CN109371052B - 提高高gc含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高高GC含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法，高GC含量噬铜菌属细菌经活化后接种于含有表面活性剂和果胶酶的稀释的富营养培养基中，培养一段时间后，离心收集菌体，然后用无菌去离子水重悬洗涤数次，离心收集菌体沉淀，重悬于预冷的甘油水溶液中，制备得到的感受态细胞进行电转化。本发明通过对培养基进行改良，发现减少培养基中营养物质含量并加入适量的表面活性剂和果胶酶可以有效减少噬铜菌属细菌胞外聚合物的产生，大大提高了感受态细胞的电转化效率。本发明针对高GC含量噬铜菌属细菌的特点开发出一种稳定、高效的电转化方法，为深入研究分析噬铜菌属细菌提供有力的技术支持。

Description

提高高GC含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种提高高GC含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法。

背景技术

噬铜菌属(genus Cupriavidus)是细菌分类学中的一个属，目前该属下包括17个种，分别为：C.alkaliphilus，C.basilensis，C.campinensis，C.gilardii，C.laharis，C.metallidurans，C.necator，C.nantongensis，C.numazuensis，C.oxalaticus，C.pampae，C.pauculus，C.pinatubonensis，C.plantarum，C.respiraculi，C.taiwanensis，C.yeoncheonensis。所属细菌为革兰氏阴性菌，具有杆状，专性好氧，能运动，有鞭毛等特征，对铜，钴，锌等金属耐受。所属细菌大部分分离自土壤、水、池塘沉积物、豆科植物结节和火山泥流沉积物。通过对已报道的12个种的基因组测序结果分析显示，噬铜菌属属于高GC含量(63％-69％)细菌。目前报道的噬铜菌属细菌对环境具有重要的作用和影响，如Cupriavidus taiwanensis是一种根瘤菌，能够与多种豆科植物共生进行生物固氮；一些种的细菌具有促进植物生长的特征，如分泌植物生长调节剂吲哚乙酸，促进磷酸盐增容等；Cupriavidus pampae与Cupriavidus numadzuensis被报道可以降解三氟乙烯等有机污染物，Cupriavidus nantongensis与Cupriavidus gilardii被报道能够将多种有机磷农药与新烟碱类农药完全矿化。

为了研究噬铜菌属细菌在土壤，植株根际以及植物体内的迁移，充分发挥其生物技术潜力和应用价值，亟待提出一种稳定、高效的电转化技术方法。常规的细菌转化方法包括化学转化法和电转化法，电转化法以其简单高效被广泛使用，但这些方法一般仅适用于大肠杆菌等模式生物，对于其余种属的细菌转化效率低下，尤其是对于含有高GC含量的细菌，表面丰富的胞外聚合物(EPS)使转化效率更低甚至无法转化。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高高GC含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的提高高GC含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法，高GC含量噬铜菌属细菌经活化后接种于含有表面活性剂和果胶酶的稀释的富营养培养基中，培养一段时间后，离心收集菌体，然后用无菌去离子水重悬洗涤数次，离心收集菌体沉淀，重悬于预冷的甘油水溶液中，制备得到的感受态细胞进行电转化。

其中，所述富营养培养基为LB液体培养基或SOC液体培养基。

前述的方法，富营养培养基稀释的倍数为2-5倍，优选5倍。

本发明中，LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH自然。LB固体培养基是在液体培养基基础上添加浓度为17g/L的琼脂。

稀释5倍的LB液体培养基(即20％LB液体培养基)的配方为：胰蛋白胨2g/L，酵母提取物1g/L，氯化钠2g/L，pH自然。

本发明中，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂包括但不限于吐温80。所述表面活性剂的终浓度为1％-2％，优选1％。

所述果胶酶的终浓度为20-100U/mL，优选100U/mL。

前述的方法，将无菌去离子水洗涤后离心得到的菌体沉淀重悬于预冷的甘油水溶液中，然后离心收集菌体沉淀，重复此操作1次，然后将所得菌体重悬于预冷的甘油水溶液中，制备得到感受态细胞。

优选地，所述甘油水溶液的浓度为10％-20％，优选10％。

在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：

1)从冻存管中挑取一环高GC含量噬铜菌属细菌于LB固体培养基上培养活化，挑取活化后的单菌落，接种于含有1％v/v吐温80和100U/mL果胶酶稀释5倍的LB液体培养基中，于37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.6左右，然后6000g 4℃离心收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次；

2)感受态细胞的制备：将步骤1)中收集得到的菌体用预冷的10％甘油水溶液重悬，6000g4℃离心，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于10％预冷的甘油水溶液中；

3)电转化：将步骤2)所得感受态细胞置于冰上，加入质粒DNA溶液，于冰上放置一段时间，将上述混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.5KV，25uF，200-400Ω条件下进行电击；然后向电极杯中加入LB液体培养基或SOC液体培养基混匀，于37℃恒温震荡培养复苏菌体；最后将菌液涂平板(含相应抗生素)，计算转化率。

本发明中，所述高GC含量噬铜菌属细菌选自Cupriavidus taiwanensis、Cupriavidus nantongensis、Cupriavidus gilardii。更优选Cupriavidus taiwanensisX1、Cupriavidus gilardii T-1。

进一步地，本发明提供一种用于提高高GC含量噬铜菌属细菌电转化效率的试剂。所述试剂为含有1％-2％v/v吐温80和20-100U/mL果胶酶的20％-50％LB液体培养基。优选地，所述试剂为含有1％v/v吐温80和100U/mL果胶酶的20％LB液体培养基。

使用时，高GC含量噬铜菌属细菌菌体用所述试剂洗涤或者将高GC含量噬铜菌属细菌在所述试剂中培养一段时间，以有效减少噬铜菌属细菌胞外聚合物，洗涤或培养后离心收集菌体，可进一步制备成感受态细胞，进行电转化。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

采用经稀释的LB液体培养基培养高GC含量噬铜菌属细菌，通过减少培养基中营养物质含量以有效减少噬铜菌属细菌胞外聚合物的产生，然后进行如下操作：

A、按照常规方法制备感受态细胞，进行电转化；或，

B、将培养好的高GC含量噬铜菌属细菌菌体用所述试剂洗涤后，离心收集菌体，制备感受态细胞，进行电转化。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)利用常规LB培养基培养高GC含量噬铜菌属细菌时，所得菌体的营养含量是过剩的，导致细菌在生长过程中会产生大量的胞外聚合物，本发明通过对培养基进行改良，发现减少培养基中营养物质含量可以有效减少噬铜菌属细菌胞外聚合物的产生。

(二)培养过程中加入少量表面活性剂(如吐温80)，一方面可以使细菌分散，减少细菌之间相互粘附，另一方面可以溶解油脂类物质，减少胞外聚合物的产生。考虑到表面活性剂对细菌生长具有一定的抑制作用，使用浓度不能过高，推荐用量1％-2％。

(三)培养过程中加入适量果胶酶。以多种纯净物作为培养基原料时，细菌产生的胞外聚合物多为多糖(PS)类物质，加入果胶酶可以有效去除这些多糖类物质。可有效制备获得感受态细胞。

(四)相较于已报道的噬铜菌属近源种电转化方法，本发明方法的电转化效率提高了14.75倍左右。

(五)本发明针对高GC含量噬铜菌属细菌的特点开发出一种稳定、高效的电转化方法，为高效率转基因体系的构建以及深入研究分析噬铜菌属细菌提供有力的技术支持。

附图说明

图1为本发明实施例1中成功转入质粒pTR102：：LuxAB的阳性转化子。

图2为本发明实施例2中成功转入质粒pTR102：：GFP的阳性转化子。

图3为本发明实施例3中成功转入质粒pTR102：：GFP的阳性转化子。

图4为本发明实施例5中不同培养基条件下Cupriavidus taiwanensis X1胞外聚合物情况。

图5为本发明实施例5中采用不同电转化法对Cupriavidus taiwanensis X1进行电转化的转化率比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的果胶酶购自江苏锐阳生物科技有限公司(9032-75-1，100U/mg)。

实施例1质粒pTR102：：LuxAB电转化导入Cupriavidus taiwanensis X1

(1)受体菌的培养：从冻存管中取一环Cupriavidus taiwanensis X1于LB固体培养基上37℃恒温培养24h，挑取活化后的单菌落，接种于100ml含有1％v/v吐温80和100U/mL果胶酶的20％LB液体培养基中，于37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.6左右，然后6000g 4℃离心15min收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次。

(2)感受态细胞的制备：将步骤(1)所得菌体，重悬于10％预冷的甘油中，5000g于4℃恒温离心10min，去上清收集菌体，重复此操作一次，所得菌体重悬于1ml10％预冷的甘油中，所得感受态可直接用于转化或保存于-80℃冰箱。

(3)电转化：

a.取100ul步骤(2)中所得感受态细胞置于冰上解冻。

b.分别加入1ug质粒pTR102：：LuxAB(质粒序列见SEQ ID NO：1)，于冰上放置30min。

c.将(b)中感受态细胞与质粒DNA混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.5kV，25uF，400Ω条件下进行电击。

d.向(c)中溶液中加入500ul SOC液体培养基，轻轻混匀，转入1.5ml EP管中，于37℃恒温震荡培养1h复苏菌体。

e.取(d)中所培养菌液100ul涂布于含有质粒所带抗性相应抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温培养24h。利用平板计数仪对长出的菌落数进行计数。

质粒pTR102：：LuxAB含有发光酶基因LuxAB，在平板上层加10ul癸醛，成功转入质粒的细菌不仅能在相应抗生素抗性平板上生长，同时在暗室条件下可发光，如图1所示。

本实施例中电转化效率可达2.3×10⁴cfu/ug～2.7×10⁴cfu/ug。

实施例2质粒pTR102：：GFP电转化导入Cupriavidus taiwanensis X1

与实施例1不同的是，将步骤(3)b中的质粒pTR102：：LuxAB换为pTR102：：GFP。

质粒pTR102：：GFP的构建方法如下：1)以商品化质粒PPK2-OSCA-GFP为模板，扩增GFP基因；2)利用限制性内切酶PstI与KpnI对pTR102：：LuxAB进行双酶切；3)将扩增得到的GFP基因插入到pTR102：：LuxAB经双酶切后回收的大片段中，构建得到质粒pTR102：：GFP。

质粒pTR102：：GFP含有绿色荧光蛋白基因GFP，成功转入质粒的细菌不仅能在相应抗生素抗性平板上生长，同时在荧光显微镜下，成功转入质粒的细菌可发出绿色荧光，如图2所示。

本实施例中电转化效率可达2.0×10⁴cfu/ug～2.4×10⁴cfu/ug。

实施例3质粒pTR102：：GFP电转化导入Cupriavidus gilardii T-1

与实施例2不同的是，将步骤(1)中的Cupriavidus taiwanensis X1换为Cupriavidus gilardii T-1。

质粒pTR102：：GFP含有绿色荧光蛋白基因GFP，成功转入质粒的细菌不仅能在相应抗生素抗性平板上生长，同时在荧光显微镜下，成功转入质粒的细菌可以发出绿色荧光，如图3所示。

本实施例中电转化效率可达1.7×10⁴cfu/ug～1.9×10⁴cfu/ug。

实施例4质粒pTR102：：LuxAB电转化导入Cupriavidus nantongensis LMG29218

与实施例1不同的是，将步骤(1)中的Cupriavidus taiwanensis X1换为Cupriavidus nantongensis LMG29218。

本实施例中电转化效率可达2.3×10⁴cfu/ug～2.7×10⁴cfu/ug。

实施例5不同电转化方法的比较

(一)传统的大肠杆菌电转化法对Cupriavidus taiwanensis X1进行电转化

1.收集菌体：将活化后的Cupriavidus taiwanensis X1接种于100ml LB液体培养基，37℃恒温培养至OD₆₀₀＝0.6，6000g 4℃离心15min收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次。

2.感受态细胞的制备：将步骤1中收集得到的菌体用20％预冷的甘油重悬，6000g4℃离心15min，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于1ml 20％预冷的甘油中，以100ul每支分装后直接用于转化或保存于-80℃冰箱。

3.电转化：将步骤2所得感受态细胞在冰上解冻，加入1ug质粒pTR102：：LuxAB，于冰上放置30min，将混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.5KV，25uF，400Ω条件下进行电击。向电极杯中加入500ul SOC液体培养基，轻轻混匀，转入1.5ml EP管中，于37℃恒温震荡培养1h复苏菌体。取复苏后菌体100ul涂布于含有质粒所带抗性相应抗生素的LB固体培养基，37℃恒温培养24h，利用平板计数计算转化率。

(二)已报道的噬铜菌属细菌(C.necator JMP134)电转化法对Cupriavidustaiwanensis X1进行电转化

1.收集菌体：将活化后的Cupriavidus taiwanensis X1接种于100ml无机盐液体培养基(1.0g/L氯化钠，0.1g/L七水合硫酸镁，0.3g/L磷酸二氢钾，1g/L磷酸氢二钾，pH7.0)中，37℃恒温培养至OD₆₀₀＝0.6，6000g 4℃离心15min收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次。

2.感受态细胞制备：将步骤1中收集得到的菌体用预冷的1M山梨醇溶液重悬，6000g 4℃离心15min，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于400ul 1M山梨醇中，以40ul每支分装后直接用于转化或保存于-80℃冰箱。

3.电转化：步骤同上述(一)。

(三)已报道的近源种(Ralstonia solanacearum)电转化法对Cupriavidustaiwanensis X1进行电转化

1.收集菌体：将活化后的Cupriavidus taiwanensis X1接种于100ml LB液体培养基，28℃恒温培养至OD₆₀₀＝0.8，6000g 4℃离心15min收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次。

2.感受态细胞的制备：将步骤1中收集得到的菌体用预冷的10％甘油重悬，6000g4℃离心15min，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于1ml 10％预冷的甘油中，以100ul每支分装后直接用于转化或保存于-80℃冰箱。

3.电转化：将步骤2所得感受态细胞在冰上解冻，加入lug质粒pTR102：：LuxAB，于冰上放置30min，将混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.4KV，25uF条件下进行电击。向电极杯中加入500ul SOC液体培养基，轻轻混匀，转入1.5ml EP管中，于37℃恒温震荡培养1h复苏菌体。取复苏后菌体100ul涂布于含有质粒所带抗性相应抗生素的LB固体培养基，28℃恒温培养24h，利用平板计数计算转化率。

(四)本发明电转化法对Cupriavidus taiwanensis X1进行电转化

1.收集菌体：从冻存管中取一环Cupriavidus taiwanensis X1于LB固体培养基上37℃恒温培养24h，挑取活化后的单菌落，接种于100ml含有1％v/v吐温80和100U/mL果胶酶的20％、50％和100％LB液体培养基中，于37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.6左右，6000g4℃离心15min收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次。

2.感受态细胞的制备：将步骤1中收集得到的菌体用预冷的10％甘油重悬，6000g4℃离心15min，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于1ml 10％预冷的甘油中，以100ul每支分装后直接用于转化或保存于-80℃冰箱。

3.电转化：将步骤2所得感受态细胞在冰上解冻，加入1ug质粒pTR102：：LuxAB，于冰上放置30min，将混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.5KV，25uF，200-400Ω条件下进行电击。向电极杯中加入500ul SOC液体培养基，轻轻混匀，转入1.5ml EP管中，于37℃恒温震荡培养1h复苏菌体。取复苏后菌体100ul涂布于含有质粒所带抗性相应抗生素的LB固体培养基，37℃恒温培养24h，利用平板计数计算转化率。

图4是不同培养基条件下Cupriavidus taiwanensis X1胞外聚合物情况。从图4可以看出，20％液体培养基培养收集得到的菌体在10％甘油重悬状态下胞外聚合物最少，细菌形态最好，而常规LB液体培养基(即100％LB液体培养基)收集得到的菌体在10％甘油重悬状态下大部分被胞外聚合物包裹，形成粘稠状态，难以沉淀用以制备感受态细胞。

图5是采用不同电转化法对Cupriavidus taiwanensis X1进行电转化的转化率比较。

通过以上几种电转化方法的比较，结果显示前三种方法均不能成功转化C.taiwanensis。并且实验中发现，在使用甘油重悬菌体时会形成黏稠状菌悬液，表明在这些方法条件下形成了大量的胞外聚合物，感受态细胞无法有效获得。

实施例6不同培养基条件下的Cupriavidus taiwanensis X1电转化效率比较

采用实施例1的方法，仅步骤(1)中活化后的单菌落接种的培养基成分不同。具体如下：

利用20％LB液体培养基，最终Cupriavidus taiwanensis X1的电转化效率是(2.0±0.1)×10⁴cfu/ug。

利用含有1％v/v吐温80的20％LB液体培养基，最终Cupriavidus taiwanensis X1的电转化效率是(2.2±0.1)×10⁴cfu/ug。

利用含有100U/mL果胶酶的20％LB液体培养基，最终Cupriavidus taiwanensisX1的电转化效率是(2.2±0.2)×10⁴cfu/ug。

利用含有1％v/v吐温80和100U/ml果胶酶的20％LB液体培养基，最终Cupriavidustaiwanensis X1的电转化效率是(2.5±0.2)×10⁴cfu/ug。

从以上比较可以看出，通过减少培养基中营养物质含量并加入适量的表面活性剂(吐温80)和果胶酶可以有效减少噬铜菌属细菌胞外聚合物的产生，大大提高了感受态细胞的电转化效率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 提高高GC含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法

<130> PI201810537

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13510

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacctcgatc gtcggacccc tcctcttcac ggcgatctat gcggcttcta taacaacgtg 60

gaacgggtgg gcatggattg caggcgctgc cctctacttg ctctgcctgc cggcgctgcg 120

tcgcgggctt tggagcggcg cagggcaacg agccgatcgc tgatcgtgga aacgataggc 180

cggaattgac ggatctatct catctgcgca aggcagaacg tgaagacggc cgccctggac 240

ctcgcccgcg agcgccaggc gcacgaggcc ggcgcgcgga cccgcgccac ggcccacgag 300

cggacgccgc agcaggagcg ccagaaggcc gccagagagg ccgagcgcgg ccgtgaggct 360

tggacgctag ggcagggcat gaaaaagccc gtagcgggct gctacgggcg tctgacgcgg 420

tggaaagggg gaggggatgt tgtctacatg gctctgctgt agtgagtggg ttgcgctccg 480

gcagcggtcc tgatcccccg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 540

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 600

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 660

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 720

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 780

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 840

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 900

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 960

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1020

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 1080

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 1140

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 1200

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 1260

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc 1320

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 1380

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 1440

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 1500

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 1560

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 1620

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 1680

gggtcgatcg acggatcttt tccgctgcat aaccctgctt cggggtcatt atagcgattt 1740

tttcggtata tccatccttt ttcgcacgat atacaggatt ttgccaaagg gttcgtgtag 1800

actttccttg gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta ggcccacccg 1860

cgagcgggtg ttccttcttc actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc aacgggaatc 1920

ctgctctgcg aggctggccg ataagctcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 1980

taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa ttaattccaa tacgcaaacc 2040

gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 2100

gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca 2160

ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 2220

tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactc 2280

tagaggatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt 2340

gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 2400

gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 2460

ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct 2520

atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc 2580

gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct 2640

tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga 2700

tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg 2760

gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc 2820

agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac 2880

ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 2940

cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 3000

tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 3060

cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg 3120

actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat 3180

tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg 3240

atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccgg gggbctcgat 3300

cccctcgcga gttggttcag ctgctgcctg aggctggacg acctcgcgga gttctaccgg 3360

cagtgcaaat ccgtcggcat ccaggaaacc agcagcggct atccgcgcat ccatgccccc 3420

gaactgcagg agtggggagg cacgatggcc gctttggtcg actttatcga gcctgatttt 3480

gaacaactca ccatcgcgac tgtgaatgaa cgtcgcttga aagcggaaat tgaaagccgt 3540

acgccagaaa tggcttaggt cttatcgtaa taccaacaaa taaggaaatg ttatgaaatt 3600

tggaaacttc cttctcactt atcagccacc tgagctatct cagaccgaag tgatgaagcg 3660

attggttaat ctgggcaaag cgtctgaagg ttgtggcttc gacaccgttt ggttgctaga 3720

gcaccacttc actgaatttg ggttgttagg gaatccttat gttgctgccg cacacctatt 3780

aggtgcgaca gaaacgctca acgttggcac tgcagctatc gtattgccga ctgcccatcc 3840

ggttcgacaa gcagaagacg taaacctact ggatcaaatg tcaaaaggac gattccgttt 3900

tggtatttgt cgcggtttgt acgataaaga ttttcgtgtc tttggtacag acatggataa 3960

cagccgagcc ttaatggact gttggtatga cttgatgaaa gaaggcttca atgaaggcta 4020

tatcgcggcg gataacgaac atattaagtt cccgaaaatc caactgaatc catcggctta 4080

cacacaaggt ggtgctcctg tttatgtcgt cgcggagtca gcatcaacga cagaatgggc 4140

tgcagagcgt ggcctaccaa tgattctaag ctggatcatc aacactcacg agaagaaagc 4200

gcagcttgat ctttacaacg aagtcgcgac tgaacatggc tacgatgtga ctaagattga 4260

ccactgtttg tcttacatca cctccgtcga tcatgactca aatagagcca aagatatttg 4320

ccgcaacttc ttgggccatt ggtacgactc atacgtgaat gccaccaaga tttttgacga 4380

ctctgaccaa acaaaaggtt acgacttcaa taaaggtcaa tggcgtgatt ttgtgttgaa 4440

aggccacaaa gacaccaatc gccgaattga ttacagctac gaaatcaacc cagtagggac 4500

gcctgaagag tgtatcgcga ttatccagca agatattgat gcgacgggta ttgacaatat 4560

ttgttgtggt tttgaagcaa acggttctga agaagaaatt atcgcatcta tgaagctatt 4620

ccagtctgat gtgatgccat atctcaaaga aaaacagtaa ttaatatttt ctaaaaggaa 4680

agagacatga aatttggatt attcttcctc aattttatga attcaaagcg ttcttctgat 4740

caagtcatcg aagaaatgtt agataccgca cattacgtag atcagttgaa gtttgacacg 4800

ttggctgttt acgaaaacca tttctcgaac aatggtgtgg ttggtgcccc actaacagtg 4860

gctggttttt tacttggtat gacaaagaac gccaaagtgg cttcgttgaa tcacgtcatt 4920

accacgcatc atccagtacg tgtggcggaa gaagcgtgtc tacttgacca aatgagtgaa 4980

ggccgttttg cctttggctt tagtgattgt gaaaagagtg cagatatgcg cttctttaat 5040

cgaccaacgg attctcagtt tcagttgttc agtgagtgtc acaagatcat caatgatgca 5100

ttcactactg ggtactgcca tccaaacaat gatttttata gttttcctaa aatctccgtt 5160

aacccacacg cgttcactga aggcggtcct gcgcaatttg tgaatgcgac gagcaaagaa 5220

gtggttgaat gggcggctaa gttagggctt ccactcgtgt ttagatggga cgactcaaac 5280

gctcaaagaa aagaatacgc cggtttgtac cacgaagttg ctcaggcaca tggtgtcgat 5340

gttagtcagg ttcgacacaa gctgacgctg ctggtcaacc aaaatgtaga tggtgaagca 5400

gcaagggcag aagcttgcgt gtatttggaa gagtttgtcc gtgaatctta ctcaaatacc 5460

gactttgagc aaaaaatggg agagctgttg tcagaaaatg ccatcggtac ttatgaagaa 5520

agtactcagg cagcgcgagt tgcgattgag tgttgtggtg ccgcggacct attgatgtct 5580

tttgagtcga tggaagataa agcgcagcaa agagcggtta tcgatgtggt aaacgccaac 5640

atcgtcaaat accactcgta acgtttaact gatgctgaag gggcagcgat gccccttata 5700

tcaccattct tttcgcgcga tagcgctaac taatagaggc atttatatgg acgtactttc 5760

agcggttaag caggaaaata tcgcagcgag cacagaaatc gatgacttga ttttcatggg 5820

aactcctcag caatggtcat tgcaggaaca aaaacagctg acatctcgcc ttgttaaagg 5880

ggcatatcaa taccattacc acaataatga tgattatcgt cagttctgcg agaggctggg 5940

agtcggagag gtggtggaag atcccccgat gtgtagcagt ggcggaccat ataggcagat 6000

cagaaggcgc ggttctccta catgttcgcc ggtgaacgcg ttgaggaagc cgggcagtgc 6060

ctcggcaaaa tccttgcgtg tagacaagac atctgcgtag cagttgtcct caacaacgat 6120

gtcgaaatcc aaatcggagt gctcatcgag tcctccgtga acgtaagagc cgccgatcag 6180

aagagcgcgg aagcgaacat cggaagcgac cgcatcgcgg atgcggttca agaaagttgc 6240

atgagcttgt ggaagtgtgc tgagcataaa tgattctcct agctgttctt tgggtaagta 6300

cgccatcagg acgttgtgag tggcgcgatt tttagcggct gaaatcagcc cttgagcctg 6360

tcggcaagtc gcgtcatgag gtccatgcgc tcatgcagga tcgccacgac caacgcgggt 6420

tcgcccgcac gcggcaggca aaaaacgtag tggtgttcgc agcgggccat ccgcagcgcg 6480

ggaaagagtt cgctcatgtc cttaaacggg ccttcgccgg cggcaagcct ggctatgccc 6540

tgttccagct tagcgatata gcggcgcacc tgcgccgcgc cccactcccg gcgcgtgtag 6600

cggatgatgc cgcgtagatc ggcttcggcc tcagccgtga ggatgtaggc cgtcaagcgc 6660

gatccccgct gagttcttca tcaagaattt cgccgacgct cttggtggac accttgccgg 6720

caagcccatc gttgatgcgg ttccccagca tggttttcag ttcctgccat gcctgatcgg 6780

catcagcgtc accggggaac agacgttcga gggcgtattg cttaatggtc ttgccctgca 6840

aggcggccag ggctttcagg ctctggtgct gctggtccgt catgtcgatt gtcaggcggc 6900

tcattggata acctccataa aatacacgta accacattag cacatatgtg ggcgtgaggc 6960

tacagcgcga ggcgcattaa ggtcgggaaa atgcgctagg cgcatttaaa ttgcgtattg 7020

ctgtaatgcg ccatgccggc tagactaggc ccaaatgggt atacccaatt tgaccaaggg 7080

ggacgcgatg agggcggcca agcactaccg acaacttcta tccatcgact tcaaacatcg 7140

aggcgctggc cttcgtgcct ggacccgacg gcacacgcgg ccggcgcatc cacgtcctgg 7200

ggcgcgaggt ccgcgaccgg cccggcctgg tcgagtacct ttcgccggcg ttcggctcgc 7260

gggtggcgct ggacggctac tgcaagccca atttcgatgc agtgctgcac ctggcgtacc 7320

ccgatcatca gcaatggggc cacgcatgaa gcgccgaagc tacgccatgc tgcgcgccgc 7380

tgccgcgctg gccgtcctgg tcgttgcctc gccggcatgg gccgagctgc gcggcgaggt 7440

cgtgcgcatc atcgacggcg acaccatcga cgtgctggta gacaagcagc cggtgcgcgt 7500

gcgcctggtg gacattgacg cgccggaaaa gcggcaagcc ttcggcgaac gtgcgcgcca 7560

ggcgctggcc ggcatggtgt tccgccggca cgtcctggtc gacgagaagg acaccgaccg 7620

ttacggccgc acgctgggca ccgtgtgggt caacatggag ctggccagcc ggccgccgca 7680

gccgcgcaac gtcaacgccg cgatggttca ccagggcatg gcgtgggcct atcgcttcca 7740

cggccgcgcg gccgaccctg aaatgctgcg gctcgaacag gaggcgcgag gcaagcgcgt 7800

cggcctctgg tccgatccgc acgccgtcga gccgtggaaa tggcgacgcg agagcaacaa 7860

ccggagggac gaaggttgaa ggtcgcccgc atctacctgc gcgccagtac ggacgagcag 7920

aatcttgaac gccaggagag ccttgtagcg gccacgcggg ccgccgggta ctacgtcgcc 7980

ggcatctacc gcgagaaggc gtccggcgca cgcgccgacc ggcccgagct gctgcgcatg 8040

atcgcggacc tgcaacctgg tgaagtcgtc gttgcggaga agatcgaccg catcagccgc 8100

ttgccgttgg ccgaggccga gcgcctggtt gcgtcgatcc gggccaaagg ggccaagctg 8160

gccgtgcctg gcgtggtgga cctgtcggag ctggccgccg aggcgaacgg agtggcgaaa 8220

atcgttctgg aatccgtcca ggacatgctt ttgaagctcg ccttgcagat ggcccgcgac 8280

gactacgagg atcggcgcga gcgtcaacgt cagggtgtcc agttggcgaa ggccgccggc 8340

cgctacaccg gccgcaaacg tgacgccggc atgcacgacc gcatcatcac gcttcgctcc 8400

ggcggatcga gcattgccaa gacggccaag ctggtcggat gcagcccgag ccaggtcaaa 8460

cgagtgtggg cggcctggaa cgcgcagcag caaaaataaa gccgggcagt gcccggcttt 8520

tctcaccttt tcgcgtcccg cagggccgct gcgagcgccc tacctagatc ctcgctttcc 8580

ccctcggtgt agtccggcca gggcacgaag ggcgcggatg cgaacctgtt gagcaggtac 8640

gccttcgggc agcggtagac caccggcgag ttcgcctttt catcccaccg ggccaggatc 8700

acgtccgcat cgcagtgcat gtccttcacc tggtcgcgga agaagccgaa ggccaccatg 8760

ccgctatgtt cgccgaggaa cgccagttgc ttcgcgctgg cgatcgcgcc gacgccgccg 8820

gccaaaaccg acgccatcac ccagccgacg aaccagaagc tggcatgctt gcggttgacc 8880

accgcacgcg cagccgcgac caggacaacg gccaagctgc cgaccagggc catgacgacc 8940

gtgatccggc cgttgtggaa agcgatgggc ttgccagcgt ccgcttgcac ggcgtcgtaa 9000

atgctggacc cgatgggcgc gcacatcagc acgacaggca gcagcaccag gaacatcgtc 9060

cgcgtccatt gcgcgagtgc cttgcggcgt tcgccggcgg caagcgcctc catcatcggc 9120

gtgaagccca acagggccac cgcagccgcc aagccggcaa cgatgccgca ggcgattaca 9180

tacatacatc ctccctaatg cgccttgcgc acggttgtag tcagagtccg cggtgggggt 9240

accgagctcg aattaaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 9300

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 9360

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgcgaa 9420

agcaaattcg accccgctga tcgtggaaac gatagggacc tgcaggtggc tgctgaaccc 9480

ccagccggaa ctgaccccac aaggccctag cgtttgcaat gcaccaggtc atcattgacc 9540

caggcgtgtt ccaccaggcc gctgcctcgc aactcttcgc aggcttcgcc gacctgctcg 9600

cgccacttct tcacgcgggt ggaatccgat ccgcacatga ggcggaaggt ttccagcttg 9660

agcgggtacg gctcccggtg cgagctgaaa tagtcgaaca tccgtcgggc cgtcggcgac 9720

agcttgcggt acttctccca tatgaatttc gtgtagtggt cgccagcaaa cagcacgacg 9780

atttcctcgt cgatcaggac ctggcaacgg gacgttttct tgccacggtc caggacgcgg 9840

aagcggtgca gcagcgacac cgattccagg tgcccaacgc ggtcggacgt gaagcccatc 9900

gccgtcgcct gtaggcgcga caggcattcc tcggccttcg tgtaataccg gccattgatc 9960

gaccagccca ggtcctggca aagctcgtag aacgtgaagg tgatcggctc gccgataggg 10020

gtgcgcttcg cgtactccaa cacctgctgc cacaccagtt cgtcatcgtc ggcccgcagc 10080

tcgacgccgg tgtaggtgat cttcacgtcc ttgttgacgt ggaaaatgac cttgttttgc 10140

agcgcctcgc gcgggatttt cttgttgcgc gtggtgaaca gggcagagcg ggccgtgtcg 10200

tttggcatcg ctcgcatcgt gtccggccac ggcgcaatat cgaacaagga aagctgcatt 10260

tccttgatct gctgcttcgt gtgtttcagc aacgcggcct gcttggcctc gctgacctgt 10320

tttgccaggt cctcgccggc ggtttttcgc ttcttggtcg tcatagttcc tcgcgtgtcg 10380

atggtcatcg acttcgccaa acctgccgcc tcctgttcga gacgacgcga acgctccacg 10440

gcggccgatg gcgcgggcag ggcaggggga gccagttgca cgctgtcgcg ctcgatcttg 10500

gccgtagctt gctggaccat cgagccgacg gactggaagg tttcgcgggg cgcacgcatg 10560

acggtgcggc ttgcgatggt ttcggcatcc tcggcggaaa accccgcgtc gatcagttct 10620

tgcctgtatg ccttccggtc aaacgtccga ttcattcacc ctccttgcgg gattgccccg 10680

gaattccccg gatcgatccg tcgatcttga tcccctgcgc catcagatcc ttggcggcaa 10740

gaaagccatc cagtttactt tgcagggctt cccaacctta ccagagggcg ccccagctgg 10800

caattccggt tcgcttgctg tccataaaac cgcccagtct agctatcgcc atgtaagccc 10860

actgcaagct acctgctttc tctttgcgct tgcgttttcc cttgtccaga tagcccagta 10920

gctgacattc atccggggtc agcaccgttt ctgcggactg gctttctacg tgttccgctt 10980

cctttagcag cccttgcgcc ctgagtgctt gcggcagcgt gaagctgacg gatcgatccg 11040

gggaattaat tcacccccga acacgagcac ggcacccgcg accactatgc caagaatgcc 11100

caaggtaaaa attgccggcc ccgccatgaa gtccgtgaat gccccgacgg ccgaagtgaa 11160

gggcaggccg ccacccaggc cgccgccctc actgcccggc acctggtcgc tgaatgtcga 11220

tgccagcacc tgcggcacgt caatgcttcc gggcgtcgcg ctcgggctga tcgcccatcc 11280

cgttactgcc ccgatcccgg caatggcaag gactgccagc gctgccattt ttggggtgag 11340

gccgttcgcg gccgaggggc gcagcccctg gggggatggg aggcccgcgt tagcgggccg 11400

ggagggttcg agaagggggg gcacccccct tcggcgtgcg cggtcacgcg cacagggcgc 11460

agccctggtt aaaaacaagg tttataaata ttggtttaaa agcaggttaa aagacaggtt 11520

agcggtggcc gaaaaacggg cggaaaaccc ttgcaaatgc tggatttttc tgcctgtggg 11580

acagcccctc aaatgtcaat aggtgcgccc ctcatctgtc agcactctgc ccctcaagtg 11640

tcaaggatcg cgcccctcat ctgtcagtag tcgcgcccct caagtgtcaa taccgcaggg 11700

cacttatccc caggcttgtc cacatcatct gtgggaaact cgcgtaaaat caggcgtttt 11760

cgccgatttg cgaggctggc cagctccacg tcgccggccg aaatcgagcc tgcccctcat 11820

ctgtcaacgc cgcgccgggt gagtcggccc ctcaagtgtc aacgtccgcc cctcatctgt 11880

cagtgagggc caagttttcc gcgaggtatc cacaacgccg gcggccgcgg tgtctcgcac 11940

acggcttcga cggcgtttct ggcgcgtttg cagggccata gacggccgcc agcccagcgg 12000

cgagggcaac cagcccggtg agcgtcggaa aggcgctgga agccccgtag cgacgcggag 12060

aggggcgaga caagccaagg gcgcaggctc gatgcgcagc acgacatagc cggttctcgc 12120

aaggacgaga atttccctgc ggtgcccctc aagtgtcaat gaaagtttcc aacgcgagcc 12180

attcgcgaga gccttgagtc cacgctagat ccgtcaattc cgggatctat ctcatctgcg 12240

caaggcagaa cgtgaagacg gccgccctgg acctcgcccg cgagcgccag gcgcacgagg 12300

ccggcgcgcg gacccgcgcc acggcccacg agcggacgcc gcagcaggag cgccagaagg 12360

ccgccagaga ggccgagcgc ggccgtgagg cttggacgct agggcagggc atgaaaaagc 12420

ccgtagcggg ctgctacggg cgtctgacgc ggtggaaagg gggaggggat gttgtctaca 12480

tggctctgct gtagtgagtg ggttgcgctc cggcagcggt cctgatcaat cgtcaccctt 12540

tctcggtcct tcaacgttcc tgacaacgag cctccttttc gccaatccat cgacaatcac 12600

cgcgagtccc tgctcgaacg ctgcgtccgg accggcttcg tcgaaggcgt ctatcgcggc 12660

ccgcaacagc ggcgagagcg gagcctgttc aacggtgccg ccgcgctcgc cggcatcgct 12720

gtcgccggcc tgctcctcaa gcacggcccc aacagtgaag tagctgattg tcatcagcgc 12780

attgacggcg tccccggccg aaaaacccgc ctcgcagagg aagcgaagct gcgcgtcggc 12840

cgtttccatc tgcggtgcgc ccggtcgcgt gccggcatgg atgcgcgcgc catcgcggta 12900

ggcgagcagc gcctgcctga agctgcgggc attcccgatc agaaatgagc gccagtcgtc 12960

gtcggctctc ggcaccgaat gcgtatgatt ctccgccagc atggcttcgg ccagtgcgtc 13020

gagcagcgcc cgcttgttcc tgaagtgcca gtaaagcgcc ggctgctgaa cccccaaccg 13080

ttccgccagt ttgcgtgtcg tcagaccgtc tacgccgacc tcgttcaaca ggtccagggc 13140

ggcacggatc actgtattcg gctgcaactt tgtcatgctt gacactttat cactgataaa 13200

cataatatgt ccaccaactt atcagtgata aagaatccgc gcgttcaatc ggaccagcgg 13260

aggctggtcc ggaggccaga cgtgaaaccc aacatacccc tgatcgtaat tctgagcact 13320

gtcgcgctcg acgctgtcgg catcggcctg attatgccgg tgctgccggg cctcctgcgc 13380

gatctggttc actcgaacga cgtcaccgcc cactatggca ttctgctggc gctgtatgcg 13440

ttggtgcaat ttgcctgcgc acctgtgctg ggcgcgctgt cggatcgttt cgggcggcgg 13500

ccaatcttgc 13510

Claims (7)

1.一种提高高GC含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法，其特征在于，高GC含量噬铜菌

属细菌经活化后接种于含有表面活性剂和果胶酶的稀释的富营养培养基中，培养一段时间后，离心收集菌体，然后用无菌去离子水重悬洗涤数次，离心收集菌体沉淀，重悬于预冷的甘油水溶液中，制备得到的感受态细胞进行电转化；

所述富营养培养基为LB液体培养基或SOC液体培养基;

富营养培养基稀释的倍数为5倍；

所述表面活性剂为吐温80；

所述表面活性剂的终浓度为1％-2％；

所述果胶酶的终浓度为20-100U/mL；

所述高GC含量噬铜菌属细菌选自Cupriavidus taiwanensis、Cupriavidusnantongensis

或Cupriavidus gilardii。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂的终浓度为1％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述果胶酶的终浓度为100U/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将无菌去离子水洗涤后离心得到的菌体沉淀重悬于预冷的甘油水溶液中，然后离心收集菌体沉淀，重复此操作1次，然后将所得菌体重悬于预冷的甘油水溶液中，制备得到感受态细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘油水溶液的浓度为10％-20％。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述甘油水溶液的浓度为10％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)从冻存管中挑取一环高GC含量噬铜菌属细菌于LB固体培养基上培养活化，挑取活化后的单菌落，接种于含有1％v/v吐温80和100U/mL果胶酶稀释5倍的LB液体培养基中，于37℃震荡培养至OD600＝0.6，然后6000g 4℃离心收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次；

2)感受态细胞的制备：将步骤1)中收集得到的菌体用预冷的10％甘油水溶液重悬，6000g

4℃离心，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于10％预冷的甘油水溶液中；

3)电转化：将步骤2)所得感受态细胞置于冰上，加入质粒DNA溶液，于冰上放置一段时

间，将上述混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.5KV，25uF，200-400Ω条件下进行电击；然后向电极杯中加入LB液体培养基或SOC液体培养基混匀，于37℃恒温震荡培养复苏菌体；最后将菌液涂平板，计算转化率。

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