KR20190134673A - 게놈 편집에 의한 엑손 스키핑 유도 방법 - Google Patents

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노리코 사사카와
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Abstract

CRISPR-Cas 및 가이드 RNA를 사용하는 게놈 상의 목적 유전자의 표적 엑손을 스키핑하기 위한 방법으로서, 상기 가이드 RNA는 CRISPR-Cas에 의한 절단 부위가 표적 엑손 직전의 스플라이싱 도너 부위 또는 표적 엑손 직후의 스플라이싱 억셉터 부위로부터 80 염기 이내에 배치되는 것과 같은 스페이서 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

Description

게놈 편집에 의한 엑손 스키핑 유도 방법
본 발명은 유전자 재조합 기술에 관한 것으로서, 연구 분야나 의료 분야에서 유용한 게놈 편집에 의한 엑손 스키핑 유도 방법에 관한 것이다.
듀시엔형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy, 이하 DMD)은 디스트로핀 유전자의 기능 상실에 의해, 근섬유가 위축되는 질환이다. 디스트로핀 유전자의 골격근 동형체(isoform; Dp427m)는 79개의 엑손으로 구성되어 있으나, 그 일부가 결손되는 등 유전자의 리딩 프레임(reading frame)이 어긋남으로써 디스트로핀 단백질이 정상적으로 만들어지지 않게 되는 것이 원인이 되어 DMD가 발병한다(비특허문헌 1).
DMD의 근치(根治)를 목표로, 기능 부전의 내재성 디스트로핀 유전자 대신에 외부로부터의 기능성 디스트로핀 유전자를 첨가하는 유전자 치료법도 다양한 연구가 이루어지고 있다. 디스트로핀의 전장 cDNA의 크기는 14 kb나 되기 때문에, 불필요한 도메인 부분을 줄여서 소형화시킨 미니 디스트로핀이나 마이크로 디스트로핀을 제작하고, 다양한 유전자 도입 벡터(AAV, 렌티바이러스, Sleeping Beauty 트랜스포존 벡터 등)를 이용하여 근조직에의 도입이 시도되고 있다. 그러나 거대한 유전자를 도입하는 것은 어렵고, 효과적인 치료법 확립에는 이르지 못하였다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 mRNA가 스플라이싱될 때 특정 엑손을 일부 읽지 않도록 함으로써, 정상적인 기능을 가지는 디스트로핀으로 복구하는 연구(엑손 스키핑)가 진행되고 있지만, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과는 일시적인 것이며, 근본적인 치료로서는 유전자 자체를 복구하는 방법이 요구되고 있다.
유전자 자체를 복구하는 수법으로서 최근, TALEN이나 CRISPR-Cas 시스템이라는 게놈 편집 기술이 개발되고 있다. 이것들은 게놈 서열 중에서 특정 서열 부위를 인식하여 DNA 이중 가닥 절단을 유도함으로써, 비상동 재조합(Non-homologous end joining, NHEJ)이나 상동 재조합(Homology directed repair, HDR)을 통한 DNA 복구 기구를 국소적으로 유도하여, 그 절단 부위에 염기를 추가하거나 삭제할 수 있는 기술이다.
CRISPR-Cas 게놈 편집 기술은 세균이나 원시 세균이 가지는 Type II 또는 Type V CRISPR 시스템이 널리 이용되고 있으며, 가이드 RNA(gRNA 또는 sgRNA)에 포함되는 스페이서 서열 의존적으로 표적 DNA에 결합하고, Cas 뉴클레아제(Type II의 경우는 Cas9, Type V의 경우는 Cpf1)의 작용에 의해, 이중 가닥 DNA 절단을 유도할 수 있다. Type II CRISPR 시스템에서 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA의 복합체, 또는 crRNA와 tracrRNA가 연결된 sgRNA(single guide RNA)이다.
게놈 편집 기술을 이용한 디스트로핀의 엑손 스키핑을 근아세포(비특허문헌 2, 3)나 mdx 마우스 레벨(비특허문헌 4 - 7)로 실시하였다는 보고가 있다.
이들 연구에서는 2개의 가이드 RNA를 사용하여 스키핑하는 엑손의 양단을 절단하고, 엑손 통째로 큰 결손을 유도하는 방법을 취하고 있지만, 이 방법의 경우에는 gRNA가 2개 필요한 만큼 비특이적인 절단이 일어날 위험이 증가한다. 한편, 어느 한쪽의 gRNA에서의 절단만으로는 전혀 엑손 스키핑을 유도할 수 없으며, 2개의 gRNA 서열이 동일 게놈 상에서 작용할 필요가 있다. 또한, 적어도 몇백 염기는 제거할 필요가 있으며, 그 영역에 미지(未知)의 제어 영역이나 miRNA의 코딩 영역이 포함되어 있는 경우, 예기치 못한 부작용이 발생할 위험도 있다.
한편, 본 발명자들은 이전 DMD 환자 유래 iPS 세포에서 TALEN이나 CRISPR-Cas9와 같은 게놈 편집 기술을 이용함으로써, (1) 엑손 스키핑, (2) 프레임 시프트 유도 및 (3) 결손 엑손의 낙-인(knock-in)에 의해, 디스트로핀의 유전자 변이를 복구할 수 있다는 것을 보고하였다(비특허문헌 8). 이 중에서 (1)의 방법에서는 엑손의 스플라이싱 억셉터(acceptor)를 제거하는 방법을 채택하고 있으며, 하나의 gRNA로 몇 염기 내지 몇십 염기의 결손을 유도할 수 있다면 충분히 엑손 스키핑을 유도할 수 있기 때문에, 상기의 [비특허문헌 2 ~ 7] 에서 보고되어 있는 방법보다 효율적이고, 부작용 변이 위험이 작고, 극히 적은 DNA 염기 제거로 충분하다는 3가지 점에서 우수하다.
한편으로, 스플라이싱 억셉터는 엑손 스키핑을 유도하는데 있어서 매력적인 표적 부위이지만, 폴리피리미딘(T/C의 연속) 서열을 포함하고 있으며 많은 엑손 서열에서 유사한 서열을 가지고 있다는 점에서, 특이성이 높은 gRNA의 설계가 곤란하다는 문제점이 있었다. CRISPR-Cas의 DNA 절단 도메인에 변이를 도입함으로써, DNA 이중 가닥 절단이 아니라 단일 가닥 절단을 유도하는 닉카아제(nickase) 개변형 CRISPR-Cas를 2개 조합함으로써 특이성을 높인 더블 닉킹(double nicking)법(Mali P et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep; 31(9):833-8; Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12; 154(6):1380-9)이 알려져 있다. 또한, Type V AsCpf1은 Type II SpCas9와 비교하여, 인간 세포 중에서의 특이성이 높다고 알려져 있으며(Kleinstiver BP et al., Nat Biotechnol, 2016 Aug; 34(8):869-74.; Kim D et al., Nat Biotechnol, 2016 Aug; 34(8):863-8), 더블 닉킹법 또는 Cpf1을 사용하여 스플라이싱 억셉터 부근을 표적화함으로써 특이성의 문제는 회피할 수 있다고 생각했다.
또한, 가이드 RNA의 스페이서 서열이나 CRISPR-Cas의 종류에 따라 절단 활성이나 절단 길이가 다르다는 것이 알려져 있으며, 효율적으로 엑손 스키핑을 유도할 수 있는 가이드 서열이나 설계 방법의 경험칙은 알려져 있지 않았다.
비특허문헌 1: Pichavant et al., Mol Ther. 2011 May; 19(5):830-40. 비특허문헌 2: Ousterout DG et al., Nat Commun. 2015 Feb 18; 6:6244 비특허문헌 3: Iyombe-Engembe JP Mol Ther Nucleic Acids. 2016 Jan 26; 5: e283. 비특허문헌 4: Xu L et al., Mol Ther. 2016 Mar; 24(3):564-9. 비특허문헌 5: Long C et al., Science, 2016 Jan 22; 351(6271):400-3. 비특허문헌 6: Nelson CE et al., Science. 2016 Jan 22; 351(6271):403-7 비특허문헌 7: Tabebordbar M et al., Science. 2016 Jan 22; 351(6271):407-11 비특허문헌 8: Li HL et al., Stem Cell Reports. 2015 Jan 13; 4(1):143-54.
본 발명은 효율적으로 엑손 스키핑을 실시하기 위한 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은 엑손 스키핑에 대한 평가를 간편하게 실시하기 위한 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 행하였다. 엑손 스키핑의 표적 유전자로서 코딩 영역 내에 제1 인트론, 해석 대상 엑손 및 제2 인트론을 포함하는 서열이 삽입된 마커 유전자를 이용하여, 엑손이 스키핑되었을 때 마커 유전자가 기능하도록 설계함으로써 마커 유전자의 표현형에 기초하여 엑손 스키핑을 효율적으로 해석할 수 있다는 것을 발견하였다. 그 결과, CRISPR-Cas 및 가이드 RNA를 사용하여 게놈 상의 목적 유전자의 표적 엑손 스키핑을 실시할 때, CRISPR-Cas에 의한 절단 부위가 표적 엑손의 스플라이싱 억셉터 부위 또는 스플라이싱 도너(donor) 부위로부터 80 염기 이내에 배치되도록 가이드 RNA를 설정함으로써, 엑손 스키핑의 효율을 향상시킬 수 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은 이하를 제공한다.
[1] CRISPR-Cas 및 가이드 RNA를 사용하는 게놈 상의 목적 유전자의 표적 엑손을 스키핑하기 위한 방법으로서, 상기 가이드 RNA는 CRISPR-Cas에 의한 절단 부위가 표적 엑손 직전의 스플라이싱 도너 부위 또는 표적 엑손 직후의 스플라이싱 억셉터 부위로부터 80 염기 이내에 배치되는 것과 같은 스페이서 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
[2] 상기 가이드 RNA는 2종류 이상 사용되는 것인, [1]에 기재된 방법.
[3] CRISPR-Cas가 RuvC 도메인의 뉴클레아제 활성 잔기가 치환된 닉카아제 개변형 Cas이며, 목적 유전자의 센스 가닥에 대한 가이드 RNA 및 안티센스 가닥에 대한 가이드 RNA를 사용하고, 양쪽 가이드 RNA는 목적 유전자의 센스 가닥에서의 절단 부위 및 목적 유전자의 안티센스 가닥에서의 절단 부위가 모두 표적 엑손 직전의 스플라이싱 도너 부위 또는 표적 엑손 직후의 스플라이싱 억셉터 부위로부터 80 염기 이내에 배치되는 것과 같은 스페이서 서열을 가지는 것인, [1]에 기재된 방법.
[4] CRISPR-Cas가 Cas9인 것인, [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[5] Cas9가 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래 혹은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래인 것인, [4]에 기재된 방법.
[6] CRISPR-Cas가 Cpf1인 것인, [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[7] Cpf1이 아키다미노코쿠스 종(Acidaminococcus sp.) BV3L6 유래 혹은 라크노스피래세애(Lachnospiraceae) 유래인 것인, [6]에 기재된 방법.
[8] 목적 유전자가 인간 디스트로핀 유전자인 것인, [1] ∼ [7] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[9] 표적 엑손이 엑손 45인 것인, [8]에 기재된 방법.
[10] 상기 가이드 RNA가 서열번호 17 ∼ 42중 어느 하나의 염기 서열의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열, 서열번호 44 ∼ 45중 어느 하나의 염기 서열의 염기번호 17 ∼ 39의 염기 서열 또는 서열번호 50 ∼ 53중 어느 하나의 염기 서열의 염기번호 24 ∼ 43의 염기 서열로 이루어진 스페이서 서열을 가지는 것인, [9]에 기재된 방법.
[11] CRISPR-Cas 및 가이드 RNA를 포함하는, 게놈 상의 목적 유전자의 표적 엑손을 스키핑하기 위한 시약으로서, 상기 가이드 RNA는 CRISPR-Cas에 의한 절단 부위가 표적 엑손 직전의 스플라이싱 도너 부위 또는 표적 엑손 직후의 스플라이싱 억셉터 부위로부터 80 염기 이내에 배치되는 것과 같은 스페이서 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 시약.
[12] 엑손 스키핑을 평가하기 위한 방법으로서, 코딩 영역 내에 제1 인트론, 해석 대상 엑손 및 제2 인트론을 포함하는 서열이 삽입된 마커 유전자를 사용하여, 해석 대상 엑손이 스키핑되었을 때 마커 유전자가 기능하도록 설계되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
[13] 엑손 스키핑이 CRISPR-Cas 및 가이드 RNA를 사용한 엑손 스키핑인 것인, [12]에 기재된 방법.
[14] 트랜스포존 벡터를 이용함으로써 마커 유전자를 해석 대상 세포의 게놈에 삽입하는 것인, [12] 또는 [13]에 기재된 방법.
[15] 마커 유전자가 루시퍼라아제 유전자인 것인, [12] ∼ [14] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[16] 해석 대상 엑손이 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 45인 것인, [12] ∼ [15] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
본 발명의 방법에 의하면, 게놈 편집 기술을 이용한 엑손 스키핑에 있어서, 엑손 스키핑의 효율을 향상시킬 수 있고, 질환의 치료 등에 효과적이다. 또한, 엑손 스키핑의 표적 유전자로서 코딩 영역 내에 제1 인트론, 해석 대상 엑손 및 제2 인트론을 포함하는 서열이 삽입된 마커 유전자를 이용하여, 엑손이 스키핑되었을 때 마커 유전자가 기능하도록 설계함으로써 마커 유전자의 표현형에 기초하여 엑손 스키핑을 효율적으로 해석할 수 있다.
도 1은 게놈 편집 엑손 스키핑법에 의한 디스트로핀 단백질의 복구 원리를 나타낸다.
도 2는 스플라이싱 억셉터 서열 부위의 서열 특이성이 일반적으로 낮고, 유사 서열이 게놈 상의 다른 장소에도 존재한다는 것을 나타내고 있으며, 특이성이 높은 CRISPR 가이드 RNA 등을 설계하는 것이 어렵다는 것을 나타내고 있다. 10 염기에서 16 염기의 길이를 가지는 임의의 DNA 서열 중, 인간 게놈 서열(hg19)의 한 곳에만 존재하는 유일 염기 서열(Unique k-mer) 데이터베이스를 작성하고, 이 유일 염기 서열의 분포를 인간 RefSeq 유전자의 전체 엑손에 있어서의 상대 위치에 따라 플로팅하였다. 인간의 엑손 내부는 대체로 유일 염기 서열이 많이 집적되어 있어 특이성이 높지만, 스플라이싱 억셉터 부분은 특이성이 대폭 낮아져 있는 것을 확인할 수 있다.
도 3은 디스트로핀 유전자의 엑손 스키핑 효율을 검출하는 리포터 벡터의 서열 일부를 나타낸다. 파이어플라이 루시퍼라아제(Firefly luciferase) 유전자의 cDNA의 도중에 있는 엑손-엑손 접합부로서 가장 잘 보이는 서열 "CAG|G"를 찾고, 여기에 디스트로핀 유전자의 엑손 44의 직후의 스플라이싱 도너(SD) 부근 서열("+" 표시), 엑손 45(">" 표시)와 전후의 인트론 서열, 엑손 46 직전의 스플라이싱 억셉터(SA) 서열("+" 표시)의 순서가 되도록 서열을 설계하고 있다. 벡터의 구축에 이용한 제한 효소 부위(NarI, AgeI, SalI)를 # 표시로 마킹하고 있다.
도 4에서는 삽입한 디스트로핀 서열 부위만으로 스플라이싱이 일어나도록, Luc 서열에 변이를 도입하여 개변시켰다. (a) 도 3의 엑손 스키핑 벡터를 293T 세포에 도입하여 mRNA를 추출하고, 스플라이싱 패턴을 생어 염기서열 분석법(Sanger sequencing method)으로 확인한 바, Luc 유전자의 도중(도 3의 31번 염기)에 슈도-스플라이싱 도너 서열이 있고, 예기치 못한 스플라이싱이 일어나고 있다(시퀀싱 전자프로그램에 여분의 파형이 혼입되어 있음)는 것이 판명되었다. (b) 디스트로핀 유전자의 전체 엑손 서열을 Ensemble BioMart사로부터 취득하고, WebLogo를 이용하여 스플라이싱 도너 부분과 스플라이싱 억셉터 부분의 컨센서스 서열을 해석한 바, 일반적인 인간 유전자의 염기 서열과 유사한 경향을 보이며, 스플라이싱 도너에는 "GT" 서열이, 스플라이싱 억셉터 서열에는 "AG"가 가장 높은 빈도로 보존되어 있는 것을 확인하였다. (c) (a)의 슈도-스플라이싱 도너 서열이 기능하지 않도록 하기 위해, Luc cDNA의 시작 염기로부터 967번째 "G"(도 3의 31번 염기)를 "A"로 개변하였다. 이때, Luc 단백질 323번째의 Val 아미노산은 Ile로 변경되었다.
도 5에서는 아미노산 변경 부위가 파이어플라이 루시퍼라아제의 활성에 미치는 영향을 예측하기 위해, 파이어플라이 루시퍼라아제 단백질의 결정 구조(PDB 코드: 1BA3)를 해석하였다. 323번째의 Val 잔기(사각형)는 활성 중심 잔기(원형 표시)[Branchini BR et al., JBC, 1997]로부터 충분히 떨어져 있어 직접적인 상호 작용은 없기 때문에, 이 아미노산을 변경해도 효소 활성에의 영향은 적다고 예상되었다. 또한, Val 잔기는 α 헬릭스의 도중에 위치하고 있다는 점으로부터 α 헬릭스 구조를 변화시키기 어려워, 구조나 화학적 성질이 유사한 Ile 잔기로 변경하였다.
도 6에서는 G967A(V323I) 변이가 스플라이싱 및 Luc 활성에 미치는 영향을 조사하였다. (a) 비교 해석에 이용한 Luc 발현 카세트. 모두, piggyBac 벡터(System Biosciences) pPV-EF1a-GW-iP-A에 삽입되어 있다. *은 G967A(V323I) 변이를 나타내고, 점선은 인트론, 박스는 엑손을 나타낸다. (b) 각 벡터를 293T 세포에 도입하고, mRNA를 추출하여 인트론 부분을 포함하는 프라이머로 PCR을 실시함으로써, 스플라이싱 패턴을 해석하였다. Lu2에 인트론을 삽입한 레인 2에서는, 예상한 대로 스플라이싱이 일어나 있는 밴드(377 bp)와는 별도로, 인트론이 잔류되어 있는 밴드(468 bp)도 관찰되었다. 유사한 경향은 디스트로핀의 엑손 45를 삽입한 레인 4에서도 나타나며, 예상한 대로의 스플라이싱이 일어난 468 bp의 밴드 이외에, 인트론을 포함한 1166 bp의 밴드도 관찰되었다. Luc2 cDNA 중에 점 변이(G967A(V323I) 변이)를 도입한 레인 3 및 레인 5에서는, 각각 스플라이싱이 보다 효율적으로 일어나 있는 것을 확인할 수 있었다. (c) Luc2 cDNA에 G967A(V323I) 변이를 도입한 것에 의한 루시퍼라아제 활성에의 영향은 거의 나타나지 않았다(2번째와 3번째의 비교). 한편, 디스트로핀 엑손 45를 삽입한 Luc2 벡터에서는 스플라이싱 효율이 좋고 엑손 45가 Luc2에 통합될수록, Luc2에 프레임 시프트가 일어나 루시퍼라아제 활성은 낮아질 것이 예상된다. G967A(V323I) 변이 도입에 의해 루시퍼라아제 활성의 백그라운드 레벨이 낮아져 있으며, 이에 의해 좋은 감도로 저 빈도의 엑손 스키핑이 검출 가능해졌다.
도 7에서는 엑손 45 전후의 인트론의 길이가 스플라이싱에 미치는 영향을 조사하기 위해, 다양한 길이의 벡터를 구축하였다. 루시퍼라아제 리포터는 piggyBac 벡터에 탑재되어 있으며, 이 벡터를 piggyBac 전이 효소 발현 벡터와 함께 도입함으로써 숙주 세포의 염색체로의 안정적인 도입이 가능하다. 또한, 리포터 벡터가 도입된 세포만을 풍부하게 할 수 있도록, IRES에 이어서 퓨로마이신(Puromycin) 내성 유전자도 탑재하고 있다.
도 8에서는 (a) 도 7의 엑손 스키핑 벡터(Luc2 G967A)를 293T 세포에 형질감염시키고, 2일 후에 mRNA를 추출하여 PCR 해석에 의해 스플라이싱 패턴을 해석하였다. 엑손 45의 전후의 인트론 길이(0.7 ∼ 4.0 kb)는 길수록 스플라이싱되어 있지 않은 밴드(1166 bp)가 감소하는 경향을 나타냈지만, 모두에서 효율적인 스플라이싱 밴드(468 bp)가 관찰되었다. 또한, gRNA1과 SpCas9 발현 플라스미드도 함께 도입함으로써, 엑손 스키핑을 유도하였다(Exon skipping "+"). 그 결과, 어떠한 인트론 길이 리포터에서도 스키핑이 유도된 밴드(377 bp)가 관찰되었다. (b) 루시퍼라아제 검정에 의해 엑손 스키핑의 유도 효율을 측정하였다. G967A 점 변이를 도입하지 않은 리포터 벡터(Luc2 +hEx45(0.7 kb))에서는, 엑손 스키핑을 유도하지 않을 때의 백그라운드 레벨이 높고 유도 전후에서 차이가 나타나지 않지만, G967A 변이를 도입한 엑손 스키핑 벡터에서는 SpCas9와 sgRNA-DMD1을 발현하는 벡터를 도입함으로써 엑손 스키핑이 유도되어 루시퍼라아제 활성의 상승을 확인할 수 있었다.
도 9는 인간 디스트로핀 유전자에서의 엑손 45의 스플라이싱 억셉터 부위에 대한 CRISPR SpCas9 gRNA의 표적 서열을 나타낸다.
도 10은 SSA 어세이에 의해 측정한 인간 293T 세포 중에서의 CRISPR-SpCas9 및 CRISPR-SpCas9(D10A)를 이용했을 때의 표적 DNA 절단 활성을 나타낸다. CRISPR-SpCas9의 경우, 가이드 RNA1 내지 5중 어느 것에서도 절단 활성이 나타난다. 한편, 닉카아제 개변형 SpCas9(D10A)를 이용했을 경우, 단독의 가이드 RNA만으로는 절단 활성이 예상한 대로 관찰되지 않는다. 센스 가닥에 대한 가이드 RNA5 및 안티센스 가닥에 대한 가이드 RNA4를 조합하여 사용했을 경우에 있어서, 높은 DNA 절단 활성을 확인할 수 있었다.
도 11은 절단 서열 해석에 의한 절단 패턴을 나타낸다. DMD-iPS 세포에 CRISPR-Cas9 및 당해 가이드 RNA를 발현하는 플라스미드 DNA를 일렉트로포레이션으로 도입하고, 게놈 DNA를 추출한 후, MiSeq 시퀀서를 이용하여 게놈 DNA 절단 패턴을 해석하였다. 염기가 결손되어 있는 위치를 누적 꺾은선 그래프로서 나타내고 있다.
도 12에서는 엑손 스키핑 리포터로서 Luc2(G967A) +hEx45(0.7 kb)를 이용하여, 293T 세포에서 sgRNA-DMD1 ∼ 5의 엑손 스키핑 효율을 측정하였다. 그 결과, gRNA가 없는 샘플과 비교하여, sgRNA-DMD1, sgRNA-DMD4, sgRNA-DMD2에서 P < 0.01의 유의미한 차이로 루시퍼라아제 활성이 상승하였다.
도 13은 (a) 디스트로핀 엑손 45의 스플라이싱 억셉터 부근에 설계된 각종 CRISPR-Cas(SpCas9, SaCas9, AsCpf1) 유래의 gRNA의 표적 서열이다. PAM 서열은 밑줄로 나타낸다. (b) AsCpf1의 gRNA 발현 카세트의 이미지 도면. H1 프로모터의 전사 시작점(TSS)에는 G(또는 A)가 바람직하다는 것이 알려져 있지만, G를 1 염기에서 3 염기로 증가시킴으로써 gRNA의 발현량이 증강되어 표적 DNA 절단 효율이 상승하는 것이 예상되었다. (c) AsCpf1 및 gRNA를 293T 세포에 도입하고, SSA 어세이에 의해 표적 DNA의 절단 활성을 측정하였다. 먼저, 전사 시작점(TSS)의 G를 1 염기에서 3 염기로 증가시킴으로써 절단 활성의 상승이 나타났다. 또한, TTTT를 PAM 서열로 하는 AsCpf1-gRNA-DMD1과 AsCpf1-gRNA-DMD2는 절단 활성이 대단히 낮지만, TTTG(TTTV)를 PAM으로 하는 AsCpf1-gRNA-DMD3과 AsCpf1-gRNA-DMD4는 SpCas9-gRNA-DMD1과 동등 이상의 절단 활성을 나타내었다. (d) 엑손 스키핑 리포터로서 Luc2(G967A) +hEx45(0.7 kb)를 이용하여, 293T 세포에서 더블 닉킹(double nicking)법, SaCas9/gRNA 및 AsCpf1/gRNA를 이용했을 경우의 엑손 스키핑 효율을 측정하였다. 그 결과, SpCas9/sgRNA-DMD1과 비교하여, SpCas9(D10A) 더블 닉킹법에 의해 sgRNA-DMD4와 sgRNA-DMD5를 페어로 사용했을 경우에 있어서 엑손 스키핑 활성이 높았다. 또한, AsCpf1의 sgRNA-DMD3과 sgRNA-DMD4를 사용하는 것으로도, 높은 엑손 스키핑 효율을 유도할 수 있었다.
도 14A에서는 (a) 디스트로핀 엑손 45 상에 설계 가능한 SpCas9-gRNA의 표적 부위에 26종류의 gRNA를 제작하였다.
도 14B는 (b) (a)에서 이용한 sgRNA-DMD1 ∼ 26의 표적 서열 및 스페이서 서열의 일람표이다. 293T 세포에 SpCas9 발현 벡터와 Luc2(G967A) +hEx45(0.7 kb) 엑손 스키핑 리포터 벡터와 함께 각 gRNA를 도입하고, 하기 프라이머(Luc2-Fwd-Splice: TGCCCACACTATTTAGCTTC(서열번호 1), Luc2-Rev-Splice: GTCGATGAGAGCGTTTGTAG)(서열번호 2))를 이용하여 T7E1 어세이를 실시하고, 각 gRNA의 리포터 벡터 상의 표적 부위의 DNA 절단 활성을 측정하였다(T7E1 Indel activity [%]). 또한, 엑손 스키핑 효율에 대해서도 측정하였다(Exon skipping Luc activity [A.U.]).
도 14C에서는 (c) 엑손 스키핑 리포터로서 Luc2(G967A) +hEx45(0.7 kb)를 이용하여, 293T 세포에서 sgRNA-DMD1 ∼ 26의 엑손 스키핑 효율을 측정하였다. 그 결과, 엑손 45의 스플라이싱 억셉터 부근을 표적으로 하는 gRNA 및 스플라이싱 도너 부근을 표적으로 하는 gRNA에서 엑손 스키핑 효율이 높다는 것이 판명되었다.
도 15에서는 도 14에서 사용한 2종류의 sgRNA의 조합에 대해, 도 14와 동일한 방법으로 SpCas9에 의한 엑손 스키핑의 효율을 평가한 결과를 나타낸다.
본 발명의 방법은 CRISPR-Cas 및 가이드 RNA를 사용한 게놈 상의 목적 유전자의 표적 엑손을 스키핑하기 위한 방법으로서, 가이드 RNA가 CRISPR-Cas에 의한 절단 부위가 표적 엑손 직전의 스플라이싱 도너 부위 또는 표적 엑손 직후의 스플라이싱 억셉터 부위로부터 80 염기 이내에 배치되는 것과 같은 스페이서 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
< CRISPR - Cas 시스템>
CRISPR 시스템으로는 복수 인자가 복합체를 형성하여 작용하는 Class 1과 단일 인자로도 작용하는 Class 2가 알려져 있으며, Class1에는 타입 I, 타입 III, 타입 IV가 포함되고, Class 2에는 타입 II, 타입 V, 타입 VI이 포함된다(Makarova KS et al., Nat Rev Microbiol. 2015 | Mohanraju P et al., Science, 2016). 현재, 포유류 세포에서의 게놈 편집 용도로는 단일 인자로 작용하는 Class 2의 CRISPR-Cas가 주로 사용되고 있으며, 타입 II Cas9나 타입 V Cpf1이 대표적이다.
CRISPR-Cas9 시스템으로는 게놈 편집 툴로서 널리 사용되고 있는 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Class 2 타입 II Cas9를 사용할 수 있지만, 다른 세균 유래의 Class 2 타입 II Cas9도 보고되어 있으며, 예를 들어 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus, Sa) 유래 Cas9나 수막염균(Neisseria meningitidis, Nm) 유래 Cas9, 써모필러스균(Streptococcus thermophilus, St) 유래 Cas9 등도 사용할 수 있다.
[I]
An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.
Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, Costa F, Shah SA, Saunders SJ, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Haft DH, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Terns RM, Terns MP, White MF, Yakunin AF, Garrett RA, van der Oost J, Backofen R, Koonin EV.
Nat Rev Microbiol. 2015 Nov; 13(11): 722-36. doi: 10.1038/nrmicro3569.
[II]
Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.
Mohanraju P, Makarova KS, Zetsche B, Zhang F, Koonin EV, van der Oost J.Science. 2016 Aug 5; 353(6299): aad5147. doi: 10.1126/science.aad5147
[III]
In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 2015 Apr 9; 520(7546):186-91.
[IV]
Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat Methods. 2013 Nov; 10(11):1116-21.
[V]
Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24; 110(39): 15644-9.
[VI]
Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 systems enable specific editing of the human genome. Mol Ther. 2016 Mar; 24(3):636-44.
또한, Class 2 타입 V의 CRISPR-Cas 시스템으로서 Cpf1이 동정되어 있으며, 아키다미노코커스 종(Acidaminococcus sp., As) 유래 Cpf1이나 라크노스피래세애(Lachnospiraceae) 유래 Cpf1을 이용함으로써, gRNA 서열 의존적으로 인간 세포에서 게놈 편집이 가능하다는 것이 보고되어 있다. 따라서, 이들 CRISPR-Cpf1을 사용할 수도 있다.
[V]
Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 2015 Oct 22; 163(3):759-71
[VI]
Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nat Biotechnol. 2017 Jan; 35(1):31-34.
CRISPR-Cas9는 RuvC 도메인과 HNH 도메인의 2개의 뉴클레아제 도메인을 가지며, 각각의 도메인이 이중 가닥 DNA의 각 가닥의 절단을 담당하고 있다. 또한, CRISPR-Cpf1은 RuvC 도메인과 NuC 도메인을 가진다. 그리고 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9에서 RuvC 도메인의 10번째의 Asp를 Ala로 치환(D10A)하면 gRNA가 결합하지 않는 DNA 가닥이 절단되지 않게 되고, HNH 도메인의 840번째의 His를 Ala로 치환(H840A)하면 gRNA가 결합하는 DNA 가닥이 절단되지 않게 된다[Jinek M et al., Science. 2012 Aug 17; 337(6096):816-21.]. 이 특성을 이용하여, 이중 가닥 DNA의 단일 가닥밖에 절단하지 않는 닉카아제를 2개 근접시킨 상태로 각각 따로따로 DNA 가닥을 절단함으로써, 원하는 영역에 이중 가닥 DNA 절단을 유도하는 더블 닉킹(또는 페어드 닉카아제(paired nickase))법이 개발되었다[Mali P et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep; 31(9):833-8.; Ran FA et al., Cell. 2013 Sep 12; 154(6):1380-9]. 이에 의해, 표적 부위 이외의 곳에 서열 변이를 유도하는 위험을 저하시키면서, 임의의 서열을 낙-인(knock in)으로 삽입하는 표적화 등의 게놈 편집이 가능해졌다[WO 2014204725 A1].
따라서, 본 발명의 방법에서는 D10A Cas9 닉카아제를 CRISPR-Cas9로서 사용하여, 센스 가닥과 안티센스 가닥을 각각 절단하기 위한 2종류의 가이드 RNA를 사용할 수도 있다(더블 닉킹법). 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 이외에도, RuvC 도메인의 활성 아미노산 잔기에 변이를 도입함으로써 더블 닉킹법에 사용할 수 있는 닉카아제형 Cas9나 닉카아제형 Cpf1을 얻을 수 있다.
상기와 같은 CRISPR-Cas를 코딩하는 DNA는 GenBank 등에 등록되어 있는 CRISPR-Cas를 코딩하는 서열에 기초하여 클로닝함으로써 입수 가능하다. 또한, 시판중인 CRISPR-Cas를 포함하는 플라스미드를 Addgene 등으로부터 입수하여 사용할 수도 있고, 당해 플라스미드를 주형으로 한 PCR에 의해 CRISPR-Cas를 코딩하는 DNA를 얻을 수도 있고, 당업자에게 공지된 인공 유전자 합성 기술을 이용하여 인공적으로 제작할 수도 있으며, 그 입수 방법에 제한은 없다. Cas 닉카아제를 코딩하는 DNA는 공지된 분자 생물학적 수법에 의해 CRISPR-Cas의 뉴클레아제 도메인의 활성 아미노산 잔기에 변이를 도입함으로써 입수할 수 있으며, 미리 변이가 도입된 CRISPR-Cas 유전자를 포함하는 플라스미드 등으로부터 클로닝하여 이용할 수도 있다. 또한, CRISPR-Cas는 숙주에서의 발현 효율을 향상시키기 위해 코돈 개변될 수도 있다.
CRISPR-Cas는 mRNA나 단백질 혹은 DNA로서 세포에 도입될 수도 있다. 가이드 RNA는 RNA 혹은 DNA로서 세포에 도입될 수도 있다. 벡터를 이용하여 도입하는 경우에 사용되는 벡터로는 진핵생물 세포에서 복제 가능한 벡터 및 에피솜을 유지하는 벡터 혹은 숙주 세포 게놈에 도입되는 벡터를 들 수 있으나, 바이러스 벡터로서 예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 또한, 트랜스포존 벡터로는 piggyBac 벡터, piggyBat 벡터, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 벡터, TolII 벡터, LINE 벡터 등을 들 수 있다. 치료에 있어서는, 항상적으로 발현하는 벡터에서의 도입은 부작용 위험이 높아지기 때문에 바람직하지 못하고, 투여 직후에 DNA 절단이 유도되면 되기 때문에 Cas9 mRNA/gRNA나 Cas9 단백질/gRNA로서의 도입, 에피소말 벡터로서의 도입 등이 바람직하다.
벡터는 선택 마커를 포함할 수도 있다. 「선택 마커」란 선택 마커가 도입된 세포에 선택 가능한 표현형을 제공하는 유전 요소를 말하며, 일반적으로는 유전자 산물이 세포의 증식을 저해하거나 또는 세포를 살상하는 약제에 대한 내성을 부여하는 유전자이다. 구체적으로는, 예를 들어 Puro 내성 유전자, Neo 내성 유전자, Hyg 내성 유전자, Bls 유전자, hisD 유전자, Gpt 유전자 및 Ble 유전자를 들 수 있다. 선택 마커의 존재를 선택하기 위해 유용한 약물로는 예를 들어, Puro 내성 유전자에 대해서는 퓨로마이신, Neo 내성 유전자에 대해서는 G418, Hyg 내성 유전자에 대해서는 하이그로마이신, Bls 유전자에 대해서는 블라스티시딘, hisD에 대해서는 히스티디놀, Gpt에 대해서는 크산틴 그리고 Ble에 대해서는 블레오마이신을 들 수 있다.
<가이드 RNA>
가이드 RNA(gRNA 또는 sgRNA)는 CRISPR-Cas9법에 있어서의 tracrRNA와 crRNA의 복합체, 또는 tracrRNA와 crRNA를 인공적으로 연결시킨 것이다[Jinek M et al., Science. 2012 Aug 17; 337(6096):816-21]. 본 발명에 있어서, 표적 유전자에 대응하는 서열을 가지는 스페이서 서열과 스캐폴드 서열을 연결시킨 것을 의미한다.
SpCas9의 가이드 RNA의 스캐폴드 서열은 공지된 서열, 예를 들어 5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3'(서열번호 3)의 서열을 사용하는 것이 가능하다. 또는, 개변된 스캐폴드 서열(Chen B et al., Cell, 2013 Dec 19; 155(7): 1479-91) 5'-GTTTTAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTT-3'(서열번호 4)일 수도 있다.
한편, 가이드 RNA는 CRISPR-Cpf1에 있어서 tracrRNA는 필요로 하지 않는다.
AsCpf1의 가이드 RNA의 스캐폴드 서열은 공지된 서열, 예를 들어 5'-GTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3'(서열번호 5) 또는 5'-GGGTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3'(서열번호 6)의 서열을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들어, 당업자에게 공지된 인공 유전자 합성 기술을 이용하여 당해 DNA를 인공적으로 제작할 수도 있고, 그 입수 방법에 제한은 없다.
본 발명의 방법에 있어서, CRISPR-Cas에 의한 절단 부위가 표적 엑손 직전의 스플라이싱 도너 부위 또는 표적 엑손 직후의 스플라이싱 억셉터 부위로부터 80 염기 이내, 바람직하게는 50 염기 이내, 더 바람직하게는 30 염기 이내에 배치되도록 가이드 RNA의 스페이서 서열을 설정한다. 또한, 엑손 스플라이싱 인핸서(Exonic Splicing Enhancer, ESE) 서열 부분에 설계할 수도 있다.
이렇게 설정함으로써, 표적 엑손의 스플라이싱 억셉터 부위 또는 도너 부위의 근방에서 절단이 일어나고, 그 복구 과정에서 스플라이싱 억셉터 부위 또는 도너 부위가 파괴되고, Pre-mRNA가 mRNA로 성숙하는 과정에서 스플라이싱 반응이 일어날 때 표적 엑손의 스키핑이 일어난다.
스플라이싱 억셉터 부위는 표적 엑손 직전의 2 염기로 정의되며, 예를 들어 AG 서열이다.
스플라이싱 도너 부위는 표적 엑손 직후의 2 염기로 정의되며, 예를 들어 GT 서열이다.
엑손 스플라이싱 인핸서(ESE) 서열은 표적 엑손 중에 존재하는 SR 단백질(SRSF1 ∼ 12 유전자)의 결합 부위로서 정의된다. SR 단백질의 결합 부위는 데이터베이스에서의 검색이 가능하며, 이러한 데이터베이스로서 예를 들어 RESCUE-ESE[Fairbrother WG et al., Science, 2002], ESEfinder[Cartegni L. et al., NAR, 2003] 등이 있다.
타입 II Cas9의 스페이서 서열은 표적 유전자의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 서열에서, PAM 서열(예를 들어, S. 피오제네스(S. pyogenes) Cas9의 경우에는 NGG, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9의 경우에는 NNGRRT)의 직전의 염기를 3' 말단으로 하는 15 ∼ 30 염기의 연속하는 염기 서열을 가지는 RNA로서 설계할 수 있다(예를 들어, NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG(서열번호7)). (N은 스페이서 서열임)
다만, 서열이 100% 일치하지 않아도 절단은 일어날 수 있기 때문에, 1 ∼ 2 염기의 미스 매칭이 있을 수 있다(특히, 5' 측). 한편, 인간 H1 PolIII 프로모터로부터의 전사 시작점으로 하기에는 스페이서 서열의 5' 말단의 염기는 C 또는 T가 아닌 것이 바람직하고, 만약에 게놈 상의 상응하는 염기가 C 또는 T인 경우에는 G로 변환하는 것이 바람직하다.
타입 V Cfp1의 가이드 RNA의 경우에는 PAM 서열(예를 들어, 아시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) Cpf1의 경우, TTTV)의 직후의 염기를 5' 말단으로 하는 15 ∼ 30 염기의 연속하는 염기 서열을 가지는 RNA로서 설계할 수 있다(예를 들어, TTTTVNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(서열번호8)). Cpf1의 경우, tracrRNA는 필요로 하지 않는다.
S. 피오제네스(S. pyogenes) Cas9에 의한 DNA 절단 부위는 스페이서 서열의 3' 말단의 염기를 1로서 3'→5'의 방향으로 세면 그 염기로부터 3번째의 염기와 4번째의 염기의 사이에서 끊어지므로, "절단 부위가 표적 엑손의 억셉터 부위 또는 도너 부위로부터 80 염기 이내에 배치되는"이란 억셉터 부위 또는 도너 부위의 염기(예를 들어, GT 또는 AG(안티센스 가닥의 경우는 AC 또는 CT))와 스페이서 서열의 3' 말단의 염기에 상응하는 염기로부터 3'→5'의 방향으로 세어 4번째의 염기의 사이에 존재하는 염기 수가 80 염기 이내인 것을 의미한다.
AsCpf1에 의한 DNA 절단 부위는 스페이서 서열의 5' 말단의 염기를 1로서 5'→3'의 방향으로 세면 상기 염기로부터 19번째의 센스 가닥 염기와 23번째의 안티센스 가닥 염기가 절단된다.
이하, 도 3에 기초하여 설명한다.
인간 디스트로핀(hDMD) 유전자의 엑손 45를 표적으로 하고, 엑손 45의 직전의 억셉터 부위를 파괴하고, 엑손 45의 스키핑을 실시한다.
이때, Sp-sgRNA-DMD1에서는 PAM 서열(AGG)의 직전의 20 염기(tggtatcttacagGAAC/TCC)(서열번호 9)에 상응하는 스페이서 서열이 설계된다. 이 경우에는 억셉터 서열(ag)과 절단 부위(C/T)의 사이에는 4 염기가 존재하고 있다.
마찬가지로, Sp-sgRNA-DMD2에서는 PAM 서열(TGG)의 직전의 20 염기(atcttacagGAACTCCA/GGA)(서열번호 10)에 상응하는 스페이서 서열이 설계된다. 이 경우에는 억셉터 서열(ag)과 절단 부위(A/G)의 사이에는 8 염기가 존재하고 있다.
마찬가지로, Sp-sgRNA-DMD3에서는 PAM 서열(TGG)의 직전의 20 염기(cagGAACTCCAGGATGG/CAT)(서열번호 11)에 상응하는 스페이서 서열이 설계된다. 이 경우에는 억셉터 서열(ag)과 절단 부위(G/C)의 사이에는 14 염기가 존재하고 있다.
마찬가지로, Sp-sgRNA-DMD4에서는 PAM 서열(CGG)의 직전의 20 염기(TCCAGGATGGCATTGGG/CAG)(서열번호 12)에 상응하는 스페이서 서열이 설계된다. 이 경우에는 억셉터 서열(ag)과 절단 부위(G/C)의 사이에는 21 염기가 존재하고 있다.
Sp-sgRNA-DMD5는 안티센스 가닥에 설정되어 있으며, PAM 서열(AGG)의 직전의 20 염기(GTTCctgtaagatacca/aaa)(서열번호 13)에 상응하는 스페이서 서열이 설계된다. 이 경우에는 억셉터 서열(ct)과 절단 부위(a/a)의 사이에는 11 염기가 존재하고 있다.
한편, 각 서열번호에 있어서 RNA 서열을 의미하는 경우는 T를 U로 바꿔 읽는 것으로 한다.
상기와 같은 스페이서 서열에 스캐폴드 서열을 부가함으로써 가이드 RNA를 얻을 수 있다. 스캐폴드 서열을 내포하고, 임의의 스페이서 서열에 대응하는 DNA 서열을 삽입함으로써 원하는 가이드 RNA를 발현시킬 수 있는 플라스미드가 시판되고 있으므로(Addgene 플라스미드 41824 등), 이를 사용하여 가이드 RNA를 세포에 도입하는 것이 간편하다.
한편, 가이드 RNA는 2종류 이상 사용할 수도 있다. 이 경우, 1개의 파괴 대상 부위(표적 엑손)에 대해, "CRISPR-Cas에 의한 절단 부위가 표적 엑손 직전의 스플라이싱 도너 부위 또는 표적 엑손 직후의 스플라이싱 억셉터 부위로부터 80 염기 이내"라는 조건을 충족시키는 2종류 이상의 가이드 RNA를 사용할 수 있다. 동일한 파괴 대상 부위에 대해 2종 또는 그 이상의 상이한 가이드 RNA를 사용하고, 동시에 2군데 이상에서 DNA 이중 가닥의 절단을 일으키는 경우, 매우 높은 효율로 엑손 스키핑을 일으킬 수 있다. 한편, 2종류 이상의 가이드 RNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥 중 한쪽에 설정될 수도 있고, 양쪽에 설정될 수도 있다.
또한, D10A Cas9 닉카아제를 사용하고, 센스 가닥과 안티센스 가닥을 각각 절단하기 위한 2종류의 가이드 RNA를 사용하는 경우는, 2종류의 가이드 RNA 중 적어도 어느 하나의 절단 부위가 표적 엑손 전후의 억셉터 부위 또는 도너 부위로부터 80 염기 이내라는 요건을 충족하도록 설계한다. 이 경우, 센스 가닥의 가이드 RNA 결합 부위(스페이서 서열)와 안티센스 가닥의 가이드 RNA 결합 부위(스페이서 서열) 사이의 거리는 -10 ∼ 200 염기인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 0 ∼ 100 염기이며, 센스 가닥의 절단 부위와 안티센스 가닥의 절단 부위의 사이에 억셉터 부위 또는 도너 부위가 배치되는 것이 바람직하다. 또한, 센스 가닥을 절단하기 위한 가이드 RNA의 스페이서 서열과 안티센스 가닥을 절단하기 위한 가이드 RNA의 스페이서 서열은 서로 겹쳐 있을 수도 있지만, 겹치지 않는 것이 바람직하다.
표적 엑손을 가지는 표적 유전자는 특별히 제한되지 않지만, 포유류의 유전자인 것이 바람직하고, 인간 유전자인 것이 더 바람직하며, 예를 들어 질환에 관련된 유전자를 들 수 있다.
그 일례로서, 듀시엔형 근이영양증의 원인 유전자인 디스트로핀 유전자를 들 수 있으며, 엑손 45를 스키핑함으로써 변이형 유전자의 표현형을 마스킹할 수 있다는 것이 알려져 있으므로, 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 45가 엑손 스키핑 대상으로는 적합하게 사용될 수 있다.
한편, 인공적으로 합성한 엑손 및 인트론을 포함하는 유전자를 표적 유전자로 할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 사용할 수 있는 가이드 RNA에 포함되는 스페이서 서열의 구체적 서열로는 서열번호 17 ∼ 42중 어느 하나의 염기 서열의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열, 서열번호 44 ∼ 45중 어느 하나의 염기 서열의 염기번호 17 ∼ 39의 염기 서열 또는 서열번호 50 ∼ 53중 어느 하나의 염기 서열의 염기번호 24 ∼ 43의 염기 서열이 예시된다. 한편, 이것들의 상보 서열일 수도 있다.
이 중에서, 2종류의 가이드 RNA를 조합하여 사용할 때 바람직한 스페이서 서열의 조합으로는 예를 들어, sgRNA-DMD1(서열번호 17의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열), sgRNA-DMD2(서열번호 18의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열), sgRNA-DMD4(서열번호 20의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열), sgRNA-DMD8(서열번호 24의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열) 또는 sgRNA-DMD9(서열번호 25의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열)과, sgRNA-DMD23(서열번호 39의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열)의 조합이다.
또한, 이 중에서, 더블 닉킹법에 사용할 때 바람직한 스페이서 서열의 조합으로는 예를 들어, sgRNA-DMD4(서열번호 20의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열)과 sgRNA-DMD5(서열번호 21의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열)이다.
세포로의 DNA, RNA 또는 이것들을 발현하는 벡터의 형질감염은 공지된 임의의 수단을 사용함으로써 가능하며, 시판중인 형질감염용 시약을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 리포펙타민2000(Lipofectamine2000; Thermo Fisher), StemFect(STEMGEN), FuGENE 6/HD(Promega), jetPRIME Kit(Polyplus-transfection), DreamFect(OZ biosciences), GenePorter3000(OZ biosciences), 칼슘 포스페이트 형질감염 키트(Calcium Phosphate Transfection Kit; OZ biosciences) 등이 사용 가능하다. 또한, 일렉트로포레이션일 수도 있으며, 예를 들어 NEPA21(Nepagene), 4D-Nucleofector(Lonza), Neon(Thermo Fisher), Gene Pulser Xcell(Bio-Rad), ECM839(BTX Harvard Apparatus) 등이 사용 가능하다. 세포로의 형질감염은 CRISPR-Cas 단백질과 gRNA로 미리 복합체를 형성시키고, 당해 복합체를 세포에 형질감염시킬 수도 있다. 또한, 수정란에 미세주입법, 일렉트로포레이션에 의해 DNA, RNA를 도입하는 것도 가능하다.
세포로는 포유동물 세포가 바람직하고, 인간 세포가 더 바람직하다. 세포는 주화 세포나 포유동물 조직으로부터 단리된 초대 배양 세포일 수도 있지만, 간엽계 세포나 인공 다능성 줄기(iPS) 세포 등의 다능성 줄기세포(stem cell)일 수도 있다. 예를 들어, 디스트로핀 유전자를 표적으로 하는 경우, DMD 환자 유래의 골격근 세포, 간엽계 세포 또는 iPS 세포를 수립하고, 거기에 당해 발명의 엑손 스키핑을 유도하는 가이드 RNA와 CRISPR-Cas, 또는 가이드 RNA 페어와 Cas 닉카아제를 함께 도입함으로써 디스트로핀 유전자의 엑손 스키핑을 유도하여 디스트로핀 단백질을 회복시킬 수 있다. 그리고 이러한 복구 세포 또는 그 유도 산물을 환자에 이식함으로써, 위축된 근세포의 보충을 할 수 있다.
또한, DMD 환자의 근조직에 당해 발명의 엑손 스키핑을 유도하는 가이드 RNA와 CRISPR-Cas, 또는 가이드 RNA 페어와 Cas 닉카아제를 함께 도입함으로써, 디스트로핀 유전자의 엑손 스키핑을 유도하여 환자의 체내에서 디스트로핀 단백질을 회복시키는 양태도 들 수 있다.
<엑손 스키핑의 평가 방법>
본 발명은 또한, CRISPR-Cas 및 가이드 RNA 등을 사용한 엑손 스키핑을 평가하기 위한 방법으로서, 코딩 영역 내에 제1 인트론, 해석 대상 엑손 및 제2 인트론을 포함하는 서열이 삽입된 마커 유전자를 사용하여, (해석 대상 엑손 근방에 설정된 가이드 RNA와 CRISPR-Cas의 작용에 의해) 해석 대상 엑손이 스키핑되었을 때 마커 유전자가 기능하도록 설계되어 있는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
한편, 엑손 스키핑은 안티센스 핵산 등에서도 유도 가능하며, 평가 대상은 게놈 편집에 한정되지 않는다.
마커 유전자로는 루시퍼라아제나 LacZ 등의 효소를 포함하는 유전자, GFP, Ds-Red 및 mCherry 등의 형광 단백질을 코딩하는 유전자, Puro 내성 유전자, Neo 내성 유전자, Hyg 내성 유전자, Bls 유전자, hisD 유전자, Gpt 유전자 및 Ble 유전자 등의 약제 내성 유전자가 예시되지만, 이들에 한정되지 않는다. 한편, 마커 유전자 cDNA 내에 스플라이싱 도너나 억셉터 서열과 동일 또는 유사 서열이 존재할 때에는, 당해 부위를 개변하여 마커 내에서의 스플라이싱이 일어나지 않도록 해두는 것이 삽입 서열에서의 스플라이싱을 특이적으로 평가하는 목적에서 바람직하다.
제1 인트론(도너 부위 및 억셉터 부위를 포함), 해석 대상 엑손 및 제2 인트론(도너 부위 및 억셉터 부위를 포함)을 포함하는 서열의 마커 유전자로의 삽입 위치는, 엑손이 삽입됨으로써 마커 유전자가 기능하지 않게 되는(마커 단백질의 활성 또는 마커 유전자에 기초한 표현형이 소실되는) 위치이다. 엑손 삽입에 의해 마커 유전자가 기능하지 않게 되는 것은 사전에 조사할 수 있다. 또한, 삽입 부위의 서열로서 CAG＠G 또는 AAG＠G라는 서열의 "＠" 부분을 선택하면, 제1 인트론의 스플라이싱 도너 서열 및 제2 인트론의 스플라이싱 억셉터 서열이 인간 스플라이싱 억셉터(MAG|GURAG) 및 인간 스플라이싱 억셉터 서열(NCAG|G)의 컨센서스(최빈도) 서열이 된다는 점에서 더 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 스플라이싱이 정상적으로 일어나는 경우, 마커 유전자는 엑손이 삽입된 융합 단백질(원래의 활성은 잃음)로서 발현되거나 또는 엑손의 삽입에 의해 정상적으로 발현하지 않으므로, 마커 유전자는 기능하지 않는다.
한편, 게놈 편집에 의해 엑손이 스키핑되면, 마커 유전자는 정상형으로서 발현하고, 마커 단백질의 활성 또는 마커 유전자에 기초한 표현형이 관찰된다.
따라서, 마커 유전자의 기능 유무에 따라 엑손이 스키핑되었는지를 해석할 수 있다. 이에 의해, 엑손 스키핑의 간편한 평가를 실시할 수 있고, 엑손 스키핑을 촉진하는 화합물의 스크리닝 등에도 유용하다.
개변 마커 유전자가 도입된 세포에서, 삽입 서열에 따른 가이드 RNA를 CRISPR-Cas와 함께 도입하고, 당해 세포의 마커 유전자에 대응하는 표현형을 해석함으로써, 엑손 스키핑이 일어나 있는지를 조사할 수 있다. 한편, 개변 마커 유전자의 염색체상으로의 도입은 트랜스포존 벡터 또는 바이러스 벡터를 이용하여 실시하는 것이 바람직하다. 트랜스포존 벡터로는 piggyBac 벡터, piggyBat 벡터, 슬리핑 뷰티 벡터, TolII 벡터, LINE 벡터 등을 들 수 있다. 바이러스 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
엑손의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 전술한 바와 같은 디스트로핀 유전자의 엑손 45 등을 들 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 양태에 한정되지 않는다.
<방법>
<유일 염기 서열(Unique k-mer) 데이터베이스> 도 2 관련
Perl 스크립트를 이용하여, 10 ∼ 16-mer(k-mer)의 전체 조합 염기 서열을 생성하였다. Bowtie 프로그램(Langmead et al., 2009)을 이용하여 생성한 k-mer 서열을 미스매칭을 허용하지 않고 인간 게놈 hg19로 매핑하였다. 그 다음, 인간 게놈 hg19에 1회만 매핑된 k-mer 서열만을 추출하여, Unique k-mer 데이터베이스를 구축하였다(Li HL et al., Stem Cell Reports, 2015). R 언어에서 작동하는 ngs.plot.r 프로그램(Shen L et al., BMC Genomics, 2014)을 이용하여, 인간 전체 엑손의 전후 200 bp에 있어서의 Unique k-mer의 분포를 조사하고, 플롯을 실시하였다.
< SpCas9 cDNA 발현 벡터의 구축>
DNA 합성(GenScript사)에 의해, C 말단에 SV40 large T 항원 유래 핵 이행 시그널 펩티드(PKKKRKV)(서열번호 217)를 가지며 인간 코돈 빈도에 최적화된 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 cDNA를 삽입한 pUC57-SphcCas9 벡터를 제작하였다. 이것을 SalI-XbaI 제한 효소로 절단하고, pENTR2B(A10463, Thermo Fisher)의 SalI-XbaI 부위에 라이게이션함으로써, pENTR-SphcCas9 벡터를 구축하였다. 그 다음, pENTR-SphcCas9 벡터의 SphcCas9 cDNA 부분을 Gateway LR 클로나아제(clonase) 반응에 의해 pHL-EF1α-GW-iC-A 벡터, pHL-EF1α-GW-iP-A 벡터 또는 pHL-EF1α-GW-A 벡터에 삽입하고, pHL-EF1α-SphcCas9-iC-A 벡터(SpCas9-IRES-mCheery-polyA), pHL-EF1α-SphcCas9-iP-A 벡터(SpCas9-IRES-PuroR-polyA)(Addgene, 60599) 및 pHL-EF1α-SphcCas9-A 벡터(SpCas9-polyA)를 구축하였다. EF1α 프로모터는 바이러스 유래 프로모터(CMV 프로모터 등)보다 다능성 줄기 세포에서의 발현량이 높게 얻어지기 때문에 적합하다.
또한, SpCas9의 D10A 변이체(닉카아제)를 제작하기 위해, GaC 코돈(Asp, D)을 GcC 코돈(Ala, A)으로 변환한 DNA 서열 SphcCas9-D10A(NcoI-SbfI)를 gBlock(IDT)으로 합성하였다.
SphcCas9-D10A(NcoI-SbfI) 서열을 NcoI-SbfI 제한 효소로 절단하고, pENTR-SphcCas9 벡터의 NcoI-SbfI 부위에 내부 융합(In-Fusion) 반응을 이용하여 삽입함으로써 pENTR-SphcCas9-D10A 벡터를 구축하였다. 그 다음, pENTR-SphcCas9-D10A 벡터의 SphcCas9-D10A cDNA 부분을 Gateway LR 클로나아제 반응에 의해 pHL-EF1α-GW-iC-A 벡터 또는 pHL-EF1α-GW-iP-A 벡터에 삽입하고, pHL-EF1α-SphcCas9-D10A-iC-A 벡터(SpCas9-IRES-mCheery-polyA) 및 pHL-EF1α-SphcCas9-D10A-iP-A 벡터(SpCas9-IRES-PuroR-polyA)를 구축하였다.
SphcCas9-D10A(NcoI-SbfI)
5'-ATTCAGTCGACCATGGATAAGAAATACAGCATTGGACTGGcCATTGGGACAAACTCCGTGGGATGGGCCGTGATTACAGACGAATACAAAGTGCCTTCAAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTGATTGGAGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACAGCTGAAGCAACTCGGCTGAAAAGAACTGCTCGGAGAAGGTATACCCGCCGAAAGAATAGGATCTGCTACCTGCAGGAGATTTTCAGCAA-3'(서열번호 14)
< SpCas9 gRNA 발현 벡터의 구축>
SpCas9의 gRNA를 발현 벡터에 클로닝하기 위해, 하기의 임의의 Sp-sgRNA-XXX-fwd 프라이머(서열번호 17 ∼ 42중 어느 하나)와 Sp-sgRNA-Universal-rev 프라이머를 10 pmol씩 혼합하고, KOD Plus Neo DNA 중합 효소(Toyobo)를 이용하여 서멀 사이클링 반응을 수행한다(98℃: 2분 열 변성을 수행한 후, {94℃: 10초, 55℃: 10초, 68℃: 10초} × 35 사이클, 그 후에 4℃로 보온). PCR 산물을 2% 아가로오스 겔로 전기영동하고, 135 bp 부근 사이즈의 DNA 밴드를 잘라내어 정제한다. 이 정제 PCR 산물을 BamHI-EcoRI으로 절단한 pHL-H1-ccdB-mEF1a-RiH 벡터(Addgene 60601)에 내부 융합(In-Fusion) 반응(Takara-Clontech)을 이용하여 삽입하고, 임의의 gRNA를 발현하는 pHL-H1-[SpCas9-gRNA]-mEF1a-RiH 벡터를 구축한다.
PCR 산물 서열(135 bp)
GAGACCACTTGGATCCRNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCAAACCCGGGC
(서열번호 15)
Sp-sgRNA-XXX-fwd
GAGACCACTTGGATCCRNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 16)
Sp-sgRNA-DMD1-fwd
GAGACCACTTGGATCCGggtatcttacaggaactccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 17)
Sp-sgRNA-DMD2-fwd
GAGACCACTTGGATCCGtcttacaggaactccaggaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 18)
Sp-sgRNA-DMD3-fwd
GAGACCACTTGGATCCGaggaactccaggatggcatGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 19)
Sp-sgRNA-DMD4-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCCAGGATGGCATTGGGCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 20)
Sp-sgRNA-DMD5-fwd
GAGACCACTTGGATCCGTTCCTGTAAGATACCAAAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 21)
Sp-sgRNA-DMD6-fwd
GAGACCACTTGGATCCGcaTTTTTGTTTTGCCTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 22)
Sp-sgRNA-DMD7-fwd
GAGACCACTTGGATCCGTGCCTTTTTGGTATCTTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 23)
Sp-sgRNA-DMD8-fwd
GAGACCACTTGGATCCAGGAACTCCAGGATGGCATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 24)
Sp-sgRNA-DMD9-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCCGCTGCCCAATGCCATCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 25)
Sp-sgRNA-DMD10-fwd
GAGACCACTTGGATCCGTCAGAACATTGAATGCAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 26)
Sp-sgRNA-DMD11-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCAGAACATTGAATGCAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 27)
Sp-sgRNA-DMD12-fwd
GAGACCACTTGGATCCGAGAACATTGAATGCAACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 28)
Sp-sgRNA-DMD13-fwd
GAGACCACTTGGATCCAATACTGGCATCTGTTTTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 29)
Sp-sgRNA-DMD14-fwd
GAGACCACTTGGATCCAACAGATGCCAGTATTCTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 30)
Sp-sgRNA-DMD15-fwd
GAGACCACTTGGATCCGAATTTTTCCTGTAGAATACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 31)
Sp-sgRNA-DMD16-fwd
GAGACCACTTGGATCCGAGTATTCTACAGGAAAAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 32)
Sp-sgRNA-DMD17-fwd
GAGACCACTTGGATCCAGTATTCTACAGGAAAAATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 33)
Sp-sgRNA-DMD18-fwd
GAGACCACTTGGATCCAATTGGGAAGCCTGAATCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 34)
Sp-sgRNA-DMD19-fwd
GAGACCACTTGGATCCGGGGAAGCCTGAATCTGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 35)
Sp-sgRNA-DMD20-fwd
GAGACCACTTGGATCCAAGCCTGAATCTGCGGTGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 36)
Sp-sgRNA-DMD21-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCTGAATCTGCGGTGGCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 37)
Sp-sgRNA-DMD22-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCTCCTGCCACCGCAGATTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 38)
Sp-sgRNA-DMD23-fwd
GAGACCACTTGGATCCAGCTGTCAGACAGAAAAAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 39)
Sp-sgRNA-DMD24-fwd
GAGACCACTTGGATCCGTCAGACAGAAAAAAGAGGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 40)
Sp-sgRNA-DMD25-fwd
GAGACCACTTGGATCCGCAGACAGAAAAAAGAGGTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 41)
Sp-sgRNA-DMD26-fwd
GAGACCACTTGGATCCGGTAGGGCGACAGATCTAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA(서열번호 42)
Sp-sgRNA-Universal-rev
GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAA(서열번호 43)
< SaCas9 cDNA 발현 벡터의 구축> 도 13 관련
DNA 합성(GenScript)에 의해, N 말단에 SV40 large T NLS를, C 말단에 뉴클레오플라스민(Nucleoplasmin) NLS와 3 × HA 태그를 가지는, 인간 코돈 빈도에 최적화된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래 Cas9 cDNA를 Gateway attL1 부위와 attL2 부위의 사이에 삽입한 pUC-Kan-SahcCas9 벡터를 제작하였다. 그 다음, pUC-Kan-SahcCas9 벡터의 SaCas9 cDNA 부분을 Gateway LR 클로나아제 반응에 의해 pHL-EF1α-GW-A 또는 pHL-EF1α-GW-iP-A 벡터에 삽입하고, HL-EF1α-SaCas9-A 및 HL-EF1α-SaCas9-iC-A 벡터를 각각 구축하였다.
< SaCas9 gRNA 발현 벡터의 구축>
SaCas9의 gRNA를 발현 벡터에 클로닝하기 위해, 하기의 임의의 sgRNA-DMD-SA-X-fwd 프라이머(서열번호 44 ∼ 45중 어느 하나)와 SA1-gRNA-Universal-Rev 프라이머를 10 pmol씩 혼합하고, KOD Plus Neo DNA 중합 효소(Toyobo)를 이용하여 서멀 사이클링 반응을 수행한다(98℃: 2분 열 변성을 수행한 후, {94℃: 10초, 55℃: 10초, 68℃: 10초} × 35 사이클, 그 후에 4℃로 보온). PCR 산물을 2% 아가로오스 겔로 전기영동하고, 135 bp 부근 사이즈의 DNA 밴드를 잘라내어 정제한다. 이 정제 PCR 산물을 BamHI-EcoRI으로 절단한 pHL-H1-ccdB-mEF1a-RiH 벡터(Addgene 60601)에 내부 융합(In-Fusion) 반응(Takara-Clontech)을 이용하여 삽입하고, 임의의 gRNA를 발현하는 pHL-H1-[SaCas9-gRNA]-mEF1a-RiH 벡터를 구축한다.
sgRNA-DMD-SA-5
5'-GAGACCACTTGGATCCATTACAGGAACTCCAGGATGGCAGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAAT-3' (서열번호 44)
sgRNA-DMD-SA-8
5'-GAGACCACTTGGATCCATTGCCGCTGCCCAATGCCATCCGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAAT-3' (서열번호 45)
SA1-gRNA-Universal-Rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAACACGGCATTTTGCCTTGTTTTAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAA-3' (서열번호 46)
< AsCpf1 cDNA 발현 벡터의 구축> 도 13 관련
DNA 합성(GenScript)에 의해, Gateway attL1 부위와 attL2 부위의 사이에, C 말단에 뉴클레오플라스민(Nucleoplasmin) NLS(KRPAATKKAGQAKKKK)(서열번호 218)와 3 × HA 태그(YPYDVPDYA YPYDVPDYA YPYDVPDYA)(서열번호 219) 서열을 가지고, 인간 코돈 빈도에 최적화된 아시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) BV3L6 유래 Cpf1 cDNA를 삽입한 pUC57-hcAsCpf1 벡터를 제작하였다. 그 다음, pENTR-hcAsCpf1 벡터의 hcAsCpf1 cDNA 부분을 Gateway LR 클로나아제 반응에 의해 pHL-EF1α-GW-A 또는 pHL-EF1α-GW-iP-A 벡터에 삽입하고, HL-EF1α-hcAsCpf1-A 및 HL-EF1α-hcAsCpf1-iC-A 벡터를 각각 구축하였다.
< AsCpf1 gRNA 발현 벡터의 구축>
AsCpf1의 gRNA를 발현 벡터에 클로닝하기 위해, 하기의 임의의 AsCpf1-gRNA-XXX-rev 프라이머(서열번호 50 ∼ 53중 어느 하나)와 AsCpf1-gRNA-Universal-GGG-fwd 프라이머(또는 AsCpf1-gRNA-Universal-G-fwd 프라이머)를 10 pmol씩 혼합하고, KOD Plus Neo DNA 중합 효소(Toyobo)를 이용하여 서멀 사이클링 반응을 수행한다(98℃: 2분 열 변성을 수행한 후, {94℃: 10초, 55℃: 10초, 68℃: 10초} × 35 사이클, 그 후에 4℃로 보온). PCR 산물을 2% 아가로오스 겔로 전기영동하고, 80 bp 부근 사이즈의 DNA 밴드를 잘라내어 정제한다. 이 정제 PCR 산물을 BamHI-EcoRI으로 절단한 pHL-H1-ccdB-mEF1a-RiH 벡터에 내부 융합(In-Fusion) 반응(Takara-Clontech)을 이용하여 삽입하고, AsCpf1 gRNA를 발현하는 pHL-H1-[AsCpf1-gRNA]-mEF1a-RiH 벡터를 구축한다.
AsCpf1-gRNA-Universal-GGG-fwd(TSS에서 GGG로)
5'-GAGACCACTTGGATCCGGGTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3'(서열번호 47)
AsCpf1-gRNA-Universal-G-fwd(TSS에서 G로)
5'-GAGACCACTTGGATCCGTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3'(서열번호 48)
AsCpf1-gRNA-XXX-rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCTACAAGAGTAGAAATTA-3'(서열번호 49)
AsCpf1-gRNA-DMD1-rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAAGGAGTTCCTGTAAGATACCAATCTACAAGAGTAGAAATTA-3'(서열번호 50)
AsCpf1-gRNA-DMD2-rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAATGGAGTTCCTGTAAGATACCATCTACAAGAGTAGAAATTA-3'(서열번호 51)
AsCpf1-gRNA-DMD3-rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAACTGGAGTTCCTGTAAGATACATCTACAAGAGTAGAAATTA-3'(서열번호 52)
AsCpf1-gRNA-DMD4-rev
5'-GCCCGGGTTTGAATTCAAAAAAAAGGATGGCATTGGGCAGCGGATCTACAAGAGTAGAAATTA-3'(서열번호 53)
< SSA 벡터의 구축> 도 10 관련
Sp-gRNA-DMD1 ∼ 5의 표적 서열을 가지는 SSA-DMD-all-ss 올리고 DNA와 SSA-DMD-all-as 올리고 DNA를 어닐링시키고, pGL4-SSA 벡터(Addgene 42962, Ochiai et al., Genes Cells, 2010)의 파이어플라이 Luc2 cDNA 내에 존재하는 BsaI 부위에 라이게이션함으로써, pGL4-SSA-DMD-all 벡터를 구축하였다. pGL4-SSA-DMD-all 벡터에서 파이어플라이 Luc2 cDNA는 분할되어 있어 Luc 활성을 나타내지 않지만, 가이드 RNA에 의해 pGL4-SSA 벡터의 표적 DNA 부분의 절단이 유도되면, SSA(Single strand annealing) 경로에 따라 DNA 절단이 복구되어 파이어플라이 Luc2 cDNA가 회복된다.
SSA-DMD-all-ss
5'-gtcgTGCCTTTTTGGTATCTTACAGGAACTCCAGGATGGCATTGGGCAGCGGCAAACTGTTGTCAGAACATggt-3' (서열번호 54)
SSA-DMD-all-as
5'-cggtaccATGTTCTGACAACAGTTTGCCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGATACCAAAAAGGCA-3' (서열번호 55)
< SSA 어세이에 의한 표적 DNA 절단 활성> 도 10, 도 13(c)
pGL4-SSA-DMD-All 벡터 100 ng, 레닐라(Renilla) Luc를 발현하는 phRL-TK 벡터를 20 ng, CRISPR-Cas를 발현하는 pHL-EF1a 벡터를 200 ng, sgRNA를 발현하는 pHL-H1-sgRNA-mEF1a-RiH 벡터를 200 ng 혼합하고, Opti-MEM 25 μl로 희석한다. 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 0.7 μl를 Opti-MEM 25 μl로 희석하고, 3 - 5분간 실온에서 항온처리한 후, 상기 DNA 용액과 혼합하고, 실온에서 20분간 추가로 항온처리한다. 여기에, 트립신-EDTA 처리에 의해 현탁한 293T 세포의 세포 수를 계측하고, 60,000 세포/100 μl가 되도록 배지로 희석하여, 상기 DNA-리포펙타민 복합체를 포함하는 96-웰 플레이트의 하나의 웰에 100 μl씩 파종한다. 48시간, 5% CO2, 37℃에서 세포를 배양한 후, 실온으로 되돌린 96-웰 플레이트에 듀얼-글로 시약(Dual-Glo Reagent)을 첨가하고, 실온에서 30분간 항온처리함으로써 세포를 융해하여 루시퍼라아제 반응을 일으킨다. 상청액 100 μl를 백색 96-웰 플레이트에 옮기고, 센트로(Centro) LB960(Berthold Technologies사)을 이용하여 파이어플라이(Firefly)와 레닐라(Renilla)의 발광 강도를 측정한다. 파이어플라이 Luc는 CRISPR에 의해 DNA 절단이 유도된 경우에만 발광하므로, 파이어플라이의 발광값을 레닐라의 발광값으로 정규화한 값을 DNA 절단 효율로서 측정한다.
<세포 배양>
293T 세포는 DMEM 배지에 5 ∼ 10% FBS를 첨가하여 배양하였다.
DMD-iPS 세포(클론 ID: CiRA00111)는 마이토마이신 C 처리에 의해 세포 증식을 멈춘 SNL 피더 세포 상에서 넉아웃(Knockout) SR 배지{200 mL의 DMEM/F12 배지(Thermo Fisher, 10565018)에 50 mL의 넉아웃 SR(Thermo Fisher, 10828028), 2.5 mL의 L-글루타민(Thermo Fisher, 25030081), 2.5 mL의 비필수 아미노산 믹스(Thermo Fisher, 11140050), 0.5 mL 2-머캅토 에탄올(Thermo Fisher, 21985023), 1.25 mL의 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Fisher, 15140122) 및 8 ng/ml 인간 염기성(basic) FGF(Wako, 6404541)를 첨가}를 이용하여 배양하였다. 혹은, StemFit AK03N(Ajinomoto) 배지를 이용하여, 피더 세포를 사용하지 않고 iMatrix-511(Nippi, 892014) 상에서 배양할 수도 있다.
< DMD - iPS 세포에 있어서의 게놈 DNA 절단 패턴의 해석> 도 11
엑손 44를 결손시킨 DMD 환자로부터 수립한 iPS 세포에 대하여, 형질감염을 실시하기 1시간 이상 전부터 배지 중에 10 μM의 Y-27632(Sigma)를 첨가하였다. 일렉트로포레이션을 실시하기 직전에, iPS 세포를 CTK 용액으로 박리하고, 0.25% 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 떨어뜨린 후 세포를 계수하고, 1 조건당 1 × 106개의 세포를 준비하였다. 여기에, NEPA21 일렉트로포레이터(Nepagene사)를 이용하여, 천공 펄스 전압 125V, 펄스 폭 5 밀리초, 펄스 수 2회의 조건으로, pHL-EF1α-SphcCas9-iP-A 벡터(Addgene, 60599) 5 μg과 pHL-H1-[Sp-gRNA]-mEF1α-RiH 벡터 5 μg을 전기 천공하였다. 또한, 더블 닉킹(double nicking)을 실시하는 경우에는, pHL-EF1α-SphcCas9-D10A-iP-A 벡터 5 μg과 pHL-H1-[Sp-gRNA]-mEF1α-RiH 벡터를 5 μg씩 2종류로 합계 10 μg을 일렉트로포레이션하였다. 일렉트로포레이션한 iPS 세포는 수일 이상 배양한 후, 게놈 DNA를 추출하고, DMD-MiSeq-Rd1-fwd-X 및 DMD-MiSeq-Rd2-rev-X 프라이머를 이용하여 1차 PCR 증폭을 수행한 후, Multiplex P5 fwd 프라이머 및 Multiplex P7 rev 프라이머를 이용하여 2차 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 산물은 겔을 절단하여 정제한 후, Qubit 2.0 플루오로미터(Fluorometer)(Thermo Fisher) 및 일루미나(Illumina)용 KAPA 라이브러리 정량 키트(Library Quantification Kit)(KAPA Biosystems)를 이용하여 정량하고, 샘플마다 등량이 되도록 혼합한 후, DNA 농도를 2 nM로 조제하고, 0.2N NaOH로 5분간 처리함으로써 DNA를 알칼리 변성시켰다. 변성된 DNA 샘플을 12 pM으로 희석하고, 4 pM의 PhiX spike-in DNA를 첨가한 후, 2 × 150 bp용 MiSeq 시약 키트 v2(Illumina)를 이용하여 MiSeq 시퀀싱 반응을 수행하였다. 시퀀싱의 결과 생성된 FASTQ 시퀀싱 파일로부터 퀄리티가 낮은 리드를 FASTX-Toolkit 중의 fastq_quality_filter 프로그램을 이용하여 제거하였다. 스파이크-인으로서 이용한 PhiX 서열을 제거한 후, fastx_barcode_splitter 프로그램을 이용하여 바코드 서열에 따라 샘플마다 분할을 수행하였다. 각 샘플의 서열은 BWA 프로그램을 이용하여 매핑하고, 서열의 삽입 결손 패턴은 CIGAR 코드의 MD 태크 정보로부터 추출하였다.
DMD-MiSeq-Rd1-fwd-X(N에는 샘플에 따른 바코드 서열이 들어감. 하기 참조)
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 56)
DMD-MiSeq-Rd2-rev-X(N에는 샘플에 따른 바코드 서열이 들어감. 하기 참조)
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 57)
Multiplex P5 fwd
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTC-3'(서열번호 58)
Multiplex P7 rev
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC-3'(서열번호 59)
상기 X의 바코드를 포함하는 구체적 서열
DMD-MiSeq-Rd1-fwd1-AGTC
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTagtcAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 60)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd2-GTCA
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgtcaAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 61)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd3-TCAG
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtcagAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 62)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd4-CAGT
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTcagtAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 63)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd5-ATGC
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTatgcAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 64)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd6-TGCA
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtgcaAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 65)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd7-GCAT
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgcatAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 66)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd8-CATG
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTcatgAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 67)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd9-AACG
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTaacgAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 68)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd10-ACGA
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTacgaAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 69)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd11-CGAA
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTcgaaAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 70)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd12-GAAC
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTgaacAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 71)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd13-TACC
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTtaccAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 72)
DMD-MiSeq-Rd1-fwd14-ACCT
5'-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTacctAATAAAAAGACATGGGGCTTCA-3'(서열번호 73)
DMD-MiSeq-Rd2-rev1-AGTC
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTagtcCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 74)
DMD-MiSeq-Rd2-rev2-GTCA
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTgtcaCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 75)
DMD-MiSeq-Rd2-rev3-TCAG
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTtcagCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 76)
DMD-MiSeq-Rd2-rev4-CAGT
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTcagtCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 77)
DMD-MiSeq-Rd2-rev5-ATGC
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTatgcCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 78)
DMD-MiSeq-Rd2-rev6-TGCA
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTtgcaCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 79)
DMD-MiSeq-Rd2-rev7-GCAT
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTgcatCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 80)
DMD-MiSeq-Rd2-rev8-CATG
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTcatgCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 81)
DMD-MiSeq-Rd2-rev9-AACG
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTaacgCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 82)
DMD-MiSeq-Rd2-rev10-ACGA
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTacgaCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 83)
DMD-MiSeq-Rd2-rev11-CGAA
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTcgaaCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 84)
DMD-MiSeq-Rd2-rev12-GAAC
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTgaacCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 85)
DMD-MiSeq-Rd2-rev13-TACC
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTtaccCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 86)
DMD-MiSeq-Rd2-rev14-ACCT
5'-CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTacctCTGGCATCTGTTTTTGAGGA-3'(서열번호 87)
<Luc 리포터를 이용한 엑손 스키핑 검출 벡터의 구축>
pGL4-CMV-luc2(프로메가)로부터 Luc2 cDNA를 PCR 증폭하고, pENTR-D-TOPO 벡터(Thermo Fisher Scientific Inc.)에 클로닝함으로써, pENTR-D-TOPO-Luc2 벡터를 구축하였다. pENTR-D-TOPO-Luc2 벡터를 NarI와 AgeI으로 절단하여, gBlock(IDT사)으로 합성한 하기의 인트론 서열과 DMD Exon 45 서열을 삽입하고, pENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45[+] 벡터를 구축하였다. 그 다음, gBlock 서열 중 hEx45의 양측에 2군데 존재하는 SalI 부위에서 절단하여, 벡터측을 다시 라이게이션함으로써 pENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45[-] 벡터를 구축하였다.
NarI-AgeI-DMD-Ex45-gBlock(도 6의 서열)
GCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGGTAAGTCTTTGATTTGTCGACCGTATCCACGATCACTAAGAAACCCAAATACTTTGTTCATGTTTAAATTTTACAACATTTCATAGACTATTAAACATGGAACATCCTTGTGGGGACAAGAAATCGAATTTGCTCTTGAAAAGGTTTCCAACTAATTGATTTGTAGGACATTATAACATCCTCTAGCTGACAAGCTTACAAAAATAAAAACTGGAGCTAACCGAGAGGGTGCTTTTTTCCCTGACACATAAAAGGTGTCTTTCTGTCTTGTATCCTTTGGATATGGGCATGTCAGTTTCATAGGGAAATTTTCACATGGAGCTTTTGTATTTCTTTCTTTGCCAGTACAACTGCATGTGGTAGCACACTGTTTAATCTTTTCTCAAATAAAAAGACATGGGGCTTCATTTTTGTTTTGCCTTTTTGGTATCTTACAGGAACTCCAGGATGGCATTGGGCAGCGGCAAACTGTTGTCAGAACATTGAATGCAACTGGGGAAGAAATAATTCAGCAATCCTCAAAAACAGATGCCAGTATTCTACAGGAAAAATTGGGAAGCCTGAATCTGCGGTGGCAGGAGGTCTGCAAACAGCTGTCAGACAGAAAAAAGAGGTAGGGCGACAGATCTAATAGGAATGAAAACATTTTAGCAGACTTTTTAAGCTTTCTTTAGAAGAATATTTCATGAGAGATTATAAGCAGGGTGAAAGGCGTCGACGTTTGCATTAACAAATAGTTTGAGAACTATGTTGGAAAAAAAAATAACAATTTTATTCTTCTTTCTCCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGG(서열번호 88)
트리코프루시아 니(Trichoplusia ni) 유래의 piggyBac 5'TR(말단 반복(Terminal repeat))과 3'TR 서열은 3 분할한 gBlocks 서열(gBlock11 ∼ 13-PV-3'TR-5'TR)로서 합성(IDT)하고, 그 3개 단편을 PCR로 연결한 후, pUC19 벡터의 AatII-PvuII 부위에 내부 융합(In-Fusion) 반응으로 삽입하여, pPV-합성 벡터를 구축하였다.
gBlock11-PV-3'TR-5'TR
GAAAAGTGCCACCTGACGTCATCTGTTAACATTATACGCGTTTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTAAACATTCTCTCTTTTACAAAAATAAACTTATTTTGTACTTTAAAAACAGTCATGTTGTATTATAAAATAAGTAATTAGCTTAACCTATACATAATAGAAACAAATTATACTTA(서열번호 89)
gBlock12-PV-3'TR-5'TR
CCTATACATAATAGAAACAAATTATACTTATTAGTCAGTCAGAAACAACTTTGGCACATATCAATATTATGCTCTGCTAGCGATATCTGTAAAACGACGGCCAGTTCTAGACTTAAGCTTCATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTCGAGTTAATTAACCAACAAGCTCGTCATCGCTTTGCAGAAGAGCAGAGAGGATATGCTCATCGTCTAAAGAACTACCCATTTTATTATATATTAGTCACGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATA(서열번호 90)
gBlock13-PV-3'TR-5'TR
ATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATACGTATAATACATATGATTCAGCTGCATTAATGAATC(서열번호 91)
PB-EF1a-GW-iP 벡터(Masui H et al., PLOS ONE, 2014 Aug 15; 9(8):e104957.)를 NheI-PacI으로 절단하고, pPV-합성된 것의 NheI-PacI 부위에 라이게이션하여 pPV-EF1a-GW-iP 벡터를 구축하였다. 그 다음, pCXLE-EGFP 벡터(Okita K et al., Nat Methods, 2011 May; 8(5):409-12.)로부터 pHL-PacI-rHBB-pA-IF-fw 프라이머(5'- GTATACCTCGAGTTAAATTCACTCCTCAGGTGC-3'(서열번호 92)) 및 pPV-PacI-rHBB-pA-IF-rev 프라이머(5'-CGAGCTTGTTGGTTAATTAAGTCGAGGGATCTCCATAA-3'(서열번호93))를 이용하여 토끼 유래 헤모글로빈 폴리 A 시그널(hemoglobin poly A signal)을 증폭시키고, pPV-EF1a-GW-iP 벡터의 PacI 부위에 내부 융합(In-Fusion) 반응을 이용하여 삽입함으로써 pPV-EF1a-GW-iP-A 벡터를 구축하였다. pPV-EF1a-GW-iP-A 벡터와 pENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45[+]를 이용한 Gateway LR 반응에 의해, pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45[+]-iP-A 벡터를 구축하였다. 또한, pPV-EF1a-GW-iP-A 벡터와 pENTR-D-TOPO-Luc2-DMD-intron-Ex45[-]를 이용한 Gateway LR 반응에 의해, pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45-[-]-iP-A 벡터를 구축하였다.
< Luc2 V323I ( G867A ) 변이의 도입>
piggyBac 벡터 pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45[-] 벡터를 주형으로 하여, 프라이머 Luc2-NcoI-IF-Fwd와 Luc2-V323I-fwd의 조합 및 Luc2-V323I-rev와 Luc2-SalI-IF-Rev의 조합으로 각각 별도로 PCR을 실시하였다. 증폭된 2개의 단편을 혼합하여 양단의 프라이머(Luc2-NcoI-IF-Fwd와 Luc2-SalI-IF-Rev)로 변이가 들어간 단편을 작성하고, pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45[-] 벡터의 NcoI와 SalI 절단 부위에 내부 융합(In-Fusion) 반응으로 삽입함으로써, pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[-] 벡터를 구축하였다.
Luc2-NcoI-IF-Fwd: GCCCCCTTCACCATGGAAG(서열번호 94)
Luc2-V323I-fwd: CAGCAAGGAGATAGGTGAGG(서열번호 95)
Luc2-V323I-rev: CCTCACCTATCTCCTTGCTG(서열번호 96)
Luc2-SalI-IF-Rev: TAATGCAAACGTCGACAAATCAAAGAC(서열번호 97)
<1 kb, 2 kb, 4 kb, 0.7 kb의 hDMD 엑손 45 및 주변 인트론 서열의 삽입>
pPV-EF1a-Luc2-hDMD-Ex45[+]-iP-A를 주형으로 하여, DMD-Ex45-SalI-IF-F와 DMD-Ex45-SalI-IF-R 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고, pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[-] 벡터의 SalI 절단 부위에 내부 융합(In-Fusion) 반응으로 삽입함으로써, pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](0.7 kb) 벡터를 구축하였다.
DMD-Ex45-SalI-IF-F: tctttgatttGTCGACcgtatc(서열번호 98)
DMD-Ex45-SalI-IF-R: taatgcaaacGTCGACgcc(서열번호 99)
1383D2 세포로부터 조제한 인간 게놈 DNA를 주형으로 하여, 하기 프라이머(HDMD-SR-XkbFrag-fwd & rev)를 이용함으로써 엑손 45와 그 주변 인트론을 증폭하고, pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[-] 벡터의 SalI 절단 부위에 내부 융합(In-Fusion) 반응으로 삽입함으로써, pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](1 kb), pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](2 kb), pPV-EF1a-Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](4 kb) 벡터를 구축하였다.
HDMD-SR-1kbFrag-fwd tctttgatttGTCGAGGGATATCTTGATGGGATGCTCC(서열번호 100)
HDMD-SR-1kbFrag-rev taatgcaaacGTCGAAAACCACTAACTAGCCACAAGT(서열번호 101)
HDMD-SR-2kbFrag-fwd tctttgatttGTCGAATTGTGAGGCACCGTGTCAC(서열번호 102)
HDMD-SR-2kbFrag-rev taatgcaaacGTCGACTCTTTGGCTCAAGTTCCCCT(서열번호 103)
HDMD-SR-4kbFrag-fwd tctttgatttGTCGAGCTGCAGCATTAGTTTATAGCA(서열번호 104)
HDMD-SR-4kbFrag-rev taatgcaaacGTCGAAACTTTGGCAAGGGGTGTGT(서열번호 105)
구축한 엑손 스키핑 리포터 cDNA 부분의 서열을 하기에 나타낸다.
Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[-]
ATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGTGGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTGGCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAAAGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATCATCATCATGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGGGCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATCTGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCATCGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGaTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGgtaagtctttgatttGTCGACgtttgcattaacaaatagtttgagaactatgttggaaaaaaaaataacaattttattcttctttctccagGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAA(서열번호 106)
Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+]
ATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGTGGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTGGCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAAAGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATCATCATCATGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGGGCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATCTGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCATCGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGaTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGgtaagtctttgatttGTCGACcgtatccacgatcactaagaaacccaaatactttgttcatgtttaaattttacaacatttcatagactattaaacatggaacatccttgtggggacaagaaatcgaatttgctcttgaaaaggtttccaactaattgatttgtaggacattataacatcctctagctgacaagcttacaaaaataaaaactggagctaaccgagagggtgcttttttccctgacacataaaaggtgtctttctgtcttgtatcctttggatatgggcatgtcagtttcatagggaaattttcacatggagcttttgtatttctttctttgccagtacaactgcatgtggtagcacactgtttaatcttttctcaaataaaaagacatggggcTTCATTtttgttttgcctttttggtatcttacagGAACTCCAGGATGGCATTGGGCAGCGGCAAACTGTTGTCAGAACATTGAATGCAACTGGGGAAGAAATAATTCAGCAATCCTCAAAAACAGATGCCAGTATTCTACAGGAAAAATTGGGAAGCCTGAATCTGCGGTGGCAGGAGGTCTGCAAACAGCTGTCAGACAGAAAAAAGAGgtagggcgacagatctaataggaatgaaaacattttagcagactttttaagctttctttagaagaatatttcatgagagattataagcagggtgaaaggcGTCGACgtttgcattaacaaatagtttgagaactatgttggaaaaaaaaataacaattttattcttctttctccagGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAA(서열번호 107)
Luc2(V323I)-hDMD-Ex45[+](1 kb)
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110)
<Luc 리포터를 이용한 엑손 스키핑 리포터 어세이 >
pPV-EF1a-Luc2(V323I)hDMD-Ex45[+] 벡터 40 ng, 레닐라(Renilla) Luc를 발현하는 phRL-TK 벡터를 20 ng, CRISPR-Cas를 발현하는 pHL-EF1a 벡터(Addgene)를 280 ng, 가이드 RNA를 발현하는 pHL-H1-sgRNA-mEF1a-RiH 벡터를 280 ng 혼합하고, Opti-MEM 25 μl로 희석한다. 리포펙타민 2000 0.7 μl를 Opti-MEM 25 μl로 희석하고, 3 - 5분간 실온에서 항온처리한 후, 상기 DNA 용액과 혼합하고, 실온에서 20분간 추가로 항온처리한다. 여기에, 트립신-EDTA 처리에 의해 현탁한 293T 세포의 세포 수를 계측하고, 60,000 세포/100 μl가 되도록 배지로 희석하여, 상기 DNA-리포펙타민 복합체를 포함하는 96-웰 플레이트의 하나의 웰에 100 μl씩 파종한다. 48시간, 5% CO2, 37℃에서 세포를 배양한 후, 실온으로 되돌린 96-웰 플레이트에 듀얼-글로 시약을 첨가하고, 실온에서 30분간 항온처리함으로써 세포를 융해하여 루시퍼라아제 반응을 일으킨다. 상청액 100 μl를 백색 96-웰 플레이트에 옮기고, Centro LB960(Berthold Technologies사)을 이용하여 파이어플라이(Firefly)와 레닐라(Renilla)의 발광 강도를 측정한다. 파이어플라이 Luc은 엑손 스키핑이 유도된 경우에만 발광하므로, 파이어플라이의 발광값을 레닐라의 발광값으로 정규화한 값을 엑손 스키핑 효율로서 측정한다.
<결과>
듀시엔형 근이영양증(Duchenne Muscular Dystrophy)에 대한 치료법을 개발하기 위해, 디스트로핀 유전자에서의 엑손 스키핑 유도를 검토하였다. 도 1에 개요를 나타낸다.
(1) 정상인의 정상 디스트로핀 유전자의 골격근 동형 단백질(Dp427m)에서는 79개의 엑손이 스플라이싱에 의해 연결되며, 3685개의 아미노산으로 이루어진 디스트로핀 단백질을 코딩하고 있다.
(2) 한편, 엑손 44를 결손시킨 DMD 환자의 경우, 엑손 44의 사이즈가 3의 배수가 아니어서 단백질 리딩 프레임(reading frame)이 어긋나게 되어 직후의 엑손 45에 정지 코돈이 발생하기 때문에, 디스트로핀 단백질이 도중에 끊어진 형태가 된다.
(3) 여기서, 엑손 45의 스플라이싱 억셉터 서열 부분을 게놈 편집으로 파괴하면, 엑손 45가 스플라이싱 시에 인식되지 않고, 직후의 엑손 46이 대신에 엑손 43과 연결되어 결과적으로 디스트로핀 단백질의 리딩 프레임을 회복시킬 수 있다.
스플라이싱 억셉터는 분기 서열, 폴리피리미딘(C/U) 서열 및 "AG" 억셉터 서열로 구성된다. 이 중에서 특히, "AG" 억셉터 서열이 스플라이싱 반응시에 가장 고도로 보존되어 있으며, 이 2개의 염기를 제거할 수 있다면, 엑손 스키핑을 유도할 수 있다.
CRISPR 시스템의 gRNA를 설계함에 있어서, 게놈 상에서의 표적 서열 이외를 인식 절단해버리는 오프 표적 위험을 감안하여, 유일 염기 서열(Unique k-mer)법[Li HL et al., Stem Cell Reports, 2015]을 이용하여 스플라이싱 억셉터 부근의 서열 특이성을 관찰한바, 일반적으로 스플라이싱 억셉터 부근의 특이성은 엑손 영역이나 그 밖의 인트론 영역과 비교해도 특히 낮다는 것이 명백해졌다(도 2).
디스트로핀 유전자의 엑손 스키핑 효율을 간편하면서도 고감도로 검출하기 위해, 파이어플라이 루시퍼라아제(Luciferase, Luc) 유전자를 이용한 리포터 벡터를 구축하였다. Luc cDNA를 2개로 분할하고, 여기에 합성 인트론 서열을 삽입한 벡터(Luc + Int)와 인간 디스트로핀 엑손 45의 전후의 서열을 더 삽입한 벡터(Luc + hEx45)를 제작하였다(도 3). 이 벡터를 293T 세포에 도입하고, mRNA를 회수하여 역전사한 후에 PCR 증폭한바, 전반 Luc cDNA에 슈도-스플라이싱 도너 서열이 포함되어 여분의 스플라이싱이 일어나 있는 것이 판명되었다(도 4(a)). 이 슈도-스플라이싱 도너 서열을 파괴하기 위해, 인간 디스트로핀 유전자에 포함되는 전체 엑손 서열로부터 스플라이싱 도너 서열과 억셉터 서열을 Ensemble Biomart 데이터베이스(http: //www.ensembl.org)로부터 추출하고, 공통되는 염기를 Weblogo 소프트(http: //weblogo.threeplusone.com/)로 해석한바, 이미 알려진 스플라이싱 도너 및 억셉터 서열과 잘 일치되어 있는 것을 확인하였다(도 4(b)). 따라서, 슈도-스플라이싱 도너 서열 "AGGTA"의 한가운데 "G"를 "G 이외의 서열"로 변환하면, 스플라이싱 도너로서 기능하지 않게 되는 것이 예상되었다. 다만, 이 염기는 Val 아미노산을 코딩하는 코돈 "GTA"의 최초의 염기이며, 이 염기를 개변하면 필연적으로 아미노산 서열이 변하게 된다. "A"로 변경하면 "ATA"이고 Ile 아미노산(도 4(c)), "C" 또는 "T"로 변경하면 "CTA" 또는 "CTA"로 Leu 아미노산을 코딩하는 코돈이 된다. 발명자들은 이 아미노산 변환이 Luc 활성에 영향을 미치지 않는지를 확인하기 위해, 루시퍼라아제 단백질의 입체 구조(PDB 코드: 1BA3)를 PDB 데이터베이스로부터 다운로드하고, Chimera 소프트웨어를 이용함으로써 G967A(V323I) 변이 아미노산 부위가 활성 잔기[Branchini BR et al., J Biol Chem. 1997 Aug 1; 272(31):19359-64.]로부터 떨어져 있어 직접 상호 작용이 없다는 것을 확인하였다(도 5).
다음으로, 실제로 예상되는 스플라이싱 패턴이 일어났는지 여부를 확인하기 위해, 도6(a)에 나타낸 각종 벡터를 293T 세포에 도입하여 mRNA를 추출하고, 역전사 후에 PCR을 실시하고 cDNA의 사이즈를 겔 전기영동으로 확인한바, G967A(V323I) 변이를 도입하지 않은 벡터(Lane 2,4)에서는 스플라이싱이 일어나지 않은 전사 산물에 상응하는 밴드가 짙게 나와 있는 것에 반해, G967A(V323I) 변이를 도입한 벡터(Lane 3,5)에서는 거의 모든 전사 산물에서 목적 사이즈의 스플라이싱이 일어나 있는 것을 확인할 수 있었다(도 6(b)). 또한, 각 벡터의 루시퍼라아제 활성을 조사한 바, 인트론 서열의 삽입 및 G967A(V323I) 변이 도입에서는 거의 변화가 나타나지 않았다. 한편, 인간 엑손 45 서열을 삽입한 경우, G967A(V323I) 변이가 없는 벡터에서는 슈도-스플라이싱 도너를 통한 루시퍼라아제 활성이 약간 나타나며 백그라운드 레벨이 높아져 있지만, G967A(V323I) 변이를 도입함으로써 인간 엑손 45를 포함한 Luc cDNA 서열이 대다수가 된 덕분으로, 매우 낮은 루시퍼라아제 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 6(c)).
다음으로, 엑손 45의 전후의 인트론 서열의 길이에 따른 스플라이싱 패턴 해석을 실시하였다. 최초로 구축한 0.7 kb의 서열 이외에, 1.0 kb, 2.0 kb, 4.0 kb 각각의 길이를 삽입한 벡터를 구축하였다(도 7). 이들 벡터의 스플라이싱 패턴을 해석한바(도8(a)), 모든 벡터에서 거의 예상한 대로의 스플라이싱 패턴(468 bp의 밴드)이 대다수였지만, 인트론 사이즈가 커짐에 따라 인트론 잔존 밴드(1166 bp)가 소실되어 가는 경향이 나타났다. 한편, 루시퍼라아제 활성을 확인한바, 인트론 사이즈가 커지면 세포로의 도입 활성이 낮아지고, 결과적으로 백그라운드 활성이 약간 높아지는 모습이 관찰되었다. 어떠한 벡터를 이용하여도, CRISPR-sgRNA-DMD1을 이용하여 엑손 스키핑을 유도했을 경우에는 루시퍼라아제 활성의 상승이 나타났으며(도 8(b)), 간편하면서도 고감도로 측정할 수 있는 리포터 벡터로서 유용하다는 것이 판명되었다.
오프 표적의 위험을 최소한으로 하면서도 디스트로핀의 엑손 스키핑을 유도하기 위해, 엑손 45의 스플라이싱 억셉터 부위에 복수의 gRNA를 설계하고(도 9), 일반적인 야생형 SpCas9와 gRNA에 의한 절단 패턴 및 D10A 닉카아제형 SpCas9와 gRNA를 2개 조합했을 경우에 대해 SSA(Single Strand Annealing) 어세이를 실시하고, 목적 부위의 DNA 절단 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 5종류의 gRNA 모두 다 높은 DNA 절단 활성을 나타내고, 또한 더블 닉킹법에서는 2개의 gRNA가 겹쳐있는 경우에는 절단 활성이 낮으며, 어느 정도의 거리가 떨어졌을 때 처음으로 효율적인 DNA 절단을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
다음으로, 각 조건에 있어서 DNA 절단 패턴을 조사하기 위해, 표적 부위를 PCR로 증폭하고, 차세대 시퀀서 MiSeq에 의한 서열 해석을 실시하였다. 그 결과, 더블 닉킹법으로 2개의 gRNA를 적절한 거리로 설계한 경우, 각 gRNA의 닉킹 유도 부위의 사이가 제거되는 DNA 절단 패턴이 많이 관찰되며, 여기에 스플라이싱 억셉터 서열, 특히 "AG" 억셉터 서열을 포함함으로써 효율적으로 엑손 스키핑을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다(도 11).
엑손 스키핑을 효율적으로 유도할 수 있는 gRNA 서열이나 CRISPR의 종류(SpCas9, AsCpf1 등), 게놈 편집 방법(더블 닉킹)을 검증하기 위해, 상기에서 개발된 엑손 스키핑 리포터를 이용하여 검증하였다.
도 12에서는 SpCas9의 gRNA 서열을 5종류 시험하고, 도 13에서는 SpCas9, SaCas9, AsCpf1 및 SpCas9 더블-닉킹법을 비교 해석하였다. 또한, 도 14에서는 인간 엑손 45에 설계 가능한 모든 서열(NGG PAM 서열을 포함하는 sgRNA 서열)로 엑손 스키핑의 효율을 측정하기 위해, 26종류의 gRNA를 설계하였다(도 14(a)).
26종류의 gRNA에 대해 인간 293T 세포에 도입하고, 표적 DNA의 절단 활성을 T7E1 어세이로 측정하였다(도 14(b)). 그 결과, sgRNA-DMD6은 DNA 절단 활성이 낮았지만, 그 이외의 gRNA는 기본적으로 10% 이상의 절단 활성을 나타냈다. 그리하여, 26종류의 gRNA에 대해 Luc2(G967A) +hEx45(0.7 kb) 리포터를 이용하여 293T 세포로 엑손 스키핑 효율을 측정하였다. 그 결과, 엑손 스키핑의 효율은 gRNA의 설계 부위 및 스플라이싱 억셉터 또는 스플라이싱 도너로부터의 거리가 중요하다는 것이 판명되었다(도 14(c)).
또한, 단독으로 엑손 스키핑 활성을 나타낸 7종류의 gRNA(DMD#1,2,4,8,9,20,23)를 선택하고, 이 중에서 임의의 2개의 sgRNA의 조합에 대해 Luc2(G967A) +hEx45(0.7 kb) 리포터를 이용하여 293T 세포로 엑손 스키핑 효율을 측정하였다. 그 결과, 2종류의 gRNA를 함께 도입함으로써, 엑손 스키핑 효율을 더욱 효율화할 수 있다는 것이 판명되었다(도 15).
참고 논문
1. Li HL, Fujimoto N, Sasakawa N, Shirai S, Ohkame T, Sakuma T, et al. Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9. Stem Cell Reports. 2015 Jan 13; 4(1):143-54.
2. Mali P, Aach J, Stranges PB, Esvelt KM, Moosburner M, Kosuri S, et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 2013 Sep; 31(9):833-8.
3. Ran FA, Hsu PD, Lin C-Y, Gootenberg JS, Konermann S, Trevino AE, et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 2013 Sep 12; 154(6):1380-9.
4. Ousterout DG, Kabadi AM, Thakore PI, Majoros WH, Reddy TE, Gersbach CA. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 2015; 6:6244.
5. Iyombe-Engembe J-P, Ouellet DL, Barbeau X, Rousseau J, Chapdelaine P, Lague P, et al. Efficient Restoration of the Dystrophin Gene Reading Frame and Protein Structure in DMD Myoblasts Using the CinDel Method. Mol Ther Nucleic Acids. 2016; 5:e283.
6. Long C, Amoasii L, Mireault AA, McAnally JR, Li H, Sanchez- Ortiz E, et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 2016 Jan 22; 351(6271):400-3.
7. Nelson CE, Hakim CH, Ousterout DG, Thakore PI, Moreb EA, Castellanos Rivera RM, et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 2016 Jan 22; 351(6271):403-7.
8. Tabebordbar M, Zhu K, Cheng JKW, Chew WL, Widrick JJ, Yan WX, et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 2016 Jan 22; 351(6271):407-11.
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AsCpf1-gRNA-DMD2-rev <400> 51 gcccgggttt gaattcaaaa aaatggagtt cctgtaagat accatctaca agagtagaaa 60 tta 63 <210> 52 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AsCpf1-gRNA-DMD3-rev <400> 52 gcccgggttt gaattcaaaa aaactggagt tcctgtaaga tacatctaca agagtagaaa 60 tta 63 <210> 53 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AsCpf1-gRNA-DMD4-rev <400> 53 gcccgggttt gaattcaaaa aaaaggatgg cattgggcag cggatctaca agagtagaaa 60 tta 63 <210> 54 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SSA-DMD-all-ss <400> 54 gtcgtgcctt tttggtatct tacaggaact ccaggatggc attgggcagc ggcaaactgt 60 tgtcagaaca tggt 74 <210> 55 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SSA-DMD-all-as <400> 55 cggtaccatg ttctgacaac agtttgccgc tgcccaatgc catcctggag ttcctgtaag 60 ataccaaaaa ggca 74 <210> 56 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DMD-MiSeq-Rd1-fwd-X <220> <221> misc_feature <222> (31)..(34) <223> n is a, c, g, or t <400> 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Sequence <220> <223> primer DMD-MiSeq-Rd1-fwd3-TCAG <400> 62 ctctttccct acacgacgct cttccgatct tcagaataaa aagacatggg gcttca 56 <210> 63 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DMD-MiSeq-Rd1-fwd4-CAGT <400> 63 ctctttccct acacgacgct cttccgatct cagtaataaa aagacatggg gcttca 56 <210> 64 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DMD-MiSeq-Rd1-fwd5-ATGC <400> 64 ctctttccct acacgacgct cttccgatct atgcaataaa aagacatggg gcttca 56 <210> 65 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DMD-MiSeq-Rd1-fwd6-TGCA <400> 65 ctctttccct acacgacgct cttccgatct tgcaaataaa aagacatggg gcttca 56 <210> 66 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DMD-MiSeq-Rd1-fwd7-GCAT <400> 66 ctctttccct acacgacgct cttccgatct gcataataaa aagacatggg gcttca 56 <210> 67 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DMD-MiSeq-Rd1-fwd8-CATG <400> 67 ctctttccct acacgacgct cttccgatct catgaataaa aagacatggg gcttca 56 <210> 68 <211> 56 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taataaattc aacaaacaat ttatttatgt ttatttattt attaaaaaaa 240 aacaaaaact caaaatttct tctataaagt aacaaaactt ttaaacattc tctcttttac 300 aaaaataaac ttattttgta ctttaaaaac agtcatgttg tattataaaa taagtaatta 360 gcttaaccta tacataatag aaacaaatta tactta 396 <210> 90 <211> 308 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gBlock12-PV-3'TR-5'TR <400> 90 cctatacata atagaaacaa attatactta ttagtcagtc agaaacaact ttggcacata 60 tcaatattat gctctgctag cgatatctgt aaaacgacgg ccagttctag acttaagctt 120 catggtcata gctgtttcct gctcgagtta attaaccaac aagctcgtca tcgctttgca 180 gaagagcaga gaggatatgc tcatcgtcta aagaactacc cattttatta tatattagtc 240 acgatatcta taacaagaaa atatatatat aataagttat cacgtaagta gaacatgaaa 300 taacaata 308 <210> 91 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gBlock13-PV-3'TR-5'TR <400> 91 atcacgtaag tagaacatga aataacaata taattatcgt atgagttaaa tcttaaaagt 60 cacgtaaaag ataatcatgc gtcattttga ctcacgcggt cgttatagtt caaaatcagt 120 gacacttacc gcattgacaa gcacgcctca cgggagctcc aagcggcgac tgagatgtcc 180 taaatgcaca gcgacggatt cgcgctattt agaaagagag agcaatattt caagaatgca 240 tgcgtcaatt ttacgcagac tatctttcta gggttaatac gtataataca tatgattcag 300 ctgcattaat gaatc 315 <210> 92 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pHL-PacI-rHBB-pA-IF-fw <400> 92 gtatacctcg agttaaattc actcctcagg tgc 33 <210> 93 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pPV-PacI-rHBB-pA-IF-rev <400> 93 cgagcttgtt ggttaattaa gtcgagggat ctccataa 38 <210> 94 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Luc2-NcoI-IF-Fwd <400> 94 gcccccttca ccatggaag 19 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Luc2-V323I-fwd <400> 95 cagcaaggag ataggtgagg 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Luc2-V323I-rev <400> 96 cctcacctat ctccttgctg 20 <210> 97 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Luc2-SalI-IF-Rev <400> 97 taatgcaaac gtcgacaaat caaagac 27 <210> 98 <211> 22 <212> DNA 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accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720 gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780 cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840 aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900 atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960 aaggagatag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggtaagtc tttgatttgt 1020 cgacgtttgc attaacaaat agtttgagaa ctatgttgga aaaaaaaata acaattttat 1080 tcttctttct ccaggcatcc gccagggcta cggcctgaca gaaacaacca gcgccattct 1140 gatcaccccc gaaggggacg acaagcctgg cgcagtaggc aaggtggtgc ccttcttcga 1200 ggctaaggtg gtggacttgg acaccggtaa gacactgggt gtgaaccagc gcggcgagct 1260 gtgcgtccgt ggccccatga tcatgagcgg ctacgttaac aaccccgagg ctacaaacgc 1320 tctcatcgac aaggacggct ggctgcacag cggcgacatc gcctactggg acgaggacga 1380 gcacttcttc atcgtggacc ggctgaagag cctgatcaaa tacaagggct accaggtagc 1440 cccagccgaa ctggagagca tcctgctgca acaccccaac atcttcgacg ccggggtcgc 1500 cggcctgccc gacgacgatg 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 199 aattgggaag cctgaatctg cgg 23 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 200 aattgggaag cctgaatctg 20 <210> 201 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 201 tgggaagcct gaatctgcgg tgg 23 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 202 agggaagcct gaatctgcgg 20 <210> 203 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 203 aagcctgaat ctgcggtggc agg 23 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 204 aagcctgaat ctgcggtggc 20 <210> 205 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 205 cctgaatctg cggtggcagg agg 23 <210> 206 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 206 gctgaatctg cggtggcagg 20 <210> 207 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 207 cctcctgcca ccgcagattc agg 23 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 208 gctcctgcca ccgcagattc 20 <210> 209 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 209 agctgtcaga cagaaaaaag agg 23 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 210 agctgtcaga cagaaaaaag 20 <210> 211 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 211 gtcagacaga aaaaagaggt agg 23 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 212 gtcagacaga aaaaagaggt 20 <210> 213 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 213 tcagacagaa aaaagaggta ggg 23 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 214 acagacagaa aaaagaggta 20 <210> 215 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 215 ggtagggcga cagatctaat agg 23 <210> 216 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 216 ggtagggcga cagatctaat 20 <210> 217 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS <400> 217 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 218 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS <400> 218 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 219 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA <400> 219 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp 1 5 10 15 Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 20 25

Claims (16)

  1. CRISPR-Cas 및 가이드 RNA를 사용하는 게놈 상의 목적 유전자의 표적 엑손을 스키핑하기 위한 방법으로서,
    상기 가이드 RNA는 CRISPR-Cas에 의한 절단 부위가 표적 엑손 직전의 스플라이싱 도너 부위 또는 표적 엑손 직후의 스플라이싱 억셉터 부위로부터 80 염기 이내에 배치되는 것과 같은 스페이서 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가이드 RNA는 2종류 이상 사용되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    CRISPR-Cas는 RuvC 도메인의 뉴클레아제 활성 잔기가 치환된 닉카아제(nickase) 변형된 Cas이며, 목적 유전자의 센스 가닥에 대한 가이드 RNA 및 안티센스 가닥에 대한 가이드 RNA를 사용하고, 양쪽 가이드 RNA는 목적 유전자의 센스 가닥에서의 절단 부위 및 목적 유전자의 안티센스 가닥에서의 절단 부위가 모두 표적 엑손 직전의 스플라이싱 도너 부위 또는 표적 엑손 직후의 스플라이싱 억셉터 부위로부터 80 염기 이내에 배치되는 것과 같은 스페이서 서열을 가지는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    CRISPR-Cas는 Cas9인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    Cas9는 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) 유래 혹은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래인 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    CRISPR-Cas는 Cpf1인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    Cpf1은 아시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) BV3L6 유래 혹은 라크노스피래세애(Lachnospiraceae) 유래인 것인 방법
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    목적 유전자는 인간 디스트로핀 유전자인 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    표적 엑손은 엑손 45인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 가이드 RNA는 서열번호 17 ∼ 42중 어느 하나의 염기 서열의 염기번호 17 ∼ 36의 염기 서열, 서열번호 44 ∼ 45중 어느 하나의 염기 서열의 염기번호 17 ∼ 39의 염기 서열 또는 서열번호 50 ∼ 53중 어느 하나의 염기 서열의 염기번호 24 ∼ 43의 염기 서열로 이루어진 스페이서 서열을 가지는 것인 방법.
  11. CRISPR-Cas 및 가이드 RNA를 포함하는, 게놈 상의 목적 유전자의 표적 엑손을 스키핑하기 위한 시약으로서,
    상기 가이드 RNA는 CRISPR-Cas에 의한 절단 부위가 표적 엑손 직전의 스플라이싱 도너 부위 또는 표적 엑손 직후의 스플라이싱 억셉터 부위로부터 80 염기 이내에 배치되는 것과 같은 스페이서 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 시약.
  12. 엑손 스키핑을 평가하기 위한 방법으로서,
    코딩 영역 내에 제1 인트론, 해석 대상 엑손 및 제2 인트론을 포함하는 서열이 삽입된 마커 유전자를 사용하여, 해석 대상 엑손이 스키핑되었을 때 마커 유전자가 기능하도록 설계되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    엑손 스키핑은 CRISPR-Cas 및 가이드 RNA를 사용한 엑손 스키핑인 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    트랜스포존 벡터를 이용함으로써 마커 유전자를 해석 대상 세포의 게놈에 삽입하는 것인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    마커 유전자는 루시퍼라아제 유전자인 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    해석 대상 엑손은 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 45인 것인 방법.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210040460A1 (en) 2012-04-27 2021-02-11 Duke University Genetic correction of mutated genes
EP3952884A4 (en) * 2019-04-12 2023-03-22 Duke University CRISPR/CAS-BASED BASE EDIT COMPOSITION TO RESTORE DYSTROPHIN FUNCTION
US11970710B2 (en) 2015-10-13 2024-04-30 Duke University Genome engineering with Type I CRISPR systems in eukaryotic cells

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2017070633A2 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CA3039928A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 President And Fellows Of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
WO2020122104A1 (ja) 2018-12-11 2020-06-18 国立大学法人京都大学 ゲノムｄｎａに欠失を誘導する方法
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2021076883A2 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Brown University Muscle regeneration and growth
WO2021168216A1 (en) * 2020-02-21 2021-08-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Crispr/cas9 correction of mutations in dystrophin exons 43, 45 and 52
EP4114932A4 (en) 2020-03-06 2024-03-13 Metagenomi Inc CLASS II, TYPE V CRISPR SYSTEMS
WO2021178934A1 (en) * 2020-03-06 2021-09-10 Metagenomi Ip Technologies, Llc Class ii, type v crispr systems
CN116096877A (zh) 2020-03-31 2023-05-09 宏基因组学公司 Ii类ii型crispr系统
KR20230019843A (ko) 2020-05-08 2023-02-09 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 두 가닥의 동시 편집을 위한 방법 및 조성물
EP4165177A1 (en) * 2020-05-08 2023-04-19 Metagenomi, Inc. Enzymes with ruvc domains
AU2021267379A1 (en) * 2020-05-08 2022-12-08 Metagenomi, Inc. Enzymes with RuvC domains
WO2022056324A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-17 Metagenomi Ip Technologies, Llc Base editing enzymes
WO2022159742A1 (en) * 2021-01-22 2022-07-28 Metagenomi, Inc Novel engineered and chimeric nucleases
WO2023039377A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 Metagenomi, Inc. Class ii, type v crispr systems
WO2024014470A1 (ja) * 2022-07-13 2024-01-18 国立大学法人大阪大学 腫瘍の予防および／または治療剤

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2926297B1 (fr) 2008-01-10 2013-03-08 Centre Nat Rech Scient Molecules chimiques inhibitrices du mecanisme d'epissage pour traiter des maladies resultant d'anomalies d'epissage.
KR20190079702A (ko) * 2008-10-24 2019-07-05 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 Dmd를 위한 다중 엑손 스키핑 조성물
NZ626359A (en) * 2009-11-12 2016-02-26 Univ Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
KR102512979B1 (ko) 2013-06-04 2023-03-22 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
AU2014274840B2 (en) * 2013-06-05 2020-03-12 Duke University RNA-guided gene editing and gene regulation
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
US10329587B2 (en) * 2013-07-10 2019-06-25 President And Fellows Of Harvard College Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing
AU2015204784B2 (en) * 2014-01-08 2021-01-28 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided gene drives
ES2821149T3 (es) * 2014-03-12 2021-04-23 Prec Biosciences Inc Eliminación del exón del gen de la distrofina mediante nucleasas modificadas genéticamente
CA2959130A1 (en) * 2014-08-11 2016-02-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Prevention of muscular dystrophy by crispr/cas9-mediated gene editing
US9970030B2 (en) * 2014-08-27 2018-05-15 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing CAS9-mediated engineering efficiency
CA2981508A1 (en) * 2015-04-01 2016-10-06 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating duchenne muscular dystrophy and becker muscular dystrophy
US20190151476A1 (en) * 2016-07-19 2019-05-23 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
AU2017364106A1 (en) * 2016-11-28 2019-06-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Prevention of muscular dystrophy by CRISPR/Cpfl-mediated gene editing
AU2017370730A1 (en) * 2016-12-08 2019-06-27 The Board Of Regents Of The University Of Texas System DMD reporter models containing humanized duschene muscular dystrophy mutations
JOP20190166A1 (ar) * 2017-01-05 2019-07-02 Univ Texas استراتيجية مثلى من أجل تعديلات تخطي إكسون باستخدام crispr/cas9 مع متواليات توجيه ثلاثي
US10687520B2 (en) * 2017-03-07 2020-06-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Generation and correction of a humanized mouse model with a deletion of dystrophin exon 44
WO2019017321A1 (ja) * 2017-07-18 2019-01-24 国立大学法人京都大学 遺伝子変異導入方法
EP3668983A1 (en) * 2017-08-18 2020-06-24 The Board of Regents of The University of Texas System Exon deletion correction of duchenne muscular dystrophy mutations in the dystrophin actin binding domain 1 using crispr genome editing

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
비특허문헌 1: Pichavant et al., Mol Ther. 2011 May; 19(5):830-40.
비특허문헌 2: Ousterout DG et al., Nat Commun. 2015 Feb 18; 6:6244
비특허문헌 3: Iyombe-Engembe JP Mol Ther Nucleic Acids. 2016 Jan 26; 5: e283.
비특허문헌 4: Xu L et al., Mol Ther. 2016 Mar; 24(3):564-9.
비특허문헌 5: Long C et al., Science, 2016 Jan 22; 351(6271):400-3.
비특허문헌 6: Nelson CE et al., Science. 2016 Jan 22; 351(6271):403-7
비특허문헌 7: Tabebordbar M et al., Science. 2016 Jan 22; 351(6271):407-11
비특허문헌 8: Li HL et al., Stem Cell Reports. 2015 Jan 13; 4(1):143-54.

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210040460A1 (en) 2012-04-27 2021-02-11 Duke University Genetic correction of mutated genes
US11976307B2 (en) 2012-04-27 2024-05-07 Duke University Genetic correction of mutated genes
US11970710B2 (en) 2015-10-13 2024-04-30 Duke University Genome engineering with Type I CRISPR systems in eukaryotic cells
EP3952884A4 (en) * 2019-04-12 2023-03-22 Duke University CRISPR/CAS-BASED BASE EDIT COMPOSITION TO RESTORE DYSTROPHIN FUNCTION

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Publication number Publication date
EP3617311A1 (en) 2020-03-04
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