CN109825522B - 一种无痕化双靶点基因组编辑系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于CRISPR/Cas9和λ‑Red的无痕化双靶点基因组编辑系统，其特征在于：1.pKS9分子量11,681kb，为温敏性质粒。含有基因：受四环素诱导的cas9和recX基因；受阿拉伯糖诱导的λ‑Red完整αβγ重组酶基因；抗性基因amp ^r。2.pCSK分子量2,914 kb，含有两个用于特异性识别基因组的sgRNA插入位点；两个受鼠李糖诱导、用于自身质粒消除的间隔区gRNA序列；抗性基因kan^r。3.在同源臂27bp时，同时双点突变效率皆在92%以上；在同源臂40bp时，同时双基因的1kb替换效率在60%以上，当大片段基因替换和点突变同时进行时，各自的编辑效率不受影响。

Description

一种无痕化双靶点基因组编辑系统

技术领域

本发明属于基因组编辑技术领域，具体涉及一种基于细菌CRISPR/Cas9 II型免疫系统和λ-Red DNA重组系统相结合的高效、无痕化基因组编辑方法。

背景技术

CRISPR（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats），可直译为成簇的、有规律的间隔短回文重复序列，是一种广泛存在于细菌和古生菌基因组中的高效基因剪切器，用于抵御外来遗传物质如噬菌体的侵入。在结构上，该系统由一个前导区(Leader)、多个高度保守的短重复序列区(Repeat)和存在于重复序列区间的多个间隔区(Spacer)所组成。前导区富含AT，长度为300～500bp的区域，一般位于CRISPR上游，被认为是CRISPR的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。间隔区长度为26～72bp，由俘获的外源DNA组成，其功能类似于免疫记忆，即用于细菌对含有该序列的外源DNA再次入侵时的识别，并通过Cas（CRISPR-associated）蛋白对其进行双链剪切。基于Cas蛋白基因序列的不同，CRISPR/Cas系统可分为多种，但只有Ⅱ型CRISPR/Cas9最为简单而被广泛应用。其作用原理是：在前导区的调控下，CRISPR区首先转录为长的pre-crRNA (Pre RISPR RNA)，并逐步加工为含有保守重复序列和间隔区的一系列成熟crRNA，同时进行转录的还有与crRNA重复序列互补的tracrRNA (Trans-activating crRNA)。当crRNA与tracrRNA转录出来后，二者互补配对而形成复合物，通过间隔区特异性识别靶基因序列，引导Cas9核酸内切酶在靶向位点进行双链DNA剪切。由于在细菌中几乎不存在非同源重组的修复功能，因此，该双链断裂将导致外源DNA的降解，从而达到对噬菌体等可识别入侵DNA的有效抵御。但如果此时存在有外源供体DNA片段（Donor）时，由于细菌具有同源重组修复机制而引发外源供体DNA片段与被剪切基因组之间发生同源重组，从而实现对基因组DNA的编辑。可见，CRISPR/Cas并没有基因重组活性，其功能只是造成基因组的双链断裂，因此更适合于基因重组工程中的选择压力或者反向筛选，即只有发生重组的阳性突变子才能保留。

λ-Red源于λ噬菌体基因组,是λ噬菌体与宿主基因组整合、实现溶源化的关键重组系统。其编码基因有exo(α)、bet（β）和gam(γ)，其中exo编码核酸外切酶Exo，功能是从5′降解dsDNA,产生3′突出末端；bet基因编码Bet单链结合蛋白，功能是结合由Exo消化产生的3′单链末端，防止其被单链核酸酶消化，促进外源ssDNA与基因组互补链结合,介导DNA链的退火和交换反应；gam基因编码Gam蛋白，功能是与宿主菌RecBCD结合并抑制其外切酶活性，以保护外源dsDNA片段不被降解。因此，λ-Red可对外源ssDNA、dsDNA与基因组的同源区域发生重组。原核生物细菌的自身同源重组效率一般都非常低，有报道大肠杆菌仅为3×10^-10。而λ-Red系统重组效率达3%甚至更高，从而可有效提高大肠杆菌的重组编辑速度。但这种效率对于阳性重组子筛选仍存在较大困难，目前常用的方法一是采用抗性基因做为筛选标记，该方法的不足之处是需要对后续抗性基因进行清除；方法二是采用直接PCR筛查，但这又需要对大量转化子PCR分析。另外，该系统一次只能对一个基因进行改造，因此，对于多基因改造如代谢工程、合成生物学时，该系统明显难以满足。

因此，将CRISPR/Cas9与λ-Red联合，利用λ-Red的高效重组和CRISPR对背景的高效清除，不仅操作简便，完全达到无痕化，而且可将重组效率进一步提高至50%-100%，可在短时间内达到对多个基因进行有效编辑，实现基因组高通量改造的目的，对大肠杆菌的菌株优化、代谢工程与合成生物都具有重要的科学意义和应用价值。

发明内容

本发明目的：为大肠杆菌工程菌株优化、代谢工程和合成生物学研究提供一个高通量、无痕化基因组编辑工具。

一种基于CRISPR/Cas9和λ-Red的双靶点基因组编辑系统 本发明主要包括两个基础质粒pKS9和pCSK（图1）。其中：pKS9为重组辅助质粒，分子量11,681kb，为温敏性质粒。含基因有：（1）cas9核酸酶基因，该基因的5′端与recX基因连接，并受诱导性四环素启动子调控表达；（2）λ-Red完整的αβγ重组酶基因，并受诱导性阿拉伯糖启动子的调控；（3）抗性基因amp r作为选择性标记。pCSK为CRISPR靶向质粒，分子量为2,914kb，含有：（1）两个用于特异性识别基因组的间隔区，一个受四环素启动子，一个受crRNA leader调控，用于表达两个负向筛选的sgRNA；（2）两个用于自身质粒消除的间隔区序列，并受诱导性鼠李糖启动子表达调控，用于表达分别靶向自身质粒的抗性基因kan r和ColA复制原点的sgRNA；（3）抗性基因kan r作为选择性标记。

两个基础质粒的基因编辑过程及作用原理：

(1) 转入pKS9质粒到宿主E.coli;

(2) 设计两个靶向不同目标基因组位点的sgRNA DNA序列，插入到pCSK，将改造后的pCSK转入到宿主E.coli；

(3) 阿拉伯糖诱导pKS9质粒上的λ-Red重组系统Exo、Beta、Gam的表达，制备感受态胞；

(4) 基因重组：电击导入重组DNA片段（与重组位点同源的单链或双链DNA序列），利用已表达的λ-Red重组系统，在基因组同源位点处发生基因重组（点突变、插入、敲除或替换）；

(5) CRISRP反向筛选：四环素诱导表达pKS9质粒上的Cas9核酸酶，同时表达pCSK质粒上的两个靶向重组位点序列的sgRNA（一个受四环素诱导，一个组成型表达），从而对未发生重组的野生型菌株基因组进行双链剪切。由于原核生物非同源重组功能较弱，从而造成大肠杆菌双链断裂基因组无法修复而死亡。

(6) 改造后的pCSK质粒消除：鼠李糖诱导靶向kan r与pCSK质粒复制原点的sgRNA表达，在四环素诱导表达pKS9质粒上的Cas9核酸酶表达条件下，对改造后的pCSK质粒进行双链剪切，完成该质粒的自我消除。

(7) 新一轮编辑：在完成改造后的pCSK质粒消除后，就可以导入带有新基因靶向的pCSK质粒，用于更多基因的编辑改造。

(8) 在完成所有设计基因的改造后，一方面通过(6)清除pCSK编辑质粒，一方面通过42℃下培养，利用pKS9质粒含有温敏型复制原点的特点，对其进行消除。

(9) 有报道显示pKS9质粒中将recX与cas9基因联合表达，一方面RecX蛋白的过量表达会抑制RecA的活性，以抑制细菌自身修复系统中的错配修复，一方面降低Cas9的基础水平表达，可更好地完成CRIPSR/Cas9系统对野生菌株的消除，提高反向筛选和基因重组效率。

附图说明

图1 pKS9/pCSK 双质粒编辑系统

图2 菌落计数与双点突变效率分析

A .a、c平板菌落为采用pKD46的点突变；b、d平板菌落为采用pKS9/pCSK双质粒的点突变；a、b为含D-半乳糖的麦康凯平板用于鉴定galK基因突变，其中红色为野生型菌落，白色为突变体菌落；c、d为含X-Gal、IPTG的LB平板，用于鉴定lacZ基因突变，其中蓝色菌落为野生型、白色为突变子。B .依据a、b平板上的红白菌落数，计算白色菌落的所占比例，即为galK基因的点突变效率；依据c、d平板上的蓝白色菌落数，同样计算白色菌落的所占比例，即为lacZ基因的点突变效率。

图3 双点突变示意图

A．galK点突变为CgactaA突变为AgactaG，大写为突变碱基。A突变G为无义突变，并产生了一个BfaI的酶切位点，从而为突变子的分子检测提供便利；C突变A为同意突变，并使互补链的PAM位点CGG转变为CTG，从而消除了CRPSPR/Cas9的识别与剪切活性。B .lacZ点突变为CCA突变为GAT，从而产生连续两个无义突变，且该突变破坏了互补链上对应的PAM位点TGG，使其转变为ATC，从而失去了CRPSPR/Cas9的识别与剪切活性。由于在galK点突变中进行PAM位点的消除设计，因此称之为PAM位点依赖性点突变，lacZ不需要对PAM进行对应的消除设计，因此称之为PAM非依赖性点突变。

图4 双基因点突变分子鉴定

galK：采用表1中的检测引物1（galK点突变子检测引物）进行菌落PCR，对PCR产物进行BfaI酶切分析。1、3、6为红色菌落，2、4、5、7-10为白色菌落；lacZ: 采用表1中的检测引物2（lacZ点突变子检测引物）进行菌落PCR，对PCR产物进行CviAII酶切分析。1、3、6为蓝色菌落，2、4、5、7-10为白色菌落。

图5 双基因替换突变

galK突变 . 采用表2中的galK . del700bp.HP引物的PCR扩增产物与基因组上的galK 700bp序列进行替换，替换大小为1247bp；dbpA突变采用表2中的dbpA::lacZ′.ins550.HP引物扩增550bp的lacZ′产物与基因组上的dbpA(约1000bp)序列进行替换。

图6菌落计数与双基因替换突变效率分析

A-D．A、C 平板DH5a菌落为采用pKD46的基因替换突变；B、D平板菌落为采用pKS9/pCSK双质粒的点突变；A、B为含D-半乳糖的麦康凯平板用于鉴定galK基因替换，其中红色为野生型菌落，白色为突变体菌落；C、D为含X-Gal、IPTG的LB平板，用于鉴定lacZ′基因插入，其中蓝色菌落为突变型、白色为野生型。E . 依据A、B平板上的红白菌落数，计算白色菌落的所占比例，即为galK基因的缺失突变效率；依据C、D平板上的蓝白色菌落数，同样计算蓝色色菌落的所占比例，即为插入lacZ′基因效率。

图7 双基因替换突变子分子鉴定

galK缺失 . 采用表21中的检测引物3（galK替换检测引物）进行菌落PCR，其中发生替换突变的PCR产物为1300bp，野生型为750bp。1、3、6为红色菌落，2、4、5、7-10为白色菌落；lacZ′插入采用表2中的检测引物4（dbpA基因替换检测引物）进行菌落PCR，其中发生lacZ′插入的PCR产物为760bp，野生型为1000bp。1、3、6为白色菌落，2、4、5、7-10为蓝色菌落。

图8 同时基因替换和基因点突变效率分析

图9 质粒消除效率

发明详情

以下实施案例仅为了更好地阐明本发明，而非限制本发明的应用范围。

下述实施例中的大肠杆菌均为商业化菌株：E.coli DH5a和E.coli W3110。

下述实施例中的LB培养基配制方法是：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，调pH值7.2，加去离子水至1L，固体培养基需添加琼脂15g。高压灭菌后使用下述实施例中的麦康凯鉴定培养基配制方法是：蛋白胨20g、乳糖10g、牛胆盐5g、氯化钠5g、中性红0.03g，pH值7.2，琼脂15g，加去离子水至1L。高压灭菌后使用下述实施例中的生色试剂用量分别为：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷X-Gal(20mg/mL)40μl/平板，异丙基硫代半乳糖苷IPTG(24mg/mL)40μl/平板，D-半乳糖1%。

下述实施例中的LB培养基鉴定β-半乳糖苷酶lacZ基因突变LB培养基在含有诱导物IPTG和生色底物X-Gal的条件下，X-Gal在β-半乳糖苷酶的催化下产生蓝色产物，使野生型大肠杆菌菌落显示蓝色，而lacZ突变株菌落则显示无色。

下述实施例中的麦康凯鉴定培养基鉴定乳糖激酶galK基因突变麦康凯鉴定培养基在含有D-半乳糖的条件下，野生型大肠杆菌能够分解D-半乳糖产酸，从而引起指示剂中性红颜色变化，显示红色菌落；当galK突变后，导致D-半乳糖无法分解产酸，从而产生无色菌落；

下述实施例中的抗生素用量分别为：氨苄抗生素Amp 100 μg/mL，卡那抗生素Kan50 μg/mL。

下述实施例中的诱导物用量分别为：阿拉伯糖0.2%，四环素Tet 200 ng/mL，鼠李糖0.2%。

下述实施案例中所采用的试剂与试剂盒均可商业购买。

采用质粒：pKS9、pCSK；pKD46(对照质粒，含有完整的λ-Red重组系统)

实施案例一、同时galK（PAM依赖型）和lacZ基因（PAM非依赖型）点突变

采用菌株为大肠杆菌E.coli W3110

表1 双点突变所需的引物与相关序列

（1）pCSK质粒改造：采用表1引物序列，对pCSK质粒进行galK和lacZ靶向序列gRNA的添加：具体方法如下：

galK sgRNA采用USER-LIC克隆方法添加到在四环素启动子后面。具体步骤是将两个含有新靶点galK sgRNA互补单链进行95℃水浴处理5min然后过夜退火，然后与pCSK引物所扩增的pCSK产物混合，经USER酶处理后转入DH5a鉴定，完成pCSK质粒骨架与galK sgRNA结合。

lacZ crRNA靶点的位置在crRNA leader后面，与传统的CRISPR质粒更换靶位点的方法相同。即对两条lacZ crRNA靶向单链95℃处理5min并缓慢退火，同时采用BsaI对pCSK质粒进行酶切和去磷酸化处理，然后对两组产物混合并通过连接酶连接，最后转入DH5a鉴定，完成第二个靶向lacZ的crRNA DNA序列结合。

（2）基因重组：

将质粒pKS9转入W3110中，在含有Amp抗生素的LB液体培养基30℃摇菌培养至OD600值0.4-0.5时，加入阿拉伯糖，在37℃，转速为250r/min的水浴摇床中诱导培养至OD600值0.6（约30min）。随后收集菌体并制备成含10%甘油的电击感受态细胞。

将改造后的pCSK(约200ng)、galK(500ng）和lacZ Oligo DNA序列(500ng）与感受细胞混合，采用1800V，5.0ms电击。电击完成后先在1ml含Amp的LB培养液中培养30℃、250r/min培养1h；然后加入Kan，继续培养2h。进而加入四环素在30℃、转速250r/min的条件下诱导2h。完成后分别涂布在含质粒双抗的LB（IPTG+X-Gal）和麦康凯(D-半乳糖)固体培养基培养过夜，第二对LB的蓝白菌落和麦康凯的红白菌落进行计数，计数结果显示：LB的白斑占总数的92.88%，麦康凯上的白斑占比为95.36%。而采用对照质粒pKD46的结果则是：LB的白斑占总数的1.35%，麦康凯上的白斑占比为1.02%（图2）。

随机挑取平板菌落，采用galK和lacZ检测引物进行分子鉴定。由于在设计galK和lacZ点突变时在galK的突变序列中产生了一个BfaI酶切位点5′-CTAG-3′，而在lacZ突变序列中消除了原有的CviAII酶切位点5′-CATG-3′（图3），因此，对不同菌落的扩增片段的酶切结果（图4）显示，在LB上的蓝白lacZ PCR产物分别显示出了可被酶切和不能酶切的特征，而对麦康凯的红白菌落galK PCR产物的酶切结果正好相反，从而证实蓝、红菌落均为野生型，而白色菌落都是突变菌株。

实施案例二、同时galK基因和ATP依赖的RNA解旋酶dbpA基因替换

采用菌株DH5a，采用表2引物与序列：

表2 同时基因替换和基因插入引物与序列

研究方法同实施案例一，其中700bp左右的galK基因被1247bp片段替换，1000bp的dbpA基因被560bp的lacZ′DNA片段替代。由于lacZ′的插入可以实现DH5a基因组内的α互补，从而使突变株在含有IPTG和XGal的LB平板上形成蓝色菌落。对于galK基因替换后的鉴定仍然采用麦康凯红白斑方法进行初步筛查。另外，本次采用的同源重组序列为双链DNA PCR产物，两侧为40bp同源臂，galK.del700bp.HP引物产生片段为1247bp,dbp A::lac Z ′.ins550.HP引物扩增片段长550bp（图5）。

依平板菌落计数的结果是galK基因的替换率为60.83%、lacZ′基因的插入率为62.21%，而对照pKD46质粒突变效率分别为0.68%和0.72%（图6）。

采用检测引物，对平板上的野生型和突变型菌落进行PCR扩增，结果显示（图7）：对红白菌落采用galK检测引物3进行PCR分析，红色菌落PCR片段大小约为750bp、白色菌落约为1300bp，这是因为1247bp替换了原有的700bp；对蓝白菌落采用检测引物4进行PCR分析，白色菌落的PCR产物大小约1000bp,蓝色菌落约为750bp,这是因为550bp的lacZ’片段取代原序列1000bp的dbpA基因片段的结果。从而证实了平板鉴定结果与分子鉴定结果一致。

实施案例三、同时乳糖激酶galK基因替换和β-半乳糖苷酶lacZ基因点突变

采用菌株：E.coli W3110，采用引物与DNA序列分别由表1的lacZ部分和表2的galK部分组成。

采用方法与实施案例1、2相同。

实验结果显示（图8）：galK的突变效率为61.4%，lacZ的突变效率为95.1%。

实施案例4重组质粒的消除效率分析

由于pCSK质粒的消除可通过四环素与鼠李糖的诱导，激活CRISPR/Cas9系统对自身的识别与剪切，从而达到自我消除的目的；而pKS9质粒因含温敏型复制原点，只需在42℃的培养条件下即可完成对该质粒的自动清除。

图9-A是pCSK质粒随时间的消除效率统计图。其过程是在菌液中加入四环素、鼠李糖诱导CRISPR系统表达，30℃下摇菌，在不同时间取菌涂板，分别涂布在含Kan抗性与不含Kan抗性的平板上，计算pCSK质粒消除效率。观察可得，4h后pCSK质粒消除效率达到95%以上。

图9-B是pKS9质粒的消除曲线图。其过程是将含有pKS9质粒的大肠杆菌接在LB液体培养基中，升温至42℃、200r/min条件下培养，在不同时间取菌涂布在含有Amp与不含Amp的LB平板上并计算pKS9质粒消除效率。曲线结果显示，在42℃下培养6-8h以后，pKS9质粒消除效率达到90%以上。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种无痕化双靶点基因组编辑系统

<141> 2019-03-18

<150> 201811439236x

<151> 2018-11-29

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11681

<212> DNA

<213> 基因编辑辅助质粒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

aacgaatgag tactgcactc gcaacgctgg ctgggaagct ggctgaacgt gtcggcatgg 60

attctgtcga cccacaggaa ctgatcacca ctcttcgcca gacggcattt aaaggtgatg 120

ccagcgatgc gcagttcatc gcattactga tcgttgccaa ccagtacggc cttaatccgt 180

ggacgaaaga aatttacgcc tttcctgata agcagaatgg catcgttccg gtggtgggcg 240

ttgatggctg gtcccgcatc atcaatgaaa accagcagtt tgatggcatg gactttgagc 300

aggacaatga atcctgtaca tgccggattt accgcaagga ccgtaatcat ccgatctgcg 360

ttaccgaatg gatggatgaa tgccgccgcg aaccattcaa aactcgcgaa ggcagagaaa 420

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gagctgcatg ctattttgag aagacaagaa gacttttatc catttttaaa agacaatcgt 4080

gagaagattg aaaaaatctt gacttttcga attccttatt atgttggtcc attggcgcgt 4140

ggcaatagtc gttttgcatg gatgactcgg aagtctgaag aaacaattac cccatggaat 4200

tttgaagaag ttgtcgataa aggtgcttca gctcaatcat ttattgaacg catgacaaac 4260

tttgataaaa atcttccaaa tgaaaaagta ctaccaaaac atagtttgct ttatgagtat 4320

tttacggttt ataacgaatt gacaaaggtc aaatatgtta ctgaaggaat gcgaaaacca 4380

gcatttcttt caggtgaaca gaagaaagcc attgttgatt tactcttcaa aacaaatcga 4440

aaagtaaccg ttaagcaatt aaaagaagat tatttcaaaa aaatagaatg ttttgatagt 4500

gttgaaattt caggagttga agatagattt aatgcttcat taggtaccta ccatgatttg 4560

ctaaaaatta ttaaagataa agattttttg gataatgaag aaaatgaaga tatcttagag 4620

gatattgttt taacattgac cttatttgaa gatagggaga tgattgagga aagacttaaa 4680

acatatgctc acctctttga tgataaggtg atgaaacagc ttaaacgtcg ccgttatact 4740

ggttggggac gtttgtctcg aaaattgatt aatggtatta gggataagca atctggcaaa 4800

acaatattag attttttgaa atcagatggt tttgccaatc gcaattttat gcagctgatc 4860

catgatgata gtttgacatt taaagaagac attcaaaaag cacaagtgtc tggacaaggc 4920

gatagtttac atgaacatat tgcaaattta gctggtagcc ctgctattaa aaaaggtatt 4980

ttacagactg taaaagttgt tgatgaattg gtcaaagtaa tggggcggca taagccagaa 5040

aatatcgtta ttgaaatggc acgtgaaaat cagacaactc aaaagggcca gaaaaattcg 5100

cgagagcgta tgaaacgaat cgaagaaggt atcaaagaat taggaagtca gattcttaaa 5160

gagcatcctg ttgaaaatac tcaattgcaa aatgaaaagc tctatctcta ttatctccaa 5220

aatggaagag acatgtatgt ggaccaagaa ttagatatta atcgtttaag tgattatgat 5280

gtcgatcaca ttgttccaca aagtttcctt aaagacgatt caatagacaa taaggtctta 5340

acgcgttctg ataaaaatcg tggtaaatcg gataacgttc caagtgaaga agtagtcaaa 5400

aagatgaaaa actattggag acaacttcta aacgccaagt taatcactca acgtaagttt 5460

gataatttaa cgaaagctga acgtggaggt ttgagtgaac ttgataaagc tggttttatc 5520

aaacgccaat tggttgaaac tcgccaaatc actaagcatg tggcacaaat tttggatagt 5580

cgcatgaata ctaaatacga tgaaaatgat aaacttattc gagaggttaa agtgattacc 5640

ttaaaatcta aattagtttc tgacttccga aaagatttcc aattctataa agtacgtgag 5700

attaacaatt accatcatgc ccatgatgcg tatctaaatg ccgtcgttgg aactgctttg 5760

attaagaaat atccaaaact tgaatcggag tttgtctatg gtgattataa agtttatgat 5820

gttcgtaaaa tgattgctaa gtctgagcaa gaaataggca aagcaaccgc aaaatatttc 5880

ttttactcta atatcatgaa cttcttcaaa acagaaatta cacttgcaaa tggagagatt 5940

cgcaaacgcc ctctaatcga aactaatggg gaaactggag aaattgtctg ggataaaggg 6000

cgagattttg ccacagtgcg caaagtattg tccatgcccc aagtcaatat tgtcaagaaa 6060

acagaagtac agacaggcgg attctccaag gagtcaattt taccaaaaag aaattcggac 6120

aagcttattg ctcgtaaaaa agactgggat ccaaaaaaat atggtggttt tgatagtcca 6180

acggtagctt attcagtcct agtggttgct aaggtggaaa aagggaaatc gaagaagtta 6240

aaatccgtta aagagttact agggatcaca attatggaaa gaagttcctt tgaaaaaaat 6300

ccgattgact ttttagaagc taaaggatat aaggaagtta aaaaagactt aatcattaaa 6360

ctacctaaat atagtctttt tgagttagaa aacggtcgta aacggatgct ggctagtgcc 6420

ggagaattac aaaaaggaaa tgagctggct ctgccaagca aatatgtgaa ttttttatat 6480

ttagctagtc attatgaaaa gttgaagggt agtccagaag ataacgaaca aaaacaattg 6540

tttgtggagc agcataagca ttatttagat gagattattg agcaaatcag tgaattttct 6600

aagcgtgtta ttttagcaga tgccaattta gataaagttc ttagtgcata taacaaacat 6660

agagacaaac caatacgtga acaagcagaa aatattattc atttatttac gttgacgaat 6720

cttggagctc ccgctgcttt taaatatttt gatacaacaa ttgatcgtaa acgatatacg 6780

tctacaaaag aagttttaga tgccactctt atccatcaat ccatcactgg tctttatgaa 6840

acacgcattg atttgagtca gctaggaggt gactgagatc ccatggtacg cgtgctagag 6900

gcatcaatgt gaaaaagccc gcgcaagcgg gtttttttat gacaaactct tttgtttatt 6960

tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 7020

ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc tccatcgatg 7080

gcatgggtat ggacagtttt ccctttgata tgtaacggtg aacagttgtt ctacttttgt 7140

ttgttagtct tgatgcttca ctgatagata caagagccat aagaacctca gatccttccg 7200

tatttagcca gtatgttctc tagtgtggtt cgttgttttt gcgtgagcca tgagaacgaa 7260

ccattgagat catacttact ttgcatgtca ctcaaaaatt ttgcctcaaa actggtgagc 7320

tgaatttttg cagttaaagc atcgtgtagt gtttttctta gtccgttacg taggtaggaa 7380

tctgatgtaa tggttgttgg tattttgtca ccattcattt ttatctggtt gttctcaagt 7440

tcggttacga gatccatttg tctatctagt tcaacttgga aaatcaacgt atcagtcggg 7500

cggcctcgct tatcaaccac caatttcata ttgctgtaag tgtttaaatc tttacttatt 7560

ggtttcaaaa cccattggtt aagcctttta aactcatggt agttattttc aagcattaac 7620

atgaacttaa attcatcaag gctaatctct atatttgcct tgtgagtttt cttttgtgtt 7680

agttctttta ataaccactc ataaatcctc atagagtatt tgttttcaaa agacttaaca 7740

tgttccagat tatattttat gaattttttt aactggaaaa gataaggcaa tatctcttca 7800

ctaaaaacta attctaattt ttcgcttgag aacttggcat agtttgtcca ctggaaaatc 7860

tcaaagcctt taaccaaagg attcctgatt tccacagttc tcgtcatcag ctctctggtt 7920

gctttagcta atacaccata agcattttcc ctactgatgt tcatcatctg agcgtattgg 7980

ttataagtga acgataccgt ccgttctttc cttgtagggt tttcaatcgt ggggttgagt 8040

agtgccacac agcataaaat tagcttggtt tcatgctccg ttaagtcata gcgactaatc 8100

gctagttcat ttgctttgaa aacaactaat tcagacatac atctcaattg gtctaggtga 8160

ttttaatcac tataccaatt gagatgggct agtcaatgat aattactagt ccttttcctt 8220

tgagttgtgg gtatctgtaa attctgctag acctttgctg gaaaacttgt aaattctgct 8280

agaccctctg taaattccgc tagacctttg tgtgtttttt ttgtttatat tcaagtggtt 8340

ataatttata gaataaagaa agaataaaaa aagataaaaa gaatagatcc cagccctgtg 8400

tataactcac tactttagtc agttccgcag tattacaaaa ggatgtcgca aacgctgttt 8460

gctcctctac aaaacagacc ttaaaaccct aaaggcttaa gtagcaccct cgcaagctcg 8520

gttgcggccg caatcgggca aatcgctgaa tattcctttt gtctccgacc atcaggcacc 8580

tgagtcgctg tctttttcgt gacattcagt tcgctgcgct cacggctctg gcagtgaatg 8640

ggggtaaatg gcactacagg cgccttttat ggattcatgc aaggaaacta cccataatac 8700

aagaaaagcc cgtcacgggc ttctcagggc gttttatggc gggtctgcta tgtggtgcta 8760

tctgactttt tgctgttcag cagttcctgc cctctgattt tccagtctga ccacttcgga 8820

ttatcccgtg acaggtcatt cagactggct aatgcaccca gtaaggcagc ggtatcatca 8880

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 8940

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 9000

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 9060

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 9120

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 9180

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 9240

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 9300

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 9360

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 9420

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 9480

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 9540

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 9600

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 9660

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 9720

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 9780

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 9840

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 9900

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 9960

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 10020

gcatcgattt attatgacaa cttgacggct acatcattca ctttttcttc acaaccggca 10080

cggaactcgc tcgggctggc cccggtgcat tttttaaata cccgcgagaa atagagttga 10140

tcgtcaaaac caacattgcg accgacggtg gcgataggca tccgggtggt gctcaaaagc 10200

agcttcgcct ggctgatacg ttggtcctcg cgccagctta agacgctaat ccctaactgc 10260

tggcggaaaa gatgtgacag acgcgacggc gacaagcaaa catgctgtgc gacgctggcg 10320

atatcaaaat tgctgtctgc caggtgatcg ctgatgtact gacaagcctc gcgtacccga 10380

ttatccatcg gtggatggag cgactcgtta atcgcttcca tgcgccgcag taacaattgc 10440

tcaagcagat ttatcgccag cagctccgaa tagcgccctt ccccttgccc ggcgttaatg 10500

atttgcccaa acaggtcgct gaaatgcggc tggtgcgctt catccgggcg aaagaacccc 10560

gtattggcaa atattgacgg ccagttaagc cattcatgcc agtaggcgcg cggacgaaag 10620

taaacccact ggtgatacca ttcgcgagcc tccggatgac gaccgtagtg atgaatctct 10680

cctggcggga acagcaaaat atcacccggt cggcaaacaa attctcgtcc ctgatttttc 10740

accaccccct gaccgcgaat ggtgagattg agaatataac ctttcattcc cagcggtcgg 10800

tcgataaaaa aatcgagata accgttggcc tcaatcggcg ttaaacccgc caccagatgg 10860

gcattaaacg agtatcccgg cagcagggga tcattttgcg cttcagccat acttttcata 10920

ctcccgccat tcagagaaga aaccaattgt ccatattgca tcagacattg ccgtcactgc 10980

gtcttttact ggctcttctc gctaaccaaa ccggtaaccc cgcttattaa aagcattctg 11040

taacaaagcg ggaccaaagc catgacaaaa acgcgtaaca aaagtgtcta taatcacggc 11100

agaaaagtcc acattgatta tttgcacggc gtcacacttt gctatgccat agcattttta 11160

tccataagat tagcggatcc tacctgacgc tttttatcgc aactctctac tgtttctcca 11220

tacccgtttt tttgggaatt cgagctctaa ggaggttata aaaaatggat attaatactg 11280

aaactgagat caagcaaaag cattcactaa ccccctttcc tgttttccta atcagcccgg 11340

catttcgcgg gcgatatttt cacagctatt tcaggagttc agccatgaac gcttattaca 11400

ttcaggatcg tcttgaggct cagagctggg cgcgtcacta ccagcagctc gcccgtgaag 11460

agaaagaggc agaactggca gacgacatgg aaaaaggcct gccccagcac ctgtttgaat 11520

cgctatgcat cgatcatttg caacgccacg gggccagcaa aaaatccatt acccgtgcgt 11580

ttgatgacga tgttgagttt caggagcgca tggcagaaca catccggtac atggttgaaa 11640

ccattgctca ccaccaggtt gatattgatt cagaggtata a 11681

<210> 2

<211> 2914

<212> DNA

<213> 基因编辑靶向质粒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc aataccatat 60

ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg 120

gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca acctattaat 180

ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc 240

ggtgagaatg gcaaaagttt atgcatttct ttccagactt gttcaacagg ccagccatta 300

cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga ttgcgcctga 360

gcgagacgaa atacgcggtc gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac 420

cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg atattcttct 480

aatacctgga atgctgtttt cccggggatc gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga 540

gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg 600

accatctcat ctgtaacatc attggcaacg ctacctttgc catgtttcag aaacaactct 660

ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc gacattatcg 720

cgagcccatt tatacccata taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg cggcctagag 780

caagacgttt cccgttgaat atggctcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 840

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 900

ataggcatgc tagcgcagaa acgtcctaga agatgccagg aggatactta gcagagagac 960

aataaggccg gagcgaagcc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga acatcacgaa 1020

atctgacgct caaatcagtg gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 1080

ccccctgatg gctccctctt gcgctctcct gttcccgtcc tgcggcgtcc gtgttgtggt 1140

ggaggcttta cccaaatcac cacgtcccgt tccgtgtaga cagttcgctc caagctgggc 1200

tgtgtgcaag aaccccccgt tcagcccgac tgctgcgcct tatccggtaa ctatcatctt 1260

gagtccaacc cggaaagaca cgacaaaacg ccactggcag cagccattgg taactgagaa 1320

ttagtggatt tagatatcga gagtcttgaa gtggtggcct aacagaggct acactgaaag 1380

gacagtattt ggtatctgcg ctccactaaa gccagttacc aggttaagca gttccccaac 1440

tgacttaacc ttcgatcaaa ccgcctcccc aggcggtttt ttcgtttaca gagcaggaga 1500

ttacgacgat cgtaaaagga tctcaagaag atcctttacg gattcccgac accatcactc 1560

tagatttcag tgcaatttat ctcttcaaat gtagcacctg aagtcagccc catacgatat 1620

aagttgtaat tctcatgtta gtcatgcccc gcgcccaccg gaaggagctg actgggttga 1680

aggctctcaa gggcatcggt cgagatcccg gtgcctaatg agtgagctaa cttacattaa 1740

ttgcgttgcg cacaccgact agcgaaaaaa ccccgccgaa gcggggtttt ttgcgaaaaa 1800

aagcaccgac tcggtgccac tttttcaagt tgataacgga ctagccttat tttaacttgc 1860

tatgctgttt tgaatggttc cgctagcact gtacctagga ctgagctagc cgtcaaaagc 1920

agcgtatata ccatggccac aattcagcaa attgtgaaca tcatcacgtt catctttccc 1980

tggttgccaa tggcccattt tcctgtcagt aacgagaagg tcgcgaattc aggcgctttt 2040

tagactggtc gtgttttaga gctatgctgt tttgaatggt cccaaaaccc gttccgtgta 2100

gacagttcgc tccaagctgt tttagagcta tgctgttttg aatggtccca aaacgccatg 2160

tttcagaaac aactctggcg catcgtttta gagctatgct gttttgaatg gtcccaaaac 2220

aaaaaaaaac cccgcccctg acagggcggg gttttttttt taattaaagt ctggtcctcg 2280

agtctggtta taatccctat cagtgataga gattgacatc cctatcagtg atagagatac 2340

tgagcacaac gaaaccgtcg ttgtagtgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 2400

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgctttttta tgcagcctac 2460

cggtatccta ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta 2520

aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaac ctcaggcatt tgagaagcac acggtcacac 2580

tgcttccggt agtcaataaa ccggtaaacc agcaatagac ataagcggct ggtacccctg 2640

aagattattt cttaataact aaaaatatgg tataatactc ttaataaatg cagtaataca 2700

ggggcttttc aagactgaag tctagctgag acaaatagtg cgattacgaa attttttaga 2760

caaaaatagt ctacgaggtt ttagagctat gctgttttga atggtcccaa aactgagacc 2820

agtctcggaa gctcaaaggt ctcgttttag agctatgctg ttttgaatgg tcccaaaact 2880

tcagcacact gagacttgtt gagttccatg tttt 2914

Claims (1)

1.一种无痕化双靶点基因组编辑系统，其特征在于，由一个温敏型的辅助质粒pKS9和一个具有自我消除的双基因位点靶向质粒pCSK所组成；

所述辅助质粒pKS9的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述双基因位点靶向质粒pCSK的序列如SEQ ID NO.2所示。

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