CN110129354B - 一种n-乙酰神经氨酸的特异性生物传感器及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种N‑乙酰神经氨酸的特异性生物传感器及其应用，属于遗传工程领域。本发明以来源于大肠杆菌(Escherichia coli K 12)的转录调控因子NanR，GFP基因为报告基因构建了N‑乙酰神经氨酸特异性的生物传感器，并建立了N‑乙酰神经氨酸与荧光强度的有效关系。该生物反应器在筛选产目的代谢产物的微生物方面具有重要的应用前景。

Description

一种N-乙酰神经氨酸的特异性生物传感器及其应用

技术领域

本发明涉及一种N-乙酰神经氨酸的特异性生物传感器及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是生物体内的一种单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸是细胞信息传递的第一接触位点，参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于调节IgG抗炎活性，增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采用从酪蛋白、燕窝等含量相对丰富的天然材料中提取，得到的产品容易引起过敏反应，或是通过严苛条件的化学法合成，高温、高压工艺复杂，中间产物等难以分离，而且对环境污染严重。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级N-乙酰神经氨酸的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径调控严密，并不会形成氨糖的积累，而且没有N-乙酰神经氨酸关键基因。如何改造枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径，供需前体物质，以及建立N-乙酰神经氨酸代谢途径是首先需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建一种积累N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明的第一个目的是提供一种生物传感器，含有启动子P_rapH、P_hbs，NanR基因、NanR基因结合位点和编码标记物的基因；所述P_rapH调控NanR的表达；所述P_hbs上整合调控NanR基因结合位点的序列，并调控编码标记物的基因表达；所述启动子P_rapH和启动子P_hbs转录方向相反。

在本发明的一种实施方式中，启动子P_rapH、P_hbs、NanR基因和NanR基因结合位点位于载体上。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pHT01。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物为荧光蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物为绿色荧光蛋白。

在本发明的一种实施方式中，编码所述启动子P_rapH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述启动子P_hbs的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述NanR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述NanR结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二个目的是提供含有所述生物传感器的基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供一种积累N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，含有上述所述的生物传感器，并表达念珠藻来源的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和大肠杆菌来源的N-乙酰神经氨酸合酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以木糖诱导型启动子P_xylA诱导N-乙酰神经氨酸的积累、

在本发明的一种实施方式中，所述念珠藻为念珠藻(Anabaena sp.)CH1。

在本发明的一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸合酶来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K1。

本发明的第四个目的是提供一种构建上述生物传感器的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)、构建重组质粒：克隆大肠杆菌(Escherichia coli)K12的NanR，以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的启动子P_rapH、P_hbs(含有NanR结合位点)和GFP，连接到重组表达质粒pHT01上，其中反向连接的启动子P_rapH、P_hbs用来调控表达NanR和GFP基因；

2)构建含有N-乙酰神经氨酸生物传感器的重组枯草芽孢杆菌：将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌，得到产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌。

所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔpta::lox72；Δctc::Gna1,pSTOP1622-AGE-NeuB；所述重组表达载体为pHT01。

本发明的第五个目的是提供一种筛选产N-乙酰神经氨酸菌株的方法，所述方法包括：将来源于的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因，以及来源于的N-乙酰神经氨酸合酶编码基因构建到质粒pSTOP 1622中，将其转化到菌株Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔpta::lox72；Δctc::Gna1(公开于论文Zhang XL,LiuYF,Liu L,Wang M,Li JH,Du GC,Chen J.Modular pathway engineering of key carbon-precursor supply-pathways for improved N-acetylneuraminic acid production inBacillus subtilis.Biotechnology and bioengineering.2018；115(9):2217-2231)中，得到菌株B6S，通过pSTOP质粒的木糖诱导型启动子P_xylA诱导产N-乙酰神经氨酸构建代谢途径，实现N-乙酰神经氨酸的积累。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K12的NanR，以及来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的启动子P_rapH、P_hbs(含有NanR结合位点)和GFP连接到质粒pHT01上，将其转化到B6S菌株中，得到菌株B6SB，通过导入所述生物传感器实现N-乙酰神经氨酸和荧光强度的关联。

本发明还提供了一种应用上述重组枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，将35-38℃、180-220rpm下培养10-20h的重组枯草芽孢杆菌以10％-20％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵30-50h。

本发明还要求保护所述生物传感器在筛选等方面的应用。

有益效果：本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可实现N-乙酰神经氨酸和荧光强度在一定范围内的良好关系，R²达0.9871，从而为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产N-乙酰神经氨酸以及菌株进化奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

附图说明

图1为NeuAc产量和单位OD菌体产生的荧光强度之间的线性关系。

具体实施方式

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，胰蛋白胨10，酵母粉5，尿素6，NaCl10。

培养条件：将37℃、200rpm下培养10h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养45h。

N-乙酰神经氨酸的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，UV检测器，HPX-87H柱(300×7.8mm，5μm)，流动相：5mM稀硫酸，流速0.50mL/min，柱温60℃，进样体积为10μL。

实施例1重组质粒的构建

根据质粒p43NMK-AGE-NeuB(Zhang XL,Liu YF,Liu L,Wang M,Li JH,Du GC,ChenJ.Modular pathway engineering of key carbon-precursor supply-pathways forimproved N-acetylneuraminic acid production in Bacillussubtilis.Biotechnology and bioengineering.2018；115(9):2217-2231)序列信息，设计引物AGE-NeuB-F：5’-CCGGGATCCATGGGCAAAAACTTACAAGCTCTGGCCCAGCTTTATAAAAATGCCC-3’，AGE-NeuB-R：5’-TCCCTGGTTTTTAAATTCGCTATGGATGATAAGTTCATCCGGGATAAAATCTTGTTCCGCG-3’，使用上述引物以质粒p43NMK-AGE-NeuB为模板，扩增SEQ ID NO.5所示的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(AGE)和SEQ ID NO.6所示的N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)；根据质粒pSTOP1622序列(SEQ ID NO.8)，设计载体反向扩增引物：pSTOP1622-F:5’-GCGAATTTAAAAACCAGGGAGAATAAGGTACCGGCCGCATGCCG-3’，pSTOP1622-R:5’-TTTTTGCCCATGGATCCCGGGAGCTCCGGAGATCTTCGAACTAGTTTGGACC-3’，使用上述引物以质粒pSTOP1622为模板，反向扩增载体，以上两个片段通过一步克隆连接构建重组质粒，经菌落PCR和测序验证正确。

实施例2重组枯草芽孢杆菌菌株B6S的构建

将构建好的重组质粒pSTOP16220AGE-NeuB转化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔpta::lox72；Δctc::Gna1)。采用AGE-NeuB-F及AGE-NeuB-R进行菌落PCR，出现2233bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌B6S构建成功。

实施例3生物传感器质粒的构建

根据大肠杆菌(Escherichia coli K12)的序列信息，设计引物NanR-F:5’-CGCAGGCGTTTTGTAATAAATTATTTCTTTTTGTTGGTGGTCTGACCGAAAGCGT-3’，NanR-R:5’-TGGGATTGATAGAATATGACATGGGCCTTATGAACGC-3’，使用上述引物以大肠杆菌K12为模板扩增NanR基因；根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168序列，设计引物rapH-F：5’-GTCATATTCTATCAATCCCAAATTTTGAAAACAATATAGAAGGAAG-3’，rapH-R：5’-TCATCCTATTCCTTGATCCTGTTTAAGGGG-3’，phbs-F：5’-AGGATCAAGGAATAGGATGAAAAAAGGAAAAAAAGGAATATTCGTTCGG-3’，phbs-R：5’-AGTTCTTCTCCCTTACCCATCCCAAAAGGATACATTCAGTTCGTTTATTATCATTTCTTCACAGTTCAG-3’，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为模板扩增上述启动子；根据GFP基因序列设计引物，GFP-F：5’-ATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGT-3’，GFP-R：5’-CCGGCAGTCTGACAAGTTATTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCCCAGC-3’，使用GFP基因为模板扩增后，根据pHT01质粒序列设计引物，pHT01-F：5’-ATAACTTGTCAGACTGCCGGGAAATCCCGGCAGTCTTTTTTCCATTTTCACGTCACGCGTCCATGGAGATCTTTGT-3’，pHT01-R：5’-TTTATTACAAAACGCCTGCGCAATAACGCAGGCGTTCTGTGACATTGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA-3’，以pHT01质粒为模板反向扩增得到载体，将上述片段通过Gibson Assembly Clonging Kit(New England Biolabs)，构建重组表达质粒pHT01-biosensor，菌落PCR、测序确定质粒构建成功。

实施例4重组N-乙酰神经氨酸生物传感器枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的pHT01-biosensor质粒转化枯草芽孢杆菌B6S以及采用不同策略构建的产量不同的产N-乙酰神经氨酸产量的枯草芽孢杆菌菌株(发酵45h产量分别为1.3g/l、2.0g/l、2.4g/l、3.2g/l)。设计菌落PCR引物，YZ-F：5’-CACCGATGATAGTGTCCGCAGAA-3’，YZ-R：5’-TGAGTATCTTCTTCCGTGATTCCTTGA-3’，引物挑选转化子进行菌落PCR，出现1941bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌均构建成功。

实施例5发酵验证生物传感器效果

将37℃、200rpm下培养10h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养45h。发酵结束后测定荧光强度，得到一定范围内N-乙酰神经氨酸和单位OD菌体产生的荧光强度间有效关系，R²达0.9871。实现了生物传感器对枯草芽孢杆菌有效的筛选作用。

表1 N-乙酰神经氨酸和荧光强度间的关系

NeuAc产量(g/L)	荧光强度/OD<sub>600</sub>
		0.8	8129
1.3	11324
		2.0	13280
2.4	15013
		3.2	19032

对比例1

具体实施方式同实施例3，区别在于，将实施例3中的启动子P_rapH分别替换为P_yabR、P_veg、P_lytR，结果显示，NeuAc-Biosensor没有得到激活。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种N-乙酰神经氨酸的特异性生物传感器及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtcatattct atcaatccca aattttgaaa acaatataga aggaagaaat tgttttttca 60

tcctgtcaat ttgttttttt cataaaaaag aaccctttat gcaagggtct ttgtcattct 120

atttcatata gtattcactt attgtcaacc acaacaaaat cctgaacctt cacctgttcc 180

tcaggcaaat caaactgata aagcatctcc ttagaatgga tatcaaacac acccacgtat 240

ccgccgatgc cctttttatg ctcttcctgg gcaactatat acaatagatt ccccttaaac 300

<210> 2

<211> 320

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggatcaagg aataggatga aaaaaggaaa aaaaggaata ttcgttcggt aaatcacctt 60

aaatccttga cgagcattga attggtataa caggtatata gatatggctt tttatatgtg 120

ttactctaca tacagaaatt cttcactttg ttggacaaac attcctcaga gtgcagtttt 180

tcttaaaaag ccgtttaatt gtctttctct tacttgctct catttttttc tgagacaggt 240

ttagaatcag actgaactgt gaagaaatga taataaacga actgaatgta tccttttggg 300

aaaggaggtg aaatgtacac 320

<210> 3

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggcctta tgaacgcatt tgattcgcaa accgaagatt cttcacctgc aattggtcgc 60

aacttgcgta gccgcccgct ggcgcgtaaa aaactctccg aaatggtgga agaagagctg 120

gaacagatga tccgccgtcg tgaatttggc gaaggtgaac aattaccgtc tgaacgcgaa 180

ctgatggcgt tctttaacgt cgggcgtcct tcggtgcgtg aagcgctggc agcgttaaaa 240

cgcaaaggtc tggtgcaaat aaacaacggc gaacgcgctc gcgtctcgcg tccttctgcg 300

gacactatca tcggtgagct ttccggcatg gcgaaagatt tcctttctca tcccggtggg 360

attgcccatt tcgaacaatt acgtctgttc tttgaatcca gtctggtgcg ctatgcggct 420

gaacatgcca ccgatgagca aatcgatttg ctggcaaaag cactggaaat caacagtcag 480

tcgctggata acaacgcggc attcattcgt tcagacgttg atttccaccg cgtgctggcg 540

gagatccccg gtaacccaat cttcatggcg atccacgttg ccctgctcga ctggcttatt 600

gccgcacgcc caacggttac cgatcaggca ctgcacgaac ataacaacgt tagttatcaa 660

cagcatattg cgatcgttga tgcgatccgc cgtcatgatc ctgacgaagc cgatcgtgcg 720

ttgcaatcgc atctcaacag cgtctctgct acctggcacg ctttcggtca gaccaccaac 780

aaaaagaaat aa 792

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgaattggt ataacaggta tatagatatg gcttttta 38

<210> 5

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgggcaaaa acttacaagc tctggcccag ctttataaaa atgccctgct taacgatgtg 60

cttccgtttt gggaaaatca ttcattagat agcgaaggcg gatattttac atgcctggat 120

agacagggca aagtctacga tacagataaa tttatctggc ttcaaaaccg ccaggtttgg 180

acattttcta tgctttgtaa ccagctggaa aaaagagaaa actggctgaa aatcgctcgc 240

aatggagcca aatttctggc acaacatggc agagatgatg aaggaaactg gtattttgct 300

ttaacacgcg gcggagaacc gctggttcaa ccgtataata tttttagcga ttgctttgca 360

gcgatggcct tttctcagta tgcattagcg tcaggagaag aatgggcaaa agatgttgct 420

atgcaagcct ataataacgt gctgagacgc aaagataacc cgaaaggcaa atacacaaaa 480

acatatccgg gaacaagacc gatgaaagct ttagccgttc cgatgattct ggcgaacctg 540

acacttgaaa tggaatggtt actgccgcaa gaaacactgg aaaatgtgct tgctgccaca 600

gtccaggaag ttatgggcga ttttcttgat caagaacagg gattaatgta tgaaaacgtc 660

gctccggatg gctcacatat cgattgcttt gaaggacgcc tgattaatcc gggccatgga 720

atcgaagcga tgtggtttat tatggatatc gctagacgca aaaacgatag caaaacaatc 780

aaccaggcgg ttgatgttgt gttaaatatc ctgaactttg cttgggataa cgaatacggc 840

ggactttact actttatgga tgcagcgggc catccgccgc aacagctgga atgggatcaa 900

aaactttggt gggtgcatct tgaaagctta gtcgcactgg cgatgggcta tagattaaca 960

ggacgcgatg catgttgggc gtggtatcaa aaaatgcatg attattcttg gcagcatttt 1020

gcagatccgg aatatggcga atggtttgga tatcttaaca gacgcggcga agtgcttctg 1080

aacctgaaag gcggaaaatg gaaaggatgc tttcatgtcc cgagagccat gtatctgtgt 1140

tggcaacagt ttgaagcact ttcataa 1167

<210> 6

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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gcgagagaaa tgattttaaa agctaaagaa gccggcgtga acgctgtcaa atttcaaaca 120

tttaaagccg ataaactgat cagcgcaatt gcgccgaaag cagaatacca aatcaaaaac 180

acaggagaat tagaatctca gctggaaatg acgaaaaaac tggaaatgaa atacgatgat 240

taccttcatc tgatggaata cgcagtcagc ctgaatcttg atgtttttag cacaccgttt 300

gatgaagatt ctattgattt tctggcgtca ctgaaacaaa aaatctggaa aattccgtca 360

ggcgaactgc ttaaccttcc gtacctggaa aaaatcgcta aacttccgat cccggataag 420

aaaattatca ttagcacagg catggccaca atcgatgaaa tcaaacagtc tgtctcaatc 480

tttatcaata acaaagtccc ggttggaaac atcacaatcc tgcattgtaa cacagaatat 540

ccgacaccgt ttgaagatgt taaccttaac gctatcaacg atctgaaaaa acattttccg 600

aaaaacaaca tcggcttttc tgatcattca agcggatttt atgcagcgat tgctgccgtt 660

ccgtatggca tcacatttat cgaaaaacat tttacactgg ataaaagcat gtctggaccg 720

gatcatcttg cttcaatcga accggatgaa ctgaaacatc tttgcattgg cgttagatgt 780

gtggaaaaat cactgggatc aaatagcaaa gttgtgacag ccagcgaaag aaaaaacaaa 840

atcgttgcac gcaaatctat catcgcgaaa acagaaatca aaaaaggaga agtgttttca 900

gagaaaaata tcacaacaaa aagaccgggc aacggaatta gcccgatgga atggtataat 960

ttactgggca aaatcgcgga acaagatttt atcccggatg aacttatcat ccatagcgaa 1020

tttaaaaacc agggagaata a 1041

<210> 7

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240

catgactttt tcaagagtgc catgcctgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

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<210> 8

<211> 6535

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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aaaaacaagc attacaggtc ttctgccgcc tctagattgc cctgccccaa tttcaaaaat 120

aaaatctttt tcaagcagtg tatttacttg agaggagaca gtagacttgt ttaatcctgt 180

aatctcagag agagttgccc tggagacagg ggagttcttc aaaatttcat ctaatattaa 240

tttttgattc atttttttta ctaaagcttg atctgcaatt tgaataataa ccactccttt 300

gtttatccac cgaactaagt tggtgttttt tgaagcttga attagatatt taaaagtatc 360

atatctaata ttataactaa attttctaaa aaaaacattg aaataaacat ttattttgta 420

tatgatgaga taaagttagt ttattggata aacaaactaa ctcaattaag atagttgatg 480

gataaacttg ttcacttaaa tcaaaggggg aaatgtacaa tggtccaaac tagttcgaag 540

atctccggag ctcccgggat ccggtaccgg ccgcatgccg gctaaacctc gcgaacggat 600

tcaccggtcc aagaattgga gccaatcaat tcttgcggag aactgtgaat gcgcaaacca 660

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cgggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 780

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gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 1200

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aagtaataac aaattactat acagataagt tgactgatca acttccatag gtaacaacct 2760

ttgatcaagt aagggtatgg ataataaacc acctacaatt gcaatacctg ttccctctga 2820

taaaaagctg gtaaagttaa gcaaactcat tccagcacca gcttcctgct gtttcaagct 2880

acttgaaaca attgttgata taactgtttt ggtgaacgaa agcccaccta aaacaaatac 2940

gattataatt gtcatgaacc atgatgttgt ttctaaaaga aaggaagcag ttaaaaagct 3000

aacagaaaga aatgtaactc cgatgtttaa cacgtataaa ggacctcttc tatcaacaag 3060

tatcccacca atgtagccga aaataatgac actcattgtt ccagggaaaa taattacact 3120

tccgatttcg gcagtactta gctggtgaac atctttcatc atataaggaa ccatagagac 3180

aaaccctgct actgttccaa atataattcc cccacaaaga actccaatca taaaaggtat 3240

atttttccct aatccgggat caacaaaagg atctgttact ttcctgatat gttttacaaa 3300

tatcaggaat gacagcacgc taacgataag aaaagaaatg ctatatgatg ttgtaaacaa 3360

cataaaaaat acaatgccta cagacattag tataattcct ttgatatcaa aatgaccttt 3420

tatccttact tctttcttta ataatttcat aagaaacgga acagtgataa ttgttatcat 3480

aggaatgagt agaagatagg accaatgaat ataatgggct atcattccac caatcgctgg 3540

accgactcct tctcccatgg ctactatcga tccaataaga ccaaatgctt tacccctatt 3600

ttcctttgga atatagcgcg caactacaac cattacgagt gctggaaatg cagctgcacc 3660

agccccttga ataaaacgag ccataataag taaggaaaag aaagaatggc caacaaaccc 3720

aattaccgac ccgaaacaat ttattataat tccaaatagg agtaaccttt tgatgcctaa 3780

ttgatcagat agctttccat atacagctgt tccaatggaa aaggttaaca taaaggctgt 3840

gttcacccag tttgtactcg caggtggttt attaaaatca tttgcaatat caggtaatga 3900

gacgttcaaa accatttcat ttaatacgct aaaaaaagat aaaatgcaaa gccaaattaa 3960

aatttggttg tgtcgtaaat tcgattgtga ataggatgta ttcacatttc accctccaat 4020

aatgagggca gacgtagttt atagggttaa tgatacgctt ccctctttta attgaaccct 4080

gttacattca ttacacttca taattaattc ctcctaaact tgattaaaac attttaccac 4140

atataaacta agttttaaat tcagtatttc atcacttata caacaatatg gcccgtttgt 4200

tgaactactc tttaataaaa taatttttcc gttcccaatt ccacattgca ataatagaaa 4260

atccatcttc atcggctttt tcgtcatcat ctgtatgaat caaatcgcct tcttctgtgt 4320

catcaaggtt taatttttta tgtatttctt ttaacaaacc accataggag attaaccttt 4380

tacggtgtaa accttcctcc aaatcagaca aacgtttcaa attcttttct tcatcatcgg 4440

tcataaaatc cgtatccttt acaggatatt ttgcagtttc gtcaattgcc gattgtatat 4500

ccgatttata tttatttttc ggtcgaatca tttgaacttt tacatttgga tcatagtcta 4560

atttcattgc ctttttccaa aattgaatcc attgtttttg attcacgtag ttttctgtat 4620

tcttaaaata agttggttcc acacatacca atacatgcat gtgctgatta taagaattat 4680

ctttattatt tattgtcact tccgttgcac gcataaaacc aacaagattt ttattaattt 4740

ttttatattg catcattcgg cgaaatcctt gagccatatc tgacaaactc ttatttaatt 4800

cttcgccatc ataaacattt ttaactgtta atgtgagaaa caaccaacga actgttggct 4860

tttgtttaat aacttcagca acaacctttt gtgactgaat gccatgtttc attgctctcc 4920

tccagttgca cattggacaa agcctggatt tacaaaacca cactcgatac aactttcttt 4980

cgcctgtttc acgattttgt ttatactcta atatttcagc acaatctttt actctttcag 5040

cctttttaaa ttcaagaata tgcagaagtt caaagtaatc aacattagcg attttctttt 5100

ctctccatgg tctcactttt ccactttttg tcttgtccac taaaaccctt gatttttcat 5160

ctgaataaat gctactatta ggacacataa tattaaaaga aacccccatc tatttagtta 5220

tttgtttggt cacttataac tttaacagat ggggtttttc tgtgcaacca attttaaggg 5280

ttttcaatac tttaaaacac atacatacca acacttcaac gcacctttca gcaactaaaa 5340

taaaaatgac gttatttcta tatgtatcaa gataagaaag aacaagttca aaaccatcaa 5400

aaaaagacac cttttcaggt gcttttttta ttttataaac tcattccctg atctcgactt 5460

cgttcttttt ttacctctcg gttatgagtt agttcaaatt cgttcttttt aggttctaaa 5520

tcgtgttttt cttggaattg tgctgtttta tcctttacct tgtctacaaa ccccttaaaa 5580

acgtttttaa aggcttttaa gccgtctgta cgttccttaa gatcaacgtg atataggttt 5640

gctaaccttt gcgttcactt aactaactta taggggtaac acttaaaaaa gaatcaataa 5700

cgatagaaac cgctcctaaa gcaggtgcat tttttcctaa cgaagaaggc aatagttcac 5760

atttattgtc taaatgagaa tggactctag aagaaacttc gtttttaatc gtatttaaaa 5820

caatgggatg agattcaatt atatgatttc tcaagataac agcttctata tcaaatgtat 5880

taaggatatt ggttaatcca attccgatat aaaagccaaa gttttgaagt gcatttaaca 5940

tttctacatc atttttattt gcgcgttcca caatctcttt tcgagaaata ttcttttctt 6000

ctttagagag cgaagccagt aacgcttttt cagaagcata taattcccaa cagcctcgat 6060

ttccacagct gcatttgggt ccattaaaat ctatcgtcat atgacccatt tccccagaaa 6120

aaccctgaac acctttatac aattcgttgt taataacaag tccagttcca attccgatat 6180

taatactgat gtaaacgatg ttttcatagt tttttgtcat accaaatact ttttcaccgt 6240

atgctcctgc attagcttca ttttcaacaa aaaccggaac attaaactca ctctcaatta 6300

aaaactgcaa atctttgata ttccaattta agttaggcat gaaaataatt tgctgatgac 6360

gatctacaag gcctggaaca caaattccta ttccgactag accataaggg gactcaggca 6420

tatgggttac aaaaccatga ataagtgcaa ataaaatctc ttttacttca ctagcggaag 6480

aactagacaa gtcagaagtc ttctcgagaa taatatttcc ttctaagtcg gttag 6535

Claims (9)

1.一种生物传感器，其特征在于，含有启动子P _rapH 、P _hbs ，NanR基因、NanR基因结合位点和编码标记物的基因；所述启动子P _rapH 、P _hbs 、NanR基因和NanR基因结合位点位于同一载体上，构成所述生物传感器；所述P _rapH 调控NanR的表达；所述P _hbs 上整合调控NanR基因结合位点的序列，并调控编码标记物的基因表达；所述启动子P _rapH 和启动子P _hbs 转录方向相反；编码所述启动子P _rapH 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述启动子P _hbs 的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；编码所述NanR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述NanR基因结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述载体包括pHT系列质粒。

3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于，所述标记物为荧光蛋白。

4.含有权利要求1~3任一所述生物传感器的基因工程菌。

5.一种积累N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，含有权利要求1~3任一所述的生物传感器，并表达念珠藻来源的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶和大肠杆菌来源的N-乙酰神经氨酸合酶。

6.一种构建权利要求1~3任一所述生物传感器的方法，其特征在于，将编码如SEQ IDNO.3所示NanR基因的核苷酸序列、如SEQ ID NO.1所示的编码启动子P _rapH 的核苷酸序列和编码如SEQ ID NO.2所示启动子P _hbs 的核苷酸序列依次连接在载体pHT01上。

7.一种筛选产N-乙酰神经氨酸菌株的方法，其特征在于，以荧光蛋白为标记物，将SEQID NO.5所示的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因和SEQ ID NO.6所示的N-乙酰神经氨酸合酶编码基因构建到质粒pSTOP 1622中，转化至含有权利要求1~3任一所述生物传感器的枯草芽孢杆菌中，培养菌体细胞，检测荧光蛋白表达量，表达量高的菌株即为目的菌株。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养是在35-38 ^oC、180-220 rpm下培养10 -20h后，以10%-20%的接种量转接至发酵培养基，于35-38 ^oC、180-220 rpm条件下发酵30-50 h。

9.权利要求1~3任一所述的生物传感器在筛选产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌中的应用。

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