KR101228580B1 - 신데칸―４ 막관통 전구체（Ｓｙｎ―４―ＴＭ） 펩타이드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 펩타이드의 대량생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM)) 펩타이드를 과발현시킬 수 있도록 설계된 재조합 발현벡터 및 이를 이용하여 실제로 펩타이드를 대량생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

신데칸―４ 막관통 전구체（Ｓｙｎ―４―ＴＭ） 펩타이드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 펩타이드의 대량생산방법{Recombination expression vector comprising Syn-4-TM peptide and mass-production method of peptide thereof}

본 발명은 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드의 대량생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드를 과발현시킬 수 있도록 설계된 재조합 발현벡터 및 이를 이용하여 실제로 펩타이드를 대량생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

세포막은 많은 단백질들을 포함하고 그것은 대략 25,000개의 막 단백질과 관련된 사람의 유전자 코드의 30퍼센트이다. 막을 관통하는 단백질들(TMPs)은 이온, 호르몬, 영양분 그리고 세포 안과 밖의 신호를 전달하는 분자들과 같은 물질들의 이동을 조절하는 역할로서 세포 막의 내부에 포함되어 있다. 그것들의 대다수는 몸 안의 주요 질병의 진행과정에 관여하고, 모든 TMPs들의 50 % 이상은 제약 타깃과 관련되어 있다. TMPs들의 생물학적 그리고 의학적인 중요함에도 불구하고, 그들의 구조와 분자 메커니즘들은 수용성 단백질들의 광범위한 구조적, 기능적 정보들과 비교하였을 때 매우 낮은 수준으로 이해되고 있다. 이러한 불균등은 TMPs의 대량의 발현과 정제를 어렵게 하고 많은 생물물리학적/생화학적 그리고 구조적 연구를 어렵게 만드는 소수성의 시퀀스 때문이다. 이러한 어려움에도 불구하고 최근에 많은 TMPs들의 발현과 정제가 보고되고 있다. 그들은 TMPs의 낮은 수준의 발현, 고유의 안 좋은 용해성과 내재된 독성 때문에 다른 발현 시스템과 다양한 정제 방법을 사용하여 재조합된 TMPs를 생산한다. 그러나 현재는, TMPs에 대한 사용 가능한 이상적인 생산 시스템이 없다. 그러므로 TMPs의 밀리그람 단위의 정제에 대한 효과적인 시스템의 확립은 벡터 구성, 적합한 호스트의 선택과 발현, 정제의 조건의 최적화가 필요하다.

신데칸은 세포-세포 그리고 세포-기질 상호작용에 참여하는 세포 표면 수용기의 중요한 역할을 한다. 대부분의 세포 유형에 존재하는 네 개의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸들을 구성하는 신데칸 패밀리들과 각각의 신데칸들은 공통의 구조를 공유한다. 신데칸들의 세포질 영역과 막을 관통하는 영역은 매우 보존된 부분이지만, 세포 밖 영역의 시퀀스들은 헤파란 설페이트가 부착되는 위치를 제외하고 각기 다르다. 세포 밖 영역의 중심 단백질의 시퀀스의 차이는 신데칸 패밀리 사이의 기능적인 면에서의 차이를 이끌 것이다. 사실, 네 개의 신데칸들은 세포와 분화 특이적으로 발현되고 그들의 헤파란 설페이트 체인들은 다양한 성장요소, 효소, 응고요소 그리고 세포 밖 기질 리간드와 상호작용한다. 그러므로, 신데칸들은 현재 세포 밖 정보들의 중요한 변환기로서 인식되고 상처회복, 혈관형성, 신경 수상 돌기의 형성 등을 포함하는 다양한 발육 과정과 관련되어 있다.

최근에는 신데칸-4 세포질 영역 또는 세포 밖 영역의 구조적 성질과 생물학적 기능의 광범위한 연구가 되고 있다. 신데칸-4는 다양한 세포 유형에서 세포 밖 기질-유도 신호 형질도입이 일어나는 초점 접착역의 성분이다. 신데칸-4는 섬유아세포 성장 요소-2 신호를 조절할 수 있다. 이러한 신호 변환은 리간드가 단일 막 관통 영역을 포함하는 세포-표면 수용체 단백질과 결합하면서 시작한다. 최근의 생화학적 그리고 구조적인 연구들은 신데칸-4의 세포 밖 영역과 결합하는 성장요소가 비공유결합의 이합체 형성을 유도한다는 것을 보여주고 있다. 특히, 신데칸-4의 소중합체를 유도하는-막 관통 영역은 신데칸-4가 중재하는 단백질 키나아제 Cα와의 상호작용 그리고 활성화에서 초점 접착역 형성과 축소와 같은 단백질 기능에 중요한 역할을 한다. 비록 상당한 진보가 되고 있지만, 신데칸-4 신호전달에서 신데칸-4 막 관통 영역의 역할은 여전히 논란이 많고, 신데칸4-TM(막관통 영역)의 고 해상도의 구조의 발견은 불충분한 수득율과 낮은 용해성 때문에 힘들다. 또한 종래의 신데칸-4 펩타이드는 실험실 수준에서 미량으로 수득하는 수준에 불과하였을 뿐 대량생산에는 적합하지 않은 문제가 있었다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 대량생산하기에 적합한 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두번째 과제는 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 대장균을 배양하고 적절하게 처리하여 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 L당 5㎎ 이상 수득할 수 있는 대량생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상술한 첫번째 과제를 달성하기 위하여, a) 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)를 코딩하는 유전자 및 b) 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 코딩하는 유전자가 작동적으로 결합된 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현벡터는 도 1의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 재조합 pET31b 벡터일 수 있다.

본 발명의 두번째 과제를 달성하기 위하여, 1) 제1항 또는 제2항의 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환하는 단계; 2) 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질을 m9 배지에서 과발현시키는 단계; 3) 상기 발현된 융합 단백질을 용해 및 원심분리하여 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)로 상기 대장균으로부터 회수하는 단계; 4) 상기 불용성 재조합 융합단백질을 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제하는 단계, 5) 상기 정제된 불용성 재조합 융합단백질을 산성조건에서 CNBr로 절단하는 단계; 및 6) 상기 절단된 불용성 재조합 융합단백질을 역상 HPLC를 수행하여 타겟 펩타이드 조각을 수득하는 단계를 포함하는 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드의 대량생산방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 기 6) 단계의 역상 HPLC의 용리액은 2종류의 용리액 A, B가 사용되며, 이 중 용리액 A는 이소프로판올 2 ~ 4중량%, 아세토니트릴 0.05 ~ 0.2 중량%, 트리플루오로아세트산 0.05 ~ 0.2중량% 및 잔량의 물을 사용하고, 용리액 B로서 이소프로판올 45 ~ 50 중량%, 아세토니트릴 25 ~ 30중량%, 트리플루오로에탄올 18 ~ 22중량%, 트리플루오로아세트산 0.05 ~ 0.2중량% 및 잔량의 물을 사용할 수 있다.

이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.

별도로 설명되어 있지 않다면, 용어 '핵산(nucleic acid)'은 단일- 또는 이중나선 형태에서 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 가리키고, 자연 발생하는 뉴클레오타이드와 비슷한 방식에서 핵산과 결합하는 본래 뉴클레오

타이드의 알려진 유사체들을 포함하며, 특별한 언급이 없는 한, 특정 핵산 서열은 그들의 상보적 서열을 포함한다.

'작동적으로 결합된(operatively linked to)'은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열(예컨대, KSI-L)사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.

세포와 관련하여 사용되는 용어 '재조합(recombinant)'은 세포가 이형의 핵산을 복제하거나 이형의 핵산에 의해 코드화되는 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 것을 가리킨다. 또한 재조합 세포는 세포의 본래 형태에서 발견되는 유전자를 발현시킬 수 있으나, 변형된 유전자가 인공적인 방법에 의해 세포로 재도입 되어지기도 한다.

'프로모터'는 원하는 단백질의 유전자가 상기 프로모터의 다운스트림에 융합되었을 때 식물 세포에서 단백질의 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 의미한다. 또한 본 발명의 프로모터는 다른 전사-번역 활성 서열에 결합하여 더욱 변형될 수 있다.

'발현 카세트(expression cassette)'는 그러한 서열에 적합한 호스트에서 구조 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 핵산 요소를 지닌 발생되거나 합성적으로 된 핵산 구조물이다. 발현 카세트는 적어도 프로모터들을 선택적으로 전사 종결 시그널을 포함한다. 일반적으로, 발현 카세트는 전사되는 핵산과 프로모터를 포함한다. 또한 발현에 영향을 주는 추가 요소들로는 여기에 기술된 것과 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 또한 호스트 세포로부터 발현된 단백질의 분비를 지시하는 시그널 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 구조물을 구성하는 변형된 세포를 선택하기 위해, 선택 마커 유전자를 발현 카세트에 편리하게 포함될 수 있으며, 당업자는 상기 이 벡터 성분이 그것의 기능에 실질적인 영향 없이 변형될 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 발현벡터는 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드를 대량생산하기에 가장 적합한 발현 카세트를 포함하고 있어, 이를 대장균에 형질전환한 뒤 본 발명의 대량생산방법을 통해 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드를 정제하는 경우 L당 5 ㎎ 이상의 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드 펩타이드를 생산할 수 있다.

따라서, 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드를 대량으로 수득할 수 있으므로, 미세량만으로는 수행할 수 없었던 상기 펩타이드들의 3차원 구조, 형성 매커니즘의 규명 및 치료제를 개발하는데 대단히 유용하다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 재조합 pET31b 벡터의 개열지도이다.
도 2a는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 신데칸4-TM의 애닐링된 DNA의 2 % 아가로오즈 젤 의 전기영동 사진이고, 도 2b는 삽입된 DNA의 확인을 위한 Novablue 세포 배양으로부터 추출된 발현 벡터의 1.5 % 아가로오즈 젤의 전기영동 사진이다.
도 3a는 발현, 정제한 KSI-융합된 신데칸4-TM의 14 % SDS-PAGE 결과이고, 도 3b는 CNBr로 절단된 단백질들의 12 % 트리스-트라이신 PAGE 결과이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 4a는 신데칸4-TM의 역상 HPLC 크로마토그램 이고, 도 4b는 도 4a의 크로마토그램(A)에서 HPLC 부분의 12 % 트리스-트라이신 PAGE 결과이다.
도 5는 HPLC 정제로부터 얻은 전체적으로 ¹⁵N로 치환된 신데칸4-TM의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼이다.
도 6은 정제된 신데칸4-TM 펩타이드들의 계면활성제의 농도와 pH값의 함수로써 얻어진 원편광 이색성 스펙트라이다.
도 7은 ¹⁵N-치환된 신데칸4-TM의 ¹H - ¹⁵N HSQC 스펙트라이다.
도 8a는 비교예 1에 따른 신데칸4-TM의 역상 HPLC 크로마토그램이고, 도 8b는 도 8a의 크로마토그램(A)에서 HPLC 부분의 12 % 트리스-트라이신 PAGE 결과이다.
도 9a는 비교예 2에 따른 신데칸4-TM의 역상 HPLC 크로마토그램이고, 도 9b는 도 9a의 크로마토그램(A)에서 HPLC 부분의 12 % 트리스-트라이신 PAGE 결과이다.

상술한 바와 같이, 종래에 개시된 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드는 실험실 수준에서 미량으로 수득하는 수준에 불과하였을 뿐 대량생산에는 적합하지 않은 문제가 있었다.

이에 본 발명에서는 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드의 대량생산에 적합한 a) 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)를 코딩하는 유전자 및 b) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM)를 코딩하는 유전자가 작동적으로 결합된 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 대장균에 형질전환한 뒤 본 발명의 대량생산방법을 통해 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 정제하는 경우 L당 5 ㎎ 이상의 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 생산할 수 있다.

먼저, 본 발명의 재조합 발현벡터는 포함된 발현 카세트의 내부에 a) 혼성 파트너 결합단백질의 일종인 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)를 코딩하는 유전자를 필수적으로 포함한다. 혼성 파트너 결합단백질은 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드와 결합하여 과발현을 유도하나 실제 항균활성에 기여하지는 않으나 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드의 활성을 저해하여 숙주세포가 정상적으로 생장할 수 있는 역할을 수행하는 것으로 본 발명의 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 대량으로 발현시키기 위해서는 반드시 필요하다. 상기 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)가 본 발명의 발현 카세트에 포함되지 않는 경우 세포독성으로 인하여 숙주세포가 자라지 못하여 융합단백질의 발현이 거의 불가능하다. 결국 본 발명의 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)는 융합단백질을 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion bodies)의 형태로 발현시키므로 세포독성을 최소화하여 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드의 대량생산이 가능하도록 보조하는 역할을 수행하는 것이다. 본 발명의 혼성 파트너 결합단백질은 바람직하게는 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)를 사용하는 것이 다른 공지의 혼성 파트너 결합단백질을 사용하는 것에 비하여 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드의 대량생산에 매우 유리하다. 한편, KSI는 당업계에 알려진 유전자를 그대로 사용하거나 약간 변형하여 사용할 수 있으나 가장 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 KSI를 사용하며, 이를 코딩하는 핵산의 염기서열은 서열번호 6에 수록되어 있다.

다음, 본 발명의 재조합 발현벡터는 포함된 발현 카세트의 내부에는 상기 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)를 코딩하는 유전자와 작동적으로 결합된 b) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM)를 코딩하는 유전자를 포함한다. 구체적으로, 서열번호 1(VLAAL IVGGV VGILF AVFLI LLLVY)의 아미노산 서열은 야생형 신데칸-4 막관통 전구체의 150 ~ 174 번 잔기에 대응하는 25개의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 것이면 이를 코딩하는 유전자 염기서열은 제한이 없으나 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 유전자 염기서열을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서, 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드의 과발현을 증대시켜 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드를 대량생산하기 위하여 서열번호 2(VLAALIVGGVVGILFAVFLILLLVYGGKKKK)로 표시되는 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드를 사용할 수 있다. 상기 서열번호 2로 표시되는 신데칸-4 막관통 전구체는 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산의 3' 말단에 6개의 아미노산 잔기(GG KKKK)를 더 포함하는 신규한 아미노산 서열이다.

상기 서열번호 2로 표시되는 신규한 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 비하여 보다 많은 융합단백질의 발현을 유도할 수 있어 대량생산에 훨씬 적합하다(실시예 1 이하 참조). 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 것이면 이를 코딩하는 유전자 염기서열은 제한이 없으나 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 유전자 염기서열을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 서열번호 1 ~ 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 코딩하는 유전자가 1 내지 8회 반복되어 있을 수 있다. 이를 통해 본 발명의 재조합 발현벡터의 발현 시 상기 유전자를 많이 반복되므로 보다 많은 신데칸-4 막관통 전구체 펩타이드를 수득할 수 있는 것이다.

나아가, 본 발명에 적용되는 서열번호 1 ~ 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 후속되는 NMR 실험 등의 편의성을 위해 비방사성인 안정한 동위원소를 이용하여 표지될 수 있으며, 바람직하게는 ¹⁵N으로 표지될 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 발현벡터 그로부터 발현되는 재조합 펩타이드 또는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 발현 카세트의 내부에 (KSI)-(Syn-4-TM) 의 5- 또는 3-말단의 인접한 위치에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), FLAG, 5 ~ 7x His (hexahistidine), NusA (N utilization substance A) 또는 Trx(Thioredoxin)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 포함될 수 있다. 그러나 가장 바람직하게는 5 ~ 7x His (hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 포함되는 경우에 발현효율을 극대화시킬 수 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 역상 크로마토그래피를 통하여 신속하고 간단하게 정제될 수 있는 것이다.

상술한 발현 카세트의 주요 구성요소들을 포함하는 발현 프레임의 구체적인 구성은, 결합 단백질인 KSI를 코딩하는 유전자에 본 발명의 서열번호 1 ~2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 코딩하는 유전자를 1회 내지 8회 반복하여 연결하고, 특히 2회 이상 반복하는 경우 각 펩타이드의 중간에는 후술하는 CNBr을 통해 절단할 수 있도록 메치오닌 코돈을 삽입하고 C 말단 부위에 메치오닌 코돈 및 6개의 히스티딘(His)으로된 아미노산을 포함하는 발현 벡터로 이루어진다. (N'- KSI(Met)- 서열번호 1 ~ 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드 중 어느 하나를 1 ~ 8회 반복(각 펩타이드 사이에 Met) - (Met) 6His - C'의 구조).

한편, 본 발명의 재조합 발현벡터는 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는, 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol.,158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 발현벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 바람직한 발현벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322,pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예:SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 가장 바람직하게는 pET-31b(노바젠)을 발현벡터로 하여 상술한 본 발명의 서열번호 ` 또는 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 도 1의 개열지도를 가지는 재조합 발현벡터를 제작하여 이를 대량생산에 활용하는 것이 가장 높은 수율을 가진다. 상기 재조합 발현벡터의 서열번호 8의 169번째 잔기 내지 265번째 잔기가 서열번호 4로 표시되는 핵산서열이 삽입된 부분이다.

상술한 본 발명의 재조합 발현벡터가 형질전환되는 숙주세포는 대장균을 사용할 수 있으며 바람직하게는 대장균 중 BLR(DE3)pLysS, C41(DE3) 또는 C43(DE3)를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 C43(DE3)를 사용하는 것이 대량생산에 가장 유리하다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 펩타이드의 대량생산방법은 1) 상술한 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환하는 단계, 2) 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질을 m9 배지에서 과발현시키는 단계, 3) 상기 발현된 융합 단백질을 용해 및 원심분리하여 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)로 상기 대장균으로부터 회수하는 단계, 4) 상기 불용성 재조합 융합단백질을 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제하는 단계, 5) 상기 정제된 불용성 재조합 융합단백질을 산성조건에서 CNBr로 절단하는 단계, 6) 상기 절단된 불용성 재조합 융합단백질을 역상 HPLC를 수행하여 타겟 펩타이드 조각을 수득하는 단계를 포함한다.

먼저, 1)단계로서 상술한 본 발명의 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환한다. 본 발명의 대량생산방법에 사용되는 재조합 발현벡터는 상술한 내용과 같으므로 그 설명을 대체한다. 한편, 재조합 발현벡터를 숙주세포인 대장균의 내부로 운반하는 방법은, 통상의 방법에 의해 진행될 수 있으며, 상세하게는 CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. etal., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac.Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

다음, 2)단계로서 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질을 과발현시킨다. 구체적으로, 본 발명의 형질전환된 숙주세포의 배양은 당업계에서 통상적으로 이용되는 배지를 이용하여 실시될 수 있으며, 바람직하게는 LB(Luria-Bertani) 배지 또는 M9 최소배지를 이용하여 형질전환체를 배양할 수 있다. 한편, 상술한 발현 카세트 중 (N'- KSI(Met)- 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드를 1 ~ 8회 반복(각 펩타이드 사이에 Met) - (Met) 6His - C') 부분이 과발현되어 융합단백질로 발현된다. 이 경우 바람직하게는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 발현을 유도할 수 있다.

다음, 3)단계로서 상기 발현된 융합 단백질을 용해하여 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)로 상기 대장균으로부터 회수하는 단계를 거칠 수 있다. 구체적으로, 배양된 숙주세포에서 발현된 융합 단백질을 수득하기 위하여는 상기 숙주세포(대장균)를 파쇄하여야 한다. 파쇄하는 방법은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 핸드 균질기(hand homogenizer), 민싱(mincing), 그라인딩, 블레이드 균질기, 프렌치 프레스, 초음파분쇄, 비드 밀 또는 맨턴-가울린 균질기(Manton-Gaulin homogenizer) 등을 이용하여 실시할 수 있다. 그 뒤 파쇄된 숙주세포로 부터 상기 발현된 융합 단백질이 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)의 형태로 수득된다.

다음, 4)단계로서 상기 용출된 불용성 재조합 융합단백질을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 정제하게 된다. 구체적으로 파쇄된 숙주세포에서는 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)과 세포 파쇄물 등이 혼재되어 있는 데, 이 중 불용성 재조합 융합단백질만을 선별적으로 수득하기 위하여 원심분리 등을 이용하여 불용성 재조합 융합단백질을 용출시킨 후 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제하게 되는 것이다. 보다 구체적으로 본 발명의 융합단백질은 C 말단에 6x His에 융합되어 있으므로 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼을 통해 상기 불용성 재조합 융합단백질만을 선별적으로 수득할 수 있으며, 구체적으로 200㎎/L 이상으로 선별적으로 수득할 수 있다.

다음, 5)단계로서 상기 정제된 불용성 재조합 융합단백질을 산성조건에서 CNBr로 절단한다. CNBr로 메치오닌 코돈을 절단하는 것을 특징으로 하는 생산방법을 제공한다. 구체적으로 상기 산성조건은 불용성 재조합 융합단백질의 절단에 유리한 환경을 조성하기 위한 것이며, 보다 바람직하게는 70%의 포름산을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 CNBr을 불용성 재조합 융합단백질을 산성조건으로 처리한 후 CNBr을 통해 화학적 절단이 이루어지게 되는데, 보다 상세하게는 상술한 본 발명의 발현 카세트에서는 각각의 구성요소 사이에 메치오닌 코돈을 삽입되어 있으므로 이를 발현한 후 CNBr을 처리함으로써 손쉽게 절단할 수 있다.

다음 6)단계로서 상기 절단된 불용성 재조합 융합단백질을 역상 HPLC를 수행하여 타겟 펩타이드 조각을 수득한다. 역상 HPLC란 비극성의 고정상을 사용하여 극성 용매와 비극성 용매의 조성의 변화를 통해 고정상과 타겟 펩타이드 조각 간의 비극성 상호작용 정도에 따라 분리하는 크로마토그래피를 의미하는 것으로서, 본 발명에서는 상기 5) 단계 이후 역상 HPLC를 수행하여 타겟 펩타이드를 수득하는 것이 다른 방법에 비하여 펩타이드의 대량생산에 대단히 유리하다.

한편, 본 발명의 한 측면에 따르면 상기 6) 단계의 역상 HPLC의 용매는 통상적으로 역상 HPLC의 용리액을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 역상 HPLC 용리액으로서 용리액 A는 이소프로판올 2 ~ 4중량%, 아세토니트릴 0.05 ~ 0.2 중량%, 트리플루오로아세트산 0.05 ~ 0.2중량% 및 잔량의 물을 사용하고, 용리액 B로서 이소프로판올 45 ~ 50 중량%, 아세토니트릴 25 ~ 30중량%, 트리플루오로에탄올 18 ~ 22중량%, 트리플루오로아세트산 0.05 ~ 0.2중량% 및 잔량의 물로 이루어지는 용리액을 사용하는 것이 펩타이드의 생산수율을 높이는데 매우 유리하며, 그 뒤 단백질을 녹이기 위한 용매로서 1:4 HFIP/MC에 녹이는 것이 가장 우수한 효과가 나타났다(실시예 3 및 비교예 1, 2 참조).

결국, 본 발명에 따른 재조합 발현벡터는 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 대량생산하기에 가장 적합한 발현 카세트를 포함하고 있어, 이를 대장균에 형질전환한 뒤 본 발명의 대량생산방법을 통해 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 정제하는 경우 L당 5 ㎎ 이상의 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 생산할 수 있다. 따라서, 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 대량으로 수득할 수 있으므로, 미세량만으로는 수행할 수 없었던 상기 펩타이드들의 3차원 구조, 형성 매커니즘의 규명 및 치료제를 개발하는데 대단히 유용하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예 1> 재조합 발현벡터의 제조 및 클로닝

본 실시예에서는 서열번호 2로 표시되는 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 코딩하는 서열번호 4의 유전자 염기서열을 케토스테로이드 아이소머레이져 효소 유전자(서열번호 7) 다음에 반복하여 연결하고 단백질 정제를 쉽게 할 수 있도록 6개 히스티딘 아미노산 잔기를 포함하는 유전자를 C 말단에 부착하여 형질전환이 이루어지는 것으로서 구체적인 내용은 다음과 같다.

구체적으로 신데칸4-TM을 코딩하는 96개 염기를 가진 서열번호 4 및 서열번호 4에 상보적인 서열번호 5로 표지되는 ntergrated DNA Technologies) 화학적으로 합성하였다. 신데칸4-TM은 대략 25개의 무극성의 잔기들과 2개의 글리신과 4개의 리신의 6개 중간 정도로 극성인 잔기들로 구성되어 있다. 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하기 위한 서열번호 4의 염기서열을 준비하였다. 보다 구체적으로 서열번호 4의 핵산서열과 그 상동체인 서열번호 5의 핵산서열은 95 ℃에서 가열하고 상온까지 30 분 이상 점차 냉각시켜 애닐링 하였다. ( 서열번호 4: 5'-GTT CTG GCG GCT CTG ATC GTT GGT GGC GTT GTG GGT ATC CTG TTC GCG GTT TTC CTG ATC CTG CTC CTG GTT TAC GGT GGC AAA AAG AAA AAG ATG -3', 서열번호 4에 상보적인 서열번호 5 : 5'-CTT TTT CTT TTT GCC ACC GTA AAC CAG GAG CAG GAT CAG GAA AAC CGC GAA CAG GAT ACC CAC AAC GCC ACC AAC GAT CAG AGC CGC CAG AAC CAT-3')애닐링 후, N-말단과 C-말단이 생성되고 이런 부착 말단은 AlwN I과 호환 가능하다. 애닐링 과정이 제대로 이루어졌는지 확인하기 위해 아가로오스 젤 전기영동을 이용한다. 만약 올리고들이 이중나선으로 애닐링 되지 않았다면 전기영동에서 밴드로 나타나지 않고 빠져나가게 된다. 즉 DNA 염기쌍 기준물질과 비교하여 애닐링 된 올리고들을 볼 수 있다. 아가로오스 젤 전기영동을 통해 확인한 DNA 이중나선은 추출되고, Encoding 신데칸4-TM의 정제된 DNA 조각(서열번호 4)은 5분 동안 실온에서 Quick T4 DNA ligase (New England Biolabs, USA)와 AlwN I로 인해 잘린 pET-31b(+) 벡터로 ligate된다(도 1 참조). pET-31b(+)에서, monomeric 또는 multimeric 신데칸-4 막관통 전구체 coding sequence는 도 1에서 보여지는 것처럼 6개의 히스티딘의 tag 서열을 upstream과 혼성 파트너로써 125개의 아미노산으로 된 bacterial KSI 유전자의 downstream에 삽입하였다.

애닐링된 DNA들은 젤 정제되고 AlwN I에 의해 탈 인산화된 pET31b(+) 벡터(Novagen, USA, 케토스테로이드 아이소머레이져 효소 유전자(서열번호 7)을 포함하고 있음)로 라이게이션을 수행하여 도 1의 개열지도로 표시되며 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 재조합 발현벡터를 제조하였다. 신데칸4-TM 유전자의 삽입체(insertion)를 확인하기 위해 라이게이션된 혼합물들은 Novablue(Novagen, USA) 활성화 세포로 형질전환 하였다. 플라스미드 DNA는 정제되고, Xba I과 Xho I (New England Biolabs, USA)을 사용하여 절단했다. 제한효소로 절단된 벡터 생성물들은 1.5 % 아가로오즈 젤을 통해 확인하였다.

도 2는 (A) 신데칸4-TM의 애닐링된 DNA의 2 % 아가로오즈 젤 (B) 삽입된 DNA의 확인을 위한 Novablue 세포 배양으로부터 추출된 발현 벡터의 1.5 % 아가로오즈 젤의 전기영동 결과이며, 추출된 플라스미드들은 Xba I과 Xho I 제한 효소로 절단하였다. 도 2a의 레인 1은 DNA 염기쌍 기준물질이고 레인 1는 빈 레인이며 레인 3번과 4 번은 이중나선을 이룬 DNA를 확인 할 수 있다.

도 2b의 레인 1 은 DNA 염기쌍 기준물질이고 레인 2, 3 번은 한 개의 KSI 혼성 단백질 삽입체가 들어간 밴드를 보이고 있다.

적절히 절단된 시료는 대략 4800 bp부근의 벡터 pET31b(+) DNA(노바젠)와 520 bp의 KSI 융합 단백질(그림 2B, 레인 1과 레인 2) 두 부분을 포함한다. 각 플라스미드의 정확한 시퀀스는 자동화 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다. 도 2a는 애닐링 된 DNA 밴드를 확인할 수 있는 2 % 아가로오스 젤이고, 도 2b는 삽입체 확인을 위한 1.5 % 아가로오스 젤이다. 이것은 2 % 아가로오스 젤로부터 추출된 애닐링 된 DNA를 AlwN I으로 잘린 pET-31b(+) 벡터로 ligate 시킨 뒤, 삽입체 확인을 위해 Novablue 활성화 세포로 형질전환 하고 플라스미드 DNA를 정제하여 제한효소로 절단된 벡터 생성물을 내린 젤 전기영동이다.

융합 단백질의 높은 수득율을 얻기 위해, 상기 도 1b로 도시된 재조합된 플라스미드는 세 종류의 대장균 BLR(DE3)pLysS (Novagen, USA), C41(DE3), C43(DE3) (Avidis, France)으로 형질전환을 했고, LB/카베니실린 한천 배지 위에 도말했다. 한천 배지는 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양했다. 잘 분리되어있는 콜로니들을 골라서 5 ml의 LB/카베니실린 배지에서 배양했다. 5 ml의 배양액은 10 ml의 LB/카베니실린 배지에 옮겨 넣은 후 37 ℃에서 다시 배양을 실시했다. 세포들이 600 nm에서 광학밀도가 0.5 에 도달하면, 단백질의 발현은 1 mM IPTG를 첨가함으로써 유도했다. IPTG로 유도된 배양액 속의 융합 단백질의 발현 정도는 12 % SDS-PAGE로 확인했다. SDS-PAGE의 결과로부터, 신데칸4-TM의 단일 삽입체를 포함하는 pET31b(+) 벡터와 형질 전환된 대장균 C43(DE3) 세포를 대량 발현을 위해 선택하였다.

<실시예 2> 융합단백질의 발현

융합 단백질 발현을 위해 단일 콜로니를 20 ml 카베니실린(50 mg/ml) (Amresco, USA)이 들어간 LB 배지에 접종시키는 것에 의해 선 배양이 준비되고, 37 ℃ 에서 하룻밤 동안 배양했다. 완전히 자란 배양액 10 ml를 1 L M9 최소 배지에 옮겨 넣은 후 37 ℃ 에서 다시 배양을 실시하였다. NMR 구조 연구를 위해서 균일하게 ¹⁵N 표지된 단백질들은 1 g/L ¹⁵N-표지 황산암모늄(Cambridge Isotope Lab, USA)을 첨가한 M9 배지에서 과 발현했다. 600 nm 에서 측정한 광학밀도가 0.6 에 도달했을 때, 최종 1 mM이 되도록 IPTG(Amresco, USA)를 첨가했다. 그 뒤 15 시간 후, 세포들은 4 ℃에서 30 분 동안 6000 rpm으로 원심 분리하여 수확한 후 더 나아가 정제를 위해 -80 ℃에서 보관하였다.

도 3a는 (A) 발현, 정제한 KSI-융합된 신데칸4-TM의 14 % SDS-PAGE [레인 1, 분자량 크기 기준물질; 레인 2, IPTG 유도 전; 레인 3, 혼성 단백질 밴드가 보이는 IPTG 유도 후; 레인 4, lysis 후 녹는 부분; 레인 5, lysis 후 융합 단백질을 포함하는 불용성 부분; 레인 6, Ni-NTA 친화 컬럼으로부터 용출된 KSI-융합 단백질]를 나타낸다. 레인 1은 단백질 분자량 기준물질이고 레인 2는 단백질 유도 전으로써 혼성 단백질의 밴드는 보이지 않는다. 레인 3은 단백질 유도 후 17 kDa 근처에서 발현된 혼성 단백질을 확인 할 수 있다. 레인 4는 세포 파쇄 후 상층액으로 14 kDa에 라이소자임의 밴드를 확인 할 수 있고, 레인 5에서 세포 파쇄 후 침전물로써 혼성 단백질 밴드를 확인 할 수 있다. 레인 6은 Ni-NTA 친화 컬럼 후 다른 세포 구성성분들과 분리되어 정제된 혼성 단백질의 밴드를 보인다.

<실시예 3> 역상 크로마토그래피를 이용한 융합단백질의 정제

1 L 배양액으로부터의 냉동된 세포들은 0.5 mg/ml 리소자임(Sigma, USA)을 넣은 100 ml 의 lysis 버퍼(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 15 % glycerol)에서 현탁했고, 얼음에서 초음파 파쇄로 용해하였다. 세포 용해물은 4 ℃에서 30 분 동안 13,200 rpm으로 원심 분리하였다. 불용성의 재조합 융합단백질 펠렛이 모아지고 그 뒤에 6 M 구아니딘-HCl(Fluka, USA)을 포함하는 100 ml의 Ni-NTA binding buffer(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazole, pH 8.0)에 실온에서 12 시간 이상 교반시키며 용해했다. 잔여의 불용성 불순물을 제거하기 위해 용해된 융합단백질은 4℃에서 35 분 동안 13,200 rpm으로 원심 분리하였다. 맑은 상층액은 사전에 50 mM NiSO₄로 대전(charged)되고 결합버퍼에 평형화 된 30 ml Ni-NTA 컬럼에 넣었다. 컬럼은 16 mM Imidazole를 포함하는 세척버퍼를 이용하여 씻어줌으로써 비특이적으로 결합한 단백질들을 제거하고, 결합된 단백질들은 용리 버퍼의 500 mM Imidazole을 이용해 용출하였다. 용출된 융합 단백질은 구아니딘과 염을 제거하기 위해 즉시 10,000 MWCO의 셀룰로오스 막 튜브(Spectra/por, USA)로 옮기고 탈 이온화된 6 L의 물에서 투석과정을 실시하였다. 투석과정 동안 변성된 융합단백질은 원래의 불용성 상태로 침전되며 그 뒤 KSI-혼성 단백질의 불용성 침전물은 동결 건조하여 수득했다. 동결 건조된 융합 단백질은 ml 당 5 mg의 농도로 70 % 포름산(Fluka, USA)으로 완전히 용해하고, 100 mg/ml의 고체 CNBr(Sigma, USA)을 첨가하여 융합 단백질 안의 메티오닌 잔기를 화학적으로 잘랐다.

도 3b는 CNBr로 절단된 단백질들의 12 % 트리스-트라이신 PAGE 분석결과[레인 1, 분자량 크기 기준물질; 레인 2, CNBr 절단 이후의 단백질과 펩타이드 혼합물]이다. 이는 화학적 절단이 잘 이루어 졌음을 의미한다.

이후, 혼합물은 실온에서 6 시간 이상 암실에서 반응시키고 5 배의 탈 이온화된 물을 첨가함으로써 반응을 종결했다. 절단된 혼합물은 포름산과 CNBr에 포함되어있을 불순물을 제거하기 위해 하루 동안 실온에서 MWCO 1,000 인 막 튜브를 사용하여 탈 이온화된 물에서 투석했다. 투석된 용액은 질소 가스로 불어 날린 뒤 동결 건조했다. 신데칸4-TM 펩타이드들은 Delta 600 HPLC 시스템(Waters, USA)에서 semi-preparative 역상 HPLC를 사용하여 정제했다. 컬럼은 Delta Pak C18 (7.8 mm × 300 mm, Waters), 유속은 3 ml/min를 사용했다. 용리액 A는 2 % 아세토니트릴/ 3 % 이소프로판올/ 95 % 물에 0.1 % 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용했고, 용리액 B는 28 % 아세토니트릴/ 47 % 이소프로판올/ 5 % 물/ 20 % 트리플루오로에탄올(TFE)에 0.1 % 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용했다. 단백질 혼합물은 25 % 헥사플루오로이소프로판올(HFIP)/ 75 % 염화메틸렌(MC)에 녹이고, 불용성 부분은 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 1 시간)로 제거했다. 녹은 부분은 0.45 미크론 막 필터를 통해 여과했고, 그 다음 six-port Rheodyne 밸브와 10 ml 시료 loop으로 주입했다. 컬럼은 용리액 A로 평형화하고 단백질 혼합물은 100 분 동안 용리액 B의 0 ~ 100 % 기울기로 분리했다. 용출 윤곽은 PDA 검출기를 사용하여 220 nm와 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 단백질을 포함하는 부분은 직접 흡광도를 확인하면서 받았으며 하루 동안 진공 하에서 동결 건조하였다. 정제된 신데칸4-TM의 순도와 분자량은 12 % 트리스-트라이신 PAGE와 질량분석법으로 확인하였다.

도 4에서 (A) 신데칸4-TM의 역상 HPLC 크로마토그램이다. 1 번 피크에는 14 kDa인 KSI가 용출되었고 2 ~ 5 번의 피크에서 조금씩 패턴이 다른 단백질이 용출된 것을 확인했다. 단백질은 3.2 kDa의 분자량을 갖고 있지만 젤로 확인 한 결과 6 kDa보다 윗부분에 나오기 때문에 단일 형태로 존재하지 않고 단백질 아미노산에 존재하는 시스테인으로 인해 이황화 결합을 하고 있는 이분자체 형태로 존재하는 것을 예상할 수 있다.

도 4b는 크로마토그램(A)에서 HPLC 부분의 12 % 트리스-트라이신 PAGE 분석이다. 각 레인 1 ~ 6은 모두 도 4a의 1 ~ 6 피크를 분취한 것으로서 모든 크로마토그램들은 PDA 검출기를 사용하여 220 nm와 280 nm에서 측정했다.

그 결과 용리액 A를 사용한 경우 신데칸4-TM(3.3 kDa)의 주요 부분이 80 분대에 용출되고 55 분(36 %의 B 용매)에 KSI 융합 파트너(13.4 kDa)가 용출된다. 흥미롭게도, 도 4b에서 보이는 트리스-트라이신 PAGE에서 정제된 신데칸4-TM이 순수한 이합체를 형성하고, 심지어 매우 불안정한 계면활성제인 SDS가 시료 버퍼에 포함되어 있을 때도 형성한다는 것을 보인다.

<비교예 1>

역상 크로마토그래피를 이용한 융합단백질의 정제에서 컬럼은 Delta Pak C4 (7.8mm × 300mm, Waters)을 사용하고 용리액 A는 95 % 물, 5% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하고 용리액B는 5 % 물, 95 % 아세토니트릴, 0.1 % 트리플루오로아세트산을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 신데칸4-TM을 정제하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8의 a는 신데칸4-TM의 역상 HPLC 크로마토그램이고 b는 a의 1 ~ 7의 피크를 분취하여 전기영동한 결과이다. 이를 통해 신데칸4-TM이 순수하게 정제되지 않았음을 확인할 수 있다.

<비교예 2>

역상 크로마토그래피를 이용한 융합단백질의 정제에서 용리액 A는 95 % 물, 5% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하고 용리액B는 5 % 물, 95 % 아세토니트릴, 0.1 % 트리플루오로아세트산을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일하게 실시하여 신데칸4-TM을 정제하였다.

도 9의 a는 신데칸4-TM의 역상 HPLC 크로마토그램이고 b는 a의 1 ~ 7의 피크를 분취하여 전기영동한 결과이다. 이를 통해 신데칸4-TM이 순수하게 정제되지 않았음을 확인할 수 있다.

<실시예 4> 질량분석

신데칸4-TM 펩타이드는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형(MALDI-TOF) 질량분석법에 의해 분석했다. 시료는 20 % TFE/ 80 % MC에 건조된 파우더를 녹여 준비했다. 질량분석스펙트럼은 Voyager-DE STR Biospectrometry spectrometer (Applied Biosystems Inc, USA)에서 얻었다.

도 5는 상기 실시예 3의 HPLC 정제로부터 얻은 전체적으로 ¹⁵N로 치환된 신데칸4-TM의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 도시한 것이다. 신데칸4-TM의 관측된 분자량은 3350.8 Da이고 이는 이론적인 분자량과 잘 일치한다. 질량 스펙트럼 결과 본 발명의 정제방법을 통해 정제된 펩타이드는 높은 순도를 가지며 펩타이드의 degradation이 없다는 것을 알 수 있다.

<실시예 5> 원편광 이색성 평가

미셀안에서의 신데칸4-TM의 이차 구조를 계면활성제 농도와 pH 값의 함수로 원편광 이색성 분광법에 의해 측정하였다. 구체적으로 원편광 이색성 실험은 Jasco J715 spectropolarimeter (Jasco, UK)에서 수행했으며 1 mm 경로 길이의 석영 크벳을 사용했다. 스펙트라는 190 nm와 260 nm사이에서 0.2 nm 간격으로 기록했으며, 1 nm 대역폭, 50 nm min^-1의 스캔 속도 그리고 0.25 s의 반응시간으로 측정했다. 150 M 펩타이드 시료들은 pH 4.0 의 20 ~ 100 mM 도데실포스포콜린(DPC)을 포함하는 10 mM 인산나트륨 버퍼에 녹여 준비했고, pH 4.0, 5.0, 6.0 에서 90 mM DPC를 포함하는 시료를 측정했다. 원편광 이색성 스펙트라는 25 ℃에서 얻었다. 데이터는 5개의 스펙트라를 평균하였다. 펩타이드가 없는 버퍼의 측정은 최종 스펙트라에서 기준선을 맞추기 위해 뺐다. 원편광 이색성 신호 Ψ (mdeg)는 degrees cm² dmol^-1 단위로 평균 잔기 질량 ellipticity, [θ]로 변환된다.

도 6은 정제된 신데칸4-TM 펩타이드들의 계면활성제의 농도와 pH값의 함수로써 얻어진 원편광 이색성 스펙트라[(좌측) pH 4.0에서 20 ~ 100 mM DPC (우측) 90 mM DPC에서 pH 4.0, 5.0, 6.0]이다.

정제된 신데칸4-TM의 원편광 이색성 분광 스펙트럼의 분석은 208 nm와 222 nm에서의 두 개의 최소 흡광을 통해 α나선 구조의 존재를 알 수 있다. 이러한 나선의 이차 구조는 20 ~ 100 mM DPC 농도(도 6 좌측)와 pH 4.0 ~ 6.0(도 6 우측)에서 매우 안정하고 비슷한 구조를 가진다. 이를 통해 단백질의 이차구조가 가지는 비대칭성 때문에 왼쪽 또는 오른쪽으로 회전하는 편광에 따라 흡광도가 달라지는 성질을 원편광 이색성 스펙트럼을 통해 측정할 수 있다. 보통 작은 분자량을 갖는 화합물의 입체화학과 생체 거대분자의 구조분석에 적용된다. 이러한 흡광도 차이가 단백질 이차구조에 대하여 특징적인 스펙트럼을 보이게 되고 이것을 이용해 단백질의 이차구조를 예측할 수 있다.

<실시예 6> 핵자기공명분광

최종 0.5 mM 펩타이드를 포함하는 ¹⁵N-표지된 신데칸4-TM 파우더 시료는 pH 5.5의 10 mM 인산수소이나트륨, 1 mM 아자이드화나트륨, 90 % 물 and 10 % 중수를 포함하는 100 mM perdeuterated DPC-d₃₈ 미셀안으로 녹인다. 액체상 NMR 스펙트라는 Bruker AVANCE 800 MHz 분광기(Bruker Biospin, Germany) 장비에서 얻었고 xyz-gradient unit을 갖는 삼중 공명을 간접적으로 관측하는 프로브를 사용했다. ¹H-¹⁵N HSQC 스펙트라는 indirect dimension에서 에코-안티에코(echo-antiecho) 방법을 사용하여 상-민감 모드(phase-sensitive mode)에서 얻었다. 물의 공명은 water flip-back pulse 를 이용하여 억제하였고, ¹⁵N의 디커플링값은 GARP4 모듈레이션에 의해 얻었다. 스펙트럼은 t2 시간 영역에서 1024 data points와 t1에서 256 increments (각각 8 scan)로 얻었다. Data processing은 TOPSPIN 2.1(Bruker Biospin, Germany)과 NMRPipe 소프트웨어에서 수행하였다.

도 7은 800 MHz Avance 액체 NMR(Bruker Biospin, Germany)에서 측정된 최적화된 NMR 버퍼를 포함하는 100 mM perdeuterated DPC-d₃₈ 에 0.5 mM 농도의 전체적으로 ¹⁵N-치환된 신데칸-4-TM의 ¹H ~ ¹⁵N HSQC 스펙트라이다. 구체적으로 재조합된 신데칸4-TM의 구조적인 상태를 확인하기 위해 NMR 스펙트라를 관측하고 펩타이드가 DPC 미셀안에서 적합한 접힘 구조를 하고 있다는 것을 확인했다. 우리는 HSQC 시료의 측정 조건을 최적화했고, 그것은 위에서 설명했듯이 최적화된 NMR 버퍼에서 pH 5.5와 313 K 이다. 이러한 시료는 안정하고 그것의 스펙트럼은 몇 달이 지나도 변하지 않았다. ¹⁵N 표지된 신데칸4-TM의 ¹H ~¹⁵N HSQC 스펙트럼은 아마이드 N-H 신호의 좋은 분산을 보이고, 도 7 에서처럼 적합한 접힘 구조의 펩타이드를 나타낸다. 폴리펩타이드의 집합체 또는 적합하지 않은 접힘 구조의 경계 표시인 비정상적인 넓은 폭 또는 공명들의 뭉침 현상은 없었다. ¹H ~ ¹⁵N 교차 픽의 대다수는 7.5와 9.0 ppm사이에 있다. 1.5 ppm 넓이의 아마이드 ¹H 화학적 이동의 분산은 미셀안에서 나선의 막 단백질에 대한 전형적인 모습이다. 이 영역에서, 우리는 60개의 강한 아마이드 픽을 관측할 수 있고, 그것은 재조합 신데칸4-TM의 아마이드 그룹의 예상되는 수의 두 배 이상이다. 특히, 5개의 글리신들을 포함하는 시퀀스의 신데칸4-TM의 HSQC 스펙트럼에서 글리신 영역(¹⁵N 화학적 이동 < 110 ppm)에 10 개의 공명들이 있다. 이것은 잠정적으로 신데칸4-TM이 사용된 미셀 조건하에서 비대칭적인 이합체를 형성한다는 것을 나타낸다.

결국 본 발명의 정제방법을 통해 신데칸-4의 막을 관통하는 영역의 성공적인 클로닝과 대장균에서 높은 발현을 처음으로 보였다. 정제된 신데칸4-TM 펩타이드의 NMR 분광법에 요구되는 방법들에 대한 적합한 충분한 양을 얻을 수 있었다. 여기에 설명된 방법들은 신데칸4-TM과 다른 막을 관통하는 단백질들의 삼차 구조를 결정하기 위한 용액과 고체상 NMR 실험을 하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 상처회복, 혈관형성 등에 직접적으로 연관되는 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드를 대량으로 생산할 수 있어 의약산업에 대단히 유용한 발명이다.

<110> Hankuk University Of Foreign Studies Research and Industry-University Cooperation Foundation <120> {Recombination expression vector comprising Syn-4-TM peptide and mass-production method of peptide thereof <130> HPC-2232 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 1 Val Leu Ala Ala Leu Ile Val Gly Gly Val Val Gly Ile Leu Phe Ala 1 5 10 15 Val Phe Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr 20 25 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> syndecan 4 <400> 2 Val Leu Ala Ala Leu Ile Val Gly Gly Val Val Gly Ile Leu Phe Ala 1 5 10 15 Val Phe Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Gly Gly Lys Lys Lys Lys 20 25 30 <210> 3 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 3 gttctggcgg ctctgatcgt tggtggcgtt gtgggtatcc tgttcgcggt tttcctgatc 60 ctgctcctgg tttacggt 78 <210> 4 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> syndecan 4 <400> 4 gttctggcgg ctctgatcgt tggtggcgtt gtgggtatcc tgttcgcggt tttcctgatc 60 ctgctcctgg tttacggtgg caaaaagaaa aagatg 96 <210> 5 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> syndecan 4 <400> 5 ctttttcttt ttgccaccgt aaaccaggag caggatcagg aaaaccgcga acaggatacc 60 cacaacgcca ccaacgatca cagccgccag aaccat 96 <210> 6 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KSI <400> 6 Met His Thr Pro Glu His Ile Thr Ala Val Val Gln Arg Phe Val Ala 1 5 10 15 Ala Leu Asn Ala Gly Asp Leu Asp Gly Ile Val Ala Leu Phe Ala Asp 20 25 30 Asp Ala Thr Val Glu Asp Pro Val Gly Ser Glu Pro Arg Ser Gly Thr 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Glu Phe Tyr Ala Asn Ser Leu Lys Leu Pro Leu Ala 50 55 60 Val Glu Leu Thr Gln Glu Val Arg Ala Val Ala Asn Glu Ala Ala Phe 65 70 75 80 Ala Phe Thr Val Ser Phe Glu Tyr Gln Gly Arg Lys Thr Val Val Ala 85 90 95 Pro Ile Asp His Phe Arg Phe Asn Gly Ala Gly Lys Val Val Ser Ile 100 105 110 Arg Ala Leu Phe Gly Glu Lys Asn Ile His Ala Cys Gln 115 120 125 <210> 7 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSI <400> 7 gttctggcgg ctctgatcgt tggtggcgtt gtgggtatcc tgttcgcggt tttcctgatc 60 ctgctcctgg tttacggt 78 <210> 8 <211> 5838 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant express vector <400> 8 atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60 ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120 tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagcagatgg ttctggcggc 180 tctgatcgtt ggtggcgttg tgggtatcct gttcgcggtt ttcctgatcc tgctcctggt 240 ttacggtggc aaaaagaaaa agatgctggc atgcgtgaat attcttctcg ccaaacaagg 300 cgcggatgct caccaccttg ccggcgccat tgaagcgaaa gtgatcgatg ggcgcaacta 360 cggtcttgcg gccctgatac tcgaagctga cggtgaaagc gaaggccgct tcgttggcga 420 ccgcgcgtac ctcctgcgtc agctccaccg ccaaaggcag tttgagcgag ttggcgtaaa 480 actcacgaat cgcagccgta ccggacctgg gctcggaacc cacggggtct tccaccgtgg 540 cgtcatcggc aaacagcgcg acgatgccgt ccagatcgcc ggcattgagc gcagccacaa 600 agcgctgtac cacggcggtg atgtgttctg gggtatgcat atgtatatct ccttcttaaa 660 gttaaacaaa attatttcta gaggggaatt 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gttccggcgt tatttcttga 1560 tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact 1620 gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt 1680 aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca 1740 aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac 1800 catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat 1860 ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc 1920 ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat 1980 caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca 2040 gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac 2100 cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 2160 ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtaagtt 2220 agctcactca ttaggcaccg ggatctcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca 2280 gctccttccg gtgggcgcgg ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta 2340 tcatgcaact cgtaggacag gtgccggcag cgctctgggt 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ggacagtatt tggtatctgc 4080 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 4140 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 4200 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 4260 tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 4320 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 4380 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 4440 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 4500 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 4560 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 4620 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 4680 gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 4740 agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 4800 gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 4860 atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 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cgggcgctag ggcgctggca 5760 agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag 5820 ggcgcgtccc attcgcca 5838

Claims (4)

1. a) 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)를 코딩하는 유전자 및 b) 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM)를 코딩하는 유전자가 작동적으로 결합된 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 도 1의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 재조합 pET31b인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
3. 1) 제1항 또는 제2항의 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환하는 단계;
   2) 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질을 m9 배지에서 과발현시키는 단계;
   3) 상기 발현된 융합 단백질을 용해 및 원심분리하여 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)로 상기 대장균으로부터 회수하는 단계;
   4) 상기 불용성 재조합 융합단백질을 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제하는 단계,
   5) 상기 정제된 불용성 재조합 융합단백질을 산성조건에서 CNBr로 절단하는 단계; 및
   6) 상기 절단된 불용성 재조합 융합단백질을 역상 HPLC를 수행하여 타겟 펩타이드 조각을 수득하는 단계를 포함하는 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드의 대량생산방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 6) 단계의 역상 HPLC의 용리액은 2종류의 용리액 A, B가 사용되며, 이 중 용리액 A는 이소프로판올 2 ~ 4중량%, 아세토니트릴 0.05 ~ 0.2 중량%, 트리플루오로아세트산 0.05 ~ 0.2중량% 및 잔량의 물을 사용하고, 용리액 B로서 이소프로판올 45 ~ 50 중량%, 아세토니트릴 25 ~ 30중량%, 트리플루오로에탄올 18 ~ 22중량%, 트리플루오로아세트산 0.05 ~ 0.2중량% 및 잔량의 물을 사용하는 것을 특징으로 하는 신데칸-4 막관통 전구체(Syn-4-TM) 펩타이드의 대량생산방법.

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