JP3688118B2 - 遺伝子トラップ用ベクターと、このベクターを用いた遺伝子トラップ方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、キイロショウジョウバエ（ドロソフィラ・メラノガステル：Drosophilamelamogaster）の新規遺伝子のクローニングおよび機能分析を容易にする新規ベクター系、およびこのベクター系による遺伝子トラッピングに関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
トウモロコシやマウスを含む広範な生物体において、遺伝子トラッピングの応用例が数多く存在する（Gossler et al. Science, 244:463-465, 1989 ）。
遺伝子トラッピングのための道具としては、トラップされた遺伝子のクローニングおよび分析を目的として種々の型のエンハンサートラップＰエレメントベクター（Wilson et al., Genes & Development, 3:1301-1313, 1989 ）の応用、並びにＧal４／ＵＡＳ転写アクティベーター系の協力下でのモザイク解析に関するその使用が効果的であることが証明されている。しかしながら、ベクターコンストラクトまたは他のレポーター遺伝子の発現パターンが１種以上の遺伝子に属するエンハンサーにより影響を受ける場合がある。また、エンハンサートラップの挿入により１種以上の隣接遺伝子が機能発現するかどうかを決定することが困難な場合もある。
【０００３】
これらの事情と、その最も近いエクソンが挿入部位から３０ｋＢ以上離れて位置している遺伝子の発現変化が変異表現型の原因となる場合があるという事実とが一緒になって、影響を受けた遺伝子をクローンし分析することが困難になることがありうる。
この出願の１つの目的は、特別にデザインした人工の調節配列を含むベクター系、および陽性の組換え体系統を容易にスクリーニングするための選択方法を提供することである。より詳しくは、この出願は、広く使用されているエンハンサートラップＰエレメントベクターに比較して、影響を受けた遺伝子を更に容易にかつ迅速にクローニングすることのでききるベクター系を提供することを目的としている。この出願の別の目的は、エンハンサートラップ系統を用いる多くの場合とは異なり、この発明のベクター系は、レポーター遺伝子の発現が単一の内因性転写ユニットによってのみ影響され、かつその遺伝子自体の発現のみを生み出すという理由から、得られたトラップ現象を容易に検出し、しかもレポーター遺伝子のより特徴的な（「機能的な」）発現パターンを極めて高い確率で得ることのできる方法を提供することである。
【０００４】
【発明の開示】
この出願の第１の発明は、以下のヌクレオチド配列：
人工の共通スプライシング受容部位、
合成ストップ／スタート配列、
レポーター遺伝子、
薬剤耐性遺伝子、
キイロショウジョウバエの検出可能な表現型の遺伝子、および
合成スプライシング供与部位
をこの順序で有する組換え体プラスミドであるキイロショウジョウバエの未知遺伝子トラップ用ベクターである。
【０００５】
この第１発明の１つの実施態様は、組換え体プラスミドとして、pCasper3に由来するプラスミドを用いることである。
第１発明の他の実施態様は、レポーター遺伝をＧal４遺伝子、Ｇal４ＤＮＡ結合領域−ｐ５３融合遺伝子、またはＧal４−ほたるルシフェラーゼ融合遺伝子とすることである。
【０００６】
この第１発明の別の実施態様は、キイロショウジョウバエにおける検出可能な表現型の遺伝子をミニ白眼遺伝子とすることである。
第１発明のさらに他の実施態様は、薬剤耐性遺伝子をネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子とし、そのプロモーターをヒートショックプロモーターとすることである。
【０００７】
この出願の第２の発明は、以下のヌクレオチド配列：
人工の共通スプライシング受容部位、
合成ストップ／スタート配列、
レポーター遺伝子、
薬剤耐性遺伝子、
キイロショウジョウバエの検出可能な表現型の遺伝子、および
合成スプライシング供与部位
をこの順序で有する組換え体プラスミドであるベクターを使用する方法であって、以下のステップ：
（ａ）白眼遺伝子を持たないハエのゲノムに前記ベクターを挿入し、
（ｂ）薬剤耐性である１次形質転換体を選択し、
（ｃ）１次形質転換体を転移酵素発現系統と交配させてベクターを他の位置に転移させ、
（ｄ）眼の色が濃いハエを採集することにより２次形質転換体を選択し、
（ｅ）２次形質転換体をＵＡＳ（上流活性化配列）−ルシフェラーゼ含有系統と交配し、産出したハエにおけるレポーター遺伝子の発現を測定し、
（ｆ）トラップされた遺伝子をクローニングにより同定し、レポーター遺伝子およびハエの検出可能な表現型の遺伝子に融合したｃＤＮＡ群の配列を決定する、
ことからなるキイロショウジョウバエ未知遺伝子のトラップ方法である。
【０００８】
この出願の第３の発明は、以下のヌクレオチド配列：
人工の共通スプライシング受容部位、
合成ストップ／スタート配列、
レポーター遺伝子としてのＧal４ＤＮＡ結合領域−ｐ５３融合遺伝子、
薬剤耐性遺伝子、
キイロショウジョウバエの検出可能な表現型の遺伝子、および
合成スプライシング供与部位
をこの順序で有する組換え体プラスミドであるベクターＡ、およびpCasperhs のポリクローニング部位内にヒートショックプロモーターと結合したＧal４活性化領域−ラージＴ抗原融合遺伝子を有するpCasperhs 由来ベクターＢを使用する方法であって、
（ａ）白眼遺伝子を持たない別個のハエのゲノムにベクターＡおよびベクターＢをそれぞれ挿入し、
（ｂ）薬剤耐性であるベクターＡの１次形質転換体を選択し、眼の色をもつベクターＢの１次形質転換体を選択し、
（ｃ）ベクターＡの１次形質転換体を転移酵素発現系統と交配してベクターを他の位置に転移させ、
（ｄ）眼の色が濃いハエを採集することによりベクターＡの２次形質転換体を選択し、
（ｅ）この２次形質転換体をベクターＢの１次形質転換体と交配してベクターＡとベクターＢの両者を有するハエを産出させ、
（ｆ）ステップ（ｅ）で得たハエをＵＡＳ−ルシフェラーゼ含有系統と交配して、その結果産出したハエにおけるレポーター遺伝子の発現を測定し、
（ｇ）トラップされた遺伝子をクローニングにより同定し、レポーター遺伝子およびハエの検出可能な表現型の遺伝子と融合したｃＤＮＡ群の配列を決定する、ことからなるキイロショウジョウバエの未知遺伝子のトラップ方法である。
【０００９】
第２および第３発明の実施態様は第１発明の実施態様に対応するものであり、これらについては以下の記載でさらに詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この発明のベクター構築体は、例えば、一般的に使用されるＰエレメント形質転換ベクターであるpCasper3（Pirotta, Vectors: A survey of mlecular cloning vectors and their uses, eds. Rodriguez, R.L. & Denhardt, D.T., Butterworths, Boston. 437-456, 1998 ）および簡便なＧal４−ＵＡＳ発現系（Brand and Perrimon, Development, 118:401-415, 1993）に基づいて構築することができる。
【００１１】
すなわち、プロモーターのないＧal４遺伝子がpCasper3のポリクローニング部位に挿入した。このＧal４遺伝子の上流には人工の共通スプライシング受容部位および合成ストップ／スタート配列が配置されており、トラップされた遺伝子上流のエキソン（群）から始まりＧａｌ４の適切なリーディングフレームに至る翻訳を支配している。
【００１２】
ミニ白眼遺伝子は、その３’ＵＴＲ（非翻訳領域）全部を除去し、人工のスプライシング供与部位を置き換えることのよって、それ自身のポリアデニル化部位をもたない断片化遺伝子とした。
遺伝子トラップ現象が生じない場合には、この断片化ミニ白眼遺伝子は目の色を付与しないと考えられる。そこで、この発明では、抗生物質による１次形質転換体の選択を補助するためにヒートショックプロモーターを結合したネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ（ｈｓ−ｎｅｏ）遺伝子を挿入した。
【００１３】
図１はジーントラップ構築体（pTrap-hsne）の概略地図であり、配列番号１はpTrap-hsneベクターの全ヌクレオチド配列である。
別のジーントラップ構築体であるpTrap-G4-p53（図２）は、プラスミドpTrap-hsneのＧal４コード化配列をＧal４ＤＮＡ結合領域−ｐ５３融合遺伝子（Clontech社製、Matchmaker Two Hybrid System, #K1605-1）で置き換えることにより作り出した。この構築体が、ヒートショックプロモーターを結合したＧal４活性化領域−ラージＴ抗原を含有する別のベクターpCasperhs-G4-LT （図３）と同じハエのゲノム中に共存すると、機能性Ｇal４分子のアセンブリーは、ｐ５３−ラージＴ抗原相互作用を通じて、外部からのヒートショックにより調節することができる。
【００１４】
このようにして、Ｇal４活性の意図的な時間的制御が可能になる。換言すると、トラップされた遺伝子のプロモーターによって空間的に決定されているパターンでのＧal４の発現を、いまや外部ヒートショックにより任意の段階で誘導することが可能となる。
Ｇal４発現の検出を容易にするために、別の構築体においては、Ｇal４遺伝子をＧal４−ほたるルシフェラーゼ融合遺伝子に置き換えてpTrap-G4-luc（図４）を得た。この人工遺伝子は、両酵素活性が保存された融合ポリペプチドをコード化している。
【００１５】
ルシフェラーゼ活性の測定はルミノアッセイにより容易に行うことができるため（Brandes et al., Neuron, 16:687-694, 1996）、個々の生きたハエにおけるＧal４を容易に検出することができる。
次に、このベクター系を用いる遺伝子トラップ法である第２および第３発明の最良の形態を詳細に説明する。
（１）スクリーニング：
ジーントラップ構築体は、顕微注入により白眼遺伝子を持たないハエのゲノムに導入することができる。１次形質転換体の選択は、ｈｓ−ｎｅｏ遺伝子により付与されたネオマイシン類似体Ｇ４１８耐性を使用して行うことが可能である。（ただし、これらの構築体を用いて形質転換実験を実施する場合、断片化ミニ白眼遺伝子は、一般に、ほとんどの場合ｗ−表現型と区別できる極めて僅かに黄色の眼を生じることになるので、Ｇ４１８による選択は不必要となる。）
ジーントラップ構築体を有する系統の樹立後、デルタ２−３遺伝因子を発現する転移酵素を含有するジャンプスターター呼ばれる系統と交配することにより、通常の方法で２次形質転換体を作成することができる。
【００１６】
通常、２次形質転換体の４から８パーセントは、祖先のハエに比較して極めて濃い目の色（濃橙色または赤色）をしている。このことは、構築体がプロモーターの下流に挿入され、ミニ白眼遺伝子が、除去された遺伝子の代わりにその遺伝子の転写「促進要素」（例えばポリアデニル化部位および転写ターミネーター）を使用していることを示している。これらは、遺伝子トラップ現象の最も有望な候補である可能性が極めて高い。これらの系統の場合、ベクターはおそらく遺伝子のイントロン内かまたは最初のイントロンの上流へ、適切な配向（すなわち転写方向が「トラップされた遺伝子」と、またミニ白眼遺伝子（およびＧal４）とも同じ）で５’ＵＴＲ内に挿入されている。ミニ白眼遺伝子はそれ自身のプロモーターをもち、それゆえその発現パターンはトラップされた遺伝子のそれと全く異なると思われる。
【００１７】
これらの陽性系統は、次の段階で、ＵＡＳ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築体を保有する「マーカー」系統と交配することにより検査される。（pTrap-G4-lucベクターを使用する場合、この段階は不必要である。）通常、極めて強い相関性が、目の色とＧal４発現の間に見られる：目の色が濃い系統の９０％以上が、ルミノメーターを用いるルシフェラーゼアッセイでＧal４を発現していることが証明されている（Brandes et al., Neuron, 16:687-692, 1996）。
（２）クローニング：
ジーントラップ構築体を内在性遺伝子のイントロン内に挿入する場合、構築体のマーカー遺伝子は、人工のスプライシング受容および付与部位を使用してｍＲＮＡレベルでスプライシングされ、トラップされた遺伝子のエキソンになると思われる。さらに正確に述べると、Ｇal４のｍＲＮＡは挿入部位の上流に位置するエキソン（群）に連結されるはずであるが、同時にミニ白眼遺伝子のｍＲＮＡが続くエキソン（群）に融合してトラップされた遺伝子の２重標的化を達成している（図５）。
【００１８】
この特徴は、３’および５’ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends：ｃＤＮＡ末端の急速増幅）法により、トラップされた遺伝子を迅速かつ容易に同定するのに使用することができる。捕獲したｍＲＮＡの一部分のみのクローニングおよび配列決定でさえも、ＢＤＧＰ（Berkeley Drosophia Gemone Project ）ＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）ライブラリー中から高い確率で相同的なｍＲＮＡを見出すことが可能である。
【００１９】
すでにクローニングされている遺伝子の同定は、同様のエンハンサートラップ構築体により作り出された突然変異を分析する際には通常は平均して１年以上の期間を要するのに対して、この発明の方法の場合には１週間未満で遺伝子の同定が可能となる場合もある。
Ｐエレメントベクターは、活性遺伝子の５’ＵＴＲまたは近傍に組み込まれる傾向があることが文献上周知であり、またこの発明者も経験した。（この発明者は、これらの場合に、もしベクターが最初のイントロンの上流に挿入され、それ故人工のスプライシング受容部位が使用できないならば、Ｇal４遺伝子は近くのプロモーターから読み通し転写により発現されることを見出している。）
この傾向の利点は、逆転写ＰＣＲもしくはvectoretteＰＣＲによって、または適当な制限消化によって構築体のネオマイシン耐性遺伝子を回収するプラスミドレスキューによって、挿入部位のフランキングゲノム配列のクローニングと配列決定により利用することができる。この場合もＢＤＧＰライブラリーを検索して意味のある一致があるかどうかを調べることができる。
（３）レスキュー：
観察された突然変異の表現型が実際にＰエレメント挿入の結果起こったことを確認するただ一つの信頼できる方法は、特定の表現型をレスキューすることである。予期されることは、表現型（野生型のハエとの何かの差異）がＰエレメントの挿入により散布された遺伝子（群）の発現変化によって起こったということである。レスキューは、疑いのある遺伝子のｃＤＮＡを、その遺伝子自身と同じ空間的および時間的パターンで最も好ましく発現することによりなされる。
【００２０】
予期されたように、第１発明のベクター構築体は通常、強い表現型を引き起こす。トラップされた遺伝子はｍＲＮＡレベルで２個の部分に分離し、多くの場合無効変異をもたらすと思われるので、これは全く意外ではない。したがって、この方法で得た突然変異はしばしばホモ接合性の致死性または不稔性を示す。低次形態の突然変異は、遺伝子トラップＰエレメント構築体の不正確な切除により得ることができる。
【００２１】
上記のように、Ｇal４の発現は、単にＧal４遺伝子がそれ自身のプロモーターをもたず共通の融合ｍＲＮＡを共有するという理由から、トラップされた遺伝子のそれを正確に反映せざるを得ない。
この同一発現は、トラップされた遺伝子のＵＡＳ結合クローンｃＤＮＡを保有する別のハエとこのハエとを交配することにより、突然変異の表現型をレスキューすることを可能とする。
【００２２】
このようにして、元のホモ接合性無効変異遺伝子をトラップしたハエ、または無効変異アレル上にある種の低次形態アレルをもったハエのトランスヘテロ接合体をレスキューすることができる。
（４）トラップされた遺伝子の空間的および発生的発現パターンの測定：
トラップされた遺伝子の空間的および時間的に制御された発現の組織化学的測定もまた、同じハエのゲノムにＵＡＳ−ｌａｃＺ構築体を導入し、ベーターガラクトシダーゼに対するＸ−ｇａｌまたは抗体染色を実施することにより、容易に行うことができる。
（５）モザイク分析：
種々の、特徴的な、そしてpTrap-G4-p53/pCasperhs-G4-TLベクター系の場合には誘導可能なＧal４発現パターンを持つような、ハエ系統の膨大なコレクションを保有することは、種々のＧal４発現パターンをもった突然変異のバックグラウンド上にそれらのＵＡＳ構築体を発現させることにより、対象となる全ての遺伝子のモザイク分析を実行可能にする。
【００２３】
この方法は、どこでいつ、特定遺伝子の発現が突然変異表現型のレスキューのために必要とされるかという問題に回答を与えるものである。
同様に、任意の遺伝子を種々の異所性パターンで発現させて新規な優生表現型を生じさせることができる。この方法は、その特定遺伝子の役割を決定し、それが関与する経路を同定する助けとなるかもしれない。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例は、この発明の種々の特徴に関する具体的実施態様を説明するものである。この実施例は、いかなる意味でもこの発明の限定を意図するものではない。
図６は、aop-Ｇal４およびm-white-aop 融合ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定結果を示す。
【００２５】
鋳型は、公知のａｏｐ（anterior open/pokkuri/yan ）発生遺伝子の最初のイントロン中に組み込んだベクターpTrap-hsneo を有する陽性遺伝子トラップ系統から調製した全ＲＮＡを用いた。この配列から、両方のスプライシングが正確に、予期された場所である人工調節配列の特定のヌクレオチドで生じたことが確認された。
【００２６】
図７では、陽性遺伝子トラップ系統とＵＡＳ−ｌａｃＺ構築体を含有するハエとを交配して得たハエの脳の種々の部分における特徴的なベ−タ−ガラクトシダーゼ染色パターン像を示す。
【００２７】
【発明の効果】
この発明のベクター系は、観察された表現型の原因となる遺伝子を容易かつ迅速にクローニングすることを可能とする。さらに、関心がある任意の遺伝子のＵＡＳ由来のコード配列を使用することにより、その特定の遺伝子を、トラップされた遺伝子と同一のパターンで発現させることができ、これらの発現は希望する任意の発生段階に時間的に調節することができる。
【００２８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１１２０６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：環状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：
CATGATGAAA TAACATAAGG TGGTCCCGTC GGCAAGAGAC ATCCACTTAA CGTATGCTTG 60
CAATAAGTGC GAGTGAAAGG AATAGTATTC TGAGTGTCGT ATTGAGTCTG AGTGAGACAG 120
CGATATGATT GTTGATTAAC CCTTAGCATG TCCGTGGGGT TTGAATTAAC TCATAATATT 180
AATTAGACGA AATTATTTTT AAAGTTTTAT TTTTAATAAT TTGCGAGTAC GCAAAGCTCT 240
TTCTCTTACA GGTCGAATTG ATGTGATGGA TCCAATGAAG CTACTGTCTT CTATCGAACA 300
AGCATGCGAT ATTTGCCGAC TTAAAAAGCT CAAGTGCTCC AAAGAAAAAC CGAAGTGCGC 360
CAAGTGTCTG AAGAACAACT GGGAGTGTCG CTACTCTCCC AAAACCAAAA GGTCTCCGCT 420
GACTAGGGCA CATCTGACAG AAGTGGAATC AAGGCTAGAA AGACTGGAAC AGCTATTTCT 480
ACTGATTTTT CCTCGAGAAG ACCTTGACAT GATTTTGAAA ATGGATTCTT TACAGGATAT 540
AAAAGCATTG TTAACAGGAT TATTTGTACA AGATAATGTG AATAAAGATG CCGTCACAGA 600
TAGATTGGCT TCAGTGGAGA CTGATATGCC TCTAACATTG AGACAGCATA GAATAAGTGC 660
GACATCATCA TCGGAAGAGA GTAGTAACAA AGGTCAAAGA CAGTTGACTG TATCGATTGA 720
CTCGGCAGCT CATCATGATA ACTCCACAAT TCCGTTGGAT TTTATGCCCA GGGATGCTCT 780
TCATGGATTT GATTGGTCTG AAGAGGATGA CATGTCGGAT GGCTTGCCCT TCCTGAAAAC 840
GGACCCCAAC AATAATGGGT TCTTTGGCGA CGGTTCTCTC TTATGTATTC TTCGATCTAT 900
TGGCTTTAAA CCGGAAAATT ACACGAACTC TAACGTTAAC AGGCTCCCGA CCATGATTAC 960
GGATAGATAC ACGTTGGCTT CTAGATCCAC AACATCCCGT TTACTTCAAA GTTATCTCAA 1020
TAATTTTCAC CCCTACTGCC CTATCGTGCA CTCACCGACG CTAATGATGT TGTATAATAA 1080
CCAGATTGAA ATCGCGTCGA AGGATCAATG GCAAATCCTT TTTAACTGCA TATTAGCCAT 1140
TGGAGCCTGG TGTATAGAGG GGGAATCTAC TGATATAGAT GTTTTTTACT ATCAAAATGC 1200
TAAATCTCAT TTGACGAGCA AGGTCTTCGA GTCAGGTTCC ATAATTTTGG TGACAGCCCT 1260
ACATCTTCTG TCGCGATATA CACAGTGGAG GCAGAAAACA AATACTAGCT ATAATTTTCA 1320
CAGCTTTTCC ATAAGAATGG CCATATCATT GGGCTTGAAT AGGGACCTCC CCTCGTCCTT 1380
CAGTGATAGC AGCATTCTGG AACAAAGACG CCGAATTTGG TGGTCTGTCT ACTCTTGGGA 1440
GATCCAATTG TCCCTGCTTT ATGGTCGATC CATCCAGCTT TCTCAGAATA CAATCTCCTT 1500
CCCTTCTTCT GTCGACGATG TGCAGCGTAC CACAACAGGT CCCACCATAT ATCATGGCAT 1560
CATTGAAACA GCAAGGCTCT TACAAGTTTT CACAAAAATC TATGAACTAG ACAAAACAGT 1620
AACTGCAGAA AAAAGTCCTA TATGTGCAAA AAAATGCTTG ATGATTTGTA ATGAGATTGA 1680
GGAGGTTTCG AGACAGGCAC CAAAGTTTTT ACAAATGGAT ATTTCCACCA CCGCTCTAAC 1740
CAATTTGTTG AAGGAACACC CTTGGCTATC CTTTACAAGA TTCGAACTGA AGTGGAAACA 1800
GTTGTCTCTT ATCATTTATG TATTAAGAGA TTTTTTCACT AATTTTACCC AGAAAAAGTC 1860
ACAACTAGAA CAGGATCAAA ATGATCATCA AAGTTATGAA GTTAAACGAT GCTCCATCAT 1920
GTTAAGCGAT GCAGCACAAA GAACTGTTAT GTCTGTAAGT AGCTATATGG ACAATCATAA 1980
TGTCACCCCA TATTTTGCCT GGAATTGTTC TTATTACTTG TTCAATGCAG TCCTAGTACC 2040
CATAAAGACT CTACTCTCAA ACTCAAAATC GAATGCTGAG AATAACGAGA CCGCACAATT 2100
ATTACAACAA ATTAACACTG TTCTGATGCT ATTAAAAAAA CTGGCCACTT TTAAAATCCA 2160
GACTTGTGAA AAATACATTC AAGTACTGGA AGAGGTATGT GCGCCGTTTC TGTTATCACA 2220
GTGTGCAATC CCATTACCGC ATATCAGTTA TAACAATAGT AATGGTAGCG CCATTAAAAA 2280
TATTGTCGGT TCTGCAACTA TCGCCCAATA CCCTACTCTT CCGGAGGAAA ATGTCAACAA 2340
TATCAGTGTT AAATATGTTT CTCCTGGCTC AGTAGGGCCT TCACCTGTGC CATTGAAATC 2400
AGGAGCAAGT TTCAGTGATC TAGTCAAGCT GTTATCTAAC CGTCCACCCT CTCGTAACTC 2460
TCCAGTGACA ATACCAAGAA GCACACCTTC GCATCGCTCA GTCACGCCTT TTCTAGGGCA 2520
ACAGCAACAG CTGCAATCAT TAGTGCCACT GACCCCGTCT GCTTTGTTTG GTGGCGCCAA 2580
TTTTAATCAA AGTGGGAATA TTGCTGATAG CTCATTGTCC TTCACTTTCA CTAACAGTAG 2640
CAACGGTCCG AACCTCATAA CAACTCAAAC AAATTCTCAA GCGCTTTCAC AACCAATTGC 2700
CTCCTCTAAC GTTCATGATA ACTTCATGAA TAATGAAATC ACGGCTAGTA AAATTGATGA 2760
TGGTAATAAT TCAAAACCAC TGTCACCTGG TTGGACGGAC CAAACTGCGT ATAACGCGTT 2820
TGGAATCACT ACAGGGATGT TTAATACCAC TACAATGGAT GATGTATATA ACTATCTATT 2880
CGATGATGAA GATACCCCAC CAAACCCAAA AAAAGAGTAA AATGAATCGT AGATACTGAA 2940
AAACCCCGCA AGTTCACTTC AACTGTGCAT CGTGCACCAT CTCAATTTCT TTCATTTATA 3000
CATCGTTTTG CCTTCTTTTA TGTAACTATA CTCCTCTAAG TTTCAATCTT GGCCATGTAA 3060
CCTCTGATCT ATAGAATTTT TTAAATGACT AGAATTAATG CCCATCTTTT TTTTGGACCT 3120
AAATTCTTCA TGAAAATATA TTACGAGGGC TTATTCAGAA GCTTATCGAT ACCGTCGACT 3180
AAAGCCAAAT AGAAATTATT CAGTTCTGGC TTAAGTTTTT AAAAGTGATA TTATTTATTT 3240
GGTTGTAACC AACCAAAAGA ATGTAAATAA CTAATACATA ATTATGTTAG TTTTAAGTTA 3300
GCAACAAATT GATTTTAGCT ATATTAGCTA CTTGGTTAAT AAATAGAATA TATTTATTTA 3360
AAGATAATTC GTTTTTATTG TCAGGGAGTG AGTTTGCTTA AAAACTCGTT TAGATCCACT 3420
AGAAGGACCG CGGCTCCTCG ACCGGATCGA AAGGAGGGCG AAGAACTCCA GCATGAGATC 3480
CCCGCGCTGG AGGATCATCC AGCCGGCGTC CCGGAAAACG ATTCCGAAGC CCAACCTTTC 3540
ATAGAAGGCG GCGGTGGAAT CGAAATCTCG TGATGGCAGG TTGGGCGTCG CTTGGTCGGT 3600
CATTTCGAAC CCCAGAGTCC CGCTCAGAAG AACTCGTCAA GAAGGCGATA GAAGGCGATG 3660
CGCTGCGAAT CGGGAGCGGC GATACCGTAA AGCACGAGGA AGCGGTCAGC CCATTCGCCG 3720
CCAAGCTCTT CAGCAATATC ACGGGTAGCC AACGCTATGT CCTGATAGCG GTCCGCCACA 3780
CCCAGCCGGC CACAGTCGAT GAATCCAGAA AAGCGGCCAT TTTCCACCAT GATATTCGGC 3840
AAGCAGGCAT CGCCATGGGT CACGACGAGA TCCTCGCCGT CGGGCATGCG CGCCTTGAGC 3900
CTGGCGAACA GTTCGGCTGG CGCGAGCCCC TGATGCTCTT CGTCCAGATC ATCCTGATCG 3960
ACAAGACCGG CTTCCATCCG AGTACGTGCT CGCTCGATGC GATGTTTCGC TTGGTGGTCG 4020
AATGGGCAGG TAGCCGGATC AAGCGTATGC AGCCGCCGCA TTGCATCAGC CATGATGGAT 4080
ACTTTCTCGG CAGGAGCAAG GTGAGATGAC AGGAGATCCT GCCCCGGCAC TTCGCCCAAT 4140
AGCAGCCAGT CCCTTCCCGC TTCAGTGACA ACGTCGAGCA CAGCTGCGCA AGGAACGCCC 4200
GTCGTGGCCA GCCACGATAG CCGCGCTGCC TCGTCCTGCA GTTCATTCAG GGCACCGGAC 4260
AGGTCGGTCT TGACAAAAAG AACCGGGCGC CCCTGCGCTG ACAGCCGGAA CACGGCGGCA 4320
TCAGAGCAGC CGATTGTCTG TTGTGCCCAG TCATAGCCGA ATAGCCTCTC CACCCAAGCG 4380
GCCGGAGAAC CTGCGTGCAA TCCATCTTGT TCAATCATGC GAAACGATCC TCATCCTGTC 4440
TCTTGATCAG ATCCCCTATT CAGAGTTCTC TTCTTGTATT CAATAATTAC TTCTTGGCAG 4500
ATTTCAGTAG TTGCAGTTGA TTTACTTGGT TGCTGGTTAC TTTTAATTGA TTCACTTTAA 4560
CTTGCACTTT ACTGCAGATT GTTTAGCTTG TTCAGCTGCG CTTGTTTATT TGCTTAGCTT 4620
TCGCTTAGCG ACGTGTTCAC TTTGCTTGTT TGAATTGAAT TGTCGCTCCG TAGACGAAGC 4680
GCCTCTATTT ATACTCCGGC GCTCTTTTCG CGAACATTCG AGGCGCGCTC TCTCGAACCA 4740
ACGAGAGCAG TATGCCGTTT ACTGTGTGAC AGAGTGAGAG AGCATTAGTG CAGAGAGGGA 4800
GAGACCCAAA AAGAAAAGAG AGAATAACGA ATAACGGCCA GAGAAATTTC TCGAGTTTTC 4860
TTTCTGCCAA ACAAATGACC TACCACAATA ACCAGTTTGT TTTGGGATCT AGTCCCTAAT 4920
TCTAGTATGT ATGTAAGTTA ATAAAACCCT TTTTTGGAGA ATGTAGATTT AAAAAAACAT 4980
ATTTTTTTTT TATTTTTTAC TGCACTGGAC ATCATTGAAC TTATCTGATC AGTTTTAAAT 5040
TTACTTCGAT CCAAGGGTAT TTGAAGTACC AGGTTCTTTC GATTACCTCT CACTCAAAAT 5100
GACATTCCAC TCAAAGTCAG CGCTGTTTGC CTCCTTCTCT GTCCACAGAA ATATCGCCGT 5160
CTCTTTCGCC GCTGCGTCCG CTATCTCTTT CGCCACCGTT TGTAGCGTTA CCTAGCGTCA 5220
ATGTCCGCCT TCAGTTGCAC TTTGTCAGCG GTTTCGTGAC GAAGCTCCAA GCGGTTTACG 5280
CCATCAATTA AACACAAAGT GCTGTGCCAA AACTCCTCTC GCTTCTTATT TTTGTTTGTT 5340
TTTTGAGTGA TTGGGGTGGT GATTGGTTTT GGGTGGGTAA GCAGGGGAAA GTGTGAAAAA 5400
TCCCGGCAAT GGGCCAAGAG GATCAGGAGC TATTAATTCG CGGAGGCAGC AAACACCCAT 5460
CTGCCGAGCA TCTGAACAAT GTGAGTAGTA CATGTGCATA CATCTTAAGT TCACTTGATC 5520
TATAGGAACT GCGATTGCAA CATCAAATTG TCTGCGGCGT GAGAACTGCG ACCCACAAAA 5580
ATCCCAAACC GCAATCGCAC AAACAAATAG TGACACGAAA CAGATTATTC TGGTAGCTGT 5640
GCTCGCTATA TAAGACAATT TTTAAGATCA TATCATGATC AAGACATCTA AAGGCATTCA 5700
TTTTCGACTA CATTCTTTTT TACAAAAAAT ATAACAACCA GATATTTTAA GCTGATCCTA 5760
GATGCACAAA AAATAAATAA AAGTATAAAC CTACTTCGTA GGATACTTCG TTTTGTTCGG 5820
GGTTAGATGA GCATAACGCT TGTAGTTGAT ATTTGAGATC CCCTATCATT GCAGGGTGAC 5880
AGCGGACGCT TCGCAGAGCT GCATTAACCA GGGCTTCGGG CAGGCCAAAA ACTACGGCAC 5940
GCTCCTGCCA CCCAGTCCGC CGGAGGACTC CGGTTCAGGG AGCGGCCAAC TAGCCGAGAA 6000
CCTCACCTAT GCCTGGCACA ATATGGACAT CTTTGGGGCG GTCAATCAGC CGGGCTCCGG 6060
ATGGCGGCAG CTGGTCAACC GGACACGCGG ACTATTCTGC AACGAGCGAC ACATACCGGC 6120
GCCCAGGAAA CATTTGCTCA AGAACGGTGA GTTTCTATTC GCAGTCGGCT GATCTGTGTG 6180
AAATCTTAAT AAAGGGTCCA ATTACCAATT TGAAACTCAG TTTGCGGCGT GGCCTATCCG 6240
GGCGAACTTT TGGCCGTGAT GGGCAGTTCC GGTGCCGGAA AGACGACCCT GCTGAATGCC 6300
CTTGCCTTTC GATCGCCGCA GGGCATCCAA GTATCGCCAT CCGGGATGCG ACTGCTCAAT 6360
GGCCAACCTG TGGACGCCAA GGAGATGCAG GCCAGGTGCG CCTATGTCCA GCAGGATGAC 6420
CTCTTTATCG GCTCCCTAAC GGCCAGGGAA CACCTGATTT TCCAGGCCAT GGTGCGGATG 6480
CCACGACATC TGACCTATCG GCAGCGAGTG GCCCGCGTGG ATCAGGTGAT CCAGGAGCTT 6540
TCGCTCAGCA AATGTCAGCA CACGATCATC GGTGTGCCCG GCAGGGTGAA AGGTCTGTCC 6600
GGCGGAGAAA GGAAGCGTCT GGCATTCGCC TCCGAGGCAC TAACCGATCC GCCGCTTCTG 6660
ATCTGCGATG AGCCCACCTC CGGACTGGAC TCATTTACCG CCCACAGCGT CGTCCAGGTG 6720
CTGAAGAAGC TGTCGCAGAA GGGCAAGACC GTCATCCTGA CCATTCATCA GCCGTCTTCC 6780
GAGCTGTTTG AGCTCTTTGA CAAGATCCTT CTGATGGCCG AGGGCAGGGT AGCTTTCTTG 6840
GGCACTCCCA GCGAAGCCGT CGACTTCTTT TCCTAGTGAG TTCGATGTGT TTATTAAGGG 6900
TATCTAGCAT TACATTACAT CTCAACTCCT ATCCAGCGTG GGTGCCCAGT GTCCTACCAA 6960
CTACAATCCG GCGGACTTTT ACGTACAGGT GTTGGCCGTT GTGCCCGGAC GGGAGATCGA 7020
GTCCCGTGAT CGGATCGCCA AGATATGCGA CAATTTTGCT ATTAGCAAAG TAGCCCGGGA 7080
TATGGAGCAG TTGTTGGCCA CCAAAAATTT GGAGAAGCCA CTGGAGCAGC CGGAGAATGG 7140
GTACACCTAC AAGGCCACCT GGTTCATGCA GTTCCGGGCG GTCCTGTGGC GATCCTGGCT 7200
GTCGGTGCTC AAGGAACCAC TCCTCGTAAA AGTGCGACTT ATTCAGACAA CGGTGAGTGG 7260
TTCCAGTGGA AACAAATGAT ATAACGCTTA CAATTCTTGG AAACAAATTC GCTAGATTTT 7320
AGTTAGAATT GCCTGATTCC ACACCCTTCT TAGTTTTTTT CAATGAGATG TATAGTTTAT 7380
AGTTTTGCAG AAAATAAATA AATTTCATTT AACTCGCGAA CATGTTGAAG ATATGAATAT 7440
TAATGAGATG CGAGTAACAT TTTAATTTGC AGATGGTTGC CATCTTGATT GGCCTCATCT 7500
TTTTGGGCCA ACAACTCACG CAAGTGGGCG TGATGAATAT CAACGGAGCC ATCTTCCTCT 7560
TCCTGACCAA CATGACCTTT CAAAACGTCT TTGCCACGAT AAATGTAAGT CTTGTTTAGA 7620
ATACATTTGC ATATTAATAA TTTACTAACT TTCTAATGAA TCGATTCGAT TTAGGTGTTC 7680
ACCTCAGAGC TGCCAGTTTT TATGAGGGAG GCCCGAAGTC GACTTTATCG CTGTGACACA 7740
TACTTTCTGG GCAAAACGAT TGCCGAATTA CCGCTTTTTC TCACAGTGCC ACTGGTCTTC 7800
ACGGCGATTG CCTATCCGAT GATCGGACTG CGGGCCGGAG TGCTGCACTT CTTCAACTGC 7860
CTGGCGCTGG TCACTCTGGT GGCCAATGTG TCAACGTCCT TCGGATATCT AATATCCTGC 7920
GCCAGCTCCT CGACCTCGAT GGCGCTGTCT GTGGGTCCGC CGGTTATCAT ACCATTCCTG 7980
CTCTTTGGCG GCTTCTTCTT GAACTCGGGC TCGGTGCCAG TATACCTCAA ATGGTTGTCG 8040
TACCTCTCAT GGTTCCGTTA CGCCAACGAG GGTCTGCTGA TTAACCAATG GGCGGACGTG 8100
GAGCCGGGCG AAATTAGCTG CACATCGTCG AACACCACGT GCCCCAGTTC GGGCAAGGTC 8160
ATCCTGGAGA CGCTTAACTT CTCCGCCGCC GATCTGCCGC TGGACTACGT GGGTCTGGCC 8220
ATTCTCATCG TGAGCTTCCG GGTGCTCGCA TATCTGGCTC TAAGACTTCG GGCCCGACGC 8280
AAGGAGTAGA AGGTAAGTAG CGGCCGCACG TAAGGGTTAA TGTTTTCAAA AAAAAATTCG 8340
TCCGCACACA ACCTTTCCTC TCAACAAGCA AACGTGCACT GAATTTAAGT GTATACTTCG 8400
GTAAGCTTCG GCTATCGACG GGACCACCTT ATGTTATTTC ATCATGGGCC AGACCCACGT 8460
AGTCCAGCGG CAGATCGGCG GCGGAGAAGT TAAGCGTCTC CAGGATGACC TTGCCCGAAC 8520
TGGGGCACGT GGTGTTCGAC GATGTGCAGC TAATTTCGCC CGGCTCCACG TCCGCCCATT 8580
GGTTAATCAG CAGACCCTCG TTGGCGTAAC GGAACCATGA GAGGTACGAC AACCATTTGA 8640
GGTATACTGG CACCGAGCCC GAGTTCAAGA AGAAGGCGTT TTTCCATAGG CTCCGCCCCC 8700
CTGACGAGCA TCACAAAAAT CGACGCTCAA GTCAGAGGTG GCGAAACCCG ACAGGACTAT 8760
AAAGATACCA GGCGTTTCCC CCTGGAAGCT CCCTCGTGCG CTCTCCTGTT CCGACCCTGC 8820
CGCTTACCGG ATACCTGTCC GCCTTTCTCC CTTCGGGAAG CGTGGCGCTT TCTCAATGCT 8880
CACGCTGTAG GTATCTCAGT TCGGTGTAGG TCGTTCGCTC CAAGCTGGGC TGTGTGCACG 8940
AACCCCCCGT TCAGCCCGAC CGCTGCGCCT TATCCGGTAA CTATCGTCTT GAGTCCAACC 9000
CGGTAAGACA CGACTTATCG CCACTGGCAG CAGCCACTGG TAACAGGATT AGCAGAGCGA 9060
GGTATGTAGG CGGTGCTACA GAGTTCTTGA AGTGGTGGCC TAACTACGGC TACACTAGAA 9120
GGACAGTATT TGGTATCTGC GCTCTGCTGA AGCCAGTTAC CTTCGGAAAA AGAGTTGGTA 9180
GCTCTTGATC CGGCAAACAA ACCACCGCTG GTAGCGGTGG TTTTTTTGTT TGCAAGCAGC 9240
AGATTACGCG CAGAAAAAAA GGATCTCAAG AAGATCCTTT GATCTTTTCT ACGGGGTCTG 9300
ACGCTCAGTG GAACGAAAAC TCACGTTAAG GGATTTTGGT CATGAGATTA TCAAAAAGGA 9360
TCTTCACCTA GATCCTTTTA AATTAAAAAT GAAGTTTTAA ATCAATCTAA AGTATATATG 9420
AGTAAACTTG GTCTGACAGT TACCAATGCT TAATCAGTGA GGCACCTATC TCAGCGATCT 9480
GTCTATTTCG TTCATCCATA GTTGCCTGAC TCCCCGTCGT GTAGATAACT ACGATACGGG 9540
AGGGCTTACC ATCTGGCCCC AGTGCTGCAA TGATACCGCG AGACCCACGC TCACCGGCTC 9600
CAGATTTATC AGCAATAAAC CAGCCAGCCG GAAGGGCCGA GCGCAGAAGT GGTCCTGCAA 9660
CTTTATCCGC CTCCATCCAG TCTATTAATT GTTGCCGGGA AGCTAGAGTA AGTAGTTCGC 9720
CAGTTAATAG TTTGCGCAAC GTTGTTGCCA TTGCTACAGG CATCGTGGTG TCACGCTCGT 9780
CGTTTGGTAT GGCTTCATTC AGCTCCGGTT CCCAACGATC AAGGCGAGTT ACATGATCCC 9840
CCATGTTGTG CAAAAAAGCG GTTAGCTCCT TCGGTCCTCC GATCGTTGTC AGAAGTAAGT 9900
TGGCCGCAGT GTTATCACTC ATGGTTATGG CAGCACTGCA TAATTCTCTT ACTGTCATGC 9960
CATCCGTAAG ATGCTTTTCT GTGACTGGTG AGTACTCAAC CAAGTCATTC TGAGAATAGT 10020
GTATGCGGCG ACCGAGTTGC TCTTGCCCGG CGTCAACACG GGATAATACC GCGCCACATA 10080
GCAGAACTTT AAAAGTGCTC ATCATTGGAA AACGTTCTTC GGGGCGAAAA CTCTCAAGGA 10140
TCTTACCGCT GTTGAGATCC AGTTCGATGT AACCCACTCG TGCACCCAAC TGATCTTCAG 10200
CATCTTTTAC TTTCACCAGC GTTTCTGGGT GAGCAAAAAC AGGAAGGCAA AATGCCGCAA 10260
AAAAGGGAAT AAGGGCGACA CGGAAATGTT GAATACTCAT ACTCTTCCTT TTTCAATATT 10320
ATTGAAGCAT TTATCAGGGT TATTGTCTCA TGAGCGGATA CATATTTGAA TGTATTTAGA 10380
AAAATAAACA AATAGGGGTT CCGCGCACAT TTCCCCGAAA AGTGCCACCT GACGTCTAAG 10440
AAACCATTAT TATCATGACA TTAACCTATA AAAATAGGCG TATCACGAGG CCCTTTCGTC 10500
TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 10560
CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG 10620
TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 10680
ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACCGAA TCGCGCGGAA CTAACGACAG TCGCTCCAAG 10740
GTCGTCGAAC AAAAGGTGAA TGTGTTGCGG AGAGCGGGTG GGAGACAGCG AAAGAGCAAC 10800
TACGAAACGT GGTGTGGTGG AGGTGAATTA TGAAGAGGGC GCGCGATTTG AAAAGTATGT 10860
ATATAAAAAA TATATCCCGG TGTTTTATGT AGCGATAAAC GAGTTTTTGA TGTAAGGTAT 10920
GCAGGTGTGT AAGTCTTTTG GTTAGAAGAC AAATCCAAAG TCTACTTGTG GGGATGTTCG 10980
AAGGGGAAAT ACTTGTATTC TATAGGTCAT ATCTTGTTTT TATTGGCACA AATATAATTA 11040
CATTAGCTTT TTGAGGGGGC AATAAACAGT AAACACGATG GTAATAATGG TAAAAAAAAA 11100
AACAAGCAGT TATTTCGGAT ATATGTCGGC TACTCCTTGC GTCGGGCCCG AAGTCTTAGA 11160
GCCAGATATG CGAGCACCCG GAAGCTCACG ATGAGAATGG CCAGAC 11206
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のベクターであるpTrap-hsneo の概略地図である。
【図２】この発明のベクターであるpTrap-G4-p53の概略地図である。
【図３】この発明のベクターであるpCasperhs-G4-LT の概略地図である。
【図４】この発明のベクターであるpTrap-G4-lucの概略地図である。
【図５】クローニングのためにこの発明のベクターが挿入されたハエゲノムの概略図である。
【図６】 aop-Ｇal４およびm-white-aop 融合ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定結果である。
【図７】陽性遺伝子トラップ系統とＵＡＳ−ｌａｃＺ構築体を含有するハエとを交配して得たハエ脳の種々の部分における特徴的なベーターガラクトシダーゼ染色パターン像である。
【発明の属する技術分野】
この発明は、キイロショウジョウバエ（ドロソフィラ・メラノガステル：Drosophilamelamogaster）の新規遺伝子のクローニングおよび機能分析を容易にする新規ベクター系、およびこのベクター系による遺伝子トラッピングに関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
トウモロコシやマウスを含む広範な生物体において、遺伝子トラッピングの応用例が数多く存在する（Gossler et al. Science, 244:463-465, 1989 ）。
遺伝子トラッピングのための道具としては、トラップされた遺伝子のクローニングおよび分析を目的として種々の型のエンハンサートラップＰエレメントベクター（Wilson et al., Genes & Development, 3:1301-1313, 1989 ）の応用、並びにＧal４／ＵＡＳ転写アクティベーター系の協力下でのモザイク解析に関するその使用が効果的であることが証明されている。しかしながら、ベクターコンストラクトまたは他のレポーター遺伝子の発現パターンが１種以上の遺伝子に属するエンハンサーにより影響を受ける場合がある。また、エンハンサートラップの挿入により１種以上の隣接遺伝子が機能発現するかどうかを決定することが困難な場合もある。
【０００３】
これらの事情と、その最も近いエクソンが挿入部位から３０ｋＢ以上離れて位置している遺伝子の発現変化が変異表現型の原因となる場合があるという事実とが一緒になって、影響を受けた遺伝子をクローンし分析することが困難になることがありうる。
この出願の１つの目的は、特別にデザインした人工の調節配列を含むベクター系、および陽性の組換え体系統を容易にスクリーニングするための選択方法を提供することである。より詳しくは、この出願は、広く使用されているエンハンサートラップＰエレメントベクターに比較して、影響を受けた遺伝子を更に容易にかつ迅速にクローニングすることのでききるベクター系を提供することを目的としている。この出願の別の目的は、エンハンサートラップ系統を用いる多くの場合とは異なり、この発明のベクター系は、レポーター遺伝子の発現が単一の内因性転写ユニットによってのみ影響され、かつその遺伝子自体の発現のみを生み出すという理由から、得られたトラップ現象を容易に検出し、しかもレポーター遺伝子のより特徴的な（「機能的な」）発現パターンを極めて高い確率で得ることのできる方法を提供することである。
【０００４】
【発明の開示】
この出願の第１の発明は、以下のヌクレオチド配列：
人工の共通スプライシング受容部位、
合成ストップ／スタート配列、
レポーター遺伝子、
薬剤耐性遺伝子、
キイロショウジョウバエの検出可能な表現型の遺伝子、および
合成スプライシング供与部位
をこの順序で有する組換え体プラスミドであるキイロショウジョウバエの未知遺伝子トラップ用ベクターである。
【０００５】
この第１発明の１つの実施態様は、組換え体プラスミドとして、pCasper3に由来するプラスミドを用いることである。
第１発明の他の実施態様は、レポーター遺伝をＧal４遺伝子、Ｇal４ＤＮＡ結合領域−ｐ５３融合遺伝子、またはＧal４−ほたるルシフェラーゼ融合遺伝子とすることである。
【０００６】
この第１発明の別の実施態様は、キイロショウジョウバエにおける検出可能な表現型の遺伝子をミニ白眼遺伝子とすることである。
第１発明のさらに他の実施態様は、薬剤耐性遺伝子をネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子とし、そのプロモーターをヒートショックプロモーターとすることである。
【０００７】
この出願の第２の発明は、以下のヌクレオチド配列：
人工の共通スプライシング受容部位、
合成ストップ／スタート配列、
レポーター遺伝子、
薬剤耐性遺伝子、
キイロショウジョウバエの検出可能な表現型の遺伝子、および
合成スプライシング供与部位
をこの順序で有する組換え体プラスミドであるベクターを使用する方法であって、以下のステップ：
（ａ）白眼遺伝子を持たないハエのゲノムに前記ベクターを挿入し、
（ｂ）薬剤耐性である１次形質転換体を選択し、
（ｃ）１次形質転換体を転移酵素発現系統と交配させてベクターを他の位置に転移させ、
（ｄ）眼の色が濃いハエを採集することにより２次形質転換体を選択し、
（ｅ）２次形質転換体をＵＡＳ（上流活性化配列）−ルシフェラーゼ含有系統と交配し、産出したハエにおけるレポーター遺伝子の発現を測定し、
（ｆ）トラップされた遺伝子をクローニングにより同定し、レポーター遺伝子およびハエの検出可能な表現型の遺伝子に融合したｃＤＮＡ群の配列を決定する、
ことからなるキイロショウジョウバエ未知遺伝子のトラップ方法である。
【０００８】
この出願の第３の発明は、以下のヌクレオチド配列：
人工の共通スプライシング受容部位、
合成ストップ／スタート配列、
レポーター遺伝子としてのＧal４ＤＮＡ結合領域−ｐ５３融合遺伝子、
薬剤耐性遺伝子、
キイロショウジョウバエの検出可能な表現型の遺伝子、および
合成スプライシング供与部位
をこの順序で有する組換え体プラスミドであるベクターＡ、およびpCasperhs のポリクローニング部位内にヒートショックプロモーターと結合したＧal４活性化領域−ラージＴ抗原融合遺伝子を有するpCasperhs 由来ベクターＢを使用する方法であって、
（ａ）白眼遺伝子を持たない別個のハエのゲノムにベクターＡおよびベクターＢをそれぞれ挿入し、
（ｂ）薬剤耐性であるベクターＡの１次形質転換体を選択し、眼の色をもつベクターＢの１次形質転換体を選択し、
（ｃ）ベクターＡの１次形質転換体を転移酵素発現系統と交配してベクターを他の位置に転移させ、
（ｄ）眼の色が濃いハエを採集することによりベクターＡの２次形質転換体を選択し、
（ｅ）この２次形質転換体をベクターＢの１次形質転換体と交配してベクターＡとベクターＢの両者を有するハエを産出させ、
（ｆ）ステップ（ｅ）で得たハエをＵＡＳ−ルシフェラーゼ含有系統と交配して、その結果産出したハエにおけるレポーター遺伝子の発現を測定し、
（ｇ）トラップされた遺伝子をクローニングにより同定し、レポーター遺伝子およびハエの検出可能な表現型の遺伝子と融合したｃＤＮＡ群の配列を決定する、ことからなるキイロショウジョウバエの未知遺伝子のトラップ方法である。
【０００９】
第２および第３発明の実施態様は第１発明の実施態様に対応するものであり、これらについては以下の記載でさらに詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この発明のベクター構築体は、例えば、一般的に使用されるＰエレメント形質転換ベクターであるpCasper3（Pirotta, Vectors: A survey of mlecular cloning vectors and their uses, eds. Rodriguez, R.L. & Denhardt, D.T., Butterworths, Boston. 437-456, 1998 ）および簡便なＧal４−ＵＡＳ発現系（Brand and Perrimon, Development, 118:401-415, 1993）に基づいて構築することができる。
【００１１】
すなわち、プロモーターのないＧal４遺伝子がpCasper3のポリクローニング部位に挿入した。このＧal４遺伝子の上流には人工の共通スプライシング受容部位および合成ストップ／スタート配列が配置されており、トラップされた遺伝子上流のエキソン（群）から始まりＧａｌ４の適切なリーディングフレームに至る翻訳を支配している。
【００１２】
ミニ白眼遺伝子は、その３’ＵＴＲ（非翻訳領域）全部を除去し、人工のスプライシング供与部位を置き換えることのよって、それ自身のポリアデニル化部位をもたない断片化遺伝子とした。
遺伝子トラップ現象が生じない場合には、この断片化ミニ白眼遺伝子は目の色を付与しないと考えられる。そこで、この発明では、抗生物質による１次形質転換体の選択を補助するためにヒートショックプロモーターを結合したネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ（ｈｓ−ｎｅｏ）遺伝子を挿入した。
【００１３】
図１はジーントラップ構築体（pTrap-hsne）の概略地図であり、配列番号１はpTrap-hsneベクターの全ヌクレオチド配列である。
別のジーントラップ構築体であるpTrap-G4-p53（図２）は、プラスミドpTrap-hsneのＧal４コード化配列をＧal４ＤＮＡ結合領域−ｐ５３融合遺伝子（Clontech社製、Matchmaker Two Hybrid System, #K1605-1）で置き換えることにより作り出した。この構築体が、ヒートショックプロモーターを結合したＧal４活性化領域−ラージＴ抗原を含有する別のベクターpCasperhs-G4-LT （図３）と同じハエのゲノム中に共存すると、機能性Ｇal４分子のアセンブリーは、ｐ５３−ラージＴ抗原相互作用を通じて、外部からのヒートショックにより調節することができる。
【００１４】
このようにして、Ｇal４活性の意図的な時間的制御が可能になる。換言すると、トラップされた遺伝子のプロモーターによって空間的に決定されているパターンでのＧal４の発現を、いまや外部ヒートショックにより任意の段階で誘導することが可能となる。
Ｇal４発現の検出を容易にするために、別の構築体においては、Ｇal４遺伝子をＧal４−ほたるルシフェラーゼ融合遺伝子に置き換えてpTrap-G4-luc（図４）を得た。この人工遺伝子は、両酵素活性が保存された融合ポリペプチドをコード化している。
【００１５】
ルシフェラーゼ活性の測定はルミノアッセイにより容易に行うことができるため（Brandes et al., Neuron, 16:687-694, 1996）、個々の生きたハエにおけるＧal４を容易に検出することができる。
次に、このベクター系を用いる遺伝子トラップ法である第２および第３発明の最良の形態を詳細に説明する。
（１）スクリーニング：
ジーントラップ構築体は、顕微注入により白眼遺伝子を持たないハエのゲノムに導入することができる。１次形質転換体の選択は、ｈｓ−ｎｅｏ遺伝子により付与されたネオマイシン類似体Ｇ４１８耐性を使用して行うことが可能である。（ただし、これらの構築体を用いて形質転換実験を実施する場合、断片化ミニ白眼遺伝子は、一般に、ほとんどの場合ｗ−表現型と区別できる極めて僅かに黄色の眼を生じることになるので、Ｇ４１８による選択は不必要となる。）
ジーントラップ構築体を有する系統の樹立後、デルタ２−３遺伝因子を発現する転移酵素を含有するジャンプスターター呼ばれる系統と交配することにより、通常の方法で２次形質転換体を作成することができる。
【００１６】
通常、２次形質転換体の４から８パーセントは、祖先のハエに比較して極めて濃い目の色（濃橙色または赤色）をしている。このことは、構築体がプロモーターの下流に挿入され、ミニ白眼遺伝子が、除去された遺伝子の代わりにその遺伝子の転写「促進要素」（例えばポリアデニル化部位および転写ターミネーター）を使用していることを示している。これらは、遺伝子トラップ現象の最も有望な候補である可能性が極めて高い。これらの系統の場合、ベクターはおそらく遺伝子のイントロン内かまたは最初のイントロンの上流へ、適切な配向（すなわち転写方向が「トラップされた遺伝子」と、またミニ白眼遺伝子（およびＧal４）とも同じ）で５’ＵＴＲ内に挿入されている。ミニ白眼遺伝子はそれ自身のプロモーターをもち、それゆえその発現パターンはトラップされた遺伝子のそれと全く異なると思われる。
【００１７】
これらの陽性系統は、次の段階で、ＵＡＳ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築体を保有する「マーカー」系統と交配することにより検査される。（pTrap-G4-lucベクターを使用する場合、この段階は不必要である。）通常、極めて強い相関性が、目の色とＧal４発現の間に見られる：目の色が濃い系統の９０％以上が、ルミノメーターを用いるルシフェラーゼアッセイでＧal４を発現していることが証明されている（Brandes et al., Neuron, 16:687-692, 1996）。
（２）クローニング：
ジーントラップ構築体を内在性遺伝子のイントロン内に挿入する場合、構築体のマーカー遺伝子は、人工のスプライシング受容および付与部位を使用してｍＲＮＡレベルでスプライシングされ、トラップされた遺伝子のエキソンになると思われる。さらに正確に述べると、Ｇal４のｍＲＮＡは挿入部位の上流に位置するエキソン（群）に連結されるはずであるが、同時にミニ白眼遺伝子のｍＲＮＡが続くエキソン（群）に融合してトラップされた遺伝子の２重標的化を達成している（図５）。
【００１８】
この特徴は、３’および５’ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends：ｃＤＮＡ末端の急速増幅）法により、トラップされた遺伝子を迅速かつ容易に同定するのに使用することができる。捕獲したｍＲＮＡの一部分のみのクローニングおよび配列決定でさえも、ＢＤＧＰ（Berkeley Drosophia Gemone Project ）ＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）ライブラリー中から高い確率で相同的なｍＲＮＡを見出すことが可能である。
【００１９】
すでにクローニングされている遺伝子の同定は、同様のエンハンサートラップ構築体により作り出された突然変異を分析する際には通常は平均して１年以上の期間を要するのに対して、この発明の方法の場合には１週間未満で遺伝子の同定が可能となる場合もある。
Ｐエレメントベクターは、活性遺伝子の５’ＵＴＲまたは近傍に組み込まれる傾向があることが文献上周知であり、またこの発明者も経験した。（この発明者は、これらの場合に、もしベクターが最初のイントロンの上流に挿入され、それ故人工のスプライシング受容部位が使用できないならば、Ｇal４遺伝子は近くのプロモーターから読み通し転写により発現されることを見出している。）
この傾向の利点は、逆転写ＰＣＲもしくはvectoretteＰＣＲによって、または適当な制限消化によって構築体のネオマイシン耐性遺伝子を回収するプラスミドレスキューによって、挿入部位のフランキングゲノム配列のクローニングと配列決定により利用することができる。この場合もＢＤＧＰライブラリーを検索して意味のある一致があるかどうかを調べることができる。
（３）レスキュー：
観察された突然変異の表現型が実際にＰエレメント挿入の結果起こったことを確認するただ一つの信頼できる方法は、特定の表現型をレスキューすることである。予期されることは、表現型（野生型のハエとの何かの差異）がＰエレメントの挿入により散布された遺伝子（群）の発現変化によって起こったということである。レスキューは、疑いのある遺伝子のｃＤＮＡを、その遺伝子自身と同じ空間的および時間的パターンで最も好ましく発現することによりなされる。
【００２０】
予期されたように、第１発明のベクター構築体は通常、強い表現型を引き起こす。トラップされた遺伝子はｍＲＮＡレベルで２個の部分に分離し、多くの場合無効変異をもたらすと思われるので、これは全く意外ではない。したがって、この方法で得た突然変異はしばしばホモ接合性の致死性または不稔性を示す。低次形態の突然変異は、遺伝子トラップＰエレメント構築体の不正確な切除により得ることができる。
【００２１】
上記のように、Ｇal４の発現は、単にＧal４遺伝子がそれ自身のプロモーターをもたず共通の融合ｍＲＮＡを共有するという理由から、トラップされた遺伝子のそれを正確に反映せざるを得ない。
この同一発現は、トラップされた遺伝子のＵＡＳ結合クローンｃＤＮＡを保有する別のハエとこのハエとを交配することにより、突然変異の表現型をレスキューすることを可能とする。
【００２２】
このようにして、元のホモ接合性無効変異遺伝子をトラップしたハエ、または無効変異アレル上にある種の低次形態アレルをもったハエのトランスヘテロ接合体をレスキューすることができる。
（４）トラップされた遺伝子の空間的および発生的発現パターンの測定：
トラップされた遺伝子の空間的および時間的に制御された発現の組織化学的測定もまた、同じハエのゲノムにＵＡＳ−ｌａｃＺ構築体を導入し、ベーターガラクトシダーゼに対するＸ−ｇａｌまたは抗体染色を実施することにより、容易に行うことができる。
（５）モザイク分析：
種々の、特徴的な、そしてpTrap-G4-p53/pCasperhs-G4-TLベクター系の場合には誘導可能なＧal４発現パターンを持つような、ハエ系統の膨大なコレクションを保有することは、種々のＧal４発現パターンをもった突然変異のバックグラウンド上にそれらのＵＡＳ構築体を発現させることにより、対象となる全ての遺伝子のモザイク分析を実行可能にする。
【００２３】
この方法は、どこでいつ、特定遺伝子の発現が突然変異表現型のレスキューのために必要とされるかという問題に回答を与えるものである。
同様に、任意の遺伝子を種々の異所性パターンで発現させて新規な優生表現型を生じさせることができる。この方法は、その特定遺伝子の役割を決定し、それが関与する経路を同定する助けとなるかもしれない。
【００２４】
【実施例】
以下の実施例は、この発明の種々の特徴に関する具体的実施態様を説明するものである。この実施例は、いかなる意味でもこの発明の限定を意図するものではない。
図６は、aop-Ｇal４およびm-white-aop 融合ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定結果を示す。
【００２５】
鋳型は、公知のａｏｐ（anterior open/pokkuri/yan ）発生遺伝子の最初のイントロン中に組み込んだベクターpTrap-hsneo を有する陽性遺伝子トラップ系統から調製した全ＲＮＡを用いた。この配列から、両方のスプライシングが正確に、予期された場所である人工調節配列の特定のヌクレオチドで生じたことが確認された。
【００２６】
図７では、陽性遺伝子トラップ系統とＵＡＳ−ｌａｃＺ構築体を含有するハエとを交配して得たハエの脳の種々の部分における特徴的なベ−タ−ガラクトシダーゼ染色パターン像を示す。
【００２７】
【発明の効果】
この発明のベクター系は、観察された表現型の原因となる遺伝子を容易かつ迅速にクローニングすることを可能とする。さらに、関心がある任意の遺伝子のＵＡＳ由来のコード配列を使用することにより、その特定の遺伝子を、トラップされた遺伝子と同一のパターンで発現させることができ、これらの発現は希望する任意の発生段階に時間的に調節することができる。
【００２８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１１２０６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：環状
配列の種類：ＤＮＡ
CATGATGAAA TAACATAAGG TGGTCCCGTC GGCAAGAGAC ATCCACTTAA CGTATGCTTG 60
CAATAAGTGC GAGTGAAAGG AATAGTATTC TGAGTGTCGT ATTGAGTCTG AGTGAGACAG 120
CGATATGATT GTTGATTAAC CCTTAGCATG TCCGTGGGGT TTGAATTAAC TCATAATATT 180
AATTAGACGA AATTATTTTT AAAGTTTTAT TTTTAATAAT TTGCGAGTAC GCAAAGCTCT 240
TTCTCTTACA GGTCGAATTG ATGTGATGGA TCCAATGAAG CTACTGTCTT CTATCGAACA 300
AGCATGCGAT ATTTGCCGAC TTAAAAAGCT CAAGTGCTCC AAAGAAAAAC CGAAGTGCGC 360
CAAGTGTCTG AAGAACAACT GGGAGTGTCG CTACTCTCCC AAAACCAAAA GGTCTCCGCT 420
GACTAGGGCA CATCTGACAG AAGTGGAATC AAGGCTAGAA AGACTGGAAC AGCTATTTCT 480
ACTGATTTTT CCTCGAGAAG ACCTTGACAT GATTTTGAAA ATGGATTCTT TACAGGATAT 540
AAAAGCATTG TTAACAGGAT TATTTGTACA AGATAATGTG AATAAAGATG CCGTCACAGA 600
TAGATTGGCT TCAGTGGAGA CTGATATGCC TCTAACATTG AGACAGCATA GAATAAGTGC 660
GACATCATCA TCGGAAGAGA GTAGTAACAA AGGTCAAAGA CAGTTGACTG TATCGATTGA 720
CTCGGCAGCT CATCATGATA ACTCCACAAT TCCGTTGGAT TTTATGCCCA GGGATGCTCT 780
TCATGGATTT GATTGGTCTG AAGAGGATGA CATGTCGGAT GGCTTGCCCT TCCTGAAAAC 840
GGACCCCAAC AATAATGGGT TCTTTGGCGA CGGTTCTCTC TTATGTATTC TTCGATCTAT 900
TGGCTTTAAA CCGGAAAATT ACACGAACTC TAACGTTAAC AGGCTCCCGA CCATGATTAC 960
GGATAGATAC ACGTTGGCTT CTAGATCCAC AACATCCCGT TTACTTCAAA GTTATCTCAA 1020
TAATTTTCAC CCCTACTGCC CTATCGTGCA CTCACCGACG CTAATGATGT TGTATAATAA 1080
CCAGATTGAA ATCGCGTCGA AGGATCAATG GCAAATCCTT TTTAACTGCA TATTAGCCAT 1140
TGGAGCCTGG TGTATAGAGG GGGAATCTAC TGATATAGAT GTTTTTTACT ATCAAAATGC 1200
TAAATCTCAT TTGACGAGCA AGGTCTTCGA GTCAGGTTCC ATAATTTTGG TGACAGCCCT 1260
ACATCTTCTG TCGCGATATA CACAGTGGAG GCAGAAAACA AATACTAGCT ATAATTTTCA 1320
CAGCTTTTCC ATAAGAATGG CCATATCATT GGGCTTGAAT AGGGACCTCC CCTCGTCCTT 1380
CAGTGATAGC AGCATTCTGG AACAAAGACG CCGAATTTGG TGGTCTGTCT ACTCTTGGGA 1440
GATCCAATTG TCCCTGCTTT ATGGTCGATC CATCCAGCTT TCTCAGAATA CAATCTCCTT 1500
CCCTTCTTCT GTCGACGATG TGCAGCGTAC CACAACAGGT CCCACCATAT ATCATGGCAT 1560
CATTGAAACA GCAAGGCTCT TACAAGTTTT CACAAAAATC TATGAACTAG ACAAAACAGT 1620
AACTGCAGAA AAAAGTCCTA TATGTGCAAA AAAATGCTTG ATGATTTGTA ATGAGATTGA 1680
GGAGGTTTCG AGACAGGCAC CAAAGTTTTT ACAAATGGAT ATTTCCACCA CCGCTCTAAC 1740
CAATTTGTTG AAGGAACACC CTTGGCTATC CTTTACAAGA TTCGAACTGA AGTGGAAACA 1800
GTTGTCTCTT ATCATTTATG TATTAAGAGA TTTTTTCACT AATTTTACCC AGAAAAAGTC 1860
ACAACTAGAA CAGGATCAAA ATGATCATCA AAGTTATGAA GTTAAACGAT GCTCCATCAT 1920
GTTAAGCGAT GCAGCACAAA GAACTGTTAT GTCTGTAAGT AGCTATATGG ACAATCATAA 1980
TGTCACCCCA TATTTTGCCT GGAATTGTTC TTATTACTTG TTCAATGCAG TCCTAGTACC 2040
CATAAAGACT CTACTCTCAA ACTCAAAATC GAATGCTGAG AATAACGAGA CCGCACAATT 2100
ATTACAACAA ATTAACACTG TTCTGATGCT ATTAAAAAAA CTGGCCACTT TTAAAATCCA 2160
GACTTGTGAA AAATACATTC AAGTACTGGA AGAGGTATGT GCGCCGTTTC TGTTATCACA 2220
GTGTGCAATC CCATTACCGC ATATCAGTTA TAACAATAGT AATGGTAGCG CCATTAAAAA 2280
TATTGTCGGT TCTGCAACTA TCGCCCAATA CCCTACTCTT CCGGAGGAAA ATGTCAACAA 2340
TATCAGTGTT AAATATGTTT CTCCTGGCTC AGTAGGGCCT TCACCTGTGC CATTGAAATC 2400
AGGAGCAAGT TTCAGTGATC TAGTCAAGCT GTTATCTAAC CGTCCACCCT CTCGTAACTC 2460
TCCAGTGACA ATACCAAGAA GCACACCTTC GCATCGCTCA GTCACGCCTT TTCTAGGGCA 2520
ACAGCAACAG CTGCAATCAT TAGTGCCACT GACCCCGTCT GCTTTGTTTG GTGGCGCCAA 2580
TTTTAATCAA AGTGGGAATA TTGCTGATAG CTCATTGTCC TTCACTTTCA CTAACAGTAG 2640
CAACGGTCCG AACCTCATAA CAACTCAAAC AAATTCTCAA GCGCTTTCAC AACCAATTGC 2700
CTCCTCTAAC GTTCATGATA ACTTCATGAA TAATGAAATC ACGGCTAGTA AAATTGATGA 2760
TGGTAATAAT TCAAAACCAC TGTCACCTGG TTGGACGGAC CAAACTGCGT ATAACGCGTT 2820
TGGAATCACT ACAGGGATGT TTAATACCAC TACAATGGAT GATGTATATA ACTATCTATT 2880
CGATGATGAA GATACCCCAC CAAACCCAAA AAAAGAGTAA AATGAATCGT AGATACTGAA 2940
AAACCCCGCA AGTTCACTTC AACTGTGCAT CGTGCACCAT CTCAATTTCT TTCATTTATA 3000
CATCGTTTTG CCTTCTTTTA TGTAACTATA CTCCTCTAAG TTTCAATCTT GGCCATGTAA 3060
CCTCTGATCT ATAGAATTTT TTAAATGACT AGAATTAATG CCCATCTTTT TTTTGGACCT 3120
AAATTCTTCA TGAAAATATA TTACGAGGGC TTATTCAGAA GCTTATCGAT ACCGTCGACT 3180
AAAGCCAAAT AGAAATTATT CAGTTCTGGC TTAAGTTTTT AAAAGTGATA TTATTTATTT 3240
GGTTGTAACC AACCAAAAGA ATGTAAATAA CTAATACATA ATTATGTTAG TTTTAAGTTA 3300
GCAACAAATT GATTTTAGCT ATATTAGCTA CTTGGTTAAT AAATAGAATA TATTTATTTA 3360
AAGATAATTC GTTTTTATTG TCAGGGAGTG AGTTTGCTTA AAAACTCGTT TAGATCCACT 3420
AGAAGGACCG CGGCTCCTCG ACCGGATCGA AAGGAGGGCG AAGAACTCCA GCATGAGATC 3480
CCCGCGCTGG AGGATCATCC AGCCGGCGTC CCGGAAAACG ATTCCGAAGC CCAACCTTTC 3540
ATAGAAGGCG GCGGTGGAAT CGAAATCTCG TGATGGCAGG TTGGGCGTCG CTTGGTCGGT 3600
CATTTCGAAC CCCAGAGTCC CGCTCAGAAG AACTCGTCAA GAAGGCGATA GAAGGCGATG 3660
CGCTGCGAAT CGGGAGCGGC GATACCGTAA AGCACGAGGA AGCGGTCAGC CCATTCGCCG 3720
CCAAGCTCTT CAGCAATATC ACGGGTAGCC AACGCTATGT CCTGATAGCG GTCCGCCACA 3780
CCCAGCCGGC CACAGTCGAT GAATCCAGAA AAGCGGCCAT TTTCCACCAT GATATTCGGC 3840
AAGCAGGCAT CGCCATGGGT CACGACGAGA TCCTCGCCGT CGGGCATGCG CGCCTTGAGC 3900
CTGGCGAACA GTTCGGCTGG CGCGAGCCCC TGATGCTCTT CGTCCAGATC ATCCTGATCG 3960
ACAAGACCGG CTTCCATCCG AGTACGTGCT CGCTCGATGC GATGTTTCGC TTGGTGGTCG 4020
AATGGGCAGG TAGCCGGATC AAGCGTATGC AGCCGCCGCA TTGCATCAGC CATGATGGAT 4080
ACTTTCTCGG CAGGAGCAAG GTGAGATGAC AGGAGATCCT GCCCCGGCAC TTCGCCCAAT 4140
AGCAGCCAGT CCCTTCCCGC TTCAGTGACA ACGTCGAGCA CAGCTGCGCA AGGAACGCCC 4200
GTCGTGGCCA GCCACGATAG CCGCGCTGCC TCGTCCTGCA GTTCATTCAG GGCACCGGAC 4260
AGGTCGGTCT TGACAAAAAG AACCGGGCGC CCCTGCGCTG ACAGCCGGAA CACGGCGGCA 4320
TCAGAGCAGC CGATTGTCTG TTGTGCCCAG TCATAGCCGA ATAGCCTCTC CACCCAAGCG 4380
GCCGGAGAAC CTGCGTGCAA TCCATCTTGT TCAATCATGC GAAACGATCC TCATCCTGTC 4440
TCTTGATCAG ATCCCCTATT CAGAGTTCTC TTCTTGTATT CAATAATTAC TTCTTGGCAG 4500
ATTTCAGTAG TTGCAGTTGA TTTACTTGGT TGCTGGTTAC TTTTAATTGA TTCACTTTAA 4560
CTTGCACTTT ACTGCAGATT GTTTAGCTTG TTCAGCTGCG CTTGTTTATT TGCTTAGCTT 4620
TCGCTTAGCG ACGTGTTCAC TTTGCTTGTT TGAATTGAAT TGTCGCTCCG TAGACGAAGC 4680
GCCTCTATTT ATACTCCGGC GCTCTTTTCG CGAACATTCG AGGCGCGCTC TCTCGAACCA 4740
ACGAGAGCAG TATGCCGTTT ACTGTGTGAC AGAGTGAGAG AGCATTAGTG CAGAGAGGGA 4800
GAGACCCAAA AAGAAAAGAG AGAATAACGA ATAACGGCCA GAGAAATTTC TCGAGTTTTC 4860
TTTCTGCCAA ACAAATGACC TACCACAATA ACCAGTTTGT TTTGGGATCT AGTCCCTAAT 4920
TCTAGTATGT ATGTAAGTTA ATAAAACCCT TTTTTGGAGA ATGTAGATTT AAAAAAACAT 4980
ATTTTTTTTT TATTTTTTAC TGCACTGGAC ATCATTGAAC TTATCTGATC AGTTTTAAAT 5040
TTACTTCGAT CCAAGGGTAT TTGAAGTACC AGGTTCTTTC GATTACCTCT CACTCAAAAT 5100
GACATTCCAC TCAAAGTCAG CGCTGTTTGC CTCCTTCTCT GTCCACAGAA ATATCGCCGT 5160
CTCTTTCGCC GCTGCGTCCG CTATCTCTTT CGCCACCGTT TGTAGCGTTA CCTAGCGTCA 5220
ATGTCCGCCT TCAGTTGCAC TTTGTCAGCG GTTTCGTGAC GAAGCTCCAA GCGGTTTACG 5280
CCATCAATTA AACACAAAGT GCTGTGCCAA AACTCCTCTC GCTTCTTATT TTTGTTTGTT 5340
TTTTGAGTGA TTGGGGTGGT GATTGGTTTT GGGTGGGTAA GCAGGGGAAA GTGTGAAAAA 5400
TCCCGGCAAT GGGCCAAGAG GATCAGGAGC TATTAATTCG CGGAGGCAGC AAACACCCAT 5460
CTGCCGAGCA TCTGAACAAT GTGAGTAGTA CATGTGCATA CATCTTAAGT TCACTTGATC 5520
TATAGGAACT GCGATTGCAA CATCAAATTG TCTGCGGCGT GAGAACTGCG ACCCACAAAA 5580
ATCCCAAACC GCAATCGCAC AAACAAATAG TGACACGAAA CAGATTATTC TGGTAGCTGT 5640
GCTCGCTATA TAAGACAATT TTTAAGATCA TATCATGATC AAGACATCTA AAGGCATTCA 5700
TTTTCGACTA CATTCTTTTT TACAAAAAAT ATAACAACCA GATATTTTAA GCTGATCCTA 5760
GATGCACAAA AAATAAATAA AAGTATAAAC CTACTTCGTA GGATACTTCG TTTTGTTCGG 5820
GGTTAGATGA GCATAACGCT TGTAGTTGAT ATTTGAGATC CCCTATCATT GCAGGGTGAC 5880
AGCGGACGCT TCGCAGAGCT GCATTAACCA GGGCTTCGGG CAGGCCAAAA ACTACGGCAC 5940
GCTCCTGCCA CCCAGTCCGC CGGAGGACTC CGGTTCAGGG AGCGGCCAAC TAGCCGAGAA 6000
CCTCACCTAT GCCTGGCACA ATATGGACAT CTTTGGGGCG GTCAATCAGC CGGGCTCCGG 6060
ATGGCGGCAG CTGGTCAACC GGACACGCGG ACTATTCTGC AACGAGCGAC ACATACCGGC 6120
GCCCAGGAAA CATTTGCTCA AGAACGGTGA GTTTCTATTC GCAGTCGGCT GATCTGTGTG 6180
AAATCTTAAT AAAGGGTCCA ATTACCAATT TGAAACTCAG TTTGCGGCGT GGCCTATCCG 6240
GGCGAACTTT TGGCCGTGAT GGGCAGTTCC GGTGCCGGAA AGACGACCCT GCTGAATGCC 6300
CTTGCCTTTC GATCGCCGCA GGGCATCCAA GTATCGCCAT CCGGGATGCG ACTGCTCAAT 6360
GGCCAACCTG TGGACGCCAA GGAGATGCAG GCCAGGTGCG CCTATGTCCA GCAGGATGAC 6420
CTCTTTATCG GCTCCCTAAC GGCCAGGGAA CACCTGATTT TCCAGGCCAT GGTGCGGATG 6480
CCACGACATC TGACCTATCG GCAGCGAGTG GCCCGCGTGG ATCAGGTGAT CCAGGAGCTT 6540
TCGCTCAGCA AATGTCAGCA CACGATCATC GGTGTGCCCG GCAGGGTGAA AGGTCTGTCC 6600
GGCGGAGAAA GGAAGCGTCT GGCATTCGCC TCCGAGGCAC TAACCGATCC GCCGCTTCTG 6660
ATCTGCGATG AGCCCACCTC CGGACTGGAC TCATTTACCG CCCACAGCGT CGTCCAGGTG 6720
CTGAAGAAGC TGTCGCAGAA GGGCAAGACC GTCATCCTGA CCATTCATCA GCCGTCTTCC 6780
GAGCTGTTTG AGCTCTTTGA CAAGATCCTT CTGATGGCCG AGGGCAGGGT AGCTTTCTTG 6840
GGCACTCCCA GCGAAGCCGT CGACTTCTTT TCCTAGTGAG TTCGATGTGT TTATTAAGGG 6900
TATCTAGCAT TACATTACAT CTCAACTCCT ATCCAGCGTG GGTGCCCAGT GTCCTACCAA 6960
CTACAATCCG GCGGACTTTT ACGTACAGGT GTTGGCCGTT GTGCCCGGAC GGGAGATCGA 7020
GTCCCGTGAT CGGATCGCCA AGATATGCGA CAATTTTGCT ATTAGCAAAG TAGCCCGGGA 7080
TATGGAGCAG TTGTTGGCCA CCAAAAATTT GGAGAAGCCA CTGGAGCAGC CGGAGAATGG 7140
GTACACCTAC AAGGCCACCT GGTTCATGCA GTTCCGGGCG GTCCTGTGGC GATCCTGGCT 7200
GTCGGTGCTC AAGGAACCAC TCCTCGTAAA AGTGCGACTT ATTCAGACAA CGGTGAGTGG 7260
TTCCAGTGGA AACAAATGAT ATAACGCTTA CAATTCTTGG AAACAAATTC GCTAGATTTT 7320
AGTTAGAATT GCCTGATTCC ACACCCTTCT TAGTTTTTTT CAATGAGATG TATAGTTTAT 7380
AGTTTTGCAG AAAATAAATA AATTTCATTT AACTCGCGAA CATGTTGAAG ATATGAATAT 7440
TAATGAGATG CGAGTAACAT TTTAATTTGC AGATGGTTGC CATCTTGATT GGCCTCATCT 7500
TTTTGGGCCA ACAACTCACG CAAGTGGGCG TGATGAATAT CAACGGAGCC ATCTTCCTCT 7560
TCCTGACCAA CATGACCTTT CAAAACGTCT TTGCCACGAT AAATGTAAGT CTTGTTTAGA 7620
ATACATTTGC ATATTAATAA TTTACTAACT TTCTAATGAA TCGATTCGAT TTAGGTGTTC 7680
ACCTCAGAGC TGCCAGTTTT TATGAGGGAG GCCCGAAGTC GACTTTATCG CTGTGACACA 7740
TACTTTCTGG GCAAAACGAT TGCCGAATTA CCGCTTTTTC TCACAGTGCC ACTGGTCTTC 7800
ACGGCGATTG CCTATCCGAT GATCGGACTG CGGGCCGGAG TGCTGCACTT CTTCAACTGC 7860
CTGGCGCTGG TCACTCTGGT GGCCAATGTG TCAACGTCCT TCGGATATCT AATATCCTGC 7920
GCCAGCTCCT CGACCTCGAT GGCGCTGTCT GTGGGTCCGC CGGTTATCAT ACCATTCCTG 7980
CTCTTTGGCG GCTTCTTCTT GAACTCGGGC TCGGTGCCAG TATACCTCAA ATGGTTGTCG 8040
TACCTCTCAT GGTTCCGTTA CGCCAACGAG GGTCTGCTGA TTAACCAATG GGCGGACGTG 8100
GAGCCGGGCG AAATTAGCTG CACATCGTCG AACACCACGT GCCCCAGTTC GGGCAAGGTC 8160
ATCCTGGAGA CGCTTAACTT CTCCGCCGCC GATCTGCCGC TGGACTACGT GGGTCTGGCC 8220
ATTCTCATCG TGAGCTTCCG GGTGCTCGCA TATCTGGCTC TAAGACTTCG GGCCCGACGC 8280
AAGGAGTAGA AGGTAAGTAG CGGCCGCACG TAAGGGTTAA TGTTTTCAAA AAAAAATTCG 8340
TCCGCACACA ACCTTTCCTC TCAACAAGCA AACGTGCACT GAATTTAAGT GTATACTTCG 8400
GTAAGCTTCG GCTATCGACG GGACCACCTT ATGTTATTTC ATCATGGGCC AGACCCACGT 8460
AGTCCAGCGG CAGATCGGCG GCGGAGAAGT TAAGCGTCTC CAGGATGACC TTGCCCGAAC 8520
TGGGGCACGT GGTGTTCGAC GATGTGCAGC TAATTTCGCC CGGCTCCACG TCCGCCCATT 8580
GGTTAATCAG CAGACCCTCG TTGGCGTAAC GGAACCATGA GAGGTACGAC AACCATTTGA 8640
GGTATACTGG CACCGAGCCC GAGTTCAAGA AGAAGGCGTT TTTCCATAGG CTCCGCCCCC 8700
CTGACGAGCA TCACAAAAAT CGACGCTCAA GTCAGAGGTG GCGAAACCCG ACAGGACTAT 8760
AAAGATACCA GGCGTTTCCC CCTGGAAGCT CCCTCGTGCG CTCTCCTGTT CCGACCCTGC 8820
CGCTTACCGG ATACCTGTCC GCCTTTCTCC CTTCGGGAAG CGTGGCGCTT TCTCAATGCT 8880
CACGCTGTAG GTATCTCAGT TCGGTGTAGG TCGTTCGCTC CAAGCTGGGC TGTGTGCACG 8940
AACCCCCCGT TCAGCCCGAC CGCTGCGCCT TATCCGGTAA CTATCGTCTT GAGTCCAACC 9000
CGGTAAGACA CGACTTATCG CCACTGGCAG CAGCCACTGG TAACAGGATT AGCAGAGCGA 9060
GGTATGTAGG CGGTGCTACA GAGTTCTTGA AGTGGTGGCC TAACTACGGC TACACTAGAA 9120
GGACAGTATT TGGTATCTGC GCTCTGCTGA AGCCAGTTAC CTTCGGAAAA AGAGTTGGTA 9180
GCTCTTGATC CGGCAAACAA ACCACCGCTG GTAGCGGTGG TTTTTTTGTT TGCAAGCAGC 9240
AGATTACGCG CAGAAAAAAA GGATCTCAAG AAGATCCTTT GATCTTTTCT ACGGGGTCTG 9300
ACGCTCAGTG GAACGAAAAC TCACGTTAAG GGATTTTGGT CATGAGATTA TCAAAAAGGA 9360
TCTTCACCTA GATCCTTTTA AATTAAAAAT GAAGTTTTAA ATCAATCTAA AGTATATATG 9420
AGTAAACTTG GTCTGACAGT TACCAATGCT TAATCAGTGA GGCACCTATC TCAGCGATCT 9480
GTCTATTTCG TTCATCCATA GTTGCCTGAC TCCCCGTCGT GTAGATAACT ACGATACGGG 9540
AGGGCTTACC ATCTGGCCCC AGTGCTGCAA TGATACCGCG AGACCCACGC TCACCGGCTC 9600
CAGATTTATC AGCAATAAAC CAGCCAGCCG GAAGGGCCGA GCGCAGAAGT GGTCCTGCAA 9660
CTTTATCCGC CTCCATCCAG TCTATTAATT GTTGCCGGGA AGCTAGAGTA AGTAGTTCGC 9720
CAGTTAATAG TTTGCGCAAC GTTGTTGCCA TTGCTACAGG CATCGTGGTG TCACGCTCGT 9780
CGTTTGGTAT GGCTTCATTC AGCTCCGGTT CCCAACGATC AAGGCGAGTT ACATGATCCC 9840
CCATGTTGTG CAAAAAAGCG GTTAGCTCCT TCGGTCCTCC GATCGTTGTC AGAAGTAAGT 9900
TGGCCGCAGT GTTATCACTC ATGGTTATGG CAGCACTGCA TAATTCTCTT ACTGTCATGC 9960
CATCCGTAAG ATGCTTTTCT GTGACTGGTG AGTACTCAAC CAAGTCATTC TGAGAATAGT 10020
GTATGCGGCG ACCGAGTTGC TCTTGCCCGG CGTCAACACG GGATAATACC GCGCCACATA 10080
GCAGAACTTT AAAAGTGCTC ATCATTGGAA AACGTTCTTC GGGGCGAAAA CTCTCAAGGA 10140
TCTTACCGCT GTTGAGATCC AGTTCGATGT AACCCACTCG TGCACCCAAC TGATCTTCAG 10200
CATCTTTTAC TTTCACCAGC GTTTCTGGGT GAGCAAAAAC AGGAAGGCAA AATGCCGCAA 10260
AAAAGGGAAT AAGGGCGACA CGGAAATGTT GAATACTCAT ACTCTTCCTT TTTCAATATT 10320
ATTGAAGCAT TTATCAGGGT TATTGTCTCA TGAGCGGATA CATATTTGAA TGTATTTAGA 10380
AAAATAAACA AATAGGGGTT CCGCGCACAT TTCCCCGAAA AGTGCCACCT GACGTCTAAG 10440
AAACCATTAT TATCATGACA TTAACCTATA AAAATAGGCG TATCACGAGG CCCTTTCGTC 10500
TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 10560
CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG 10620
TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 10680
ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACCGAA TCGCGCGGAA CTAACGACAG TCGCTCCAAG 10740
GTCGTCGAAC AAAAGGTGAA TGTGTTGCGG AGAGCGGGTG GGAGACAGCG AAAGAGCAAC 10800
TACGAAACGT GGTGTGGTGG AGGTGAATTA TGAAGAGGGC GCGCGATTTG AAAAGTATGT 10860
ATATAAAAAA TATATCCCGG TGTTTTATGT AGCGATAAAC GAGTTTTTGA TGTAAGGTAT 10920
GCAGGTGTGT AAGTCTTTTG GTTAGAAGAC AAATCCAAAG TCTACTTGTG GGGATGTTCG 10980
AAGGGGAAAT ACTTGTATTC TATAGGTCAT ATCTTGTTTT TATTGGCACA AATATAATTA 11040
CATTAGCTTT TTGAGGGGGC AATAAACAGT AAACACGATG GTAATAATGG TAAAAAAAAA 11100
AACAAGCAGT TATTTCGGAT ATATGTCGGC TACTCCTTGC GTCGGGCCCG AAGTCTTAGA 11160
GCCAGATATG CGAGCACCCG GAAGCTCACG ATGAGAATGG CCAGAC 11206
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のベクターであるpTrap-hsneo の概略地図である。
【図２】この発明のベクターであるpTrap-G4-p53の概略地図である。
【図３】この発明のベクターであるpCasperhs-G4-LT の概略地図である。
【図４】この発明のベクターであるpTrap-G4-lucの概略地図である。
【図５】クローニングのためにこの発明のベクターが挿入されたハエゲノムの概略図である。
【図６】 aop-Ｇal４およびm-white-aop 融合ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定結果である。
【図７】陽性遺伝子トラップ系統とＵＡＳ−ｌａｃＺ構築体を含有するハエとを交配して得たハエ脳の種々の部分における特徴的なベーターガラクトシダーゼ染色パターン像である。
Claims (16)
- 以下のヌクレオチド配列：
人工の共通スプライシング受容部位、
合成ストップ／スタート配列、
Ｇａｌ４遺伝子を含むレポーター遺伝子、
ヒートショックプロモーターを連結した薬剤耐性遺伝子、
その 3' 非翻訳領域に合成スプライシング供与部位を連結したミニ白眼遺伝子、
をこの順序で有する組換え体プラスミドであるキイロショウジョウバエの未知遺伝子トラップ用ベクター。 - 組換え体プラスミドが、pCasper3に由来するプラスミドである請求項１のベクター。
- レポーター遺伝子が、Ｇal４遺伝子単独である請求項１または２のベクター。
- 配列番号１のヌクレオチド配列を有する請求項３のベクター。
- レポーター遺伝子が、Ｇal４ＤＮＡ結合領域−ｐ５３融合遺伝子である請求項１または２のベクター。
- レポーター遺伝子が、Ｇal４−ほたるルシフェラーゼ融合遺伝子である請求項１または２のベクター。
- 薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子である請求項１ないし６のいずれかのベクター。
- Casperhs のポリクローニング部位内に、ヒートショックプロモーターと結合したＧal４活性化領域−ラージＴ抗原融合遺伝子を有するpCasperhs 由来ベクター。
- 以下のヌクレオチド配列：
人工の共通スプライシング受容部位、
合成ストップ／スタート配列、
Ｇａｌ４遺伝子を含むレポーター遺伝子、
ヒートショックプロモーターを連結した薬剤耐性遺伝子、
その 3' 非翻訳領域に合成スプライシング供与部位を連結したミニ白眼遺伝子、
をこの順序で有する組換え体プラスミドであるベクターを使用する方法であって、以下のステップ：
（ａ）白眼遺伝子を持たないハエのゲノムに前記ベクターを挿入し、
（ｂ）薬剤耐性である１次形質転換体を選択し、
（ｃ）１次形質転換体を転移酵素発現系統と交配させてベクターを他の位置に転移させ、
（ｄ）眼の色が濃いハエを採集することにより２次形質転換体を選択し、
（ｅ）２次形質転換体をＵＡＳ（上流活性化配列）−ルシフェラーゼ含有系統と交配し、産出したハエにおけるレポーター遺伝子の発現を測定し、
（ｆ）トラップされた遺伝子をクローニングにより同定し、レポーター遺伝子およびミニ白眼遺伝子に融合したｃＤＮＡ群の配列を決定する、ことからなるキイロショウジョウバエ未知遺伝子のトラップ方法。 - 組換え体プラスミドが、pCasper3に由来するプラスミドである請求項９の方法。
- ベクターのレポーター遺伝子がＧal４遺伝子単独であり、ステップ（ｅ）においてＧal４の発現を測定する請求項９または１０の方法。
- ベクターのレポーター遺伝子がＧal４−ほたるルシフェラーゼ融合遺伝子であり、ステップ（ｅ）において２次形質転換体をＵＡＳ−ルシフェラーゼ含有系統と交配せずにこの融合遺伝子の発現を測定する請求項９または１０の方法。
- 薬剤耐性遺伝子がネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子であり、ステップ（ｂ）でＧ４１８耐性形質転換体を選択する請求項９ないし１２のいずれかの方法。
- 以下のヌクレオチド配列：
人工の共通スプライシング受容部位、
合成ストップ／スタート配列、
レポーター遺伝子としてのＧal４ＤＮＡ結合領域−ｐ５３融合遺伝子、
ヒートショックプロモーターを連結した薬剤耐性遺伝子、
その 3' 非翻訳領域に合成スプライシング供与部位を連結したミニ白眼遺伝子、
をこの順序で有する組換え体プラスミドであるベクターＡ、およびpCasperhs のポリクローニング部位内にヒートショックプロモーターと結合したＧal４活性化領域−ラージＴ抗原融合遺伝子を有するpCasperhs由来ベクターＢを使用する方法であって、
（ａ）白眼遺伝子を持たない別個のハエのゲノムにベクターＡおよびベクターＢをそれぞれ挿入し、
（ｂ）薬剤耐性であるベクターＡの１次形質転換体を選択し、眼の色をもつベクターＢの１次形質転換体を選択し、
（ｃ）ベクターＡの１次形質転換体を転移酵素発現系統と交配してベクターを他の位置に転移させ、
（ｄ）眼の色が濃いハエを採集することによりベクターＡの２次形質転換体を選択し、
（ｅ）この２次形質転換体をベクターＢの１次形質転換体と交配してベクターＡとベクターＢの両者を有するハエを産出させ、
（ｆ）ステップ（ｅ）で得たハエをＵＡＳ−ルシフェラーゼ含有系統と交配して、その結果産出したハエにおけるレポーター遺伝子の発現を測定し、
（ｇ）トラップされた遺伝子をクローニングにより同定し、レポーター遺伝子およびミニ白眼遺伝子と融合したｃＤＮＡ群の配列を決定する、ことからなるキイロショウジョウバエの未知遺伝子のトラップ方法。 - ベクターＡがpCasper3に由来するプラスミドである請求項１４の方法。
- 薬剤耐性遺伝子がネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子であり、ステップ（ｂ）でＧ４１８耐性形質転換体を選択する請求項１４または１５の方法。
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