CN112501094B - 一种用于检测乳糖含量的生物工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程菌和乳糖含量检测技术领域，具体涉及一种用于检测乳糖含量的生物工程菌及其制备方法和应用，生物工程菌为将重组质粒pDecLac转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3,pLys)后获得，重组质粒含有类胡萝卜素表达基因和质粒载体pET‑15b；乳糖作为诱导剂，使工程菌表达产生类胡萝卜素，根据工程菌类胡萝卜素表达量进行样品中乳糖含量的检测；测量乳糖含量过程中，样品无需过多处理，只需在超净工作台中对样品进行紫外消毒15min，且涉及仪器为分光光度计，仪器价格低廉，该方法科学合理、操作简单且成本低，市场前景广阔。

Description

一种用于检测乳糖含量的生物工程菌及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于生物工程菌和乳糖含量检测技术领域，具体涉及一种用于检测乳糖含量的生物工程菌及其制备方法和应用。
背景技术：
目前已经建立了大量用于测定乳糖含量的方法，比如分光光度法、酶化学方法、红外光谱法以及高特异性、高灵敏度的高效液相色谱分析法。例如中国专利CN201410499047.7公开了一种乳糖浓度检测装置及检测方法，所述乳糖浓度检测装置与电化学工作站电连接；包括控制器，存储器，盛有液体的上端开口的容器，设于容器上的盖板，设于盖板下表面上的呈渐开线状的导轨，设于导轨内端的插入液体中并采用铂材料制成的对电极，设于导轨上的可沿导轨移动的转动装置，设于容器底部的搅动装置和设于盖板上的用于向容器内滴入乳糖溶液的滴液漏斗；中国专利CN201710070663.4公开了一种检测样品中乳糖的试纸及该试纸的制备方法，选取滤纸，做底物载体，用烘干技术，将乳糖酶加入到滤纸上烘干，将TMB、辣根过氧化物酶、半乳糖氧化酶依次加入到另一滤纸上，分步烘干；选取pvc板，用于固定烘干后的滤纸，最后裁剪成乳糖检测试纸；本制备试纸可检测样本中是否存在乳糖，由于使用了酶促反应，反应迅速，灵敏度高，采用试纸方法，可一次加样完成检测，通过颜色变化来判断结果，简单易用，本发明制备工艺简单，成本较底，易于推广，可用于快速检测样本中是否含有乳糖；中国专利CN201710073863.5公开一种乳糖含量的检测方法，步骤(1)将待测样品溶于去离子水中，超声波溶解得混合溶液；步骤(2)将步骤(1)得到的混合溶液转移至容量瓶中定容，离心过滤得到待测溶液；步骤(3)重复步骤(1)和步骤(2)的方法，并将所述待测样品替换成乳糖标准品，得到标准溶液；步骤(4)将标准溶液和待测溶液利用液相色谱进行检测，得到乳糖标准品及待测样品中各组分的保留时间及峰面积，并绘制乳糖标准品的浓度为峰面积的对应标准曲线，将待测样品各组分的保留时间及峰面积与标准曲线进行比较，计算得到待测样品中乳糖的含量。现有技术所用方法存在着对样品的前处理较为繁琐或仪器昂贵等问题。开发一种操作简单且成本低的乳糖检测方法是非常有必要的。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，开发一种用于检测乳糖含量的生物工程菌及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明提供一种用于检测乳糖含量的生物工程菌，为将重组质粒pDecLac转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3,pLys)后获得，重组质粒含有类胡萝卜素表达基因和质粒载体pET-15b，所述生物工程菌产类胡萝卜素。
进一步的，所述类胡萝卜素为八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素或玉米黄素；所述类胡萝卜素表达基因为能够表达八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素或玉米黄素的噬夏孢欧文氏菌中的基因。
进一步的，所述类胡萝卜素表达基因为合成基因crtB-crtI-crtE。
本发明还提供生物工程菌的制备方法，具体步骤如下：
第一步、将类胡萝卜素表达基因克隆到质粒载体pET-15b上，构建重组质粒pDecLac；
第二步、将大肠杆菌BL21(DE3，pLys)通过氯化钙法制成感受态；
第三步、将重组质粒pDecLac转化大肠杆菌BL21(DE3,pLys)感受态构建生物工程菌。
本发明涉及的第一步的具体步骤为：将噬夏孢欧文氏菌的crtB、crtI和crtE串联在一起构成目的基因crtB-crtI-crtE，将目的基因crtB-crtI-crtE克隆到质粒载体pET-15b的NdeI和XhoI位点之间，构建重组质粒pDecLac；
本发明涉及的第二步的具体步骤为：
S1、取购自于索莱宝公司的大肠杆菌BL21(DE3，pLys)单菌落于50mL液体LB培养基(含25μg˙mL-1氯霉素)中，37℃，200rpm培养过夜；
S2、取过夜培养物接种以1:50比例转接至50mL液体LB培养基(含25μg˙mL-1氯霉素)中，37℃，200rpm培养约2h，使其OD600≈0.2-0.4；
S3、取1mL菌液于灭菌处理过的1.5mLEP(eppendorf管)中，冰浴15min，4℃，1500×g离心5min，弃上清；
S4、将步骤S3得到的沉淀用0.2mL冰冷的0.1moL/L氯化钙溶液轻轻悬浮，冰浴15min，4℃，1500×g离心5min，弃上清；
S5、将步骤S4得到的沉淀用0.2mL冰冷的0.1moL/L氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰中，制成大肠杆菌BL21(DE3，pLys)感受态细胞；
本发明涉及的第三步的具体步骤为：
S1、取5μL重组质粒pDecLac，加入到制好的大肠杆菌BL21(DE3，pLys)感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min；然后42℃热激90s，迅速置于冰浴5min；再加入800μL液体LB培养基，37℃振荡培养1h；
S2、取100μL涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的固体LB培养基上，正向放置37℃培养箱1h，倒置培养过夜至单菌落清晰，获得用于检测乳酸含量的生物工程菌。
本发明还提供生物工程菌在乳糖含量检测方面的应用，将生物工程菌在无乳糖的培养基中培养，加入含乳糖的待测样品诱导类胡萝卜素累积，根据类胡萝卜素的表达量进行样品中乳糖含量的测定。
进一步的，将生物工程菌在无乳糖的培养基中培养至OD600＝0.50-1.00，再转接培养6小时后加入待测样品。
本发明涉及的生物工程菌在乳糖含量检测方面的应用原理为：将生物工程菌在LB液体培养基中进行培养，在没有乳糖存在时，类胡萝卜素表达基因不表达，工程菌几乎不累积类胡萝卜素；当有乳糖存在时，工程菌产生类胡萝卜素，并且在一定浓度范围内，类胡萝卜素含量与培养基中的乳糖浓度呈线性相关，从而实现样品乳糖含量的检测。
本发明与现有技术相比，该生物工程菌含有类胡萝卜素表达基因和质粒载体pET-15b，质粒载体pET-15b中含有乳糖操纵子；在大肠杆菌生长过程中，乳糖既可以被当作碳源利用促进生长，又可以在含有乳糖操纵子的质粒中作为诱导剂诱导目的基因的表达，产生类胡萝卜素，不同浓度的乳糖诱导产生的类胡萝卜素含量不同，通过测量菌液中类胡萝卜素的吸光度建立吸光度与乳糖浓度的线性关系。测量乳糖含量过程中，样品无需过多处理，只需在超净工作台中对样品进行紫外消毒15min，且涉及仪器为分光光度计，仪器价格低廉，该方法科学合理、操作简单且成本低，市场前景广阔。
附图说明：
图1为本发明涉及的质粒载体pET-15b的图谱示意图。
图2为本发明涉及的重组质粒pDecLac构建图谱示意图。
图3为本发明涉及的实施例2的生物工程菌在474nm下的吸光值与乳糖诱导浓度变化的线性关系图。
具体实施方式：
下面通过具体实施例并结合附图对本发明进行详细说明。
实施例1：
本实施例涉及用于检测乳糖含量的生物工程菌的制备方法，将大肠杆菌BL21(DE3,pLys)通过氯化钙法制成感受态，并将重组质粒pDecLac通过热激冰浴的方法转入感受态获得生物工程菌，具体步骤如下：
第一步、构建重组质粒pDecLac：
将噬夏孢欧文氏菌的crtB、crtI和crtE串联在一起构成目的基因crtB-crtI-crtE，将目的基因克隆到质粒载体pET-15b的NdeI和XhoI位点之间，构建重组质粒pDecLac；
第二步、将大肠杆菌BL21(DE3，pLys)通过氯化钙法制成感受态：
S1、取购自于索莱宝公司的大肠杆菌BL21(DE3，pLys)单菌落于50mL液体LB培养基(含25μg˙mL-1氯霉素)中，37℃，200rpm培养过夜；
S2、取过夜培养物接种以1:50比例转接至50mL液体LB培养基(含25μg˙mL-1氯霉素)中，37℃，200rpm培养约2h，使其OD600≈0.2-0.4；
S3、取1mL菌液于灭菌处理过的1.5mLEP(eppendorf管)中，冰浴15min，4℃，1500×g离心5min，弃上清；
S4、将步骤S3得到的沉淀用0.2mL冰冷的0.1moL/L氯化钙(CaCl2)溶液轻轻悬浮，冰浴15min，4℃，1500×g离心5min，弃上清；
S5、将步骤S4得到的沉淀用0.2mL冰冷的0.1moL/L氯化钙(CaCl2)溶液轻轻悬浮，放置在冰中，制成大肠杆菌BL21(DE3,pLys)感受态细胞；
第三步、将重组质粒pDecLac转化大肠杆菌BL21(DE3,pLys)感受态构建生物工程菌：
S1、取5μL重组质粒pDecLac，加入到制好的大肠杆菌BL21(DE3,pLys)感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min；然后42℃热激90s，迅速置于冰浴5min；再加入800μL液体LB培养基，37℃振荡培养1h；
S2、取100μL涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的固体LB培养基上，正向放置37℃培养箱1h，倒置培养过夜至单菌落清晰，获得用于检测乳酸含量的生物工程菌。
本实施例所使用的质粒载体pET-15b含有乳糖操纵子lac，在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态，此时lacI序列在Plac启动序列操纵下表达的lac阻遏蛋白与lacO序列结合，阻遏RNA聚合酶和P序列结合，抑制转录启动；当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导，目的基因才会表达。
本实施例涉及的质粒载体pET-15b和目的基因crtB-crtI-crtE均购自于上海生物工程公司，所述目的基因crtB-crtI-crtE是由上海生物工程公司优化合成，其碱基核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
ATGAACAACCCGTCCCTGCTGAACCACGCGGTTGAAACCATGGCGGTTGGTTCTAAATCTTTCGCGACCGCGTCTAAACTGTTCGACGCGAAAACCCGTCGTTCTGTTCTGATGCTGTACGCGTGGTGCCGTCACTGCGACGACGTTATCGATGACCAGACCCTGGGCTTCCAGGCTCGTCAGCCGGCGCTGCAGACCCCGGAACAGCGCCTGATGCAGCTGGAAATGAAAACCCGTCAGGCGTACGCGGGTTCTCAGATGCACGAACCGGCGTTCGCGGCGTTCCAGGAAGTTGCGATGGCTCACGACATCGCGCCGGCGTACGCGTTCGACCACCTGGAAGGCTTCGCGATGGATGTTCGTGAAGCGCAGTACTCTCAGCTGGACGACACCCTGCGCTACTGCTACCACGTTGCGGGTGTGGTTGGTCTGATGATGGCTCAGATCATGGGCGTTCGTGACAACGCTACCCTGGACCGTGCTTGCGACCTGGGTCTGGCGTTCCAGCTGACCAACATCGCGCGTGACATCGTAGACGATGCGCACGCTGGTCGTTGCTACCTGCCGGCGTCTTGGCTGGAACACGAAGGTCTGAACAAAGAAAACTACGCGGCGCCGGAAAACCGTCAGGCACTGTCCCGTATCGCGCGTCGTCTGGTTCAGGAAGCAGAACCGTACTACCTGAGCGCTACCGCTGGCCTGGCTGGTCTGCCGCTGCGTTCTGCTTGGGCTATCGCGACCGCTAAACAGGTTTACCGTAAAATCGGTGTTAAAGTTGAACAGGCGGGTCAGCAGGCATGGGACCAGCGTCAGTCTACCACCACCCCGGAAAAACTGACCCTGCTGCTGGCGGCTTCCGGTCAGGCGCTGACCTCTCGTATGCGTGCTCACCCGCCGCGTCCGGCTCACCTGTGGCAGCGTCCGCTGTAAGAAGGAGATATACCATGACCGTTTGCGCTAAAAAACACGTTCACCTGACCCGTGACGCGGCTGAACAGCTGCTGGCTGACATCGACCGTCGTCTGGACCAGCTGCTGCCGGTTGAAGGTGAACGTGACGTTGTTGGTGCTGCTATGCGTGAAGGTGCGCTGGCGCCGGGTAAACGTATCCGTCCGATGCTGCTGCTGCTGACCGCGCGTGACCTGGGTTGCGCGGTTTCTCACGACGGTCTGCTGGACCTGGCGTGCGCTGTTGAAATGGTTCACGCTGCGTCCCTGATCCTGGACGACATGCCGTGCATGGACGACGCGAAACTGCGTCGTGGTCGTCCGACCATCCACTCTCACTACGGTGAACACGTGGCGATCCTGGCGGCGGTTGCGCTGCTGTCCAAAGCGTTCGGTGTGATCGCAGATGCTGATGGTCTGACCCCGCTGGCTAAAAACCGTGCGGTTAGCGAACTGTCCAACGCGATCGGTATGCAGGGTCTGGTGCAGGGTCAGTTCAAAGACCTGAGCGAAGGTGACAAACCGCGTTCTGCGGAAGCGATCCTGATGACCAACCACTTCAAAACCTCTACCCTGTTCTGCGCGTCCATGCAGATGGCGTCTATCGTTGCTAACGCGTCTTCTGAAGCGCGTGATTGCCTGCACCGTTTCTCTCTGGATCTGGGTCAGGCGTTCCAGCTGCTGGATGACCTGACCGACGGCATGACCGATACCGGTAAAGACTCTAACCAGGACGCGGGCAAATCTACTCTGGTTAACCTGCTGGGTCCGCGTGCGGTGGAAGAACGTCTGCGTCAGCACCTGCAGCTGGCATCTGAACACCTGTCCGCTGCTTGCCAGCACGGTCACGCGACCCAGCACTTCATCCAGGCTTGGTTCGACAAAAAACTGGCTGCTGTTTCTTAAGAAGGAGATATACCATGAAACCGACCACCGTTATCGGTGCGGGTTTCGGTGGTCTGGCACTGGCTATCCGTCTGCAGGCGGCTGGCATCCCGGTTCTGCTGCTGGAACAGCGTGATAAACCGGGTGGTCGTGCATACGTTTACGAAGACCAGGGTTTCACCTTCGACGCGGGTCCGACCGTGATCACCGACCCGTCTGCGATTGAAGAACTGTTCGCGCTGGCTGGTAAACAGCTGAAAGAATACGTTGAACTGCTGCCGGTTACCCCGTTCTACCGTCTGTGCTGGGAATCTGGTAAAGTTTTCAACTACGACAACGATCAGACCCGCCTGGAAGCGCAGATCCAGCAGTTCAACCCGCGTGACGTTGAAGGCTACCGTCAGTTCCTGGATTACAGCCGTGCGGTTTTCAAAGAAGGCTACCTGAAACTGGGCACCGTTCCGTTCCTGTCTTTCCGCGACATGCTGCGTGCGGCGCCGCAGCTGGCTAAACTGCAGGCTTGGCGTTCTGTTTATTCCAAAGTTGCGTCTTACATCGAAGATGAACACCTGCGTCAGGCGTTCTCTTTCCACTCTCTGCTGGTTGGTGGTAACCCGTTCGCGACCTCTTCCATCTACACTCTGATCCACGCGCTGGAACGTGAATGGGGTGTTTGGTTCCCGCGCGGCGGTACCGGCGCGCTGGTTCAGGGTATGATCAAACTGTTCCAGGATCTGGGCGGCGAAGTTGTTCTGAACGCGCGTGTATCTCACATGGAAACCACCGGTAACAAAATCGAAGCGGTTCACCTGGAAGACGGCCGTCGCTTCCTGACCCAGGCGGTTGCTTCTAACGCTGACGTGGTTCACACCTACCGTGACCTGCTGTCTCAGCACCCGGCTGCGGTAAAACAGTCTAACAAACTGCAGACCAAACGTATGTCTAACTCTCTGTTCGTTCTGTACTTCGGCCTGAACCACCACCACGACCAGCTGGCTCACCACACCGTTTGCTTCGGTCCGCGTTACCGTGAACTGATCGACGAAATCTTCAACCACGACGGTCTGGCTGAAGACTTCTCTCTGTACCTGCACGCTCCGTGCGTTACCGACAGCTCCCTGGCGCCGGAAGGTTGCGGTTCTTACTACGTTCTGGCGCCGGTTCCGCATCTGGGTACCGCTAACCTGGATTGGACCGTGGAAGGTCCGAAACTGCGTGATCGTATCTTCGCGTACCTGGAACAGCACTACATGCCGGGTCTGCGTTCTCAGCTGGTTACCCACCGTATGTTCACTCCGTTCGATTTCCGTGACCAGCTGAACGCGTACCACGGTAGCGCTTTCTCTGTTGAACCGGTTCTGACCCAGTCTGCTTGGTTCCGCCCGCACAACCGTGACAAAACCATCACCAACCTGTACCTGGTTGGTGCGGGTACCCATCCGGGTGCTGGTATCCCAGGTGTTATCGGTAGCGCTAAAGCTACCGCGGGTCTGATGCTGGAAGACCTGATCTAA
所述质粒载体pET-15b的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：
Figure BDA0002820665640000061
Figure BDA0002820665640000071
Figure BDA0002820665640000081
Figure BDA0002820665640000091
实施例2：
本实施例涉及利用生物工程菌测定乳糖含量的方法，通过携带番茄红素表达基因的生物工程菌测定乳糖含量，具体方法如下：
将实施例1的生物工程菌划线于LB平板(含100μg˙mL-1氨苄青霉素与25μg˙mL-1氯霉素)上，挑取单菌落于50mL的液体LB培养基(含100μg˙mL-1氨苄青霉素与25μg˙mL-1氯霉素)中，于37℃,180rpm恒温培养至OD600＝1.00；将上述菌液按1：50比例扩大培养于50mL液体LB培养基(含100μg˙mL-1氨苄青霉素与25μg˙mL-1氯霉素)中，于37℃,180rpm恒温培养6h；分别添加1.25mL浓度为0、4、12、20、28、36、44、52g˙L-1的乳糖溶液，25℃诱导12h，每组三个重复；取诱导后的菌液1mL测其在474nm下的吸光值，采用分光光度计测量吸光值，绘制吸光值与乳糖诱导浓度的散点图并拟合关系曲线，结果如图3所示。
从图3可以得出，生物工程菌在474nm下的吸光值与乳糖诱导浓度变化呈线性关系，y＝0.01735x+4.78826，R2＝0.99501。
本实施例涉及的乳糖含量检测的原理是：在大肠杆菌生长过程中，乳糖既可以被当作碳源利用促进生长，又可以在含有乳糖操纵子的质粒中作为诱导剂诱导目的基因的表达。由于质粒pET-15b含有乳糖操纵子lac，在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态，此时lacI序列在Plac启动序列操纵下表达的lac阻遏蛋白与lacO序列结合，阻遏RNA聚合酶和P序列结合，抑制转录启动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导，激活目的基因crtB-crtI-crtE的转录，产生番茄红素，不同浓度乳糖诱导产生的番茄红素含量不同。随乳糖浓度的变化，474nm下菌液吸光值(A474)也会变化，在一定浓度范围内乳糖浓度与A474呈现良好的线性关系。
实施例3：
本实施例涉及用实施例1的生物工程菌检测样品中乳糖含量的实验，具体步骤如下：将实施例1的生物工程菌划线于LB平板(含100μg˙mL-1氨苄青霉素与25μg˙mL-1氯霉素)上，挑取单菌落于50mL的液体LB培养基(含100μg˙mL-1氨苄青霉素与25μg˙mL-1氯霉素)中，于37℃,180rpm恒温培养至OD600＝1.00；将上述菌液按1：50比例扩大培养于50mL液体LB培养基(含100μg˙mL-1氨苄青霉素与25μg˙mL-1氯霉素)中，于37℃,180rpm恒温培养6h；添加1.25mL浓度为36g˙L-1的乳糖溶液，25℃诱导12h，每组三个重复；取诱导后的菌液1mL测其在474nm下的吸光值。根据实施例1中线性关系可计算出实际乳糖含量为35.989g˙L-1，认为该方法具有良好的检测效果。
实施例4：
本实施例涉及用实施例1的生物工程菌检测牛奶中乳糖含量实验，具体步骤如下：将实施例1的生物工程菌划线于LB平板(含100μg˙mL-1氨苄青霉素与25μg˙mL-1氯霉素)上，挑取单菌落于50mL的液体LB培养基(含100μg˙mL-1氨苄青霉素与25μg˙mL-1氯霉素)中，于37℃,180rpm恒温培养至OD600＝1.00；将上述菌液按1：50比例扩大培养于50mL液体LB培养基(含100μg˙mL-1氨苄青霉素与25μg˙mL-1氯霉素)中，于37℃,180rpm恒温培养6h；直接添加经紫外灭菌15min后的1.25mL牛奶于扩大培养后的50mL液体LB培养基(含100μg˙mL-1氨苄青霉素与25μg˙mL-1氯霉素)中，25℃诱导12h，每组三个重复；取菌液测其在474nm下的吸光值。在经过分光光度计测量时，由于牛奶呈乳白色，调零标准液体为LB液体：牛奶＝51.10mL：1.25mL，为使测量结果有效，需将调零标准液体再次用LB液体稀释再进行吸光值测量，其稀释倍数与菌液的稀释倍数相同。
根据实施例1中所得线性关系，可计算出牛奶中乳糖含量为45.487g˙L-1。采用高效液相色谱法测定同批次牛奶的乳糖含量，使用Bio-Rad HPX-87H色谱柱，Agilent1200系列配RID检测器，柱温55℃，流速0.5mL/min,流动相为5mmol/L H2SO4,经测定乳糖浓度为44.4001g˙L-1,说明本实施例用生物工程菌测量乳糖含量的方法具有良好的检测效果。
序列表
<110> 青岛大学
<120> 一种用于检测乳糖含量的生物工程菌及其制备方法和应用
<130> 20201203
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3346
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaacaacc cgtccctgct gaaccacgcg gttgaaacca tggcggttgg ttctaaatct 60
ttcgcgaccg cgtctaaact gttcgacgcg aaaacccgtc gttctgttct gatgctgtac 120
gcgtggtgcc gtcactgcga cgacgttatc gatgaccaga ccctgggctt ccaggctcgt 180
cagccggcgc tgcagacccc ggaacagcgc ctgatgcagc tggaaatgaa aacccgtcag 240
gcgtacgcgg gttctcagat gcacgaaccg gcgttcgcgg cgttccagga agttgcgatg 300
gctcacgaca tcgcgccggc gtacgcgttc gaccacctgg aaggcttcgc gatggatgtt 360
cgtgaagcgc agtactctca gctggacgac accctgcgct actgctacca cgttgcgggt 420
gtggttggtc tgatgatggc tcagatcatg ggcgttcgtg acaacgctac cctggaccgt 480
gcttgcgacc tgggtctggc gttccagctg accaacatcg cgcgtgacat cgtagacgat 540
gcgcacgctg gtcgttgcta cctgccggcg tcttggctgg aacacgaagg tctgaacaaa 600
gaaaactacg cggcgccgga aaaccgtcag gcactgtccc gtatcgcgcg tcgtctggtt 660
caggaagcag aaccgtacta cctgagcgct accgctggcc tggctggtct gccgctgcgt 720
tctgcttggg ctatcgcgac cgctaaacag gtttaccgta aaatcggtgt taaagttgaa 780
caggcgggtc agcaggcatg ggaccagcgt cagtctacca ccaccccgga aaaactgacc 840
ctgctgctgg cggcttccgg tcaggcgctg acctctcgta tgcgtgctca cccgccgcgt 900
ccggctcacc tgtggcagcg tccgctgtaa gaaggagata taccatgacc gtttgcgcta 960
aaaaacacgt tcacctgacc cgtgacgcgg ctgaacagct gctggctgac atcgaccgtc 1020
gtctggacca gctgctgccg gttgaaggtg aacgtgacgt tgttggtgct gctatgcgtg 1080
aaggtgcgct ggcgccgggt aaacgtatcc gtccgatgct gctgctgctg accgcgcgtg 1140
acctgggttg cgcggtttct cacgacggtc tgctggacct ggcgtgcgct gttgaaatgg 1200
ttcacgctgc gtccctgatc ctggacgaca tgccgtgcat ggacgacgcg aaactgcgtc 1260
gtggtcgtcc gaccatccac tctcactacg gtgaacacgt ggcgatcctg gcggcggttg 1320
cgctgctgtc caaagcgttc ggtgtgatcg cagatgctga tggtctgacc ccgctggcta 1380
aaaaccgtgc ggttagcgaa ctgtccaacg cgatcggtat gcagggtctg gtgcagggtc 1440
agttcaaaga cctgagcgaa ggtgacaaac cgcgttctgc ggaagcgatc ctgatgacca 1500
accacttcaa aacctctacc ctgttctgcg cgtccatgca gatggcgtct atcgttgcta 1560
acgcgtcttc tgaagcgcgt gattgcctgc accgtttctc tctggatctg ggtcaggcgt 1620
tccagctgct ggatgacctg accgacggca tgaccgatac cggtaaagac tctaaccagg 1680
acgcgggcaa atctactctg gttaacctgc tgggtccgcg tgcggtggaa gaacgtctgc 1740
gtcagcacct gcagctggca tctgaacacc tgtccgctgc ttgccagcac ggtcacgcga 1800
cccagcactt catccaggct tggttcgaca aaaaactggc tgctgtttct taagaaggag 1860
atataccatg aaaccgacca ccgttatcgg tgcgggtttc ggtggtctgg cactggctat 1920
ccgtctgcag gcggctggca tcccggttct gctgctggaa cagcgtgata aaccgggtgg 1980
tcgtgcatac gtttacgaag accagggttt caccttcgac gcgggtccga ccgtgatcac 2040
cgacccgtct gcgattgaag aactgttcgc gctggctggt aaacagctga aagaatacgt 2100
tgaactgctg ccggttaccc cgttctaccg tctgtgctgg gaatctggta aagttttcaa 2160
ctacgacaac gatcagaccc gcctggaagc gcagatccag cagttcaacc cgcgtgacgt 2220
tgaaggctac cgtcagttcc tggattacag ccgtgcggtt ttcaaagaag gctacctgaa 2280
actgggcacc gttccgttcc tgtctttccg cgacatgctg cgtgcggcgc cgcagctggc 2340
taaactgcag gcttggcgtt ctgtttattc caaagttgcg tcttacatcg aagatgaaca 2400
cctgcgtcag gcgttctctt tccactctct gctggttggt ggtaacccgt tcgcgacctc 2460
ttccatctac actctgatcc acgcgctgga acgtgaatgg ggtgtttggt tcccgcgcgg 2520
cggtaccggc gcgctggttc agggtatgat caaactgttc caggatctgg gcggcgaagt 2580
tgttctgaac gcgcgtgtat ctcacatgga aaccaccggt aacaaaatcg aagcggttca 2640
cctggaagac ggccgtcgct tcctgaccca ggcggttgct tctaacgctg acgtggttca 2700
cacctaccgt gacctgctgt ctcagcaccc ggctgcggta aaacagtcta acaaactgca 2760
gaccaaacgt atgtctaact ctctgttcgt tctgtacttc ggcctgaacc accaccacga 2820
ccagctggct caccacaccg tttgcttcgg tccgcgttac cgtgaactga tcgacgaaat 2880
cttcaaccac gacggtctgg ctgaagactt ctctctgtac ctgcacgctc cgtgcgttac 2940
cgacagctcc ctggcgccgg aaggttgcgg ttcttactac gttctggcgc cggttccgca 3000
tctgggtacc gctaacctgg attggaccgt ggaaggtccg aaactgcgtg atcgtatctt 3060
cgcgtacctg gaacagcact acatgccggg tctgcgttct cagctggtta cccaccgtat 3120
gttcactccg ttcgatttcc gtgaccagct gaacgcgtac cacggtagcg ctttctctgt 3180
tgaaccggtt ctgacccagt ctgcttggtt ccgcccgcac aaccgtgaca aaaccatcac 3240
caacctgtac ctggttggtg cgggtaccca tccgggtgct ggtatcccag gtgttatcgg 3300
tagcgctaaa gctaccgcgg gtctgatgct ggaagacctg atctaa 3346
<210> 2
<211> 5708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60
ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120
caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180
gcgggatatc cggatatagt tcctcctttc agcaaaaaac ccctcaagac ccgtttagag 240
gccccaaggg gttatgctag ttattgctca gcggtggcag cagccaactc agcttccttt 300
cgggctttgt tagcagccgg atcctcgagc atatggctgc cgcgcggcac caggccgctg 360
ctgtgatgat gatgatgatg gctgctgccc atggtatatc tccttcttaa agttaaacaa 420
aattatttct agaggggaat tgttatccgc tcacaattcc cctatagtga gtcgtattaa 480
tttcgcggga tcgagatctc gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc 540
gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct 600
cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc 660
gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac 720
ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga 780
gatcccggac accatcgaat ggcgcaaaac ctttcgcggt atggcatgat agcgcccgga 840
agagagtcaa ttcagggtgg tgaatgtgaa accagtaacg ttatacgatg tcgcagagta 900
tgccggtgtc tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac caggccagcc acgtttctgc 960
gaaaacgcgg gaaaaagtgg aagcggcgat ggcggagctg aattacattc ccaaccgcgt 1020
ggcacaacaa ctggcgggca aacagtcgtt gctgattggc gttgccacct ccagtctggc 1080
cctgcacgcg ccgtcgcaaa ttgtcgcggc gattaaatct cgcgccgatc aactgggtgc 1140
cagcgtggtg gtgtcgatgg tagaacgaag cggcgtcgaa gcctgtaaag cggcggtgca 1200
caatcttctc gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattaac tatccgctgg atgaccagga 1260
tgccattgct gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg ttatttcttg atgtctctga 1320
ccagacaccc atcaacagta ttattttctc ccatgaagac ggtacgcgac tgggcgtgga 1380
gcatctggtc gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta gcgggcccat taagttctgt 1440
ctcggcgcgt ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc actcgcaatc aaattcagcc 1500
gatagcggaa cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt tttcaacaaa ccatgcaaat 1560
gctgaatgag ggcatcgttc ccactgcgat gctggttgcc aacgatcaga tggcgctggg 1620
cgcaatgcgc gccattaccg agtccgggct gcgcgttggt gcggatatct cggtagtggg 1680
atacgacgat accgaagaca gctcatgtta tatcccgccg ttaaccacca tcaaacagga 1740
ttttcgcctg ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg caactctctc agggccaggc 1800
ggtgaagggc aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa agaaaaacca ccctggcgcc 1860
caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca 1920
ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtaagt tagctcactc 1980
attaggcacc gggatctcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc 2040
ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac 2100
tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga 2160
gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag 2220
ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca 2280
tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct 2340
tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc 2400
tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc gcggctctta 2460
ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga 2520
gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg 2580
cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg aatggaagcc ggcggcacct 2640
cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg agccaatcaa ttcttgcgga gaactgtgaa 2700
tgcgcaaacc aacccttggc agaacatatc catcgcgtcc gccatctcca gcagccgcac 2760
gcggcgcatc tcgggcagcg ttgggtcctg gccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc 2820
gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat 2880
acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg caaaacgtct gcgacctgag caacaacatg 2940
aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag tctggaaacg cggaagtcag cgccctgcac 3000
cattatgttc cggatctgca tcgcaggatg ctgctggcta ccctgtggaa cacctacatc 3060
tgtattaacg aagcgctggc attgaccctg agtgattttt ctctggtccc gccgcatcca 3120
taccgccagt tgtttaccct cacaacgttc cagtaaccgg gcatgttcat catcagtaac 3180
ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat cggtatcatt acccccatga acagaaatcc 3240
cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt 3300
tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca 3360
ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc 3420
gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc 3480
ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg 3540
cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt 3600
aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatatgcgg tgtgaaatac 3660
cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 3720
actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 3780
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 3840
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 3900
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 3960
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 4020
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 4080
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 4140
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 4200
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 4260
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 4320
ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 4380
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 4440
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 4500
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 4560
tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 4620
agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 4680
gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 4740
agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 4800
cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 4860
ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 4920
cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt 4980
cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 5040
ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 5100
tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 5160
catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 5220
gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata 5280
gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 5340
tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 5400
catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 5460
aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 5520
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 5580
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 5640
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 5700
ttcaagaa 5708

Claims (2)

1.一种用于检测乳糖含量的生物工程菌的应用，其特征在于，将生物工程菌在无乳糖的培养基中培养，加入含乳糖的待测样品诱导类胡萝卜素累积，根据类胡萝卜素的表达量进行样品中乳糖含量的测定；
所述生物工程菌为将重组质粒pDecLac转化至大肠杆菌E.coli BL21后获得，重组质粒pDecLac包括类胡萝卜素表达基因和质粒载体pET-15b，所述生物工程菌产类胡萝卜素；
所述类胡萝卜素为八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素或玉米黄素；
所述类胡萝卜素表达基因为 SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测乳糖含量的生物工程菌的应用，其特征在于，将生物工程菌在无乳糖的培养基中培养至OD600=0.50-1.00，再转接培养6小时后加入待测样品。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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生产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌的构建;刘敏等;《药物生物技术》;20071231;第14卷(第1期);1-4 *
重组类胡萝卜素合成相关酶的纯化及紫外线对烟草Ggps基因表达的影响;刘敏;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20071015;摘要 *

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