CN112961879A - 一种n-乙酰神经氨酸生产稳定性提高的重组枯草芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种N‑乙酰神经氨酸生产稳定性提高的重组枯草芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。本发明通过将两个单输出细胞亚群调控回路组合，构建了一种可以提高亚群调控回路稳定性的的双输出亚群调控回路。在双输出亚群调控回路中，存在两个传感器启动子P_veg105作为输出启动子，只有当两个P_veg105同时发生遗传突变，细胞亚群调控回路才会失效，这增加了亚群调控回路的稳定性。所得到的重组枯草芽孢杆菌可以在96h的连续传代发酵培养过程中一直维持NeuAc生产，且产量稳定在0.65‑0.90g/L。

Description

一种N-乙酰神经氨酸生产稳定性提高的重组枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及一种N-乙酰神经氨酸生产稳定性提高的重组枯草芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。

背景技术

目前在实验室小试规模可以实现利用微生物细胞工厂生产多种目标化合物，但是能实现商业化应用的生物过程很少。从实验室小试规模放大到工业生产规模的过程中，由于遗传突变导致的遗传异质性、复杂调控的表型异质性、以及发酵过程中难以控制的环境异质性等原因，由一个单克隆细胞发展而来的生产群体在发酵过程中存在生产和非生产细胞。生产细胞因生产负担常常表现为降低的适应能力，因此，更加具有生长优势的非生产细胞在发酵过程中会逐步取代生产细胞，从而占据整个生物反应器，降低微生物细胞工厂的生产稳定性，这限制了很多生物过程的工业化应用。目前虽已开发有细胞亚群调控回路富集发酵过程中的生产细胞亚群，但是他们都是用单拷贝的传感器启动子调控生长关键基因来赋予生产细胞生长优势。单拷贝的传感器启动子的遗传突变可导致亚群调控回路失效，因此有待开发更稳定的亚群调控回路，从而进一步提高重组菌的生产稳定性。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性菌的模式微生物，由于它的GRAS身份，以及生长速率快、发酵培养时间短、培养条件要求低、易于进行代谢工程改造和分泌蛋白质能力强等等优势，在工业上应用十分广泛，在生产蛋白和高附加值化合物的生产上具有非常重要的地位。N-乙酰神经氨酸(NeuAc)又名唾液酸，燕窝酸，是一种重要的营养添加剂和药物中间体，在促进婴儿大脑发育，维持大脑健康和增强免疫力方面发挥着关键作用。此种NeuAc生产稳定性提高的重组枯草芽孢杆菌菌株的构建不仅为高附加值化合物NeuAc发酵法大规模生产奠定了基础，还为枯草芽孢杆菌的代谢工程改造提供新的有效方法。

发明内容

技术问题

现有技术中，使用单拷贝的传感器启动子调控生长关键基因来赋予生产细胞生长优势，没有考虑到细胞生长过程中单拷贝的传感器启动子易发生遗传突变，影响传代和生产的稳定性。

技术方案

提供一种提高重组枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸生产稳定性的方法。本发明通过将两个单输出细胞亚群调控回路组合，构建了一种可以提高亚群调控回路稳定性的的双输出亚群调控回路。

本发明的第一个目的是提供一种双输出亚群调控回路，所述调控回路是包含第一必需基因调控模块和第二必需基因调控模块的质粒。

在一种实施方式中，所述必需基因包括但不限于二氢蝶呤醛缩酶基因folB、SEDS家族肽聚糖糖基转移酶基因ftsW。

在一种实施方式中，所述第一必需基因调控模块包括：启动子P_veg105、RBS₁、第一必需基因和阻遏蛋白lac I表达框。

在一种实施方式中，所述第二必需基因调控模块包括：启动子P_veg105、RBS₀、N端编码序列N₁、第二必需基因、IPTG诱导型启动子P_grac2、转录调控蛋白nanR的编码基因。

在一种实施方式中，所述第一必需基因是二氢蝶呤醛缩酶基因folB，所述第二必需基因是SEDS家族肽聚糖糖基转移酶基因ftsW。

在一种实施方式中，所述质粒上还含有抗生素基因；包括但不限于氯霉素抗性基因CmR、氨苄青霉素抗性基因AmpR。

在一种实施方式中，所述第一必需基因调控模块中，启动子P_veg105和RBS₁调控第一必需基因表达；

所述第二必需基因调控模块中，启动子P_veg105、RBS₀和N端编码序列N₁调控第二必需基因表达；所述IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；

所述第一必需基因与lac I表达框转录方向相对，所述第二必需基因和转录调控蛋白nanR转录方向相对；所述第一必需基因和lac I表达框之间具有一个双向终止子，转录调控蛋白nanR的编码基因和第二必需基因之间具有一个双向终止子。

在一种实施方式中，所述双输出细胞亚群调控回路是以pHT01为载体骨架。

在一种实施方式中，所述lac I表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述IPTG诱导型启动子P_grac2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，RBS₀的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码转录调控蛋白nanR的基因序列如SEQ IDNO.5所示。

在一种实施方式中，启动子P_veg105的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；RBS₁的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，必需基因folB的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在一种实施方式中，必需基因ftsW的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在一种实施方式中，必需基因ftsW的N端序列N₁如SEQ ID NO.11所示。

本发明的第二个目的是提供所述双输出细胞亚群调控回路的构建方法。

在一种实施方式中，所述双输出细胞亚群调控回路是以细胞亚群调控回路1.1为模板，使用引物fp-1.1-9.8k-f/r扩增得到线性化亚群调控回路1.1；以细胞亚群调控回路1.3为模板，使用引物ftsW-1.6k-f/r扩增得到包括P_veg105、RBS₀、N端编码序列N₁和必需基因ftsW的线性片段；将两个片段连接获得双输出细胞亚群调控回路。

所述，所述细胞亚群调控回路1.1和细胞亚群调控回路1.3记载于公开号CN112342234A的专利。

在一种实施方式中，所述双输出亚群调控质粒的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种提高重组枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸生产稳定性的方法。

在一种实施方式中，所述方法通过将所述双输出亚群调控回路转化先至枯草芽孢杆菌细胞中，再缺失枯草芽孢杆菌的必需基因folB和ftsW。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是低产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌BgG-N abrB-30bp，所述重组枯草芽孢杆菌BgG-N abrB-30bp的构建方法公开于Tian R,Liu Y,Chen J,et al.Synthetic N-terminal coding sequences for fine-tuning geneexpression and metabolic engineering in Bacillus subtilis.Metab Eng.中。

本发明的第四个目的是提供含有所述双输出亚群调控回路的重组枯草芽孢杆菌。

本发明还要求保护所述双输出亚群调控回路或所述重组枯草芽孢杆菌在N-乙酰神经氨酸的生产中的应用。

有益效果：通过增加亚群调控回路稳定性双输出亚群调控回路，在双输出亚群调控回路中，存在两个传感器启动子P_veg105作为输出启动子，只有当两个P_veg105同时发生遗传突变，细胞亚群调控回路才会失效，这增加了亚群调控回路的稳定性。所得到的重组枯草芽孢杆菌可以在96h的连续传代发酵培养过程中一直维持NeuAc生产。

附图说明

图1为双输出亚群调控回路结构示意图。

图2为重组枯草芽孢杆菌NeuAc生产稳定性分析。

具体实施方式

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

LB液体培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉。

发酵培养基配方为：40g/L葡萄糖，12g/L酵母粉，6g/L胰蛋白胨，6g/L硫酸铵，12g/L三水合磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，3g/L硫酸镁，6g/L尿素。

发酵过程为：将培养在LB琼脂平板上的单菌落接种到LB液体培养基中，在37℃和220rpm下培养12h，制成种子液；将种子液以2％(v/v)的接种量和相同的初始OD₆₀₀值转接到25mL发酵培养基(250mL摇瓶)中。在37℃、220rpm培养12h后获得发酵液，以2％(v/v)的接种量转接至装有25mL新鲜发酵培养基的250mL摇瓶，在相同条件下继续培养12h，再重复转接-培养7次。每次转接时，同时以2％(v/v)的接种量将发酵液接种于装有1.5mL新鲜发酵培养基的24孔深孔板，在37℃、220rpm培养48h后收集细胞，用于NeuAc生产分析。

样品检测方法：首先，将发酵液离心后取上清，加入两倍体积35mM稀硫酸去除胞外蛋白。之后，使用离心机在14000rpm离心10min后，用0.22μm滤膜过滤后，使用液相色谱column(300×7.8mm)有机酸柱，检测波长为210nm。流动相采用10mM稀硫酸，流速为0.5mL/min柱温为40℃。

实施例1双输出亚群调控质粒的构建

(1)以亚群调控回路1.1质粒(来源于公开号：CN112342234A)作为模板，以fp-1.1-9.8k-f和fp-1.1-9.8k-r为引物，pcr扩增线性化亚群调控回路1.1质粒；

fp-1.1-9.8k-f：cagctcaaaaaaactgtttatctgtaagctgcaaggcgattaagttgggta；

fp-1.1-9.8k-r：agcgtattacggagcacttcccatactttcgccagctggcgtaatag；

(2)以亚群调控回路1.3质粒(来源于公开号：CN112342234A)作为模板，以ftsW-1.6k-f和ftsW-1.6k-r为引物，pcr扩增获得包括P_veg105、RBS₀、N端编码序列N₁和必需基因ftsW的片段；

ftsW-1.6k-f：tatgggaagtgctccgtaatacgct；

tsW-1.6k-r：ttacagataaacagtttttttgagctgtttctttttcattcc；

将上述2个片段纯化回收，利用Gibson Assembly Clonging Kit(New EnglandBiolabs)进行连接，构建双输出亚群调控质粒，待平板上长出转化子后，通过菌落PCR和测序，确认其构建成功。

构建好的双输出亚群调控质粒含有整合有转录调控蛋白nanR结合序列的启动子P_veg105、RBS₁和必需基因folB；含有阻遏蛋白lac I表达框；含有IPTG诱导型启动子P_grac2、RBS₀、转录调控蛋白nanR的编码基因；含有整合有转录调控蛋白nanR结合序列的启动子P_veg105，RBS₀、N端编码序列N₁和必需基因ftsW。所述IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；所述启动子P_veg105和RBS₁调控必需基因folB表达；所述启动子P_veg105和必须基因ftsW之间依次设置RBS₀和N端编码序列N₁，所述启动子P_veg105、RBS₀和N端编码序列N₁调控必需基因ftsW表达；所述folB与所述lac I表达框转录方向相对，和所述转录调控蛋白nanR转录方向相同；所述ftsW和所述转录调控蛋白nanR转录方向相对；folB和lacI表达框之间具有一个双向终止子，转录调控蛋白nanR的编码基因和必须基因ftsW之间具有一个双向终止子。

实施例2构建敲除基因组上必需基因拷贝的敲除框

1、构建fol敲除框

(1)利用引物qc-folB-1.2k-1f和qc-folB-1.2k-1r对野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168进行菌落PCR，扩增获得fol1片段；

qc-folB-1.2k-1f：agctagaagctctcttgacagct；

qc-folB-1.2k-1r：gtttcctgtgtgaaattgttatccgctcttgcttaaatccagctcagcggt；

(2)以质粒P7Z6(如SEQ ID NO.12)为模板，以3p7s6-1.3f和3p7s6-1.3r为引物，PCR扩增获得fol2片段；

3p7s6-1.3f：gagcggataacaatttcacacaggaaac；

3p7s6-1.3r：taacgccagggttttcccagtc；

(3)以qc-folB-1.2k-3f和qc-folB-1.2k-3r为引物，对野生型枯草芽孢杆菌168进行菌落PCR，扩增获得fol3片段；

qc-folB-1.2k-3f：gactgggaaaaccctggcgttaaccttgagcaaacgatcaactatgct；

qc-folB-1.2k-3r：ctcccgcatcgcattttgtaatct；

(4)纯化fol1、fol2和fol3片段，最后通过融合pcr的方式，将三个片段融合后扩增，构建fol敲除框。

2、构建fts敲除框

fts敲除框的构建方法来源于刘延峰、堵国成、曹燕亭、王惠好、卢杨、刘龙、李江华、陈坚.一种调控N-乙酰神经氨酸产量提高的重组枯草芽孢杆菌.(公开号CN112342234A)

实施例3重组枯草芽孢杆菌NeuAc生产稳定性分析

先将细胞亚群调控回路1.1质粒转入枯草芽孢杆菌BgG-N abrB-30bp(BgG-NabrB-30bp构建方法公开于论文《Synthetic N-terminal coding sequences for fine-tuning gene expression and metabolic engineering in Bacillus subtilis》中，并在后续实验中命名为重组枯草芽孢杆菌No.1)，然后利用实施例2构建获得的fol敲除框将其基因组上的必需基因folB拷贝敲除，构建重组枯草芽孢杆菌No.2；

先将细胞亚群调控回路1.3质粒转入重组枯草芽孢杆菌No.1，然后利用实施例2构建获得的ftsW敲除框将其基因组上的必需基因ftsW拷贝敲除，构建重组枯草芽孢杆菌No.3；

先将实施例1构建的双输出亚群调控回路质粒，转入重组枯草芽孢杆菌No.1，然后利用实施例2构建获得的fol敲除框和ftsW敲除框将其基因组上的必需基因folB和ftsW拷贝敲除，构建重组枯草芽孢杆菌No.4。

将细胞亚群调控回路1.1和细胞亚群调控回路1.3共同转化重组枯草芽孢杆菌No.1，发现菌株仅能单独表达一条细胞亚群调控回路。

随后进行发酵生产并分析这四株重组枯草芽孢杆菌的NeuAc生产稳定性。每隔12h进行转接发酵生产，并收取发酵液接种于24孔深孔板再培养48h后收集细胞NeuAc产量分析，结果如图2所示，重组枯草芽孢杆菌No.1在传代至第3次NeuAc产量逐渐下降，传代至第5次则停止生产；重组枯草芽孢杆菌No.2传代至第7次停止生产；而重组枯草芽孢杆菌No.4传代7次后仍能稳定生产NeuAc(第1次传代培养到第7次传代培养NeuAc产量稳定在0.65-0.90g/L)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种N-乙酰神经氨酸生产稳定性提高的重组枯草芽孢杆菌

<130> BAA210184A

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11297

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tattggtatg actggtttta agcgcaaaaa aagttgcttt ttcgtaccta ttaatgtatc 60

gttttagaaa accgactgta aaaagtacag tcggcattat ctcatattat aaaagccagt 120

cattaggcct atctgacaat tcctgaatag agttcataaa caatcctgca tgataaccat 180

cacaaacaga atgatgtacc tgtaaagata gcggtaaata tattgaatta cctttattaa 240

tgaattttcc tgctgtaata atgggtagaa ggtaattact attattattg atatttaagt 300

taaacccagt aaatgaagtc catggaataa tagaaagaga aaaagcattt tcaggtatag 360

gtgttttggg aaacaatttc cccgaaccat tatatttctc tacatcagaa aggtataaat 420

cataaaactc tttgaagtca ttctttacag gagtccaaat accagagaat gttttagata 480

caccatcaaa aattgtataa agtggctcta acttatccca ataacctaac tctccgtcgc 540

tattgtaacc agttctaaaa gctgtatttg agtttatcac ccttgtcact aagaaaataa 600

atgcagggta aaatttatat ccttcttgtt ttatgtttcg gtataaaaca ctaatatcaa 660

tttctgtggt tatactaaaa gtcgtttgtt ggttcaaata atgattaaat atctcttttc 720

tcttccaatt gtctaaatca attttattaa agttcatttg atatgcctcc taaattttta 780

tctaaagtga atttaggagg cttacttgtc tgctttcttc attagaatca atcctttttt 840

aaaagtcaat attactgtaa cataaatata tattttaaaa atatcccact ttatccaatt 900

ttcgtttgtt gaactaatgg gtgctttagt tgaagaataa aagaccacat taaaaaatgt 960

ggtcttttgt gtttttttaa aggatttgag cgtagcgaaa aatccttttc tttcttatct 1020

tgataataag ggtaactatt gccgatcgtc cattccgaca gcatcgccag tcactatggc 1080

gtgctgctag cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 1140

ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agtatgggaa gtgctccgta atacgctgac 1200

aagagagaaa gggcttggag gtattgaaac aagaggagtt ctgagaattg gtatgcctta 1260

taagtccaat taacagttga aaacctgcat aggagagcta tgcgggtttt ttattttaca 1320

taatgataca taatttaccg aaacttgcgg aacataattg aggaatcata gaattttgtc 1380

aaaataattt tattgacaac gtcttattaa cgttgatata atttaaattt tatttgacaa 1440

aaatgggctc gtgttgtaca atggtataac aggtataaag gtatatcgtt taggaggcta 1500

gcctttgtta aagccattag gtgatcgcgt tgtcattgaa ctcgtagaat taaaaaaaat 1560

gctaaaatct tatgattact cactgatatt cgcaatcgtt ttattatgcg gattcggttt 1620

agtgatggta tacagctcaa gcatgattac ggctgtctcc cggtatggag taagcagtaa 1680

ttttttcttc atgcggcagc tgtttgcttt aattgcgggt ggcgctctat ttattctcat 1740

ggcgttgttt ccttataaag cactggccca tcaaaagttt cagaagggga tactgcttgt 1800

atctgttctt gcgcttatct cactgtttgt tttcgggcat gttgccggaa acgcgcagag 1860

ctggtttaaa atcggcggaa tgagtattca gccgggggag tttgtgaaac tggtcgtgat 1920

tttatacctt gcagccgtat atgcaaaaaa acaaagttat atcgaccatc tgttaacggg 1980

agtagcccct ccggtagtca tgacgcttat aatttgtggg ttaattgcca tgcagccaga 2040

tttcggtaca gccatgatta tagggttaat tgcgacgtgc atgatcttgt gctccggctt 2100

cagcggaaag acgctggtga ggcttgtgat actgggcgga attgttttca ttttagtcag 2160

ccctattatc tatttgaatc aggacaaaat tttaactgaa ggccgtttag cgcgttttga 2220

gagtcttgaa gacccattta agtatgcaaa ttcatcaggt ttgcaagtga tcaattctta 2280

ttatgcgatc agctcaggcg gcattttcgg cctggggctc ggtgaaagta tccaaaaata 2340

cggatatctg cctgaatcac acactgactt tattatggct gtcattgctg aagagctcgg 2400

catttttggg gtattgtttg tgattttctt attgggtttt gtcgtcataa aaggttttta 2460

tattgccaga aaatgcgagg acccgtttgg aagtcttctg gcgatcggca tttcaagcat 2520

gattgccatc cagtcgttta ttaaccttgg cggtgtcagc ggattaattc cgattacagg 2580

ggttacgctg ccatttatca gttacggggg ctcttctttg gtgctgctgc tggggagtat 2640

ggggatatta gcgaatatca gcatgtttgt gaaatattca gagaataaga aaaagaaaga 2700

gcccttggcg ccgaagggaa tgaaaaagaa acagctcaaa aaaactgttt atctgtaagc 2760

tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac 2820

ggccagtgaa ttcgagctca atgtcacaga acgcctgcgt tattgcgcag gcgttttgta 2880

ataaaaacac cccatacaga aagcttataa tgcgatctgc ttcactaaag tggcagggcg 2940

gagctcaggc cttaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 3000

aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 3060

attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt 3120

caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg 3180

aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc 3240

gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat 3300

tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt 3360

cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc 3420

tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc 3480

cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag 3540

atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt 3600

ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat 3660

ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag 3720

attgtgcacc gccgttttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac 3780

gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg 3840

cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg 3900

tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt 3960

tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc 4020

ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcatc aaaatcgtct ccctccgttt 4080

gaatatttga ttgatcgtaa ccagatgaag cactctttcc actatcccta cagtgttatg 4140

gcttgaacaa tcacgaaaca ataattggta cgtacgatct ttcagccgac tcaaacatca 4200

aatcttacaa atgtagtctt tgaaagtatt acatatgtaa gatttaaatg caaccgtttt 4260

ttcggaagga aatgatgacc tcgtttccac cggaattagc ttggtaccag ctattgtaac 4320

ataatcggta cgggggtgaa aaagctaacg gaaaagggag cggaaaagaa tgatgtaagc 4380

gtgaaaaatt ttttaaaaaa tctcttgaca ttggaaggga gatatgttat tataagaatt 4440

gcggaattgt gagcggataa caattcataa ttgtgagcgg ataacaattc aaccccaaag 4500

gaggtgaaat gtacacatgg gccttatgaa cgcatttgat tcgcaaaccg aagattcttc 4560

acctgcaatt ggtcgcaact tgcgtagccg cccgctggcg cgtaaaaaac tctccgaaat 4620

ggtggaagaa gagctggaac agatgatccg ccgtcgtgaa tttggcgaag gtgaacaatt 4680

accgtctgaa cgcgaactga tggcgttctt taacgtcggg cgtccttcgg tgcgtgaagc 4740

gctggcagcg ttaaaacgca aaggtctggt gcaaataaac aacggcgaac gcgctcgcgt 4800

ctcgcgtcct tctgcggaca ctatcatcgg tgagctttcc ggcatggcga aagatttcct 4860

ttctcatccc ggtgggattg cccatttcga acaattacgt ctgttctttg aatccagtct 4920

ggtgcgctat gcggctgaac atgccaccga tgagcaaatc gatttgctgg caaaagcact 4980

ggaaatcaac agtcagtcgc tggataacaa cgcggcattc attcgttcag acgttgattt 5040

ccaccgcgtg ctggcggaga tccccggtaa cccaatcttc atggcgatcc acgttgccct 5100

gctcgactgg cttattgccg cacgcccaac ggttaccgat caggcactgc acgaacataa 5160

caacgttagt tatcaacagc atattgcgat cgttgatgcg atccgccgtc atgatcctga 5220

cgaagccgat cgtgcgttgc aatcgcatct caacagcgtc tctgctacct ggcacgcttt 5280

cggtcagacc accaacaaaa agaaataatg ccactttagt gaagcagatc gcattataag 5340

ctttctgtat ggggtgtttt tattacaaaa cgcctgcgca ataacgcagg cgttctgtga 5400

catttctgca atagacactt ttccttcagc ctctgcaggt tttttctggc tccatcatga 5460

cttttttctc gtaatttcaa ttgctactga tttatagtgt ccgggaattg gcgggtctgg 5520

cttaatcact ttcaccgtac attgctgaac aggctgaaat tttccgagaa cagtgccagc 5580

aatacgttcc gccagcgttt ccaccaattt cacaggctcc ccttccacga tatctttaca 5640

tacgtgatag agctcagcat agttgatcgt ttgctcaagg tcgtctgtct gtccagcttt 5700

gcttaaatcc agctcagcgg ttaaatcgac tttaaaccgc tggccaagtt tgttttcttc 5760

tgtgaacaca ccgtgatatc cgtaaaactc cataccttct acataaactt tatccatagg 5820

ctagctctcc aaacgatata cctttatacc tgttatacca ttgtacaaca cgagcccatt 5880

tttgtcaaat aaaatttaaa ttatatcaac gttaataaga cgttgtcaat aaaattattt 5940

tgacaaaatt ctatgattcc tcaattatgt tccgcaagtt tcggtaaatt atgtatcatt 6000

atgtaaaata aaaaacccgc atagctctcc tatgcaggtt ttcaactgtt aattggactt 6060

ataaggcata ccaattctca gaactcctct tgtttcaata cctccaagcc ctttctctct 6120

tgtcagcgta ttacggagca cttcccataa tcacttgggg ttgacgaccg agtagttcac 6180

cggcacgaaa cttcacgtca cgcgtccatg gagatctttg tctgcaactg aaaagtttat 6240

accttacctg gaacaaatgg ttgaaacata cgaggctaat atcggcttat taggaatagt 6300

ccctgtacta ataaaatcag gtggatcagt tgatcagtat attttggacg aagctcggaa 6360

agaatttgga gatgacttgc ttaattccac aattaaatta agggaaagaa taaagcgatt 6420

tgatgttcaa ggaatcacgg aagaagatac tcatgataaa gaagctctaa aactattcaa 6480

taaccttaca atggaattga tcgaaagggt ggaaggttaa tggtacgaaa attaggggat 6540

ctacctagaa agccacaagg cgataggtca agcttaaaga acccttacat ggatcttaca 6600

gattctgaaa gtaaagaaac aacagaggtt aaacaaacag aaccaaaaag aaaaaaagca 6660

ttgttgaaaa caatgaaagt tgatgtttca atccataata agattaaatc gctgcacgaa 6720

attctggcag catccgaagg gaattcatat tacttagagg atactattga gagagctatt 6780

gataagatgg ttgagacatt acctgagagc caaaaaactt tttatgaata tgaattaaaa 6840

aaaagaacca acaaaggctg agacagactc caaacgagtc tgttttttta aaaaaaatat 6900

taggagcatt gaatatatat tagagaatta agaaagacat gggaataaaa atattttaaa 6960

tccagtaaaa atatgataag attatttcag aatatgaaga actctgtttg tttttgatga 7020

aaaaacaaac aaaaaaaatc cacctaacgg aatctcaatt taactaacag cggccaaact 7080

gagaagttaa atttgagaag gggaaaaggc ggatttatac ttgtatttaa ctatctccat 7140

tttaacattt tattaaaccc catacaagtg aaaatcctct tttacactgt tcctttaggt 7200

gatcgcggag ggacattatg agtgaagtaa acctaaaagg aaatacagat gaattagtgt 7260

attatcgaca gcaaaccact ggaaataaaa tcgccaggaa gagaatcaaa aaagggaaag 7320

aagaagttta ttatgttgct gaaacggaag agaagatatg gacagaagag caaataaaaa 7380

acttttcttt agacaaattt ggtacgcata taccttacat agaaggtcat tatacaatct 7440

taaataatta cttctttgat ttttggggct attttttagg tgctgaagga attgcgctct 7500

atgctcacct aactcgttat gcatacggca gcaaagactt ttgctttcct agtctacaaa 7560

caatcgctaa aaaaatggac aagactcctg ttacagttag aggctacttg aaactgcttg 7620

aaaggtacgg ttttatttgg aaggtaaacg tccgtaataa aaccaaggat aacacagagg 7680

aatccccgat ttttaagatt agacgtaagg ttcctttgct ttcagaagaa cttttaaatg 7740

gaaaccctaa tattgaaatt ccagatgacg aggaagcaca tgtaaagaag gctttaaaaa 7800

aggaaaaaga gggtcttcca aaggttttga aaaaagagca cgatgaattt gttaaaaaaa 7860

tgatggatga gtcagaaaca attaatattc cagaggcctt acaatatgac acaatgtatg 7920

aagatatact cagtaaagga gaaattcgaa aagaaatcaa aaaacaaata cctaatccta 7980

caacatcttt tgagagtata tcaatgacaa ctgaagagga aaaagtcgac agtactttaa 8040

aaagcgaaat gcaaaatcgt gtctctaagc cttcttttga tacctggttt aaaaacacta 8100

agatcaaaat tgaaaataaa aattgtttat tacttgtacc gagtgaattt gcatttgaat 8160

ggattaagaa aagatattta gaaacaatta aaacagtcct tgaagaagct ggatatgttt 8220

tcgaaaaaat cgaactaaga aaagtgcaat aaactgctga agtatttcag cagttttttt 8280

tatttagaaa tagtgaaaaa aatataatca gggaggtatc aatatttaat gagtactgat 8340

ttaaatttat ttagactgga attaataatt aacacgtaga ctaattaaaa tttaatgagg 8400

gataaagagg atacaaaaat attaatttca atccctatta aattttaaca agggggggat 8460

taaaatttaa ttagaggttt atccacaaga aaagacccta ataaaatttt tactagggtt 8520

ataacactga ttaatttctt aatgggggag ggattaaaat ttaatgacaa agaaaacaat 8580

cttttaagaa aagcttttaa aagataataa taaaaagagc tttgcgatta agcaaaactc 8640

tttacttttt cattgacatt atcaaattca tcgatttcaa attgttgttg tatcataaag 8700

ttaattctgt tttgcacaac cttttcagga atataaaaca catctgaggc ttgttttata 8760

aactcagggt cgctaaagtc aatgtaacgt agcatatgat atggtatagc ttccacccaa 8820

gttagccttt ctgcttcttc tgaatgtttt tcatatactt ccatgggtat ctctaaatga 8880

ttttcctcat gtagcaaggt atgagcaaaa agtttatgga attgatagtt cctctctttt 8940

tcttcaactt ttttatctaa aacaaacact ttaacatctg agtcaatgta agcataagat 9000

gtttttccag tcataatttc aatcccaaat cttttagaca gaaattctgg acgtaaatct 9060

tttggtgaaa gaattttttt atgtagcaat atatccgata cagcaccttc taaaagcgtt 9120

ggtgaatagg gcattttacc tatctcctct cattttgtgg aataaaaata gtcatattcg 9180

tccatctacc tatcctatta tcgaacagtt gaacttttta atcaaggatc agtccttttt 9240

ttcattattc ttaaactgtg ctcttaactt taacaactcg atttgttttt ccagatctcg 9300

agggtaacta gcctcgccga tcccgcaaga ggcccggcag tcaggtggca cttttcgggg 9360

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 9420

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 9480

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 9540

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 9600

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 9660

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 9720

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 9780

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 9840

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 9900

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 9960

ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 10020

aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 10080

acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 10140

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 10200

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 10260

gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 10320

taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 10380

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 10440

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 10500

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 10560

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 10620

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 10680

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 10740

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 10800

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 10860

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 10920

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 10980

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 11040

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 11100

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 11160

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 11220

tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 11280

aatacgcatg cttaagt 11297

<210> 2

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaaagaatg atgtaagcgt gaaaaatttt ttaaaaaatc tcttgacatt ggaagggaga 60

tatgttatta taagaattgc ggaattgtga gcggataaca attcataatt gtgagcggat 120

aacaattcaa ccccaaagga ggtgaaatgt acac 154

<210> 3

<211> 1523

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgctcccttt tccgttagct ttttcacccc cgtaccgatt atgttacaat agctggtacc 60

aagctaattc cggtggaaac gaggtcatca tttccttccg aaaaaacggt tgcatttaaa 120

tcttacatat gtaatacttt caaagactac atttgtaaga tttgatgttt gagtcggctg 180

aaagatcgta cgtaccaatt attgtttcgt gattgttcaa gccataacac tgtagggata 240

gtggaaagag tgcttcatct ggttacgatc aatcaaatat tcaaacggag ggagacgatt 300

ttgatgaaac cagtaacgtt atacgatgtc gcagagtatg ccggtgtctc ttatcagacc 360

gtttcccgcg tggtgaacca ggccagccac gtttctgcga aaacgcggga aaaagtggaa 420

gcggcgatgg cggagctgaa ttacattccc aaccgcgtgg cacaacaact ggcgggcaaa 480

cagtcgttgc tgattggcgt tgccacctcc agtctggccc tgcacgcgcc gtcgcaaatt 540

gtcgcggcga ttaaatctcg cgccgatcaa ctgggtgcca gcgtggtggt gtcgatggta 600

gaacgaagcg gcgtcgaagc ctgtaaaacg gcggtgcaca atcttctcgc gcaacgcgtc 660

agtgggctga tcattaacta tccgctggat gaccaggatg ccattgctgt ggaagctgcc 720

tgcactaatg ttccggcgtt atttcttgat gtctctgacc agacacccat caacagtatt 780

attttctccc atgaagacgg tacgcgactg ggcgtggagc atctggtcgc attgggtcac 840

cagcaaatcg cgctgttagc gggcccatta agttctgtct cggcgcgtct gcgtctggct 900

ggctggcata aatatctcac tcgcaatcaa attcagccga tagcggaacg ggaaggcgac 960

tggagtgcca tgtccggttt tcaacaaacc atgcaaatgc tgaatgaggg catcgttccc 1020

actgcgatgc tggttgccaa cgatcagatg gcgctgggcg caatgcgcgc cattaccgag 1080

tccgggctgc gcgttggtgc ggatatctcg gtagtgggat acgacgatac cgaagacagc 1140

tcatgttata tcccgccgtt aaccaccatc aaacaggatt ttcgcctgct ggggcaaacc 1200

agcgtggacc gcttgctgca actctctcag ggccaggcgg tgaagggcaa tcagctgttg 1260

cccgtctcac tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca atacgcaaac cgcctctccc 1320

cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 1380

cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta aggcctgagc tccgccctgc cactttagtg 1440

aagcagatcg cattataagc tttctgtatg gggtgttttt attacaaaac gcctgcgcaa 1500

taacgcaggc gttctgtgac att 1523

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaggaggtg aaatgtacac 20

<210> 5

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgggcctta tgaacgcatt tgattcgcaa accgaagatt cttcacctgc aattggtcgc 60

aacttgcgta gccgcccgct ggcgcgtaaa aaactctccg aaatggtgga agaagagctg 120

gaacagatga tccgccgtcg tgaatttggc gaaggtgaac aattaccgtc tgaacgcgaa 180

ctgatggcgt tctttaacgt cgggcgtcct tcggtgcgtg aagcgctggc agcgttaaaa 240

cgcaaaggtc tggtgcaaat aaacaacggc gaacgcgctc gcgtctcgcg tccttctgcg 300

gacactatca tcggtgagct ttccggcatg gcgaaagatt tcctttctca tcccggtggg 360

attgcccatt tcgaacaatt acgtctgttc tttgaatcca gtctggtgcg ctatgcggct 420

gaacatgcca ccgatgagca aatcgatttg ctggcaaaag cactggaaat caacagtcag 480

tcgctggata acaacgcggc attcattcgt tcagacgttg atttccaccg cgtgctggcg 540

gagatccccg gtaacccaat cttcatggcg atccacgttg ccctgctcga ctggcttatt 600

gccgcacgcc caacggttac cgatcaggca ctgcacgaac ataacaacgt tagttatcaa 660

cagcatattg cgatcgttga tgcgatccgc cgtcatgatc ctgacgaagc cgatcgtgcg 720

ttgcaatcgc atctcaacag cgtctctgct acctggcacg ctttcggtca gaccaccaac 780

aaaaagaaat aa 792

<210> 6

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gly Leu Met Asn Ala Phe Asp Ser Gln Thr Glu Asp Ser Ser Pro

1 5 10 15

Ala Ile Gly Arg Asn Leu Arg Ser Arg Pro Leu Ala Arg Lys Lys Leu

20 25 30

Ser Glu Met Val Glu Glu Glu Leu Glu Gln Met Ile Arg Arg Arg Glu

35 40 45

Phe Gly Glu Gly Glu Gln Leu Pro Ser Glu Arg Glu Leu Met Ala Phe

50 55 60

Phe Asn Val Gly Arg Pro Ser Val Arg Glu Ala Leu Ala Ala Leu Lys

65 70 75 80

Arg Lys Gly Leu Val Gln Ile Asn Asn Gly Glu Arg Ala Arg Val Ser

85 90 95

Arg Pro Ser Ala Asp Thr Ile Ile Gly Glu Leu Ser Gly Met Ala Lys

100 105 110

Asp Phe Leu Ser His Pro Gly Gly Ile Ala His Phe Glu Gln Leu Arg

115 120 125

Leu Phe Phe Glu Ser Ser Leu Val Arg Tyr Ala Ala Glu His Ala Thr

130 135 140

Asp Glu Gln Ile Asp Leu Leu Ala Lys Ala Leu Glu Ile Asn Ser Gln

145 150 155 160

Ser Leu Asp Asn Asn Ala Ala Phe Ile Arg Ser Asp Val Asp Phe His

165 170 175

Arg Val Leu Ala Glu Ile Pro Gly Asn Pro Ile Phe Met Ala Ile His

180 185 190

Val Ala Leu Leu Asp Trp Leu Ile Ala Ala Arg Pro Thr Val Thr Asp

195 200 205

Gln Ala Leu His Glu His Asn Asn Val Ser Tyr Gln Gln His Ile Ala

210 215 220

Ile Val Asp Ala Ile Arg Arg His Asp Pro Asp Glu Ala Asp Arg Ala

225 230 235 240

Leu Gln Ser His Leu Asn Ser Val Ser Ala Thr Trp His Ala Phe Gly

245 250 255

Gln Thr Thr Asn Lys Lys Lys

260

<210> 7

<211> 319

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tatgggaagt gctccgtaat acgctgacaa gagagaaagg gcttggaggt attgaaacaa 60

gaggagttct gagaattggt atgccttata agtccaatta acagttgaaa acctgcatag 120

gagagctatg cgggtttttt attttacata atgatacata atttaccgaa acttgcggaa 180

cataattgag gaatcataga attttgtcaa aataatttta ttgacaacgt cttattaacg 240

ttgatataat ttaaatttta tttgacaaaa atgggctcgt gttgtacaat ggtataacag 300

gtataaaggt atatcgttt 319

<210> 8

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggagagctag cct 13

<210> 9

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggataaag tttatgtaga aggtatggag ttttacggat atcacggtgt gttcacagaa 60

gaaaacaaac ttggccagcg gtttaaagtc gatttaaccg ctgagctgga tttaagcaaa 120

gctggacaga cagacgacct tgagcaaacg atcaactatg ctgagctcta tcacgtatgt 180

aaagatatcg tggaagggga gcctgtgaaa ttggtggaaa cgctggcgga acgtattgct 240

ggcactgttc tcggaaaatt tcagcctgtt cagcaatgta cggtgaaagt gattaagcca 300

gacccgccaa ttcccggaca ctataaatca gtagcaattg aaattacgag aaaaaagtca 360

<210> 10

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgttaaaaa aaatgctaaa atcttatgat tactcactga tattcgcaat cgttttatta 60

tgcggattcg gtttagtgat ggtatacagc tcaagcatga ttacggctgt ctcccggtat 120

ggagtaagca gtaatttttt cttcatgcgg cagctgtttg ctttaattgc gggtggcgct 180

ctatttattc tcatggcgtt gtttccttat aaagcactgg cccatcaaaa gtttcagaag 240

gggatactgc ttgtatctgt tcttgcgctt atctcactgt ttgttttcgg gcatgttgcc 300

ggaaacgcgc agagctggtt taaaatcggc ggaatgagta ttcagccggg ggagtttgtg 360

aaactggtcg tgattttata ccttgcagcc gtatatgcaa aaaaacaaag ttatatcgac 420

catctgttaa cgggagtagc ccctccggta gtcatgacgc ttataatttg tgggttaatt 480

gccatgcagc cagatttcgg tacagccatg attatagggt taattgcgac gtgcatgatc 540

ttgtgctccg gcttcagcgg aaagacgctg gtgaggcttg tgatactggg cggaattgtt 600

ttcattttag tcagccctat tatctatttg aatcaggaca aaattttaac tgaaggccgt 660

ttagcgcgtt ttgagagtct tgaagaccca tttaagtatg caaattcatc aggtttgcaa 720

gtgatcaatt cttattatgc gatcagctca ggcggcattt tcggcctggg gctcggtgaa 780

agtatccaaa aatacggata tctgcctgaa tcacacactg actttattat ggctgtcatt 840

gctgaagagc tcggcatttt tggggtattg tttgtgattt tcttattggg ttttgtcgtc 900

ataaaaggtt tttatattgc cagaaaatgc gaggacccgt ttggaagtct tctggcgatc 960

ggcatttcaa gcatgattgc catccagtcg tttattaacc ttggcggtgt cagcggatta 1020

attccgatta caggggttac gctgccattt atcagttacg ggggctcttc tttggtgctg 1080

ctgctgggga gtatggggat attagcgaat atcagcatgt ttgtgaaata ttcagagaat 1140

aagaaaaaga aagagccctt ggcgccgaag ggaatgaaaa agaaacagct caaaaaaact 1200

gtttatctgt aa 1212

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgttaaagc cattaggtga tcgcgttgtc attgaactcg tagaa 45

<210> 12

<211> 3189

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagatacc gttcgtatag 2280

catacattat acgaagttat cttgatatgg ctttttatat gtgttactct acatacagaa 2340

aggaggaact aaacatggcc aagttgacca gtgccgttcc ggtgctcacc gcgcgcgacg 2400

tcgccggagc ggtcgagttc tggaccgacc ggctcgggtt ctcccgggac ttcgtggagg 2460

acgacttcgc cggtgtggtc cgggacgacg tgaccctgtt catcagcgcg gtccaggacc 2520

aggtggtgcc ggacaacacc ctggcctggg tgtgggtgcg cggcctggac gagctgtacg 2580

ccgagtggtc ggaggtcgtg tccacgaact tccgggacgc ctccgggccg gccatgaccg 2640

agatcggcga gcagccgtgg gggcgggagt tcgccctgcg cgacccggcc ggcaactgcg 2700

tgcacttcgt ggccgaggag caggactgaa taacttcgta tagcatacat tatacgaacg 2760

gtaaatcgtc gacctgcagg catgcaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 2820

actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 2880

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aacgcgcga 3189

Claims (10)

1.一种双输出亚群调控回路，其特征在于，是包含第一必需基因调控模块和第二必需基因调控模块的质粒；所述必需基因包括但不限于二氢蝶呤醛缩酶基因folB、SEDS家族肽聚糖糖基转移酶基因ftsW；

所述第一必需基因调控模块包括：启动子P_veg105、RBS₁、第一必需基因和阻遏蛋白lac I表达框；

所述第二必需基因调控模块包括：启动子P_veg105、RBS₀、N端编码序列N₁、第二必需基因、IPTG诱导型启动子P_grac2、转录调控蛋白nanR的编码基因。

2.根据权利要求1所述的双输出亚群调控回路，其特征在于，所述质粒上还含有抗生素基因；包括但不限于氯霉素抗性基因CmR、氨苄青霉素抗性基因AmpR。

3.根据权利要求1所述的双输出亚群调控回路，其特征在于，所述第一必需基因调控模块中，启动子P_veg105和RBS₁调控第一必需基因表达；

所述第二必需基因调控模块中，启动子P_veg105、RBS₀和N端编码序列N₁调控第二必需基因表达；所述IPTG诱导型启动子P_grac2和RBS₀调控转录调控蛋白nanR表达；

所述第一必需基因与lac I表达框转录方向相对，第二必需基因和转录调控蛋白nanR转录方向相对；所述第一必需基因和lac I表达框之间具有一个双向终止子，转录调控蛋白nanR的编码基因和第二必需基因之间具有一个双向终止子。

4.根据权利要求1所述的双输出亚群调控回路，其特征在于，必需基因folB的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；必需基因ftsW的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；必需基因ftsW的N端序列N1如SEQ ID NO.11所示。

5.根据权利要求1～4任一所述的双输出亚群调控回路，其特征在于，是以pHT01为载体骨架。

6.一种构建双输出细胞亚群调控回路的方法，其特征在于，以细胞亚群调控回路1.1为模板，获得线性化亚群调控回路1.1；以细胞亚群调控回路1.3为模板，获得包括P_veg105、RBS₀、N端编码序列N₁和必需基因ftsW的线性片段；将两个片段连接获得双输出细胞亚群调控回路。

7.一种提高枯草芽孢杆菌生产N-乙酰神经氨酸生产稳定性的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一所述的双输出细胞亚群调控回路先转化至枯草芽孢杆菌细胞中，再缺失位于枯草芽孢杆菌基因组的必需基因folB和ftsW。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BgG-N abrB-30bp。

9.含有权利要求1～5任一所述双输出细胞亚群调控回路的重组枯草芽孢杆菌。

10.权利要求1～5任一所述细胞亚群调控回路或权利要求9所述的重组枯草芽孢杆菌在N-乙酰神经氨酸的生产中的应用。

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