CN112342234B - 一种调控n-乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控N‑乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。本发明所述重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是以低产N‑乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌菌株作为出发菌株，通过正向响应N‑乙酰神经氨酸的生物传感器调控必需基因表达来偶联生长与合成，构建了一种细胞亚群调控回路，从而赋予高产细胞亚群生长优势，提高其在发酵过程中所占的比例，从而得到的一株高产N‑乙酰神经氨酸的重组菌株，其产量达到2.97g/l，是不进行细胞亚群调控的对照菌株的1.55倍。这为枯草芽孢杆菌代谢工程高效生产N‑乙酰神经氨酸奠定了基础。

Description

一种调控N-乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及一种调控N-乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在工业上应用十分广泛，在生产蛋白和高附加值化合物的生产上具有非常重要的地位。同时，它是一种非致病微生物，已经被美国食品和药物管理局(FDA)认可为安全的(GRAS)食品级微生物。此外，枯草芽孢杆菌具有许多优点，包括：细胞生长速率快，发酵培养时间短，培养条件要求低，易于进行代谢工程改造，分泌蛋白质能力强等。N-乙酰神经氨酸(NeuAc)又名唾液酸，燕窝酸，是一种重要的营养添加剂和药物中间体，在促进婴儿大脑发育，维持大脑健康和增强免疫力方面发挥着关键作用。

目前虽然在代谢工程改造中已有很多策略用于改善目标产物的生物合成，比如酶活性和表达水平优化、阻断竞争途径、中心代谢流重构等，但是这些策略都没有考虑到单细胞水平上生物合成能力的差异。随着单细胞检测技术的发展，研究表明由一个单克隆细胞发展而来的群体存在异质性，即在发酵过程中存在生产亚群、非生产亚群等。生产亚群因生产负担常常表现为降低的适应能力，然而，非生产亚群消耗营养物质却不能高效合成目标产物，可能将更多的营养物质用于生长，因此更加具有生长优势。因此，在发酵过程中，生产亚群会非生产细胞亚群所占的比例会逐步增加，从而占据整个生物反应器，降低产物合成的综合效率。目前还未有利用细胞自身的异质性改善枯草芽孢杆菌生物合成的先例。因此，此株高产NeuAc枯草芽孢杆菌菌株的构建不仅为高附加值化合物NeuAc发酵法大规模生产奠定了基础，还为枯草芽孢杆菌的代谢工程改造提供新的有效方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种调控重组枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸产量提高的方法。本发明利用可以正向响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器调控必需基因表达，构建一种细胞亚群调控回路，偶联生长与合成，从而赋予高产细胞亚群生长优势，提高其在发酵过程中所占的比例而提高NeuAc的产量。

本发明的第一个目的是提供细胞亚群调控回路，含有响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器和必需基因；

所述响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器包括：IPTG诱导型启动子P_grac2、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子P_veg105、必需基因；所述IPTG诱导型启动子P_grac2调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子P_veg105调控必需基因表达；所述启动子P_grac2和P_veg105转录方向相反；

所述必需基因包括但不限于二氢蝶呤醛缩酶基因folB和SEDS家族肽聚糖糖基转移酶基因ftsW。

在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路还含有阻遏蛋白lac I表达框；所述阻遏蛋白lac I表达框的转录方向与启动子P_grac2的转录方向相反。

在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路以pHT01为载体骨架。

在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路以pHT01为载体骨架，含有阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子P_grac2、RBS₀、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子P_veg105、RBS₁和必需基因folB；所述IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子P_veg105和RBS₁调控必需基因folB表达；所述lac I表达框和启动子P_grac2转录方向相反，启动子P_grac2和P_veg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因folB之间具有一个双向终止子。

在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路以pHT01为载体骨架，含有阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子P_grac2、RBS₀、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子P_veg105，RBS₁和必需基因ftsW；所述IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子P_veg105和RBS₁调控必需基因ftsW表达；所述lac I表达框和启动子P_grac2转录方向相反，启动子P_grac2和P_veg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因ftsW之间具有一个双向终止子。

在一种实施方式中，所述细胞亚群调控回路包括pHT01载体骨架、阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子P_grac2、RBS₀、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子P_veg105、N端编码序列N₁和必需基因ftsW；所述IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子P_veg105和必须基因ftsW之间依次设置RBS₀和N端编码序列N₁，所述启动子P_veg105、RBS₀和N端编码序列N₁调控必需基因ftsW表达；所述lac I表达框和启动子P_grac2转录方向相反，启动子P_grac2和P_veg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因ftsW之间具有一个双向终止子。

在一种实施方式中，pHT01载体骨架的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述lac I表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述IPTG诱导型启动子P_grac2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，RBS₀的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码转录调控蛋白nanR的基因序列如SEQ IDNO.5所示。

在一种实施方式中，启动子P_veg105的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；RBS₁的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，必需基因folB的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在一种实施方式中，必需基因ftsW的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在一种实施方式中，必需基因folB的N端序列N₁如SEQ ID NO.11所示

本发明的第二个目的是提供一种调控重组枯草芽孢杆菌提高N-乙酰神经氨酸产量的方法，是通过细胞亚群调控回路将受调控的细胞的生长和产物合成偶联，促进生产细胞亚群，抑制非生产细胞亚群。

在一种实施方式中，所述方法通过缺失所述重组枯草芽孢杆菌的必需基因folB或ftsW，再将所述细胞亚群调控回路转化至枯草芽孢杆菌细胞中。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以低产N-乙酰神经氨酸的重组菌株BgG-N abrB-30bp作为出发菌株，所述重组菌株BgG-N abrB-30bp的构建方法公开于TianR,Liu Y,Chen J,et al.Synthetic N-terminal coding sequences for fine-tuninggene expression and metabolic engineering in Bacillus subtilis.Metab Eng.中。

本发明的第三个目的是提供含有所述细胞亚群调控回路的重组枯草芽孢杆菌。

本发明还要求保护所述细胞亚群调控回路或所述重组枯草芽孢杆菌在N-乙酰神经氨酸的生产中的应用。

有益效果：本发明构建了一种细胞亚群调控回路，通过正向响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器调控必需基因表达来偶联生长与合成，从而赋予高产细胞亚群生长优势，提高其在发酵过程中所占的比例，从而得到的一株高产N-乙酰神经氨酸的重组菌株，其产量可达到2.97g/l，是不进行细胞亚群调控的对照菌株的1.55倍。

附图说明

图1为细胞亚群调控回路结构示意图。

图2为细胞亚群调控回路生长与合成偶联的效果。

具体实施方式

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

种子液培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉；发酵培养基配方为：40g/L葡萄糖，12g/L酵母粉，6g/L胰蛋白胨，6g/L硫酸铵，12g/L三水合磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，3g/L硫酸镁，6g/L尿素；

发酵过程为：挑取单菌落至有1.5ml发酵培养基(含有合适的抗生素，实验组根据需要添加0.1mM的IPTG或者2g/l NeuAc，对照组不添加IPTG)的24孔板中，于37℃、220rpm发酵60小时。

样品检测方法：首先，将发酵液离心后取上清，加入两倍体积35mM稀硫酸去除胞外蛋白。之后，使用离心机在1400rpm离心10min后，用0.22μm滤膜过滤后，使用液相色谱column(300×7.8mm)有机酸柱，检测波长为210nm。流动相采用10mM稀硫酸，流速为0.5mL/min柱温为40摄氏度。

实施例1细胞亚群调控回路1.1质粒构建

(1)以质粒pHT01-grac2序列(如SEQ ID NO.12)作为模板，以fp-HI2G-8k-f和fp-HI2G-8k-r为引物，PCR扩增获得带有lac I表达框和IPTG诱导型启动子P_grac2的pHT01载体骨架；

fp-HI2G-8k-r：GTGTACATTTCACCTCCTTTGGGGTTG；

fp-HI2G-8k-f：TTCACGTCACGCGTCCATGGAGATCTTTG；

(2)以响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器质粒Bbl-veg105(如SEQ ID NO.13)作为模板，以HI2Vfol-0.4k-2f和HI2Vfol-0.4k-2r为引物，PCR扩增获得有nanR结合位点的启动子P_veg105片段；

HI2Vfol-0.4k-1f：AAACGATATACCTTTATACCTGTTATACCATTGTACAACACGAGC；

HI2Vfol-0.4k-1r：

CAAAGATCTCCATGGACGCGTGACGTGAAGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCG；

(3)以HI2Vfol-0.4k-2f和HI2Vfol-0.4k-2r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌168进行菌落PCR，扩增获得SEQ ID NO.9所示的必需基因folB片段；

HI2Vfol-0.4k-2f：

CCTCTGCAGGTTTTTTCTGGCTCCATCATGACTTTTTTCTCGTAATTTCAATTGCTACTGAT；

HI2Vfol-0.4k-2r：

TGGTATAACAGGTATAAAGGTATATCGTTTGGAGAGCTAGCCTATGGATAAAGTTTATGTAGAAGGTATGGAGTTTTACGGA；

(4)以响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器质粒Bbl-veg105序列(如SEQ ID NO.11)作为模板，以HI2Vfol-1k-3f和HI2Vfol-1k-3r为引物，PCR扩增获得SEQ ID NO.5所示的编码nanR蛋白的基因片段；

HI2Vfol-1k-3f：

CAACCCCAAAGGAGGTGAAATGTACACATGGGCCTTATGAACGCATTTGATTC；

HI2Vfol-1k-3r：TGGAGCCAGAAAAAACCTGCAGAGG；

将上述4个片段纯化回收，利用Gibson Assembly Clonging Kit(New EnglandBiolabs)进行连接，构建细胞亚群调控回路1.1，待平板上长出转化子后，通过菌落PCR和测序，确认其构建成功。在构建好的细胞亚群调控回路1.1中，IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；启动子P_veg105和RBS₁调控必需基因folB表达；lac I表达框和启动子P_grac2转录方向相反，启动子P_grac2和P_veg105转录方向相对。

实施例2细胞亚群调控回路1.2质粒构建

(1)以质粒pHT01-grac2(如SEQ ID NO.12)作为模板，以fp-HI2G-8k-f和fp-HI2G-8k-r为引物，PCR扩增带有lac I表达框和IPTG诱导型启动子P_grac2的pHT01载体骨架；

fp-HI2G-8k-r：GTGTACATTTCACCTCCTTTGGGGTTG；

fp-HI2G-8k-f：TTCACGTCACGCGTCCATGGAGATCTTTG；

(2)以响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器质粒Bbl-veg105序列(如SEQ ID NO.13)作为模板，以HI2Vfol-0.4k-1f和HI2Vfol-0.4k-1fr为引物PCR扩增获得含有nanR结合位点的启动子veg105片段(如SEQ ID NO.7所示)；

HI2Vfol-0.4k-1f：AAACGATATACCTTTATACCTGTTATACCATTGTACAACACGAGC；

HI2Vfol-0.4k-1r：

CAAAGATCTCCATGGACGCGTGACGTGAAGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCG；

(3)以HI2VftsW-1.2-2f和HI2VftsW-1.2-2r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌168进行菌落PCR，扩增获得SEQ ID NO.10所示的必需基因ftsW片段；

HI2VftsW-1.2-2f：

CCTCTGCAGGTTTTTTCTGGCTCCATTACAGATAAACAGTTTTTTTGAGCTGTTTCTTTTTCATTCCCT；

HI2VftsW-1.2-2r：

GGTATAACAGGTATAAAGGTATATCGTTTGGAGAGCTAGCCTATGTTAAAAAAAATGCTAAAATCTTATGATTACTCACTGATATTCGCA；

(4)以响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器质粒Bbl-veg105序列(如SEQ ID NO.13)作为模板，以HI2Vfol-1k-3f和HI2Vfol-1k-3r为引物，PCR扩增获得SEQ ID NO.5所示的编码nanR蛋白的基因片段；

HI2Vfol-1k-3f：

CAACCCCAAAGGAGGTGAAATGTACACATGGGCCTTATGAACGCATTTGATTC；

HI2Vfol-1k-3r：TGGAGCCAGAAAAAACCTGCAGAGG；

将上述4个片段纯化回收，利用Gibson Assembly Clonging Kit(New EnglandBiolabs)进行连接，构建细胞亚群调控回路1.2，待平板上长出转化子后，通过菌落PCR和测序，确认其构建成功。在构建好的细胞亚群调控回路1.1中，IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；启动子P_veg105和RBS₁调控必需基因ftsW表达；lac I表达框和启动子P_grac2转录方向相反，启动子P_grac2和P_veg105转录方向相对。

实施例3细胞亚群调控回路1.3质粒构建

2HI2VftsW-N4-10f：

ACGAGTTCAATGACAACGCGATCACCTAATGGCTTTAACAAAGGCTAGCCTCCTAAACGATATACCTTTATACCTGTTATACCATTGTAC；

2HI2VftsW-N4-10r：

ATCGCGTTGTCATTGAACTCGTAGAATTAAAAAAAATGCTAAAATCTTATGATTACTCACTGATATTCGCA；

以实施例2获得的测序正确的质粒作为模板，以2HI2VftsW-N4-10f和2HI2VftsW-N4-10r为引物，PCR扩增细胞亚群调控回路1.3，纯化后直接转入大肠杆菌JM109，待平板上长出转化子后，通过菌落PCR和测序，确认其构建成功。

在构建好的细胞亚群调控回路1.3中，IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；启动子P_veg105、RBS₀和N端编码序列N₁调控必需基因ftsW表达；lac I表达框和启动子P_grac2转录方向相反，启动子P_grac2和P_veg105转录方向相对。

实施例4构建敲除基因组上必需基因拷贝的敲除框

1、构建fol敲除框

(1)利用引物qc-folB-1.2k-1f和qc-folB-1.2k-1r对野生型枯草芽孢杆菌168进行菌落PCR，扩增获得fol1片段；

qc-folB-1.2k-1f：AGCTAGAAGCTCTCTTGACAGCT；

qc-folB-1.2k-1r：

GTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCTTGCTTAAATCCAGCTCAGCGGT；

(2)以质粒P7S6为模板，以3p7s6-1.3f和3p7s6-1.3r为引物，PCR扩增获得fol2片段

3p7s6-1.3f：GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC；

3p7s6-1.3r：TAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC；

(3)以qc-folB-1.2k-3f和qc-folB-1.2k-3r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，扩增获得fol3片段。

qc-folB-1.2k-3f：

GACTGGGAAAACCCTGGCGTTAACCTTGAGCAAACGATCAACTATGCT；

qc-folB-1.2k-3r：CTCCCGCATCGCATTTTGTAATCT；

(4)纯化fol1、fol2和fol3片段，最后通过融合PCR的方式，将三个片段融合后扩增，构建fol敲除框。

2、构建fts敲除框

(1)以qc-FtsW-1k-1f和qc-FtsW-1k-1r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，扩增获得fts1片段；

qc-FtsW-1k-1f：GGAAGTGGCTGAATCTGAATACAGCACTTCAATGA；

2qc-FtsW-1k-1r：CGCTCAACATCCTCTTCCCTGCTTCTAACTTCCATTATCT；

(2)以质粒P7S6为模板，以qc-FtsW-1.3-2f和qc-FtsW-1.3-2r为引物，PCR扩增获得fts2片段；

qc-FtsW-1.3-2f：

AGTTAGAAGCAGGGAAGAGGATGTTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC；

qc-FtsW-1.3-2r：

GGATGGCAATCATGCTTGAAATGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；

(3)以2qc-FtsW-1.1k-3f和2qc-FtsW-1.1k-3r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌168进行菌落PCR，扩增获得fts3片段。

2qc-FtsW-1.1k-3f：CTGGCGTTACATTTCAAGCATGATTGCCATCCAGTCGT；

qc-FtsW-1.1k-3r：CCTCACAAATTTGGTCCCTTAATTCAGGTGACAG；

(4)纯化fts1、fts2和fts3片段，最后通过融合PCR的方式，将三个片段融合后扩增，构建fts敲除框。

实施例5细胞亚群调控回路对菌株生长与合成的偶联调控

(1)利用引物cr-nanT-1.3k-1f和cr-nanT-1.3k-1r对枯草芽孢杆菌BgG-N abrB-30b(构建方法公开于论文《Synthetic N-terminal coding sequences for fine-tuninggene expression and metabolic engineering in Bacillus subtilis》中)进行菌落PCR，扩增获得nanT1片段；

cr-nanT-1.3k-1f：gagtacttaaacacaaatcgtgacggct；

cr-nanT-1.3k-1r：tgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcaagctgtccggcaacatcag；

(2)以质粒P7ZP43(序列如：如SEQ ID NO.14)为模板，以p7ZP43-1.5f和p7ZP43-1.5r为引物，PCR扩增获得nanT2片段；

p7ZP43-1.5f：gagcggataacaatttcacacaggaaaca；

p7ZP43-1.5r：gtgtacattcctctcttacctataatggtaccg；

(3)以cr-nanT-1.5k-3f和cr-nanT-1.5k-3r为引物，对大肠杆菌进行菌落PCR，扩增获得nanT3片段。

cr-nanT-1.5k-3f：cggtaccattataggtaagagaggaatgtacacatgagtactacaacccagaatatcccgt；

cr-nanT-1.5k-3r：

cgggatttcccggcagtctgacaagttattctgcaatagacacttttccttaacttttggttttgactaaatcgtttttggcg；

(4)以cr-nanT-1.3k-4f和cr-nanT-1.3k-4r为引物，对枯草芽孢杆菌BgG-N abrB-30bp进行菌落PCR，扩增获得nanT4片段。

cr-nanT-1.3k-4f：gaataacttgtcagactgccgggaaatcccggcagtcttttttccattgcctgcaagcttttccagct；

cr-nanT-1.3k-4r：acactcgtagccatcctagttatcact；

(5)纯化nanT1、nanT2、nanT3和nanT4片段，最后通过融合PCR的方式，将四个片段融合后扩增，构建nanT整合框，随后将其转入枯草芽孢杆菌BgG-N abrB-30bp，获得重组枯草芽孢杆菌BgG-N abrB-30bp-nanT。

将实施例1构建的细胞亚群调控回路1.1质粒转入BgG-N abrB-30bp-nanT中，然后利用fol敲除框将其基因组上的必需基因folB拷贝敲除，构建含有细胞亚群调控回路1.1的重组枯草芽孢杆菌细胞；

将细胞亚群调控回路1.2质粒和1.3质粒分别转入异源表达nanT的枯草芽孢杆菌BgG-N abrB-30bp，然后利用fts敲除框将其基因组上的必需基因ftsW拷贝敲除，构建含有细胞亚群调控回路1.2或1.3的重组枯草芽孢杆菌细胞。

挑取带有细胞亚群调控回路1.1、1.2或1.3的重组枯草芽孢杆菌的单菌落于有1.5ml发酵培养基的24孔板中，于37℃、220rpm发酵48小时，监测菌株生长，检测生长与合成偶联效果。两个实验组：一个实验组在培养基中添加0.1mM IPTG，一个实验组在培养基中添加0.1mM IPTG和2g/l NeuAc；一个对照组：不添加IPTG。因为枯草芽孢杆菌自身不能将胞外的N-乙酰神经氨酸转运进胞内，所以在验证偶联效果时异源表达了来源于大肠杆菌的转运蛋白nanT。结果如图2所示，添加IPTG后，在不添加N-乙酰神经氨酸的环境中细胞生长受到抑制，添加N-乙酰神经氨酸可以使细胞恢复生长，这表明细胞生长与N-乙酰神经氨酸的合成成功偶联，细胞亚群调控回路可以赋予生产细胞亚群生长优势。

实施例6细胞亚群调控对NeuAc合成的影响

将实施例1构建的细胞亚群调控回路1.1质粒转入枯草芽孢杆菌BgG-N abrB-30bp(构建方法公开于论文《Synthetic N-terminal coding sequences for fine-tuninggene expression and metabolic engineering in Bacillus subtilis》中)，然后利用实施例5构建的fol敲除框将其基因组上的必需基因folB拷贝敲除，构建含有细胞亚群调控回路1.1的重组枯草芽孢杆菌；将细胞亚群调控回路1.2质粒和1.3质粒分别转入枯草芽孢杆菌BgG-N abrB-30bp，然后利用fts敲除框将其基因组上的必需基因ftsW拷贝敲除，构建含有细胞亚群调控回路1.2或1.3的重组枯草芽孢杆菌。随后挑取带有细胞亚群调控回路1.1、1.2和1.3的单菌落于有1.5ml发酵培养基(添加有终浓度为0.1mM的IPTG)的24孔板中，于37℃、220rpm发酵60小时。以不添加IPTG作为对照。

表1细胞亚群调控回路对NeuAc合成的影响

结果显示，利用生物传感器调控必需基因表达后，不进行细胞亚群调控的对照菌对应的NeuAc的产量约为1.9g/L，经过细胞亚群调控的NeuAc产量可提高至2.70～2.97g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种调控N-乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌

<130> BAA200085A

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6315

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccatggaga tctttgtctg caactgaaaa gtttatacct tacctggaac aaatggttga 60

aacatacgag gctaatatcg gcttattagg aatagtccct gtactaataa aatcaggtgg 120

atcagttgat cagtatattt tggacgaagc tcggaaagaa tttggagatg acttgcttaa 180

ttccacaatt aaattaaggg aaagaataaa gcgatttgat gttcaaggaa tcacggaaga 240

agatactcat gataaagaag ctctaaaact attcaataac cttacaatgg aattgatcga 300

aagggtggaa ggttaatggt acgaaaatta ggggatctac ctagaaagcc acaaggcgat 360

aggtcaagct taaagaaccc ttacatggat cttacagatt ctgaaagtaa agaaacaaca 420

gaggttaaac aaacagaacc aaaaagaaaa aaagcattgt tgaaaacaat gaaagttgat 480

gtttcaatcc ataataagat taaatcgctg cacgaaattc tggcagcatc cgaagggaat 540

tcatattact tagaggatac tattgagaga gctattgata agatggttga gacattacct 600

gagagccaaa aaacttttta tgaatatgaa ttaaaaaaaa gaaccaacaa aggctgagac 660

agactccaaa cgagtctgtt tttttaaaaa aaatattagg agcattgaat atatattaga 720

gaattaagaa agacatggga ataaaaatat tttaaatcca gtaaaaatat gataagatta 780

tttcagaata tgaagaactc tgtttgtttt tgatgaaaaa acaaacaaaa aaaatccacc 840

taacggaatc tcaatttaac taacagcggc caaactgaga agttaaattt gagaagggga 900

aaaggcggat ttatacttgt atttaactat ctccatttta acattttatt aaaccccata 960

caagtgaaaa tcctctttta cactgttcct ttaggtgatc gcggagggac attatgagtg 1020

aagtaaacct aaaaggaaat acagatgaat tagtgtatta tcgacagcaa accactggaa 1080

ataaaatcgc caggaagaga atcaaaaaag ggaaagaaga agtttattat gttgctgaaa 1140

cggaagagaa gatatggaca gaagagcaaa taaaaaactt ttctttagac aaatttggta 1200

cgcatatacc ttacatagaa ggtcattata caatcttaaa taattacttc tttgattttt 1260

ggggctattt tttaggtgct gaaggaattg cgctctatgc tcacctaact cgttatgcat 1320

acggcagcaa agacttttgc tttcctagtc tacaaacaat cgctaaaaaa atggacaaga 1380

ctcctgttac agttagaggc tacttgaaac tgcttgaaag gtacggtttt atttggaagg 1440

taaacgtccg taataaaacc aaggataaca cagaggaatc cccgattttt aagattagac 1500

gtaaggttcc tttgctttca gaagaacttt taaatggaaa ccctaatatt gaaattccag 1560

atgacgagga agcacatgta aagaaggctt taaaaaagga aaaagagggt cttccaaagg 1620

ttttgaaaaa agagcacgat gaatttgtta aaaaaatgat ggatgagtca gaaacaatta 1680

atattccaga ggccttacaa tatgacacaa tgtatgaaga tatactcagt aaaggagaaa 1740

ttcgaaaaga aatcaaaaaa caaataccta atcctacaac atcttttgag agtatatcaa 1800

tgacaactga agaggaaaaa gtcgacagta ctttaaaaag cgaaatgcaa aatcgtgtct 1860

ctaagccttc ttttgatacc tggtttaaaa acactaagat caaaattgaa aataaaaatt 1920

gtttattact tgtaccgagt gaatttgcat ttgaatggat taagaaaaga tatttagaaa 1980

caattaaaac agtccttgaa gaagctggat atgttttcga aaaaatcgaa ctaagaaaag 2040

tgcaataaac tgctgaagta tttcagcagt tttttttatt tagaaatagt gaaaaaaata 2100

taatcaggga ggtatcaata tttaatgagt actgatttaa atttatttag actggaatta 2160

ataattaaca cgtagactaa ttaaaattta atgagggata aagaggatac aaaaatatta 2220

atttcaatcc ctattaaatt ttaacaaggg ggggattaaa atttaattag aggtttatcc 2280

acaagaaaag accctaataa aatttttact agggttataa cactgattaa tttcttaatg 2340

ggggagggat taaaatttaa tgacaaagaa aacaatcttt taagaaaagc ttttaaaaga 2400

taataataaa aagagctttg cgattaagca aaactcttta ctttttcatt gacattatca 2460

aattcatcga tttcaaattg ttgttgtatc ataaagttaa ttctgttttg cacaaccttt 2520

tcaggaatat aaaacacatc tgaggcttgt tttataaact cagggtcgct aaagtcaatg 2580

taacgtagca tatgatatgg tatagcttcc acccaagtta gcctttctgc ttcttctgaa 2640

tgtttttcat atacttccat gggtatctct aaatgatttt cctcatgtag caaggtatga 2700

gcaaaaagtt tatggaattg atagttcctc tctttttctt caactttttt atctaaaaca 2760

aacactttaa catctgagtc aatgtaagca taagatgttt ttccagtcat aatttcaatc 2820

ccaaatcttt tagacagaaa ttctggacgt aaatcttttg gtgaaagaat ttttttatgt 2880

agcaatatat ccgatacagc accttctaaa agcgttggtg aatagggcat tttacctatc 2940

tcctctcatt ttgtggaata aaaatagtca tattcgtcca tctacctatc ctattatcga 3000

acagttgaac tttttaatca aggatcagtc ctttttttca ttattcttaa actgtgctct 3060

taactttaac aactcgattt gtttttccag atctcgaggg taactagcct cgccgatccc 3120

gcaagaggcc cggcagtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 3180

tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 3240

gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 3300

tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 3360

aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 3420

cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 3480

agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 3540

ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 3600

tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 3660

tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 3720

caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 3780

accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 3840

attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 3900

ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 3960

taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 4020

taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 4080

aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 4140

agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 4200

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 4260

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 4320

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 4380

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 4440

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 4500

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 4560

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 4620

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 4680

acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 4740

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 4800

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 4860

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 4920

ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 4980

taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 5040

cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcatgctta agttattggt 5100

atgactggtt ttaagcgcaa aaaaagttgc tttttcgtac ctattaatgt atcgttttag 5160

aaaaccgact gtaaaaagta cagtcggcat tatctcatat tataaaagcc agtcattagg 5220

cctatctgac aattcctgaa tagagttcat aaacaatcct gcatgataac catcacaaac 5280

agaatgatgt acctgtaaag atagcggtaa atatattgaa ttacctttat taatgaattt 5340

tcctgctgta ataatgggta gaaggtaatt actattatta ttgatattta agttaaaccc 5400

agtaaatgaa gtccatggaa taatagaaag agaaaaagca ttttcaggta taggtgtttt 5460

gggaaacaat ttccccgaac cattatattt ctctacatca gaaaggtata aatcataaaa 5520

ctctttgaag tcattcttta caggagtcca aataccagag aatgttttag atacaccatc 5580

aaaaattgta taaagtggct ctaacttatc ccaataacct aactctccgt cgctattgta 5640

accagttcta aaagctgtat ttgagtttat cacccttgtc actaagaaaa taaatgcagg 5700

gtaaaattta tatccttctt gttttatgtt tcggtataaa acactaatat caatttctgt 5760

ggttatacta aaagtcgttt gttggttcaa ataatgatta aatatctctt ttctcttcca 5820

attgtctaaa tcaattttat taaagttcat ttgatatgcc tcctaaattt ttatctaaag 5880

tgaatttagg aggcttactt gtctgctttc ttcattagaa tcaatccttt tttaaaagtc 5940

aatattactg taacataaat atatatttta aaaatatccc actttatcca attttcgttt 6000

gttgaactaa tgggtgcttt agttgaagaa taaaagacca cattaaaaaa tgtggtcttt 6060

tgtgtttttt taaaggattt gagcgtagcg aaaaatcctt ttctttctta tcttgataat 6120

aagggtaact attgccgatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc 6180

tagcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 6240

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 6300

ccagggtttt cccag 6315

<210> 2

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaaagaatg atgtaagcgt gaaaaatttt ttaaaaaatc tcttgacatt ggaagggaga 60

tatgttatta taagaattgc ggaattgtga gcggataaca attcataatt gtgagcggat 120

aacaattcaa ccccaaagga ggtgaaatgt acac 154

<210> 3

<211> 1523

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgctcccttt tccgttagct ttttcacccc cgtaccgatt atgttacaat agctggtacc 60

aagctaattc cggtggaaac gaggtcatca tttccttccg aaaaaacggt tgcatttaaa 120

tcttacatat gtaatacttt caaagactac atttgtaaga tttgatgttt gagtcggctg 180

aaagatcgta cgtaccaatt attgtttcgt gattgttcaa gccataacac tgtagggata 240

gtggaaagag tgcttcatct ggttacgatc aatcaaatat tcaaacggag ggagacgatt 300

ttgatgaaac cagtaacgtt atacgatgtc gcagagtatg ccggtgtctc ttatcagacc 360

gtttcccgcg tggtgaacca ggccagccac gtttctgcga aaacgcggga aaaagtggaa 420

gcggcgatgg cggagctgaa ttacattccc aaccgcgtgg cacaacaact ggcgggcaaa 480

cagtcgttgc tgattggcgt tgccacctcc agtctggccc tgcacgcgcc gtcgcaaatt 540

gtcgcggcga ttaaatctcg cgccgatcaa ctgggtgcca gcgtggtggt gtcgatggta 600

gaacgaagcg gcgtcgaagc ctgtaaaacg gcggtgcaca atcttctcgc gcaacgcgtc 660

agtgggctga tcattaacta tccgctggat gaccaggatg ccattgctgt ggaagctgcc 720

tgcactaatg ttccggcgtt atttcttgat gtctctgacc agacacccat caacagtatt 780

attttctccc atgaagacgg tacgcgactg ggcgtggagc atctggtcgc attgggtcac 840

cagcaaatcg cgctgttagc gggcccatta agttctgtct cggcgcgtct gcgtctggct 900

ggctggcata aatatctcac tcgcaatcaa attcagccga tagcggaacg ggaaggcgac 960

tggagtgcca tgtccggttt tcaacaaacc atgcaaatgc tgaatgaggg catcgttccc 1020

actgcgatgc tggttgccaa cgatcagatg gcgctgggcg caatgcgcgc cattaccgag 1080

tccgggctgc gcgttggtgc ggatatctcg gtagtgggat acgacgatac cgaagacagc 1140

tcatgttata tcccgccgtt aaccaccatc aaacaggatt ttcgcctgct ggggcaaacc 1200

agcgtggacc gcttgctgca actctctcag ggccaggcgg tgaagggcaa tcagctgttg 1260

cccgtctcac tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca atacgcaaac cgcctctccc 1320

cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 1380

cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta aggcctgagc tccgccctgc cactttagtg 1440

aagcagatcg cattataagc tttctgtatg gggtgttttt attacaaaac gcctgcgcaa 1500

taacgcaggc gttctgtgac att 1523

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaggaggtg aaatgtacac 20

<210> 5

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgggcctta tgaacgcatt tgattcgcaa accgaagatt cttcacctgc aattggtcgc 60

aacttgcgta gccgcccgct ggcgcgtaaa aaactctccg aaatggtgga agaagagctg 120

gaacagatga tccgccgtcg tgaatttggc gaaggtgaac aattaccgtc tgaacgcgaa 180

ctgatggcgt tctttaacgt cgggcgtcct tcggtgcgtg aagcgctggc agcgttaaaa 240

cgcaaaggtc tggtgcaaat aaacaacggc gaacgcgctc gcgtctcgcg tccttctgcg 300

gacactatca tcggtgagct ttccggcatg gcgaaagatt tcctttctca tcccggtggg 360

attgcccatt tcgaacaatt acgtctgttc tttgaatcca gtctggtgcg ctatgcggct 420

gaacatgcca ccgatgagca aatcgatttg ctggcaaaag cactggaaat caacagtcag 480

tcgctggata acaacgcggc attcattcgt tcagacgttg atttccaccg cgtgctggcg 540

gagatccccg gtaacccaat cttcatggcg atccacgttg ccctgctcga ctggcttatt 600

gccgcacgcc caacggttac cgatcaggca ctgcacgaac ataacaacgt tagttatcaa 660

cagcatattg cgatcgttga tgcgatccgc cgtcatgatc ctgacgaagc cgatcgtgcg 720

ttgcaatcgc atctcaacag cgtctctgct acctggcacg ctttcggtca gaccaccaac 780

aaaaagaaat aa 792

<210> 6

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gly Leu Met Asn Ala Phe Asp Ser Gln Thr Glu Asp Ser Ser Pro

1 5 10 15

Ala Ile Gly Arg Asn Leu Arg Ser Arg Pro Leu Ala Arg Lys Lys Leu

20 25 30

Ser Glu Met Val Glu Glu Glu Leu Glu Gln Met Ile Arg Arg Arg Glu

35 40 45

Phe Gly Glu Gly Glu Gln Leu Pro Ser Glu Arg Glu Leu Met Ala Phe

50 55 60

Phe Asn Val Gly Arg Pro Ser Val Arg Glu Ala Leu Ala Ala Leu Lys

65 70 75 80

Arg Lys Gly Leu Val Gln Ile Asn Asn Gly Glu Arg Ala Arg Val Ser

85 90 95

Arg Pro Ser Ala Asp Thr Ile Ile Gly Glu Leu Ser Gly Met Ala Lys

100 105 110

Asp Phe Leu Ser His Pro Gly Gly Ile Ala His Phe Glu Gln Leu Arg

115 120 125

Leu Phe Phe Glu Ser Ser Leu Val Arg Tyr Ala Ala Glu His Ala Thr

130 135 140

Asp Glu Gln Ile Asp Leu Leu Ala Lys Ala Leu Glu Ile Asn Ser Gln

145 150 155 160

Ser Leu Asp Asn Asn Ala Ala Phe Ile Arg Ser Asp Val Asp Phe His

165 170 175

Arg Val Leu Ala Glu Ile Pro Gly Asn Pro Ile Phe Met Ala Ile His

180 185 190

Val Ala Leu Leu Asp Trp Leu Ile Ala Ala Arg Pro Thr Val Thr Asp

195 200 205

Gln Ala Leu His Glu His Asn Asn Val Ser Tyr Gln Gln His Ile Ala

210 215 220

Ile Val Asp Ala Ile Arg Arg His Asp Pro Asp Glu Ala Asp Arg Ala

225 230 235 240

Leu Gln Ser His Leu Asn Ser Val Ser Ala Thr Trp His Ala Phe Gly

245 250 255

Gln Thr Thr Asn Lys Lys Lys

260

<210> 7

<211> 319

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tatgggaagt gctccgtaat acgctgacaa gagagaaagg gcttggaggt attgaaacaa 60

gaggagttct gagaattggt atgccttata agtccaatta acagttgaaa acctgcatag 120

gagagctatg cgggtttttt attttacata atgatacata atttaccgaa acttgcggaa 180

cataattgag gaatcataga attttgtcaa aataatttta ttgacaacgt cttattaacg 240

ttgatataat ttaaatttta tttgacaaaa atgggctcgt gttgtacaat ggtataacag 300

gtataaaggt atatcgttt 319

<210> 8

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggagagctag cct 13

<210> 9

<211> 360

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 9

atggataaag tttatgtaga aggtatggag ttttacggat atcacggtgt gttcacagaa 60

gaaaacaaac ttggccagcg gtttaaagtc gatttaaccg ctgagctgga tttaagcaaa 120

gctggacaga cagacgacct tgagcaaacg atcaactatg ctgagctcta tcacgtatgt 180

aaagatatcg tggaagggga gcctgtgaaa ttggtggaaa cgctggcgga acgtattgct 240

ggcactgttc tcggaaaatt tcagcctgtt cagcaatgta cggtgaaagt gattaagcca 300

gacccgccaa ttcccggaca ctataaatca gtagcaattg aaattacgag aaaaaagtca 360

<210> 10

<211> 1212

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 10

atgttaaaaa aaatgctaaa atcttatgat tactcactga tattcgcaat cgttttatta 60

tgcggattcg gtttagtgat ggtatacagc tcaagcatga ttacggctgt ctcccggtat 120

ggagtaagca gtaatttttt cttcatgcgg cagctgtttg ctttaattgc gggtggcgct 180

ctatttattc tcatggcgtt gtttccttat aaagcactgg cccatcaaaa gtttcagaag 240

gggatactgc ttgtatctgt tcttgcgctt atctcactgt ttgttttcgg gcatgttgcc 300

ggaaacgcgc agagctggtt taaaatcggc ggaatgagta ttcagccggg ggagtttgtg 360

aaactggtcg tgattttata ccttgcagcc gtatatgcaa aaaaacaaag ttatatcgac 420

catctgttaa cgggagtagc ccctccggta gtcatgacgc ttataatttg tgggttaatt 480

gccatgcagc cagatttcgg tacagccatg attatagggt taattgcgac gtgcatgatc 540

ttgtgctccg gcttcagcgg aaagacgctg gtgaggcttg tgatactggg cggaattgtt 600

ttcattttag tcagccctat tatctatttg aatcaggaca aaattttaac tgaaggccgt 660

ttagcgcgtt ttgagagtct tgaagaccca tttaagtatg caaattcatc aggtttgcaa 720

gtgatcaatt cttattatgc gatcagctca ggcggcattt tcggcctggg gctcggtgaa 780

agtatccaaa aatacggata tctgcctgaa tcacacactg actttattat ggctgtcatt 840

gctgaagagc tcggcatttt tggggtattg tttgtgattt tcttattggg ttttgtcgtc 900

ataaaaggtt tttatattgc cagaaaatgc gaggacccgt ttggaagtct tctggcgatc 960

ggcatttcaa gcatgattgc catccagtcg tttattaacc ttggcggtgt cagcggatta 1020

attccgatta caggggttac gctgccattt atcagttacg ggggctcttc tttggtgctg 1080

ctgctgggga gtatggggat attagcgaat atcagcatgt ttgtgaaata ttcagagaat 1140

aagaaaaaga aagagccctt ggcgccgaag ggaatgaaaa agaaacagct caaaaaaact 1200

gtttatctgt aa 1212

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgttaaagc cattaggtga tcgcgttgtc attgaactcg tagaa 45

<210> 12

<211> 8857

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tattggtatg actggtttta agcgcaaaaa aagttgcttt ttcgtaccta ttaatgtatc 60

gttttagaaa accgactgta aaaagtacag tcggcattat ctcatattat aaaagccagt 120

cattaggcct atctgacaat tcctgaatag agttcataaa caatcctgca tgataaccat 180

cacaaacaga atgatgtacc tgtaaagata gcggtaaata tattgaatta cctttattaa 240

tgaattttcc tgctgtaata atgggtagaa ggtaattact attattattg atatttaagt 300

taaacccagt aaatgaagtc catggaataa tagaaagaga aaaagcattt tcaggtatag 360

gtgttttggg aaacaatttc cccgaaccat tatatttctc tacatcagaa aggtataaat 420

cataaaactc tttgaagtca ttctttacag gagtccaaat accagagaat gttttagata 480

caccatcaaa aattgtataa agtggctcta acttatccca ataacctaac tctccgtcgc 540

tattgtaacc agttctaaaa gctgtatttg agtttatcac ccttgtcact aagaaaataa 600

atgcagggta aaatttatat ccttcttgtt ttatgtttcg gtataaaaca ctaatatcaa 660

tttctgtggt tatactaaaa gtcgtttgtt ggttcaaata atgattaaat atctcttttc 720

tcttccaatt gtctaaatca attttattaa agttcatttg atatgcctcc taaattttta 780

tctaaagtga atttaggagg cttacttgtc tgctttcttc attagaatca atcctttttt 840

aaaagtcaat attactgtaa cataaatata tattttaaaa atatcccact ttatccaatt 900

ttcgtttgtt gaactaatgg gtgctttagt tgaagaataa aagaccacat taaaaaatgt 960

ggtcttttgt gtttttttaa aggatttgag cgtagcgaaa aatccttttc tttcttatct 1020

tgataataag ggtaactatt gccgatcgtc cattccgaca gcatcgccag tcactatggc 1080

gtgctgctag cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 1140

ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg 1200

ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattcgagct 1260

caatgtcaca gaacgcctgc gttattgcgc aggcgttttg taataaaaac accccataca 1320

gaaagcttat aatgcgatct gcttcactaa agtggcaggg cggagctcag gccttaactc 1380

acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 1440

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt 1500

ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga 1560

gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt 1620

ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat 1680

atccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg 1740

atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg 1800

ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt 1860

gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg 1920

gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg 1980

cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag 2040

aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag 2100

cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgtttt 2160

acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc 2220

ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt 2280

ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat 2340

gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct 2400

ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc 2460

gtataacgtt actggtttca tcaaaatcgt ctccctccgt ttgaatattt gattgatcgt 2520

aaccagatga agcactcttt ccactatccc tacagtgtta tggcttgaac aatcacgaaa 2580

caataattgg tacgtacgat ctttcagccg actcaaacat caaatcttac aaatgtagtc 2640

tttgaaagta ttacatatgt aagatttaaa tgcaaccgtt ttttcggaag gaaatgatga 2700

cctcgtttcc accggaatta gcttggtacc agctattgta acataatcgg tacgggggtg 2760

aaaaagctaa cggaaaaggg agcggaaaag aatgatgtaa gcgtgaaaaa ttttttaaaa 2820

aatctcttga cattggaagg gagatatgtt attataagaa ttgcggaatt gtgagcggat 2880

aacaattcat aattgtgagc ggataacaat tcaaccccaa aggaggtgaa atgtacacat 2940

gggtaaggga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt cttgttgaat tagatggtga 3000

tgttaatggg cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa ggtgatgcaa catacggaaa 3060

acttaccctt aaatttattt gcactactgg aaagcttcct gttccttggc caacacttgt 3120

cactactctt acttatggtg ttcaatgctt ttcaagatac ccagatcata tgaagcggca 3180

cgacttcttc aagagcgcca tgcctgaggg atacgtgcag gagaggacca tcttcttcaa 3240

ggacgacggg aactacaaga cacgtgctga agtcaagttt gagggagaca ccctcgtcaa 3300

cagaatcgag cttaagggaa tcgatttcaa ggaggacgga aacatcctcg gccacaagtt 3360

ggaatacaac tacaactccc acaacgtata catcatggca gacaaacaaa agaatggaat 3420

caaagttaac ttcaaaatta gacacaacat tgaagatgga agcgttcaac tagcagacca 3480

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<210> 13

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<213> 人工序列

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catggcatgg atgaactata caaataatgg agccagaaaa aacctgcaga ggctgaagga 3600

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ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 7860

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tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 8100

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aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 8460

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gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 8580

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gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagatacc gttcgtatag 2280

catacattat acgaagttat cttgatatgg ctttttatat gtgttactct acatacagaa 2340

aggaggaact aaacatggcc aagttgacca gtgccgttcc ggtgctcacc gcgcgcgacg 2400

tcgccggagc ggtcgagttc tggaccgacc ggctcgggtt ctcccgggac ttcgtggagg 2460

acgacttcgc cggtgtggtc cgggacgacg tgaccctgtt catcagcgcg gtccaggacc 2520

aggtggtgcc ggacaacacc ctggcctggg tgtgggtgcg cggcctggac gagctgtacg 2580

ccgagtggtc ggaggtcgtg tccacgaact tccgggacgc ctccgggccg gccatgaccg 2640

agatcggcga gcagccgtgg gggcgggagt tcgccctgcg cgacccggcc ggcaactgcg 2700

tgcacttcgt ggccgaggag caggactgaa taacttcgta tagcatacat tatacgaacg 2760

gtaaatcgtc gactgatagg tggtatgttt tcgcttgaac ttttaaatac agccattgaa 2820

catacggttg atttaataac tgacaaacat caccctcttg ctaaagcggc caaggacgcc 2880

gccgccgggg ctgtttgcgt tcttgccgtg atttcgtgta ccattggttt acttattttt 2940

ttgccaaggc tgtaatggct gaaaattctt acatttattt tacattttta gaaatgggcg 3000

tgaaaaaaag cgcgcgatta tgtaaaatat aaagtgatag cggtaccatt ataggtaaga 3060

gaggaatgta cacctgcagt gcaagcatgc aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg 3120

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt 3180

cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 3240

cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc 3300

acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc 3360

ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc 3420

ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc 3480

accgaaacgc gcga 3494

Claims (5)

1.细胞亚群调控回路，其特征在于，为（a）或（b）或（c）：

（a）以pHT01为载体骨架，含有阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子P_grac2、RBS₀、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子P_veg105、RBS₁和必需基因folB；所述IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子P_veg105和RBS₁调控必需基因folB表达；所述lac I表达框和启动子P_grac2转录方向相反，启动子P_grac2和P_veg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因folB之间具有一个双向终止子；

（b）以pHT01为载体骨架，含有阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子P_grac2、RBS₀、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子P_veg105，RBS₁和必需基因ftsW；所述IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子P_veg105和RBS₁调控必需基因ftsW表达；所述lac I表达框和启动子P_grac2转录方向相反，启动子P_grac2和P_veg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因ftsW之间具有一个双向终止子；

（c）以pHT01为载体骨架，含有阻遏蛋白lac I表达框、IPTG诱导型启动子P_grac2、RBS₀、转录调控蛋白nanR的编码基因、整合有转录调控蛋白nanR结合序列的组成型启动子P_veg105、N端编码序列N₁和必需基因ftsW；所述IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子P_veg105和必须基因ftsW之间依次设置RBS₀和N端编码序列N₁，所述启动子P_veg105、RBS₀和N端编码序列N₁调控必需基因ftsW表达；所述lac I表达框和启动子P_grac2转录方向相反，启动子P_grac2和P_veg105转录方向相对；调控转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因ftsW之间具有一个双向终止子；

所述启动子P_veg105的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；RBS₀的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；RBS₁的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述N端编码序列N₁的序列如SEQ ID NO.11所示；所述必需基因folB的核苷酸序列如SEQ NO.9所示；必需基因ftsW的核苷酸序列如SEQNO.10所示。

2.权利要求1所述的细胞亚群调控回路在提高N-乙酰神经氨酸产量方面的应用。

3.一种提高枯草芽孢杆菌生产N-乙酰神经氨酸能力的方法，其特征在于，缺失所述枯草芽孢杆菌基因组的必需基因folB或ftsW，再将权利要求1所述的细胞亚群调控回路转化至枯草芽孢杆菌细胞中。

4.含有权利要求1所述细胞亚群调控回路的重组枯草芽孢杆菌。

5.权利要求1所述细胞亚群调控回路或权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌在N-乙酰神经氨酸的生产中的应用。

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