CN114591881B

CN114591881B - 一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN114591881B
Application number: CN202210265171.1A
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 陈坚; 卢健行; 吕雪芹; 堵国成; 卢伟; 李江华; 刘延峰; 刘长峰; 毛馨竹
Original assignee: Jiangnan University; Shandong Runde Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangnan University; Shandong Runde Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-03-17
Filing date: 2022-03-17
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-03-17
Also published as: CN114591881A

Abstract

本发明涉及一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其应用，通过对几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达载体pP43NMK‑D65的启动子及RBS序列进行改造，平衡菌株的生长和产物的生产，提高酶活；再通过过表达细胞壁合成蛋白EzrA，修复几丁二糖脱乙酰酶Dac在表达过程中对细胞壁的损害，实现几丁二糖脱乙酰酶Dac诱导后在发酵液中的持续性表达。与现有技术相比，本发明提供的菌株构建完成后生产性能稳定，几丁二糖脱乙酰酶胞外酶活可达6404.83U/mL，具有很好的应用前景，为酶转化法实现GlcN的工业化生产奠定了基础。

Description

一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

氨基葡萄糖GlcN作为一种功能性产品已广泛应用于医药、保健、农业及化妆品等领域，但是截止到目前工业上生产氨基葡萄糖GlcN的方法主要仍是化学水解法。化学水解法是以虾蟹壳为原料，使用高浓度的酸对原料中的几丁质进行水解，在高温条件下经过浓盐酸的水解作用，使几丁质的糖苷键断裂，酰胺键水解，反应过程中需加入活性炭进行脱色，多次加热溶解与减压蒸馏、结晶与重结晶、粉碎、烘干等步骤。虽然已经开发出利用经过代谢工程改造过的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及真菌进行氨基葡萄糖GlcN的生产，但高浓度的氨基葡萄糖GlcN积累在发酵液中会对细胞生长造成影响，发酵液中可积累的氨基葡萄糖GlcN浓度很难进一步提升，远低于工业化的生产要求。后续发展到利用微生物发酵法生产氨基葡萄糖GlcN的前体物质N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc，再结合酸水解生成氨基葡萄糖GlcN。

目前，微生物发酵法与化学水解法相比过程简单，为可再生的生产方法，条件温和，原料来源丰富不受限制，但是发酵周期长，发酵过程控制严苛，发酵终产物N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc需结合化学水解法生产氨基葡萄糖GlcN，仍然存在生产效率较低与环境污染的问题。因此，亟需开发出能够代替化学水解法的氨基葡萄糖GlcN绿色高效生产方式。

来源于极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii的几丁二糖脱乙酰酶Dac在代谢途径中首先作用的底物为N-乙酰氨基葡萄糖二聚体GlcNAc₂，从N-乙酰氨基葡萄糖二聚体GlcNAc₂还原端水解下乙酰基团，生成非还原性末端部分乙酰化的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖聚合物，在外切氨基葡萄糖苷酶(Exo-β-D-Glucosaminidase)的水解作用下，将N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖聚合物水解成N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc和氨基葡萄糖GlcN，此后，几丁二糖脱乙酰酶Dac再作用于生成的N-乙酰氨基葡萄糖单体GlcNAc，将其水解成氨基葡萄糖GlcN。

目前针对几丁二糖脱乙酰酶Dac的生产研究主要集中在组成型异源表达上。为了大量获得胞外表达的几丁二糖脱乙酰酶Dac，研究人员往往采用高拷贝组成型表达质粒pP43NMK游离表达目的基因。通过信号肽的筛选及优化改善几丁二糖脱乙酰酶Dac的分泌表达水平，从而提高胞外酶活；通过对酶自身分子结构进行半理性改造，将酶与底物结合关键位点上的氨基酸进行突变，提高与底物的结合能力；对酶自身分子结构的半理性改造，不仅用于提高酶与底物的结合能力，还可以通过改变酶表面电荷来改变最适pH，从而提高酶在特定工业生产环境下的催化性能。例如记载于公开号为CN109777761B的中国发明专利中，公开了一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的工程菌及其构建方法，通过融合表达几丁二糖脱乙酰酶Dac与yncM信号肽，并获得了5’端的非翻译区突变体，发酵60h胞外酶活最高为1548.7U/ml；记载于公开号为CN113151135A的中国发明专利中，公开了一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用，通过对几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达载体pP43NMKmut-C4-yncM-Dac的信号肽进行筛选和优化，提高几丁二糖脱乙酰酶Dac的分泌效率，提高酶活，并构建了可以稳定高效表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的食品安全级工程菌株；记载于公开号为CN113355310A的中国发明专利中，公开了最适pH降低的几丁二糖脱乙酰酶组合突变体及应用，通过分子模型和计算机分析预测几丁二糖脱乙酰酶表面电荷及酶活相关位点，再通过定点突变技术构建相关位点的突变体，筛选出不同位点突变时最适pH、酶活以及产物GlcN稳定性均较优的单突变体，构建其组合突变体，得到最适pH下降至6.0，酶活明显提高的组合突变体。但包括上述方法在内的研究均表明，几丁二糖脱乙酰酶Dac难以在发酵液中大量积累，酶活也有待于进一步提高。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，缓解几丁二糖脱乙酰酶Dac对菌株细胞壁的持续性破坏，提高几丁二糖脱乙酰酶Dac高产菌株对产物几丁二糖脱乙酰酶Dac的耐受性，实现毒性蛋白几丁二糖脱乙酰酶Dac在发酵液中持续性积累，且几丁二糖脱乙酰酶Dac的胞外酶活达6404.83U/mL。

本发明的第一个目的是提供一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌融合表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的几丁二糖脱乙酰酶与核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pgrac100启动子。

进一步地，几丁二糖脱乙酰酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，几丁二糖脱乙酰酶和Pgrac₁₀₀启动子以pP43NMK为载体进行融合表达。具体地，本发明以pP43NMK-D65为载体，载体pP43NMK-D65记载于High level productionof diacetylchitobiose deacetylase by refactoring genetic elements andcellular metabolism中，该pP43NMK载体还融合表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的NprB信号肽突变体，并在几丁二糖脱乙酰酶基因的5′非翻译区引入SEQ ID NO.12所示的DNA片段，引入位点位于启动子P43的+1转录起始位点后的8个碱基之后。

进一步地，通过RBS序列调控几丁二糖脱乙酰酶的表达，所述RBS序列为SEQ IDNO.4-6所示序列之一。

进一步地，上述枯草芽孢杆菌过表达细胞壁合成蛋白EzrA，该细胞壁合成蛋白EzrA的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步地，细胞壁合成蛋白EzrA通过组成型启动子Pveg调控表达，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

进一步地，工程菌以枯草芽孢杆菌B.subtilis C6为宿主。

枯草芽孢杆菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构球囊，而肽聚糖是由N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc通过β-1,4糖苷键交替链接形成的高强度支架结构，如图1。肽聚糖的合成和分解速率决定着细菌细胞形态，肽聚糖支架的维护和保养对于细菌自身代谢具有重要作用。本发明中发现，几丁二糖脱乙酰酶Dac作用的底物为N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc，从而破坏了细胞壁的结构，这也是几丁二糖脱乙酰酶Dac难以在发酵液中实现大量积累的主要原因。所以需要精准调控几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达并加强细胞壁的合成能力，进一步改善高产菌株对几丁二糖脱乙酰酶Dac的耐受性。因此，本发明通过将菌株的生长和产物的生产过程解偶联，平衡菌株生长；进一步通过对核糖体结合位点(RBS)进行优化，进一步提高几丁二糖脱乙酰酶的翻译表达水平；最后通过加强细胞壁合成蛋白的表达，实现几丁二糖脱乙酰酶Dac在发酵液中的持续性积累。

本发明的第二个目的是提供一种生产氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：以上述枯草芽孢杆菌发酵上清液为催化剂，催化N-乙酰氨基葡糖转化为氨基葡萄糖。

进一步地，枯草芽孢杆菌发酵上清液通过将上述枯草芽孢杆菌种子液接种至发酵培养基中，在35-40℃培养6-12h进行IPTG诱导，在35-40℃诱导48-72h，再经离心得到。

进一步地，枯草芽孢杆菌种子液通过重组枯草芽孢杆菌在LB液体培养基中于35-45℃培养6-18h得到。

进一步地，将枯草芽孢杆菌种子液按照3-5％接种量接种至发酵培养基中。

进一步地，发酵培养基为TB发酵培养基，组成为：酵母粉20-25g/L，蛋白胨10-15g/L，甘油2-5g/L，KH₂PO₄ 2-5g/L，K₂HPO₄ 10-15g/L，110-120℃灭菌10-30min。

进一步地，10000-15000rpm下离心1-3min得到枯草芽孢杆菌发酵上清液。

进一步地，诱导剂IPTG的浓度为0.5-1.5mM/L。

进一步地，底物N-乙酰氨基葡萄糖的添加量为60-120g/L。

本发明的第三个目的是提供一种平衡枯草芽孢杆菌生长和几丁二糖脱乙酰酶生产的方法，所述的方法包括在枯草芽孢杆菌中融合表达编码几丁二糖脱乙酰酶的基因和Pgrac₁₀₀启动子(如使用诱导型启动子Pgrac100替换几丁二糖脱乙酰酶Dac原始表达载体上的组成型启动子P43)，以及过表达细胞壁合成蛋白EzrA。

进一步地，枯草芽孢杆菌优选为B.subtilis C6。

本发明通过启动子工程，将组成型启动子P43更换为诱导型启动子Pgrac₁₀₀，调控几丁二糖脱乙酰酶的表达，同时，产物几丁二糖脱乙酰酶分解细胞壁，过表达枯草芽孢杆菌细胞壁合成蛋白后，一定程度上修复几丁二糖脱乙酰酶在表达过程中对细胞壁的破坏，从而平衡菌株的生长和产物几丁二糖脱乙酰酶Dac的生产，提供了一种精准调控几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达进而提升胞外酶活的方法。

本发明的第四个目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌对几丁二糖脱乙酰酶Dac耐受性的方法，该方法包括在枯草芽孢杆菌中过表达细胞壁合成蛋白EzrA。

进一步地，本发明一实施例中选择B.subtilis C6，通过组成型启动子Pveg调控细胞壁合成蛋白EzrA的过表达。

本发明的第五个目的是提供上述分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌在生物、制药、食品或化工领域的应用，如用于制备几丁二糖脱乙酰酶Dac、含有几丁二糖脱乙酰酶Dac的产品、氨基葡萄糖或含有氨基葡萄糖的产品等。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明中的几丁二糖脱乙酰酶Dac受到诱导型启动子PgraC₁₀₀的调控时，重组枯草芽孢杆菌菌株诱导后60h胞外酶活达3961.5U/mL；优化几丁二糖脱乙酰酶Dac的翻译表达强度后，诱导后60h胞外酶活达5117.7U/mL；过表达枯草芽孢杆菌中的保守蛋白EzrA后，诱导后60h胞外酶活达6404.83U/mL。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌解决几丁二糖脱乙酰酶Dac表达量不足，酶活较低的问题，提高了几丁二糖脱乙酰酶Dac高产菌株对产物几丁二糖脱乙酰酶Dac的耐受性，缓解了几丁二糖脱乙酰酶Dac对枯草芽孢杆菌细胞生长的影响，实现了几丁二糖脱乙酰酶Dac发酵液中的持续性积累。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为枯草芽孢杆菌细胞壁中肽聚糖支架的结构示意图；

图2为本发明实施例1中构建的诱导表达型重组菌株BC6-A-D65(PxylA组)、BC6-C-D65(Pgrac100组)与组成型表达菌株(Control组)分泌的几丁二糖脱乙酰酶Dac酶活对比；

图3为本发明实施例2中构建的重组菌株BC6-C-D65-R1到BC6-C-D65-R5诱导60h后分泌的几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活及催化底物生成氨基葡萄糖的产量对比；

图4为本发明实施例3中重组质粒PgraC-D65-R1-Pveg-EzrA的构建方法；

图5为本发明实施例3中构建的重组菌株BC6-C-D65-R1-G-EzrA和BC6-C-D65-R1诱导60h后分泌的几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活及催化底物生成氨基葡萄糖的产量对比；

图6本发明实施例3中构建的重组菌株BC6-C-D65-R1-G-EzrA与对照菌株BC6-C-D65-R1和野生型菌株菌株B.subtilis 168的生长情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

涉及的检测方法：

(1)几丁二糖脱乙酰酶酶活力定义

在40℃反应条件下，1h能转化1μmol底物N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc为1μmol产物氨基葡萄糖GlcN所需的酶量，称为一个酶活力单位，即1U＝1μmol/h。

(2)检测试剂；

底物N-乙酰氨基葡萄糖溶液GlcNAc(100g/L)：称取适量N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc溶于PB₁中，并用PB₁定容。

PB₁磷酸钠缓冲液(200mmol/L，pH 8.0)：配制浓度为200mmol/L的NaH₂PO₄溶液和Na₂HPO₄溶液，适量混合，用pH测定仪测定混合液pH值，确定pH 8.0，得到PB₁磷酸钠缓冲液，室温储存。

PB₂碳酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 10.5)：配制浓度为100mmol/L的Na₂CO₃溶液和NaHCO₃溶液，适量混合，用pH测定仪测定混合液pH值，确定pH 10.5，得到PB₂碳酸钠缓冲液，室温储存。

DTT二硫苏糖醇(2mol/L)：称取适量二硫苏糖醇于dd H₂O中，混合均匀，密封低温保存。

10×OPA检测试剂：称取500mg邻苯二甲醛OPA定容于100mL PB₂中，混合均匀，密封低温避光保存。

1×OPA检测试剂：3mL 10×OPA，300μL无水乙醇，15μLDTT，定容于30mL PB₂中，混合均匀，密封低温避光保存。现用现配。

HCl终止剂(0.5mol/L)：取适量盐酸于dd H₂O中。

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG(500mM/L)：取适量IPTG于dd H₂O中。

木糖xylA(500g/L)：取适量木糖xylA于dd H₂O中。

(3)几丁二糖脱乙酰酶酶酶活力检测方法：邻苯二甲醛显色法

待测粗酶液与底物各100μL分装于1.5mL EP管中，40℃预热5min。将预热后的100μL粗酶液加入100μL底物中，40℃震荡反应2min，精确计时，加入HCl终止剂终止反应。离心后取上清于1.5mL EP管中用PB₁稀释20倍，混合均匀后取5μL加入95μL 1×OPA检测试剂中，震荡2min。利用酶标仪检测其在330nm处的吸光值。以失活后的酶液为反应空白对照。

GlcN的标准曲线绘制，精确称取标准品(精确到0.0001g)配制0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L GlcN溶液，取5μL加入95μL OPA检测试剂中，震荡2min。利用酶标仪检测其在330nm处的吸光值。绘制标准曲线。

酶活力计算公式如下所示：

式中：

X：粗酶液酶活力(U/mL)；

A：粗酶液体积0.1(mL)；

B：底物溶液体积0.1(mL)；

M：加入终止剂后样品稀释倍数1.5；

C：反应液GlcN浓度(g/L)；

D：空白液GlcN浓度(g/L)。

T：反应时间2(min)；

60：1h为60min；

215.6：标准样品氨基葡萄糖盐酸盐摩尔质量(g/mol)；

0.1：底物溶液体积数(mL)

x：酶液稀释倍数20。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，121℃灭菌15min。

LB固体培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂粉20，121℃灭菌15min。

TB发酵培养基(g/L)：酵母粉24，蛋白胨12，甘油4，KH₂PO₄ 2.31，K₂HPO₄ 12.54，115℃灭菌20min。

实施例1替换启动子Pgrac100的重组枯草芽孢杆菌的构建

选择枯草芽孢杆菌中常用的2种诱导型启动子，Pgrac100和PxylA，序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2所示，分别以质粒PgraC100-sfGFP、PxylA-sfGFP和pP43NMK-D65为模板(其中，几丁二糖脱乙酰酶Dac的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示)，通过PCR技术扩增启动子Pgrac100、PxylA及对应的阻遏蛋白xylR-PxylA、lacI-Pgrac100序列和Dac表达载体骨架，引物序列如表1所示。经琼脂糖凝胶电泳验证DNA片段大小后进行一步克隆连接，连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli DH5α，经菌落PCR确定阳性转化子，对阳性转化子进行测序，测序结果正确的转化子提质粒后，得到重组质粒Pgrac-D65和PxylA-D65，再将重组质粒转入表达宿主枯草芽孢杆菌B.subtilis C6，得到重组菌株BC6-A-D65和到BC6-C-D65。

表1

使用接种环挑取重组菌株BC6-A-D65和BC6-C-D65的转化子在50mL离心管中进行种子培养。每管含有5mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的液体LB培养基，于37℃弹簧摇床培养12h得到种子液，在500mL锥形瓶中，将种子液以4％(v/v)的接种量转接至96mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的液体TB培养基进行发酵培养。初始诱导条件：诱导时机，发酵后6-12h；诱导时长，48-72h；诱导剂浓度，IPTG 0.5-1.5mM/L，木糖10-20g/L。通过邻苯二甲醛显色法进行粗酶液酶活检测，结果如图2所示。

图2中显示，以启动子PgraC100调控Dac表达的重组菌株BC6-C-D65表现出良好的性能，诱导60h几丁二糖脱乙酰酶Dac活性最高，达3961.5 U/mL。与未替换启动子的菌株相比，酶活提升了7.6％。

实施例2 RBS序列的优化设计及效果验证

借助在线工具“RBS calculator”(https://salislab.net/software/)设计了5条不同翻译强度的RBS序列，并预测和计算mRNA的初始翻译速率，如表2所示。

表2

以PgraC-D65质粒为模板，经PCR扩增构建融合不同RBS序列的几丁二糖脱乙酰酶Dac表达载体骨架，引物序列如表3，经琼脂糖凝胶电泳分析后转化至E.coli DH5α感受态细胞中进行DNA片段的自环化。然后将转化子送至金唯智公司测序验证，测序正确后，经质粒提取得到一系列重组质粒(Pgrac-D65-R1到Pgrac-D65-R5)，再将重组质粒转入枯草芽孢杆菌B.subtilis C6得到一系列重组菌株(BC6-C-D65-R1到BC6-C-D65-R5)。

表3

使用接种环挑取重组菌株BC6-C-D65-R1到BC6-C-D65-R5的转化子在50mL离心管中进行种子培养。每管含有5mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的液体LB培养基，于37℃弹簧摇床培养12h得到种子液，在500mL锥形瓶中，将种子液以4％(v/v)的接种量转接至96mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的液体TB培养基进行发酵培养。诱导条件如实施例1中所述，通过邻苯二甲醛显色法进行粗酶液酶活检测，并检测氨基葡萄糖浓度，结果如图3所示。

图3中为重组菌株BC6-C-D65-R1到BC6-C-D65-R5诱导60h后的几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活情况及产物生产情况，可见重组菌株BC6-C-D65-R1的几丁二糖脱乙酰酶Dac活性最高，达5117.7U/mL。

实施例3过表达枯草芽孢杆菌细胞壁合成蛋白工程菌株的构建及效果验证

使用强组成型启动子Pveg实现EzrA的过表达。分别以Pgrac-D65-R1质粒以及枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组为模板，通过PCR扩增技术扩增Dac表达载体骨架和EzrA蛋白序列，引物序列如表4所示，经琼脂糖凝胶电泳验证DNA片段大小后进行一步克隆连接，连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli DH5α，经菌落PCR确定阳性转化子，对阳性转化子进行测序，测序结果正确的转化子提质粒后，得到重组质粒PgraC-D65-R1-Pveg-EzrA，重组质粒的构建如图4所示。再将重组质粒转入表达宿主枯草芽孢杆菌B.subtilis C6，得到重组菌株BC6-C-D65-R1-G-EzrA。

表4

使用接种环挑取重组菌株BC6-C-D65-R1-G-EzrA的转化子在50mL离心管中进行种子培养。每管含有5mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的液体LB培养基，于37℃弹簧摇床培养12h得到种子液，在500mL锥形瓶中，将种子液以4％(v/v)的接种量转接至96mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的液体TB培养基进行发酵培养。诱导条件如实施例1中所述，通过邻苯二甲醛显色法进行粗酶液酶活检测，并检测氨基葡萄糖浓度，结果如图5所示。

图5中可见，重组菌株BC6-C-D65-R1-G-EzrA诱导60h几丁二糖脱乙酰酶Dac活性达6404.83U/mL，比未过表达EzrA的菌株酶活提高25.15％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

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序列表

<110> 江南大学

<120> 一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1520

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 60

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga 120

gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc 180

cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata 240

acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag 300

cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat 360

cgcagtggga acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc 420

actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg 480

ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat 540

ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga 600

gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt 660

agtgcaggca gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag 720

cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgtt ttacaggctt cgacgccgct 780

tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc 840

cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa 900

cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat 960

cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg 1020

ggaaacggtc tgataagaga caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt 1080

catcaaaatc gtctccctcc gtttgaatat ttgattgatc gtaaccagat gaagcactct 1140

ttccactatc cctacagtgt tatggcttga acaatcacga aacaataatt ggtacgtacg 1200

atctttcagc cgactcaaac atcaaatctt acaaatgtag tctttgaaag tattacatat 1260

gtaagattta aatgcaaccg ttttttcgga aggaaatgat gacctcgttt ccaccggaat 1320

tagcttggta ccagctattg taacataatc ggtacggggg tgaaaaagct aacggaaaag 1380

ggagcggaaa agaatgatgt aagcgtgaaa aattttttaa aaaatctctt gacattggaa 1440

gggagatatg ttattataag aattgcggaa ttgtgagcgg ataacaattc ataattgtga 1500

gcggataaca attcaacccc 1520

<210> 2

<211> 1416

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

ctaacttata ggggtaacac ttaaaaaaga atcaataacg atagaaaccg ctcctaaagc 60

aggtgcattt tttcctaacg aagaaggcaa tagttcacat ttattgtcta aatgagaatg 120

gactctagaa gaaacttcgt ttttaatcgt atttaaaaca atgggatgag attcaattat 180

atgatttctc aagataacag cttctatatc aaatgtatta aggatattgg ttaatccaat 240

tccgatataa aagccaaagt tttgaagtgc atttaacatt tctacatcat ttttatttgc 300

gcgttccaca atctcttttc gagaaatatt cttttcttct ttagagagcg aagccagtaa 360

cgctttttca gaagcatata attcccaaca gcctcgattt ccacagctgc atttgggtcc 420

attaaaatct atcgtcatat gacccatttc cccagaaaaa ccctgaacac ctttatacaa 480

ttcgttgtta ataacaagtc cagttccaat tccgatatta atactgatgt aaacgatgtt 540

ttcatagttt tttgtcatac caaatacttt ttcaccgtat gctcctgcat tagcttcatt 600

ttcaacaaaa accggaacat taaactcact ctcaattaaa aactgcaaat ctttgatatt 660

ccaatttaag ttaggcatga aaataatttg ctgatgacga tctacaaggc ctggaacaca 720

aattcctatt ccgactagac cataagggga ctcaggcata tgggttacaa aaccatgaat 780

aagtgcaaat aaaatctctt ttacttcact agcggaagaa ctagacaagt cagaagtctt 840

ctcgagaata atatttcctt ctaagtcggt tagaattccg ttaagatagt cgactcctat 900

atcaatacca atcgagtagc ctgcattctt attaaaaaca agcattacag gtcttctgcc 960

gcctctagat tgccctgccc caatttcaaa aataaaatct ttttcaagca gtgtatttac 1020

ttgagaggag acagtagact tgtttaatcc tgtaatctca gagagagttg ccctggagac 1080

aggggagttc ttcaaaattt catctaatat taatttttga ttcatttttt ttactaaagc 1140

ttgatctgca atttgaataa taaccactcc tttgtttatc caccgaacta agttggtgtt 1200

ttttgaagct tgaattagat atttaaaagt atcatatcta atattataac taaattttct 1260

aaaaaaaaca ttgaaataaa catttatttt gtatatgatg agataaagtt agtttattgg 1320

ataaacaaac taactcaatt aagatagttg atggataaac ttgttcactt aaatcaaagg 1380

gggaaatgac aaatggtcca aactagtgat atctaa 1416

<210> 3

<211> 272

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 3

Met Val Val Asn Met Phe Glu Asp Ile Asp Thr Phe Glu Glu Ala Phe

1 5 10 15

Asn Lys Leu Leu Arg Glu Val Leu Glu Phe Asp Leu Gln Asn Pro Phe

20 25 30

Lys Asp Ala Lys Lys Val Leu Cys Ile Glu Pro His Pro Asp Asp Cys

35 40 45

Val Ile Gly Met Gly Gly Thr Ile Lys Lys Leu Ser Asp Met Gly Val

50 55 60

Glu Val Ile Tyr Val Cys Met Thr Asp Gly Tyr Met Gly Thr Thr Asp

65 70 75 80

Glu Ser Leu Ser Gly His Glu Leu Ala Ala Ile Arg Arg Lys Glu Glu

85 90 95

Glu Glu Ser Ala Arg Leu Leu Gly Val Lys Lys Ile Tyr Trp Leu Asn

100 105 110

Tyr Arg Asp Thr Glu Leu Pro Tyr Ser Arg Glu Val Arg Lys Asp Leu

115 120 125

Thr Lys Ile Leu Arg Lys Glu Gln Pro Asp Gly Val Phe Ala Pro Asp

130 135 140

Pro Trp Leu Pro Tyr Glu Ser His Pro Asp His Arg Thr Thr Gly Phe

145 150 155 160

Leu Ala Ile Glu Ser Val Ala Phe Ser Gln Leu Pro Asn Phe Ser Asn

165 170 175

Thr Asp Leu Asp Ile Gly Leu Asn Pro Tyr Asn Ser Gly Ser Phe Ile

180 185 190

Ala Leu Tyr Tyr Thr His Lys Pro Asn Tyr Ile Val Asp Ile Thr Asp

195 200 205

Leu Met Glu Leu Lys Leu Lys Ala Ile Arg Val His Arg Ser Gln Phe

210 215 220

Pro Asp Asp Ile Trp Glu Lys Trp Glu Pro Phe Leu Arg Thr Ile Ala

225 230 235 240

Met Phe Tyr Gly Glu Lys Ile Gly Val Arg Tyr Gly Glu Gly Phe Arg

245 250 255

Ile Met Pro Gly Leu Phe Tyr His Ile Thr Pro Phe Thr Asp Leu Ile

260 265 270

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

ggaaaggaag gaatttttt 19

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

aaaaggaggt ctatat 16

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

gcaaagagag gagaaacgg 19

<210> 7

<211> 819

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

atggtcgtca acatgttcga ggacatcgac acgttcgagg aagcgtttaa caagctgctg 60

cgcgaagtcc tggaatttga tctgcaaaat ccgttcaaag acgcgaagaa agtcctttgc 120

atcgaaccgc atccggacga ttgcgttatt ggaatgggcg gcacaatcaa aaaactgagc 180

gatatgggcg tcgaagtcat ctacgtttgc atgacagacg gctatatggg cacaacagac 240

gaaagcctgt caggacacga attagcagca atccgccgca aagaagaaga agaaagcgca 300

cgcctgctgg gcgttaaaaa gatctattgg ctgaactacc gcgatacaga actgccgtat 360

tcacgcgaag tccgcaaaga tctgacgaaa attctgcgca aagaacaacc ggacggagtt 420

tttgcaccag atccttggct tccgtacgaa tcacatccgg atcatagaac gacaggcttt 480

ctggcgattg aatcagttgc gtttagccag ctgccgaatt ttagcaacac ggatctggac 540

attggcctga atccgtataa cagcggaagc tttatcgcgc tgtactacac gcacaaaccg 600

aactacatcg tcgacatcac ggacctgatg gaactgaaac tgaaggcgat tcgcgtccat 660

agaagccagt ttccggacga tatttgggag aaatgggaac cgttcctgag aacaatcgcg 720

atgttctacg gcgaaaaaat cggcgttcgc tacggagaag gctttagaat tatgccgggc 780

ctgttctacc acatcacacc gtttacggac ctgatctga 819

<210> 8

<211> 562

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 8

Met Glu Phe Val Ile Gly Leu Leu Ile Val Leu Leu Ala Leu Phe Ala

1 5 10 15

Ala Gly Tyr Phe Phe Arg Lys Lys Ile Tyr Ala Glu Ile Asp Arg Leu

20 25 30

Glu Ser Trp Lys Ile Glu Ile Leu Asn Arg Ser Ile Val Glu Glu Met

35 40 45

Ser Lys Ile Lys His Leu Lys Met Thr Gly Gln Thr Glu Glu Phe Phe

50 55 60

Glu Lys Trp Arg Glu Glu Trp Asp Glu Ile Val Thr Ala His Met Pro

65 70 75 80

Lys Val Glu Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Glu Glu Asn Ala Asp Lys Tyr

85 90 95

Arg Phe Lys Lys Ala Asn Gln Val Leu Val His Ile Asp Asp Leu Leu

100 105 110

Thr Ala Ala Glu Ser Ser Ile Glu Lys Ile Leu Arg Glu Ile Ser Asp

115 120 125

Leu Val Thr Ser Glu Glu Lys Ser Arg Glu Glu Ile Glu Gln Val Arg

130 135 140

Glu Arg Tyr Ser Lys Ser Arg Lys Asn Leu Leu Ala Tyr Ser His Leu

145 150 155 160

Tyr Gly Glu Leu Tyr Asp Ser Leu Glu Lys Asp Leu Asp Glu Ile Trp

165 170 175

Ser Gly Ile Lys Gln Phe Glu Glu Glu Thr Glu Gly Gly Asn Tyr Ile

180 185 190

Thr Ala Arg Lys Val Leu Leu Glu Gln Asp Arg Asn Leu Glu Arg Leu

195 200 205

Gln Ser Tyr Ile Asp Asp Val Pro Lys Leu Leu Ala Asp Cys Lys Gln

210 215 220

Thr Val Pro Gly Gln Ile Ala Lys Leu Lys Asp Gly Tyr Gly Glu Met

225 230 235 240

Lys Glu Lys Gly Tyr Lys Leu Glu His Ile Gln Leu Asp Lys Glu Leu

245 250 255

Glu Asn Leu Ser Asn Gln Leu Lys Arg Ala Glu His Val Leu Met Thr

260 265 270

Glu Leu Asp Ile Asp Glu Ala Ser Ala Ile Leu Gln Leu Ile Asp Glu

275 280 285

Asn Ile Gln Ser Val Tyr Gln Gln Leu Glu Gly Glu Val Glu Ala Gly

290 295 300

Gln Ser Val Leu Ser Lys Met Pro Glu Leu Ile Ile Ala Tyr Asp Lys

305 310 315 320

Leu Lys Glu Glu Lys Glu His Thr Lys Ala Glu Thr Glu Leu Val Lys

325 330 335

Glu Ser Tyr Arg Leu Thr Ala Gly Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Phe

340 345 350

Glu Lys Arg Leu Asp Glu Ile Gly Lys Leu Leu Ser Ser Val Lys Asp

355 360 365

Lys Leu Asp Ala Glu His Val Ala Tyr Ser Leu Leu Val Glu Glu Val

370 375 380

Ala Ser Ile Glu Lys Gln Ile Glu Glu Val Lys Lys Glu His Ala Glu

385 390 395 400

Tyr Arg Glu Asn Leu Gln Ala Leu Arg Lys Glu Glu Leu Gln Ala Arg

405 410 415

Glu Thr Leu Ser Asn Leu Lys Lys Thr Ile Ser Glu Thr Ala Arg Leu

420 425 430

Leu Lys Thr Ser Asn Ile Pro Gly Ile Pro Ser His Ile Gln Glu Met

435 440 445

Leu Glu Asn Ala His His His Ile Gln Glu Thr Val Asn Gln Leu Asn

450 455 460

Glu Leu Pro Leu Asn Met Glu Glu Ala Gly Ala His Leu Lys Gln Ala

465 470 475 480

Glu Asp Ile Val Asn Arg Ala Ser Arg Glu Ser Glu Glu Leu Val Glu

485 490 495

Gln Val Ile Leu Ile Glu Lys Ile Ile Gln Phe Gly Asn Arg Phe Arg

500 505 510

Ser Gln Asn His Ile Leu Ser Glu Gln Leu Lys Glu Ala Glu Arg Arg

515 520 525

Phe Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Asp Ser Tyr Glu Ile Ala Ala Ala Ala

530 535 540

Val Glu Lys Ala Ala Pro Gly Ala Val Glu Lys Ile Lys Ala Asp Ile

545 550 555 560

Ser Ala

<210> 9

<211> 1689

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

atggagtttg tcattggatt attaattgta ctgcttgcgc tgtttgcggc aggctacttt 60

ttcaggaaaa aaatctacgc cgaaatcgac cggctggaat cgtggaagat tgaaattctg 120

aatcggtcga tcgtggaaga aatgtctaaa ataaaacatt taaaaatgac gggtcagaca 180

gaagagttct ttgagaagtg gcgtgaagaa tgggatgaga ttgtcacagc ccacatgccg 240

aaagttgaag agctccttta tgatgccgag gaaaatgcag acaaataccg gtttaaaaag 300

gccaatcaag tgctcgttca tatcgacgac ctgctgacag cggctgaatc aagcattgaa 360

aagattcttc gggaaatcag cgatcttgtc acaagtgagg aaaagagccg tgaagagatt 420

gaacaggtga gggagcgcta ttcgaaatct cgaaaaaacc tgctggctta cagccacctt 480

tacggggagc tttatgacag ccttgaaaag gatctggacg aaatttggag cggcatcaaa 540

caatttgaag aagaaacaga aggcggaaac tatattactg cacgaaaagt actgcttgag 600

caggaccgca atcttgaacg gcttcagtca tacatagatg atgtgccgaa gctgttagct 660

gactgtaaac agacggtgcc cggacagatt gcaaagctca aggatggcta tggcgaaatg 720

aaagaaaaag ggtacaagct tgagcatatc cagcttgata aggaattaga aaatctgtca 780

aaccagctga aacgagcgga acatgtcctg atgactgaac tggatattga tgaagcgtcc 840

gcaatcctgc agctcattga cgaaaatatt caatctgttt atcagcagct ggagggcgaa 900

gttgaagccg gtcaatccgt actaagcaaa atgcctgaat tgattattgc ttacgacaag 960

cttaaagaag agaaagagca tacgaaagcg gaaactgagc tggtgaagga aagctacagg 1020

ctgacagccg gtgagctcgg caaacagcag gcttttgaaa agcgccttga tgaaattgga 1080

aagctgctat catccgttaa agataagctt gatgcagagc atgtcgccta ctcactttta 1140

gtagaagaag ttgcttcaat agagaagcaa attgaagaag tgaaaaaaga gcatgccgag 1200

tatcgtgaaa atctgcaagc gctgagaaaa gaagagcttc aggcgaggga gacgctcagc 1260

aatttgaaaa aaacaatttc tgagacagca agactgctga agactagcaa cattccaggc 1320

attccgagcc atattcaaga gatgctggag aacgcgcatc atcatattca agaaacggtc 1380

aatcaactaa acgaacttcc attaaatatg gaagaagccg gagcccattt gaaacaagca 1440

gaagatatcg tcaacagggc aagccgggaa tcagaggaac ttgtcgagca ggtcatcctc 1500

attgaaaaaa tcattcagtt cggaaaccgg ttcagaagcc agaatcatat tttatctgaa 1560

cagctgaaag aagcggaaag acgtttttat gcttttgatt atgacgactc ttatgaaatt 1620

gccgctgccg ctgtagaaaa ggctgcgcca ggtgcagttg aaaaaatcaa agctgacata 1680

tccgcttag 1689

<210> 10

<211> 65

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

ttattaacgt tgatataatt taaattttat ttgacaaaaa tgggctcgtg ttgtacaata 60

aatgt 65

<210> 11

<211> 28

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 11

Met Arg Lys Leu Thr Lys Thr Ser Gln Leu Asp Ala Gly Leu Cys Thr

1 5 10 15

Ala Ala Gln Met Val Phe Val Thr His Ala Ser Ala

20 25

<210> 12

<211> 73

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 12

ggtaccatta taggtaagag aggaatgtac acatggtcgt caacatgttc gaggacatcg 60

acacgttcga gga 73

Claims

1.一种分泌几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌融合表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的几丁二糖脱乙酰酶与核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pgrac100启动子，过表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的细胞壁合成蛋白EzrA，并通过RBS序列调控几丁二糖脱乙酰酶的表达，所述RBS序列为SEQ ID NO.4-6所示序列之一。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述几丁二糖脱乙酰酶和Pgrac₁₀₀启动子以pP43NMK为载体进行融合表达。

3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：以枯草芽孢杆菌B. subtilis C6为宿主。

4.一种生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于：以权利要求1-3任一项所述的枯草芽孢杆菌发酵上清液为催化剂，催化N-乙酰氨基葡糖转化为氨基葡萄糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌发酵上清液通过将枯草芽孢杆菌种子液接种至发酵培养基中，在35-40℃培养6-12h进行IPTG诱导，在35-40℃诱导48-72h，再经离心得到。

6.权利要求1-3任一项所述的枯草芽孢杆菌在制备几丁二糖脱乙酰酶、含有几丁二糖脱乙酰酶的产品、氨基葡萄糖或含有氨基葡萄糖的产品中的应用。

7.一种平衡枯草芽孢杆菌生长和几丁二糖脱乙酰酶生产的方法，其特征在于：所述的方法包括在枯草芽孢杆菌中融合表达氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的几丁二糖脱乙酰酶与核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pgrac100启动子，过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的细胞壁合成蛋白EzrA，并通过RBS序列调控几丁二糖脱乙酰酶的表达，所述RBS序列为SEQ ID NO.4-6所示序列之一。

8.一种提高枯草芽孢杆菌对几丁二糖脱乙酰酶耐受性的方法，其特征在于：所述的方法包括在枯草芽孢杆菌中融合表达氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的几丁二糖脱乙酰酶与核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pgrac100启动子，过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的细胞壁合成蛋白EzrA，并通过RBS序列调控几丁二糖脱乙酰酶的表达，所述RBS序列为SEQID NO.4-6所示序列之一。