgacgg gtattgtctc cacgatggcg tctgcatgta tattgaagca 480 ctggataagt atgcttgcaa ttgtgtggtg ggctacatcg gggagagatg ccaatacaga 540 gacctcaaat ggtgggaact gcgctga 567 <210> 5 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF <400> 5 aatagtgatt ctgagtgtcc cctgagtcac gacgggtatt gtctccacga tggcgtctgc 60 atgtatattg aagcactgga taagtatgct tgcaattgtg tggtgggcta catcggggag 120 agatgccaat acagagacct caaatggtgg gaactgcgct ga 162 <210> 6 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSI <400> 6 atgcataccc cagaacacat caccgccgtg gtacagcgct ttgtggctgc gctcaatgcc 60 ggcgatctgg acggcatcgt cgcgctgttt gccgatgacg ccacggtgga agaccccgtg 120 ggttccgagc ccaggtccgg tacggctgcg attcgtgagt tttacgccaa ctcgctcaaa 180 ctgcctttgg cggtggagct gacgcaggag gtacgcgcgg tcgccaacga agcggccttc 240 gctttcaccg tcagcttcga gtatcagggc cgcaagaccg tagttgcgcc catcgatcac 300 tttcgcttca atggcgccgg caaggtggtg agcatccgcg ccttgtttgg cgagaagaat 360 attcacgcat gccag 375 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Histag <400> 7 caccaccacc accaccac 18 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor Xa recognition site <400> 8 attgagggca ga 12

Claims (10)

  1. 친화성 태그(affinity tag) 및 에피토프 태그(epitope tag)로 구성되는 군으로부터 선택되는 분리-정제를 위한 태그(tag);
    서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 KSI(ketosteroid isomoerase);
    단백질 절단효소 인식부위(protease recognition site); 및
    서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 상피세포성장인자(EGF)를 포함하는, 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 절단효소는 트롬빈, TEV(tobacco etch virus) 프로테아제, 프리시션(PreScission) 프로테아제, Factor Xα 또는 엔테로키나아제(Enterokinase)인, 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 단백질 절단효소는 Factor Xa인, 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 단백질 절단효소 인식부위는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 친화성 태그(affinity Tag)는 히스티틴 태그(histidine tag), 글루타치온 전이효소(glutathione s transferase, GST), 인테인(Intein) 또는 말토스 결합단백질(maltose binding protein, MBP)인, 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 에피토프 태그(epitope tag)는 플래그 태그(FLAG tag), Myc, V5 또는 HA인, 재조합 상피세포성장인자 생산용 융합 단백질.
  9. 제1항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포 준비단계;
    상기 형질전환 숙주세포를 배양배지에서 배양하는 형질전환 숙주세포 배양단계;
    상기 배양된 형질전환 숙주세포로부터 상기 융합 단백질을 정제하는 정제단계; 및
    상기 융합 단백질에 단백질 절단효소를 처리하여 재조합된 상피세포성장인자를 절단하고 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 상피세포성장인자 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 단백질 절단효소는 트롬빈, TEV(tobacco etch virus) 프로테아제, 프리시션(PreScission) 프로테아제, Factor Xα 또는 엔테로키나아제(Enterokinase)인, 재조합 상피세포성장인자 제조방법.






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