KR20230062873A - 염기 편집 효소 - Google Patents

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KR20230062873A
KR20230062873A KR1020237012244A KR20237012244A KR20230062873A KR 20230062873 A KR20230062873 A KR 20230062873A KR 1020237012244 A KR1020237012244 A KR 1020237012244A KR 20237012244 A KR20237012244 A KR 20237012244A KR 20230062873 A KR20230062873 A KR 20230062873A
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쥰 리앙 린
앨런 브룩스
크리스티나 버터필드
크리스토퍼 브라운
신디 캐스텔
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메타지노미, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 독특한 도메인 특징을 갖는 엔도뉴클레아제 효소뿐만 아니라 이러한 효소 또는 이의 변이체를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

염기 편집 효소
상호 참조
본 출원은 2020년 9월 11일에 출원된 "염기 편집 효소(BASE EDITING ENZYMES)"라는 제목의 미국 가출원 제63/077,057호 및 2021년 7월 15일에 출원된 "염기 편집 효소(BASE EDITING ENZYMES)"라는 제목의 미국 가출원 제63/222,351호를 우선권으로 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 포함된다.
Cas 효소는 이와 연관된 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복 서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat; CRISPR) 가이드 리보핵산(RNA)과 함께 원핵생물 면역계의 만연한(박테리아의 약 45%, 고세균의 약 84%) 성분으로 보이며, CRISPR-RNA 가이드 핵산 절단에 의해 감염성 바이러스 및 플라스미드와 같은 비-자기 핵산으로부터 상기 미생물을 보호하는 역할을 한다. CRISPR RNA 요소를 코딩하는 데옥시리보핵산(DNA) 요소는 구조 및 길이가 상대적으로 보존될 수 있지만, 이의 CRISPR 연관(Cas) 단백질은 매우 다양하며, 광범위하게 다양한 핵산-상호작용 도메인을 포함한다. CRISPR DNA 요소는 1987년도에 일찍 관찰되었지만, CRISPR/Cas 복합체의 프로그래밍 가능한 엔도뉴클레아제 절단 능력은 비교적 최근에야 인식되어, 다양한 DNA 조작 및 유전자 편집 응용 분야에서 재조합 CRISPR/Cas 시스템을 사용하게 되었다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출되고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2021년 9월 9일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 55921-715_601_SL.txt이고, 크기가 705,305 바이트이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기(base editor); 및 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 핵산 편집 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 닉카제(nickase) 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 2, 타입 II cas 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 71, 72 또는 74에 비해 잔기 13에, 서열번호 73에 비해 잔기 12에, 서열번호 75에 비해 잔기 17에, 서열번호 76에 비해 잔기 23에, 또는 서열번호 597에 비해 잔기 10에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 72에 비해 잔기 13에, 또는 서열번호 75에 비해 잔기 17에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제; 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 360-368 또는 598 중 어느 하나 또는 이의 변이체를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM) 서열에 결합하도록 구성된 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 닉카제 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 2, 타입 II cas 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 71, 72 또는 74에 비해 잔기 13에, 서열번호 73에 비해 잔기 12에, 서열번호 75에 비해 잔기 17에, 서열번호 76에 비해 잔기 23에서 또는 서열번호 597에 비해 잔기 10에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 서열번호 1-51, 57-66, 385-443, 444-475 또는 594-595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 서열번호 50-51 또는 385-390 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제에 대해 80% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 HNH 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비축퇴성(non-degenerate) 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, 상기 조작된 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비축퇴성 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 가이드 리보핵산 구조체; 상기 조작된 가이드 리보핵산에 결합하도록 구성된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제; 및 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 서열번호 50-51 또는 385-390 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 360-368 또는 598로 이루어진 군으로부터 선택된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 서열번호 1-51, 57-66, 385-443, 444-475 또는 594-595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 아데닌 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 상기 아데노신 데아미나제는 서열번호 50-51, 57, 385-443, 448-475, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 시토신 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 상기 시토신 데아미나제는 서열번호 1-49, 444-447, 594, 또는 58-66 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 염기 편집기에 커플링된 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 우라실 DNA 글리코실라제 억제제는 서열번호 52-56 또는 서열번호 67 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체는 적어도 2개의 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체는 상기 가이드 리보핵산 서열 및 상기 tracr 리보핵산 서열을 포함하는 하나의 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 가이드 리보핵산 서열은 원핵생물, 박테리아, 고세균, 진핵생물, 진균, 식물, 포유동물, 또는 인간 게놈 서열에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 상기 가이드 리보핵산 서열은 길이가 15 내지 24 개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 엔도뉴클레아제의 N- 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 NLS는 서열번호 369-384로부터 선택된 것 또는 이의 변이체에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 염기 편집기에 직접 공유 결합되거나, 링커를 통해 상기 염기 편집기에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 71, 72 또는 74에 비해 잔기 13에, 서열번호 73 또는 78에 비해 잔기 12에, 서열번호 75에 비해 잔기 17에, 서열번호 76에 비해 잔기 23에, 서열번호 77에 비해 잔기 8에, 또는 서열번호 597에 비해 잔기 10에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 72에 비해 잔기 13에, 또는 서열번호 75에 비해 잔기 17에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 염기 편집기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 Mg2+ 공급원을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서: (a) 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70, 71, 73, 74, 76, 78, 77 또는 78 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나; (b) 상기 가이드 RNA 구조체는 서열번호 88, 89, 91, 92, 94, 96, 95 또는 488 중 어느 하나의 비축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나; (c) 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 360, 361, 363, 365, 367, 또는 368 중 어느 하나를 포함하는 PAM에 결합하도록 구성되거나; (d) 상기 염기 편집기는 서열번호 58 또는 595 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서: (a) 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70, 71, 또는 78 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나; (b) 상기 가이드 RNA 구조체는 서열번호 88, 89, 또는 96 중 적어도 하나의 비축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나; (c) 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 360, 362 또는 368 중 어느 하나를 포함하는 PAM에 결합하도록 구성되거나; (d) 상기 염기 편집기는 서열번호 594 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 서열 동일성은 BLASTP, CLUSTALW, MUSCLE, MAFFT 또는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 상기 서열 동일성은 단어 길이(W) 3, 기대값(E) 10, 및 존재(existence) 11, 연장 1에서의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 설정 갭 코스트의 매개변수를 사용하고 조건부 조성 점수 매트릭스 조정을 사용하여 상기 BLASTP 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 촉매적으로 사멸되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 핵산은 염기 편집기에 커플링된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하고, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 핵산을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 핵산은 염기 편집기에 커플링된, 서열번호 70-78 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 것인 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 엔도뉴클레아제의 N- 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 NLS는 서열번호 369-384로부터 선택된 것 또는 이의 변이체에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 유기체는 원핵생물, 박테리아, 진핵생물, 진균, 식물, 포유동물, 설치류 또는 인간이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 염기 편집기에 커플링된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 벡터를 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 양상 또는 실시양태의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, CELiD, 아데노 관련 바이러스(AAV) 유래 비리온 또는 렌티바이러스이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 양상 또는 실시양태의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 양상 또는 실시양태의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제의 제조 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서, 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를, RuvC 도메인 및 HNH 도메인를 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고; 여기서 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 상기 엔도뉴클레아제는 상기 염기 편집기에 직접 공유 결합되거나, 링커를 통해 상기 염기 편집기에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서, 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를, 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제, 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기, 및 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고; 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하고; 상기 PAM은 서열번호 70-78 또는 597로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 상기 염기 편집기에 공유 결합되거나, 링커를 통해 상기 염기 편집기에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 서열번호 1-51, 57-66, 385-443, 444-475 또는 594-595 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 아데닌 데아미나제를 포함하고; 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 아데닌을 포함하고; 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리펩티드를 변형시키는 것은 상기 아데닌을 구아닌으로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 아데닌 데아미나제는 서열번호 50-51, 57, 385-443, 448-475, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 시토신 데아미나제를 포함하고; 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 시토신을 포함하고; 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리펩티드를 변형시키는 것은 상기 시토신을 우라실로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시토신 데아미나제는 서열번호 1-49, 444-447, 594, 또는 58-66 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체는 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 염기 편집기에 커플링된 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 우라실 DNA 글리코실라제 억제제는 서열번호 52-56 또는 서열번호 67 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 가닥 및 상기 PAM을 포함하는 제2 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 PAM은 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체의 상기 서열에 상보적인 상기 서열의 3' 말단에 바로 인접한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제, Cas14 엔도뉴클레아제, Cas12a 엔도뉴클레아제, Cas12b 엔도뉴클레아제, Cas12c 엔도뉴클레아제, Cas12d 엔도뉴클레아제, Cas12e 엔도뉴클레아제, Cas13a 엔도뉴클레아제, Cas13b 엔도뉴클레아제, Cas13c 엔도뉴클레아제 또는 Cas 13d 엔도뉴클레아제가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 진핵생물, 식물, 진균, 포유동물, 설치류 또는 인간 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 양상 또는 실시양태의 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것을 포함하고, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 복합체는 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌에 결합시, 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌의 뉴클레오티드를 변형시키도록 구성되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템은 아데닌 데아미나제를 포함하고, 상기 뉴클레오티드는 아데닌이고, 상기 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 것은 상기 아데닌을 구아닌으로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템은 시티딘 데아미나제 및 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 포함하고, 상기 뉴클레오티드는 시토신이고 상기 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 것은 상기 아데닌을 우라실로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 게놈 DNA, 바이러스 DNA 또는 박테리아 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 시험관내에 있다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 세포 내에 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 원핵 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포, 진균 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 설치류 세포, 영장류 세포 또는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 동물 내에 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 달팽이관 내에 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 배아 내에 있다. 일부 실시양태에서, 상기 배아는 2세포 배아이다. 일부 실시양태에서, 상기 배아는 마우스 배아이다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 본원에 기재된 임의의 양상 또는 실시양태의 핵산 또는 본원에 기재된 임의의 양상 또는 실시양태의 벡터를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 상기 엔도뉴클레아제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 핵산은 상기 엔도뉴클레아제를 코딩하는 상기 오픈 리딩 프레임이 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 상기 엔도뉴클레아제를 코딩하는 상기 오픈 리딩 프레임을 함유하는 캡핑된 mRNA를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 번역된 폴리펩티드를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 리보핵산(RNA) pol III 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 코딩하는 데옥시리보핵산(DNA)을 전달하는 것을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 RuvC 도메인 및 HNH 도메인를 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 및 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 및 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드를 제공한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 360-368 또는 598 중 어느 하나를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 및 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제에 대해 80% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 HNH 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 tracr 리보핵산 서열은 서열번호 88-96, 488 및 489 중 어느 하나로부터 선택된 약 60 내지 90 개의 연속 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 서열번호 1-51, 57-66, 385-443, 444-475 또는 594-595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 아데닌 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 상기 아데노신 데아미나제는 서열번호 50-51, 57, 385-443, 448-475, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 시토신 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 상기 시토신 데아미나제는 서열번호 1-49, 444-447, 594, 또는 58-66 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 및 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기로서, 상기 염기 편집기는 서열번호 1-51, 385-386, 387-443, 444-447, 488-475 또는 595 중 어느 하나, 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 염기 편집기를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 촉매적으로 사멸되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 상기 Cas 엔도뉴클레아제는 클래스 II, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제 또는 클래스 II, 타입 V Cas 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Cas 엔도뉴클레아제는 닉카제 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Cas 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 71, 72 또는 74에 비해 잔기 13에, 서열번호 73에 비해 잔기 12에, 서열번호 75에 비해 잔기 17에, 서열번호 76에 비해 잔기 23에, 또는 서열번호 597에 비해 잔기 10에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 360-368 또는 598로 이루어진 군으로부터 선택된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 아데닌 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 상기 아데노신 데아미나제는 서열번호 50-51, 385-443, 또는 448-475 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 아데노신 데아미나제는 서열번호 50-51, 385-390, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염기 편집기는 시토신 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 상기 시토신 데아미나제는 서열번호 1-49, 444-447 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 염기 편집기에 커플링된 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 우라실 DNA 글리코실라제 억제제는 서열번호 52-56 또는 서열번호 67 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 엔도뉴클레아제의 N- 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 NLS는 서열번호 369-384로부터 선택된 것 또는 이의 변이체에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 염기 편집기에 직접 공유 결합되거나, 링커를 통해 상기 염기 편집기에 공유 결합된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 핵산은 서열번호 1-51, 385-386, 387-443, 444-447 또는 488-475 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 코딩하는 것인 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 유기체는 원핵생물, 박테리아, 진핵생물, 진균, 식물, 포유동물, 설치류 또는 인간이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 양상 또는 실시양태의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, CELiD, 아데노 관련 바이러스(AAV) 유래의 비리온 또는 렌티바이러스이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양상 또는 실시양태 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 양상 또는 실시양태 중 어느 하나의 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 염기 편집기의 제조 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 (a) 본원에 기재된 임의의 양상 또는 실시양태의 핵산 편집 폴리펩티드; 및 (b) 상기 핵산 편집 폴리펩티드와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나의 비축퇴성 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 양상 또는 실시양태의 상기 조작된 핵산 편집 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 임의의 양상 또는 실시양태의 상기 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것을 포함하고, 상기 복합체는 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌에 결합시, 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌의 뉴클레오티드를 변형시키도록 구성되는 것인 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 (a) RuvC 도메인 및 HNH 도메인를 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있는 것인 엔도뉴클레아제; (b) 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및 (c) 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, (i) 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 (ii) 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 tracr 리보핵산 서열울 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 (a) 서열번호 70-78 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여된 RuvC 도메인을 포함하는 것인 엔도뉴클레아제; 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, (i) 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 (ii) 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 tracr 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 (a) 서열번호 360-368을 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여된 RuvC 도메인을 포함하는 것인 엔도뉴클레아제; 및 (b) 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및 (c) 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, (i) 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열 및 (ii) 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 tracr 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제에 대해 80% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 HNH 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, tracr 리보핵산 서열은 서열번호 88-96, 488 및 489 중 어느 하나로부터 선택된 약 60 내지 90 개의 연속 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 (a) (i) 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 (ii) 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 tracr 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, 상기 tracr 리보핵산 서열은 서열번호 88-96, 488 및 489 중 어느 하나로부터 선택된 약 60 내지 90 개의 연속 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 가이드 리보핵산 구조체; 및 상기 조작된 가이드 리보핵산에 결합하도록 구성된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 360-368로 이루어진 군으로부터 선택된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 서열번호 1-51 및 385-475 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 아데닌 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 서열번호 57에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 시토신 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 58에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 59-66 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템은 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 우라실 DNA 글리코실라제 억제제는 서열번호 52-56 또는 서열번호 67 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 가이드 리보핵산 구조체는 적어도 2개의 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 가이드 리보핵산 구조체는 가이드 리보핵산 서열 및 tracr 리보핵산 서열을 포함하는 하나의 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 리보핵산 서열은 원핵생물, 박테리아, 고세균, 진핵생물, 진균, 식물, 포유동물 또는 인간 게놈 서열에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 가이드 리보핵산 서열은 길이가 15 내지 24 개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 상기 엔도뉴클레아제의 N- 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 염기 편집기에 직접 공유 결합되거나, 링커를 통해 염기 편집기에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 엔도뉴클레아제 및 염기 편집기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 370을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 Mg2+ 공급원을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 70과 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 88과 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 360을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 71과 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 89와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 361을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 73과 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 91과 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 363을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 75와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 93과 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 365를 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 76과 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 94와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 366을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 77과 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 95와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 367을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 78과 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 96과 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 368을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 염기 편집기는 아데닌 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 서열번호 57을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 시토신 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 58을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템은 우라실 DNA 글리코실화 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 우라실 DNA 글리코실화 억제제는 서열번호 67을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열 동일성은 BLASTP, CLUSTALW, MUSCLE, MAFFT, 또는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 단어 길이(W) 3, 기대값(E) 10, 및 존재 11, 연장 1에서의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 설정 갭 코스트의 매개변수를 사용하고, 조건부 조성 점수 매트릭스 조정을 사용하여 BLASTP 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 핵산은 염기 편집기에 커플링된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하고, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 핵산을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 핵산은 염기 편집기에 커플링된, 서열번호 70-78 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 것인 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 상기 엔도뉴클레아제의 N- 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유기체는 원핵생물, 박테리아, 진핵생물, 진균, 식물, 포유동물, 설치류 또는 인간이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 염기 편집기에 커플링된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 본원에 기재된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 tracr 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, CELiD, 아데노 관련 바이러스(AAV) 유래의 비리온 또는 렌티바이러스이다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제의 제조 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서, 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를, RuvC 도메인 및 HNH 도메인를 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있는 것인 엔도뉴클레아제; 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고; 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제는 염기 편집기에 직접 공유 결합되거나, 링커를 통해 염기 편집기에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서, 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를, 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제, 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기, 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고; 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하고; 상기 PAM은 서열번호 360-368로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 염기 편집기에 공유 결합되거나, 링커를 통해 염기 편집기에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 서열번호 1-51 및 385-475로부터 선택된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 아데닌 데아미나제를 포함하고; 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 아데닌을 포함하고; 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리펩티드를 변형시키는 것은 아데닌을 구아닌으로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제는 서열번호 57에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염기 편집기는 시토신 데아미나제를 포함하고; 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 시토신을 포함하고; 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리펩티드를 변형시키는 것은 시토신을 우라실로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 58에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 59-66 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복합체는 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 우라실 DNA 글리코실라제 억제제는 서열번호 52-56 또는 서열번호 67 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 조작된 가이드 리보핵산 구조체의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 가닥 및 상기 PAM을 포함하는 제2 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, PAM은 조작된 가이드 리보핵산 구조체의 서열에 상보적인 서열의 3' 말단에 바로 인접한다.
일부 실시양태에서, 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제, Cas14 엔도뉴클레아제, Cas12a 엔도뉴클레아제, Cas12b 엔도뉴클레아제, Cas 12c 엔도뉴클레아제, Cas12d 엔도뉴클레아제, Cas12e 엔도뉴클레아제, Cas13a 엔도뉴클레아제, Cas13b 엔도뉴클레아제, Cas13c 엔도뉴클레아제 또는 Cas 13d 엔도뉴클레아제가 아니다. 일부 실시양태에서, 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 진핵생물, 식물, 진균, 포유동물, 설치류 또는 인간 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 여기서 엔도뉴클레아제는 조작된 가이드 리보핵산 구조체와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 복합체는 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌에 결합시, 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌의 뉴클레오티드를 변형시키도록 구성되는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템은 아데닌 데아미나제를 포함하고, 뉴클레오티드는 아데닌이고, 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 것은 아데닌을 구아닌으로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템은 시티딘 데아미나제 및 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 포함하고, 뉴클레오티드는 시토신이고 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 것은 아데닌을 우라실로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 유전자좌는 게놈 DNA, 바이러스 DNA 또는 박테리아 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 유전자좌는 시험관내에 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 유전자좌는 세포 내에 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포, 진균 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 설치류 세포, 영장류 세포 또는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 동물 내에 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 달팽이관 내에 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 배아 내에 있다. 일부 실시양태에서, 배아는 2세포 배아이다. 일부 실시양태에서, 배아는 마우스 배아이다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 본원에 기재된 핵산 또는 본원에 기재된 벡터를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 엔도뉴클레아제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 전달하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 엔도뉴클레아제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 엔도뉴클레아제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 함유하는 캡핑된 mRNA를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 번역된 폴리펩타이드를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 리보핵산(RNA) pol III 프로모터에 작동 가능하게 연결된 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 코딩하는 데옥시리보핵산(DNA)를 전달하는 것을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 RuvC 도메인 및 HNH 도메인를 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있는 것인 엔도뉴클레아제; 및 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 70-78 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여된 RuvC 도메인을 포함하는 것인 엔도뉴클레아제; 및 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드를 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 360-368을 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여된 RuvC 도메인을 포함하는 것인 엔도뉴클레아제; 및 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제에 대해 80% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 HNH 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, tracr 리보핵산 서열은 서열번호 88-96, 488 및 489 중 어느 하나로부터 선택된 약 60 내지 90 개의 연속 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 서열번호 1-51 및 385-475 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 아데닌 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 서열번호 57에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 시토신 데아미나제이다.일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 58에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 시토신 데아미나제는 서열번호 59-66 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 추가적인 양상 및 이점은 본 개시내용의 예시적인 실시양태만이 제시되고 설명되는 하기 상세한 설명으로부터 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다. 알 수 있는 바와 같이, 본 개시내용은 다른 및 상이한 실시양태가 가능하고, 이의 여러 세부사항은 모두 본 개시내용에서 벗어나지 않으면서 다양한 명백한 측면에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면 및 설명은 본질적으로 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 제한적인 것으로 간주되지 않아야 한다.
참조에 의한 인용
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부된 청구범위에서 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명, 및 첨부 도면(또한 본원에서 "도면" 및 "도")을 참조하여 얻어질 것이며, 첨부 도면에서,
도 1은 상이한 클래스 및 타입의 CRISPR/Cas 유전자좌의 전형적인 구성을 도시한다.
도 2는 본원에 기재된 시스템의 발현을 구동하는 T7 프로모터를 함유하는 염기 편집기 플라스미드의 구조를 도시한다.
도 3은 본원에 기재된 시스템에 대한 플라스미드 지도를 도시한다. MGA는 TadA*(ABE8.17m으로부터)-SV40 NLS를 포함하고 MGC는 우라실 글리코실라제 억제제에 연결된 APOBEC1(BE3으로부터) 및 SV40 NLS를 포함한다.
도 4는 닉카제 효소를 생성하는 뉴클레아제 활성을 파괴하도록 돌연변이된 본원에 기재된 선택된 엔도뉴클레아제의 RuvCI 도메인 내의 예측된 촉매 잔기를 도시한다.
도 5는 단일 가이드 RNA 발현 카세트를 본원에 기재된 시스템으로 클로닝하기 위한 예시적인 방법을 도시한다. 하나의 단편은 T7 프로모터와 스페이서를 포함한다. 다른 단편은 스페이서와 단일 가이드 스캐폴드 서열 및 양방향 터미네이터를 포함한다. 단편을 발현 플라스미드로 조립하여, sgRNA와 염기 편집기를 동시에 발현할 수 있는 기능적 작제물을 생성한다.
도 6a 및 6b는 이. 콜라이(E. coli)에서의 lacZ 표적화를 위한 sgRNA 설계를 도시한다. 본원에 기재된 시스템에 사용된 스페이서 길이는 22 개의 뉴클레오티드였다. 본원에 기재된 선택된 시스템의 경우, 이. 콜라이에서 lacZ를 표적화하는 3개의 sgRNA가 편집 윈도우(editing window)를 결정하도록 설계하였다.
도 7은 선택된 돌연변이된 효과기의 닉카제 활성을 도시한다. 양쪽 5' 말단에 형광단(6-FAM)으로 표지된 600bp 이중 가닥 DNA 단편을 동족 sgRNA가 보충된 정제된 효소와 함께 인큐베이션하였다. 반응 산물을 10% TBE-우레아 변성 겔에서 분해시켰다. 이중 가닥 절단은 400개 및 200개 염기의 밴드를 생성한다. 닉카제 활성은 600개 및 200개 염기의 밴드를 생성한다.
도 8a, 8b 및 8c는 본원에 기재된 선택된 시스템에 의한 염기 편집을 입증하는 생어(Sanger) 시퀀싱 결과를 도시한다.
도 9는 본원에 기재된 시스템이 본원에 기재된 엔도뉴클레아제 및 염기 편집기를 사용하여 염기-편집 능력을 어떻게 확장하는가를 도시한다.
도 10a 및 10b는 TadA(ABE8.17m) 및 MG 닉카제를 포함하는 아데닌 염기 편집기(ABE)의 염기 편집 효율을 도시한다. TadA는 tRNA 아데닌 데아미나제이고 TadA(ABE8.17m)는 이. 콜라이 TadA의 조작된 변이체이다. TadA(ABE8.17m)와 융합된 12가지의 MG 닉카제를 작제하고 이. 콜라이에서 테스트하였다. 3개의 가이드를 lacZ를 표적화하도록 설계하였다. 상자에 표시된 숫자는 Edit R에 의해 정량화된 A에서 G로의 전환의 백분율을 나타낸다. ABE8.17m은 실험의 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 11a 및 11b는 래트 APOBEC1, MG 닉카제 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 박테리오파지(UGI(PBS1))의 우라실 글리코실라제 억제제를 포함하는 시토신 염기 편집기(CBE)의 염기 편집 효율을 도시한다. APOBEC1은 시토신 데아미나제이다. N-말단에서 rAPOBEC1에 융합되고 C-말단에서 UGI에 융합된 12가지의 MG 닉카제를 작제하고 이. 콜라이에서 테스트하였다. 3개의 가이드를 lacZ를 표적화하도록 설계하였다. 상자에 표시된 숫자는 Edit R에 의해 정량화된 C에서 T로의 전환의 백분율을 나타낸다. BE3는 실험에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 12는 CBE의 염기 편집 활성에 미치는 MG 우라실 글리코실라제 억제제(UGI)의 효과를 도시한다. 패널 (a)는 N-말단 APOBEC1, MG15-1 닉카제 및 C-말단 UGI를 포함하는 MGC15-1 및 변이체의 염기 편집 활성을 보여주는 그래프를 도시한다. 3가지 MG UGI를 이. 콜라이에서 시토신 염기 편집 활성의 개선에 대해 테스트하였다. 패널 (b)는 N-말단 rAPOBEC1, SpCas9 닉카제 및 C-말단 UGI를 포함하는 BE3의 염기 편집 활성을 보여주는 그래프이다. 2가지 MG UGI를 HEK293T 세포에서 시토신 염기 편집 활성의 개선에 대해 테스트하였다. 편집 효율은 Edit R에 의해 정량화하였다.
도 13a 및 13b는 A0A2K5RDN7, MG 닉카제 및 MG UGI를 포함하는 시토신 염기 편집기의 편집 효율을 보여주는 편집된 부위의 지도를 도시한다. 작제물은 N-말단 A0A2K5RDN7, MG 닉카제 및 C-말단 MG69-1을 포함한다. 단순화를 위해, 도면에는 MG 닉카제의 정체만이 도시된다. BE3은 염기 편집에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 음성 대조군으로는 공 벡터(empty vector)를 사용하였다. 상이한 날에 3회의 독립적인 실험을 수행하였다. 약어: R, 반복; NEG, 음성 대조군.
도 14는 이. 콜라이에서의 TadA 특성규명을 위한 양성 선택 방법을 도시한다. 패널 (a)는 TadA 선택에 사용된 하나의 플라스미드 시스템의 지도를 도시한다. 벡터는 CAT(H193Y), CAT를 표적화는 sgRNA 발현 카세트 및 ABE 발현 카세트를 포함한다. 본 도면에는, 이. 콜라이로부터의 N-말단 TadA 및 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 C-말단 SpCas9(D10A)가 도시되어 있다. 패널 (b)는 이. 콜라이 세포 내로 도입/형질전환될 때 CAT(H193Y)의 주형 가닥의 A2 위치가 편집되어 H193Y 돌연변이를 야생형으로 되돌리고 이의 활성을 복원시킴을 입증하는 시퀀싱 추적을 도시한다. 약어: CAT, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제.
도 15는 TadA에 의해 유발된 돌연변이가 클로람페니콜(Cm)의 높은 내용성(tolerance)을 가능하게 함을 도시한다. 패널 (a)는 이. 콜라이의 항생제 내성을 선택하기 위해 상이한 농도의 클로람페니콜이 사용된 성장 플레이트의 사진을 도시한다. 이 예에서, 이. 콜라이(EcTadA)로부터의 TadA의 야생형 및 변이체 2가지를 테스트하였다. 패널 (b)는 돌연변이된 TadA를 보유하는 ABE가 야생형보다 더 높은 편집 효율을 나타낸다는 것을 입증하는 결과 요약 표를 도시한다. 이들 실험에서, 콜로니는 0.5 ㎍/mL 이상의 Cm을 갖는 플레이트로부터 채취하였다. 단순화를 위해, 표에는 데아미나제의 정체만이 도시된다.
도 16a는 양성 선택에서 MG TadA 활성을 조사하기 위한 성장 플레이트의 사진을 도시한다. 8개의 MG68 TadA 후보를 0 내지 2 ㎍/mL의 클로람페니콜(ABE는 N-말단 TadA 변이체 및 C-말단 SpCas9(D10A) 닉카제를 포함함)에 대해 테스트하였다. 단순화를 위해, 데아미나제의 정체만이 도시된다. 이 실험에서, 콜로니는 0.5 ㎍/mL 이상의 Cm을 갖는 플레이트로부터 채취하였다.
도 16b는 MG TadA 후보의 편집 효율을 요약하고, MG68-3 및 MG68-4가 아데닌의 염기 편집을 구동하였음을 입증한다.
도 17은 MG68-4 상의 D109N 돌연변이를 통한 MG68-4_nSpCas9의 염기 편집 효율의 개선을 도시한다. 패널 (a)는 야생형 MG68-4 및 이의 변이체가 0 내지 4 ㎍/mL의 클로람페니콜에 대해 테스트된 성장 플레이트의 사진을 도시한다. 단순화를 위해, 데아미나제의 정체만이 도시된다. 이 실험에서 아데닌 염기 편집기는 N-말단 TadA 변이체 및 C-말단 SpCas9(D10A) 닉카제를 포함한다. 패널 (b)는 MG TadA 후보의 편집 효율을 나타내는 요약 표를 도시한다. 패널 (b)는 MG68-4 및 MG68-4(D109N)가 아데닌의 염기 편집을 나타냈고, D109N 돌연변이가 증가된 활성을 나타냈음을 입증한다. 이 실험에서, 콜로니는 0.5 ㎍/mL 이상의 Cm을 갖는 플레이트로부터 채취하였다.
도 18은 MG68-4(D109N)_nMG34-1의 염기 편집을 도시한다. 패널 (a)는 N-말단 MG68-4(D109N) 및 C-말단 SpCas9(D10A) 닉카제를 포함하는 ABE가 0 내지 2 ㎍/mL의 클로람페니콜에 대해 테스트된 실험의 성장 플레이트의 사진을 도시한다. 패널 (b)는 sgRNA의 존재 및 부재 하의 편집 효율을 나타내는 요약 표를 도시한다. 이 실험에서 콜로니는 1 ㎍/mL 이상의 Cm을 갖는 플레이트로부터 채취하였다.
도 19는 MG68-4-nMG34-1 염기 편집 활성의 개선을 위해 설계된 28가지의 MG68-4 변이체(서열번호 448-475)를 도시한다. 효소의 편집을 개선하기 위한 표적화 돌연변이유발을 위해 12개의 잔기를 선택하였다.
서열 목록의 간략한 설명
본 출원과 함께 제출된 서열 목록은 본 개시내용에 따른 방법, 조성물 및 시스템에서 사용하기 위한 예시적인 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 제공한다. 하기는 이 중의 서열의 예시적인 설명이다.
서열번호 1-47은 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템에 적합한 MG66 데아미나제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 48-49는 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템에 적합한 MG67 데아미나제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 50-51은 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템에 적합한 MG68 데아미나제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 52-56은 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템에 적합한 우라실 DNA 글리코실라제 억제제의 서열을 나타낸다.
서열번호 57-66은 참조 데아미나제의 서열을 나타낸다.
서열번호 67은 참조 우라실 DNA 글리코실라제 억제제의 서열을 나타낸다.
서열번호 68은 아데닌 염기 편집기의 서열을 나타낸다.
서열번호 69는 시토신 염기 편집기의 서열을 나타낸다.
서열번호 70-78은 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템에 적합한 MG 닉카제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 79-87은 본원에 기재된 시험관내 닉카제 분석에서 사용된 프로토스페이서 및 PAM을 나타낸다.
서열번호 88-96은 본원에 기재된 시험관내 닉카제 분석에서 사용된 단일 가이드 RNA의 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 97-156은 이. 콜라이 lacZ를 표적화할 때의 스페이서의 서열을 나타낸다.
서열번호 157-176은 부위 지정 돌연변이유발을 수행할 때의 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 177-178은 lacZ 시퀀싱을 위한 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 179-342는 증폭 동안 사용된 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 343-345는 lacZ 시퀀싱을 위한 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 346-359는 증폭 동안 사용된 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 360-368은 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템에 적합한 프로토스페이서 인접 모티프를 나타낸다.
서열번호 369-384는 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템에 적합한 핵 국소화 서열(NLS)을 나타낸다.
서열번호 385-443은 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템에 적합한 MG68 데아미나제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 444-447은 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템에 적합한 MG121 데아미나제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 448-475는 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템에 적합한 MG68 데아미나제의 전장 펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 476 및 477은 아데닌 염기 편집기의 서열을 나타낸다.
서열번호 478-482는 시토신 염기 편집기의 서열을 나타낸다.
서열번호 483-487은 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템을 코딩하기에 적합한 플라스미드의 서열을 나타낸다.
서열번호 488 및 489는 MG15-1 및 MG34-1에 대한 sgRNA 스캐폴드 서열을 나타낸다.
서열번호 490-522는 이. 콜라이 및 HEK293T 세포에서 게놈 유전자좌를 표적화하기 위해 사용된 스페이서의 서열을 나타낸다.
서열번호 523-585는 증폭 및 생어 시퀀싱 동안 사용된 프라이머의 서열을 나타낸다.
본 발명의 다양한 실시양태가 본원에서 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 수많은 변경, 변화 및 치환이 본 개시내용에서 벗어나지 않고 당업자에게 일어날 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 개시된 일부 방법의 실행은 달리 명시되지 않는 한, 면역학, 생화학, 화학, 분자생물학, 미생물학, 세포생물학, 유전체학 및 재조합 DNA의 기술을 사용한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012); the series Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds.); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R.I. Freshney, ed. (2010))] (그 전체가 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형인 부정관사 및 정관사는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수형도 포함하도록 의도된다. 또한, "포함되는", "포함되다", "갖는", "갖다", "~와 함께" 또는 이들의 어미변화가 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어들은 용어 "포함하는"와 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "세포"는 일반적으로 생물학적 세포를 지칭한다. 세포는 살아있는 유기체의 기본적인 구조적, 기능적 및/또는 생물학적 단위일 수 있다. 세포는 하나 이상의 세포를 갖는 유기체로부터 유래할 수 있다. 일부 비제한적인 예는 원핵 세포, 진핵 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단세포 진핵 유기체의 세포, 원생동물 세포, 식물 세포(예를 들어, 식물 작물, 과일, 채소, 곡물, 대두, 옥수수, 메이즈, 밀, 씨앗, 토마토, 쌀, 카사바, 사탕수수, 호박, 건초, 감자, 면, 대마, 담배, 현화 식물, 침엽수, 겉씨 식물, 양치류, 석송, 붕어마름(hornwort), 우산이끼, 이끼로부터의 세포), 조류 세포(예를 들어, 보트리코쿠스 브라우니이(Botryococcus braunii), 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii), 나노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 클로렐아 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 사르가숨 파텐스 씨. 아가르드(Sargassum patens C. Agardh) 등), 해조류(예를 들어, 다시마), 진균 세포(예를 들어, 효모 세포, 버섯으로부터의 세포), 동물 세포, 무척추 동물(예를 들어, 초파리, 자포동물, 극피동물, 선충류 등)로부터의 세포, 척추동물(예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유동물)로부터의 세포, 포유동물(예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양, 설치류, 래트, 마우스, 인간이 아닌 영장류, 인간 등)의 세포 등을 포함한다. 때때로, 세포는 천연 유기체로부터 유래하지 않는다(예를 들어, 세포는 합성으로 제조될 수 있고, 때로는 인공 세포로 명명됨).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 일반적으로 염기-당-포스페이트 조합물을 지칭한다. 뉴클레오티드는 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 합성 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 핵산 서열의 단량체 단위(예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA))일 수 있다. 용어 뉴클레오티드는 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 아데노신 트리포스페이트(ATP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 시토신 트리포스페이트(CTP), 구아노신 트리포스페이트(GTP) 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 예컨대 dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들어 [αS]dATP, 7-데아자-dGTP 및 7-데아자-dATP, 및 이들을 함유하는 핵산 분자에 뉴클레아제 내성을 부여하는 뉴클레오티드 유도체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 뉴클레오티드는 디데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(ddNTP) 및 이들의 유도체를 지칭할 수 있다. 디데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트의 예시적인 예는 ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP 및 ddTTP를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오티드는 표지되지 않거나, 광학적으로 검출 가능한 모이어티(예를 들어, 형광단)을 포함하는 모이어티를 사용하는 것과 같이 검출 가능하게 표지될 수 있다. 표지화는 양자점으로 수행될 수도 있다. 검출 가능한 표지는 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 생물발광 표지 및 효소 표지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 형광 표지는 플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인(FAM), 2'7'-디메톡시-4'5-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 로다민, 6-카르복시로다민(R6G), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA), 6-카르복시-X-로다민(ROX), 4-(4'디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL), 캐스케이드 블루, 오레곤 그린, 텍사스 레드, 시아닌 및 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 형광 표지된 뉴클레오티드의 구체적인 예는 [R6G]dUTP, [TAMRA]dUTP, [R110]dCTP, [R6G]dCTP, [TAMRA]dCTP, [JOE]ddATP, [R6G]ddATP, [FAM]ddCTP, [R110]ddCTP, [TAMRA]ddGTP, [ROX]ddTTP, [dR6G]ddATP, [dR110]ddCTP, [dTAMRA]ddGTP, 및 [dROX]ddTTP(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Perkin Elmer로부터 입수 가능); 플루오로링크(FluoroLink) 데옥시뉴클레오티드, 플루오로링크 Cy3-dCTP, 플루오로링크 Cy5-dCTP, 플루오로링크 플루오르(Fluor) X-dCTP, 플루오로링크 Cy3-dUTP, 및 플루오로링크 Cy5-dUTP(미국 일리노이주 알링턴 하이츠 Ill 소재의 Amersham으로부터 입수 가능); 플루오레세인-15-dATP, 플루오레세인-12-dUTP, 테트라메틸-로다민-6-dUTP, IR770-9-dATP, 플루오레세인-12-ddUTP, 플루오레세인-12-UTP, 및 플루오레세인-15-2'-dATP(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 Boehringer Mannheim으로부터 입수 가능); 및 염색체 표지된 뉴클레오티드, BODIPY-FL-14-UTP, BODIPY-FL-4-UTP, BODIPY-TMR-14-UTP, BODIPY-TMR-14-dUTP, BODIPY-TR-14-UTP, BODIPY-TR-14-dUTP, 캐스케이드 블루-7-UTP, 캐스케이드 블루-7-dUTP, 플루오레세인-12-UTP, 플루오레세인-12-dUTP, 오레곤 그린 488-5-dUTP, 로다민 그린-5-UTP, 로다민 그린-5-dUTP, 테트라메틸로다민-6-UTP, 테트라메틸로다민-6-dUTP, 텍사스 레드-5-UTP, 텍사스 레드-5-dUTP 및 텍사스 레드-12-dUTP(미국 오레곤주 유진 소재의 Molecular Probes로부터 입수 가능)를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 또한 화학 변형에 의해 표지되거나 표시될 수 있다. 화학적으로 변형된 단일 뉴클레오티드는 비오틴-dNTP일 수 있다. 비오틴화된 dNTP의 일부 비제한적 예는 비오틴-dATP(예를 들어, 비오-N6-ddATP, 비오틴-14-dATP), 비오틴-dCTP(예를 들어, 비오틴-11-dCTP, 비오틴-14-dCTP), 및 비오틴-dUTP(예를 들어, 비오틴-11-dUTP, 비오틴-16-dUTP, 비오틴-20-dUTP)를 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 일반적으로 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 세포에 대해 외인성 또는 내인성일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 세포-유리(cell-free) 환경에 존재할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 유전자 또는 이의 단편일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 유사체(예를 들어, 변경된 백본, 당 또는 핵염기)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 유사체의 일부 비제한적 예는 5-브로모우라실, 펩티드 핵산, 제노 핵산, 모르폴리노, 잠금 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 디데옥시뉴클레오티드, 코르디세핀, 7-데아자-GTP, 형광단(예를 들어, 당에 연결된 로다민 또는 플루오레세인), 티올-함유 뉴클레오티드, 비오틴-연결된 뉴클레오티드, 형광 염기 유사체, CpG 섬, 메틸-7-구아노신, 메틸화된 뉴클레오티드, 이노신, 티오우리딘, 슈도우리딘, 디히드로우리딘, 쿠에오신 및 와이오신을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 세포-유리 DNA(cfDNA) 및 세포-유리 RNA(cfRNA)를 포함하는 세포-유리 폴리뉴클레오티드, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다.
용어 "형질감염" 또는 "형질감염된"은 일반적으로 비바이러스 또는 바이러스 기반 방법에 의해 핵산이 세포 내로 도입되는 것을 지칭한다. 핵산 분자는 완전한 단백질 또는 이의 기능적 부분을 코딩하는 유전자 서열일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88]을 참조한다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 일반적으로 펩티드 결합(들)에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 상기 용어는 특정 길이의 중합체를 의미하지 않으며, 펩티드가 재조합 기술, 화학적 또는 효소적 합성을 사용하여 생산되는지 또는 자연적으로 발생하지를 암시하거나 구별하려는 의도도 아니다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라, 적어도 하나의 변형된 아미노산을 포함하는 아미노산 중합체에도 적용된다. 일부 경우에, 중합체는 비아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 전장 단백질, 및 2차 및/또는 3차 구조(예를 들어, 도메인)를 갖거나 갖지 않는 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함한다. 상기 용어는 또한 예를 들어 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 산화 및 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 기타 조작에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산" 및 "아미노산들"은 일반적으로 변형된 아미노산 및 아미노산 유사체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 천연 및 비천연 아미노산을 지칭한다. 변형된 아미노산은 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 아미노산 상에 자연적으로 존재하지 않는 기 또는 화학적 모이어티를 포함하도록 화학적으로 변형된 것이다. 아미노산 유사체는 아미노산 유도체를 지칭할 수 있다. 용어 "아미노산"은 D-아미노산과 L-아미노산 둘 모두를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-고유(non-native)"는 일반적으로 고유 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 비-고유는 친화도 태그를 지칭할 수 있다. 비-고유는 융합을 지칭할 수 있다. 비-고유는 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 자연 발생 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 비-고유 서열은 비-고유 서열이 융합되는 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열에 의해서도 나타날 수 있는 활성(예를 들어, 효소 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 키나제 활성, 유비퀴틴화 활성 등)을 나타내고/내거나 이를 코딩할 수 있다. 비-고유 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 키메라 핵산 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 키메라 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열을 생성하기 위해 유전적 조작에 의해 자연 발생 핵산 또는 폴리펩티드 서열(또는 이의 변이체)에 연결될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 일반적으로 유전자의 전사 또는 발현을 제어하고 RNA 전사가 개시되는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 영역에 인접하거나 중첩하여 위치될 수 있는 조절 DNA 영역을 지칭한다. 프로모터는 종종 전사 인자라고 지칭되는 단백질 인자에 결합하는 특정 DNA 서열을 함유할 수 있으며, 이는 RNA 폴리머라제가 DNA에 결합하여 유전자 전사로 이어지는 것을 용이하게 한다. '코어 프로모터'로도 지칭되는 '기본 프로모터'는 일반적으로 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 전사 발현을 촉진하기 위해 필요한 모든 기본 요소를 함유하는 프로모터를 지칭할 수 있다. 일반적으로 진핵생물의 기본 프로모터는 반드시 그런 것은 아니지만, TATA 박스 및/또는 CAAT 박스를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 일반적으로 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 전사되는 과정(예컨대, mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 및/또는 전사된 mRNA가 이후에 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"로 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된", "작동 가능한 연결", "작동적으로 연결된" 또는 이의 문법적 등가물은 일반적으로 유전 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 서열 등의 병치를 지칭하며, 여기서 요소들은 예상된 방식으로 작동하도록 허용하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서 서열을 포함할 수 있는 조절 요소는 조절 요소가 코딩 서열의 전사 개시를 돕는 경우 코딩 영역에 작동 가능하게 연결된 것이다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한, 조절 요소와 코딩 영역 사이에 중간 잔기가 있을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 일반적으로 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이와 회합하고 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달하는 것을 매개하는 데 사용될 수 있는 거대분자 또는 거대분자의 회합체를 지칭한다. 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포솜 및 기타 유전자 전달 비히클을 포함한다. 벡터는 일반적으로 표적에서 유전자의 발현을 촉진하기 위해 유전자에 작동 가능하게 연결된 유전 요소, 예를 들어 조절 요소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현 카세트" 및 "핵산 카세트"는 일반적으로 함께 발현되거나 발현을 위해 작동 가능하게 연결된 핵산 서열 또는 요소의 조합물을 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 일부 경우에, 발현 카세트는 조절 요소 및 발현을 위해 작동 가능하게 연결된 유전자 또는 유전자들의 조합물을 지칭한다.
DNA 또는 단백질 서열의 "기능적 단편"은 일반적으로 전장 DNA 또는 단백질 서열의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능적 또는 구조적)을 보유하는 단편을 지칭한다. DNA 서열의 생물학적 활성은 전장 서열에 기인하는 것으로 알려진 방식으로 발현에 영향을 미치는 능력일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "조작된" 대상은 일반적으로 대상이 인간의 개입에 의해 변형되었음을 나타낸다. 비제한적 예에 따르면, 핵산은 자연에서 발생하지 않는 서열로 이의 서열을 변경함으로써 변형될 수 있으며; 핵산은 라이게이션된 산물이 원래 핵산에 존재하지 않는 기능을 갖도록 자연에서는 회합되지 않는 핵산에 핵산을 라이게이션시킴으로써 변형될 수 있고; 조작된 핵산은 자연에 존재하지 않는 서열로 시험관 내에서 합성될 수 있고; 단백질은 이의 아미노산 서열을 자연에 존재하지 않는 서열로 변경함으로써 변형될 수 있고; 조작된 단백질은 새로운 기능 또는 특성을 획득할 수 있다. "조작된" 시스템은 적어도 하나의 조작된 구성요소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "합성" 및 "인공"은 자연 발생 인간 단백질에 대한 낮은 서열 동일성(예를 들어, 50% 미만의 서열 동일성, 25% 미만의 서열 동일성, 10% 미만의 서열 동일성, 5% 미만의 서열 동일성, 1% 미만의 서열 동일성)을 갖는 단백질 또는 이의 도메인을 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 예를 들어, VPR 및 VP64 도메인은 합성 전이활성화(transactivation) 도메인이다.
본원에 사용된 용어 "tracrRNA" 또는 "tracr 서열"은 일반적으로 예시적인 야생형 tracrRNA 서열(예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) 에스. 아우레우스(S. aureus) 등으로부터의 tracrRNA)에 대해 적어도 약 5%, 10%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 갖는 핵산을 지칭할 수 있다. tracrRNA는 예시적인 야생형 tracrRNA 서열(예를 들어, 에스. 피오게네스 에스. 아우레우스 등으로부터의 tracrRNA)에 대해 최대 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 갖는 핵산을 지칭할 수 있다. tracrRNA는 결실, 삽입, 또는 치환, 변이체, 돌연변이 또는 키메라와 같은 뉴클레오티드 변화를 포함할 수 있는 tracrRNA의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. tracrRNA는 적어도 6개의 인접한 뉴클레오티드의 스트레치에 걸쳐 예시적인 야생형 tracrRNA(예를 들어, 에스. 피오게네스 에스. 아우레우스 등으로부터의 tracrRNA) 서열과 적어도 약 60% 동일할 수 있는 핵산을 지칭할 수 있다. 예를 들어, tracrRNA 서열은 적어도 6개의 인접한 뉴클레오티드의 스트레치에 걸쳐 적어도 약 60% 동일하거나, 적어도 약 65% 동일하거나, 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 75% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 85% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 100% 동일할 수 있다. 타입 II tracrRNA 서열은 인접한 CRISPR 어레이에서 반복 서열의 일부에 상보성을 갖는 영역을 식별함으로써 게놈 서열 상에서 예측될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "가이드 핵산"은 일반적으로 또 다른 핵산에 혼성화할 수 있는 핵산을 지칭할 수 있다. 가이드 핵산은 RNA일 수 있다. 가이드 핵산은 DNA일 수 있다. 가이드 핵산은 핵산 서열에 부위-특이적으로 결합하도록 프로그래밍될 수 있다. 표적화될 핵산, 또는 표적 핵산은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 가이드 핵산은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 핵산의 일부는 가이드 핵산의 일부에 상보적일 수 있다. 가이드 핵산에 상보적이고 이와 혼성화하는 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 가닥은 상보적 가닥이라 불릴 수 있다. 상보적 가닥에 상보적이고 따라서 가이드 핵산에 상보적이지 않을 수 있는 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 가닥은 비상보적 가닥이라 불릴 수 있다. 가이드 핵산은 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함할 수 있으며, "단일 가이드 핵산"이라 불릴 수 있다. 가이드 핵산은 2개의 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함할 수 있으며, "이중 가이드 핵산"으로 불릴 수 있다. 달리 명시되지 않은 경우, 용어 "가이드 핵산"은 단일 가이드 핵산과 이중 가이드 핵산 둘 모두를 지칭하는 포괄적인 의미일 수 있다. 가이드 핵산은 "핵산 표적화 세그먼트" 또는 "핵산 표적화 서열 서열"로 지칭될 수 있는 세그먼트를 포함할 수 있다. 핵산 표적화 세그먼트는 "단백질 결합 세그먼트" 또는 "단백질 결합 서열" 또는 "Cas 단백질 결합 세그먼트"로 지칭될 수 있는 하위 세그먼트를 포함할 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성 퍼센트"는 일반적으로 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정할 때 국소적 또는 전체적 비교 윈도우에 걸쳐 최대 일치를 위해 비교되고 정렬될 때 동일한, 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 지정된 백분율을 갖는 2개(예를 들어, 쌍별 정렬) 이상(예를 들어, 다중 서열 정렬)의 서열을 지칭한다. 폴리펩티드 서열에 적합한 서열 비교 알고리즘은 예를 들어 단어 길이(W) 3, 기대값(E) 10, 및 존재 11, 연장 1에서의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 설정 갭 코스트의 매개변수를 사용하고 30개 잔기보다 긴 폴리펩티드 서열에 대한 조건부 조성 점수 매트릭스 조정을 사용하는 BLASTP; 단어 길이(W) 2, 기대값(E) 1000000, 및 30개 미만의 잔기의 서열에 대한 오픈 갭 9 및 연장 갭 1의 PAM30 스코어링 매트릭스 설정 갭 코스트의 매개변수를 사용하는 BLASTP(이들은 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 이용 가능한 BLAST 스위트의 BLASTP에 대한 디폴트 매개변수임); 의 매개변수를 갖는 CLUSTALW; 일치 2, 불일치 -1 및 갭 -1의 매개변수를 갖는 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘; 디폴트 매개변수를 갖는 MUSCLE; retree가 2이고 최대 반복이 1000인 매개변수를 갖는 MAFFT; 디폴트 매개변수를 갖는 Novafold; 디폴트 매개변수를 갖는 HMMER hmmalign을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "RuvC_III 도메인"은 일반적으로 RuvC 엔도뉴클레아제 도메인(RuvC 뉴클레아제 도메인은 3개의 불연속적인 세그먼트, 즉 RuvC_I, RuvC_II, 및 RuvC_III로 이루어짐)의 불연속적인 3번째 세그먼트를 지칭한다. RuvC 도메인 또는 이의 세그먼트는 일반적으로 알려진 도메인 서열에 대한 정렬, 주석이 달린 도메인을 갖는 단백질에 대한 구조적 정렬에 의해, 또는 알려진 도메인 서열(예를 들어, RuvC_III에 대한 Pfam HMM PF18541)에 기초하여 구축된 히든 마르코프 모델(HMM)과 비교함으로써 식별될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "HNH 도메인"은 일반적으로 특징적인 히스티딘 및 아스파라긴 잔기를 갖는 엔도뉴클레아제 도메인을 지칭한다. HNH 도메인은 일반적으로 알려진 도메인 서열에 대한 정렬, 주석이 달린 도메인을 갖는 단백질에 대한 구조적 정렬에 의해, 또는 알려진 도메인 서열(예를 들어, 도메인 HNH에 대한 Pfam HMM PF01844)에 기초하여 구축된 히든 마르코프 모델(HMM)과 비교함으로써 식별될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "염기 편집기"는 일반적으로 이중 가닥 파손(double-strand break)의 생성 및 복구를 필요로 하지 않으면서 하나의 표적 염기 또는 염기쌍의 다른 것으로의 전환(예를 들어, A:T에서 G:C로, C:G에서 T:A로)을 촉매하는 효소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 데아미나제이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "데아미나제"는 일반적으로 탈아미노화 반응을 촉매하는 단백질 또는 효소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아데닌 또는 아데노신의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 아데노신 데아미나제(예를 들어, DNA에서 아데노신을 탈아미노화하는 조작된 아데노신 데아미나제)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 각각 시티딘(또는 시토신) 또는 데옥시시티딘의 우리딘(또는 우라실) 또는 데옥시우리딘으로의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 시티딘(또는 시토신) 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 시토신(또는 시토신)의 우라실(또는 우리딘)로의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 시티딘(또는 시토신) 데아미나제 도메인이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트, 마우스 또는 박테리아(예를 들어, 이. 콜라이)와 같은 유기체로부터의 자연 발생 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 자연에서 발생하지 않는 유기체로부터의 자연 발생 데아미나제의 변이체이다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 "최적으로 정렬된"은 일반적으로, 예를 들어, 가장 높은 또는 "최적화된" 동일성 퍼센트 점수를 생성하는 정렬에 의해 결정하는 경우 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 최대 일치성으로 정렬된 2개(예를 들어, 쌍별 정렬) 이상(예를 들어, 다중 서열 정렬)의 서열을 지칭한다.
본 개시내용에는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 본원에 기재된 임의의 효소의 변이체가 포함된다. 이러한 보존적 치환은 폴리펩티드의 3차원 구조 또는 기능을 방해하지 않으면서 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 이루어질 수 있다. 보존적 치환은 서로에 대해 유사한 소수성, 극성, 및 R 사슬 길이를 갖는 아미노산을 치환함으로써 달성될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 상이한 종으로부터의 상동성 단백질의 정렬된 서열을 비교함으로써, 코딩된 단백질의 기본 기능을 변경하지 않으면서 종 사이에서 돌연변이된 아미노산 잔기(예를 들어, 비-보존된 잔기)를 위치시킴으로써 보존적 치환을 식별할 수 있다. 이러한 보존적으로 치환된 변이체는 본원에 기재된 엔도뉴클레아제 단백질 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 보존적으로 치환된 변이체는 기능적 변이체이다. 이러한 기능적 변이체는 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 중요한 활성 부위 잔기 또는 가이드 RNA 결합 잔기의 활성이 파괴되지 않도록 치환을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 개시내용에는 효소의 활성을 감소시키거나 제거하기 위한 하나 이상의 촉매 잔기의 치환을 갖는 본원에 기재된 임의의 효소의 변이체(예를 들어, 감소된-활성 변이체)가 포함된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단백질과 같은 감소된 활성 변이체는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 촉매 잔기의 파괴성 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 엔도뉴클레아제는 닉카제 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여된 RuvC 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 활성이 결여되거나 촉매적으로 사멸되도록 포함할 수 있고 구성될 수 있다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 다양한 참고문헌으로부터 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)] 참조). 하기 8개의 그룹은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
개요
고유한 기능 및 구조를 갖는 새로운 Cas 효소의 발견은 데옥시리보핵산(DNA) 편집 기술을 추가로 변경하여 속도, 특이성, 기능 및 사용 용이성을 개선할 잠재력을 제공할 수 있다. 미생물에서 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복 서열(CRISPR) 시스템의 예측된 유병률 및 미생물 종의 완전한 다양성에 비해, 기능적으로 특성규명된 CRISPR/Cas 효소는 문헌에 비교적 거의 없다. 이것은 부분적으로 엄청난 수의 미생물 종들이 실험실 조건에서 쉽게 배양되지 않을 수 있기 때문이다. 다수의 미생물 종을 나타내는 자연 환경적 지위(environmental niche)로부터 메타게놈 시퀀싱은 알려진 새로운 CRISPR/Cas 시스템의 수를 크게 증가시키고, 새로운 올리고뉴클레오티드 편집 기능의 발견을 가속화할 잠재성을 제공할 수 있다. 이러한 접근법의 결실에 대한 최근의 예는 2016년에 천연 미생물 군집의 메타게놈 분석으로부터 CasX/CasY CRISPR 시스템의 발견으로 입증되었다.
CRISPR/Cas 시스템은 미생물에서 적응 면역 시스템으로서 기능하는 것으로 기재된 RNA-유도 뉴클레아제 복합체이다. 자연적 맥락에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR(일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복 서열) 오페론 또는 유전자좌에서 발생하며, 일반적으로 2개의 부분: (i) RNA 기반 표적화 요소를 코딩하는 동등하게 짧은 스페이서 서열에 의해 분리된 짧은 반복 서열(30-40 bp)의 어레이 및 (ii) 부속 단백질/효소와 함께 RNA 기반 표적화 요소에 의해 유도되는 뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩하는 Cas를 코딩하는 ORF를 포함한다. 특정 표적 핵산 서열의 효율적인 뉴클레아제 표적화는 일반적으로 (i) 표적의 처음 6-8개의 핵산(표적 시드)과 crRNA 가이드 사이의 상보적 혼성화; 및 (ii) 표적 시드의 정의된 부근 내에 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 존재(PAM은 일반적으로 숙주 게놈 내에서 통상적으로 나타내지 않는 서열임) 둘 모두를 필요로 한다. 시스템의 정확한 기능 및 조직화에 따라, CRISPR-Cas 시스템은 공유된 기능적 특성 및 진화적 유사성에 기반하여 일반적으로 2가지 클래스, 5가지 타입 및 16가지 서브타입으로 조직화된다(도 1 참조).
클래스 I CRISPR-Cas 시스템은 대형 다중서브유닛 효과기 복합체를 가지며, 타입 I, III 및 IV를 포함한다.
타입 I CRISPR-Cas 시스템은 구성요소의 측면에서 중간 정도로 복잡한 것으로 간주된다. 타입 I CRISPR-Cas 시스템에서, RNA-표적화 요소의 어레이는 이들 다음에 프로토스페이서-인접 모티프(PAM)라 불리는 적합한 짧은 컨센서스(consensus) 서열이 뒤따를 때 뉴클레아제 복합체를 핵산 표적으로 유도하는 짧고 성숙한 crRNA를 방출시키도록 반복 요소에서 프로세싱되는 긴 전구체 crRNA(프리-crRNA)로서 전사된다. 이러한 프로세싱은 crRNA 유도 뉴클레아제 복합체의 뉴클레아제(Cas3) 단백질 구성요소를 또한 포함하는, 캐스케이드(Cascade)라 불리는 대형 엔도뉴클레아제 복합체의 엔도리보뉴클레아제 서브유닛(Cas6)을 통해 발생한다. Cas I 뉴클레아제는 주로 DNA 뉴클레아제로서 기능한다.
타입 III CRISPR 시스템은 Csm 또는 Cmr 단백질 서브유닛을 포함하는 반복체 관련 신비 단백질(repeat-associated mysterious protein: RAMP)과 함께, Cas10으로 알려진 중앙 뉴클레아제의 존재를 특징으로 할 수 있다. 타입 I 시스템에서와 같이, 성숙한 crRNA는 Cas6 유사 효소를 사용하여 프리-crRNA로부터 프로세싱된다. 타입 I 및 II 시스템과 달리, 타입 III 시스템은 DNA-RNA 듀플렉스(예컨대, RNA 폴리머라제에 대한 주형으로 사용되는 DNA 가닥)를 표적화하여 절단하는 것으로 보인다.
타입 IV CRISPR-Cas 시스템은 고도로 감소된 대형 서브유닛 뉴클레아제(csf1), Cas5(csf3) 및 Cas7(csf2) 그룹의 RAMP 단백질에 대한 2개의 유전자, 및 일부 경우에, 예측된 소형 서브유닛에 대한 유전자로 이루어진 효과기 복합체를 보유하고; 이러한 시스템은 통상적으로 내인성 플라스미드에서 발견된다.
클래스 II CRISPR-Cas 시스템은 일반적으로 단일 폴리펩티드 다중도메인 뉴클레아제 효과기를 가지며, 타입 II, V 및 VI를 포함한다.
타입 II CRISPR-Cas 시스템은 구성요소 측면에서 가장 단순한 것으로 간주된다. 타입 II CRISPR-Cas 시스템에서, CRISPR 어레이의 성숙한 crRNA로의 프로세싱은 특별한 엔도뉴클레아제 서브유닛의 존재를 필요로 하지 않고, 오히려 어레이 반복 서열에 상보적인 영역을 갖는 작은 트랜스-코딩된 crRNA(tracrRNA)를 필요로 하고; tracrRNA는 이의 상응하는 효과기 뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 및 반복 서열 둘 모두와 상호작용하여 전구체 dsRNA 구조를 형성하고, 이는 내인성 RNAse III에 의해 절단되어 tracrRNA 및 crRNA 둘 모두가 로딩된 성숙한 효과기 효소를 생성한다. Cas II 뉴클레아제는 DNA 뉴클레아제로 알려져 있다. 타입 2 효과기는 일반적으로 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인의 폴드 내에 삽입된 관련 없는 HNH 뉴클레아제 도메인과 함께 RNase H 폴드를 채택하는 RuvC 유사 엔도뉴클레아제 도메인으로 이루어진 구조를 나타낸다. RuvC 유사 도메인은 표적(예를 들어, crRNA 상보적) DNA 가닥의 절단을 담당하는 반면, HNH 도메인은 대체된 DNA 가닥의 절단을 담당한다.
타입 V CRISPR-Cas 시스템은 RuvC 유사 도메인을 포함하여, 타입 II 효과기와 유사한 뉴클레아제 효과기(예를 들어, Cas12) 구조를 특징으로 한다. 타입 II와 유사하게, 타입 V CRISPR 시스템의 대부분(전부는 아님)은 tracrRNA를 사용하여 프리-crRNA를 성숙한 crRNA로 프로세싱하지만, 프리-crRNA를 다수의 crRNA로 절단하기 위해 RNAse III를 필요로 하는 타입 II 시스템과는 달리, 타입 V 시스템은 효과기 뉴클레아제 자체를 사용하여 프리-crRNA를 절단할 수 있다. 타입-II CRISPR-Cas 시스템과 마찬가지로, 타입 V CRISPR-Cas 시스템은 다시 DNA 뉴클레아제로 알려져 있다. 타입 II CRISPR-Cas 시스템과 달리, 일부 타입 V 효소(예를 들어, Cas12a)는 이중 가닥 표적 서열의 첫 번째 crRNA 유도 절단에 의해 활성화되는 강력한 단일 가닥의 비특이적 데옥시리보뉴클레아제 활성을 갖는 것으로 보인다.
타입 VI CRIPSR-Cas 시스템은 RNA 가이드된 RNA 엔도뉴클레아제를 갖는다. RuvC 유사 도메인 대신에, 타입 VI 시스템(예를 들어, Cas13)의 단일 폴리펩티드 효과기는 2개의 HEPN 리보뉴클레아제 도메인을 포함한다. 타입 II 및 V 시스템 둘 모두와 달리, 타입 VI 시스템은 또한 프리-crRNA를 crRNA로 프로세싱하기 위해 tracrRNA를 필요로 하지 않는 것으로 보인다. 그러나, 타입 V 시스템과 유사하게, 일부 타입 VI 시스템(예를 들어, C2C2)은 표적 RNA의 첫 번째 crRNA 유도 절단에 의해 활성화된 강력한 단일 가닥의 비특이적 뉴클레아제(리보뉴클레아제) 활성을 보유하는 것으로 보인다.
이의 더 단순한 구조 때문에, 클래스 II CRISPR-Cas는 디자이너 뉴클레아제/게놈 편집 활용으로서 조작 및 개발을 위해 가장 널리 채택되어 왔다.
시험관내 사용을 위한 이러한 시스템의 초기 변경 중 하나는 문헌[Jinek et al. (Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)]에서 찾을 수 있다. Jinek 연구는 처음으로 (i) 에스. 피오게네스 SF370으로부터 단리된, 재조합에 의해 발현되고 정제된 전장 Cas9(예를 들어, 클래스 II, 타입 II Cas 효소), (ii) 절단하고자 하는 표적 DNA 서열에 상보적인 ∼20 nt 5' 서열, 이어서 3' tracr-결합 서열을 갖는 정제된 성숙한 ~42 nt crRNA(전체 crRNA는 T7 프로모터 서열을 갖는 합성 DNA 주형으로부터 시험관내에서 전사됨); (iii) T7 프로모터 서열을 갖는 합성 DNA 주형으로부터 전사된, 시험관내에서 정제된 tracrRNA, 및 (iv) Mg2+를 포함하는 시스템을 기술하였다. Jinek은 이후 (ii)의 crRNA가 링커(예를 들어, GAAA)에 의해 (iii)의 5' 말단에 연결되어 Cas9를 그 자체로 표적으로 유도할 수 있는 단일 융합 합성 가이드 RNA(sgRNA)를 형성하는 개선된 조작된 시스템을 기술하였다.
그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[Mali et al. (Science. 2013 Feb 15; 339(6121): 823-826.)]은 이후에 (i) C 말단 핵 국소화 서열(예를 들어, SV40 NLS) 및 적합한 폴리아데닐화 신호(예를 들어, TK pA 신호)와 함께 적합한 포유동물 프로모터 하의 코돈 최적화된 Cas9(예를 들어, 클래스 II, 타입 II Cas 효소)를 코딩하는 ORF; 및 (ii) 적합한 폴리머라제 III 프로모터(예를 들어, U6 프로모터) 하의 sgRNA(G로 시작하는 5' 서열에 이어서, 3' tracr-결합 서열에 결합된 20 nt의 상보적인 표적화 핵산 서열, 링커 및 tracrRNA 서열을 가짐)를 코딩하는 ORF를 코딩하는 DNA 벡터를 제공함으로써 포유동물 세포에서 사용하기 위해 상기 시스템을 변경하였다.
염기 편집
염기 편집은 이중 가닥 파손의 생성 및 복구를 필요로 하지 않는 하나의 표적 염기 또는 염기쌍의 다른 것으로의 전환(예를 들어, A:T에서 G:C로, C:G에서 T:A로)이다. 염기 편집은 DNA 또는 RNA 내의 특정 부위에 점 돌연변이를 도입할 수 있게 하는 DNA 및 RNA 염기 편집기의 도움으로 달성될 수 있다. 일반적으로, DNA 염기 편집기는 촉매적 불활성 뉴클레아제와, 단일 가닥 DNA(ssDNA)에만 작용하는 촉매적 활성 염기-변형 효소의 융합을 포함할 수 있다. RNA 염기 편집기는 유사한 RNA 특이적 효소로 구성될 수 있다. 염기 편집은 DNA 내의 비표적(off-target) 및 무작위 돌연변이를 감소시키면서 유전자 변형의 효율을 증가시킬 수 있다.
DNA 염기 편집기는 세포 및 유기체에서 단일 염기 치환을 위한 도구 역할을 하는 조작된 리보핵단백질 복합체이다. 이들은 조작된 염기-변형 효소를 dsDNA를 절단할 수 없는 촉매적으로 결핍된 Cas 변이체와 융합시켜 생성될 수 있지만, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열 의존적 방식으로 dsDNA를 풀어서(unfold) 가이드 RNA가 이의 상보적인 표적을 찾아서 ssDNA 절단 부위를 나타내도록 할 수 있다. 가이드 RNA는 상보적 DNA에 어닐링하여, ssDNA의 단편을 대체하고 Cas '가위(scissors)'를 염기 변형 부위로 유도한다. 세포 복구 기구는 상보적인 편집된 주형으로부터의 정보를 사용하여 닉킹된(nicked) 비편집된 가닥을 복구할 것이다.
지금까지, 2가지 타입의 DNA 편집기, 시토신 염기(CBE) 및 아데닌 염기 편집기(ABE)가 개발되었다. 이들은 최소한의 비표적 DNA 편집으로 DNA 내의 점 돌연변이를 효율적이고 정확하게 편집하는 것으로 나타났다(문헌[Nat Biotechnol. 2017;35:435-437, Nat Biotechnol. 2017;35:438-440 and Nat Biotechnol. 2017;35:475-480, 이들 각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨] 참조). 그러나, 최근의 연구 결과는 DNA에 비표적 변형이 존재하고 많은 비표적 변형이 DNA 염기 편집기에 의해 RNA에도 도입된다는 것을 나타낸다.
MG 염기 편집기
일부 양상에서, 본 개시내용은 (a) RuvC 도메인 및 HNH 도메인를 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; (b) 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및 (c) 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, (i) 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 (ii) 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있다. 일부 경우에, 엔도뉴클레아제는 닉카제 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성된다. 일부 경우에 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열은 tracr 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 (a) 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, (i) 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 (ii) 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다. 일부 경우에 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열은 tracr 서열을 포함한다. 일부 경우에, RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있다. 일부 경우에, 엔도뉴클레아제는 닉카제 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 (a) 서열번호 360-368 또는 598 중 어느 하나를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 및 (b) 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및 (c) 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, (i) 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 (ii) 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다. 일부 경우에, 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열은 tracr 서열을 포함한다. 일부 경우에, 엔도뉴클레아제는 닉카제 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있다. 일부 경우에, 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제에 대해 80% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 HNH 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, tracr 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나 또는 이의 변이체로부터 선택된 약 60 내지 90 개의 연속 뉴클레오티드에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, tracr 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비축퇴성 뉴클레오티드에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 (a) (i) 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 (ii) tracr 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, 상기 tracr 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비축퇴성 뉴클레오티드에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 가이드 리보핵산 구조체; 및 상기 조작된 가이드 리보핵산에 결합하도록 구성된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 360, 362 또는 368 중 어느 하나를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 서열번호 1-51, 57-66, 385-443, 444-475 또는 594-595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 아데닌 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 서열번호 50-51, 57, 385-443, 448-475 또는 595 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 시토신 데아미나제이다.일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 1-49, 444-447, 594, 또는 58-66 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템은 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 우라실 DNA 글리코실라제 억제제는 서열번호 52-56 또는 서열번호 67 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 가이드 리보핵산 구조체는 적어도 2개의 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 가이드 리보핵산 구조체는 가이드 리보핵산 서열 및 tracr 리보핵산 서열을 포함하는 하나의 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 리보핵산 서열은 원핵생물, 박테리아, 고세균, 진핵생물, 진균, 식물, 포유동물 또는 인간 게놈 서열에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 가이드 리보핵산 서열은 길이가 15 내지 24 개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제의 N- 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함한다.
NLS는 하기 표 1의 임의의 서열 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다:
표 1: 본 개시내용에 따라 Cas 효과기와 함께 사용될 수 있는 예시적인 NLS 서열
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 염기 편집기에 직접 공유 결합되거나, 링커를 통해 염기 편집기에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 효소 또는 도메인을 연결시키는 링커는 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS, SGSETPGTSESATPESA, GSGGS, SGSETPGTSESATPES, SGGSS, 또는 GAAA, 또는 본원에 기재된 임의의 다른 링커 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열의 하나 또는 다수의 카피를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 엔도뉴클레아제 및 염기 편집기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 Mg2+ 공급원을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 70 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 88의 적어도 하나와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 360을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 71 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 89 중 적어도 하나와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 361을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 73 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 91의 적어도 하나와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 363을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 75 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 93의 적어도 하나와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 365를 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 76 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 94의 적어도 하나와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 366을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 77 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 95의 적어도 하나와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 367을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 78 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 가이드 RNA 구조체는 서열번호 96의 적어도 하나와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고; 엔도뉴클레아제는 서열번호 368을 포함하는 PAM에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 염기 편집기는 아데닌 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제는 서열번호 57 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 시토신 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 58 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템은 우라실 DNA 글리코실화 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 우라실 DNA 글리코실화 억제제는 서열번호 67 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열 동일성은 BLASTP, CLUSTALW, MUSCLE, MAFFT 또는 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 단어 길이(W) 3, 기대값(E) 10, 및 존재 11, 연장 1에서의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 설정 갭 코스트의 매개변수를 사용하고 조건부 조성 점수 매트릭스 조정을 사용하여 상기 BLASTP 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 핵산은 염기 편집기에 커플링된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하고, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 핵산을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 핵산은 염기 편집기에 커플링된, 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 것인 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 상기 엔도뉴클레아제의 N- 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유기체는 원핵생물, 박테리아, 진핵생물, 진균, 식물, 포유동물, 설치류 또는 인간이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 염기 편집기에 커플링된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 본원에 기재된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서, 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 tracr 리보핵산 서열을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, CELiD, 아데노 관련 바이러스(AAV) 유래의 비리온 또는 렌티바이러스이다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제의 제조 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서, 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를, RuvC 도메인 및 HNH 도메인를 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있는 것인 엔도뉴클레아제; 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제는 염기 편집기에 직접 공유 결합되거나, 링커를 통해 염기 편집기에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서, 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를, 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제, 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기 및 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고; 여기서 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하고; 상기 PAM은 서열번호 360-368 또는 598 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 염기 편집기에 공유 결합되거나, 링커를 통해 염기 편집기에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 서열번호 1-51, 57-66, 385-443, 444-475 또는 594-595 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 아데닌 데아미나제를 포함하고; 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 아데닌을 포함하고; 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리펩티드를 변형시키는 것은 아데닌을 구아닌으로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제는 서열번호 57 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염기 편집기는 시토신 데아미나제를 포함하고; 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 시토신을 포함하고; 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리펩티드를 변형시키는 것은 시토신을 우라실로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 58 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 59-66 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복합체는 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 우라실 DNA 글리코실라제 억제제는 서열번호 52-56 또는 서열번호 67 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 조작된 가이드 리보핵산 구조체의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 가닥 및 상기 PAM을 포함하는 제2 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, PAM은 조작된 가이드 리보핵산 구조체의 서열에 상보적인 서열의 3' 말단에 바로 인접한다.
일부 실시양태에서, 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제, Cas14 엔도뉴클레아제, Cas12a 엔도뉴클레아제, Cas12b 엔도뉴클레아제, Cas 12c 엔도뉴클레아제, Cas12d 엔도뉴클레아제, Cas12e 엔도뉴클레아제, Cas13a 엔도뉴클레아제, Cas13b 엔도뉴클레아제, Cas13c 엔도뉴클레아제 또는 Cas 13d 엔도뉴클레아제가 아니다. 일부 실시양태에서, 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 진핵생물, 식물, 진균, 포유동물, 설치류 또는 인간 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계를 포함하고, 여기서 엔도뉴클레아제는 조작된 가이드 리보핵산 구조체와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 복합체는 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌에 결합시, 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌의 뉴클레오티드를 변형시키도록 구성되는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템은 아데닌 데아미나제를 포함하고, 뉴클레오티드는 아데닌이고, 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 것은 아데닌을 구아닌으로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템은 시티딘 데아미나제 및 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 포함하고, 뉴클레오티드는 시토신이고 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 것은 아데닌을 우라실로 전환시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 유전자좌는 게놈 DNA, 바이러스 DNA 또는 박테리아 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 유전자좌는 시험관내에 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 유전자좌는 세포 내에 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포, 진균 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 설치류 세포, 영장류 세포 또는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 동물 내에 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 달팽이관 내에 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 배아 내에 있다. 일부 실시양태에서, 배아는 2세포 배아이다. 일부 실시양태에서, 배아는 마우스 배아이다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 본원에 기재된 핵산 또는 본원에 기재된 벡터를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 엔도뉴클레아제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 전달하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 엔도뉴클레아제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 엔도뉴클레아제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 함유하는 캡핑된 mRNA를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 번역된 폴리펩타이드를 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산 편집 시스템을 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 리보핵산(RNA) pol III 프로모터에 작동 가능하게 연결된 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 코딩하는 데옥시리보핵산(DNA)을 전달하는 것을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 RuvC 도메인 및 HNH 도메인를 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 및 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드를 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 360-368 또는 598 중 어느 하나를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 및 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제에 대해 80% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 HNH 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나 또는 이의 변이체로부터 선택된 약 60 내지 90 개의 연속 뉴클레오티드에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비축퇴성 뉴클레오티드에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 아데닌 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 서열번호 50-51, 57, 385-443, 448-475, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 시토신 데아미나제이다.일부 실시양태에서, 시토신 데아미나제는 서열번호 1-49, 444-447, 594, 또는 58-66 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 개시내용의 시스템은 예를 들어 핵산 편집(예를 들어, 유전자 편집), 핵산 분자에 대한 결합(예를 들어, 서열-특이적 결합)과 같은 다양한 적용을 위해 사용될 수 있다. 이러한 시스템은, 예를 들어, 대상체에서 질환을 유발할 수 있는 유전적으로 유전된 돌연변이를 해결(예를 들어, 제거 또는 대체)하여 유전자를 불활성화시킴으로써 세포에서 이의 기능을 확인하기 위해, 질환 유발 유전 요소를 검출하기 위한 진단 도구로서(예를 들어, 역전사된 바이러스 RNA 또는 질환 유발 돌연변이를 코딩하는 증폭된 DNA 서열의 절단을 통해), 특정 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 박테리아에서 항생제 내성을 코딩하는 서열)을 표적화하고 검출하기 위한 프로브와 조합된 불활성화된 효소로서, 바이러스를 불활성화하거나 바이러스 게놈을 표적화하여 숙주 세포를 감염시킬 수 없도록 하기 위해, 가치있는 소분자, 거대분자 또는 2차 대사산물을 생산하도록 유기체를 조작하기 위해 유전자를 추가하거나 대사 경로를 수정하기 위해, 진화적 선택을 위한 유전자 구동 요소를 확립하기 위해, 바이오센서로서 외래 소분자 및 뉴클레오티드에 의한 세포 변화를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
표 2: 본원에 언급된 단백질 및 핵산 서열의 서열 목록
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예
실시예 1. - 염기 편집기를 위한 플라스미드 작제
염기 편집을 표적화하기 위해 CRISPR 기능을 이용하는 염기 편집 효소를 생성하기 위해, Cas 효과기 효소를 본원에 기재된 예시적인 데아미나제에 다양한 구성으로 융합시켰다. 이 과정은 융합 효소를 생성하기에 적합한 벡터를 작제하는 첫 번째 단계를 포함한다. 2개의 진입 플라스미드 벡터, MGA 및 MGC를 먼저 작제하였다.
T7 프로모터-His 태그-TadA*(ABE8.17m)-SV40 NLS를 함유하는 MGA(Metagenomi 아데닌 염기 편집기) 진입 플라스미드를 작제하기 위해, 3개의 DNA 단편을 pAL6으로부터 증폭시켰다. T7 프로모터-His 태그-APOBEC1(BE3)-UGI-SV40 NLS를 함유하는 MGC(Metagenomi 시토신 염기 편집기) 진입 플라스미드를 작제하기 위해, APOBEC1 및 UGI-SV40 NLS를 pAL9로부터 증폭시키고, 두 조각의 벡터 백본을 pAL6로부터 증폭시켰다(도 3 참조).
효과기 내로 돌연변이를 도입하기 위해, MG1-4, MG1-6, MG3-6, MG3-7, MG3-8, MG4-5, MG14-1, MG15-1 또는 MG18-1 효과기 유전자 서열을 함유하는 소스 플라스미드를 적절한 돌연변이를 포함하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 Q5 DNA 폴리머라제에 의해 증폭시켰다. 그 다음, 선형 DNA 단편을 인산화하고 라이게이션하였다. DNA 주형을 제조업체의 지침에 따라 KLD 효소 믹스(New England Biolabs)를 사용하여 DpnI로 분해시켰다.
pMGA 및 pMGC 발현 플라스미드를 생성하기 위해, 돌연변이된 효과기를 보유하는 플라스미드로부터 유전자를 증폭시키고 각각 XhoI 및 SacII 부위를 통해 MGA 및 MGC 진입 플라스미드로 클로닝하였다. T7 프로모터-sgRNA-양방향 터미네이터를 포함하는 sgRNA 발현 카세트를 BE 발현 플라스미드로 클로닝하기 위해, 한 세트의 프라이머(정방향 프라이머로서 P366)를 사용하여 T7 프로모터-스페이서 서열을 증폭시키는 한편, 또 다른 세토의 프라이머(역방향 프라이머로서 P367)를 사용하여 스페이서 서열-sgRNA 스캐폴드-양방향 터미네이터를 증폭시켰고, 여기서 pTCM 플라스미드를 주형으로서 사용하였다(도 2 참조). 2개의 단편을 XbaI 부위를 통해 pMGA 및 pMGC로 조립하여 각각 pMGA-sgRNA 및 pMGC-sgRNA를 생성하였다.
표 3 - 본원에 기재된 ABE 스크리닝 시스템을 위해 제조된 작제물의 요약
Figure pct00005
Figure pct00006
증폭된 모든 DNA 단편을 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen)에 의해 정제하고, NEBuilder HiFi DNA Assembly(New England Biolabs)를 통해 조립하고, 생성된 조립체를 제조업체의 지침에 따라 Endura 전기천공적격(Electrocompetent) 세포(Lucergen)를 통해 증식하였다(도 4 및 5 참조). 클로닝된 모든 유전자의 DNA 서열은 ELIM BIOPHARM에서 확인되었다.
표 4 - 본원에 기재된 선택된 시스템에 대해 분석된 보존된 촉매 잔기
Figure pct00007
실시예 2.- 단백질 발현 및 정제
pMGA 및 pMGC 플라스미드에서 T7 프로모터 구동된 돌연변이된 효과기 유전자를 상기 실시예 1에 기재된 각각의 플라스미드로 형질전환시킴으로써 제조업체의 지침(Thermo)에 따라 Magic Media 중의 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포에서 발현시켰다. 16℃에서 40시간 인큐베이션한 후, 형질전환된 세포를 수거하고, 용해 완충액(HisTrap 평형 완충액: 20 mM Tris(Sigma T2319-100 ML), 300 mM 염화나트륨(VWR VWRVE529-500 ML), 5% 글리세롤, 10 mM MgCl2, 10 mM 이미다졸(Sigma 68268-100 ML-F) 포함; pH 7.5) 및 EDTA-무함유 프로테아제 억제제(Pierce)에 현??시키고, -80℃ 냉동고에서 냉동시켰다. 그 다음, 세포를 얼음 위에서 해동하고, 초음파 처리하고, 정화하고, 친화성 정제 전에 여과하였다. 단백질을 제조업체의 사양에 따라 Akta Avant FPLC 상의 Cytiva 5ml HisTrap FF 컬럼에 적용하고 단백질을 20 mM Tris(Sigma T2319-100 ML), 300 mM 염화나트륨(VWR VWRVE529-500 ML), 5% 글리세롤, 10 mM MgCl2, 250 mM 이미다졸 포함(Sigma 68268-100 ML-F); pH 7.5의 등용매 용출로 용출시켰다. His-태그된 효과기 단백질을 함유하는 용출된 분획을 농축시키고 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 5% 글리세롤; pH 7.5로 완충액 교환하였다. Image Lab(Bio-Rad)에서 SDS PAGE 농도계로 상대적 순도를 결정한 후 단백질 농도를 비신코닌산 분석(Thermo)으로 결정하고 조정하였다(도 7 참조).
실시예 3. - 시험관내 닉카제 분석
IDT에 의해 합성된 6-카르복시플루오레세인(6-FAM) 표지된 프라이머 P141 및 P146(서열번호 179 및 180)을, Q5 DNA 폴리머라제를 사용하여 효과기의 표적화 서열을 함유하는 LacZ의 선형 단편을 증폭시키는 데 사용하였다. T7 프로모터에 이어서 20-bp 또는 22-bp 스페이서 서열을 함유하는 sgRNA를 함유하는 DNA 단편을 제조업체의 지침에 따라 HiScribe T7 고수율 RNA 합성 키트(New England Biolabs)를 사용하여 시험관내에서 전사하였다. 서열 목록에서 명명된 sgRNA에 상응하는 서열을 갖는 합성 sgRNA를 사용자 매뉴얼에 따라 Monarch RNA Cleanup 키트(New England Biolabs)로 정제하고 농도를 Nanodrop으로 측정하였다.
DNA 닉카제 활성을 결정하기 위해, 각각의 정제된 돌연변이된 효과기를 먼저 이의 동족 sgRNA로 보충하였다. 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 150 nM 효소, 150 nM RNA 및 15 nM DNA를 함유하는 15 μL 반응 혼합물에 선형 DNA 기질을 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 분해된 DNA를 AMPure XP SPRI 상자성 비드(Beckman Coulter)를 사용하여 정제하고 6 μL TE 완충액(10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 8.0)으로 용출시켰다. 닉킹된 DNA를 10% TBE-우레아 변성 겔(Biorad)에서 분해시키고 ChemiDoc(Bio-Rad)에 의해 이미지화하였다(도 7 참조, 이는 야생형 효소의 경우에 400개 및 200개 염기인 것에 비해 도시된 효소는 600개 및 200개 염기의 밴드의 생성에 의해 닉카제 활성을 나타냄을 보여준다). 결과는 결정적이지 않은 MG4-5(D17A)를 제외한 도 7에서 테스트된 모든 닉카제 돌연변이가 야생형 절단 활성 대신 예상된 닉카제 활성을 나타냈음을 보여주었다.
실시예 4.- 이. 콜라이 내로의 염기 편집기 도입
플라스미드를 제조업체의 지침에 따라 Lucergen의 전기천공적격 BL21(DE3) 세포로 형질전환시켰다. 전기천공 후, 세포를 37℃에서 1시간 동안 발현 회수 배지로 회수하고 100 L/mg 암피실린 및 0.1 mM IPTG를 함유하는 LB 플레이트에 도말하였다. 37℃에서 밤새 성장시킨 후, 콜로니를 채취하고 lacZ 유전자를 프라이머 P137 및 P360을 사용하여 Q5 DNA 폴리머라제(New England Biolabs)에 의해 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 정제하고 ELIM BIOPHARM에서 생어 시퀀싱에 의해 시퀀싱하였다. 시토신 염기 편집기 또는 아데닌 염기 편집기 각각에 대한 표적화된 프로토스페이서 영역에 C에서 T로의 전환 또는 A에서 G로의 전환이 존재하는지 여부를 조사하여 염기 편집을 결정하였다.
이. 콜라이에서 편집 효율을 평가하기 위해, 플라스미드를 전기천공적격 BL21(DE3)(Lucergen)로 형질전환시키고 전기천공된 세포를 37℃에서 1시간 동안 발현 회수 배지로 회수하였다. 10 μL의 회수된 세포를 96웰 딥 웰 플레이트에서 100 μL/mg 암피실린 및 0.1 mM IPTG를 함유하는 990 μL SOB에 접종하고, 37℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 염기 편집기 발현을 위해 유도된 1 μL 세포를 프라이머 P137 및 P360을 사용한 20 μL PCR 반응(Q5 DNA 폴리머라제)에서 lacZ 유전자의 증폭을 위해 사용하였다. 생성된 PCR 산물을 정제하고 ELIM BIOPHARM에서 생어 시퀀싱에 의해 시퀀싱하였다. 편집 효율의 정량화는 실시예 12에 기재된 바와 같이 Edit R에 의해 처리하였다.
표 5 - 관련 PAM 및 데아미나제와 함께 본원에 기재된 MG 염기 편집기
Figure pct00008
실시예 5. - 포유동물 세포에서의 단백질 뉴클레오펙션 및 앰플리콘 seq(예측)
뉴클레오펙션은 Lonza 4D 뉴클레오펙터(nucleofector) 및 Lonza SF 세포주 4D-Nucleofector X 키트 S(카탈로그 번호 V4XC-2032)를 사용하여 제조업체의 권장사항에 따라 포유동물 세포(예를 들어, K-562, Neuro-2A 또는 RAW264.7)에서 수행한다. SF 뉴클레오펙션 완충액을 조제한 후, 200,000개의 세포를 뉴클레오펙션당 5 μl의 완충액에 재현탁한다. 뉴클레오펙션당 나머지 15 μl의 완충액에서, Synthego의 20 pmol의 화학적으로 변형된 sgRNA를 18 pmol의 염기 편집 효소(예를 들어, ABE8e)와 합하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하여 복합체를 제조한다. 세포를 20 μl 뉴클레오펙션 큐벳에 첨가한 후, 단백질 용액을 첨가하고, 혼합물을 분쇄하여 혼합한다. 세포를 프로그램 CM-130으로 뉴클레오펙션하고, 그 직후에 회수를 위해 80 μl의 가온된 배지를 각 웰에 첨가한다. 5분 후, 각 샘플로부터의 25 μl를 48웰 폴리-d-리신 플레이트(Corning) 내의 250 μl의 신선한 배지에 첨가한다. 그 다음, 세포를 3일 더 배양한 후 게놈 DNA 추출을 위해 상기 리포펙션된 세포와 동일한 방식으로 처리한다.
Illumina 바코딩 후, PCR 산물을 30 μl H2O로 용출시키면서 Monarch DNA 겔 추출 키트(New England Biolabs)를 사용하여 2% 아가로스 겔로 전기영동하여 풀링하고 정제한다. DNA 농도를 Qubit dsDNA 고감도 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)로 정량화하고 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina MiSeq 기기(페어드 엔드 리드(paired-end read), R1: 250 내지 280 사이클, R2: 0 사이클)에서 시퀀싱한다.
시퀀싱 리드를 MiSeq 리포터(Illumina)를 사용하여 역다중화하고 CRISPResso2를 사용하여 FASTQ 파일을 분석한다. 개별 대립유전자의 이중 편집을 Python 스크립트에 의해 분석한다. 염기 편집 값은 상이한 연구원들에 의해 수집된 n = 3개의 독립적인 생물학적 복제물을 대표하며, 평균 ± 표준 편차가 표시된다. 염기 편집 값은 정렬된 총 리드에 걸쳐 아데닌 돌연변이유발을 갖는 리드 수의 백분율로서 보고된다.
실시예 6. - 포유동물 세포에서 플라스미드 뉴클레오펙션 및 전체 게놈 seq(예측)
모든 플라스미드는 우라실 특이적 절제 시약(USER) 클로닝 방법에 의해 조립한다. SpCas9, SaCas9 및 모든 조작된 변형에 대한 가이드 RNA 플라스미드를 조립한다. 포유동물 세포 형질감염을 위한 플라스미드는 ZymoPURE Plasmid Midiprep 키트(Zymo Research Corporation)를 사용하여 제조한다. HEK293T 세포(ATCC CRL-3216)는 10% 소 태아 혈청(ThermoFisher Scientific)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Corning)에서 배양하고 37℃에서 5% CO2로 유지한다.
HEK293T 세포를 동일한 배양 배지에서 48웰 폴리-d-리신 플레이트(Corning)에 시딩한다. 1.5 μl 리포펙타민 2000(ThermoFisher Scientific)으로 플레이팅한지 12 내지 16시간 후에 세포를 750 ng 염기 편집기 플라스미드, 250 ng 가이드 RNA 플라스미드 및 형질감염 대조군으로서 10 ng 녹색 형광 단백질을 사용하여 형질감염시킨다. 첫날 후 3일마다 배지를 교환하면서 세포를 배양한 다음, Å~1 PBS(ThermoFisher Scientific)로 세척한 후, 100 μl의 새로 준비된 용해 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.05% SDS, 25 ㎍ ml-1 프로테이나제 K(ThermoFisher Scientific))를 각각의 형질감염된 웰에 직접 첨가하여 게놈 DNA를 추출한다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 80℃에서 30분 동안 열 불활성화한다. 이후 게놈 DNA 용해물을 고처리량 시퀀싱(HTS)을 위해 즉시 사용한다.
HEK293T 세포로부터의 게놈 DNA의 HTS를 수행한다. Illumina 바코딩 후, PCR 산물을 30μl H2O로 용출시키면서 Monarch DNA 겔 추출 키트(NEB)를 사용하여 2% 아가로스 겔로 전기영동하여 풀링하고 정제한다. DNA 농도를 Qubit dsDNA 고감도 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)로 정량화화고 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina MiSeq 기기(페어드 엔드 리드, R1: 250 내지 280 사이클, R2: 0 사이클)에서 시퀀싱한다.
실시예 7. - 편집 윈도우의 결정(예측)
편집 윈도우 영역을 조사하기 위해, 지정된 sgRNA에서 가장 높은 C-T 전환 빈도를 나타내는 시토신을 1로 정규화하고, 이후에 동일한 sgRNA의 PAM 서열의 30nt 상류부터 10nt 하류에 이르는 위치에 있는 다른 시토신(총 43 bp)을 정규화한다. 그 다음, 정규화된 C-T 전환 빈도를 지정된 염기 편집기의 모든 테스트된 sgRNA에 대해 위치에 따라 분류하고 비교한다. 포괄적인 편집 윈도우(comprehensive editing window: CEW)는 정규화 후 평균 C-T 전환 효율이 0.6을 초과하는 위치에 걸쳐있는 것으로 정의된다.
각 시티딘 데아미나제에 대한 기질 선호도를 조사하기 위해, C 부위를 초기에 sgRNA 표적화 영역 내의 이의 위치에 따라 분류하고, 정규화된 C-T 전환 빈도가 0.8 이상인 적어도 하나의 C 부위를 함유하는 위치를 후속 분석에 포함시킨다. 그 다음, 선택된 C 부위를 편집된 시토신(NC 또는 CN)의 상류 또는 하류에 있는 염기 유형에 따라 비교한다. 엔도뉴클레아제의 N-말단과 C-말단 둘 모두에서 효율적인 C-T 전환을 나타내는 시티딘 데아미나제에 대해, 각각의 NT- 및 CT-CBE를 함께 통합하여 기질 선호도를 평가한다. 통계 분석을 위해, 일원 분산분석을 사용하고 p < 0.05를 유의한 것으로 간주한다.
실시예 8a.- 포유동물 세포에서 전체 게놈 시퀀싱 및 전사체학을 통한 비표적 분석 테스트(예측)
리포펙션 16 내지 20시간 전에, HEK293T 세포를 항생제가 없는 DMEM+GlutaMAX 배지(Thermo Fisher Scientific)에서 웰당 3.104개 세포의 밀도로 48웰 폴리-d-리신-코팅된 플레이트에 플레이팅한다. 750ng 닉카제 또는 염기 편집기 발현 플라스미드 DNA를 15μl Opti-MEM+GlutaMAX에서 250ng의 sgRNA 발현 플라스미드 DNA와 합한다. 이것을 웰당 1.5 μl 리포펙타민 2000 및 8.5 μl Opti-MEM + GlutaMAX를 포함하는 10μl의 지질 혼합물과 합한다. 형질감염 3일 후 세포를 수거하고 DNA 또는 RNA를 수거한다. DNA 분석을 위해, 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, 제조업체의 지침에 따라 100 μl QuickExtract 완충액(Lucigen)에 용해시킨다. RNA 수거의 경우, MagMAX mirVana 총 RNA 단리 키트(Thermo Fisher Scientific)를 KingFisher Flex와 함께 사용한다.
포유동물 세포로부터의 게놈 DNA를 제조업체의 지침에 따라 96웰 플레이트 Nextera 인덱싱 프라이머(Illumina)를 사용하는 Nextera DNA Flex 라이브러리 준비 키트(Illumina)를 사용하여 단편화하고 어댑터-라이게션한다. 라이브러리 크기 및 농도를 단편 분석기(Agilent)로 확인하고 DNA를 Illumina HiSeq 시스템을 사용한 WGS를 위해 Novogene로 보낸다.
모든 표적화 NGS 데이터는 하기의 일반적인 4단계를 수행하여 분석한다. (1) 정렬; (2) 중복 마킹; (3) 변이체 호출; 및 (4) 아티팩트 및 생식계열 돌연변이를 제거하기 위한 변이체의 백그라운드 여과. 돌연변이 참조 및 대체 대립유전자는 참조 게놈의 플러스 가닥과 관련하여 보고된다.
전체 전사체 시퀀싱을 위해, NEBNext 폴리(A) mRNA 마그네틱 단리 모듈(New England BioLabs)을 사용하여 mRNA 선택을 수행한다. Illumina용 NEBNext Ultra II RNA 라이브러리 준비 키트(New England BioLabs)를 사용하여 RNA 라이브러리 준비를 수행한다. RNA 입력량에 기초하여, 어댑터 라이게이션된 DNA의 PCR 농축을 위해 12의 사이클 횟수를 사용한다. 이 방법으로 수행되는 모든 크기 선별을 위해 전반적으로 NEBNext 샘플 정제 비드(New England BioLabs)를 사용한다. Illumina(New England BioLabs)용 NEBNext Multiplex Oligos는 프로토콜에 설명된 PCR 레시피에 따라 멀티플렉스 인덱스를 위해 사용한다. 시퀀싱 전에, 4200 TapeStation System(Agilent)에서 고감도 D1000 ScreenTape를 사용하여 샘플을 품질 확인한다. NovaSeq(Novogene)를 사용하여 라이브러리를 풀링하고 시퀀싱한다. 그 다음, 표적화 RNA 시퀀싱을 수행한다. 제조업체의 지침에 따라 EZDnase(Thermo Fisher Scientific)가 포함된 SuperScript IV 원-스텝 RT-PCR 시스템을 사용하여 단리된 RNA로부터 역전사(RT-PCR)를 통한 PCR에 의해 상보적 DNA를 생성한다.
하기 프로그램을 사용한다: 58℃에서 12분 동안; 98℃에서 2분 동안; 이어서 앰플리콘에 따라 달라지는 PCR 사이클: CTNNB1 및 IP90의 경우; 32 사이클(98℃에서 10초 동안, 60℃에서 10초 동안, 72℃에서 30초 동안). 조합된 RT-PCR 후, 앰플리콘을 상기 설명한 바와 같이 바코딩하고 Illumina MiSeq 시퀀서를 사용하여 시퀀싱한다. 각 앰플리콘의 정방향 프라이머의 말단 후에 첫 번째 염기에서 시작하는 각 앰플리콘의 처음 125개 뉴클레오티드를 참조 서열에 대해 정렬하고 각 앰플리콘에서 최대 A-대-I 빈도 분석을 위해 사용한다. 프라이머를 사용하고 2단계 PCR 및 바코딩 방법을 사용하여 비표적 DNA 시퀀싱을 수행하여, 상기와 같이 Illumina MiSeq 시퀀서를 사용하여 시퀀싱할 샘플을 준비한다.
실시예 8b. - 전체 게놈 시퀀싱 및 전사체학에 의한 비표적 편집의 분석(예측)
실시예 8a에서와 같이 제조된 형질감염된 세포를 3일 후에 수거하고 제조업체의 지침에 따라 Agencourt DNAdvance 게놈 DNA 단리 키트(Beckman Coulter)를 사용하여 게놈 DNA를 단리한다. 관심대상의 온-타겟 및 비표적 게놈 영역을 측접 HTS 프라이머 쌍을 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 주형으로서 5 ng의 게놈 DNA를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 Phusion 고충실도 DNA 폴리머라제(ThermoFisher)로 PCR 증폭을 수행한다. 반응이 증폭의 선형 범위(각각 EMX1, FANCF, HEK293 부위 2, HEK293 부위 3, HEK293 부위 4 및 RNF2 프라이머에 대해 30, 28, 28, 28, 32 및 32 사이클)에서 중단된 것을 보장하기 위해 사이클 횟수를 각 프라이머 쌍에 대해 개별적으로 결정한다. PCR 산물을 RapidTips(Diffinity Genomics)를 사용하여 정제한다. 정제된 DNA를 시퀀싱 어댑터를 함유하는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭시킨다. 생성물을 Quant-iT™ PicoGreen dsDNA 분석 키트(ThermoFisher) 및 KAPA 라이브러리 정량화 키트-Illumina(KAPA Biosystems)를 사용하여 겔 정제하고 정량화한다. 샘플을 이전에 설명한 바와 같이 Illumina MiSeq에서 시퀀싱한다.
시퀀싱 리드를 MiSeq Reporter(Illumina)를 사용하여 자동으로 역다중화하고, 개별 FASTQ 파일을 맞춤형 Matlab 스크립트를 이용하여 분석한다. 각 리드를 스미스-워터맨 알고리즘을 사용하여 적절한 참조 서열에 쌍별로 정렬한다. Q-점수가 31 미만인 염기 호출은 N으로 대체되므로 뉴클레오티드 빈도의 계산에서 제외된다. 이러한 처리는 약 1/1,000의 예상 MiSeq 염기-호출 오류율을 산출한다. 리드 및 참조 서열이 갭을 함유하지 않은 정렬된 서열은 정렬 표에 저장되며, 여기에는 각 유전자좌에 대한 염기 빈도가 표 형식으로 기재되어 있다. 인델(indel) 빈도는 맞춤형 Matlab 스크립트를 이용하여 정량화하였다.
인델이 발생할 수 있는 윈도의 양쪽에 측접한 2개의 10-bp 서열에 대한 정확한 일치를 위해 시퀀싱 리드를 스캔한다. 정확한 일치가 위치하지 않으면, 리드는 분석에서 제외된다. 이러한 인델 윈도우의 길이가 참조 서열과 정확히 일치한다면, 리드는 인델을 함유하지 않는 것으로 분류된다. 인델 윈도우가 참조 서열보다 2개 이상의 염기가 길거나 짧다면, 시퀀싱 리드는 각각 삽입 또는 결실로 분류된다.
실시예 9. - 마우스 편집 실험(예측)
신규 데아미나제 도메인에 융합된 신규 DNA 표적화 뉴클레아제 도메인으로 이루어진 염기 편집기를 질환의 적절한 마우스 모델에서 테스트함으로써 치료 후보로서 검증될 수 있을 것으로 예상된다.
적절한 모델의 일례는 예를 들어 Herbert 등(10.1161/ATVBAHA.110.204040)에 의해 설명된 바와 같이 인간 PCSK9 단백질을 발현하도록 조작된 마우스를 포함한다. PCSK9 단백질은 LDL 수용체(LDLR) 수준을 조절하고 혈청 콜레스테롤 수준에 영향을 미친다. 인간 PCSK9 단백질을 발현하는 마우스는 상승된 콜레스테롤 수준 및 더 빠른 죽상동맥경화증 발달을 나타낸다. PCSK9는 비정상적으로 높은 혈장 지질 수준으로 인해 심혈관 질환의 위험이 증가된 사람들에서 지질 수준의 감소를 위한 검증된 약물 표적이다(https://doi.org/10.1038/s41569-018-0107-8). 게놈 편집을 통한 PCSK9 수준의 감소는 개체의 일생 동안 지질 수준을 영구적으로 저하시켜 일생 동안 지속되는 심혈관 질환 위험의 감소를 제공할 것으로 예상된다. 게놈 편집 접근법 중 하나는 서열을 편집하여 미성숙 정지 코돈을 생성함으로써 PCSK9 mRNA가 기능적 단백질로 번역되는 것을 방지하는 것을 목표로 PCSK9 유전자의 코딩 서열을 표적화는 것을 포함할 수 있다. 대부분의 단백질의 번역을 차단하기 위해 코딩 서열의 5' 말단에 가까운 영역을 표적화하는 것은 유용하다. 높은 효율 및 특이성을 갖는 정지 코돈(TGA, TAA, TAG)을 생성하는 것은 PCSK9 코딩 서열의 영역을 표적화하는 것을 필요로 할 것이며, 여기서 편집 윈도우는 가장 높은 빈도의 편집 이벤트가 정지 코돈을 초래하도록 적절한 서열 위에 배치될 것이다. 따라서, 광범위한 PAM을 갖는 다수의 염기 편집 시스템 또는 축퇴성 PAM을 갖는 염기 편집 시스템의 이용가능성은 PCSK9 유전자에서 더 많은 수의 잠재적 표적 부위에 접근하는 데 유용하다. 또한, 비표적 편집의 빈도가 낮은(예를 들어, 온-타겟 편집 이벤트의 1% 이하 범위) 추가적인 편집 시스템도 이러한 맥락에서 유전자 편집을 수행하는 데 유용하다.
치료 효과를 위해 요구되는 염기 편집의 효율은 혈장 지질 수준의 상당한 감소를 달성하기 위한 50% 이상의 범위 내이다. PCSK9 유전자에서 정지 코돈을 생성하기 위해 염기 편집기를 사용하는 예는 Carreras 등(https://doi.org/10.1186/s12915-018-0624-2)의 것으로, 여기서 PCSK9 대립유전자의 10% 내지 34%가 편집되어 정지 코돈을 생성하였다. 이러한 수준의 편집이 마우스에서 혈장 지질 수준의 측정 가능한 감소를 초래하기에 충분하였지만, 인간에서의 치료적 사용을 위해서는 더 높은 편집 효율이 요구될 것이다.
PCSK9 유전자에서 정지 코돈을 도입하기 위한 최적의 염기 편집(BE) 시스템 및 가이드를 식별하기 위해, Hepa1-6 세포와 같은 마우스 간 세포주에서 스크리닝을 수행할 수 있다. 이용가능한 다양한 BE 시스템으로 PCSK9 유전자를 표적화하는 가이드를 식별하기 위해 먼저 인 실리코(In silico) 스크리닝을 사용할 수 있다. 다수의 가능한 가이드 중에서 선택하기 위해, 인-실리코 분석을 수행하여, 편집될 때 정지 코돈을 생성할 수 있는 서열을 포함하는 편집 윈도우를 어느 가이드가 갖는지를 결정할 수 있다. 그 다음, 코딩 서열의 5' 말단에 더 가까운 가이드가 선호될 수 있다. 생성된 일련의 가이드와 BE 단백질을 조합하여 리보핵단백질 복합체(RNP)를 형성할 수 있고 Hepa1-6 세포로 뉴클레오펙션할 수 있다. 72시간 후, 표적 부위에서의 편집 효율을 NGS 분석에 의해 결정할 수 있다. 이들 시험관내 결과에 기초하여, 가장 높은 빈도의 정지 코돈 형성을 초래한 하나 이상의 BE/가이드 조합을 생체내 시험을 위해 선택할 수 있다.
인간 치료 환경에 적용하기 위해, 염기 편집기 및 가이드 RNA를 포함하는 염기 편집 구성요소를 전달하는 안전하고 효과적인 방법이 요구된다. 생체내 전달 방법은 바이러스성 또는 비바이러스성 방법으로 나뉠 수 있다. 바이러스 벡터 중에서, 아데노 관련 바이러스(AAV)는 이의 안전성 기록, 다수의 조직 및 세포 유형으로의 효율적인 전달 및 확립된 제조 공정으로 인해 임상 용도로 선택되는 바이러스이다. 큰 크기의 염기 편집기(BE)는 AAV의 패키징 용량을 초과하여 단일 아데노바이러스 관련 바이러스의 패키징을 방해한다. 스플릿 인테인(split intein) 기술을 사용하여 BE를 2개의 AAV로 패키징하는 접근법이 마우스에서 성공적인 것으로 입증되었지만(https://doi.org/10.1038/s41551-019-0501-5), 2개의 바이러스에 대한 필요성은 개발 및 제조를 복잡하게 만든다. AAV의 추가 단점은, 바이러스가 숙주 세포의 게놈 내로의 통합을 촉진하는 메커니즘을 가지고 있지 않고 대부분의 AAV 게놈이 에피솜으로 남아 있는 반면, AAV 게놈의 일부는 세포에서 자연적으로 발생하는 무작위 이중 가닥 파손에서 통합된다는 점이다(Curr Opin Mol Ther. 2009 August; 11(4): 442-447). 이는 유기체의 일생 동안 BE를 발현하는 유전자 서열의 지속을 야기할 수 있다. 더욱이, AAV 게놈은 형질도입된 세포의 핵 내부에서 에피솜으로서 지속되고 수년 동안 유지될 수 있으며, 이는 이들 세포에서 BE의 장기간 발현을 초래하여 비표적 효과의 위험을 증가시킬 수 있는데, 비표적 이벤트의 발생 위험이 편집 효소가 활성인 시간의 함수이기 때문이다. 아데노바이러스(Ad), 예컨대 Ad5는 DNA 페이로드를 포유동물의 간으로 효율적으로 전달할 수 있으며 최대 45kb의 DNA를 패키징할 수 있다. 그러나, 아데노바이러스는 사망을 포함한 심각한 이상반응(adverse event)을 초래할 수 있는 환자에서의 반응(https:// doi.org/10.1016/j.ymthe.2020.02.010)을 포함하여, 포유동물(http://dx.doi.org/10.1136/gut.48.5.733)에서 강력한 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다.
지질 나노입자 및 중합체 나노입자를 포함하는 비바이러스성 전달 벡터(doi:10.1038/mt.2012.79에서 검토됨)는 바이러스성 전달 벡터에 비해, 낮은 면역원성 및 핵산 카고(cargo)의 일시적인 발현을 포함하는 몇 가지 이점이 있다. 비바이러스성 전달 벡터에 의해 유발된 일시적인 발현은 비표적 이벤트를 최소화할 것으로 예상되기 때문에 게놈 편집 응용 분야에 특히 적합하다. 또한, 바이러스 벡터와 달리 비바이러스성 전달은 치료 효과를 달성하기 위해 반복 투여할 수 있는 잠재성이 있다. 또한, 실제로는 핵산의 크기가 증가하고 입자 크기가 증가할수록 패키징이 덜 효율적이 되지만, 비바이러스 벡터에 패키징될 수 있는 핵산 분자의 크기에 이론적인 제한은 없다.
BE는 가이드 RNA와 함께 BE를 코딩하는 합성 mRNA를 LNP로 캡슐화함으로써 지질 나노입자(LNP)와 같은 비바이러스 벡터를 사용하여 생체내에서 전달할 수 있다. 이것은 예를 들어 Finn 등(DOI: 10.1016/j.celrep.2018.02.014) 또는 Yin 등(doi:10.1038/nbt.3471)에 의해 설명된 바와 같이 당업계에 잘 알려진 방법론을 사용하여 수행할 수 있다. 전형적으로, LNP는 PCSK9 유전자의 발현을 방해하고자 시도할 때 표적 기관/세포 유형이기도 한 간의 간세포로 주로 카고를 전달한다. 이 접근법에 대한 개념 증명을 입증하기 위해, 본 발명자들은 데아미나제 도메인에 융합된 새로운 게놈 편집 단백질로 구성된 BE가 합성 mRNA로 코딩되고, 마우스의 PCSK9 유전자 내의 선택된 부위를 표적화하는 적절한 가이드 RNA와 함께 LNP에 패키징될 수 있을 것으로 예상하고 있다. 인간 PCSK9 유전자를 발현하도록 조작된 마우스의 경우, 가이드는 인간 PCSK9 유전자만을 표적화하거나 인간과 마우스 PCSK9 유전자 둘 모두를 표적화하도록 설계할 수 있다. 이들 LNP의 주입 후, 간 세포의 게놈 내의 표적 위치에서의 편집 효율을 앰플리콘 시퀀싱 또는 분해에 의한 인델 추적과 같은 기타 방법에 의해 분석할 수 있다(doi: 10.1093/nar/gku936). 생리학적 영향은 표준 방법을 사용하여 총 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준을 포함하는 마우스의 혈중 지질 수준을 측정함으로써 결정할 수 있다.
신규 BE를 평가하기 위해 마우스에서 모델링될 수 있는 질환의 또 다른 예는 원발성 고수산뇨증 I형이다. 원발성 고수산뇨증 I형(PH1)은 효소 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 AGXT 유전자의 결함에 의해 유발되는 희귀한 상염색체 열성 질환이다. 이는 글리옥실레이트 대사의 결함 및 독성 대사산물 옥살레이트의 축적을 초래한다. 이 질환을 치료하는 한 가지 접근법은 글리콜레이트로부터 글리옥실레이트를 생성하는 효소 글리콜레이트 옥시다제(GO)의 발현을 감소시켜 옥살레이트 형성에 이용가능한 기질(글리옥실레이트)의 양을 감소시키는 것이다. PH1은, AGXT 유전자의 두 카피 모두가 녹아웃되어(agxt -/- 마우스) 야생형 대조군에 비해 소변 중 옥살레이트 수준의 유의한 3배 증가가 초래된 마우스에서 모델링될 수 있다. 따라서, agxt -/- 마우스를 사용하여 내인성 마우스 GO 유전자의 코딩 서열에서 정지 코돈을 생성하도록 설계된 신규 염기 편집기의 효능을 평가할 수 있다. GO 유전자에 정지 코돈을 도입하기기 위한 최적의 BE 시스템 및 가이드를 식별하기 위해, Hepa1-6 세포와 같은 마우스 간 세포주에서 스크리닝을 수행할 수 있다. 인 실리코 스크리닝을 먼저 사용하여 이용가능한 다양한 BE 시스템으로 GO 유전자를 표적화하는 가이드를 식별할 수 있다. 다수의 가능한 가이드 중에서 선택하기 위해, 인-실리코 분석을 수행하여, 편집될 때 정지 코돈을 생성할 수 있는 서열을 포함하는 편집 윈도우를 어느 가이드가 갖는지를 결정할 수 있다. 그 다음, 코딩 서열의 5' 말단에 더 가까운 가이드가 선호될 수 있다. 생성된 일련의 가이드와 BE 단백질을 조합하여 리보핵단백질 복합체(RNP)를 형성할 수 있고 Hepa1-6 세포로 뉴클레오펙션할 수 있다. 72시간 후, 표적 부위에서의 편집 효율을 NGS 분석에 의해 결정할 수 있다. 이들 시험관내 결과에 기초하여, 가장 높은 빈도의 정지 코돈 형성을 초래한 하나 이상의 BE/가이드 조합을 생체내 시험을 위해 선택할 수 있다.
BE 및 가이드는 AAV 바이러스와 함께 BE를 발현하기 위한 스플릿 인테인 시스템 및 가이드를 전달하기 위한 제3 AAV를 사용하여 마우스에 전달할 수 있다. 대안적으로, 아데노바이러스의 >40Kb 패키징 용량 때문에 아데노바이러스 유형 5를 사용하여 BE 및 가이드를 단일 바이러스로 전달할 수 있다. 또한, BE를 적절한 LNP에 패키징된 가이드 RNA와 함께 mRNA로서 전달할 수 있다. LNP를 agxt -/- 마우스에 정맥내 주사한 후, 소변 중 옥살레이트 수준을 시간 경과에 따라 모니터링하여 옥살레이트 수준이 감소되었는지 여부를 결정할 수 있으며, 이는 BE가 활성이고 예상되는 치료 효과를 가졌다는 것을 암시한다. BE가 정지 코돈을 도입하였는지 여부를 결정하기 위해, GO 유전자의 적절한 영역을 처리된 마우스 및 대조군 마우스의 간으로부터 추출된 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시킬 수 있다. 생성된 PCR 산물을 차세대 시퀀싱을 사용하여 시퀀싱하여 서열 변화의 빈도를 결정할 수 있다.
실시예 10. - 새로운 데아미나제의 유전자 발견
다양한 환경(토양, 퇴적물, 지하수, 호열성, 인간 및 비인간 마이크로바이옴)로부터의 4Tbp(테라 염기쌍)의 독점적 및 공개 조립된 메타게놈 시퀀싱 데이터를 마이닝하여 신규 탈아민 분해 효소를 발견하였다. 알려진 데아미나제의 HMM 프로필을 구축하고 HMMER3(hmmer.org)를 사용하여 예측된 모든 단백질에 대해 검색하여 본 발명자들의 데이터베이스로부터 데아미나제를 식별하였다. 예측된 및 참조(예를 들어, 진핵생물 APOBEC1, 박테리아 TadA) 데아미나제를 MAFFT를 사용하여 정렬하고, FastTree2를 사용하여 계통발생수(phylogenetic tree)를 추론하였다. 신규 패밀리 및 서브패밀리는 본원에 개시된 서열로 구성된 클레이드(clade)를 식별함으로써 정의하였다. 효소 기능을 나타내는 중요한 촉매 잔기의 존재에 기초하여 후보를 선택하였다(예를 들어, 서열번호 1-51, 385-386, 387-443, 444-447, 또는 488-475 참조).
실시예 11. - 플라스미드 작제
유전자의 DNA 단편은 Twist Bioscience 또는 Integrated DNA Technologies(IDT)에서 합성되었다. 플라스미드 DNA를 Endura 전기천공적격 세포(Lucigen)에서 증폭시키고 QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)에 의해 단리하였다. 플라스미드의 제한 효소 분해에 의해 벡터 백본을 제조하였다. 삽입체를 Elim BIOPHARM 또는 IDT에서 주문한 프라이머를 사용하여 Q5 고충실도 DNA 폴리머라제(New England Biolabs)에 의해 증폭시켰다. 벡터 백본과 삽입체 둘 모두를 Gel DNA 회수 키트(Zymo Research)를 사용하여 겔 추출에 의해 정제하였다. 하나 또는 다수의 DNA 단편을 NEBuilder HiFi DNA 조립(New England Biolabs)(서열번호 483-487)을 통해 벡터로 조립하였다.
실시예 12. - 시퀀싱에 의한 이. 콜라이에서의 염기 편집 효율의 평가
실시예 4에서와 같이 제조된 5 ng의 추출된 DNA를 주형으로서 사용하고, 프라이머(P137 및 P360)를 PCR 증폭을 위해 사용하고, 생성된 산물을 ELIM BIOPHARM에서 생어 시퀀싱을 위해 제출하였다. 시퀀싱을 위해 사용된 프라이머는 표 6 및 7(서열번호 523-531)에 나타낸다.
표 6 - 이. 콜라이에서 lacZ 유전자의 염기 편집 분석에 사용된 프라이머
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
표 7 - 이. 콜라이에서 우라실 글리코실라제 억제제(UGI)의 효과의 염기 편집 분석을 위해 사용된 프라이머
Figure pct00014
도 8은 생어 시퀀싱에 의해 평가된, 본 실험에 의해 조사된 효소에 의한 예시적인 염기 편집을 도시한다.
도 10은 표 3에 따른 TadA(ABE8.17m)(서열번호 596) 및 MG 닉카제를 사용한 아데닌 염기 편집기(ABE)의 염기 편집 효율을 도시한다. TadA는 tRNA 아데닌 데아미나제이고; TadA(ABE8.17m)는 이. 콜라이 TadA의 조작된 변이체이다. TadA(ABE8.17m)와 융합된 12가지의 MG 닉카제를 작제하고 이. 콜라이에서 테스트하였다. 3개의 가이드를 lacZ를 표적화하도록 설계하였다. 상자에 표시된 숫자는 각 위치에서 Edit R에 의해 정량화된 A에서 G로의 전환의 백분율을 나타낸다. ABE8.17m은 실험의 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 11은 래트 APOBEC1, MG 닉카제 및 바실러스 서브틸리스 박테리오파지(UGI(PBS1))의 우라실 글리코실라제 억제제를 포함하는 시토신 염기 편집기(CBE)의 염기 편집 효율을 도시한다. APOBEC1은 시토신 데아미나제이다. N-말단에서 rAPOBEC1와 융합되고 C-말단에서 UGI와 융합된 12가지의 MG 닉카제를 작제하고 이. 콜라이에서 테스트하였다. 3개의 가이드를 lacZ를 표적화하도록 설계하였다. 상자에 표시된 숫자는 Edit R에 의해 정량화된 C에서 T로의 전환의 백분율을 나타낸다. BE3는 실험에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 12는 CBE의 염기 편집 활성에 미치는 MG 우라실 글리코실라제 억제제(UGI)의 효과를 도시한다. (a) MGC15-1은 N-말단 APOBEC1, MG15-1 닉카제 및 C-말단 UGI로 구성된다. 3가지 MG UGI를 이. 콜라이에서 시토신 염기 편집 활성의 개선에 대해 테스트하였다. (b) BE3은 N-말단 rAPOBEC1, SpCas9 닉카제 및 C-말단 UGI를 포함한다. 2가지 MG UGI를 HEK293T 세포에서 시토신 염기 편집 활성의 개선에 대해 테스트하였다. 편집 효율은 Edit R에 의해 정량화하였다.
실시예 13. - 세포 배양, 형질감염, 차세대 시퀀싱 및 염기 편집 분석
HEK293T 세포를 성장시키고 37℃, 5% CO2에서 10%(v/v) 소 태아 혈청(Gibco)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지와 GlutaMAX(Gibco)에서 계대하였다. 5 x 104개의 세포를 세포 부착을 위해 처리된 96웰 세포 배양 플레이트(Costar)에 시딩하고, 20 내지 24시간 동안 성장시키고, 소비된 배지를 형질감염 직전에 새로운 배지로 재생하였다. 200 ng 발현 플라스미드 및 1 μL 리포펙타민 2000(ThermoFisher Scientific)을 제조업체의 지침에 따라 웰당 형질감염을 위해 사용하였다. 형질감염된 세포를 3일 동안 성장시키고, 수거하고, 제조업체의 지침에 따라 QuickExtract(Lucigen)를 이용하여 gDNA를 추출하였다. 염기 편집을 위한 표적화 영역을 표 8 및 9(서열번호 538-585)에 열거된 프라이머와 함께 Q5 고충실도 DNA 폴리머라제(New England Biolabs)를 사용하여 증폭시키고 주형으로서 DNA를 추출하였다.
표 8 - HEK293T에서 UGI 효과의 염기 편집 분석을 위해 사용된 프라이머
Figure pct00015
표 9a - A0A2K5RND7-MG 닉카제-MG69-1로 형질감염된 HEK293T 세포에서 표적화된 영역을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
제조업체의 지침에 따라 HighPrep PCR Clean-up System(MAGBIO)을 사용하여 PCR 산물을 정제하였다. 후보 효소의 염기 편집에 미치는 우라실 글리코실라제 억제제(UGI)의 효과는 생어 시퀀싱을 위해 PCR 산물을 Elim BIOPHARM에 제출하여 분석하였고, 효율은 Edit R로 정량화하였다. A0A2K5RND7-MG 닉카제-MG69-1의 염기 편집을 분석하기 위해, 차세대 시퀀싱(NGS)을 위해 사용된 어댑터를 KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR 키트(Roche) 및 TruSeq DNA 라이브러리 준비 키트(illumina)와 호환되는 프라이머를 사용한 후속 PCR 반응에 의해 PCR 산물에 추가하였다. 생성된 산물의 DNA 농도를 TapeStation(Agilent)으로 정량화하고, 샘플을 함께 풀링하여 NGS 분석을 위한 라이브러리를 제조하였다. 생성된 라이브러리를 Aria 실시간 PCR 시스템(Agilent)을 사용하여 qPCR에 의해 정량화하고, 제조업체의 지침에 따라 Illumina Miseq 기기를 사용하여 고처리량 시퀀싱을 수행하였다. 시퀀싱 데이터를 Cripresso2에 의해 염기 편집에 대해 분석하였다.
도 13은 CMP/dCMP-타입 데아미나제 도메인 함유 단백질(uniprot 수탁번호 A0A2K5RDN7), MG 닉카제 및 MG UGI를 포함하는 시토신 염기 편집기의 염기 편집 효율을 보여주는 염기 편집기가 표적화하는 부위의 지도를 도시한다. 작제물은 N-말단 A0A2K5RDN7, MG 닉카제 및 C-말단 MG69-1을 포함한다. 단순화를 위해, 도면에는 MG 닉카제의 정체만이 도시된다. BE3(APOBEC1)은 염기 편집에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 음성 대조군으로는 공 벡터를 사용하였다. 상이한 날에 3회의 독립적인 실험을 수행하였다. 약어: R, 반복; NEG, 음성 대조군.
표 9b: 실시예 13의 작제물에 사용된 단백질 도메인
Figure pct00020
실시예 14. - 이. 콜라이에서 염기 편집기 돌연변이의 양성 선택
도 14는 이. 콜라이에서의 TadA 특성규명을 위한 양성 선택 방법을 도시한다. 패널 (a)는 TadA 선택에 사용된 한 가지 플라스미드 시스템의 지도를 도시한다. 벡터는 CAT(H193Y), CAT를 표적화는 sgRNA 발현 카세트 및 ABE 발현 카세트를 포함한다. 본 도면에는, 이. 콜라이로부터의 N-말단 TadA 및 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 C-말단 SpCas9(D10A)가 도시되어 있다. 패널 (b)는 이. 콜라이 세포 내로 도입/형질전환될 때 CAT(H193Y)의 주형 가닥의 A2 위치가 편집되어 H193Y 돌연변이를 야생형으로 되돌리고 이의 활성을 복원시킴을 입증하는 시퀀싱 추적을 도시한다. 약어: CAT, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제.
농도가 10 ng/μL인 플라스미드 용액 1μL를 25μL BL21(DE3) 전기천공적격 세포(Lucigen)로 형질전환시키고, 37℃에서 1시간 동안 975μL 발현 회수 배지로 회수하였다. 50 μL의 생성된 세포를 100 ㎍/mL 카르베니실린, 0.1 mM IPTG 및 적당량의 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천 플레이트에 도말하였다. 콜로니를 채취할 수 있을 때까지 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하였다. 콜로니 PCR을 사용하여 염기 편집을 함유하는 게놈 영역을 증폭시키고, 생성된 산물을 생어 시퀀싱을 위해 ELIM BIOPHARM에 제출하였다. PCR 및 시퀀싱을 위해 사용된 프라이머는 표 10에 나열되어 있다(서열번호 532-537).
표 10 - CAT(H193Y)의 염기 편집 분석을 위해 사용된 프라이머
Figure pct00021
도 15는 TadA에 의해 유발된 돌연변이가 클로람페니콜(Cm)의 높은 내용성을 가능하게 함을 도시한다. 패널 (a)는 이. 콜라이의 항생제 내성을 선택하기 위해 상이한 농도의 클로람페니콜이 사용된 성장 플레이트의 사진을 도시한다. 이 예에서, 이. 콜라이(EcTadA)로부터의 TadA의 야생형 및 변이체 2가지를 테스트하였다. 패널 (b)는 돌연변이된 TadA를 보유하는 ABE가 야생형보다 더 높은 편집 효율을 나타낸다는 것을 입증하는 결과 요약 표를 도시한다. 이들 실험에서, 콜로니는 0.5 ㎍/mL 이상의 Cm을 갖는 플레이트로부터 채취하였다. 단순화를 위해, 표에는 데아미나제의 정체만이 도시되어 있지만, 효과기(SpCas9) 및 작제물 구성은 상기 도면에 도시되어 있다.
도 16은 양성 선택에서 MG TadA 활성의 조사를 도시한다. 패널 (a)는 8개의 MG68 TadA 후보를 0 내지 2 ㎍/mL의 클로람페니콜에 대해 테스트한 실험으로부터의 성장 플레이트의 사진(ABE는 N-말단 TadA 변이체 및 C-말단 SpCas9(D10A) 닉카제를 포함함)을 도시한다. 단순화를 위해, 데아미나제의 정체만이 도시된다. 패널 (b)는 MG TadA 후보의 편집 효율을 나타내는 요약 표를 도시한다. 패널 (b)는 MG68-3 및 MG68-4가 아데닌의 염기 편집을 구동하였음을 입증한다. 이 실험에서, 콜로니는 0.5 ㎍/mL 이상의 Cm을 갖는 플레이트로부터 채취하였다.
도 17은 MG68-4 상의 D109N 돌연변이를 통한 MG68-4_nSpCas9의 염기 편집 효율의 개선을 보여준다. 패널 (a)는 야생형 MG68-4 및 이의 변이체가 0 내지 4㎍mL의 클로람페니콜에 대해 테스트된 성장 플레이트의 사진을 도시한다. 단순화를 위해, 데아미나제의 정체만이 도시된다. 이 실험에서 아데닌 염기 편집기는 N-말단 TadA 변이체와 C-말단 SpCas9(D10A) 닉카제를 포함한다. 패널 (b)는 MG TadA 후보의 편집 효율을 나타내는 요약 표를 도시한다. 패널 (b)는 MG68-4 및 MG68-4(D109N)가 아데닌의 염기 편집을 나타내고 D109N 돌연변이가 증가된 활성을 나타냄을 입증한다. 이 실험에서 콜로니는 0.5 ㎍mL Cm 이상인 플레이트로부터 채취하였다.
도 18은 MG68-4(D109N)_nMG34-1의 염기 편집을 도시한다. 패널 (a)는 N-말단 MG68-4(D109N) 및 C-말단 SpCas9(D10A) 닉카제를 포함하는 ABE가 0 내지 2 ㎍/mL의 클로람페니콜에 대해 테스트된 실험의 성장 플레이트의 사진을 도시한다. 패널 (b)는 sgRNA의 존재 및 부재 하의 편집 효율을 나타내는 요약 표를 도시한다. 이 실험에서, 콜로니는 1 ㎍/mL 이상의 Cm을 갖는 플레이트로부터 채취하였다.
도 19는 MG68-4-nMG34-1 염기 편집 활성의 개선을 위해 설계된 28가지의 MG68-4 변이체를 도시한다. 효소의 편집을 개선하기 위한 표적화 돌연변이유발을 위해 12개 잔기를 선택하였다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 명세서 내에 제공된 특정 실시예에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 전술한 명세서를 참조하여 설명되었지만, 본원의 실시양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되는 것을 의미하지 않는다. 수많은 변경, 변화 및 치환이 본 개시내용에서 벗어나지 않고 당업자에게 일어날 것이다. 또한, 본 발명의 모든 양상은 다양한 조건 및 변수에 의존하는 본원에 제시된 특정 묘사, 구성 또는 상대적 비율에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 임의의 이러한 대안, 변경, 변화 또는 등가물도 포함하는 것으로 고려된다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이러한 청구범위 내의 방법 및 구조 및 이의 등가물이 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> METAGENOMI IP TECHNOLOGIES, LLC <120> BASE EDITING ENZYMES <130> 55921-715.601 <140> <141> <150> 63/222,351 <151> 2021-07-15 <150> 63/077,057 <151> 2020-09-11 <160> 593 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 186 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: uncultivated organism <220> <223> Category: MG66 putative cytidine deaminase <220> <223> Description: MG66-2 deaminase <400> 1 Met Ala Arg Val Leu Gly Leu Asp Pro Gly Phe Ala Thr Cys Gly Tyr 1 5 10 15 Ala Leu Val Asp Leu Thr Arg Lys Asp Gly Ala Pro Phe Val Asp Val 20 25 30 Arg Ser Leu Gly Thr Leu Arg Thr Ala Lys Ala Asp Lys Lys Arg Lys 35 40 45 Val Leu Ala Ala Asp Asp Asn Leu Arg Arg Ala Gln Glu Leu Ile Arg 50 55 60 Ala Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Asn Ala Gln Ala Ile Val Ala Glu Ser 65 70 75 80 Met Ser Phe Pro Arg Asn Ser Ala Ala Ala Ala Lys Met Ala Met Cys 85 90 95 Trp Gly Ile Val Ala Thr Leu Ala Glu Met Asn Asp Leu Pro Ile Val 100 105 110 Gln Ala Thr Pro Lys Glu Ile Lys Ile Ala Val Ala Gly Val 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Asp Trp Asp Pro Lys Lys 1325 1330 1335 Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val 1340 1345 1350 Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val 1355 1360 1365 Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu 1370 1375 1380 Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val 1385 1390 1395 Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu 1400 1405 1410 Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu 1415 1420 1425 Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe 1430 1435 1440 Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu 1445 1450 1455 Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr 1460 1465 1470 Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val 1475 1480 1485 Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn 1490 1495 1500 Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile 1505 1510 1515 His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys 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Claims (133)

  1. 조작된 핵산 편집 시스템으로서,
    (a) RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제;
    (b) 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및
    (c) 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서,
    i. 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및
    ii. 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열
    을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체
    를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성되는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 닉카제(nickase) 돌연변이를 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 2, 타입 II cas 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 71, 72 또는 74에 비해 잔기 13에, 서열번호 73에 비해 잔기 12에, 서열번호 75에 비해 잔기 17에, 서열번호 76에 비해 잔기 23에, 또는 서열번호 597에 비해 잔기 10에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 72에 비해 잔기 13에, 또는 서열번호 75에 비해 잔기 17에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  8. 조작된 핵산 편집 시스템으로서,
    (a) 서열번호 70-78, 596, 또는 597-598 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제;
    (b) 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및
    (c) 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서,
    i. 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및
    ii. 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열
    을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체
    를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템.
  9. 조작된 핵산 편집 시스템으로서,
    (a) 서열번호 360-368 또는 598 중 어느 하나 또는 이의 변이체를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된 엔도뉴클레아제로서,
    상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제;
    (b) 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및
    (c) 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서,
    i. 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및
    ii. 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열
    을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체
    를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 닉카제 돌연변이를 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  11. 제9항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성되는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  12. 제9항에 있어서, 상기 클래스 2, 타입 II cas 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 71, 72 또는 74에 비해 잔기 13에, 서열번호 73에 비해 잔기 12에, 서열번호 75에 비해 잔기 17에, 서열번호 76에 비해 잔기 23에, 또는 서열번호 597에 비해 잔기 10에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  13. 제9항에 있어서, 상기 염기 편집기는 서열번호 1-51, 57-66, 385-443, 444-475 또는 594-595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  14. 제9항에 있어서, 상기 염기 편집기는 서열번호 50-51 또는 385-390 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여된 RuvC 도메인을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제에 대해 80% 미만의 동일성을 갖는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  18. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 HNH 도메인을 추가로 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비축퇴성(non-degenerate) 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  20. 조작된 핵산 편집 시스템으로서,
    (a) (i) 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및
    (ii) 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열
    을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서,
    상기 조작된 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비축퇴성 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 가이드 리보핵산 구조체;
    (b) 상기 조작된 가이드 리보핵산에 결합하도록 구성된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제; 및
    (c) 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기
    를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 360-368 또는 598로 이루어진 군으로부터 선택된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성되는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기는 서열번호 1-51, 57-66, 385-443, 444-475 또는 594-595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기는 서열번호 50-51 또는 385-390 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기는 아데닌 데아미나제인 조작된 핵산 편집 시스템.
  25. 제23항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제는 서열번호 50-51, 57, 385-443, 448-475, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  26. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기는 시토신 데아미나제인 조작된 핵산 편집 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 상기 시토신 데아미나제는 서열번호 1-49, 444-447, 594, 또는 58-66 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 염기 편집기에 커플링된 우라실 DNA 글리코실라제 억제제(UGI)를 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템.
  29. 제28항에 있어서, 상기 우라실 DNA 글리코실라제 억제제(UGI)는 서열번호 52-56 또는 서열번호 67 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체는 적어도 2개의 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체는 상기 가이드 리보핵산 서열 및 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 상기 리보핵산 서열을 포함하는 하나의 리보핵산 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 리보핵산 서열은 원핵생물, 박테리아, 고세균, 진핵생물, 진균, 식물, 포유동물 또는 인간 게놈 서열에 상보적인 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 리보핵산 서열은 길이가 15 내지 24 개의 뉴클레오티드인 조작된 핵산 편집 시스템.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제의 N- 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 추가로 포함하는 조작된 핵산 편집 시스템.
  35. 제34항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 369-384로부터 선택된 것 또는 이의 변이체에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 염기 편집기에 직접 공유 결합되거나, 링커를 통해 상기 염기 편집기에 공유 결합되는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 폴리펩티드는 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 염기 편집기를 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성되는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 Mg2+ 공급원을 추가로 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70, 71, 73, 74, 76, 78, 77 또는 78 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 가이드 RNA 구조체는 서열번호 88, 89, 91, 92, 94, 96, 95 또는 488 중 어느 하나의 비축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 360, 361, 363, 365, 367, 또는 368 중 어느 하나를 포함하는 PAM에 결합하도록 구성되거나; 또는
    (d) 상기 염기 편집기는 서열번호 58 또는 595 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  41. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70, 71 또는 78 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 가이드 RNA 구조체는 서열번호 88, 89, 또는 96 중 적어도 하나의 비축퇴성 뉴클레오티드와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 360, 362 또는 368 중 어느 하나를 포함하는 PAM에 결합하도록 구성되거나; 또는
    (d) 상기 염기 편집기는 서열번호 594 또는 이의 변이체와 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 동일성은 BLASTP, CLUSTALW, MUSCLE, MAFFT 또는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정되는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  43. 제42항에 있어서, 상기 서열 동일성은 단어 길이(W) 3, 기대값(E) 10, 및 존재 11, 연장 1에서의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 설정 갭 코스트의 매개변수를 사용하고, 조건부 조성 점수 매트릭스 조정을 사용하여, 상기 BLASTP 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정되는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 촉매적으로 사멸되도록 구성되는 것인 조작된 핵산 편집 시스템.
  45. 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 핵산은 염기 편집기에 커플링된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하고, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 핵산.
  46. 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 핵산은 염기 편집기에 커플링된, 서열번호 70-78 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 것인 핵산.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 엔도뉴클레아제의 N- 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 핵산.
  48. 제47항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 369-384로부터 선택된 것 또는 이의 변이체에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 핵산.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기체는 원핵생물, 박테리아, 진핵생물, 진균, 식물, 포유동물, 설치류 또는 인간인 핵산.
  50. 염기 편집기에 커플링된 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 벡터.
  51. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서,
    상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서,
    (a) 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및
    (b) 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열
    을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 벡터.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드, 미니서클, CELiD, 아데노 관련 바이러스(AAV) 유래 비리온 또는 렌티바이러스인 벡터.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  55. 제54항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 엔도뉴클레아제의 제조 방법.
  56. 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서, 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를,
    a. RuvC 도메인 및 HNH 도메인를 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있는 것인 엔도뉴클레아제;
    b. 상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기; 및
    c. 상기 엔도뉴클레아제 및 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체
    를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고; 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하는 것인, 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법.
  57. 제56항에 있어서, RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 상기 엔도뉴클레아제는 상기 염기 편집기에 직접 공유 결합되거나, 링커를 통해 상기 염기 편집기에 공유 결합되는 것인 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  59. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 71, 72 또는 74에 비해 잔기 13에, 서열번호 73 또는 78에 비해 잔기 12에, 서열번호 75에 비해 잔기 17에, 서열번호 76에 비해 잔기 23에, 서열번호 77에 비해 잔기 8에, 또는 서열번호 597에 비해 잔기 10에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  60. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 최적으로 정렬된 경우에 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 72에 비해 잔기 13에, 또는 서열번호 75에 비해 잔기 17에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  61. 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법으로서, 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드를,
    클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제,
    상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기, 및
    상기 엔도뉴클레아제 및 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체
    를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고; 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 포함하며; 상기 PAM은 서열번호 70-78 또는 597로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 상기 염기 편집기에 공유 결합되거나, 링커를 통해 상기 염기 편집기에 커플링되는 것인 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 염기 편집기는 서열번호 1-51, 57-66, 385-443, 444-475 또는 594-595 또는 이의 변이체로부터 선택된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염기 편집기는 아데닌 데아미나제를 포함하고;
    상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 아데닌을 포함하며;
    상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리펩티드를 변형시키는 것은 상기 아데닌을 구아닌으로 전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 아데닌 데아미나제는 서열번호 50-51, 57, 385-443, 448-475, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  66. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염기 편집기는 시토신 데아미나제를 포함하고;
    상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 시토신을 포함하며;
    상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리펩티드를 변형시키는 것은 상기 시토신을 우라실로 전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 시토신 데아미나제는 서열번호 1-49, 444-447, 594, 또는 58-66 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체는 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 염기 편집기에 커플링된 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 우라실 DNA 글리코실라제 억제제는 서열번호 52-56 또는 서열번호 67 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  70. 제61항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는, 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 가닥 및 상기 PAM을 포함하는 제2 가닥을 포함하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 PAM은 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체의 상기 서열에 상보적인 상기 서열의 3' 말단에 바로 인접한 것인 방법.
  72. 제61항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제, Cas14 엔도뉴클레아제, Cas12a 엔도뉴클레아제, Cas12b 엔도뉴클레아제, Cas12c 엔도뉴클레아제, Cas12d 엔도뉴클레아제, Cas12e 엔도뉴클레아제, Cas13a 엔도뉴클레아제, Cas13b 엔도뉴클레아제, Cas13c 엔도뉴클레아제 또는 Cas 13d 엔도뉴클레아제가 아닌 것인 방법.
  73. 제61항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 방법.
  74. 제61항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드는 진핵생물, 식물, 진균, 포유동물, 설치류 또는 인간 이중 가닥 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오티드인 방법.
  75. 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것을 포함하고, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체와 복합체를 형성하도록 구성되며, 상기 복합체는 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌에 결합시, 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌의 뉴클레오티드를 변형시키도록 구성되는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템은 아데닌 데아미나제를 포함하고, 상기 뉴클레오티드는 아데닌이며, 상기 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 것은 상기 아데닌을 구아닌으로 전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  77. 제75항에 있어서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템은 시티딘 데아미나제 및 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 포함하고, 상기 뉴클레오티드는 시토신이며, 상기 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 것은 상기 아데닌을 우라실로 전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 게놈 DNA, 바이러스 DNA 또는 박테리아 DNA를 포함하는 것인 방법.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 시험관 내에 있는 것인 방법.
  80. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 유전자좌는 세포 내에 있는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포, 박테리아 세포, 진핵 세포, 진균 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 설치류 세포, 영장류 세포 또는 인간 세포인 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 세포는 동물 내에 있는 것인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 세포는 달팽이관 내에 있는 것인 방법.
  84. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 세포는 배아 내에 있는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 배아는 2세포 배아인 방법.
  86. 제84항에 있어서, 상기 배아는 마우스 배아인 방법.
  87. 제75항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은, 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항의 벡터를 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  88. 제75항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은, 상기 엔도뉴클레아제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 핵산은 상기 엔도뉴클레아제를 코딩하는 상기 오픈 리딩 프레임이 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  90. 제75항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은, 상기 엔도뉴클레아제를 코딩하는 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 캡핑된 mRNA를 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  91. 제75항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은 폴리펩티드를 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  92. 제75항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 핵산 편집 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 것은, 리보핵산(RNA) pol III 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 조작된 가이드 리보핵산 구조체를 코딩하는 데옥시리보핵산(DNA)을 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  93. 조작된 핵산 편집 폴리펩티로서,
    RuvC 도메인 및 HNH 도메인를 포함하는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되고, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 RuvC 도메인은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있는 것인 엔도뉴클레아제; 및
    상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기
    를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  94. 제93항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  95. 조작된 핵산 편집 폴리펩티드로서,
    서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여된 RuvC 도메인을 포함하는 것인 엔도뉴클레아제; 및
    상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기
    를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  96. 조작된 핵산 편집 폴리펩티드로서,
    서열번호 360-368 또는 598 중 어느 하나를 포함하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성된 엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 클래스 2, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제이며, 상기 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 결여된 RuvC 도메인을 포함하는 것인 엔도뉴클레아제; 및
    상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기
    를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래되는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  98. 제93항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제에 대해 80% 미만의 동일성을 갖는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  99. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 HNH 도메인을 추가로 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  100. 제95항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 tracr 리보핵산 서열은 서열번호 88-96, 488 및 489 중 어느 하나로부터 선택된 약 60 내지 90 개의 연속 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  101. 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기는 서열번호 1-51, 57-66, 385-443, 444-475 또는 594-595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  102. 제93항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기는 아데닌 데아미나제인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  103. 제102항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제는 서열번호 50-51, 57, 385-443, 448-475, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  104. 제93항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기는 시토신 데아미나제인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  105. 제104항에 있어서, 서열번호 1-49, 444-447, 594, 또는 58-66 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  106. 조작된 핵산 편집 폴리펩티드로서,
    엔도뉴클레아제로서, 상기 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 활성이 결핍되도록 구성되는 것인 엔도뉴클레아제; 및
    상기 엔도뉴클레아제에 커플링된 염기 편집기로서, 상기 염기 편집기는 서열번호 1-51, 385-386, 387-443, 444-447, 488-475 또는 595 중 어느 하나, 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 염기 편집기
    를 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  107. 제106항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 표적 데옥시리보핵산의 한 가닥을 절단하도록 구성되는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  108. 제106항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 촉매적으로 사멸되도록 구성되는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  109. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 Cas 엔도뉴클레아제인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  110. 제109항에 있어서, 상기 Cas 엔도뉴클레아제는 클래스 II, 타입 II Cas 엔도뉴클레아제 또는 클래스 II, 타입 V Cas 엔도뉴클레아제인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  111. 제106항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 70-78 또는 597 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 엔도뉴클레아제는 닉카제 돌연변이를 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  113. 제112항에 있어서, 상기 Cas 엔도뉴클레아제는 서열번호 70에 비해 잔기 9에, 서열번호 71, 72 또는 74에 비해 잔기 13에, 서열번호 73에 비해 잔기 12에, 서열번호 75에 비해 잔기 17에, 서열번호 76에 비해 잔기 23에, 또는 서열번호 597에 비해 잔기 10에 아스파르테이트에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  114. 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 360-368 또는 598로 이루어진 군으로부터 선택된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 결합하도록 구성되는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  115. 제106항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기는 아데닌 데아미나제인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  116. 제115항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제는 서열번호 50-51, 385-443, 448-475, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  117. 제116항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제는 서열번호 50-51, 385-390, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  118. 제106항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기 편집기는 시토신 데아미나제인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  119. 제118항에 있어서, 상기 시토신 데아미나제는 서열번호 1-49, 444-447 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  120. 제106항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 또는 상기 염기 편집기에 커플링된 우라실 DNA 글리코실라제 억제제(UGI)를 추가로 포함하는 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  121. 제120항에 있어서, 상기 우라실 DNA 글리코실라제 억제제는 서열번호 52-56 또는 서열번호 67 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  122. 제106항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제를 포함하는 폴리펩티드는, 상기 엔도뉴클레아제의 N- 또는 C-말단에 근접한 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  123. 제122항에 있어서, 상기 NLS는 서열번호 369-384로부터 선택된 것 또는 이의 변이체에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  124. 제106항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 상기 염기 편집기에 직접 공유 결합되거나, 링커를 통해 상기 염기 편집기에 공유 결합되는 것인 조작된 핵산 편집 폴리펩티드.
  125. 유기체에서의 발현에 최적화된 조작된 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 핵산은 서열번호 1-51, 385-386, 387-443, 444-447, 488-475, 또는 595 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 코딩하는 것인 핵산.
  126. 제125항에 있어서, 상기 유기체는 원핵생물, 박테리아, 진핵생물, 진균, 식물, 포유동물, 설치류 또는 인간인 핵산.
  127. 제125항 또는 제126항의 핵산을 포함하는 벡터.
  128. 제127항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드, 미니서클, CELiD, 아데노 관련 바이러스(AAV) 유래의 비리온 또는 렌티바이러스인 벡터.
  129. 제127항 또는 제128항의 벡터를 포함하는 세포.
  130. 제129항의 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 염기 편집기의 제조 방법.
  131. 시스템으로서,
    (a) 제106항 내지 제124항 중 어느 한 항의 핵산 편집 폴리펩티드; 및
    (b) 상기 핵산 편집 폴리펩티드와 복합체를 형성하도록 구성된 조작된 가이드 리보핵산 구조체로서,
    i. 표적 데옥시리보핵산 서열에 혼성화하도록 구성된 가이드 리보핵산 서열; 및
    ii. 상기 엔도뉴클레아제에 결합하도록 구성된 리보핵산 서열
    을 포함하는 조작된 가이드 리보핵산 구조체
    를 포함하는 시스템.
  132. 제131항에 있어서, 상기 조작된 가이드 리보핵산 서열은 서열번호 88-96 또는 488-489 중 어느 하나의 비축퇴성 뉴클레오티드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 시스템.
  133. 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은 제106항 내지 제124항 중 어느 한 항의 상기 조작된 핵산 편집 폴리펩티드 또는 제131항 또는 제132항의 상기 시스템을 상기 표적 핵산 유전자좌에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 복합체는 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌에 결합시, 상기 복합체가 상기 표적 핵산 유전자좌의 뉴클레오티드를 변형시키도록 구성되는 것인, 표적 핵산 유전자좌를 변형시키는 방법.
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